Diagnostico da leishmaniose visceral humana

José Angelo Lauletta LindosoInstituto de Infectologia Emílio Ribas-SES-SP

Laboratório de Soroepidemiologia-LIM38 HC-FMUSP

Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo

10 SEMINÁRIO REGIONAL SOBRE LEISHMANIOSE VISCERAL

FLORIANÓPOLIS-SC

90% dos casos: Brasil, Etiopia, Nepal, Índia, Sudão e Bangladesh

Urbanização da LV no Brasil

Harhay et al. Trends in

Parasitology 2011

Distribuição de municípios do Estado de São Paulo segundo classificação epidemiológica para leishmaniose visceral americana. Dezembro/2012.

Classificação dos municípios quanto a área de transmissão de

LVA, ESP, 2010 a 2012

Sem transmissãoEsporádicaModeradaIntensa

Situação geográfica, magnitude e transcendência

Mundo Américas Brasil

76 países com casos registrados 11 países com casos registrados 5 Regiões e 21 Unidades Federadas com casos registrados

Países prioritários: Índia, Bangladesh, Sudão,Sul de Sudão, Brasil e Etiópia

Países prioritários: Brasil, Paraguai, Argentina e Colômbia

Casos esporádicos: Nicarágua, Venezuela, Honduras, Costa Rica, Bolívia

Regiões prioritárias: Nordeste, Norte e Sudeste

Média casos/ano: 0,2 a 0,4 milhões

Média de casos registrados ao ano: 3.500

Estimativa de casos: 4.500-6.800 casos/ano (Alvar, 2012)

Média de casos registrados ao ano: 3.383

Estimativa de casos: 4200-6300 casos/ano (Alvar, 2012)

20.000 a 40.000 mortes/ano Letalidade: 7% Letalidade: 6,9%

AgenteEtiológico

DOENÇA MULTIFATORIAL

Vetor Reservatório Hospedeirosusceptível

Alterações Geográficas

físicos

Fatores

humanos ou sociais biológicos

Leishmaniose Visceral

Interação

Parasito IntracelularResposta imunológica celular e

humoral do hospedeiro

Espectro clínico da doença

Imunopatogenia das Leishmanioses

FATORES DETERMINANTES DA INFECÇÃO

PARASITA

TAMANHO DO INÓCULO

FASE DE METACICLOGÊNESE

Fase de Metaciclogênese (crescimento lento)

0 5 dias

METACICLOGÊNESE

Maturação

Expressão de moléculas na sua superfície LPG

GP63VETOR

SUBSTÂNCIAS NA SALIVA

MAXADILANHOSPEDEIRO

FATOR GENÉTICO

FATORES IMUNES R. Inata

R. Adquirida

Leishmaniose

Vetor

MacrófagoDiferenciação

Progressão

da doença

Promastigotas.........Amastigotas

Órgãos

Pele

Hospedeiro

Infecção

PMN

Eo

complemento

oxLDL

Mf

CD8+

IFNg

IFNg

CD4+ TH1

TNFaIL-2

IL-12 NK

IFNg

IL-10

CD4+ TH2

IL-4IL-3

GM-CSFTGFb

IGF-IInespecífica

Específica

IL-10TNFa

Aspectos imunopatogênicos da leishmaniose visceral

Órgãos alvo

Neutrófilos

Monócitos

Hemácias Plaquetas

Alterações laboratoriais:

Anemia PlaquetopeniaNeutropenia Linfopenia

Linfonodos

Medula óssea

Fígado

Baço

Comprometimento da medula óssea edesvio na produção de outros tipos celulares

Infecção de células do sistema reticulo endotelial

Diminuição na produção dos progenitores dos

linfócitos T

Triade clássicaFebre

EmagrecimentoHepatoesplenomegalia

1 2

3

4

56

7

Comprometimento do sistema imune

Imunossupressão específica a antígenos de

Leishmania

Síndrome inflamatória sistêmica

Deficiência da imunidade efetora

Reversíveis após otratamento

Ativação imune sistêmica

Teste de Montenegro negativo

Diminuição de linfócitos T

Ativação policlonal células B

Hipergamaglobulinemia

Ativação policlonal células T

Elevados níveis de citocinas inflamatórias

1 2

3

4

5

6

77

Leishmaniose Visceral

Assintomática Oligossintomática Clássica

Sorologia

Teste de Montenegro

Hepatoesplenomegalia

+ ++ ++++

+ + ou - -

Ausente Discreta Volumosa

(Badaró et al, 1986)

FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE VISCERAL

Clássica: 5 a 10% dos

infectados por L.chagasi

Subclínica ou Oligossintomática:

sintomatologia leve. Facilmente

confundidas com processos

infecciosos de diversas

etiologias. Progressão para a

cura ou para a LV clássica.

