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ANÁLISE DE IMAGENS EM

TECNOLOGIA DE SEMENTES

Produção de Sementes (LPV-5705)

Pós-graduação - Fitotecnia

Primeiro Semestre de 2014

C.C.

Francisco Guilhien Gomes Junior

Tecnologia de Sementes

Depto de Produção Vegetal

USP/ESALQ

11/05/2012 13h10 - Atualizado em 11/05/2012 14h14

Satélite russo registra maior foto já feita da Terra, com 121 megapixelsCada pixel da imagem corresponde a 1 km de distância

PIXEL, RESOLUÇÃO E TAMANHO DA IMAGEM

TamanhoO tamanho de uma imagem digital está definido no número de linhas e colunas que a forma

ResoluçãoCapacidade que um sistema de captura/reprodução de imagens tem para reproduzir detalhes

A resolução de uma imagem é o número de pixels impressos ou exibidos por unidade de medida

Pixel: (“Pictures Elements”)É o menor ponto que forma uma imagem

x

y

Pixel = f(x,y)

Imagem digital

Imagem bitmapImagem vetorialCDR, AI e EPS TIFF, JPEG, PNG, GIF, BMP e PSD

Representação de uma imagem bidimensional

usando números binários codificados de modo a

permitir seu armazenamento, transferência,

impressão ou reprodução, e seu processamento por

meios eletrônicos

Tipos de imagens digitais

Cada pixel

tem um valor

independente

de corImagem

Vetorial

Imagem

Bitmap

Imagens digitais: vetorial e bitmap

A imagem

vetorial pode ser

redimensionada

sem perda de

qualidade

A resolução de uma

imagem bitmap

deve ser definida

antes da impressão

e o seu

redimensionamento

pode causar perda

de qualidade

As imagens vetoriais

são geradas a partir de

linhas (vetores) e

pontos, e são definidas

por coordenadas e

fórmulas matemáticas

As imagens bitmap

são geradas a partir

de uma malha

quadriculada, onde

a menor unidade é

chamada pixel

Esquerda: semente

de milho captada

em imagem de

100dpi, 256 tons de

cinza e 8bits.

Direita: ampliada 7x

em tela (700%)

Resolução de imagem digital

Teixeira (2004)

Propriedades das cores

RGB - Modelo aditivo CMYK - Modelo subtrativo

Escala de cinzas

Fonte: Google

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28 x 28 x 28

16,7 milhões de

cores

Modelo

RGB

8 bits

Escala de

cinzas

8 bits

Pixel = f(x,y)

Pixel = f(x,y) 28

256 níveis

x

y

x

y

Bits nos modelos RGB e escala de cinzas Imagem digital

Níveis de cinza

2568 bits

1287 bits

646 bits

325 bits

164 bits

83 bits

42 bits

21 bit

Marques Filho e Vieira Neto (1999)

IMAGEM BINÁRIA

Procedimentos não destrutivos para avaliação da

qualidade de sementesRaios X

Microtomografia computadorizada de raios X

Tomografia por ressonância magnética

Câmera multiespectral

Fluorescência de clorofila

Avaliação de características físicas e morfológicas

de sementes e de plântulasDescritores de cor, forma e tamanho das sementes

Avaliação do vigor de sementes com base em imagens

digitais de plântulas

Análise de imagens de sementes e de

plântulas

Procedimentos não destrutivos para avaliação

da qualidade de sementes

TESTE DE

RAIOS X

Procedimentos não destrutivos para avaliação

da qualidade de sementes

Raios X

Descoberta dos raios X

Físico alemão Wilhelm Conrad Röntgen (1845-1923)

8 de novembro de 1895: primeira chapa de raios X

Fonte: google

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Raios X

Características dos raios X

Fonte: google

Raios X

Como são gerados os raios X?

