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16
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
POLIANA DE OLIVEIRA CAVALCANTE ALENCAR
POLISSACARÍDEOS OBTIDOS DA ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria
caudata J. Agardh: ESTUDO QUÍMICO-ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DE
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
FORTALEZA-CE
2016
POLIANA DE OLIVEIRA CAVALCANTE ALENCAR
POLISSACARÍDEOS OBTIDOS DA ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria
caudata J. Agardh: ESTUDO QUÍMICO-ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DE
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Prof.ª Dra. Ana Lúcia Ponte Freitas.
FORTALEZA-CE
2016
POLIANA DE OLIVEIRA CAVALCANTE ALENCAR
POLISSACARÍDEOS OBTIDOS DA ALGA MARINHA VERMELHA Gracilaria
caudata J. Agardh: ESTUDO QUÍMICO-ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DE
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Bioquímica, do Centro de Ciências da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovada em: 10/05/2016.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por seu amor e pela certeza da sua presença em todos os momentos da
minha vida.
À minha orientadora, Prof.a Dr.ª Ana Lúcia Ponte Freitas, pela oportunidade,
colaboração científica e contribuição para o meu amadurecimento pessoal e
profissional. Por toda a amizade e gentileza dedicada a mim durante a realização
deste trabalho.
À Prof.ª Dr.ª Regina Célia Monteiro de Paulo, por sua contribuição para realização
deste trabalho, por sua disponibilidade em discutir alguns resultados.
Ao Prof. Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira, pela ajuda na realização de alguns
experimentos, pelas preciosas sugestões e pela receptividade.
Ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear
(CENAUREM) pela disponibilização de equipamentos.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Algas Marinhas, Carla Vivianne, Clarck
Barros, Felipe Bezerra, Luís Costa, Glauber Lima, Willer Malta, Luciano Chaves,
Joana Castro e Karolina Basílio, pela convivência diária, pela colaboração e pelos
momentos de descontração.
Aos colegas do Laboratório de Polímeros da UFC, em especial, Clara Myrla e
Venicius Sombra.
Aos colegas de outros laboratórios, em especial, Ewerton de Abreu e Edivânia
Oliveira.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Biologia molecular, em especial
a técnica Eliane Araújo por todo incentivo e apoio em todos os momentos.
Ao meu eterno amor Ábner Medeiros, por me fazer muito feliz e pelo seu apoio.
Obrigada pela sua amizade, companheirismo, fidelidade, respeito e amor.
Aos meus pais, Círio Régis e Ocely de Oliveira, por se esforçarem a vida inteira para
me proporcionarem uma educação de qualidade.
Aos meus irmãos Natan Régis e Pauline Cavalcante que torcem sempre por mim.
Ao meu sobrinho amado Natanael Cavalcante por ser um presente e milagre de
Deus na minha vida. Obrigada pelos momentos de alegria.
Aos familiares, amigos e irmãos em Cristo, em especial aos que considero como
irmãos: Tábata Missay, Tiana Portela, Fabíola Cordeiro e Hilca Lavor.
“E ainda que tivesse o dom de profecia,
e conhecesse todos os mistérios e toda
a ciência, e ainda que tivesse toda a fé,
de maneira tal que transportasse os
montes, e não tivesse amor, nada disso
me aproveitaria”.
I Coríntios 13:2
RESUMO
Algas marinhas do filo Rhodophyta são fontes naturais de polissacarídeos sulfatados
que são amplamente utilizados na indústria alimentícia e na indústria farmacêutica.
O presente trabalho teve como finalidade obter os polissacarídeos sulfatados totais
da alga marinha vermelha Gracilaria caudata (PSG) por extração enzimática,
determinar a sua estrutura química e testar o seu potencial antioxidante. As análises
químicas revelaram a presença de 85% de açúcares totais e 1% de proteínas
contaminantes no extrato obtido. Através de espectrometria de emissão óptica com
plasma (ICP-OES), os PSG apresentaram 0,9% de átomos de enxofre e um grau de
sulfatação de 0,14%. A massa molar média dos PSG foi determinada por
cromatografia em permeação em gel (GPC) e mostrou ser da ordem de 116,51 kDa.
Os polissacarídeos sulfatados totais foram submetidos a testes de caracterização
estrutural através da análise por espectroscopia de infravermelho com transformada
de Fourier e ressonância magnética nuclear (RMN) de próton (1H) e carbono (13C),
identificando os PSG como galactana do tipo agarana. A atividade antioxidante in
vitro dos PSG foi avaliada através de testes, tais como, ensaios de eliminação do
radical DPPH, quelação do íon ferroso e capacidade antioxidante total. Os
resultados indicaram que tais polissacarídeos possuem capacidade de sequestrar
radicais livres de maneira significativa e concentração-dependente. A atividade
antioxidante in vivo dos PSG foi avaliada em modelo de estresse oxidativo induzido
pelo 2,2’-azobis-2-amidinopropano (AAPH) em ratos, com posterior dosagem de
marcadores do sistema antioxidante enzimático, como catalase (CAT) e superóxido
desmutase (SOD), além da quantificação de marcadores de dano oxidativo, como
nitrito e tiol. O resultado demonstrou uma melhora no desequilíbrio redox pelo
aumento da atividade da CAT e aumento da atividade da SOD, com melhor resposta
na dose de 3 mg/kg. Devido a estes resultados, os polissacarídeos sulfatados
obtidos a partir da alga marinha Gracilaria caudata mostram potencial de virem a ser
utilizados na indústria alimentícia e farmacêutica.
Palavras-chave: Gracilaria, agarana, estrutura química, estresse oxidativo.
ABSTRACT
Red algae are natural sources of sulfated polysaccharides, which are widely used in
the food and pharmaceutical industries. This study aims to obtain the total sulfated
polysaccharides from the red seaweed Gracilaria caudata (PSG) through enzymatic
extraction, determine their chemical structure and their antioxidant potential.
Chemical analysis revealed that the obtained extract is comprised of 85% total
sugars and 1% of contaminating proteins. Through Inductively Coupled Plasma-
Optical Emission Spectrometry (ICP-OES), the PSG showed a percentage of 0.9%
sulfur atoms and a degree of sulfation of 0.14%. The average molar mass of PSG
was determined through gel permeation chromatography (GPC) and was determined
as 116.51 kDa. The total sulfated polysaccharides were subjected to structural
characterization tests through infrared Fourier transform spectroscopy and C13 and
H1 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analysis, identifying the PSG as galactan
from the agaran type. The in vitro antioxidant activity of PSG was determined using
tests such as elimination of DPPH radical, chelation of ferrous ion and total
antioxidant capacity. The results indicated that such polysaccharides have the
capacity to scavenge free radicals significantly and in a concentration-dependent
maner. The in vivo antioxidant activity of PSG was evaluated in an oxidative stress
model induced by 2,2'-azobis-2-amidinopropane (AAPH) in rats, with subsequent
dosage of antioxidant enzyme system markers, such as catalase (CAT) and
superoxide dismutase (SOD), and the quantitation of oxidative damage markers such
as nitrite and thiol. The results showed an improvement in the redox imbalance
through increased CAT activity and increased SOD activity with the best response
found at a dose of 3 mg / kg. Because of these results, the sulfated polysaccharide
obtained from seaweed Gracilaria caudata shows potential for their being used in the
food and pharmaceutical industry.
Keywords: Gracilaria, agarana, chemical structure, oxidative stress.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática estrutural das galactanas de
algas vermelhas........................................................................
20
Figura 2 - Estrutura química da agarana................................................... 22
Figura 3 - Representação esquemática do estresse oxidativo.................. 25
Figura 4 - Representação esquemática de estabilização de radical livre.. 25
Figura 5 - Cadeia transportadora de elétrons (respiração mitocondrial)... 26
Figura 6 - Reação de Fenton..................................................................... 27
Figura 7 - Reação de homólise da água.................................................... 28
Figura 8 - Reação de produção do peroxinitrito....................................... 30
Figura 9 - Representação das fases da peroxidação lipídica.................... 31
Figura 10 - Reação de dismutação do ânion superóxido........................... 32
Figura 11 - Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio.............. 33
Figura 12 - Reação de redução do peróxido de hidrogênio através
da conversão da GSH em GSSH...........................................
33
Figura 13 - Aspecto macroscópico da alga marinha vermelha Gracilaria
caudata e sua classificação taxonômica...................................
36
Figura 14 - Esquema de extração enzimática de polissacarídeos da alga
vermelha Gracilaria caudata......................................................
39
Figura 15 - Esquema de quantificação do conteúdo de
carboidratos...............................................................................
41
Figura 16 - Esquema de quantificação de proteínas
contaminantes...........................................................................
42
Figura 17 - Reação de estabilização do radical livre DPPH........................ 44
Figura 18 - Reações de inativação de radicais peroxilas............................ 50
Figura 19 - Perfil cromatográfico dos polissacarídeos sulfatados totais da
alga Gracilaria caudata em cromatografia de permeação em
gel..............................................................................................
55
Figura 20 - Espectro de absorção na região do infravermelho dos
polissacarídeos sulfatados totais extraídos da alga Gracilaria
caudata......................................................................................
56
Figura 21 - Espectro de RMN de 1H dos polissacarídeos sulfatados totais
da alga Gracilaria caudata.........................................................
61
Figura 22 -
Espectro de RMN de 13C dos polissacarídeos sulfatados
totais da alga Gracilaria caudata...............................................
62
Figura 23 - Espectro de DEPT 135 dos polissacarídeos sulfatados totais
da alga Gracilaria caudata.........................................................
63
Figura 24 - Espectro de HSQC dos polissacarídeos sulfatados totais da
alga Gracilaria caudata..............................................................
64
Figura 25 - Estrutura básica repetitiva dos polissacarídeos sulfatados
extraídos da alga Gracilaria caudata.........................................
65
Figura 26 - Efeito dos PSG no sequestro do radical DPPH......................... 66
Figura 27 - Habilidade dos PSG na quelação do íon ferroso...................... 68
Figura 28 - Capacidade antioxidante total dos PSG................................... 69
Figura 29 - Atividade da enzima catalase (CAT) no tecido hepático........... 70
Figura 30 - Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) no tecido
hepático.....................................................................................
71
Figura 31 - Determinação de nitrito no tecido hepático............................... 72
Figura 32 - Conteúdo de tiol proteico no tecido hepático............................ 73
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Rendimento dos polissacarídeos sulfatados obtidos de
algas vermelhas do gênero Gracilaria..................................
52
Tabela 2 - Análise química dos polissacarídeos sulfatados da alga G.
caudata................................................................................
54
Tabela 3 - Atribuições no espectro do infravermelho para
polissacarídeos sulfatados de algas
marinhas..............................................................................
57
Tabela 4 - Assinalamentos de RMN de 1H e 13C para os
PSG......................................................................................
60
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAPH 2,2’-azobis-2-amidinopropano
ATP Adenosina Trifosfato
BHA Hidroxianisol Butilado
BHT Hidroxitolueno Butilado
BSA Albumina Sérica Bovina
CAT Capacidade Antioxidante Total
CPC Cloreto de Cetil Piridínio
DPPH 2,2-difenil-1-picrilidrazila-hidrato
DTNB Ácido ditionitrobenzóico
EDTA Ácido Etilenodiaminotetra-acético
ERNs Espécies Reativas de Nitrogênio
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FADH2 Flavina- Adenina Dinucleótido
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
GPC Cromatografia de Permeação em Gel
MPK Pico das Massas Molares
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleótido
PBS Tampão Fosfato – Salino
PSG Polissacarídeos sulfatados totais da Gracilaria caudata
RMN Ressonância Magnética Nuclear
TNB Ácido tionitrobenzóico
UV Ultra violeta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 16
1.1 Algas............................................................................................................... 16
1.2 Gênero Gracilaria.......................................................................................... 18
1.3 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas......................................... 19
1.3.1 Galactanas sulfatadas............................................................................... 20
1.3.1.1 Agaranas................................................................................................... 21
1.4 Atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados............................... 22
1.5 Estresse oxidativo...................................................................................... 24
2 OBJETIVOS.................................................................................................... 35
2.1 Objetivo geral.............................................................................................. 35
2.2 Objetivos específicos................................................................................. 35
3 MATERIAIS........................................................................................................ 36
3.1 Coleta e identificação da alga marinha....................................................... 36
3.2 Animais.......................................................................................................... 37
3.3 Soluções e reagentes................................................................................... 37
4 MÉTODOS......................................................................................................... 38
4.1 Extração dos polissacarídeos sulfatados.................................................. 38
4.2 Rendimento.................................................................................................... 40
4.3 Análises químicas e estruturais dos polissacarídeos sulfatados
totais....................................................................................................................
40
4.3.1 Quantificação do conteúdo de carboidratos........................................... 40
4.3.2 Quantificação do conteúdo de proteínas contaminantes...................... 41
4.3.3 Quantificação do conteúdo de sulfato e carbono................................... 42
4.3.4 Determinação da massa molar por cromatografia de permeação em
gel.........................................................................................................................
43
4.3.5 Caracterização química por espectroscopia de absorção na região
do infravermelho.................................................................................................
43
4.3.6 Determinação da estrutura química por ressonância magnética
nuclear..................................................................................................................
43
4.4 Atividade antioxidante in vitro..................................................................... 44
4.4.1 Ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila-hidrato.... 44
4.4.2 Ensaio de quelação do íon ferroso........................................................... 45
4.4.3 Ensaio de capacidade antioxidante total pela formação do complexo
fosfomolibdênio..................................................................................................
46
4.5 Atividade antioxidante in vivo...................................................................... 47
4.5.1 Estresse oxidativo induzido por AAPH.................................................... 47
4.5.2 Homogeneização do tecido hepático....................................................... 47
4.5.3 Dosagem de proteína no tecido hepático................................................ 48
4.5.4 Determinação da atividade da catalase................................................... 48
4.5.5 Determinação da atividade da superóxido dismutase........................... 49
4.5.6 Determinação de nitrito............................................................................. 49
4.5.7 Determinação do conteúdo de tiol........................................................... 50
4.6 Análise estatística......................................................................................... 51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 52
5.1 Rendimento.................................................................................................... 52
5.2 Análises químicas e estruturais.................................................................. 53
5.2.1 Quantificação do conteúdo de carboidratos........................................... 53
5.2.2 Quantificação do conteúdo de proteínas contaminantes...................... 53
5.2.3 Quantificação do conteúdo de sulfato e carbono................................... 54
5.2.4 Determinação da massa molar por cromatografia de permeação em
gel.........................................................................................................................