Assintomática: infectados

sem evidência clínica.

AI: asymptomatic infection=LST+/++++ and IFAT−

SRI: subclinical resistant infection= LST+/++ and IFAT+/++

III: indeterminate initial infection=LST−and IFAT+/++

SI: symptomatic infection=LST− and IFAT+++/++++

SOI: subclinical oligosymptomatic infection=LST− and IFAT+++/++++

Crescente et al, AJTMH, 103, 2009

Perfil Clínico de LV

Silveira et al

SINAIS E SINTOMAS

SINAIS E SINTOMAS FREQUENCIA

FEBRE 98-100%

ESPLENOMEGALIA 98-100%

HEPATOMEGALIA 90-100%

LINFOADENOPATIA 30-50%

DIARRÉIA 15-35%

PALIDEZ 35-70%

ADINAMIA 80-100%

EPISTAXES 15-30%

PETÉQUIAS 20%

ICTERÍCIA 5%

Diagnóstico Laboratorial

• Exames Inespecíficos:• Hemograma

• Leucopenia

• Anemia

• Plaquetopenia

• Eletroforese de proteínas• Hipergamaglobulinemia

• Inversão da relação albumina/proteína

Diagnóstico Laboratorial

• Sorológico:• Elisa• IFI• Western blot

• Parasitológico• Pesquisa direta• Cultura: Meio NNN• Inoculação em hamster

• Molecular• PCR

Diagnóstico da Leishmaniose Visceral

• Critérios clínicos• Manifestações clínicas

• Laboratoriais• Sorologia

• IFI e ELISA

• Pesquisa e cultura

• Testes imunocromatográficos• rK 39

Diagnóstico de laboratório

Exames específicos

• Métodos diagnósticos disponíveis :

- Métodos diretos: Exame parasitológico, cultura e PCR

- Métodos indiretos: Teste Imunocromatográfico (Teste rápido), Imunofluorescência indireta (IFI) e ELISA

Diagnóstico de laboratório

Métodos diretos

Permitem a visualização do parasito na amostra obtida do paciente e incluem:

• A visualização de amastigotas no esfregaço de material obtido a partir de punção aspirativa.

• A visualização de promastigotas em cultivos de material obtido na punção aspirativa

• A detecção de material genético (ADN o ARN) do parasito por meio de técnicas como a

Reação em Cadeia de Polimerase (PCR).

Foto: Costa, JML, CPq GM-Fiocruz, Brasil

Foto: Costa, JML, CPq GM-Fiocruz, Brasil

Foto: Braz, LM, IMT-USP-SP, Brasil

Técnica: Punção aspirativa

• Procedimento invasivo

• Necessita de instalações adequadas e apoio para a realização de possíveis transfusão e

cirurgia, se houver complicações relacionadas ao procedimento;

• Requer habilidade e conhecimento técnico específico do médico

• Sensibilidade variável, quando utilizado o exame parasitológico direto:

• aspirado de baço: 93% a 99%

• aspirado de medula óssea: 53% a 86%

• aspirado de gânglio linfático: 53% a 65%

ATENÇÃO: A cultura de Leishmania aumenta a sensibilidade do diagnóstico direto

Métodos diretos

http://youtu.be/XwaiUBudFj4

Métodos diretos

• A sensibilidade dos métodos diretos é variável e depende:

• da experiência do analista e o tempo utilizado para a leitura da lâmina

•da técnica utilizada para punção aspirativa e processamento da amostra

•da condição imunológica do paciente

• Tempo de resultado do diagnóstico

• A realização do exame parasitológico direto é rápido e de amplo uso

DEMONSTRAÇÃO DO PARASITO ATRAVÉS DE EXAME DIRETO DE AMOSTRAS DE MEDULA ÓSSEA.

