1394 رﺎﻬﺑ (1) هرﺎﻤﺷ ،(4) نﺎﯾﺰﺑآ شروﺮﭘ و...

و همکاران ریم خواجويم

93

برداري و پرورش آبزیانبهره

1394 بهار، لوا م، شمارهچهارجلد http://japu.gau.ac.ir

مطالعه تأثیر برخی عوامل شیمیایی بر فعالیت آنزیم تریپسین و کیموتریپسین بچه ماهی in vitroدر محیط ) Oncorhynchus mykiss(کمان آالي رنگیننورس قزل

3فردو امین اوجی 2عباس زمانی*، 1مریم خواجوي

دانشگاه تربیت مدرس، نور، ،ارشد تکثیر و پرورش آبزیانآموخته کارشناسیدانش1 ، دانشگاه خلیج فارس بوشهراستادیار گروه شیالت3دانشگاه مالیر، ،استادیار گروه شیالت2

12/2/1394 تاریخ پذیرش:؛ 12/11/1393 تاریخ دریافت:

1چکیدهها، عوامـل اکسـید کننـده و هاي فلزي، سورفاکتانتشیمیایی شامل یون ، اثر عواملپژوهشدر این

آالي هـاي تریپسـین و کیموتریپسـین بچـه مـاهی نـورس قـزلهاي آنزیمی بر فعالیت آنزیممهارکنندهنسبت بـه نمونـه شـاهد اثـر Na+ و K+ هايکمان مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد یونرنگین

و Ca+2 هـاي). یونP<05/0( و کیموتریپسـین نداشـتند فعالیت آنزیم تریپسـین داري برکاهشی معنی2+Mg 2 هــايیــون دار وســبب افــزایش معنــی+Mn، 2+Cu، 2+Ba، 2+Co، 2+Zn،2+Fe 3 و+Al باعــث

هاي). سـورفاکتانتP>05/0دار در فعالیـت آنـزیم تریپسـین و کیموتریپسـین گردیدنـد (کاهش معنیداري در فعالیـت آنـزیم تریپسـین و کیموتریپسـین و باعث افزایش معنـیلیک و اسید تاروکو ساپونین

دار در فعالیت آنزیم کیموتریپسـین نسـبت بـه نمونـه شـاهد شـدند سدیم کوالت باعث افزایش معنی)05/0<P 05/0داري را بر فعالیت آنزیم تریپسـین نشـان نـداد (افزایش معنی سدیم کوالت) ولی>P (

دار در فعالیت آنـزیم تریپسـین و کیموتریپسـین کسیدهیدروژن باعث کاهش معنیعامل اکسیدکننده پرا). P<05/0داري مشـاهده نگردیـد () ولی در رابطه با سدیم پربورات اخـتالف معنـیP>05/0گردید ( SBTI ،PMSF هايدهمهارکنن و کیموتریپسین نسبت به نمونه شاهد در حضورآنزیم تریپسین فعالیت

[email protected]مسئول مکاتبه: *

1394 بهار) 1)، شماره (4برداري و پرورش آبزیان (بهره

94

، A ، پپاســتاتینTPCKهــاي مهارکننــده. )P>05/0(داشــت داريمعنــیمیـدین کــاهش و پاراآمینوبنزآو بتامرکپتواتانول بر روي فعالیت آنزیم تریپسین در مقایسه با نمونـه شـاهد EDTAیدواستیک اسید،

هاي در حضـور مهارکننـده تریپسـینکیموآنـزیم ). فعالیتP<05/0(داري را نشان ندادند کاهش معنیTPCK ،ستیک اسید، یدواEDTA 05/0(را نشان داد داريمعنیاهش و بتامرکپتواتانول ک<P( فعالیت .

ــده ــور مهارکنن ــین در حض ــزیم تریپس ــ TLCKآن ــیاهش ک ــان داد داريمعن ــر )P>05/0(را نش . اثبر روي فعالیت آنزیم کیموتریپسین در مقایسه بـا نمونـه شـاهد A و پپاستاتین TLCKهاي مهارکننده

).P<05/0(اري را نشان ندادند دکاهش معنی

کمان، عوامل شیمیایی، تریپسینآالي رنگینبچه ماهی نورس، قزل کلیدي: هايواژه

مقدمه مواد افزایش مسئلههاي آبی خصوص محیطهمحیطی بي زیستهاینگران ترینمهمز ا یکیامروزه

مواد کارخانجات، معدنی و یآل مواد هايپساب نفت، نشت فاضالب، صورتبه که باشدمی آالینده مختلف اشکال به جهان هايآب آلودگی موجب که بوده فلزات شبه و فلزات از اعم گوناگون شیمیایی

از جمله آبزیان زنده موجودات حیات بر غیرمستقیم یا مستقیم اتاثرتوانند می هاآلودگی . اینشوندمیفیزیولوژیک بدن ماهیان تابع عوامل شیمیایی و هاي فعالیت ).2009داشته باشند (ناجی و همکاران،

تواند بر عملکرد رشد و تولیدمثل باشد و میها میزیست آنهمچنین مواد غذایی موجود در محیط). امروزه با توجه به 2012؛ قوتی و همکاران، 2003ها تأثیرگذار باشد (شاهسونی و همکاران، آن