55
5.2.5 Caracterização química por espectroscopia de absorção na região
do infravermelho.................................................................................................
56
5.2.6 Determinação da estrutura química por ressonância magnética
nuclear de 13C e 1H..............................................................................................
58
5.3 Atividade antioxidante in vitro..................................................................... 65
5.3.1 Ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo-
hidrato..................................................................................................................
65
5.3.2 Ensaio de quelação do íon ferroso........................................................... 66
5.3.3 Ensaio de capacidade antioxidante total................................................. 68
5.4 Atividade antioxidante in vivo...................................................................... 69
5.4.1 Atividade da catalase (CAT)...................................................................... 69
5.4.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD).............................................. 70
5.4.3 Determinação da concentração do nitrito............................................... 71
5.4.4 Determinação do conteúdo de tiol........................................................... 72
6 CONCLUSÃO.................................................................................................... 74
REFERÊNCIAS..................................................................................................... 75
16
INTRODUÇÃO
1.1 Algas
Os organismos marinhos são importantes fontes de metabólitos bioativos
e ocupam aproximadamente 70% da biosfera, os quais possuem uma grande
diversidade taxonômica (HOLDT; KRAAN, 2011). Dentre os organismos marinhos,
as algas são organismos eucarióticos fotoautotróficos que possuem uma grande
variedade de formatos e tamanhos, abrangendo desde formas unicelulares
(microalgas) a espécies multicelulares de dimensões maiores conhecidas como
macroalgas (FRANCESCHINI et al., 2010). O fato de serem organismos autotróficos
confere às algas grande importância ecológica, representando a base da cadeia
alimentar de oceanos e lagos. Além disso, apresentam grande importância
econômica para o ser humano (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012).
As algas não possuem tecidos especializados, nem vasos condutores,
sendo a clorofila “a” o pigmento fotossintético mais comumente encontrado (LEE,
1997). Habitam os mais diversos ambientes, desde oceanos, águas doces e solos
úmidos até tronco de árvores (VAN DEN HOECK; MANN; JAHNS, 1995). Sua
distribuição geográfica depende de diversos fatores, tais como: temperatura e
salinidade da água, disponibilidade de luz solar, correntes dos oceanos, das
condições físicas e químicas do ambiente (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012).
Tradicionalmente, as algas têm sido classificadas no Reino Protista, como
sugerido por Margulis e Schwartz (1998). No entanto, a classificação dos seres vivos
tem passado por várias modificações, principalmente em função dos avanços em
biologia molecular e sua influência sobre o estudo da evolução dos seres vivos. Tais
modificações são, ainda, alvo de muitos debates entre os cientistas (RAVEN;
EVERT; EICHHORN, 2007).
Esses seres, devido a sua grande diversidade, podem ser classificados
de acordo com a composição química de suas paredes celulares, tipos de pigmentos
presentes, natureza química dos produtos de reserva, além de aspectos citológicos
e morfológicos. Essa enorme diversidade permite a classificação das algas em três
grandes grupos dentro do Reino Protista: Rhodophyta (algas vermelhas),
17
Phaeophyta (algas pardas) e Chlorophyta (algas verdes) (DAWCZYNSKI;
SCHUBERT; JAHREIS, 2007; RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001).
O Brasil possui uma enorme diversidade em relação ao número de
espécies de algas marinhas (GOMES, 2012). A área compreendida entre o Estado
do Ceará e o Norte do Rio de Janeiro abriga uma das floras algais mais
diversificadas do país (VIDOTI; ROLLEMBEG, 2004). O Estado do Ceará possui em
maior quantidade algas vermelhas, da divisão Rhodophyta (205 espécies), seguida
das algas verdes, divisão Chlorophyta (77 espécies) e das algas pardas ou marrons,
divisão Phaeophyta (31 espécies), perfazendo um total de 313 espécies (FARIAS,
2004).
O grupo das rodófitas é composto por aproximadamente 4000 a 6000
espécies, constituindo o grupo com o maior número de espécies na costa brasileira,
sendo a ordem Ceramiales a encontrada em maior quantidade. As rodófitas são
quase exclusivamente macroscópicas e marinhas, típicas em mares quentes. Têm
tamanhos variando de poucos centímetros até cerca de 1 m de comprimento
(MCHUGH, 2003; TEIXEIRA, 2012). Vivem fixadas em um substrato (bentônicas) e
sua principal característica é a presença do pigmento que confere a coloração
característica destes organismos, a ficoeritrina (KILINÇ et al., 2013; VIDOTTI;
ROLLEMBERG, 2004). As macroalgas marinhas de maior importância econômica
mundial pertencem ao filo Rhodophyta, como as algas dos gêneros Gracilaria,
Gelidium e Hypnea (MCHUGH, 2003).
Muitas rodofíceas são utilizadas comercialmente como alimento humano,
na extração do ágar, um ficocolóide de alto valor econômico, utilizado na fabricação
de gomas e laxantes ou, ainda, como meio de cultura para microrganismos. As
rodofíceas também são utilizadas na extração de carragenanas que estão entre os
principais ficocolóides usados na indústria alimentícia, atuando como agentes
espessantes, estabilizantes, gelificantes e emulsificantes em diversos produtos,
como gelatinas, geléias, carnes processadas, produtos derivados do leite, pasta de
dente ou clarificante de cervejas (LIMA et al., 2013). Dentro do grupo das algas
vermelhas, algumas espécies de Gracilaria são comestíveis e cultivadas em várias
partes do mundo. Seu consumo pode ser direto como massa alimentícia, para
18
compor saladas e bolinhos de arroz e, indireto, na extração do ágar (MCHUGH,
2003).
Quanto ao grupo das algas marrons ou pardas, possui cerca de 1.750
espécies, são organismos pluricelulares predominantemente marinhos, típicos em
mares frios, vivendo fixados em um substrato ou flutuando, formando imensas
florestas submersas (KILINÇ et al., 2013). São reconhecidas pelo seu grande
tamanho, podendo crescer 30 cm por dia e ir até aos 65 m de comprimento
(TEIXEIRA, 2012). A cor das algas marrons, que varia de verde-oliva a marrom-
escuro, se deve à predominância de pigmentos marrom-amarelados, particularmente
fucoxantina, sobre a clorofila (CASTRO; HUBER, 2012).
Já o grupo das algas verdes possui cerca de 17.000 representantes, com
tamanhos semelhantes às algas vermelhas, habitam ambientes aquáticos, sejam
eles dulcícolas ou marinhos, e solos úmidos ou troncos. Contêm os pigmentos
clorofilas a e b, carotenos e xantofilas (KILINÇ et al., 2013; MCHUGH, 2003;
VIDOTTI; ROLLEMBERG, 2004). Esse grupo é pouco estudado no mundo,
sobretudo no Brasil (TEIXEIRA, 2012).
Recentemente, a procura por compostos bioativos em algas marinhas
tem-se intensificado, pois pesquisadores têm relatado que esses seres possuem
diversas atividades biológicas, tais como atividade anticoagulante e antitrombótica,
antiviral, anti-tumor, imunomodulatória, antioxidante, anti-hiperlipidêmica e
antidiabética (BARROW; SHAHIDI, 2008; MOHAMED; HASHIM; RAHMAN, 2012;
VASCONCELOS; ARAÚJO; SANTANA, 2015; WIJESEKARA; YOON; KIM, 2010).
1.2 Gênero Gracilaria
Diante deste quadro, as algas marinhas vermelhas do gênero Gracilaria
destacam-se como uma das principais fontes de moléculas bioativas com potencial
terapêutico. Morfologicamente, estas algas possuem talo cilíndrico ou achatado,
filamentoso ou pseudoparenquimatoso, com comprimento podendo variar entre 0,1 a
5 metros, apresentam coloração avermelhada, podendo ocorrer variantes de cor
verde (GUIMARÃES; PLASTINO; OLIVEIRA, 1999). Encontram-se geograficamente
19
distribuídas, principalmente em regiões tropicais e temperadas e pertencem a um
dos maiores gêneros da família Gracilariaceae (MARINHO-SORIANO; BOURRET,
2005). São conhecidas aproximadamente 100 espécies do gênero Gracilaria, as
quais se destacam como fonte rica de ágar que são polissacarídeos sulfatados
(BELLORIN, 2002; FRANCESCHINI et al., 2010; SILVA, 2009).
1.3 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas
Nos últimos 50 anos, o grupo de polissacarídeos sulfatados de algas
marinhas vem chamando atenção dos pesquisadores por estarem envolvidos em
diversos processos celulares (HAN et al., 2005) e por apresentarem diversas
atividades farmacológicas (ATHUKORALA et al., 2007; COURA et al., 2012; NADER
et al., 1979). Esses compostos são encontrados na parte mais externa da parede
celular de algas marinhas, enquanto a parte interna da parede celular (parte rígida) é
constituída por microfibrilas de celulose ou de outro polissacarídeo (RAVEN; EVERT;
EICHHORN, 2007). A sua função biológica parece está envolvida na proteção contra
desidratação em períodos de maré baixa, fornecendo ainda flexibilidade à estrutura
da alga e facilitando o processo de captura de luz e nutrientes por estes organismos
(CABRERA; STORTZ; RODRIGUEZ, 2014; PERCIVAL; MCDOWELL, 1967).
Os polissacarídeos sulfatados são polímeros formados por unidades
repetitivas de açúcares carregados negativamente, devido à presença de radicais
sulfatos, o que promove sua ligação a um grande número de proteínas em solução
no organismo. Esta característica estrutural pode ser a responsável pela diversidade
de atividades biológicas apresentadas por estas macromoléculas (SOUSA, 2010).
Esses compostos podem variar na sua composição química em função do grupo de
algas em que se encontram (PERCIVAL; MCDOWELL, 1967).
As algas pardas produzem dois tipos de polissacarídeos componentes
mucilaginosos amorfos, os alginatos e as fucanas (BOISSON-VIDAL et al., 1995;
PAINTER, 1983; PATANKAR et al., 1993; RAMANA; RAO, 1991; ROCHA et al.,
2004). Nas algas verdes, os polissacarídeos sulfatados são na maioria das vezes
heteropolissacarídeos ricos em galactose, manose, xilose, raminose, arabinose e/ou
20
ácidos urônicos (COSTA et al., 2012; HAYAKAWA et al., 2000). Em alguns casos,
há uma predominância de um monossacarídeo sobre outros em várias ordens de
algas verdes (MAO et al., 2009).
Nas algas vermelhas são encontrados na forma de galactanas sulfatadas,
constituídas principalmente por repetições do monossacarídeo galactose (CRAIGIE,
1990). Ocorre uma variação estrutural considerável nas galactanas sulfatadas de
diferentes espécies de algas vermelhas e em amostras coletadas em ambientes
distintos, ou em diferentes estações do ano. A principal variação nestes
polissacarídeos está no padrão de sulfatação, onde a distribuição do sulfato ao
longo da cadeia de galactose é totalmente heterogênea, e as quantidades de sulfato
são marcadamente diferentes entre as espécies (PEREIRA et al., 2005).
1.3.1 Galactanas Sulfatadas
As galactanas sulfatadas podem ser encontradas principalmente na forma
de agaranas ou carragenanas (VAN DE VELDE; PEREIRA; ROLLEMA, 2004). Estas
galactanas são polímeros de açúcares complexos e heterogêneos que apresentam
como unidade fundamental um dissacarídeo de β (1→3) D-galactopiranose (unidade
A) e α (1 → 4) D- ou L- galactopiranose (unidade B) com presença de radicais
sulfatos (LAHAYE, 2001; PAINTER, 1983), exibindo assim, um arranjo dissacarídeo
alternante repetitivo entre as unidades A e B (AB)n (figura 1) (COURA et al., 2012).
Algumas unidades de α– galactopiranose podem ocorrer também na forma cíclica
3,6-anidrogalactopiranose (PAINTER, 1983).
Figura 1 - Representação esquemática estrutural das galactanas de algas vermelhas
Fonte: Sousa (2015).
21
As galactanas são classificadas de acordo com a estereoquímica de suas
moléculas, quando relacionadas com a conformação da unidade B. A unidade A
sempre se apresenta na configuração enantiomérica D-, enquanto que a unidade B
pode se apresentar tanto na configuração enantiomérica D- como na L-. Então,
quando esta unidade pertencer à série D-, a galactana é classificada como
carragenana e quando pertencer à série L-, é classificada como agarana (CAMPO et
al., 2009; MOHAMED; HASHIM; RAHMAN, 2012; WIJESEKARA; PANGESTUTI;
KIM, 2011).
1.3.1.1 Agaranas
Agarana, ou simplesmente ágar, é largamente utilizada na indústria,
sendo que 60% das suas aplicações são agroalimentares. Outra parte é bastante
utilizada como instrumento de laboratório (gel de eletroforese em agarose, meio de
cultura microbiológico) e na indústria farmacêutica (laxante, emulsificador,
espessante, agente de dispersão de comprimidos, componente de formulação de
cápsulas de vitaminas e drogas) e também como base para cosméticos
(FRANDESCHINI et al., 2010; RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2007).
As agaranas consistem da mistura de uma fração neutra, completamente
cíclica, chamada de agarose e de uma fração aniônica, que corresponde às
agaropectinas (LI et al., 2008; MUTHUSWAMY et al., 2007). A agarose (figura 2),
fração gelificante, é uma molécula linear neutra, essencialmente livre de sulfatos,
que consiste de cadeias repetidas de unidades alternadas β-1,3 D-galactose e α-1,4
3,6-anidro-L-galactose. Este polímero pode ainda apresentar substituições de seus
resíduos de monossacarídeos por 6-O-metil-D-galactose, L-galactose e 2-O-metil-L-
galactose (ARMISEN; GALACTAS, 1987; ARMISEN; GALATAS; HISPANAGAR,
2000). Essa fração gelificante do ágar possui uma estrutura de dupla hélice que se
agrega para formar uma estrutura tridimensional que retém as moléculas de água
nos seus interstícios formando assim géis termorreversíveis. As ligações de
hidrogênio formadas entre os átomos de oxigênio presente no polissacarídeo com
22
moléculas de água são responsáveis pela estabilização da estrutura do gel
(LAHAYE; ROCHAS, 1991).