Solução fisiológica (salina), estéril e

gentamicina

Inoculação em animais

Diagnóstico molecular

• Gênero específico• kDNA

• Espécie específico• mannose phosphate isomerase gene (MPI)

• Distingue braziliensis, peruviana e guyanensis

• cysteine proteinase B: PCR-RFLP• brazisliensis e não braziliensis

• Gp 63: PCR-RFLP

• G6PD

• Hsp 70: PCR-RFLP

• Tempo de resultado do diagnóstico:

• o PCR é rápido, com elevada sensibilidade e de acordo com os iniciadores usados, apresenta também elevada especificidade. É mais oneroso e requer uma estrutura laboratorial mais complexa.

• o cultivo requer pelo menos 30 dias para obter o resultado

Métodos diretos

Foto: Kanashiro, EY. eMartins, T. IMT-USP-SP

Foto: Martins, T. IMT-USP-SP

Foto: Braz, LM. IMT-USP-SP

Métodos indiretos

• Se baseiam na detecção de anticorpos específicos contra Leishmania.• As técnicas disponíveis são:

• imunocromatografia - teste rápido – rK 39• imunofluorescência indireta (IFI) valores ≥ 1:80• ELISA (EIE)

• Imunocromatografia (teste rápido):

• detecta anticorpos contra o antígeno rK39• é fácil de realizar, rápido e econômico• recomendado para diagnóstico precoce devendo estar disponível em todos os níveis de atenção• sensibilidade: 84,7% (79,7 – 88,7%) e 92,0% (87,8 – 94,8%)

• especificidade: 96,8% (93,9 – 98,4%) e 95,6% (92,2 – 97,5%)•O teste rápido está validado para uso em soro.

http://youtu.be/g1mIDwiYX4w

DIRECT AGGLUTINATION TEST (DAT)

• KIT Biomedical Research, Amsterdam, The Netherlands

• Promastigotas de L. donovani

• Leishmania donovani, L. infantum or L. chagasi

• Não requer equipamento e treinamento

• Alta sensibilidade e especificidade

• Placas 96 poços fundo em V

TESTE RÁPIDO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA

(Kalazar Detect Rapid Teste – InBios)

APRESENTAÇÃO:

50 TESTES E DOIS TAMPÕES OU

25 TESTES E UM TAMPÃO

20 µl soro

2 a 3 gotas de tampão (Chase Buffer)

Linha controle Linha controleLinha teste (+)

TESTE NEGATIVO TESTE POSITIVO

TESTE RÁPIDO PARA LEISHMANIOSE VISCERAL HUMANA

(Kalazar Detect Rapid Teste – InBios)

Imunocromatografia (teste rápido):

• Interpretação dos resultados de um teste rápido rK39.• Positivo: quando a linha do controle e a linha teste estiverem presentes, o

teste é considerado reagente mesmo quando sua linha for levemente vermelha.

• Negativo: quando apenas a linha do controle estiver presente.• Inválido: quando houver ausência da linha controle

Funed: Representação Esquemática do resultado do teste rápido

Teste rápido é um teste de diagnóstico fácil de utilização ao lado do paciente.Quando positivo, pela alta especificidade, permite definir o diagnóstico de LV.Porém, pela sua sensibilidade que não é elevada, não permite descartar o diagnóstico de LV.

Métodos indiretos

• Imunocromatografia (teste rápido):

• O teste rápido está indicado para pacientes com suspeita clinica de leishmaniose visceral, de qualquer idade, proveniente de área endêmica e com os seguintes sinais e sintomas:

• Febre de qualquer duração associada à esplenomegalia• Febre de qualquer duração associada à hepatomegalia• Febre de duração igual ou superior a 14 dias, associada a qualquer citopenia

(anemia, leucopenia, plaquetopenia ou pancitopenia).

• ELISA

• detecta anticorpos anti-Leishmania

• menor especificidade

• a amostra é feita a partir da coleta de sangue, de onde se separa o soro e o plasma, que

podem ser usados para detecção dos anticorpos

• procedimento realizado em laboratório e processamento feito em espectrofotômetro a

492 nm.

• a amostra é considerada positiva quando a densidade ótica é igual ou superior a

densidade ótica média dos soros controles negativos mais dois desvios padrões

Técnicas recomendadas para o diagnóstico de leishmaniose visceral paraáreas endêmicas , segundo nível de sistema de saúde.

