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Ribeiro, S.F.F.
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1. INTRODUÇÃO
Ribeiro, S.F.F.
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1.1 – PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS
Peptídeos antimicrobianos são moléculas de baixa massa molecular com uma
vasta atividade inibitória contra bactérias, vírus e fungos (Izadphanah e Gallo, 2005).
Pertencem a um grupo diverso e abundante de moléculas que são produzidas por
diversas células, tanto em plantas quanto em animais, e que são agrupadas de acordo
com a sua atividade antimicrobiana intrínseca (Gallo et al., 2002; Brogden, 2005).
Uma característica comum a estes peptídeos é a presença de resíduos de
cisteínas em número par (4, 6 ou 8), interconectadas por pontes dissulfeto, conferindo a
eles uma alta estabilidade (Broekaert et al., 1997). Além disso, sua composição de
aminoácidos, anfipaticidade, carga catiônica e tamanho, fazem com que estes
peptídeos tenham a habilidade de se inserirem facilmente nas membranas lipídicas
possibilitando então a morte do microrganismo alvo (Brogden, 2005; Izadphanah e
Gallo, 2005).
Em animais, esses peptídeos antimicrobianos constituem parte do sistema imune
inato (Lehrer et al., 1993; Gabay, 1994; Boman, 1995; Hultmark, 1997). Em plantas,
proteínas e peptídeos antimicrobianos formam um sistema de defesa similar à
imunidade inata em animais, protegendo-as assim do ataque de certos patógenos e
pragas (Shewry e Lucas, 1997; Gallo et al., 2002).
A base molecular dos mecanismos de ação pelos quais, o peptídeo
antimicrobiano age contra o patógeno é pouco definida, mas acredita-se que diferenças
na fluidez de membrana e composição lipídica interfiram na associação dos peptídeos
antimicrobianos às membranas alvo, podendo levar estas ao seu rompimento (Feder et
al., 2001).
Izadphanah e Gallo (2005) propuseram um mecanismo de ação para esses
peptídeos antimicrobianos onde, o efeito sobre os microrganismos está relacionado
tanto à sua carga catiônica quanto à sua estrutura. Esta carga permite que o peptídeo
antimicrobiano se ancore a componentes aniônicos presentes na membrana lipídica do
microrganismo alvo. Sendo assim, esta atração eletrostática inicial é responsável pela
associação do peptídeo antimicrobiano à membrana. Porém, tal ligação se dá de forma
inespecífica. Já Brogden (2005) acredita que ao se ligarem à membrana do
microrganismo alvo, os peptídeos antimicrobianos formem poros nessas membranas,
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levando assim à morte do microrganismo. Em seu trabalho Brodgen (2005) cita três
diferentes modos de ação pelo qual esses peptídeos, agindo sobre a membrana, levam
a morte do microrganismo. São eles: canal transmembrana, poro toroidal e modelo
tapete (Figura 1). Estudos recentes vêm observando também a capacidade de
diferentes peptídeos de penetrarem células alvo, podendo também interagir com outras
membranas intracelulares. Foi observado que os peptídeos pVEC e (KFF)3 K são
capazes de penetrar o envelope celular das leveduras Saccharomyces cerevisiae e
Candida albicans e que a entrada desses se dá de forma muito variada (Holm et al.,
2005).
Devido a essa capacidade que os peptídeos antimicrobianos possuem de
interagir com determinadas membranas celulares e, dessa forma, exibirem uma
eficiente atividade antimicrobiana contra determinados agentes patogênicos, é que tem-
se observado, nos últimos anos, um grande interesse em se estudar esse grupo de
proteínas (Gallo et al., 2002).
A seleção de um número cada vez maior de microrganismos resistentes a
antibióticos e a outros agentes antimicrobianos tem despertado a atenção de muitos
pesquisadores na tentativa de se desenvolverem novos agentes terapêuticos (Gallo et
al., 2002). O potencial terapêutico dos peptídeos antimicrobianos é valorizado graças à
capacidade destes compostos de matarem rapidamente um grande número de
microrganismos incluindo bactérias, vírus e fungos que são multiresistentes a drogas.
Na tabela 1 podemos observar de forma simplificada, por exemplo, uma lista de alguns
peptídeos antimicrobianos que possuem atividade biológica contra várias espécies
fúngicas (Reddy et al., 2004).
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Figura 1 – O mecanismo de interação e permeabilização de AMPs em membranas de
microrganismos. Regiões hidrofóbicas do peptídeo (azul escuro) alinham-se com a
região lipídica central da bicamada e regiões hidrofílicas do peptídeo (vermelha) formam
a região interior do poro. (A) Canal transmembrana; (B) Poro toroidal e (C) Modelo
tapete (Reproduzido de Brodgen, 2005).