A agaropectina (figura 2) caracteriza-se como um polissacarídeo ácido
que contem sulfato, metil, ácido pirúvico e ácido D-glucurônico associado a uma
estrutura linear da agarose, localizados em diferentes combinações ou posições na
molécula (ARMISEN; GALACTAS, 1987). A proporção destes dois polímeros varia
de acordo com a espécie da alga, com a agarose compreendendo ao menos dois
terços do ágar natural (CARDOSO, 2007; RETAMALES; MARTÍNEZ; BUSHCMANN,
1994).
Figura 2 - Estrutura química da agarana: agarose (1) e agaropectina (2)
Fonte: Barros et al. (2013).
1.4 Atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados
Diferentes investigações têm demonstrado uma relação direta entre o
consumo de algas marinhas e a prevenção e/ou o tratamento de patologias
relacionadas com o estresse oxidativo (FUNAHASHI; IMAI; MASE, 2001; JIMÉNEZ-
ESCRIG; SÁNCHEZ-MUÑIZ, 2000; VIDAL et al., 2006) e diversos trabalhos
23
apontam que tal atividade deve-se aos polissacarídeos sulfatados (COSTA et al.,
2011; WANG et al., 2010; YANG et al., 2011; YE et al., 2008) que têm sido foco da
pesquisa de novos produtos de interesse biomédico e farmacológico devido a sua
baixa toxicidade no tratamento terapêutico e seu importante papel antioxidante na
eliminação de radicais livres e na redução do estresse oxidativo em organismos
vivos (HU et al., 2001; RUPEREZ; AHRAZEM; LEAL, 2002; WANG et al., 2015).
As atividades anticoagulante e antitrombótica estão entre as propriedades
mais estudadas desses compostos na busca de encontrar um substituto à heparina,
que apresenta diversos efeitos indesejados, tais como doenças cardiovasculares,
trombocitopenia e propensão a hemorragias (MOURÃO; PEREIRA, 2000;
QUINDERÉ et al., 2014). Outras atividades biológicas de importância significativa
vêm sendo extensamente exploradas, tais como atividades anti-hiperlipidêmica (YU
et al., 2003), antiviral (DAMONTE et al., 1994; SINHA et al., 2010), antibacteriana
(AMORIM et al., 2012; NAIR; CHABHADIYA; CHANDA, 2007; VENKATESWARLU
et al., 2007), antitumoral (BARROS et al., 2013; VISHCHUK; ERMAKOVA;
ZVYAGINTSEVA, 2011), antiproliferativa (COSTA et al., 2010), antimetastática
(ZACHARSKI; ORNSTEIN, 1998), antioxidante (ALVES et al., 2012; SILVA et al.,
2015); anti-inflamatória (COURA et al., 2015; SILVA et al., 2015) , antiaterosclerótica
(ENGELBERG, 1991) e antinociceptiva (RIBEIRO et al., 2014).
Dentre as espécies de algas que possuem polissacarídeos sulfatados
com propriedades antiinflamatórias e antinociceptiva, tem-se a alga marinha
vermelha Gracilaria caudata, cujo polissacarídeo (ágar) apresentou potencial anti-
inflamatório frente a ensaios de edema induzido por diferentes agentes pró-
inflamatórios e peritonite, além de demonstrar efeito antinociceptivo no ensaio de
hipernocicepção promovida por injeção subcutânea de carragenina (CHAVES, et al.,
2013). Os polissacarídeos da alga Gracilaria caudata também já apresentaram
outras atividades descritas na literatura, como antinociceptiva (CHAVES et al.,
2013), antitumoral (BARROS, 2011), antidiarréica (COSTA et al., 2016) e
gastroprotetora (SILVA et al., 2011). Necessitando, portanto, de estudos mais
profundos acerca do seu potencial antioxidante, uma vez que, em diversas
24
patologias, como as citadas acima, o dano oxidativo é parte fundamental da gênese
e perpetuação das complicações (PASSALI et al., 2015).
Tendo em vista a natureza química dos polissacarídeos de algas, esses
compostos apresentam inúmeras possibilidades de ligações a proteínas em solução
tanto na matriz celular como no plasma sanguíneo, potencializando seus efeitos
biológicos (ARFORS; LEY, 1993). No entanto, a relação entre estrutura e atividades
biológicas de galactanas sulfatadas ainda é pouco conhecida. Porém, pode-se
afirmar que apenas a densidade de carga não é suficiente para explicar a ampla
gama de atividades biológicas apresentadas por essas moléculas, devendo-se
considerar também o padrão de substituição, natureza da cadeia principal do
polissacarídeo, tamanho da molécula, posição dos grupos sulfatos, tipo de ligação e
geometria da molécula (MELO et al., 2004; POMIN, 2010).
1.5 Estresse Oxidativo
O estresse oxidativo é caracterizado por um desequilíbrio entre a
produção de radicais livres e a capacidade de ação dos sistemas antioxidantes,
conforme exibido na figura 3 (MAYNE, 2003). No caso de um estresse oxidativo
leve, as células reagem à situação, aumentando a produção de defesas
antioxidantes, tentando restabelecer o equilíbrio. No entanto, quando essas espécies
são produzidas de forma acentuada, e os mecanismos de defesa são incapazes de
neutralizá-los, elas oferecem risco à saúde, pois podem provocar danos a uma
grande variedade de biomoléculas, causando lesão celular e danos irreversíveis,
ocasionando assim, morte celular (CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007;
GUPTA; ABU-GHANNAM, 2011; WANG et al., 2011). Evidências apontam que o
estresse oxidativo está envolvido na patogênese de, pelo menos, 100 doenças
diferentes, incluindo câncer, arteriosclerose, diabetes mellitus, artrite reumatóide,
distrofia muscular, catarata e desordens neurológicas (PASSALI et al., 2015).
25
Figura 3 – Representação esquemática do estresse oxidativo
Fonte: O autor.
Os radicais livres são moléculas ou átomos simples que têm pelo menos
um elétron desemparelhado externo à sua órbita. Isto resulta em instabilidade
eletrônica e confere às espécies radicalares a capacidade de extrair elétrons de
biomoléculas para completar seu orbital (figura 4). Desta ação, resultam as ações
deletérias dos radicais livres frente às moléculas orgânicas, sobretudo lipídios
celulares, proteínas e bases nucléicas (FANG ; YANG; WU, 2002; FERNANDES et
al., 2012; SOLOMONS; FRYHLE, 2001; VALKO et al., 2006).
Figura 4 – Representação esquemática de estabilização de radical livre
Fonte: O autor.
26
A geração de radicais livres constitui, por excelência, um processo
natural, contínuo e fisiológico, cumprindo funções biológicas relevantes. Durante os
processos metabólicos, esses radicais atuam como compostos intermediários para a
transferência de elétrons nas várias reações bioquímicas. Sua produção, em
proporções adequadas, possibilita a geração de ATP (energia) por meio da cadeia
transportadora de elétrons; fertilização do óvulo; ativação de genes; e participação
de mecanismos de defesa durante o processo de infecção. Porém, a produção
excessiva dessas espécies pode conduzir a danos oxidativos (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997; SHAMI; MOREIRA, 2004).
A respiração mitocondrial é a principal fonte geradora de radicais livres
(figura 5). Neste processo, o oxigênio é o aceptor final dos elétrons oriundos dos
nutrientes e são coletados sob a forma de NADH e FADH2 através de reações redox.
Durante este evento, prótons são bombardeados para o espaço intermembranar da
mitocôndria, gerando energia para a síntese de ATP. Porém, elétrons podem
escapar de determinados sítios (Complexo I e coenzima Q), provocando a redução
univalente de O2 (AUGUSTO, 2006; GREEN; BRAND; MURPHY, 2004).
Figura 5 – Cadeia transportadora de elétrons (respiração mitocondrial)
Fonte: Augusto (2006).
27
Quanto a essas espécies reativas, as moléculas derivadas do
metabolismo do oxigênio são denominadas espécies reativas de oxigênio (EROs).
Já as provenientes do metabolismo do nitrogênio são denominadas espécies
reativas de nitrogênio (ERNs) (SILVA et al., 2011). As EROs podem ser produzidas
por outros fatores, por exemplo, mediadores de carcinogêneses (BANERJEE;
DASGUPTA; DE, 2005) e fontes exógenas, tais como: dieta desequilibrada, excesso
de álcool, tabaco e poluição atmosférica (OLIVEIRA; SCHOFFEN, 2010).
As principais espécies reativas de oxigênio são ânion superóxido (O2•ˉ),
radical hidroxila (HO•), radical peroxila (ROO•), peróxido de hidrogênio (H2O2),
hidroperóxido orgânico (HOO•), oxigênio singlete (1O2) e ozônio (O3) (SILVA;
CERCHIARO; HONORIO, 2011). Essas espécies dividem-se em radicalares e não-
radicalares. As espécies radicalares são: oxigênio (O2), ânion superóxido (O2•ˉ),
radical hidroxila (HO•), radical peroxila orgânico (ROO•), radical alcoxila (RO•) e
radical hidroperoxila (HOO•). As espécies não-radicalares, por sua vez, são
formadas pelas espécies: peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlete (1O2),
ozônio (O3) e ácido hipocloroso (HOCl) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006).
Quando o O2 aceita um elétron, ele se torna um radical ânion chamado
superóxido (O2•ˉ) que não atravessa as membranas biológicas e tem baixa
reatividade com biomoléculas, porém ele pode reagir com outros radicais e com
grupamentos ferro-enxofre de proteínas (HALLIWELL E GUTTERIDGE, 2006;
SOLOMONS; FRYHLE, 2001). O superóxido tanto é envolvido em papéis
fisiológicos positivos, como negativos (SOLOMONS; FRYHLE, 2001). O H2O2, por
sua vez, é pouco reativo, porém é uma molécula difusível entre membranas. O H2O2
reagindo com O2•ˉ, origina HO• através da reação de Fenton (figura 6) (BARREIROS;
DAVID, 2006).
Figura 6 - Reação de Fenton
Fonte: Almeida (2014).
28
O radical HO• é o mais deletério ao organismo, pois é altamente reativo e
não há enzimas com capacidade de catalisar sua remoção, além de inativar
proteínas ao oxidar seus grupos sulfidrilas e pontes dissulfeto, além de iniciar o
processo de peroxidação lipídica (VALKO et al., 2007). É formado no organismo
principalmente por dois mecanismos: reação de H2O2 com metais de transição
(reação de Fenton) e homólise da água por exposição à radiação ionizante (figura
7). Este radical frequentemente reage com moléculas por abstração de hidrogênio e
adição à insaturações. O ataque intensivo e freqüente deste radical podem originar
mutações no DNA e, consequentemente, levar ao desenvolvimento de câncer em
seres humanos no período de 15 a 20 anos (BARREIROS; DAVID, 2006;
HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1992).
Figura 7 – Reação de homólise da água
Fonte: Barreiros e David (2006).
O radical hidroperoxila, formado a partir da protonação do ânion
superóxido, pode reagir com ácidos graxos e acredita-se ser o responsável pela
peroxidação de lípidos LDL. Quanto à formação de oxigênio singlete, não há
evidências de que ocorra sob condições fisiológicas, acredita-se que seja originário
de sistemas de peroxidação lipídica, já o radical peroxila orgânico é formado a partir
das reações em cadeia das espécies radicalares de oxigênio com ácidos graxos
(LOSADA, 1998).
As principais espécies reativas de nitrogênio são óxido nítrico (NO),
peroxinitrito (ONOOˉ), ácido peroxinitroso (HOONO) e dióxido de nitrogênio (NO2). O
óxido nítrico (NO•) é uma espécie reativa de nitrogênio sintetizada em diversas
células através da enzima óxido nítrico sintase, que converte o aminoácido L-
arginina a NO• + L- citrulina, outro aminoácido. É um radical abundante que age em
diversos processos biológicos (VASCONCELOS et al., 2007) e é rapidamente
H2O HO• + H•
Luz UV
29
metabolizado a produtos estáveis, nitrato e nitrito, na maioria dos fluidos do corpo,
inclusive no plasma (RADI et al., 2001).
Um aspecto marcante do óxido nítrico (NO•) é a sua capacidade de ser
benéfica ou potencialmente tóxica, em condições de estresse oxidativo, conforme a
concentração ou depuração tecidual (DUSSE; VIEIRA; CARVALHO, 2003). É
responsável por exercer diversas funções fisiológicas, sendo também um importante
mensageiro intercelular nos mamíferos superiores. Pelas suas características
químicas de alta difusibilidade, a sinalização do NO• é exercida diretamente em nível
intracelular, sem receptores transmembranosos. Devido à sua penetração
intracelular sem intermediários membranosos, o organismo utiliza o NO• em funções
fisiológicas em que é necessária uma resposta rápida (SCMIDT; WALTER, 1994).
Realiza também importantes funções no sistema imunológico, como controle de
doenças infecciosas, auto-imunes, tumores e doenças degenerativas crônicas
(BOGDAN, 2001). Em células endoteliais, desempenha um papel significante no
controle cardiovascular, como modulador da resistência vascular periférica e
agregação plaquetária, possuindo também a função de neurotransmissor e de
mediador de processos inflamatórios (GALVÃO; CARVALHO, 2014).