Elétrons acelerados

emitidos pelo cátodo se

chocam com um alvo

metálico (ânodo de

tungstênio)

Ao atingir o alvo, os

elétrons desaceleram e

perdem a energia cinética,

cedendo energia aos

elétrons do ânodo, gerando

energia térmica e radiação

Raios X: geração

O comprimento de onda gerado depende do nível de

energia

Alto nível de energia: ondas curtas

Mais apropriados para objetos grandes e, ou

densos

Possuem alta absorção e resolução e causam

baixo dano aos tecidos

Baixo nível de energia: ondas longas

São apropriados para objetos pequenos

Exemplo: sementes

Possuem baixa absorção e resolução e causam

alto dano aos tecidos

Fatores que afetam o nível de absorção

dos raios X pela semente

Espessura e densidade dos tecidos

Composição da semente

Proteínas, carboidratos e lipídios: diferentes graus de

hidrofobicidade

O teor de água da semente influencia a densidade

óptica

Comprimento de onda da radiação ionizante

Raios X de menor comprimento de onda => maior poder

de penetração

35% de água 15% de água

Imagens radiográficas de sementes de

Tucumã (Astrocaryum aculeatum)

apresentando diferentes graus de umidade

Viabilidade da utilização de raios X emsementes

CAUSA EFEITO

Radiografia de semente

de milho doce

A pequena dose de radiação usada durante o teste não exerceinfluência negativa sobre a germinação (não provocamutação)

Não inviabiliza a

semente (método não

destrutivo): relações

de causas e efeitos

Gomes-Junior e Cicero (2012)

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ISTA - desde a década de 1980 (detecção de sementes cheias,

vazias, danificadas mecanicamente ou por insetos).

RAS 2009 – capítulo específico (16) sobre o teste de raios X.

Raios X para análise de sementes

Histórico

Início da década de 1950 na Suécia: avaliação da

qualidade de sementes de Pinus sylvestris L.

(Simak e Gustafsson,1953)

Pinus sylvestris L.

Primeiro trabalho foi realizado por Lundström em

1903: sementes de coníferas

Raios X para análise de sementes

Histórico

Primeiro trabalho brasileiro foi realizado por Silvio

M. Cicero em 1998: avaliação de danos mecânicos

em sementes de milho

Setembro de 2001: inauguração do Laboratório de

Análise de Imagens do Departamento de

Produção Vegetal da USP/Esalq, financiado pela

FAPESP (primeiro laboratório para avaliação de

sementes utilizando raios X no Brasil)

Raios X

Como interpretar os resultados?

Conhecer a morfologia interna

Conhecer o princípio do teste

Raios X

Como interpretar os resultados?

Trinca 3Trinca 1

Trinca 2

Radícula

Plúmula

Raízes seminais

Raios X

Como interpretar os resultados?

1 mm

Crotalaria juncea L.

radícula

hipocótilo

plúmula

cotilédones

tegumento

Raios X

Como interpretar os resultados?

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Raios X

Aplicações em Tecnologia de Sementes

Detecção de anormalidades em embriões

Determinação do estádio de desenvolvimento das

sementes

Estudos de alterações fisiológicas durante os

processos de maturação, secagem, germinação ou

condicionamento fisiológico

Identificação de injúrias mecânicas, injúrias causadas

por insetos ou injúrias decorrentes de outros fatores

adversos em pré e pós-colheita

Seleção de sementes cheias

Base para utilização de programas computadorizados

na avaliação de alterações da morfologia interna

Embrião

deformadoPA

Embrião com

pequeno defeito PA

PNEmbrião sem

defeito

Socolowski e Cicero (2008)

Tecoma stans

Raios X

Detecção de anormalidades em embriões

Raios X

Identificação de injúrias mecânicas

Gomes-Junior e Cicero (2012)

Flor et al. (2004)

milho doce

soja

Plântula anormal

Plântula anormal

Raios X

Identificação de injúrias por “umidade”