A
B C
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Tabela 1 – Peptídeos antimicrobianos com atividade contra fungos.
PEPTÍDEO
FONTE
MODO DE
AÇÃO
ATIVIDADE
ANTIFÚNGICA
Gallinacina-1 Galinha Lise C. albicans
Lactoferricina-B Humano, boi Lise C. albicans
Defensina NP-1 granulócitos de coelho Lise C. neoformans
Defensina HNP-1 Neutrófilo humano Lise C. albicans
Protegrina Humanos Lise C. albicans
Tripticina Humanos Lise A. flavus
Magainina-2 Xenopus laevis Lise C. albicans
Drosomicina Drosophila Lise F. oxysporum
Dermaseptina Phyllomedusa sauvagii Lise C. neoformans
Fonte: Reddy et al., 2004.
1.2 – PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE PLANTAS
As plantas, por serem organismos sésseis, estão constantemente expostas aos
diversos tipos de fatores físicos e químicos desfavoráveis no ambiente, incluindo a
presença de um grande número de organismos fitopatogênicos. Sendo assim, a sua
sobrevivência nessas condições exige uma rápida resposta de defesa (Castro e Fontes,
2005). Durante seu processo evolutivo as plantas desenvolveram eficientes sistemas de
defesa os quais envolvem um reconhecimento específico e uma alta sensibilidade a
organismos patogênicos. O grande número de estratégias de defesa selecionadas pela
planta faz com que a resistência passe a ser uma regra enquanto a suscetibilidade,
uma exceção (Shewry e Lucas, 1997).
Diversos mecanismos estão envolvidos na defesa de plantas contra seus
agressores tais como acúmulo de componentes fenólicos, de alcalóides, de
aminoácidos não protéicos, de glicosídeos ou proteínas e peptídeos com atividades
antimicrobianas e inseticidas (Wittstock e Gershenzon, 2002; Castro e Fontes, 2005).
Um grande número de peptídeos antimicrobianos tem sido isolado de plantas,
especialmente de sementes, local em que podemos encontrá-los em nível elevado se
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compararmos às folhas, flores e demais órgãos da planta (Broekaert et al., 1997; Wang
et al., 2001).
Os peptídeos antimicrobianos podem ser divididos em 10 famílias, levando-se
em consideração, principalmente, suas características estruturais, como pode ser
observado na tabela 2. Geralmente, esses peptídeos presentes em plantas possuem
estrutura tridimensional globular, estabilizada pela presença de pontes dissulfeto.
Dentre estes podemos citar: (1) as proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs), as
quais inicialmente acreditava-se participarem no transporte de lipídeos entre organelas;
(2) as snakinas, que foram inicialmente isoladas de batata (Solanum tuberosum); (3) as
defensinas de planta, inicialmente isoladas de sementes de cevada (Hordeum vulgare);
(4) as tioninas, sendo a purotionina, isolada de trigo (Triticum aestivum), a primeira
proteína cuja atividade contra patógenos de plantas foi detectada in vitro; (5) os
peptídeos tipo-heveína, descritos inicialmente como os peptídeos mais abundantes do
látex de seringueiras; (6) os peptídeos tipo-knotinas, isolados inicialmente de sementes
de maravilha (Mirabilis jalapa); (7) as seferdinas, únicos peptídeos antimicrobianos de
plantas descritos que não possuem pontes dissulfeto, representados por cadeias
polipeptídicas lineares ricas em glicina e histidina, e isolados de raiz de bolsa-de-
pastoros (Capsella bursa-pastoris); (8) peptídeos MBP-1, isolados de milho (Zea mays);
(9) peptídeos macrocíclicos purificados de várias plantas da família Rubiaceae, como o
café (Coffea arabica) e (10) pequenos peptídeos denominados Ib-AMPs isolados de
sementes de balsamina (Impatiens balsamina) (García-Olmedo et al., 2001).
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Tabela 2 – Peptídeos e pequenas proteínas de plantas com atividade antimicrobiana.