ها در آبزي پروري، بررسی تأثیر این ترکیبات بر و نقش آنها به انواع ترکیبات شیمیایی آلودگی آبشود. از مهمترین این ترکیبات هاي گوارشی مهم ارزیابی میهاي فیزیولوژیک از جمله آنزیمشاخص

هاي آنزیمی اشاره ، عوامل اکسید کننده و همچنین مهارکننده1هاهاي فلزي، سورفاکتانتتوان به یونمیها هاي ذاتی آنزیمتوانند ویژگیهستند که می 2معموالً ترکیباتی آلی و آمفیفیلیک هانمود. سورفاکتانت

مانند ساختار دوم و سوم را با اتصال به آنزیم تحت تأثیر قرار داده و در نتیجه بر توانایی کاتالیزوري توانند با می عوامل اکسیدکننده ترکیباتی هستند که ).2012، کانجاپو و روزن(گذار باشند ها تأثیرآن

1- Surfactant 2- Amphiphilic


95

ها شوند. بسیاري از ها واکنش داده و با جذب الکترون باعث اکسیدشدن آنهاي تیول در آنزیمگروهشوند که این واکنش ها میهاي آزاد باعث اکسیدشدن آنزیمعوامل اکسید کننده قوي با تشکیل رادیکال

شود به دناتوره شدن پروتئین میرابتدا با جذب اتم هیدروژن موجود در کربن آلفا صورت گرفته و منج ).2010 ؛ فینگان و همکاران،1996(روبینگ،

عنوان الکتروفیل یا نوکلئوفیل و از طریق پیوندهاي کئوردینانس، آنزیم و توانند بههاي فلزي مییونها در بستگی به توانایی آن طور عمدهبهها ولی ویژگی یون نزدیک نمایندسوبسترا را به یکدیگر

تواند محیط هیدراتاسیون آنزیم و فعالیت کاتالیزوري آن را ها داشته و میصالح ساختار آبی آنزیما .)1999گالسکر و همکاران، دهد (تحت تأثیر قرار

هایی هستند که با آنزیم واکـنش داده و مـانع عملکـرد طبیعـی آن ها آنزیمی نیز مولکولمهارکنندههـاي گوارشـی بـدن در بـین آنزیمبرخی مواد غذایی وجود دارند. هاي آبی و در شوند و در محیطمی

ثرتري در گـوارش ؤویـژه تریپسـین و کیموتریپسـین از نقـش مـهروده بـ 1زهايیناماهیان، سرینوپروتئهمـراه ها اسید آمینه سـرین بـهدر جایگاه فعال این آنزیمها برخوردارند. نترکیبات پروتئینی و هضم آ

گارسـیا کـارنو،( و آسپارتیک نقش اصلی فعالیـت کاتـالیزوري را بـر عهـده دارد آمینه هیستیدیناسیدوارش تواند تحت تأثیر عوامل شیمیایی قرار گرفته و بر میـزان گـها میمیزان فعالیت این آنزیم. )1992

ها تأثیرگذار باشد.پروتئینشـود و ن محسـوب میمهمترین گونه پرورشی سردابی در ایرا) O.mykiss(کمان آالي رنگینقزل

). با توجه به 2013تن بوده است (سازمان شیالت ایران، 143917بالغ بر 1392میزان تولید آن در سال هاي آبـی و اسـتفاده از ایـن منـابع آبـی در پـرورش مـاهی افزایش میزان ترکیبات شیمیایی در محیط

ین و کیموتریپسین و قابلیـت گـوارش هاي تریپستواند بر میزان فعالیت آنزیمآالي رنگین کمان میقزلهـدف از ایـن مطالعـه، بررسـی نقـش ویژه در مراحل آغازین رشد تأثیرگـذار باشـد. همواد پروتئینی ب

هـاي هاي آنزیمـی بـر فعالیـت آنـزیمکننده و مهارکننـده ها، عوامل اکسیدهاي فلزي، سورفاکتانتیونکمان بوده که حساسیت بیشتري به ایـن ي رنگینآالتریپسین و کیموتریپسین در بچه ماهیان نورس قزل

باشد.ترکیبات داشته می

1- Serinoproteinases


96

هامواد و روشکمان که کیسه زرده آالي رنگینعدد بچه ماهی نورس سالم قزل 40در این تحقیق تعداد :نمونه ماهی

عصاره ها کامالً جذب شده و از نظر فیزیولوژیک قادر به دریافت غذا و هضم آن بودند براي تهیه آن نزیمی مورد استفاده قرار گرفتند.آ

کمان در بافرآالي رنگینبراي تهیه عصاره آنزیمی، نمونه بچه ماهی نورس قزل :تهیه عصاره آنزیمیبه 1با نسبت NaClموالر 5/0و 2CaClموالر میلی 10 حاوي HCl ،5/7 pH -موالر تریسمیلی 50حاصله براي سوسپانسیون هموژنایرز، همگن گردید ودقیقه در حضور یخ با دستگاه 1مدت به 50

سپس محلول رویی .گردید سانتریفیوژگرم 14000 درگراد درجه سانتی 4دقیقه در دماي 45مدت ).2010و بنجاکول، (خانتافات ادامه آزمایشات انتخاب گردید عنوان عصاره خام آنزیمی برايهب

و کیموتریپسین آنزیم تریپسین براي سنجش فعالیت :نو کیموتریپسی سنجش فعالیت آنزیم تریپسینسوبستراي ) استفاده گردید. براي سنجش فعالیت آنزیم تریپسین از 1961ارالنگر و همکاران ( از روش

BAPNA)Nα–benzoyl-DL-argenine-ρ-nitroanilide-HCL ( و براي سنجش فعالیت آنزیم) SAAPNA )N-Succinyl-AlaAla-Pro-phe-ρ-nitroanilide-HCLکیموتریپسین از سوبستراي

نانومتر قرائت گردید. 410ول موج رها شده در ط ρ-nitroanilideجذب استفاده گردید.