Injúrias severas no eixo

embrionário

Injúrias severas na

região dos cotilédones

Plântula anormal

soja

Forti et al. (2010)

Menezes et al. (2012)

Semente de

arroz: secagem

a 50o C

Raios X

Identificação de injúrias causadas por secagem

Caruncho em

feijão-caupi

Melo et al. (2010)

Raios X

Identificação de injúrias causadas por insetos

Forti et al. (2008)

Percevejo em

feijão

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Raios X

Seleção de sementes cheias

Totalmente formada Parcialmente formada Não formada

(Carvalho et al., 2010)

Sementes

de mamona

Área do embrião = 57%

Raios X

Base para utilização de programas computadorizados na

avaliação de alterações da morfologia interna

Espaço livre interno total = 1,28 mm2

Semente

de algodão

Semente de

Xylopia aromatica

Sokolowski et al. (2011)Marcos-Filho et al. (2010)

Neethirajan et al. (2007)

Detecção de grãos de

trigo “germinados” com

base na densidade de

pixels

Raios X

1 Moega de entrada de sementes

2 Tubo de raios X

3 Ampliação da imagem

4 Interface de usuário

5 Unidade de classificação

Posicionamento

da semente

Obtenção da

imagem radiográficaAnálise e processamento

dos dadosClassificação

Raios X no controle de qualidade de

sementes

Fonte: google (adaptado)

Tomografia computadorizada de

raios X (TC)

É uma técnica que permite a visualização de

seções transversais (cortes internos) de um

objeto de forma não destrutiva

A captura é feita através de uma série de

pequenas rotações

As informações de atenuação da radiação que

atravessa o objeto são gravadas para um plano

de interesse

Um algoritmo processa os dados para formar

uma imagem 2D

A combinação dessas imagens pode gerar a

visualização em 3D

Microtomografia de raios X

Tubo de

raios X

Intensificador

de imagem

Câmera

CCD

Projeções

Imagem 3D

Algoritmo de reconstrução

Seções

Análise das imagens

Determinação de

parâmetros físicos

Modelo 3D

Sistema de

circulação

Amostra

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Microtomografia computadorizada de

raios X (microTC)

Diferença em relação à TC

consiste no grau de

resolução da imagem e no

tamanho do objeto a ser

analisado

Apresenta resoluções

mínimas de 50 microns,

favorecendo a visualização

e caracterização da

estrutura interna de objetos

pequenos, como sementes

Microtomógrafo SkyScan 1172: Embrapa Instrumentação

Microtomografia de raios X

Posicionamento da amostra:

Seção 572

Seção 690

Semente de milho

Microtomografia computadorizada de raios X

2000 seções transversais

Microtomografia computadorizada de raios X

Imagem

radiográfica

Faxitron X-ray MX 20

DC 12 digital

SkyScan 1172

Passo de rotação: 0,2°

Rotação total: 180°

Tamanho do pixel: 6,6µm

Seção coronal

Seção transversal Seção sagital

Imagem detalhada do embriãoTomografia por ressonância

magnética

A tomografia por ressonância magnética utiliza

fortíssimos campos magnéticos e ondas de

rádio para formar imagens de uma amostra

São utilizados os pulsos de radiofrequência

direcionados somente ao hidrogênio contido na

amostra

O excesso de energia liberado pelos prótons de

hidrogênio quando o pulso de radiofrequência é

desligado emite um sinal de uma bobina para o

computador

Por meio de cálculos matemáticos os sinais são

transformados em uma imagem

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Monitoramento da secagem de sementes de cevada

Seefeldt et al. (2007)

Imagem por ressonância magnética

5 min 2 h 5 min 5 h 5 min 6 h 5 min

8 h 5 min 11 h 5 min 12 h 5 min 17 h 5 minKoizumi et al. (2008)