A reação do NO• com O2• gera o peroxinitrito (ONOO-), conforme a reação
exibida na figura 8. Essa espécie reativa de nitrogênio (ERN) é muito tóxica e oxida
diversas moléculas biológicas, inclusive a grupos S-H das proteínas, provocando
hidroxilação e nitração de compostos aromáticos. (STOREY, 2005). Sendo este
ONOO- capaz de reagir com o H+ e gerar •OH, a ERO mais reativa ao organismo
(SILVA; CERCHIARO; HONÓRIO, 2011). A exposição de NO• ao oxigênio ou a
protonação do peroxinitrito produz o dióxido de nitrogênio (NO2•) que é um potente
iniciador da peroxidação lipídica em fluidos biológicos (VASCONCELOS et al.,
2007).
30
Figura 8 – Reação de produção do peroxinitrito
O2•ˉ + NO ONOO-
Fonte: Storey (2005).
A peroxidação lipídica é uma consequência do estresse oxidativo, sendo
os ácidos graxos poliinsaturados os alvos moleculares mais importantes das EROs
devido a sua abundância nas células e sua susceptibilidade pela presença de
grupos metilênicos entre duplas ligações (HALLIWELL; CHIRICO, 1993). Essa
susceptibilidade ocorre porque a extração de um átomo de hidrogênio desses
grupos metilênicos produz um novo radical que pode reagir com o oxigênio em uma
reação de cadeia denominada auto-oxidação. Esse tipo de reação só é inibido na
presença de antioxidantes que podem capturar os radicais peroxila rapidamente,
reagindo com eles para formar radicais estabilizados que não continuam a cadeia de
reações (SOLOMONS; FRYHLE, 2001).
A peroxidação de ácidos graxos pode gerar hidroperóxidos através de
uma reação em cadeia (figura 9), demonstrando a habilidade de um único radical
propagar reações bioquímicas deletérias (VERMEULEN; VAN BOCKSTAEZE;
BERNEMAN, 2003). Os hidroperóxidos também podem gerar produtos não
radicalares menos reativos como aldeídos, cetonas e epóxidos que, em pontos mais
distantes do local de formação, podem se ligar covalentemente a grupos
nucleofílicos presentes em DNA, peptídeos e proteínas, causando modificações nas
funções dessas biomoléculas (GUARATINI; MEDEIROS; COLEPICOLO, 2007;
LOUREIRO; DI MASCIO; MEDEIROS, 2002).
31
Figura 9 - Representação das fases da peroxidação lipídica (LH: ácido graxo insaturado; L˙: radical lipídico; LOO˙: radical peroxila e LOOH: hidroperóxido lipídico)
Fonte: Almeida (2014).
A lipoperoxidação em membranas biológicas leva à perda das funções da
membrana celular, mudanças na fluidez, transtornos da permeabilidade, inativação
de receptores de membrana e enzimas, perda da seletividade para entrada e saída
de nutrientes e substâncias tóxicas à célula (BARBER; HARRIS, 1994; HALLIWELL;
CHIRICO, 1993). A peroxidação lipídica é a maior fonte de produtos citotóxicos,
como o 4-hidroxinonenal e malondialdeído (MDA), que contribuem para a toxicidade
e perda da sinalização celular (LIMA; ABDALLA, 2001).
O DNA é outra molécula-alvo que pode ser danificada por inúmeras
fontes, tais como EROs e ERNs, produtos da peroxidação lipídica e alguns fatores
ambientais e mutagênicos (LOUREIRO; DI MASCIO; MEDEIROS, 2002).
Modificações no DNA são potencialmente mutagênicas, aumentando a incidência de
câncer e doenças degenerativas, acelerando também o processo de envelhecimento
(KIM et al., 2004). O dano a proteínas também pode ocorrer pelo ataque direto de
ERO/ERN ou por produtos da lipoperoxidação, por exemplo, o malondialdeído
(MDA) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006).
Nesse contexto, os sistemas biológicos tiveram que desenvolver
mecanismos de defesa para eliminar estes radicais e assim protegerem-se. Estas
defesas que mantêm o equilíbrio redox nas células podem dividir-se em enzimáticas
e não enzimáticas. As defesas enzimáticas mais relevantes são: a superóxido
dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (KRISHNAMURTHY;
WADHWANI, 2012). Existem outras moléculas antioxidantes não enzimáticas, que
32
podem ser produzidas pela própria célula (coenzima Q, ácido úrico, bilirrubina, etc)
ou obtidas pela dieta (algumas vitaminas, minerais e compostos fenólicos)
(BARREIROS; DAVID, 2006; CERQUEIRA; MEDEIROS; AUGUSTO, 2007;
WAHLQVIST, 2013).
Os antioxidantes, quer sejam naturais ou sintéticos, possuem elevada
estabilidade oxidativa em função de sua estrutura molecular, e por isso
desempenham papel fundamental na prevenção à oxidação de substâncias. Sendo
assim, os antioxidantes são definidos como compostos que possuem a capacidade
de proteger os sistemas biológicos contra os efeitos, potencialmente, nocivos de
processos ou de reações que causam excessiva oxidação nas células vegetais e
animais (AUST et al., 2001; REN et al., 2014; VASCONCELOS et al., 2007).
A enzima superóxido dismutase (SOD), considerada a primeira linha de
defesa contra o ânion superóxido, é responsável por sua dismutação, que resulta na
formação de peróxido de hidrogênio (figura 10) (ORTIZ et al., 2013; REUTER et al.,
2010). Nos sistemas eucariontes existem duas formas de SOD. A forma SOD-
cobrezinco que está presente principalmente no citosol, enquanto que SOD-
manganês está localizada primariamente na mitocôndria (ACHARYA et al., 1991).
Estas enzimas estão amplamente distribuídas no organismo e apresentam
diferentes isoformas.
Figura 10 – Reação de dismutação do ânion superóxido
Fonte: Reuter et al. (2010).
A enzima catalase (CAT) encontra-se predominantemente localizada em
uma estrutura celular, o peroxissomo. Está presente em grande quantidade em
hepatócitos e eritrócitos, e sua ação consiste em converter o peróxido de hidrogênio
em água e oxigênio (figura 11) (MASAKI; OKANO; SAKURAI, 1998). A catalase
possui quatro cadeias peptídicas, cada cadeia liga-se a um grupo heme, e cada
33
grupo heme contém um íon de ferro, sendo este a reagir diretamente com o peróxido
de hidrogênio (BEATTIE, 2007).
Figura 11 – Reação de decomposição do peróxido de hidrogênio
Fonte: Reuter et al. (2010).
A glutationa peroxidase (GPx) é uma enzima localizada no citosol e na
matriz mitocondrial que reduz o peróxido de hidrogênio através da conversão da
glutationa reduzida (GSH) em glutationa oxidada (GSSH) (figura 12). Por sua vez, a
glutationa redutase regula os níveis de GSH e a ação da glutationa peroxidase, ao
reduzir a GSSG em GSH através da oxidação do NADPH proveniente da via das
pentoses (KULBACKA et al., 2012).
Figura 12 – Reação de redução do peróxido de hidrogênio através da conversão da GSH em GSSH
Fonte: Reuter et al. (2010).
O interesse pelo estudo de substâncias com atividade antioxidante em
algas surgiu no Japão, com a busca de novos aditivos para alimentos em
substituição aos antioxidantes sintéticos hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno
butilado (BHT), que têm demonstrado potencial carcinogênico, alterações
enzimáticas e alterações lipídicas em animais (CHENG et al., 2013; KUMAR;
GANESAN; SUBBA RAO, 2008; RUPEREZ; AHRAZEM; LEAL, 2002; SOUZA et al.,
2011). Esse interesse aliado ao fato de muitas algas marinhas secas poderem ser
estocadas por longos períodos sem perigo de deterioração oxidativa despertou
também o interesse de pesquisadores em relação ao mecanismo antioxidante
presente nas algas (ROCHA et al., 2007).
34
As condições ambientais as quais as algas marinhas estão
constantemente submetidas (alta intensidade luminosa, raios UV, extremos de
temperatura, radiações ionizantes, variações de oxigênio e poluentes) sugerem que
tais organismos possuem compostos com alta atividade antioxidante, visto que
desenvolveram mecanismos de adaptação em condições ambientais estressantes.
Diversos trabalhos apontam que tal atividade deva-se aos polissacarídeos
sulfatados (COSTA et al., 2011; WANG et al., 2010; YANG et al., 2011; YE et al.,
2008).
O tecido hepático, devido suas funções metabólicas e de desintoxicação,
é um órgão que conta com uma grande quantidade de enzimas com funções
oxidativas e redutivas, entre as quais se encontram o sistema de citocromo P-450,
flavina-monooxigenases, peroxidases, hidroxilases, esterases e amidases. Sendo
essencial na regulação do metabolismo, na síntese de proteínas e de outras
moléculas, no acúmulo de glicose na forma de glicogênio, no armazenamento de
vitaminas e ferro, na degradação de hormônios e na inativação e excreção de
drogas e de toxinas (BERNE et al., 2004; BURT; JAMES, 1994; MEEKS;
HARRISON; BULL, 2000; ORMAN et al., 2011).
No processo de biotransformação, muitos compostos são metabolizados
pelo fígado que altera a sua toxicidade, reduz sua atividade e os elimina. A
exposição crônica a substâncias tóxicas geralmente resulta em alteração da função
orgânica, diminuição do tamanho do órgão e aumento do tecido conjuntivo,
causando fibrogênese que agravada pode desenvolver a cirrose hepática
(FRIEDMAN; ARTHUR, 2002).
As espécies reativas também podem provocar esteatose hepática por
peroxidação lipídica e indução de citosinas (DIEHL, 2009), o que culmina no
desenvolvimento de fibrogênese hepática (CARVALHEIRA; SAAD, 2006). Devido às
já citadas ações desintoxicantes do fígado, e a consequente repercussão sistêmica
no organismo causada pelo dano hepático, o fígado está entre os principais órgãos –
alvo ao estresse oxidativo (WOHAIEB, 1993), assim esse tecido foi escolhido no
presente estudo como órgão-alvo para a avaliação da atividade antioxidante dos
PSG.
35
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Determinar a estrutura química dos polissacarídeos sulfatados totais da
alga marinha vermelha Gracilaria caudata e verificar seu potencial antioxidante.
2.2 Objetivos Específicos
Extrair polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria caudata (PSG) por
digestão com papaína e calcular o rendimento de obtenção dos PSG.
Quantificar o teor de carboidratos, proteínas e sulfatação nos PSG.
Estimar a massa molar dos PSG através de Cromatografia de Permeação em
Gel (GPC) e determinar a estrutura química dos polissacarídeos por
Espectroscopia na região do Infravermelho com transformada de Fourier e por
Ressonância Magnética Nuclear de próton (1H) e carbono (13C).
Avaliar o efeito dos PSG quanto a sua atividade antioxidante in vitro pelos
métodos de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), de
quelação do Íon Ferroso e de formação do complexo fosfomolibdênio.
Avaliar a atividade antioxidante in vivo dos PSG em ratos induzidos ao
estresse oxidativo por 2,2’-azobis-2-amidinopropano (AAPH).
Verificar o efeito antioxidante dos PSG nos níveis de enzimas do sistema
antioxidante, Catalase (CAT) e Superóxido Dismutase (SOD), além de avaliar
o efeito dos PSG na quantificação de substratos indicativos de dano
oxidativo, nitrito e tiol, em ratos submetidos ao estresse oxidativo por AAPH.
36
3 MATERIAIS
3.1 Coleta e identificação da alga marinha
Exemplares da alga marinha vermelha G. caudata foram coletados na
Praia de Fleixeiras, município de Trairí, Ceará, Brasil, em Fevereiro/2015 durante
maré baixa. Após a coleta as algas foram transportadas em recipiente térmico em
baixa temperatura para o Laboratório de Algas Marinhas do Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular (UFC). Em seguida, as algas foram limpas de
epífitas e demais organismos incrustantes, lavadas com água e subsequentemente
armazenadas a -20 °C, para posterior utilização. Uma exsicata foi depositada no
Herbário Ficológico do Instituto de Ciências do Mar da Universidade Federal do
Ceará-Brasil (nº 02988). O aspecto macroscópico da alga e sua classificação
taxonômica podem ser observados na figura 13.
Figura 13 - Aspecto macroscópico da alga marinha vermelha Gracilaria caudata e sua classificação taxonômica
Fonte: Barros (2011).
Filo Rodhophyta
Classe Florideophyceae
Ordem Gracilariales
Família Gracilariaceae
Gênero Gracilaria
Espécie Gracilaria caudata
37
3.2 Animais
Foram utilizados, respectivamente, ratos Wistar (180-230g), no total de 6
animais por grupo (n=6) para o teste de antioxidante in vivo dos polissacarídeos
sulfatados totais (PSG) da alga marinha vermelha Gracilaria caudata em modelo de
estresse oxidativo induzido por 2,2’-azobis-2-amidinopropano (AAPH). Os animais
foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, e
receberam água e alimentação ad libitum. Todos os esforços foram realizados para
minimizar o estresse e sofrimento dos animais utilizados.
Todos os procedimentos experimentais estão de acordo com os
Princípios Éticos na Experimentação Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética
para Uso de Animais (CEUA) da Universidade Estadual do Ceará (UECE). O
protocolo experimental utilizado está aprovado sob o número 1847455/2016 do
Comitê de Ética para o Uso de Animais (CEUA) da UECE.
3.3 Soluções e reagentes
Todos os reagentes utilizados apresentavam pureza adequada. Os
reagentes e soluções utilizadas foram:
2,2’-azobis-2-amidinopropano, 2,2-difenil-1-picrilidrazila, 2,2-dimetilsilapentano-5-
sulfonado, acetato de sódio, acetona, ácido ascórbico, ácido clorídrico, ácido
etilenodiamino, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, adrenalina, água deuterada,
albumina sérica bovina, azul de comassie, brometo de potássio, catalase, cisteína,
cloreto de cetilpiridínio, cloreto de sódio, etanol, ferrozina, fosfato de potássio,
galactose, glicina, hidróxido de sódio, hidroxitolueno butilado, metanol, molibdato de
amônio, naftiletilenodiamina, nitrato de sódio, papaína, peróxido de hidrogênio,
pululana e sulfanilamida.