استفاده ) 1976( بردفورد براي سنجش میزان پروتئین محلول از روش :سنجش میزان پروتئین محلول گردید.عنوان استاندارد استفاده هب mg/ ml 1 با غلظت گردید. در این روش از آلبومین سرم گاوي

کلرید کلسیم ،)KCl( کلرید پتاسیم ،)NaCl( کلرید سدیم هاي فلزياثر یون :هاي فلزياثر یون)2CaCl(، کلرید منیزیم )2MgCl(، ) 2کلرید مسCuCl(، استات روي )2)Zn(CH3COOH(، کلرید

سولفات و )4FeSOسولفات آهن (، )2CoCl( کلرید کبالت ،)2BaCl( کلرید باریم ،)2MnCl( منگنزو لو( تعیین شد و کیموتریپسین آنزیم تریپسین فعالیتبر mM2 غلظت در )SO2Al)4(3( آلومینیوم

ي با فلزهاي یونآنزیمی با نمونهبراي این منظور، ابتدا ). 2009و همکاران، جلولی ؛ 2008همکاران، سپس مخلوط حاصل از انکوباسیون با به گردید. دقیقه در دماي اتاق انکو 30 مذکور براي مدت غلظت

HCl، 8pH 20 -موالر تریسمیلی 50 در بافر BAPNAموالر میلی 1بافر ( -محلول سوبسترا HCl، 8pH -موالر تریسمیلی 50 بافردر SAAPNAموالر میلی 1/0براي تریپسین و 2CaCl موالرمیلیدرجه 37دقیقه در دماي 20 براي مدتوط شده و مخل )براي کیموتریپسین 2CaCl موالرمیلی 20


97

روش سنجش نمونه شاهد نیز . انجام شد nm410سپس قرائت نوري در طول موج گرفت. قرارگراد سانتیو آنزیم تریپسیننسبی همانند نمونه آنزیمی بود فقط نمونه شاهد فاقد یون فلزي بود. سپس فعالیت

بر اساس فرمول زیربه فعالیت نمونه شاهد هاآنزیم تصاصیاخ از طریق نسبت فعالیت کیموتریسپسین :گزارش گردید صورت درصدهب

100× هاي فلزيفعالیت اختصاصی آنزیم در حضور یون

= فعالیت نسبی (درصد) فعالیت اختصاصی آنزیم در نمونه شاهد

میکرولیتر از نمونه آنزیمی 20 براي بررسی اثر این ترکیبات، :و عوامل اکسیدکنندهها سورفاکتانتاثر تـا حصـول غلظـت 3سدیم کوالت و 2، اسید تاروکولیک1ساپونینهاي سورفاکتانتمیکرولیتر از 20 با

1 بـا غلظـت نهـایی 4سـدیم پربـوراتشامل ترکیب شد. همچنین عوامل اکسیدکننده درصد 1 نهایینزیمی ترکیب شدند. سپس عمـل آنیز با نمونه درصد 15با غلظت نهایی 5روژندیهو پراکسید درصد

میکرولیتر از ایـن 25انجام شد. سپس گراد درجه سانتی 40ساعت در دماي 1 انکوباسیون براي مدتموالر میلی 50 در بافر BAPNAموالر میلی 1بافر ( - محلول سوبسترابا و را برداشته شدهانکوبه ترکیب 50بـافردر SAAPNAمـوالر میلـی 1/0سین و براي تریپ 2CaCl موالرمیلی HCl، 8pH 20 -تریسبراي مـدت مخلوط شده و )براي کیموتریپسین 2CaCl موالرمیلی HCl، 8pH 20 -موالر تریسمیلی

نـانومتر 410قرار گرفت. سپس قرائت نـوري در طـول مـوج گراد درجه سانتی 37دقیقه در دماي 20 این ترکیبـاتآنزیمی بود فقط نمونه شاهد فاقد انجام شد. روش سنجش نمونه شاهد نیز همانند نمونه

. سـپس )1961؛ ارالنگـر و همکـاران، 2009و همکـاران، جلـولی و از آب مقطر استفاده گردید ( بودبـه فعالیـت هـاآنزیم اختصاصی از طریق نسبت فعالیت و کیموتریسپسین آنزیم تریپسیننسبی فعالیت

:گزارش گردید دصورت درصهب بر اساس فرمول زیرنمونه شاهد

ها و عوامل اکسیدکنندهسورفاکتانتفعالیت اختصاصی آنزیم در حضور ×100 فعالیت نسبی (درصد) =

فعالیت اختصاصی آنزیم در نمونه شاهد

1- Saponin 2- Taurocholic Acid 3- Sodium Cholate 4- Sodium Perborate 5- Hydrogen Peroxide