FAMÍLIA
Nº DE RESÍDUOS
DE
AMINOÁCIDOS
Nº DE
PONTES
DISSULFETO
ATIVIDADE
LTPs 90 – 95 3 – 4 Antibacteriana; antifúngica
Snakinas 61 – 70 6 Antibacteriana; antifúngica
Defensinas 45 – 54 4 Antibacteriana; antifúngica; inibem α-
amilase
Tioninas 45 – 47 3 – 4 Antibacteriana; antifúngica
Tipo heveína 43 4 Antibacteriana (Gram +); antifúngica
Tipo knotina 36 – 37 3 Antibacteriana (Gram +); antifúngica
Seferdinas 28 – 38 0 Antibacteriana; antifúngica
MBP-1 33 2 Antibacteriana; antifúngica
Peptídeos
Macrocíclicos
29 – 31 3 Antibacteriana (Gram +)
Ib-AMPs 30 2 Antibacteriana (Gram +); antifúngica
Fonte: García-Olmedo et al., 2001.
Dentre os principais peptídeos antimicrobianos de plantas estudados
encontramos principalmente as tioninas, as defensinas e as LTPs.
As tioninas são pequenas proteínas básicas, possuindo em sua maioria 45 a 47
resíduos de aminoácidos e apresentam de 6 a 8 resíduos de cisteína, formando 3 ou 4
pontes dissulfeto (Garcia e Olmedo et al., 1989). Podem ser classificadas em 2
subgrupos, um contendo 8 cisteínas conectadas por 4 pontes dissulfeto e outro com 6
cisteínas interligadas por 3 pontes dissulfeto (Broekaert et al., 1997).
As tioninas foram isoladas principalmente a partir de sementes de trigo, no
entanto, proteínas relacionadas têm sido purificadas a partir de várias outras sementes
de cereais (Garcia e Olmedo et al., 1989). Em cevada a sua expressão foi detectada no
endosperma de sementes, onde foi isolada uma tionina com propriedade antimicrobiana
denominada α-hordotionina (α-HT). Thevissen et al. (1996) demonstraram que essa
tionina altera a permeabilidade da membrana do fungo Neurospora crassa causando
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um aumento da entrada de Ca+2, do efluxo de K+, além de causar a alcalinização do
meio.
Estudos de imunolocalização desses peptídeos em plantas revelaram que as
tioninas estão localizadas principalmente dentro dos vacúolos, embora também tenha
sido observada a sua presença na parede celular (Broekaert et al., 1997).
As tioninas são tóxicas para bactérias Gram positivas e negativas, para os
fungos filamentosos e também para leveduras. Stuart e Harris (1992) mostraram que as
tioninas inibem o crescimento in vitro de fungos e bactérias. Posteriormente, esses
efeitos foram confirmados em ensaios utilizando diversas bactérias patogênicas assim
como nos fungos Colletotrichum langenarum e Fusarium solani, que foram fortemente
inibidos por tioninas isoladas de diferentes espécies de plantas como trigo, cevada,
batata e rabanete (Molina et al., 1993; Moreno et al., 1994 e Terras et al., 1996).
As defensinas de plantas são proteínas pequenas, com 45 a 54 resíduos de
aminoácidos, altamente básicas, ricas em cisteínas, sendo estruturalmente
relacionadas a defensinas encontradas em outros tipos de organismos, incluindo
insetos e humanos (Thevissen et al., 1999; 2003).
Os primeiros membros da família das defensinas de plantas foram isolados de
grãos de trigo e cevada (Colilla et al., 1990; Mendez et al., 1990). Estas foram
originalmente denominadas γ-tioninas por apresentarem um tamanho similar (5 kDa) e o
mesmo número de pontes dissulfeto (Broekaert et al., 1995). Contudo, trabalhos
subseqüentes estabeleceram que as tioninas e γ-tioninas são estruturalmente não
relacionadas (Terras et al., 1992; Bruix et al., 1993; Bohlmann, 1994; Pelegrini e
Franco, 2005).
Terras et al. (1995) verificaram que defensinas encontradas em plantas
desempenham um papel importante na proteção dos tecidos de plantas jovens durante
os primeiros estágios de emergência. A expressão das defensinas nos vários tecidos
das diferentes espécies de plantas, como repolho (Park et al., 2002); ervilha (Almeida et
al., 2002); tabaco (Lay et al., 2003); batata (Segura et al., 1999); espinafre (Terras et al.,
1995); tomate (Brandstadter et al., 1996) e Arabidopsis (Penninckx et al., 1996 e
Thomma et al., 2002) foi estudada e, observou-se que não estão presentes somente
nas sementes, mas também nas camadas celulares periféricas das frutas e dos órgãos
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florais. Esta localização periférica está relacionada com a função de proteção dos
órgãos contra os ataques microbianos (Thevissen et al., 2003).