Monitoramento da hidratação de sementes de soja

Imagem por ressonância magnética

Câmera multiespectral

Imagem multiespectral: imagens de um mesmo objeto, tomadas com diferentes comprimentos de ondas eletromagnéticas (luz visível, infravermelha, ultravioleta, raios X ou qualquer outra faixa do espectro)

Imagem colorida tradicional

Utiliza três filtros

para as bandas

Red, Green e

Blue

Imagem RGB

Limite do

Infravermelho

Comprimento de onda (nm)R

esp

osta

rela

tiva

Imagem multiespectral

ultravioleta infravermelho

Clorofila b

Clorofila a

Comprimento de onda (nm)

Ab

so

rbâ

ncia

Imagem colorida tradicional

Clorofilas a e b

apresentam

quase o mesmo

sinal RGB

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Clorofila b

Clorofila a

Comprimento de onda (nm)

Ab

so

rbâ

ncia

Imagem multiespectral

Em comprimentos

de onda específicos

as clorofilas a e b

apresentam

diferentes sinais e

podem sem

identificadas

Identificação de fungos em sementes de

espinafre

Olesen et al. (2011)

Olesen et al. (2011)

Identificação de fungos em sementes de

espinafreAlternaria

Cladosporium

Fusarium

Stemphylium

Sem infecção

Verticilium

Inte

nsid

ad

e m

éd

ia

Comprimento de onda (nm)

Identificação de fungos em sementes de

espinafreN

úm

ero

de p

ixels

Núm

ero

de p

ixels

Intensidade do pixel

Alternaria spp.

Cladosporium spp.

Fusarium spp.

Verticillium spp.

Stemphylium spp.

Sem infecção

Olesen et al. (2011)

Câmera multiespectral no controle de

qualidade de sementes

Entrada das sementes

Esteira móvel

Espectômetro e unidade de iluminação

Classificação:Sementes maduras e sadiasSementes imaturasSementes infectadas por fungos

Fonte: google (adaptado)

Fluorescência de clorofila

Jalink et al. (1998)

A clorofila fluoresce quando

excitada em um determinado

comprimento de onda

1. Um laser ou uma luz de LED

excita a clorofila

2. Um filtro de largura de banda

estreita filtra a fluorescência

3. A clorofila da semente é

determinada

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Fluorescência de clorofila em semente de

pimenta durante a germinação

Média

de F

C/p

ixel

x1000 (

valo

r escala

de c

inza)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

40

30

20

10

0

Tempo (h)

68h 20min

50

http://www.phenovation.com

Lote de baixo vigor

Ocorrência de sementes esverdeadas

Lote de alto vigor

Sinal de fluorescência, baixo para alto: pretovermelholaranjaamareloverde

Fluorescência de clorofila em sementes

de soja

http://www.phenovation.com

Avaliação de características físicas e morfológicas de sementes e de plântulas

Sementes

Plântulas

Câmera CCD

Escâner de mesa

Computador e programa

para análise de imagens

Imagens em Time-lapse

Descritores de cor, forma e

tamanho das sementes

Classificação do vigor

de lotes de sementes

Construção da imagem da semente

Curva de embebição (monitoramento)

Taxa de crescimento da raiz

Índices médios RGB

Descritores biomorfológicos Adaptado de Dell´Aquila (2006)Dell’Aquila (2009)

Índices RGB como indicadores da viabilidade

de sementes

Inicial Após envelhecimento

Escurecimento do tegumento de

sementes de lentilha após o

envelhecimento (51 dias a 40 °C

e teor de água de 14,4%)

Dell’Aquila (2006)

Índices médios RGB como indicadores da

viabilidade de sementes

Onobrychis viciifolia

Behtari et al. (2014)

Índices médios RGB como indicadores da

viabilidade de sementes

20/03/2014

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Índices médios RGB no monitoramento da

taxa de crescimento da raiz

Dell’Aquila (2009)