98

عنـوان هبـ )mM5( TLCK7و )SBTI6 )mM 05/0هـاي اثـر مهارکننـده :ي آنزیمیهااثر مهارکنندهــد ــین،بازدارن ــی تریپس ــدین و )PMSF8 )mM10 هاي اختصاص ــ )mM5( 9پاراآمینوبنزآمی ــوان هب عن TPCKهاي پروتئازهاي سرین، مهارکننده

10 )mM5( عنـوان مهارکننـده اختصاصـی کیموتریپسـین، هب 12عنوان مهارکننده اختصاصی پروتئازهاي آسـپارتیک، یدواسـتیک اسـیدهب )A11 )mM01/0 پپاستاتین

)mM1( یستئین، عنوان مهارکننده پروتئازهاي سهبEDTA13 )mM2( عنوان مهارکننده متالوپروتئازها هببـر فعالیـت آنـزیم ) S-S(سـولفید عنوان یک عامل احیاکننده پیوند ديهب )mM 5( 14و بتامرکپتواتانول

هـا آنزیمی با مهارکننده نمونهارزیابی قرار گرفت. براي این منظور، ابتدا موردو کیموتریپسین تریپسین -محلول سوبسـترا دماي اتاق انکوبه گردید. سپس مخلوط حاصله از انکوباسیون با دردقیقه 15براي بـراي 2CaCl موالرمیلی HCl، 8pH 20 -موالر تریسمیلی 50 در بافر BAPNAموالر میلی 1بافر (

HCl، 8pH 20 -مــوالر تــریسمیلــی 50 بــافردر SAAPNAمــوالر میلــی 1/0تریپســین و درجـه 37دقیقـه در دمـاي 20بـراي مـدت مخلـوط شـده و )اي کیموتریپسینبر 2CaCl موالرمیلی

روش سـنجش نمونـه .انجـام شـد nm410قرار گرفت. سپس قرائت نوري در طول مـوج گراد سانتی؛ 2010 و بنجـاکول، (خانتافات شاهد نیز همانند نمونه آنزیمی بود فقط نمونه شاهد فاقد مهارکننده بود

از طریـق نسـبت و کیموتریسپسـین آنـزیم تریپسـیننسبی سپس فعالیت ). 1961و همکاران، ارالنگرگـزارش صـورت درصـدهبـ بر اساس فرمـول زیـربه فعالیت نمونه شاهد هاآنزیم اختصاصی فعالیت : گردید

100× هاي حاوي مهارکنندهفعالیت اختصاصی آنزیم در نمونه

= فعالیت نسبی (درصد) مونه شاهدفعالیت اختصاصی آنزیم در ن

1- Soybean trypsin inhibitor 2- N-tosyl-L-Lysine Chloromethyl Keton 3- Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride 4- ρ-Aminobenzamidine 5- N-tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone 6- Pepstatin A 7- Iodoacetic acid 8- Ethylenediaminetetraacetic acid 14- ß, mercaptoethanol


99

اسمیرنوف استفاده - ها از آزمون کولموگروفدر این تحقیق، براي بررسی نرمال بودن داده :آنالیز آماريبر هاي آنزیمیها، عوامل اکسید کننده و مهارکنندههاي فلزي، سورفاکتانتیوناثر براي بررسی گردید وواریانس تجزیهآزمون از کمان آالي رنگینزلق نورس ماهیو کیموتریپسین بچه تریپسین آنزیمفعالیت

دار بودن اختالف براي تعیین معنی و استفاده گردید SPSS 17 رافزانرم تحت) ANOVA(یک طرفه هاي آنزیمیها، عوامل اکسیدکننده و مهارکنندههاي فلزي، سورفاکتانتیونبین نمونه شاهد با هامیانگین

تکرار انجام گرفت. 3در ها نیز. تمام ارزیابیتفاده شداسدرصد 5در سطح آزمون دانکن از

نتایجهاي ها، عوامل اکسیدکننده و مهارکنندههاي فلزي، سورفاکتانتیوناثر نتایج حاصل از بررسی

هايشکلکمان در آالي رنگینقزل نورس ماهیو کیموتریپسین بچه تریپسین آنزیمبر فعالیت آنزیمی آمده است. 3تا 1

بچـه مـاهی نـورس ) B( و کیموتریپسین )A( آنزیم تریپسین بر فعالیت mM 2با غلظت هاي فلزي یون ثرا -1شکل

باشد دار در فعالیت نسبی آنزیم میحروف کوچک غیرمشترك بیانگر اختالف معنی. (O.mykiss) کمانآالي رنگینقزل)05/0 = α ،3 = n ،Mn ± SD(


100

درصد) و عوامل اکسـید کننـده 1ها (سدیم کوالت، ساپونین و اسید تاروکولیک با غلظت سورفاکتانت ثرا -2شکل

و ) A( آنـزیم تریپسـین بـر فعالیـتدرصـد) 1درصد و سدیم پربورات با غلظت 15(پراکسید هیدروژن با غلظت مشترك بیـانگر اخـتالف حروف کوچک غیر. )O.mykiss( کمانآالي رنگینبچه ماهی نورس قزل) B( کیموتریپسین

)α ،3 = n ،Mn ± SD = 05/0(باشد دار در فعالیت نسبی آنزیم میمعنی

ـینبچـه مـاهی نـورس قـزل )B( و کیموتریپسین )A( آنزیم تریپسین بر فعالیتهاي آنزیمی کنندهمهار ثرا - 3شکل کمـان آالي رنگ)O.mykiss .(باشد دار در فعالیت نسبی آنزیم میمشترك بیانگر اختالف معنیحروف کوچک غیر)05/0 = α، 3 = n ،Mn ± SD(