As defensinas de plantas podem ser agrupadas dentre as que possuem e as que
não possuem atividade antimicrobiana. As que possuem atividade antimicrobiana in
vitro contra determinados fungos filamentosos, podem ou não causar algum tipo de
alteração morfológica (Thomma et al., 2002). Interessantemente, muitas defensinas
podem ser ativas contra vários tipos de patógenos fúngicos humanos, dentre eles a
levedura Candida albicans (Thomma et al., 2003; Thevissen et al., 2004). Estudos
demonstraram também que defensinas isoladas de sementes de Medicago sativa
(alfafa), denominada alfAFP, possui uma forte atividade contra o patógeno fúngico de
grande importância agronômica Verticillium dahlial, sendo capaz de inibir o crescimento
de 50 % de esporos pré-germinados, quando presente numa concentração de 5µg.mL-1
e de inibir 100 %, quando presente a 15 µg.mL-1. Além deste fungo, esta defensina
também foi capaz de inibir outros patógenos fúngicos como Alternaria solani e Fusarium
culmorum (Gao et al., 2000).
Estudos envolvendo defensinas purificadas de sementes de Dahlia merckii
denominada Dm-AMP1, determinaram um possível mecanismo de ação das defensinas
de planta. Foram realizados experimentos em que se demonstrou que essa Dm-AMP1
é capaz de alterar a permeabilidade da membrana fúngica, promovendo um aumento
no efluxo de K+ e no influxo de Ca+2, além de permitir a entrada do Sytox Green, um
corante fluorescente que penetra apenas as células que estão com sua membrana
plasmática comprometida (Thevissen et al., 1996; 1999). Esta Dm-AMP1 também
possui atividade antifúngica contra a levedura Saccharomyces cerevisiae e, seu
mecanismo de ação depende da composição lipídica de sua membrana plasmática
(Thevissen et al., 2003a). Estudos mais recentes demonstraram que a Dm-AMP1 é
capaz de interagir de forma dose dependente com esfingolipídeos isolados da
membrana de S. cerevisiae e que essa interação é aumentada na presença de
concentrações equimolares de ergosterol, o principal esterol fúngico (Thevissen et al.,
2003b).
As proteínas transportadoras de lipídeos (LTPs) são proteínas básicas, com
massa molecular em torno de 10 kDa, possuindo um alto ponto isoelétrico e observa-se
a presença de 8 resíduos de cisteína ligados por 4 pontes dissulfeto. As LTPs facilitam
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a transferência de lipídeos através das membranas in vitro e estão localizadas
basicamente na parede celular da planta e parcialmente em compartimentos ligados ao
metabolismo de lipídeos, como os glioxissomos (Kader, 1996). O papel de defesa das
LTPs é suportado por evidências de sua localização na parede periclinal externa das
células epidérmicas por toda a planta mas também pelo aumento da expressão de seus
genes em resposta à presença de patógenos (Kader, 1996).
Muitas LTPs foram identificadas por possuírem atividade antifúngica in vitro,
estando envolvidas no processo de inibição do crescimento de fungos e bactérias
(Terras et al., 1992; Molina et al., 1993). Estudos têm demonstrado que as LTPs
apresentam a capacidade de inibir o crescimento de muitos fitopatógenos como
Pseudomonas solanacearum, Claribacter michiganensis, Fusarium solani, Rhizoctonia
solani, Trichoderma viride e Cercospora beticola (Terras et al., 1992; Molina et al.,
1993; Kader, 1996; Carvalho et al., 2001).
Regente e de la Canal (2000) isolaram e caracterizaram um peptídeo
antifúngico básico, denominado Ha-AP10, apresentando aproximadamente 10 kDa e
que demonstraram pertencer a família das LTPs de planta. A caracterização molecular
de um clone de cDNA (Regente e de la Canal, 2003) mostrou que esta Ha-AP10 é
homóloga a ltp4 de Arabidopsis thaliana (Arondel et al., 2000) apresentando um
peptídeo sinal que a direciona para uma via secretória. Em 2005 (Regente e de la
Canal) também demonstraram que o peptídeo Ha-AP10 é capaz de induzir uma
permeabilização da membrana plasmática de esporos fúngicos e isso pôde ser
observado pelo uso do corante Sytox green.
Uma LTP presente em sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) foi
isolada e pôde-se observar uma eficiente atividade antifúngica in vitro em sinergismo
com uma defensina contra os patógenos fúngicos Fusarium oxysporum e F. solani,
provocando alterações morfológicas em suas hifas. Foram também realizados ensaios
de imunolocalização onde foi mostrada a localização dessa LTP na parede celular e em
compartimentos citosólicos nas sementes de feijão (Carvalho et al., 2001; 2004).
Outros trabalhos também mostraram a presença e o isolamento de uma LTP
com massa molecular de aproximadamente 9 kDa, presente em exsudados de
sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) (Diz et al., 2003; Rose et al., 2006).