38
4 MÉTODOS
4.1 Extração dos polissacarídeos sulfatados
A extração dos polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria
caudata (PSG) ocorreu segundo a metodologia de Farias et al. (2000) com
modificações. Inicialmente, a alga foi despigmentada através de exposição à
insolação e aspergida com água periodicamente, em seguida, desidratada em
temperatura ambiente e macerada com triturador mecânico. Alga macerada (5 g) foi
colocada em contato com 250 mL do tampão de extração Acetato de sódio 0,1 M e
pH 5,0 contendo EDTA 5 mM e cisteína 5 mM e digerida com 17 mL e uma solução
de papaína bruta (30 mg/mL) e incubou-se a 60 ° C durante 06 horas. A mistura foi
então filtrada por uma membrana de nylon, e o filtrado foi guardado.
Os polissacarídeos sulfatados, presentes no filtrado, foram precipitados
com 16 mL de solução de cloreto de cetilpiridínio (CPC) 10%. Após 24 h, a
temperatura ambiente, a mistura foi centrifugada a 8000 × g durante 25 min a 25 °C.
Os polissacarídeos sulfatados foram lavados com 500 mL de solução de 0,05% de
CPC. Em seguida, os polissacarídeos sulfatados foram filtrados e dissolvidos em
100 mL de uma solução de NaCl-Etanol (100: 15 v/v). Os polissacarídeos de tal
mistura foram precipitados com 300 mL de etanol absoluto. Após 24 h, a 4 °C, o
precipitado foi recolhido por filtração e lavado exaustivamente com etanol a 80%
(500 mL, etanol absoluto (300 mL) e acetona (300 mL). Seguindo-se secagem por
fluxo de ar quente (60 ºC) (figura 14).
39
Figura 14 - Esquema de extração enzimática de polissacarídeos da alga vermelha Gracilaria caudata
5 g de alga seca em 250 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0), contendo EDTA 5 mM, Cisteína 5 mM e 17 mL de solução de papaína 30 mg/mL
Polissacarídeos Sulfatados Totais (PSG)
Digestão (60 °C; 06h)
Filtrado
Precipitação CPC10% (25 ºC; 24 h)
Centrifugação (8000 g; 25 ºC, 25 min)
Precipitado
Lavagem (CPC 0,05 %)
Filtração
Precipitado
Dissolução NaCl 2M: Etanol (100:15 v/v)
Precipitação Etanol P.A (4 °C; 24 h) / Filtração
Precipitado
Lavagens: 2x Etanol 80% 1x Etanol P.A 3x Acetona P.A
Secagem por fluxo de ar quente (60 °C)
Filtração
40
4.2 Rendimento
Para cálculo do rendimento dos PSG obtidos em relação ao peso da alga
seca utilizado para extração foi utilizada a seguinte equação:
Massa (g) do extrato seco obtido
4.3 Análises químicas e estruturais dos polissacarídeos sulfatados totais
4.3.1 Quantificação do conteúdo de carboidratos
A quantificação dos carboidratos totais foi realizada pelo método de
Albalasmeh; Berhe e Ghezzehei (2013). A partir de uma solução estoque de 1
mg/mL de PSG foram realizadas três diluições em proporções diferentes: 1:10, 1:20
e 1:30. Em seguida, 1 mL de cada diluição foi separado em tubos de ensaio para
posterior adição de 3 mL de ácido sulfúrico concentrado, seguido de agitação por 30
segundos. Posteriormente, a solução foi colocada em banho de gelo por 2 minutos
até atingir a temperatura ambiente, tendo em vista a mistura reacional ser bastante
exotérmica. Finalmente, foi feita a leitura de absorbância a 315 nm em um
espectrofotômetro ultravioleta (UV). Todas as concentrações foram realizadas em
triplicata (figura 15). Foi realizada a curva padrão de galactose substituindo os
polissacarídeos por uma solução de galactose (10 a 100 µg/mL), permitindo assim a
quantificação dos PSG por correlação com a curva de calibração.
Massa (g) de macroalga seca utilizada para o processo de extração
Teor de ágar % =
x100
41
Figura 15 - Esquema de quantificação do conteúdo de carboidratos
4.3.2 Quantificação do conteúdo de proteínas contaminantes
O conteúdo de proteínas contaminantes foi determinado através do
método proposto por Bradford (1976). A solução de Bradford foi realizada da
seguinte maneira: 50,0 mg de Comassie G-250 foram dissolvidos em 25,0 mL de
álcool etílico e agitada durante 1 hora em erlenmeyer envolto com papel alumínio.
Em seguida, adicionaram-se 50,0 mL de ácido fosfórico 85%. O volume foi então
aferido em balão volumétrico para um volume de 500 mL com uso de água
destilada. A solução resultante foi filtrada três vezes com papel de filtro no escuro e
armazenada em frasco âmbar à temperatura ambiente.
Foi realizada a confecção de uma curva padrão com Albumina Sérica
Bovina (BSA) através da mistura de 0,1 mL de Solução de BSA em diferentes
concentrações (5 a 50 μg/mL) com 2,5 mL de solução de Bradford. Após 10 minutos,
as soluções foram analisadas em espectrofotômetro (SPECTRONIC
INSTRUMENTS, modelo SPECTRONIC® 20 GENESYSTM) em um comprimento de
onda de 595 nm. Todas as concentrações foram analisadas em triplicatas.
Para quantificar o teor de proteínas da amostra, foram utilizadas soluções
de 1 mg/mL de polissacarídeos. A partir dessas soluções, 0,1 mL foi adicionado a
2,5 mL de solução de Bradford e após 10 minutos foram realizadas as leituras em
Solução Estoque PSG 1 mg/mL
diluições: 1:10, 1:20 e 1:30
Em tubo de ensaio (triplicata): 1 mL da diluição + 3 mL de H2SO4(conc.)
Agitação (30 seg) Resfriamento: banho de gelo (2 min)
Leitura em espectrofotômetro UV (315 nm)
42
espectrofotômetro a 595 nm. A análise foi realizada em triplicata (figura 16). A
estimativa das concentrações de proteínas foi realizada através da correlação entre
as leituras obtidas das soluções contendo as amostras e as da curva padrão de
BSA.
Figura 16 - Esquema de quantificação de proteínas contaminantes
4.3.3 Quantificação do conteúdo de sulfato e carbono
O teor de sulfato nos PSG foi determinado por espectrometria de emissão
óptica com plasma (ICP-OES). Neste método, 12 mg dos polissacarídeos foram
digeridos em 3 mL de HNO3 concentrado a 70 °C durante 1 h . Após a digestão e o
arrefecimento da solução, o volume foi ajustado para 50 mL e o teor de enxofre foi
medido num espectrómetro de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente
(ICP plasma Spectro Arcos ) a 180731 nm (KRUG, 2010). O conteúdo de carbono foi
determinado por microanálise elementar (Perkin Elmer CHN 2400).
O grau de sulfatação foi determinado baseado nos percentuais de
carbono (%C) e enxofre (%S) a partir da equação abaixo. Para a determinação do
grau de sulfatação por unidade dissacarídica repetitiva é necessário o conhecimento
da estrutura do PSG, que é formado por dissacarídeos contendo um β-D-
galactopiranose (Unid A) com outro α-L-galactopiranose ou 3,6-anidro-α-L-
galactopiranose (Unid B). Visto que o teor de sulfatação é definido como o número
de OSO3-, ou átomos de enxofre, por unidade AB, com 12 atómos de carbono, então
o número 12 multiplicado pela massa atômica do carbono corresponde ao número
de carbonos por unidade dissacarídica.
Em tubo de ensaio (triplicata):
0,1 mL solução PSG 1 mg/mL + 2,5
mL Reagente de Bradford
Tempo: 10 min
Leitura em
Espectrofotômetro (595 nm)
43
(S% / massa atômica S)
(C% / massa atômica do C x12)
4.3.4 Determinação da massa molar por cromatografia de permeação em gel
O pico de massas molares foi realizado por cromatografia de permeação
em gel (GPC) com concentração de 0,5 % de PSG e 0,1 M de NaNO3 como
solvente. A cromatografia ocorreu em equipamento Shimadzu em temperatura
ambiente usando uma coluna Ultrahydrogel linear (7,8 x 300 mm), com fluxo de 0,5
mL/min. Um refratômetro diferencial e um fotômetro de raios ultravioleta (a 280 nm)
foram utilizados como detectores e o volume de eluição corrigido para o marcador
interno de etileno glicol a 11,25 mL. Foram utilizadas amostras de pululanas (Shodex
Denko), homopolissacarídeos lineares isolados do fungo Aureobasidium pullulans
(LEATHERS, 2003) de diferentes massas molares, em intervalo de grandeza de 103
a 106 g/mol (Mw de 5,9 × 103, 1,18 × 104, 4,73 × 104, 2,12 × 105, 7,88 × e 105 g/mol),
para a construção da curva de calibração.
4.3.5 Caracterização química por espectroscopia de absorção na região do
infravermelho
Os espectros na região do infravermelho foram obtidos com
espectrômetro de Infravermelho com transformada de Fourier da Shimadzu, modelo
FTIR-8300, apresentando uma região espectral de 4000 a 400 cm-1. Pastilhas de
Brometo de Potássio (KBr) foram utilizadas para a análise da amostra.
4.3.6 Determinação da estrutura química por ressonância magnética nuclear
Os espectros de 1H e 13C uni (1D) e bidimensionais (2D) de RMN foram
realizados no Centro Nordestino de Aplicação e uso da Ressonância Magnética
Teor de sulfato % =
= 4,5 x
(C%)
(S%)
44
Nuclear (CENAUREMN) da Universidade Federal do Ceará, utilizando-se
espectrômetro Bruker Avance DRX 500. Os PSG da alga marinha Gracilaria caudata
foram dissolvidos em água deuterada D2O a 2,5% m/v. A análise dos PSG foi
realizada a 60 ºC por 12 horas, utilizando 2,2-dimetilsilapentano-5-sulfonato de sódio
(DSS) como padrão interno (0,00 ppm por 1H).
4.4 Atividade antioxidante in vitro
4.4.1 Ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo-hidrato (DPPH)
O sequestro do radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo-hidrato (DPPH) foi
avaliado de acordo com o método descrito por Blois (1958), com algumas
modificações. Esse ensaio se baseia na medição da capacidade antioxidante de
uma determinada substância em sequestrar o radical DPPH (figura 17), reduzindo-o
a hidrazina. Essa reação ocorre através da doação de átomos de hidrogênio (RH) ou
outros radicais (A•) para o radical DPPH por parte da substância antioxidante, assim
a hidrazina é obtida com mudança simultânea na coloração de violeta a amarelo
pálido (ALVES et al., 2010; BRAND-WILLIAMS; CUVELIER; BERSET, 1995).
Figura 17 - Reação de estabilização do radical livre DPPH
Fonte: Oliveira, 2015.
Para a realização do ensaio, 300 µL da amostra dos PSG nas
concentrações 0,1 mg/mL; 0,5 mg/mL; 1 mg/mL; 2 mg/mL e 4 mg/mL foram
dissolvidas e agitados em 200 µL de metanol (MeOH). Em seguida, a essas
45
soluções foram adicionadas 2,5 mL de DPPH (75 µM em MeOH) e mantidas em
temperatura ambiente no escuro por 30 minutos, em seguida, leituras de
absorbâncias foram realizadas a 517 nm (A517). Todas as reações foram realizadas
em triplicata. O mesmo método foi realizado com o controle positivo BHT para
posterior análise e comparação de resultados.
O efeito no sequestro do radical livre DPPH (%) foi calculado através da
seguinte equação:
Efeito do Sequestro DPPH (%) = [A0 – (A – Ab) / A0] x100
Em que, A0= A517 do DPPH sem amostra; A=A517 da amostra e DPPH; e Ab=A517 da
amostra sem DPPH.
4.4.2 Ensaio de quelação do íon ferroso
A ferrozina é um composto bastante utilizado na identificação e
quantificação do ferro, pois na presença de Fe2+ produz um complexo vermelho com
absorção em 562 nm. Neste complexo o Fe2+ atua como ácido de Lewis que recebe
elétrons livres dos nitrogênios da ferrozina que atuam como base de Lewis
(ligantes). Após a adição de um agente quelante, menos ferro estará disponível para
a formação do complexo e consequentemente haverá uma diminuição da
absorbância em 562 nm (SILVA, 2009).
O ensaio de quelação do íon ferroso foi realizado de acordo com o
método descrito por Chew et al. (2008), com algumas modificações. Nesta ordem,
misturou-se 1 mL de Sulfato Ferroso 0,1 mM (FeSO4), 1 mL de amostra PSG nas
concentrações 0,1 mg/mL; 0,5 mg/mL; 1 mg/mL; 2 mg/mL e 4 mg/mL e 1 mL de
Ferrozina 0,25 mM (ácido 3-(2-piridil) 5,6-difenil-1,2,4-triazina-p-p’-disulfônico). Os
tubos foram agitados em vórtex por 1 minuto. Após 10 minutos, foram realizadas
leituras em espectrofotômetro a 562 nm. Todas as reações foram realizadas em
triplicata. O mesmo método foi realizado com o controle positivo EDTA para posterior
análise e comparação de resultados.
46
Os resultados foram expressos como habilidade de quelação do íon
ferroso (%) e calculados através da seguinte equação:
Habilidade de quelação do íon Ferroso (%) = [A0 – (A – Ab) / A0] x 100
Em que, Ao= A562nm dos reagentes sem amostra; A=A562 da mistura reacional
(amostra + reagentes); e Ab=A562 da amostra sem reagentes.
4.4.3 Ensaio de capacidade antioxidante total pela formação do complexo
fosfomolibdênio
O ensaio de capacidade antioxidante total foi realizado através da
formação do complexo fosfomolibdênio descrito por Prietro; Pineda e Aguilar (1999).