101

کمان آالي رنگینتریپسین بچه ماهی نورس قزلو کیمو هاي فلزي بر فعالیت آنزیم تریپسینثر یونابـر فعالیـت آنـزیم تریپسـین و Na+ و K+هـاي ) نشان داده شده اسـت. اثـر یونBو A( 1در شکل

Mg+2 و Ca+2هـاي). یونP<05/0داري را با نمونه شاهد نشـان ندادنـد (کیموتریپسین اختالف معنی

نسـبت بـه نمونـه شـاهد گردیدنـد ن و کیموتریپسین داري در فعالیت آنزیم تریپسیباعث افزایش معنی)05/0<Pفعالیت آنزیم تریپسین در حضور .( 2+Mg 2 داري بیشتر ازطور معنیهب+Ca بـود)05/0<P .(

نشـان نـداد Mg+2 و Ca+2 هايداري را بین یونکه فعالیت آنزیم کیموتریپسین اختالف معنیدر حالی)05/0<P .(2هـاي یون+Mn ،2+Cu ،2+Ba ،2+Co ،2+Fe، 2+Zn 3 و+Al داري در باعـث کـاهش معنـی

کـه بـین طـوريه) بـP>05/0فعالیت آنزیم تریپسین و کیموتریپسین نسبت به نمونه شـاهد گردیدنـد (داري در فعالیت آنـزیم اختالف معنی Ba+2 و Co+2هاي و بین یون Cu، 2+Zn ،2+Fe ،3+Al+2هاي یون

، Zn ،2+Ba+2هـاي فعالیت آنـزیم کیموتریپسـین در حضـور یون .)P<05/0تریپسین مشاهده نگردید (2+Al 2هاي و در بین یون+Mn 2و+Co 05/0داري را نشان نداد (کاهش معنی>P(.

) و کیموتریپسین Aها و عوامل اکسیدکننده بر فعالیت آنزیم تریپسین (اثر سورفاکتانت 2در شکل )Bداري در باعث افزایش معنیو اسید تاروکولیک نینساپو هاي) نشان داده شده است. سورفاکتانت

و اسید تاروکولیک ساپونین) ولی بین P>05/0فعالیت آنزیم تریپسین نسبت به نمونه شاهد گردیدند (باعث افزایش فعالیت آنزیم تریپسین در سدیم کوالت). P<05/0(داري مشاهده نشد اختالف معنی

). عوامل اکسیدکننده P<05/0داري را نشان نداد (ف معنیمقایسه با نمونه شاهد گردید ولی اختالشامل پراکسید هیدروژن و سدیم پربورات باعث کاهش فعالیت آنزیم تریپسین نسبت به نمونه شاهد

داري را نشان داد که پراکسید هیدروژن در مقایسه با نمونه شاهد اختالف معنی طوريهگردیدند ب)05/0<P( که بین سدیم پربورات و نمونه شاهد اختالف معنیدر حالی) 05/0داري مشاهده نشد>P.(

داري در فعالیت باعث افزایش معنیو اسید تاروکولیک ساپونینسدیم کوالت، هايسورفاکتانتکه اسید تاروکولیک نسبت به طوري ه) بP>05/0آنزیم کیموتریپسین نسبت به نمونه شاهد گردیدند (

). P>05/0(داري بر روي فعالیت آنزیم کیموتریپسین نشان داد افزایش معنی ساپونین سدیم کوالت و). سدیم پربورات اثر P<05/0داري وجود نداشت (اختالف معنیو ساپونین سدیم کوالتولی بین

) ولی P<05/0داري بر روي فعالیت آنزیم کیموتریپسین نسبت به نمونه شاهد نشان نداد (کاهشی معنیداري داشت ید هیدروژن نسبت به نمونه شاهد بر روي فعالیت آنزیم کیموتریپسین کاهش معنیپراکس

)05/0<P.(


102

نشـان داده شـده ) B و A( 3شـکل در و کیموتریپسـین ها بر فعالیت آنزیم تریپسیناثر مهارکننده، SBTI هـايدهمهارکننـ نسبت به نمونه شاهد در حضـورآنزیم تریپسین نشان داد فعالیت نتایجاست.

TLCK ،PMSF 05/0(دارد داريمعنیو پارا آمینوبنزآمیدین کاهش<P(که بـین طوريه. بSBTI و TLCK ــی ایــن مهارکننــده داري مشــاهده نگردیــداخــتالف معنــی ــه ول ــارا PMSFها نســبت ب و پ

، A ، پپاسـتاتینTPCKهـاي مهارکننـده ).P<05/0( داري را نشـان دادنـدآمینوبنزآمیدین کاهش معنیو بتامرکپتواتانول بر روي فعالیت آنزیم تریپسین در مقایسه با نمونـه شـاهد EDTAیدواستیک اسید،

).P<05/0(داري را نشان ندادند کاهش معنی، SBTI ،PMSF هايدهمهارکنن در مقایسه با نمونه شاهد در حضورتریپسین کیموآنزیم فعالیت