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Estes resultados podem estar relacionados com a função de proteção destas proteínas
durante a germinação da semente contra o ataque de determinados microrganismos.
1.3 – OUTRAS PROTEÍNAS DE BAIXA MASSA MOLECULAR, PRESENTES EM
PLANTAS, COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
1.3.1 – INIBIDORES DE PROTEINASES SERÍNICAS
Os inibidores de proteinases constituem um largo e diverso grupo de proteínas
de planta capazes de formar complexos proteína-proteína reversíveis com
determinadas enzimas resultando na sua inativação (Mosolov et al., 2001). Esses
inibidores são considerados reguladores de proteinases endógenas, proteínas de
reserva e finalmente agentes de defesa de plantas contra certos patógenos e pragas
(Antcheva et al., 2001; Mosolov et al., 2001). Contudo, existem evidências do
envolvimento de inibidores de proteinases em muitos outros processos importantes,
além dessas 3 principais funções (Mosolov et al., 2001).
Um dos grupos de inibidores de proteinases melhor estudados é o grupo dos
inibidores de proteinases do tipo serínica, pertencentes à família do tipo II isolados de
batata (PT-II). Os membros deste grupo possuem aproximadamente 50 resíduos de
aminoácidos, sendo polipeptídeos ricos em cisteína que inibem tanto tripsina quanto α-
quimiotripsina. São expressos em vários tecidos de plantas da família Solanaceae,
algumas vezes em altos níveis nas folhas (Antcheva et al., 2001). Um outro inibidor de
proteinase isolado, caracterizado e seqüenciado a partir de sementes de pimenta
(Capsicum annuum), foi denominado PSI-1.2 e também mostrou ser um membro da
família de inibidores do tipo II já isolados de batata. Este inibidor possui 52 resíduos de
aminoácidos, é um polipeptídeo rico em resíduos de cisteína que tem a capacidade de
inibir tanto tripsina quanto quimiotripsina (Antcheva et al., 2001).
Inibidores denominados Bowman-Birk (BBI) pertencentes ao grupo dos inibidores
de proteinases serínicas, foram primeiramente isolados de sementes de soja. São
encontrados em diversas espécies de planta, especialmente em sementes de mono e
dicotiledôneas. BBIs de dicotiledôneas geralmente possuem uma massa molecular
entre 7 e 8 kDa. São formados a partir do produto de uma família multigênica dentro de
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algumas espécies e, conseqüentemente, muitas isoformas podem ser identificadas
(Ragg et al., 2006).
A atividade de inibidores tripsínicas (TIs), encontrados em sementes e em
tubérculos, sempre esteve associada à defesa contra herbívoros inibindo as suas
proteinases (Jouanin et al., 1998). Mais recentemente, foi demonstrado que certos TIs
atuam como inibidores do crescimento fúngico fazendo com que estes inibidores façam
parte do conjunto de proteínas relacionadas a defesa de plantas, fornecendo uma
barreira à entrada de determinados patógenos (Chen et al., 1998; Yang et al., 2006).
Os inibidores de proteinases são considerados agentes antimetabólicos, já que
causam deficiência protéica no patógeno. Logo, o comportamento desses inibidores
como antibióticos está atribuído à sua interferência na digestão protéica, a qual reduz a
disponibilidade de aminoácidos, impedindo a síntese de proteínas necessárias para o
crescimento, desenvolvimento e reprodução do patógeno (Soares-Costa et al., 2002)
Uma proteína de 16 kDa denominada SAP16 foi isolada de flores de Helianthus
annuus, exibindo atividade associada a inibidores de tripsina. Foi demonstrado que esta
proteína possui a habilidade de inibir a germinação de esporos do fungo Sclerotinia
sclerotiorum em concentrações de 5 µg.mL-1 e uma redução evidente do crescimento
micelial em concentrações de 3 µg.mL-1, indicando uma alta atividade antifúngica contra
este patógeno. Além de inibir o desenvolvimento das hifas do fungo S. sclerotiorum, a
proteína SAP16 foi capaz de inibir o fungo Fusarium solani f. sp. eumartii (Giudici et al.,
2000).
Também foi visto que uma outra proteína, de massa molecular de 18 kDa, obtida
de sementes de Psoralea corylifolia, denominada Psc-AFP, possui atividade associada
a inibidores de tripsina e que também foi capaz de inibir o crescimento dos fungos
Alternaria brassicae, Aspergillus nurger, Fusarium oxysporum e Rhizoctonia cerealis
sugerindo também um papel de defesa para esta proteína (Yang et al., 2006).