Semente de rabanete Método direto para a

identificação de sementes

com alto potencial de

desempenho

Armazenamento das imagens

de plântulas

Resultados rápidos, objetivos

e precisos

Biossíntese incompleta

Membranas incompletas

MATURIDADE FISIOLÓGICA

Degeneração das membranas

Redução das atividades respiratórias e biossintéticas

Germinação lenta

Redução do potencial de conservação

Menor taxa de crescimento e de desenvolvimento

Menor uniformidade de desempenho

Maior sensibilidade a adversidades

Redução da emergência de plântulas em campo

Aberrações morfológicas (plântulas anormais)

Perda do poder germinativo

MORTE Adaptado de Delouche e Baskin (1973)

Avaliação automatizada do vigor de sementes

baseada em imagens digitais de plântulas

Processamento de uma imagem digital de

plântula de milho

256 tons de cinza

(8 bits)

300 dpi

Imagem binária Esqueleto em

imagem binária

Algoritmocontador de

pixels

Teixeira et al. (2006)

Cn = média aritmética

do comprimento (cm)

n = número de

plântulas medidas em

"pixels" sob resolução

(r) dada em dpi.

Hipocótilo

Raiz

Baalbaki et al. (2009)

Marcos-Filho et al. (2009)

Programas

Seed Vigor Imaging System (SVIS)

Sistema de Análise de Sementes (SAS)

Análise Automatizada do Vigor de

Sementes (Vigor-S)

Determinação de índices (escala de 0 a

1000)

Crescimento

Uniformidade de desenvolvimento

Vigor

Determinação do comprimento médio

das plântulas

Avaliação automatizada do vigor de sementesalface

soja

Comp. plântula em azul: 7,8 cm

Índice de Crescimento: 837

Índice de Uniformidade: 947

Índice de Vigor: 870

Comp. plântula em azul: 4,5 cm

Índice de Crescimento: 435

Índice de Uniformidade: 925

Índice de Vigor: 582

Baixo vigor Alto vigor

Gomes-Junior et al. (2014)

Avaliação automatizada do vigor de sementes

de feijão (programa SVIS)

SVIS: índices de vigor para soja(plântulas com três dias de idade)

Proposta da Ohio Seed Improvement Association

Alto vigor: > 500

Vigor médio: 200 - 500

Baixo vigor: < 200

Proposta da Ohio State University

Vigor excepcional: 800 - 1000

Alto vigor: 600 - 799

Bom vigor: 400 - 599

Baixo vigor: 200 - 399

Grãos: < 200

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Cultivar Nitro

Lote Germ.(%) PCG (%) EASS (%) EP (%) IV IU

6 99 a* 96 a 97 a 99 a 902 ab 922 ab

7 88 b 80 b 77 b 92 b 752 c 882 c

8 99 a 97 a 97 a 100 a 918 a 907 bc

9 99 a 96 a 98 a 100 a 883 ab 934 a

10 99 a 93 a 95 a 95 a 861 b 921 ab

C.V. (%) 5,5 5,5 6,0 5,3 3,6 2,9

Marcos Filho et al. (2006)* Comparação na coluna (teste de Tukey: p≤ 0,05)

Avaliação automatizada do vigor de sementes

de melão: comparação com métodos tradicionais

Índice de VigorÍndice de

Uniformidade

Cuidados e limitações

Temperatura no germinador

Parâmetros

SVIS

Temperatura °C

Milho Soja

24 °C 25 °C 26 °C 24 °C 25 °C 26 °C

Crescimento 531 B 459 B 734 A 612 B 573 B 731 A

Uniformidade 832 B 861 A 859 A 867 A 872 A 870 A

Vigor 621 B 579 B 765 A 739 B 722 B 800 A

Uniformidade de umedecimento do substrato

Horário de instalação do teste de germinação e aquisiçãodas imagens

Comparação entre cultivares com diferentes taxas de crescimento

Sementes dormentes

Otoni e McDonald et al. (2005)