را نشان داد داريمعنیکاهش و بتامرکپتواتانول EDTA، یدواستیک اسید، TPCKپارا آمینوبنزآمیدین، )05/0<P(که بین طوريه. بSBTI و PMSF ،یدواستیک اسید، و بین پارا آمینوبنزآمیدینEDTA و

A و پپاستاتین TLCKهاي مهارکننده ).P<05/0( داري مشاهده نگردیداختالف معنی بتامرکپتواتانولداري را نشان ندادند سین در مقایسه با نمونه شاهد کاهش معنیبر روي فعالیت آنزیم کیموتریپ

)05/0>P.(

بحثتوانند با جایگاه فعال آنزیم واکنش داده و هاي آنزیمی ترکیباتی شبه سوبسترا بوده که میمهارکننده

،گارسیا کـارنوو باعث غیرفعال شدن آنزیم شوند ( از اتصال سوبستراي حقیقی با آن جلوگیري نمایند محـیط با تواندکه می دارند متفاوتی بازدارندگی اتاثرماهیان مختلف هايگونه در هامهارکننده). 1992اختصاصی آنزیم هايمهارکننده .)2008و همکاران، لوباشد ( ارتباط در ماهیان ژنتیکی لیمسا و زندگی

و همچنین TPCKل و مهارکننده اختصاصی آنزیم کیموتریپسین شام TLCKو SBTIتریپسین شامل پپاسـتاتینها شـامل و سایر مهارکننده پاراآمینوبنزآمیدین و PMSF هاي پروتئاز سرین شاملمهارکننده

A ،ــید ــتیک اس ــانول EDTA، یدواس ــین و و بتامرکپتوات ــزیم تریپس ــدگی روي آن ــر مهارکنن داراي اثمطالعات انجام شده با مطالعه ایننتیجه کمان بودند. آالي رنگینکیموتریپسین در بچه ماهی نورس قزل

و همکـاران، کورتـویچ()، آزاد چینـوك 2005و همکـاران، کاسـتیلو یـانز( مـونتريساردین ماهیان در مارکوشی( تامباکویی)، 2010 و بنجاکول، خانتافات( )، سرخو2007همکاران، بوگاتف و)، ساردین (2006


103

، )2012و همکاران، کتاري( زبرا بلنی ،)2011ن، و همکارا سیلوا( ايموجارا نقره ،)2010و همکاران، ) همخوانی داشت.2014) و کیلکاي معمولی (زمانی و همکاران، 2012ماهی مرکب (بالتی و همکاران،

و کیموتریپسـین در تریپسـین آنـزیم افـزایش فعالیـت کلسیم و منیزیم باعث هاي فلزي شاملیون فعالیت آنزیم برو منیزیم هاي مربوط به اثر کلسیم یافتهد. کمان گردیدنآالي رنگینماهی نورس قزلبچه

)، ساردین2004و همکاران، کالومکالوتن ( انجام شده در ماهیان و کیموتریپسین با مطالعات تریپسین)S. melanostictus ( گرینلینــگ و)P.azonus ()و لــو)، مانــدارین (2006و همکــاران، کیشــیمورا

) و 2012، ماهی مرکب (بـالتی و همکـاران، )2012و همکاران، کتاري( لنیزبرا ب ،)2008همکارانش، هاي فلزي بر فعالیـت در ارتباط با اثر یون) همخوانی دارد. 2014(زمانی و همکاران، کیلکاي معمولیعنوان کوفاکتور در افزایش فعالیـت هتوانند بها میباید اشاره نمود که آنو کیموتریپسین آنزیم تریپسین

نقش کرده و یا در برخی موارد باعـث کـاهش فعالیـت آنـزیم شـوند کـه در ایـن بـین، ينزیمی ایفاآ و هـاي کلسـیمکه یـون طوريهثرتري بر فعالیت آنزیم تریپسین دارند بؤهاي دو ظرفیتی نقش مکاتیونفعالیـت روي از و نقـره که برخی مانند جیوه، مس،حالی شوند درمی باعث افزایش فعالیت آن منیزیم

تحـت و کیموتریپسین تریپسینهاي فعالیت آنزیم ).1953 (گرین و نوراث، نمایندآنزیم جلوگیري میو توسط لو ییجانتچنین .کاهش یافت هاي مس، روي، منگنز، باریم، کبالت، آهن و آلومینیومتأثیر یون، بـالتی و همکـاران ) در شـانک مخطـط2009، علی و همکاران (ماهی ماندارین) در 2008( همکاران

) در 2014و همکـاران ( زمـانی ،) در زبـرا بلنـی2012) در ماهی مرکب، کتـاري و همکـاران (2012( گردید.گزارش نیز کیلکاي معمولی

طور که به طوريهتوانند جریان الکترون در یک سوبسترا یا آنزیم را تغییر دهند، بهاي فلزي مییونهـاي گـروه بـههاي فلزي ممکـن اسـت یوننزیم را کنترل نمایند. ثري واکنش کاتالیز شده توسط آؤم

کربونیل و آمین زنجیره اصلی متصل شـوند، امـا اتصـال ویـژه از طریـق زنجیـره جـانبی اسـید آمینـه کربوکسیالت اسید آسپارتیک و اسید گلوتامیک و حلقه اتم نیتروژن هیسـتیدین انجـام مخصوصاً گروه