1.3.2 – PROTEÍNAS DO TIPO NAPINA
As albuminas 2S de Crucíferas, também denominadas napinas, estão entre as
proteínas mais estudadas, particularmente as de sementes do gênero Brassica e
Arabidopsis (Ericson et al., 1986).
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As napinas são proteínas pertencentes à classe das albuminas 2S e constituem
uma família de proteínas de reserva de sementes. Estas proteínas possuem baixa
massa molecular, são solúveis em água e possuem alto conteúdo de cisteína e
nitrogênio. Proteínas do tipo napina exibem um alto grau de polimorfismo e isso ocorre
devido ao fato de serem codificadas por uma família multigênica e também por estarem
sujeitas a um processo proteolítico diferencial. Devido à presença de muitas isoformas,
é difícil se obter uma preparação pura de uma dada espécie. A maioria destas proteínas
é composta por 2 subunidades , uma subunidade maior de 8 kDa e uma menor de 3
kDa derivadas de uma dada molécula precursora única e ligadas por pontes dissulfeto
(Vashishta et al., 2006).
As napinas também fazem parte do grupo das proteínas que possuem atividade
antifúngica (Terras et al., 1992). É importante se determinar a interação bioquímica pela
qual estas proteínas estão atuando, especialmente levando-se em consideração que a
maioria das proteínas com atividade antifúngica possuem vários modos de ação. As
napinas com atividade antifúngica fornecem um bom exemplo de proteínas de defesa
que possuem múltiplas funções evidentes e as quais têm sido mostradas por
interagirem com mais de uma entidade bioquímica. As napinas apesar de pertencerem
à família das albuminas 2S apresentam propriedades inibitórias para determinadas
proteinases. Complexos oxidados de napinas que podem atuar como inibidores de
proteinases efetivos contribuem para a atividade biológica dessas proteínas, agindo
como potentes agentes antifúngicos. As napinas também causam alteração na
membrana fúngica e atuam sinergisticamente com outras proteínas (Wijaya et al.,
2000). Napinas de rabanete assim como α-purotioninas de trigo podem causar danos
na membrana de fungos promovendo a permeabilização da membrana da hifa
(Neumann et al., 1996).
As albuminas 2S são proteínas de reserva e têm sido descritas por estarem entre
20 e 60 % do total de proteínas de sementes de dicotiledôneas, fazendo delas uma das
três maiores classes de proteínas de reservas de sementes. Elas são metabolizadas
durante a germinação, sendo consideradas uma fonte de nitrogênio e de enxofre para o
desenvolvimento do embrião (Youle e Huang, 1981). Constituem, em sua maioria, uma
complexa mistura de proteínas de baixo peso molecular com propriedades físico-
químicas semelhantes. A seqüência de aminoácidos das albuminas 2S apresenta uma
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série de características comuns: uma alta concentração de cisteínas, de resíduos
básicos, bem como a Pro (15 %) e Gli (30 %). Onze proteínas purificadas da fração
albumínica correspondendo a proteínas 2S apresentaram pesos moleculares similares,
todos em torno de 14,500 Da (Scofield e Crouch, 1987; Monsalve e Rodriguez, 1990).
Vários trabalhos vêm mostrando o potencial inibitório das albuminas 2S sobre
diferentes patógenos. A partir de sementes de Malva parviflora foram purificadas e
caracterizadas duas proteínas, mostrando alta homologia com albuminas 2S. Essas são
compostas de duas diferentes subunidades de 3 e 5 kDa apresentando a propriedade
de inibir o crescimento de fungos fitopatogênicos como Fusarium graminearum e
Phytophthora infestans (Wang e Bunkers, 2000; Wang et al., 2001).
Outro exemplo foi uma proteína de 5 kDa, denominada Pe-AFP1, isolada de
sementes de Passiflora edulis, que apresenta a capacidade de inibir o desenvolvimento
dos fungos filamentosos Trichoderma harzianum, F. oxysporum e Aspergillus fumigatus
em concentrações de 32, 34 e 40 µg.mL-1 (Pelegrini et al., 2006).
Foi também isolada uma proteína homóloga a albuminas 2S a partir de
sementes de Passiflora edulis f. flavicarpa. Essa proteína de peso molecular em torno
de 12 kDa, com 2 cadeias, de aproximadamente 8 e 4 kDa, inibiu in vitro, o crescimento
de fungos fitopatogênicos como Colletotrichum lindemuthianum e F. oxysporum, além
da levedura Saccharomyces cerevisiae. Além de estar envolvida na inibição, esta
proteína está relacionada ao fato de promover a permeabilização da membrana desses
fungos (Agizzio et al., 2003; 2006).