Este método fundamenta-se na redução de Molibdênio (VI) para Molibdênio (V) que
ocorre na presença de determinadas substâncias com capacidade antioxidante, com
formação de um complexo esverdeado Fosfato/Molibdênio(V) em pH ácido, o qual é
determinado espectrofotometricamente a 695 nm. Brevemente, adicionou-se 300 µL
da amostra de PSG 0,1 mg/mL; 0,5 mg/mL; 1 mg/mL; 2 mg/mL e 4 mg/mL a 3 mL de
solução de molibdato de amônio 4 mM, ácido sulfúrico 0,6 M e fosfato de sódio 28
mM, homogeneizado e incubado a 95 °C durante 90 min. Após o resfriamento foram
realizadas leituras a 695 nm. O branco foi feito substituindo-se a amostra pelo
solvente utilizado para todas as amostras (água destilada). Foi utilizada uma
amostra de 400 µg/mL de ácido ascórbico como substância de referência. Para o
cálculo da capacidade antioxidante total dos PSG, o ácido ascórbico foi considerado
como 100% de atividade antioxidante. Todas as reações foram realizadas em
triplicata. Os resultados foram expressos em capacidade antioxidante total (%) e
calculados através da seguinte equação:
(A695nm amostra – A695nm branco)
(A695nm ác. ascórbico – A695nm branco) Capacidade antioxidante total (%) =
x 100
47
4.5 Atividade antioxidante in vivo
4.5.1 Estresse oxidativo induzido por AAPH
A indução do estresse oxidativo foi realizada através da injeção
intraperitoneal (dose única) de 2,2’-azobis-2-amidinopropano (AAPH). Esse
composto é constituído de moléculas pequenas que apresentam o grupo funcional
azo, que é frequentemente utilizado no estudo da peroxidação lipídica e na
caracterização de antioxidantes. O AAPH também tem sido amplamente utilizado,
como fonte de radicais livres do tipo peroxil, no estudo de oxidações de vários tipos
de tecidos e até mesmo de todo o organismo (NOGUCHI et al., 1998; TANG; LIU,
2007).
Os ratos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (n=6): grupo salina,
animais que receberam apenas solução salina via intraperitoneal sem nenhum
tratamento adicional; grupo do desequilíbrio redox induzido por AAPH, animais que
receberam apenas a dose única de solução aquosa de AAPH (40 mg/kg) via
intraperitoneal sem nenhum tratamento adicional; grupo PSG 3 mg/kg + AAPH,
animais que receberam pré-tratamento com PSG na dose de 3 mg/kg via
intraperitoneal e após 30 minutos receberam o AAPH (40 mg/kg) via intraperitoneal;
grupo PSG 10 mg/kg + AAPH, animais que receberam pré-tratamento com PSG na
dose de 10 mg/kg via intraperitoneal e após 30 minutos receberam o AAPH (40
mg/kg) via intraperitoneal. Após 18 horas, os animais foram sacrificados e os
fígados foram retirados para a realização das análises propostas.
4.5.2 Homogeneização do tecido hepático
Cada 100 mg de tecido hepático foi homogeneizado em 900 μL de
tampão (Tris-HCl 10mM, NaCl 0,9 % (p/v), pH 7.4), utilizando homogeneizador Ultra-
turrax T25. As amostras foram homogeneizadas de 3 a 4 vezes, por cerca de 10
segundos, na temperatura de 4 oC, e posteriormente, foram centrifugadas por 10 min
48
na velocidade de 720 x g a 4 oC. Após o término da centrifugação foi retirado o
sobrenadante dos eppendorfs e armazenados a -80oC até o seu uso nos ensaios.
4.5.3 Dosagem de proteína no tecido hepático
O conteudo de proteína foi determinado pelo metodo de Bradford (1976),
onde a albumina de soro bovino foi utilizada como padrão. Para a análise, o
protocolo foi adaptado para ser executado em placas de ELISA. Previamente,
alíquotas dos sobrenadantes foram diluídas em água destilada 1:50. Em seguida,
foram colocados 10 µL dessas amostras diluídas em cada poço da placa de ELISA.
Após esse procedimento, foram adicionados a cada poço 200 µL da solução de
Bradford. Depois da adição do corante, as amostras reagiram durante 5 minutos. Em
seguida, foi medida a absorbância através de um leitor de ELISA a 595 nm
(Beckman DU 640B). As absorbâncias foram gravadas e os dados foram expressos
em mg/mL.
A curva padrão foi estabelecida através do uso de Albumina Bovina
(Concentração de 0,5 mg/mL) onde foram estabelecidos 4 pontos de concentração
(0,5; 0,25; 0,125; 0,0625).
4.5.4 Determinação da atividade da catalase (CAT)
A atividade da enzima catalase foi medida através do método descrito por
Maehly e Chance (1954) que emprega a geração H2O e O2 pelo peróxido de
hidrogênio. A atividade da enzima foi medida pelo grau desta reação. Uma alíquota
dos sobrenadantes hepáticos (20 μL, homogeneizada em tampão fosfato de
potássio pH 7,4) foi adicionada a 980 μL de meio reativo (peróxido de hidrogênio –
H2O2 – a 15% em tampão Tris-HCl a 1 M e EDTA a 5 mM pH 8,0 em H2O Milli-Q).
As absorbâncias iniciais e finais foram gravadas a 230 nm (espectrofotômetro
Beckman DU 640B) durante 1 minuto. Os resultados foram expressos em
mmol/min/mg de proteína.
49
4.5.5 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD)
O ensaio tem como finalidade verificar a auto-oxidação da adrenalina
pela ação da superóxido dismutase. Primeiramente, o ensaio foi realizado com a
montagem do “branco” onde foi colocado 970 uL de tampão glicina juntamente com
10 uL de catalase e 20 uL de adrenalina, a leitura foi feita em espectrofotômetro a
480 nm durante 3 minutos em cubetas de vidro. Após essa análise, foram
adicionados 960, 950 ou 930 uL de tampão glicina respectivamente com 10, 20 ou
40 uL de uma alíquota dos sobrenadantes hepáticos com 10 uL de catalase e 20 uL
de adrenalina e imediatamente lida em espectrofotômetro a 480 nm durante 3
minutos em cubetas de vidro.
4.5.6 Determinação de nitrito
O nitrito é um marcador de espécie reativa de nitrogênio, pois o óxido
nítrico (NO˙) e rapidamente metabolizado a produtos estáveis, como nitrito e nitrato,
na maioria dos fluidos do corpo (RADI et al., 2001). O método de determinação de
nitrito mais comumente utilizado baseia-se na reação de diazotação (método de
Griess), específico para nitrito e que não detecta nitrato (THÉROND et al., 2000). O
tratamento da amostra com agentes redutores ou enzimas gera o total de produtos
em termos de nitrito, com detecção espectrofotométrica (GREEN; TANNEMBAUN;
GOLDMAN, 1981).
Para a realização do ensaio, foram usados 100 μL do reagente de Griess
(N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em água, sulfanilamida a 1% em ácido fosfórico a
5%) adicionados a 100 μL de alíquota do sobrenadante hepático ou 100 μL dos
padrões nas várias concentrações. Para o branco foram usados 100 μL do reagente
de Greiss e adicionados a 100 μL de tampão fosfato. A leitura da absorbância foi
feita em 560 nm por espectrofotometria em placa de ELISA (96 poços). As leituras
da absorbância dos padrões (y) foram plotadas contra as concentrações de cada
50
padrão (x), então foi determinada a equação da reta que foi usada para a
determinação da concentração de cada amostra.
4.5.7 Determinação do conteúdo de tiol
O conteúdo de tiol funciona como marcador de dano protéico, pois são
antioxidantes que contêm em sua estrutura o grupamento–SH (sulfidrila). Entre
estes compostos estão a glutationa, a cisteína, homocisteína e as proteínas tiólicas,
que constituem um importante tampão redox tiol-dissulfeto. Esses compostos estão
envolvidos no sequestro de radicais livres e são capazes de quelar íons metálicos
danosos, desempenhando assim um papel crucial na defesa antioxidante do
organismo (WŁODEK et al., 2010). Sabe-se que os grupos tióis combatem a fase de
propagação de reações em cadeia através da inativação de radicais peroxilas (LO•),
conforme mostra a figura 18 (PASSALI et al., 2015).
Figura 18 - Reações de inativação de radicais peroxilas
A determinação do conteúdo de tiol foi realizada segundo o método de
Ellman (1959) que determina os tióis totais da amostra. A oxidação dos tióis livres da
amostra leva à formação de pontes dissulfeto; o ácido ditionitrobenzóico (DTNB),
reagente de cor, é reduzido pelos tióis não oxidados, gerando um derivado amarelo
chamado ácido tionitrobenzóico (TNB), cuja absorção é medida
espectrofotometricamente a 412 nm. O teor de sulfidrila ligada à proteína é
inversamente proporcional ao dano oxidativo das proteínas (figura 15).
Para a realização do ensaio, 20 ul de uma alíquota do sobrenadante
hepático de cada amostra foi adicionado em 150ul de tampão + 820 ul de metanol e
Fonte: Passali et al. (2015).
51
então adicionado mais 10ul de DTNB. Para cada amostra foi feito um branco. Em
seguida, a mistura foi agitada e incubada por 15 minutos a temperatura ambiente.
Após esse período, as misturas foram centrifugadas por 15 min na velocidade de
3000g à 25 °C. Após o término da centrifugação foi retirado o sobrenadante para
leitura em espectrofotômetro a 412 nm. Esse ensaio foi realizado em duplicata para
cada amostra. Os resultados foram expressos em nmol de TNB formado por mg de
proteína.
4.6 Análise estatística
Os resultados obtidos do ensaio antioxidante in vitro foram expressos
como média±desvio padrão e analisados pelo teste de análise de variância two-way-
ANOVA com pós-teste Bonferroni. Os valores foram considerados significativos a
partir de p<0,001. O programa de estatística usado foi o GraphPadPrism 5.0.
Os resultados obtidos do ensaio antioxidante in vivo foram expressos
como media ± E.P.M. O teste ANOVA Oneway seguido de pós-teste apropriado para
as diversas comparações. As diferenças foram consideradas significantes quando
p<0,05. As análises foram realizadas usando o software GraphPad Prism versão 5.0.
52
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Rendimento
Neste trabalho foi realizada a extração de polissacarídeos sulfatados
através de digestão enzimática com papaína. A partir de 5g de massa seca da alga
Gracilaria caudata foram obtidos 1,248g de polissacarídeos sulfatados totais,
correspondendo a um rendimento de 24,96%. Esse rendimento situa-se na faixa
entre valores obtidos em outras algas do gênero Gracilaria, conforme mostra a
tabela 1.
Tabela 1 - Rendimento dos polissacarídeos sulfatados obtidos de algas vermelhas do gênero Gracilaria
Alga Referência Rendimento (%)
Gracilaria birdiae Maciel et al., 2008.
6,50
Gracilaria blodgettii Freile-Pelegrín;
Murano, 2005.
26,20 - 37,00
Gracilaria cervicornis Freile-Pelegrín;
Murano, 2005.
39,30
Gracilaria córnea Melo et al., 2002.
21,40
Gracilaria corticata Adriamanantoanina; Chambat; Rinaudo,
2007.
21,80
Gracilaria corticata Meena et al., 2008. 9,50 – 16,00
Gracilaria crassa Meena et al., 2008. 12,00 – 23,00
Gracilaria crassissima Freile-Pelegrín;
Murano, 2005.
13,10 – 30,00
Gracilaria edulis Praiboon et al., 2006
10,90
Gracilaria fisheri Praiboon et al., 2006.
13,30
53
O rendimento de polissacarídeos de algas pode ser influenciado por
diversos fatores como o tipo de espécie, a metodologia empregada na extração,
estágio de vida da alga, variações sazonais e também o habitat natural das
espécies. Esses fatores explicam a diferença de rendimentos dentro do gênero
Gracilaria conforme descrito na tabela (MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003;
ROMERO; VILLANUEVA; MONTAÑO, 2008). Esses fatores, especialmente a
metodologia empregada na extração de polissacarídeos, pode explicar a diferença
no rendimento encontrado neste estudo (24,96%), comparado ao valor de 32,8%
encontrado por Barros et al. (2013) para os polissacarídeos sulfatados da mesma
alga Gracilaria caudata obtidos por extração aquosa a 100 °C. Em geral, na extração
aquosa esperam-se maiores rendimentos de polissacarídeos, pois envolve um
número bem menor de etapas durante o processo. O resultado encontrado no
presente estudo demonstra que G. caudata é uma alga que apresenta alto
rendimento na extração enzimática de polissacarídeos.
5.2 Análises químicas e estruturais
5.2.1 Quantificação do conteúdo de carboidratos
Os PSG obtidos por extração enzimática apresentaram 85% de
açúcares totais. Esse valor é considerado alto quando comparado a outras
espécies de algas vermelhas. Em outros estudos, foi encontrado teor de açúcar
de 50,2% para Solieria filiformis (SOUSA, 2015) e 52,65% para Gracilaria debilis
(SUDHARSAN et al., 2015). A quantidade de carboidrato pode variar devido às
condições experimentais utilizadas na extração dessas moléculas (RODRIGUES
et al., 2011).
5.2.2 Quantificação do conteúdo de proteínas contaminantes
A leitura da absorbância de proteínas nas soluções dos PSG foi
correlacionada com a curva de calibração da BSA, demonstrando uma quantidade
54
de 1,0% de proteínas na amostra, indicando, desta forma, pequena contaminação
dos PSG por proteínas. Como esperado, esse teor de contaminação apresentou-se
mais baixo que o encontrado por Barros et al. (2013), que obteve 8,75% de
proteínas nos polissacarídeos sulfatados da alga G. caudata obtidos por extração
aquosa sem a utilização de enzima proteolítica no processo. Portanto, o método de
extração realizado no presente estudo demonstrou ser mais eficiente, pois a enzima
proteolítica papaína ao catalisar a quebra das ligações peptídicas nas proteínas
presentes no meio facilita a liberação dos polissacarídeos sulfatados das paredes
celulares das algas, levando a uma menor contaminação da amostra por proteínas
(PESSOA; KILIKIAN, 2005).