تریپتوفان (حلقـه نیتـروژن)، توان بهمیهاي فلزي جانبی براي اتصال یونهاي شود. از دیگر زنجیرهمیآسـپاراژین و ، هیدروکسـیل) )، سرین، ترئونین، تیـروزین (گـروهthioetherسیستئین (تیول)، متیونین (

محیط الکترواسـتاتیک در جایگـاه .اشاره نمود گروه آمین) گلوتامین (گروه کربونیل، و در برخی مواردزیم یک عامل عمده براي هدایت سوبسترا به جایگاه اتصال در جهت صحیح خـود اسـت کـه فعال آن


104

د نماینـ آنـزیم کمـک در نتیجه به کنتـرل عمـلشرکت نموده و این روند درتوانند هاي فلزي مییون ).1999و همکاران، گالسکر(

آالي ی نـورس قـزلها بر فعالیت آنـزیم تریپسـین و کیموتریپسـین در بچـه مـاهتأثیر سورفاکتانت تامبـاکویی)، 2009و همکـاران، جلولی( تریگر خاکستريدست آمده در ماهیان هکمان با نتایج برنگین

و کیلکـاي معمـولی (زمـانی و )2012 و همکـاران، کتـاري( ، زبرا بلنی)2009و همکاران، اسپوزیتو (هاي بـاال باعـث ها در غلظتتدهد که سورفاکتانها نشان میبررسی .) همخوانی دارد2014همکاران،

ین تغییري در ساختار آنزیم ایجاد نکرده و حتـی یهاي پاشوند ولی در غلظتها میدناتوره شدن آنزیمدلیـل تجمـع ایـن هتواند بی در فعالیت آنزیم نیز شوند. احتماال این امر مییتوانند باعث افزایش جزمی

هـاي بـاالي ي باالیی هسـتند رخ دهـد. ولـی در غلظتهایی از آنزیم که حاوي انرژترکیبات در مکانشـود دلیل دناتوره شدن ساختار آنزیم افت قابل توجهی در فعالیت آنزیم مشـاهده مـیهسورفاکتانت، ب

و کیموتریسـپین در حضـور عوامـل تریپسـینآنـزیم که یج این مطالعه نشان دادانت. )1996، روبینگ(هیدروژن) ناپایـدار بـوده و از فعالیـت آن کاسـته شـد. چنـین اکسیدکننده (سدیم پربورات و پراکسید

و همکـاران، اسـپوزیتو( تامبـاکویی)، 2009و همکـاران، جلولی ( تریگر خاکسترينتایجی در ماهیان ) نیز گزارش 2014و کیلکاي معمولی (زمانی و همکاران، )2012و همکاران، کتري( زبرا بلنی ،)2009

ماننـد پراکسـید کنندهکه بسیاري از پروتئازها در حضور عوامـل اکسـیدند اتحقیقات نشان دادهگردید. توانند عوامل اکسیدکننده، ترکیباتی هستند که می ) ناپایدار هستند.2009و همکاران، جلولی( هیدروژن

هـا واکـنش بسـیار قـوي داشـته باشـند. بسـیاري از عوامـل هـا و پروتئینهاي تیـول در آنزیمبا گروههاي آزاد باعث اکسیدشدن پروتئین شوند که این امر در ابتدا با توانند با تشکیل رادیکالمی اکسیدکننده

گیرد و سرانجام منجربه دناتوره شـدن آن جذب اتم هیدروژن موجود در کربن آلفا پروتئین صورت می ).2010و همکاران، فینگان(شود می

هاي تریپسین و کیموتریپسین فعالیت آنزیم توان بیان کرد کهدست آمده میهبا توجه به نتایج بها، عوامل اکسیدکننده و هاي فلزي، سورفاکتانتکمان تحت تأثیر یونآالي رنگینماهی نورس قزلبچه

محیطی و کنترل توجه به مسائل زیست بنابراینهاي آنزیمی در حداقل غلظت شان بوده و مهارکننده ثر باشد.ؤیان متواند در رشد بهینه بچه ماهآلودگی می


105

منابع1. Ali, N.E.H., Hmidet, N., Bougatef, A., Nasri, R. and Nasri, M. 2009. A Laundry

Detergent-Stable Alkaline Trypsin from Striped Seabream (Lithognathus mormyrus) Viscera: Purification and Characterization. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 57: 10943-10950.

2. Balti, R., Bougherra, F., Bougatef, A., Hayet, B.K., Nedjar-Arroume, N., Dhulster, P., Guillochon, D. and Nasri, M. 2012. Chymotrypsin from the hepatopancreas of cuttlefish (Sepia officinalis) with high activity in the hydrolysis of long chain peptide substrates: Purification and biochemical characterization. Food Chemistry. 130: 475-484.

3. Bougatef, A., Souissi, N., Fakhfakh, N., Ellouz-Triki, Y. and Nasri, M. 2007. Purification and characterization of trypsin from the viscera of sardine (Sardina pilchardus). Food Chemistry. 102: 343-350.

4. Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254.

5. Castillo-Yanez, F., Pacheco-Aguilar, R., Garcia-Carreno, F. and Toro, M. 2005. Isolation and characterization of trypsin from pyloric caeca of Monterey sardine, Sardinops sagax caerulea. Comparative and Biochemistry physiology B. 140: 91-98.

6. Erlanger, B., Kokowsky, N. and Cohen, W. 1961. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Archives of Biochemistry and Biophysics. 95: 271-278.