1.4 – AS LEVEDURAS
As leveduras são microrganismos unicelulares que crescem pela formação de
novas células, seguida de um aumento no volume celular (Johnston et al., 1977; Posten
e Cooney, 1993; Duboc e von Stockar, 1996).
Certas espécies ocorrem em superfícies de frutas frescas ou então apodrecidas,
enquanto outras podem aparecer em superfícies expostas da planta. Algumas podem
ser encontradas no solo, água, esgoto e até no trato digestivo de mamíferos
(Alexopoulos et al., 1996).
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As leveduras possuem uma parede celular bem rígida capaz de preservar a
integridade osmótica da célula, além de determinar a morfologia celular durante os
diferentes estágios do seu ciclo de vida. Em S. cerevisiae, a parede celular é
essencialmente feita de proteínas e possui 3 diferentes cadeias polissacarídicas: uma
cadeia predominante e linear de β-1,3 glucanos; uma menor mas altamente ramificada
de β-1,6 glucanos e uma cadeia de quitina (Baladrón et al., 2002). Em células de
Candida, o glucano é o polissacarídeo mais abundante da parede, compondo de 60 –
65 % do total de polissacarídeos e, mananos compõe aproximadamente de 20 – 25 %.
O componente que aparece em menor quantidade é a quitina, sendo de
aproximadamente 5 % do total de sacarídeos presentes na parede celular (Ruiz-Herrera
et al., 1994).
A membrana das leveduras é composta de lipídeos (fosfolipídeos e lipídeos
neutros) e também de proteínas, sendo o ergosterol o principal componente lipídico
neutro e o mais importante para a vida da levedura (Bossche e Koymans, 1998).
Diversas espécies de leveduras, como, por exemplo, as pertencentes ao gênero
Candida, podem ou não apresentar alguns tipos de patogenicidade aos humanos.
Espécies pertencentes a este gênero podem produzir infecções localizadas ou
disseminadas como a candidíase, a meningite, infecções no sangue dentre outras, que
são causadas pelo patógeno humano C. albicans. Existem ainda outras espécies do
gênero Candida que são consideradas patógenos facultativos como, por exemplo, a C.
tropicalis, C. parapsilosis e a C. globrata sendo estas leveduras isoladas de habitats
naturais como o solo, água e também de frutas (Alexopoulos et al., 1996).
A espécie C. albicans exibe uma variedade de formas morfológicas,
classificando-se desde leveduras unicelulares de brotamento até leveduras com
habilidade de formar hifas (Sudbery et al., 2004). Esta propriedade de dimorfismo, ou
seja, esta transição morfogênica entre as formas leveduriforme e filamentosa é
considerada uma característica relevante para se determinar a virulência no momento
da infecção (Gow et al., 2002). Estas mudanças morfológicas podem ser induzidas por
uma variedade de condições ambientais sejam elas temperatura, pH e também pela
composição de nutrientes do meio de crescimento (Sudbery et al., 2004). Estudos
recentes têm demonstrado que altas concentrações de fosfato também podem induzir a
formação de pseudohifas uniformes em leveduras (Hornby et al., 2003).
Ribeiro, S.F.F.
16
Tanida et al. (2006) observaram que múltiplos genes estão envolvidos no
crescimento e na virulência de leveduras do gênero Candida. Dentre estes destacam-se
os genes 1 e 2 de resistência a drogas, denominados CDR1 e CDR2 e o gene 1 de
resistência a multidrogas (MDR1). Foi visto que algumas espécies de Candida que
expressam altos níveis de CDR1 e CDR2 são resistentes a algumas drogas que
utilizam alguns transportadores ligados ao transporte de ATP e também a novos
agentes antimicrobianos os quais não são eliminados por bombas de efluxo
dependente de ATP, podendo assim permitir novos tratamentos de infecções fúngicas e
bacterianas.
1.5 – PIMENTAS (Capsicum annuum L.)
O gênero Capsicum tem aproximadamente 27 espécies e pertence à família das
Solanaceae. Este gênero contém 5 espécies, por exemplo, C. annum, C. frutescens, C.
baccatum, C. pubescens e C. chinense. C. annuum é conhecida tanto como pimenta
como pimentão e é cultivada globalmente para consumo in natura e pelo seu uso como
tempero, corante e também como produto medicinal (Sugita et al., 2006). Existe um
grupo cujos frutos não possuem pungência e a eles denominamos pimentão, já o outro
é caracterizado pela presença de alcalóides (capsaicinóides) que conferem pungência
aos seus frutos, a este grupo denominamos pimentas (Bosland, 1996).