5.2.3 Quantificação do conteúdo de sulfato e carbono
As amostras dos PSG apresentaram 0,9% de enxofre e 29,8% de
carbono, permitindo assim calcular o grau de sulfatação do material, correspondente
a 0,14% (tabela 2). O grau de sulfatação obtido foi conforme o esperado, pois, em
geral, agaranas apresentam baixa sulfatação em sua estrutura, enquanto que
carragenanas apresentam alto grau de sulfatação (LAHAYE, 2001; USOV, 1998;
VAN DE VELDE et al., 2002).
O grau de sulfatação encontrado para os PSG de Gracilaria caudata foi
maior que o valor encontrado por Barros et al. (2013) para os polissacarídeos
sulfatados da mesma alga obtidos por extração aquosa. Em outro estudo, Maciel et
al. (2008) encontrou para os polissacarídeos sulfatados da alga marinha vermelha
Gracilaria birdiae um grau de sulfatação de 0,22%.
Tabela 2 - Análise química dos polissacarídeos sulfatados da alga G. caudata
a Determinado por método de Albalasmeh; Berhe e Ghezzehei (2013).
b Determinado por microanálise elementar utilizando fator de correção 6,25.
c Determinado por método de Bradford (1976).
Amostra Carboidratoa
(%)
Sb
(%)
Cb
(%)
Grau de
Sulfatação
Proteínac
(%)
PSG 85 0,9 29,8 0,14 1,0
55
5.2.4 Determinação da massa molar por cromatografia de permeação em gel
Os polissacarídeos, por serem polímeros naturais, são polidispersos, o
que significa que não exibem massas molares precisamente definidas, mas sim uma
média das massas molares que representa uma distribuição das espécies
moleculares quase idênticas em estrutura, mas variando de comprimento de cadeia
(STANLEY, 2006).
O perfil cromatográfico dos PSG é apresentado na figura 19. O
cromatograma mostra um único pico com volume de eluição de 8,99 mL no seu
ápice, comportando-se como um sistema homogêneo. A massa molar do pico foi
estimada em 1,2 x 105 g/mol ou 116,51 kDa. Essa massa molar está dentro de uma
faixa esperada, já que macromoléculas biológicas já são conhecidas por possuírem
alta massa molar (104 a 1010 g/mol) (CHANG, 2009). O valor encontrado foi inferior
ao dos polissacarídeos sulfatados da alga marinha vermelha G. caudata obtidos por
extração aquosa que tiveram sua massa molar estimada em 250kDa (BARROS et
al., 2013).
Figura 19 - Perfil cromatográfico dos polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria caudata em cromatografia de permeação em gel
56
5.2.5 Caracterização química por espectroscopia de absorção na região do
infravermelho
Essa é uma técnica útil na identificação de componentes funcionais em
polissacarídeos e para diferenciar entre algas produtoras de carragenanas e
agaranas (GÓMEZ-ORDOÑEZ; RUPEREZ, 2011; PEREIRA et al., 2011). O
espectro de absorção na região do infravermelho de PSG é apresentado na figura
20. As bandas características para a análise estrutural dos polissacarídeos foram
indicadas para melhor compreensão.
Figura 20 - Espectro de absorção na região do infravermelho dos polissacarídeos sulfatados totais extraídos da alga Gracilaria caudata
A análise do espectro foi possível pela comparação com dados da
literatura vistos, em resumo, na tabela abaixo (tabela 3). O espectro de absorção na
região do infravermelho dos PSG (figura 20) sugeriu bandas comuns às que são
relacionadas aos polissacarídeos de algas: 1373, 1261, 1078, 931 e 890 cm-1
(BARROS et al., 2013; MOLLET; RHAOUI; LEMOINE, 1998). A banda com número
de onda de 1078 cm-1 é atribuída ao esqueleto carbônico de polissacarídeos do tipo
galactana (MOLLET; RAHAOUI; LEMOINE, 1998; PRADO; FERNANDES; NATALE,
2003), enquanto a banda com número de onda de 931 cm-1, encontrada no espectro
57
dos PSG, é característica de açúcar do tipo 3,6-anidrogalactose (CHOPIN;
WHALEN, 1993; PRADO; FERNANDES; NATALE, 2003; ROCHAS; LAHAYE;
YAPHE, 1986).
Tabela 3 - Atribuições no espectro do infravermelho para polissacarídeos sulfatados de algas marinhas
Número de onda (cm-1
) Atribuições Referência
1380-1355 Éster Sulfato Prado; Fernandes; Natale, 2003; Rochas; Lahaye; Yaphe, 1986;
1250-1240 O=S=O (estiramento
assimétrico)
Chopin; Whalen, 1993; Prado; Fernandes; Natale, 2003; Rochas; Lahaye; Yaphe, 1986.
1080-1040 Esqueleto de galactanas
(C-O + C-OH)
Mollet; Rahaoui; Lemoine,1998; Prado; Fernandes; Natale, 2003.
930 C-O-C de 3,6-
anidrogalactose
Chopin; Whalen, 1993; Prado; Fernandes; Natale, 2003; Rochas; Lahaye; Yaphe, 1986.
900-890 C-6 de β-D-galactose Prado; Fernandes; Natale,
2003.
845-850 Galactose-4-sulfato Prado; Fernandes; Natale,
2003; Villanueva et al., 2010.
820 Galactose-6-sulfato Chopin; Whalen, 1993; Prado; Fernandes; Natale, 2003; Rochas; Lahaye; Yaphe, 1986.
740-725 C-O-C de ligação glicosídica Mollet; Rahaoui; Lemoine,
1998.
A análise do espectro de infravermelho revela que os PSG pertencem ao
grupo dos ágares, devido à banda observada com número de onda 890 cm-1
(CHRISTIAEN; BODARD, 1983; MACIEL et al., 2008; SOUZA et al., 2012), além de
evidenciar a presença de grupamentos sulfato na molécula, percebidos pelas
bandas com números de onda de 1261 cm-1 e 1373 cm-1 (CHOPIN; WHALEN, 1993;
58
LIOYD et al., 1961; SALEHI et al., 2011; SOUZA et al., 2012). A baixa intensidade
dessas bandas sugere que os PSG possuem um pequeno grau de sulfatação. Esse
resultado foi confirmado pelo grau de sulfatação (0,14) determinado por microanálise
elementar.
A região entre 800 e 850 cm-1 é usada para inferir a posição dos grupos
sulfato em polissacarídeos do tipo ágar. As bandas em 845 e 830 cm-1 podem ser
atribuídas, respectivamente, a 4-O-sulfato e 2-O-sulfato de resíduos de D-galactose,
enquanto que as bandas em 820 e 805 cm-1 podem ser atribuídas, respectivamente,
a 6-O-sulfato da unidade de L-galactose e sulfatação em C-2 de 3,6-anidro-L-
galactose (LIOYD et al., 1961; SALEHI et al., 2011; SOUZA et al., 2012).
A análise dos PSG por espectroscopia de Infravermelho sugeriu que
grupos sulfato ocorrem em C-6 dos resíduos de L-galactose, devido à presença de
um sinal de baixa intensidade na região em 825 cm-1. Os resíduos de 6-sulfato-α-L-
galactose são conhecidos por serem precursores dos resíduos de 3,6-anidro-α-L-
galactose (TALARICO et al., 2004).
Os polissacarídeos sulfatados totais de G. caudata não apresentaram
nenhum sinal resolvido em 805 e 845 cm-1 indicando a ausência de sulfatação em C-
2 de 3,6-anidro-L-galactose e no C-4 da unidade D-galactose (LIOYD et al., 1961;
MURANO, 1995).
5.2.6 Determinação da estrutura química por ressonância magnética nuclear
(RMN) de 13C e 1H
O espectro de RMN de 1H dos PSG (figura 21) revela picos em 5,14 e
4,53 ppm, indicativos de prótons anoméricos de 3,6-α-L-anidrogalactose (LA) e β-
D-galactose (G) ligado a LA, respectivamente. Já o sinal em 5,22 ppm é atribuído a
próton anomérico do resíduo L-galactose (ANDRIAMANANTOANINA; CHAMBAT;
RINAUDO, 2007; IZUMI, 1973; MACIEL et al., 2008; MURANO, 1995).
O espectro de RMN 1H também mostrou sinais resolvidos em 3,41 e 3,5
ppm, característicos de metilação, atribuídos a prótons de grupamentos metil ligados
a C-6 de β-D-galactose (G6M) e C-2 de 3,6-anidrogalactose (LA2M),
59
respectivamente. Trabalhos anteriores relatam um padrão de metilação recorrente
em diferentes espécies de Gracilaria, revelando a presença de metil éter em C-6 de
β-D-galactose (G6M) e em C-2 de 3,6-anidrogalactose (LA2M), respectivamente
(FURNEAUX; MILLER; STEVENSON, 1990; LAHAYE; ROCHAS; YAPHE, 1986).
O sinal intenso em 1,45 ppm é representativo de próton metílico do acetal
de ácido piruvico ligado nas posições C4 e C6 de β-D-galactose (BARROS et al.,
2013; LAHAYE; ROCHAS; YAPHE, 1986).
O espectro de RMN de 13C (figura 22) dos polissacarídeos sulfatados
totais de G. caudata sugeriu um padrão típico de ágar com 12 sinais, relacionados
aos carbonos oriundos da agarose (FREILE-PELEGRÍN; MURANO, 2005; USOV;
YAROTSKY; SHASHKOV, 1980). Os sinais em 102,6; 70,4; 82,4; 68,9; 75,4 e 61,5
ppm correspondem aos carbonos C (1-6) da unidade β-D-galactose (G), enquanto
os sinais em 98,5; 69,9; 80,2; 77,5; 75,7 e 69,5 ppm correspondem aos carbonos C
(1-6) da unidade 3.6-α-L-anidrogalactose (LA) (tabela 4). Sinais adicionais no
espectro sugerem a presença de grupos substituintes na estrutura repetitiva da
agarose.
O sinal em 25,7 indica a presença de acido pirúvico neste polissacarídeo
(MURANO et al., 1992). Esse resultado corrobora com os dados obtidos no
experimento de 1H RMN.
60
Tabela 4 - Assinalamentos de RMN de 1H e
13C para os PSG
Resíduo
1H deslocamento químico
(ppm)
H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 O-Me
G 4,53 3,62 3,76 4,12 3,73 3,79 nd
LA 5,14 4,12 4,53 4,65 4,56 4,12 nd
L-6S 5,22 nd nd nd nd nd nd
G6M nd nd nd nd nd nd 3,41
LA2M nd nd nd nd nd nd 3,5
13
C deslocamento químico (ppm)
C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 O-Me
G 102,6 70,4 82,4 68,9 75,4 61,5 nd
LA 98,5 69,9 80,2 77,5 75,7 69,5 69,5 nd
L-6S nd nd nd nd nd 66,7 nd
G6M nd nd nd nd nd 71,7 nd
LA2M nd nd nd nd nd nd nd
Fonte: BARROS et al. (2013); LAHAYE et al. (1989); MACIEL et al. (2008). Resíduo: Nomenclatura proposta por Knutsen et al. (1994). nd: não detectado.
A ressonância em 71,7 ppm no espectro de 13C RMN foi atribuído ao
carbono C-6 dos resíduos de β-D-galactose-6-O-metil (FREILE-PELEGRÍN;
MURANO, 2005; LAHAYE; ROCHAS; YAPHE, 1986; MURANO, 1995; USOV;
IVANOVA; SHASHKOV, 1983), porém os PSG não apresentaram sinal no espectro
de 13C RMN para resíduos de 2-O-metil-α-L-anidrogalactose.
Os PSG não apresentaram sinal em 61,7 ppm, descrito para resíduos de
4-O-metil-α-L-galactose (BIRD et al., 1987), demonstrando a ausência de
grupamentos metil nessa posição. Em adição, a falta de sinais em 97,51; 102,87 e
77,77 ppm, atribuídos a β-D-galactose-4-sulfato (ANDRIAMANANTOANINA;
CHAMBAT; RINAUDO, 2007), indica que os PSG não apresentam sulfatação em C-
4 dos resíduos de β-D-galactose. Esse resultado corrobora com os dados obtidos no
experimento de FT – IR.
O experimento de DEPT 135 de 13C (figura 23) revela a presença de dois
sinais de grupos metilênicos: 69,5 ppm para 3,6-anidro-α-L-galactose (LA) e 61,5
ppm para resíduos de galactose (G) (BARROS et al., 2013; MACIEL et al., 2008).
61
Através do espectro bidimensional de correlação heteronuclear HSQC
(figura 24) foi possível confirmar algumas atribuições de deslocamentos químicos,
permitindo associar de forma convincente importantes absorções de hidrogênios
com seus respectivos carbonos, conforme mostra a tabela 4.
Figura 21 - Espectro de RMN de 1H dos polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria caudata
62
Figura 22 - Espectro de RMN de
13C dos polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria
caudata .
poliana.002.esp
112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8Chemical Shift (ppm)
102.5
6102.2
1101.4
0
98.4
6
82.3
6
80.1
779.5
7
77.4
8
75.7
275.4
3
71.7
270.3
969.9
369.4
868.8
7
66.7
3
61.5
1
25.7
2
poliana.003.esp
102.5
3102.1
9
98.4
6
82.3
3
80.1
679.5
3
77.4
5
75.7
175.4
3
71.7
070.3
669.9
0
69.4
7
68.8
4
66.7
1
61.4
8
DEPT
13C
63
Figura 23 - Espectro de DEPT 135 dos polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria caudata
64
Figura 24 - Espectro de HSQC dos polissacarídeos sulfatados totais da alga Gracilaria caudata
De acordo com os dados espectrais e com a análise de dados da
literatura, pôde-se chegar à conclusão de que os PSG tratam-se de galactana tipo
ágar formada principalmente por repetições dos resíduos de (1→3) β-D-
galactopiranose e α (1 → 4) - 3,6-anidro-α-L- galactose (figura 25), com substituições
desses monossacarídeos por β-D-galactopiranose-6-metil (G-6M), 3,6-anidro- α-L-
galactose-2-metil (LA2M) e α-L- galactose-6-sulfato (L-6S), além de apresentarem
substituições por acetal de ácido piruvico em sua unidade de β-D-galactopiranose.