7. Esposito, T.S., Amaral, I.P.G., Buarque, D.S., Oliveira, G.B., Carvalho, L.B. and Bezerra, R.S. 2009. Fish processing waste as a source of alkaline proteases for laundry detergent. Food Chemistry. 112: 125-130.

8. Finnegan, M., Linley, E., Denyer, S.P., McDonnell, G., Simons, C. and Maillard, J.Y. 2010. Mode of action of hydrogen peroxide and other oxidizing agents: differences between liquid and gas forms. Journal of Antimicrobial Chemother. 65: 2108-2115.

9. Garcia-Carenno F.L. 1992. Protease inhibition in theoty and practice. Biotechnology Education. 3(4): 145-150.

10. Ghovati, N., Mohammadi, S. and Mohammadi, V. 2012. Assessment of hardness and alkalinity changes in comparison to toxicity of zinc in common carp (Cyprinus carpio). Journal of Talab, Islamic Azad University, Ahvaz Branch, 8:21-28.

11. Glusker, J.P., Katz, A.K. and Bock, C.W. 1999. Metal ions in biological systems. The Rigaku Journal. 16(2): 8-17.

12. Green, N.M. and Neurath, H. 1953. The effects of divalent cations on trypsin. The Journal of Biological Chemistry. 204: 379-390.

13. Iranian fisheries organization statistical yearbook. 2013. 64p.


106

14. Jellouli, K., Bougatef, A., Daassi, D., Balti, R., Barkia, A. and Nasri, M. 2009. New alkaline trypsin from the intestine of Grey triggerfish (Balistes capticus) with high activity at low temperature: Purification and characterization. Food Chemistry. 116: 644-650.

15. Khantaphant, S. and Benjakul, S. 2010. Purification and characterization of trypsin from the pyloric Caeca of brownstripe red snapper (Lutjanus vitta). Food Chemistry. 120: 658-664.

16. Kishimura, H., Hayashi, K., Miyashita, Y. and Nonami, Y. 2006. Characterization of trypsins from the viscera of true sardine (Sardinops melanostictus) and the pyloric caeca of arabesque greenling (Pleuroprammus azonus). Food Chemistry. 97: 65-70.

17. Klomklao, S., Benjakul, S. and Visessanguan, W. 2004. Comparative studies on proteolytic activities of splenic extract from three tuna species commonly used in Thailand. Journal of Food Biochemistry. 28: 355-372.

18. Ktari, N., Ben Khaled, H., Nasri, R., Jellouli, K., Ghorbel, S. and Nasri, M. 2012. Trypsin from zebra blenny (Salaria basilisca) viscera: Purification, characterisation and potential application as a detergent additive. Food Chemistry. 130: 467-474.

19. Kurtovic, I., Marshall, S.N. and Simpson, B.K. 2006. Isolation and characterization of a trypsin fraction from the pyloric ceca of chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Comparative Biochemistry and Physiology B. 143: 432-440.

20. Lu, B.J., Zhou, L.G., Cai, Q.F., Hara, K., Maeda, A., Su, W.J. and Cao, M.J. 2008. Purification and characterisation of trypsins from the pyloric caeca of Mandarin fish (Siniperca chuatsi). Food Chemistry. 110: 352-360.

21. Marcuschi, M., Espósito, T.S., Machado, M.F.M., Hirata, I.Y., Machado, M.F.M., Silva, M.V., Carvalho, L.B., Oliveira, V. and Bezerra, R.S. 2010. Purification, characterization and substrate specificity of a trypsin from the Amazonian fish tambaqui (Colossoma macropomum). Biochemical and Biophysical Research Communications. 396: 667-673.

22. Naji, T., Khara, H., Rostami, M. and Nasiri Parman, E. 2009. Effect of ammonia toxicity on the liver of common carp (Cyprinus carpio). Environmental Sciences and Technology. 11: 131-148.

23. Rosen, M.J. and Kunjappu, J.T. 2012. Surfactants and Interfacial Phenomena (4th ed.). Hoboken, New Jersey, John Wiley and Sons. 576p.

24. Rubingh, D.N. 1996. The influence of surfactants on enzyme activity. Current Opinion in Colloids and Interface Science. 1(5): 598-603.

25. Shahsavani, D., Mehri, M. and Nazari, K. 2003. Assessment of anionic detergent (shampoo) effect on hematological parameters of Carassius auratus. Journal of Pajoohesh and Sazandegi - Animal and Aquaculture. 61: 99-103.


107

26. Silva, J.F., Esposito, T.S., Marcuschi, M., Ribeiro, K., Cavalli, R.O., Oliveira, V. and Bezerra, R.S. 2011. Purification and partial characterisation of a trypsin from the processing waste of the silver mojarra (Diapterus rhombeus). Food Chemistry. 129: 777-782.

27. Zamani, A., Rezaei, M., Madani, R. and Habibi Rezaie, M. 2014. Trypsin Enzyme from Viscera of Common Kilka (Clupeonella cultriventris caspia): Purification, Characterization, and Its Compatibility with Oxidants and Surfactants. Journal of Aquatic Food Product Technology. 23: 237-252.


108

1394 رﺎﻬﺑ (1) هرﺎﻤﺷ ،(4) نﺎﯾﺰﺑآ شروﺮﭘ و...

Documents