Nivel de lo sistema de salud Técnicas de diagnóstico

Centro de Atención Primaria

Serológico: Antígeno rK39, detectado en prueba inmunocromatográfica

Hospital Distrital o Regional

Serológico: Antígeno rK39, detectado en prueba inmunocromatográfica o

prueba de aglutinación directa *

Parasitologico: Microscopía de aspiración en la médula ósea, los ganglios

linfáticos o el bazo **

Hospital de Referencia (Atención

terciaria)

Serología : Antígeno rK39 detectado en prueba inmunocromatográfica,

prueba de aglutinación directa, otro prueba serológica (por

ejemplo, IFAT, ELISA)

Parasitologico: Microscopía de las muestras de crema leucocitaria, médula

ósea, ganglios linfáticos o bazo

Cultivo o PCR

Fuente: WHO TRS 949,2010

(*)Prueba de aglutinación directa se debe utilizar sólo si la adecuada supervisión y control de calidad

(**) Aspiración del bazo debe ser realizado únicamente por personal médico experimentado y si las instalaciones para el tratamiento de las complicaciones hemorrágicas se encuentran disponibles.

IMPORTANTE

Em decorrência do aumento da coinfecção Leishmania/HIV nos últimos anos, recomenda-se oferecer o teste de HIV a todo paciente com diagnóstico de leishmaniose visceral, tendo em vista que esta pode manifestar-se como doença oportunista em pessoas imunodeprimidas.

Projeto de pesquisa em andamento

Validação do teste imunocromatográficos rk39 em humanos utilizando sangue total e exsudado de mucosa oral (saliva).

Local LV CS CI

Campo Grande 22 2 1

Bauru 17 0 0Aracaju 27 2 -

São Paulo - - 0

Total 66 4 1

Tabela 2. Frequência de amostras positivas no teste rápido, em

amostras de soro de pacientes de LV e controles, de acordo com o

local de coleta

LV – leishmaniose visceral, CS – controle sadio, CI – controle

infectado

As quatro amostras de controle saudáveis (CS) e uma de

controle infectado (CI) reagiram fracamente (linha tênue).

Local Teste P % IC 95%

Campo GrandeN=26

TR-ST 96,15 81,11-99,32

TR-FO 84,62 66,57-93,85

TR-SO 92,31 75,86-97,86

BauruN=8

TR-ST 100,0 67,56-100,0TR-FO 62,50 30,57-86,32TR-SO 100,0 67,56-100,0

AracajuN=18

TR-ST 83,33 60,78-94,16

TR-FO* 68,75 44,00-85,84

TR-SO 77,78 54,79-91,00

TotalN=52

TR-ST 92,31 81,83-96,97

TR-FO# 76,00 62,59-85,70

TR-SO 88,46 77,03-94,60

Tabela 4. Positividade (%) e intervalos de confiança de 95% de probabilidade (IC 95%)

do teste rápido em amostras soro de pacientes com LV, de acordo com o local de coleta

Local Teste P % IC 95%Campo GrandeN=14

DAT 85,71 57,19-98,22IFI 92,86 66,13-99,82

BauruN=8

DAT 100,00 63,06-100,0IFI 87,50 47,35-99,68

AracajuN=11

DAT 100,00 71,51-100,0IFI 100,00 71,51-100,0

TotalN=33

DAT 93,94 79,77-99,26IFI 93,94 79,77-99,26

Tabela 9. Positividade (%) com intervalos de confiança de 95% de probabilidade (IC

95%) do DAT e IFI em amostras de pacientes com LV

Local Teste P % IC 95%

Campo GrandeN=5

DAT 0,00 0,00-43,45IFI 0,00 0,00-43,45

BauruN=2

DAT 0,00 0,00-65,76IFI 0,00 0,00-65,76

AracajuN=6

DAT 0,00 0,00-39,03

IFI 50,00 18,76-81,24

TotalN=13

DAT 0,00 0,00-22,81IFI 23,08 8,18-50,26

José Angelo Lauletta Lindoso

• Instituto de Infectologia Emílio Ribas – SES-SP

• 3896-1236

• Instituto de Medicina Tropical

• 3061-7023

E-mail: jlindoso@usp.br