65
Figura 25 - Estrutura básica repetitiva dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Gracilaria caudata
5.3 Atividade antioxidante in vitro
5.3.1 Ensaio de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo-hidrato
(DPPH)
Os resultados demonstraram que os PSG da G. caudata apresentaram
uma inibição significativa do radical, de modo concentração-dependente (figura 26).
A concentração que apresentou melhor atividade sequestradora foi a de 4,0 mg/mL,
com taxa de eliminação de 57,9%, enquanto o controle BHT apresentou 95,7% de
taxa de eliminação para essa mesma concentração. Todas as concentrações
testadas apresentaram atividade antioxidante estatisticamente inferior ao composto
BHT, utilizado para capturar radicais e prevenir a auto-oxidação.
O sequestro do radical livre DPPH obtido nesse estudo na concentração
de 2 mg/mL (41%) foi inferior ao encontrado por Souza et al. (2012) para os
polissacarídeos sulfatados da alga vermelha Gracilaria birdiae em que na dose
avaliada de 2 mg/mL apresentaram 65% de habilidade no sequestro do radical
DPPH. Esse resultado de 41% para os PSG na concentração de 2 mg/ml mostrou-
se condizente com o resultado encontrado por Sudharsan et al. (2015) que obteve
38,6% de habilidade no sequestro do radical DPPH por parte dos polissacarídeos
sulfatados da alga vermelha Gracilaria debilis na mesma concentração de 2 mg/ml.
66
Segundo Brand-Williams; Cuvelier e Berset (1995), a interação de um
potente antioxidante com o DPPH depende, sobretudo, de sua conformação
estrutural e do número de grupos hidroxílicos disponíveis, então se acredita que o
efeito inibitório encontrado contra este radical esteja relacionado à estrutura química
dos polissacarídeos sulfatados que apresentam hidroxilas livres, favorecendo assim
a abstração dos átomos de hidrogênio. Já que compostos que possuem atividade
antioxidante interagem com o DPPH permutando os elétrons ou átomos de
hidrogênio para o radical livre, reduzindo-o (MENSOR et al., 2001).
Figura 26 - Efeito dos PSG no sequestro do radical DPPH
0,1 0,5 1 2 4 0
50
100
150BHT
PSG
45,13
23,58
93,45
25,91
95,26
31,1
95,26
41,09
95,68
57,94
Concentrações (mg/mL)
Seq
uestr
o d
e D
PP
H (
%)
5.3.2 Ensaio de quelação do íon ferroso
A atividade quelante se resume na capacidade de um composto capturar
íons metálicos presentes no meio, impossibilitando assim que o mesmo reaja com
outras substâncias. Nos seres vivos, evidências indicam que os íons metálicos
podem atuar como catalisadores na deterioração oxidativa de macromoléculas
biológicas (CHEW et al., 2008; STOHS; BAGCHI, 1995).
O ferro tem importante papel biológico (GUTOWSKI; KOWALCZYK,
2013), pois no ambiente celular, mais da metade das enzimas são metaloproteínas,
67
e uma parte delas estabelece complexos com Fe2+ ou Fe3+ (WALDRON et al., 2009).
No contexto do metabolismo aeróbico, o ferro continuamente está variando seu
estado de oxidação para produzir EROs. Enquanto este metal estiver ligado às
proteínas, tudo estará seguro, não obstante, quando desprotegido, o ferro produz
muitas espécies reativas e danosas de radicais do O2, além de radicais hidroxilas
através do estímulo da lipoperoxidação via reação de Fenton (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ +
OH- + ●OH) (GUTOWSKI; KOWALCZYK, 2013; WONG; DUCE, 2015).
A figura 27 mostra a capacidade dos PSG em quelar o íon ferroso. Os
resultados mostram que os PSG exibem excelente atividade quelante de ferro com
69,8% de quelação férrica na concentração de 4 mg/mL. Já o controle EDTA
apresentou 95,6% de quelação férrica nessa mesma concentração. A atividade
avaliada comportou-se de forma concentração-dependente. Essa capacidade de
quelação pode ser explicada pela natureza nucleofílica dos elétrons livres das
hidroxilas ou dos grupos sulfatos que estão presentes na estrutura química dos
PSG, pois em geral íons metálicos, deficientes de elétrons, interagem com
moléculas biológicas através da atração entre estas oposições de cargas (VAN
ELDIK, 1999, 2005).
A atividade de quelação férrica obtida nesse estudo (69,8%) foi maior do
que a encontrada por Sousa (2015) para os polissacarídeos sulfatados da alga
vermelha Solieria filiformis em que na mesma concentração avaliada de 4 mg/mL
encontrou apenas 42,76% de habilidade de quelação. Esse resultado mostrou-se
também superior ao obtido por Alves (2011) para os polissacarídeos sulfatados da
alga marinha vermelha Hypnea musciformis que apresentaram apenas 8% de
habilidade de quelação na concentração de 5 mg/ml.
68
Figura 27 - Habilidade dos PSG na quelação do íon ferroso
0,1 0,5 1 2 4 0
50
100
150EDTA
PSG95,59
36,04
95,56
38,02
95,69
41,39
95,66
63,3
95,63
69,76
Concentrações (mg/mL)
Hab
ilid
ad
e Q
uela
ção
Ferr
o (
%)
5.3.3 Ensaio de capacidade antioxidante total
Os PSG da G. caudata apresentaram excelente capacidade antioxidante
total, que se comportou de forma concentração-dependente, exibindo como melhor
resultado o valor de 89,1% na concentração de 4 mg/mL, mostrando-se bastante
promissor quando comparado com o ácido ascórbico (controle positivo), que foi
considerado como 100% de atividade na formação do complexo fosfomolibdênio
(figura 28). Supõe-se que a obtenção dessa alta atividade deva-se ao excesso de
elétrons livres que os polissacarídeos sulfatados apresentam em sua estrutura
química, pois atuam como agentes redutores, facilitando o processo de redução do
Molibdênio (VI) para Molibdênio (V).
Este resultado de 89,1% foi superior ao encontrado por Sousa (2015)
para os polissacarídeos sulfatados da alga vermelha Solieria filiformis em que na
concentração avaliada de 4 mg/mL foi encontrado apenas 62,46% de capacidade de
antioxidante total.
69
Figura 28 - Capacidade antioxidante total dos PSG
0,1 0,5 1,0 2,0 4,00
50
100
150Ácido ascórbico
PSG100 100 100 100 100
1,41
12,23
27,33
55,61
89,08
Concentrações (mg/mL)
Cap
acid
ad
e A
nti
oxid
an
te T
ota
l (%
)
5.4 Atividade Antioxidante in vivo
5.4.1 Atividade da catalase (CAT)
O grupo que recebeu somente administração de AAPH apresentou
atividade da catalase no mesmo nível da atividade do grupo salina, no entanto, os
grupos que fizeram uso de AAPH e PSG nas doses de 3 e 10 mg/kg apresentaram
um aumento significativo da atividade da CAT em relação aos grupos AAPH e
salina. Isso demonstra que os PSG parecem ter ação na melhoria do sistema
antioxidante por meio do aumento da atividade da CAT (figura 29). Em estudo
semelhante, Qi e Sun (2015) avaliaram o efeito antioxidante dos polissacarídeos
sulfatados da alga Ulva pertusa através da atividade da catalase em ratos
hiperlipidêmicos e também encontraram aumento da atividade desta enzima nos
animais que foram suplementados com os polissacarídeos em questão. Outro
estudo que corrobora com os nossos achados é o de Zheng et al. (2016), que ao
verificar o estresse oxidativo induzido pelo AAPH de forma aguda em eritrócitos
humanos obteve resultado similar ao nosso com relação aos grupos salina e AAPH,
que não apresentaram diferença estatística. Assim, o fato do AAPH não ter induzido
70
um desequilíbrio redox, em relação ao grupo salina, parece estar relacionado à
metodologia de indução aguda.
Figura 29 – Atividade da enzima catalase (CAT) no tecido hepático Ratos foram tratados com salina (controle) e PSG (3 e 10 mg/Kg) 30 minutos antes da administração de AAPH (40 mg/Kg). O grupo controle recebeu apenas salina. Dados são expressos como média ± E.P.M (n= 6 animais). *Estatisticamente diferente da salina. #Estatisticamente diferente do AAPH. (P <0,05). Teste ANOVA One-Way.
CATALASE
Salina - 3 10
0
5
10
15Salina
3
10
PSG (mg/kg)
AAPH (40 mg/kg)
** ##
CA
T (
U/m
g p
tn)
5.4.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD)
No grupo tratado em que foi administrado somente AAPH houve uma
redução significativa da atividade da enzima SOD em relação ao grupo tratado com
salina, já no grupo AAPH pré-tratado com a dose de 3 mg/kg, os PSG foram
eficazes em impedir o decréscimo na atividade da SOD causado pelo AAPH, porém
não houve diferença estatística entre esse grupo e o grupo salina, o que sugere uma
possível proteção dos PSG (3mg/kg) impedindo a redução da atividade desta
enzima antioxidante (figura 30). Dados na literatura já demonstraram que os
polissacarídeos sulfatados da alga marinha Laminaria japonica promoveram o
71
aumento na atividade da SOD em células hepáticas de ratos submetidos ao estresse
oxidativo induzido por tetracloreto de carbono (ZHAO et al., 2004). Em estudo
anterior, comparativo entre ratos jovens e idosos, foi demonstrado que a
administração dos polissacarídeos sulfatados da alga vermelha Porphyra
haitanensis foram capazes de aumentar a atividade da SOD em ratos idosos,
dotados naturalmente de menor eficiência no sistema antioxidante enzimático
(ZHANG et al., 2004).
Figura 30 – Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) no tecido hepático Ratos foram tratados com salina (controle) e PSG (3 e 10 mg/kg) 30 minutos antes da administração de AAPH (40 mg/Kg). O grupo controle recebeu apenas salina. Dados são expressos como média ± E.P.M (n= 6 animais). *Estatisticamente diferente da salina. #Estatisticamente diferente do AAPH. (P <0,05). Teste ANOVA One-Way.
SOD
Salina - 3 100
10
20
30
40
50
10
Salina
3
-
AAPH (40 mg/kg)
PSG (mg/kg)
#
*
*
#
*
SO
D (
U/m
g d
e p
tn)
5.4.3 Determinação da concentração do nitrito
Na determinação do nitrito não houve diferença significativa entre os
grupos experimentais (figura 31), ou seja, os níveis desse marcador foram
estatisticamente os mesmos em todos os grupos estudados, o que revela a
72
inexistência do dano hepático após o desequilíbrio redox causado nos animais pela
indução de forma aguda. É possível que essa indução não tenha sido suficiente para
alterar o parâmetro analisado, pois as células do fígado possuem uma série de
mecanismos compensatórios para lidar com espécies reativas (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1984; HIRAGANAHALLI et al., 2012). Assim, faz-se necessário
avaliar o efeito subcrônico do estresse oxidativo induzido pelo AAPH no modelo
testado, a fim de comprovar a eficácia da proteção antioxidante conferida pelos
PSG.
Figura 31 – Determinação de nitrito no tecido hepático Ratos foram tratados com salina (controle) e PSG (3 e 10 mg/Kg) 30 minutos antes da administração de AAPH (40 mg/Kg). O grupo controle recebeu apenas salina. Dados são expressos como média ± E.P.M (n= 6 animais). (P <0,05). Teste ANOVA One-Way.
Nitrito
Salina - 3 10
0
100
200
300
400Salina
3
10
-
PSG (mg/kg)
AAPH (40 mg/kg)
Nit
rito
(m
M/m
g p
tn)
5.4.4 Determinação do conteúdo de tiol
Como pode-se observar na figura 32, não há diferença estatística na
determinação do conteúdo de tiol, indicando que não houve alterações no dano
oxidativo proteico dos animais suplementados com AAPH. Acredita-se que isso
73
esteja relacionado à indução aguda do estresse oxidativo. Como relata Passali et al.
(2015), o nível de tiol pode ser um marcador final, em vez de um marcador precoce,
do processo de estresse oxidativo. O resultado obtido é semelhante ao encontrado
na avaliação do estresse oxidativo através da determinação do nitrito, o que
contribui para a compreensão da resistência das células hepáticas, embora outros
tecidos possam apresentar resultados diferentes, ao dano oxidativo e reforça a
necessidade de um protocolo de indução ao estresse oxidativo sub-crônico no tecido
hepático.
Figura 32 – Conteúdo de tiol protéico no tecido hepático Ratos foram tratados com salina (controle) e PSG (3 e 10 mg/Kg) 30 minutos antes da administração de AAPH (40 mg/Kg). O grupo controle recebeu apenas salina. Dados são expressos como média ± E.P.M (n= 6 animais). (P <0,05). Teste ANOVA One-Way.
TIOL
Salina - 3 10
0
10
20
30
40Salina
3
10
-
PSG (mg/kg)
AAPH (40 mg/kg)
SH
(m
Mo
l/m
g p
tn)
74
6 CONCLUSÃO
A extração enzimática dos polissacarídeos sulfatados totais mostrou ser
um método bastante eficiente, pois os PSG obtidos apresentaram alto rendimento.
As análises químicas revelaram a presença de 85% de açúcares totais e baixa
contaminação proteica na amostra analisada. Foi possível verificar também baixa
sulfatação na estrutura química dos PSG. Através de métodos espectroscópicos, os
polissacarídeos sulfatados da alga marinha Gracilaria caudata foram identificados
como sendo galactana tipo ágar com peso molecular médio de 116,51 kDa.
Os PSG apresentaram efeito antioxidante significativo para todas as
atividades antioxidantes in vitro testadas. Baseado nos resultados da atividade
antioxidante in vivo, pode-se dizer que os PSG exibiram um efeito de melhora no
desequilíbrio redox em ratos, porém esse estresse oxidativo causado pelo AAPH foi
insuficiente para gerar dano no tecido hepático. Assim, pesquisas posteriores devem
ser realizadas no sentido de avaliar mais profundamente a ação dos PSG no efeito
subcrônico do estresse oxidativo.
75
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