A pungência ou ardência das pimentas deve-se aos alcalóides ou, mais
especificamente, a dois capsaicinóides: a capsaicina e a diidrocapsaicina. São
substâncias encontradas quase que exclusivamente na placenta e nas sementes e, em
menor quantidade, no pericarpo sendo que as variedades de pimentas possuem
diferentes teores de capsaicinóides (Reifschneider et al., 2000).
Cinco espécies de Capsicum são consideradas cultivadas em todo o mundo: C.
annuum, C. frutescens, C. chinense, C. baccatum e C. pubescens (Casali e Couto,
1984). Todas estas espécies apresentam possibilidade de troca de genes de forma
natural (Reifschneider et al., 2000). Além destas 5 espécies domesticadas, existem
cerca de 20 espécies silvestres, a maioria delas encontradas na América do Sul (Heiser
Jr., 1976).
Ribeiro, S.F.F.
17
Um dos aspectos mais relevantes das espécies de Capsicum está relacionado a
sua ampla utilização, quer seja como alimento in natura ou processado como princípio
ativo para a indústria farmacêutica ou cosmética, dentre outros (Viñals et al., 1996;
Reifschneider et al., 2000). Para fins medicinais, as pimentas também são usadas em
algumas regiões do mundo,como estimulante digestivo, como afrodisíaco, no combate
a disenteria e infecções intestinais e, ainda, como antiparasitário e cicatrizante, dentre
outros (Viñals et al., 1996).
Os frutos de Capsicum são importantes fontes de 3 antioxidantes naturais: a
Vitamina C, os carotenóides e a Vitamina E. Também são fontes de vitaminas do
complexo B (tiamina, riboflavina, niacina, B-6 e ácido fólico), além da Vitamina A . Há
evidências de que os antioxidantes ajudam na prevenção de doenças degenerativas, de
doenças cardiovasculares, catarata, mal-de-Parkinson e mal-de-Alzreimer, uma vez que
são capazes de seqüestrar radicais livres (Reifschneider et al., 2000).
Os frutos de Capsicum são também importantes fontes protéicas. Atualmente,
são vários os números de genes identificados nesta planta e que estão relacionados à
expressão de proteínas com efeitos antimicrobianos, podendo estes virem a servir
como ferramentas úteis para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos
(Reifschneider et al., 2000).
Em recentes estudos envolvendo plantas de C. annuum, foi observada a
presença de dois membros da família de genes que codificam proteínas do tipo
defensina, denominadas j1-1 e j1-2, possuindo estruturas altamente similares. A análise
da seqüência dos íntrons dentro do gene j1-2 revelou a existência de um exon adicional
(exon 2ji) o qual também codifica uma proteína do tipo defensina. É muito provável que
este exon tenha sido derivado da troca genômica de um gene jx, pertencente a uma
outra subfamília, a qual permanece não identificada (Houlne et al., 1998). Em outro
trabalho, também envolvendo genes de plantas de C. annuum, três clones
denominados CALTPI, CALTPII e CALTPIII foram identificados como correspondentes
a genes que codificam LTPs. Estes foram isolados de uma biblioteca de cDNA de
plantas infectadas com Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria exibindo respostas de
hipersensibilidade (HR). Os transcritos dos 3 genes CALTP acumulam-se
diferentemente em folhas, caules e frutos de pimenta infectada por X. campestris pv.
vesicatoria, Phytophthora capsici e Colletotrichum gloesporioides (Jung et al., 2003).
Ribeiro, S.F.F.
18
Estudos mais recentes descreveram também o isolamento de um clone de cDNA,
denominado CaAFP de pimenta, o qual codifica uma pequena proteína de 85
aminoácidos, incluindo 8 resíduos de cisteína. Foi demonstrado que CaAFP consiste de
3 domínios: um peptídeo sinal, um domínio de ligação a quitina e um domínio C-
terminal. Os autores também demonstraram, através de Northern blots, que este clone
é altamente expresso em folhas e em brotos florais, mas não em raízes. A proteína
heteróloga super expressa em Escherichia coli foi purificada e mostrou inibir a
germinação de esporos e a formação do apressório de muitos fungos patogênicos de
plantas incluindo Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloesporioides (Lee et al.,
2004).
Recentemente, Diz et al. (2006) obtiveram a partir de sementes de C. annuum
um extrato rico em peptídeos, o qual após processos de purificação resultou em três
diferentes frações, denominadas F1, F2 e F3. Estas foram utilizadas em testes
antifúngicos que demonstraram que todas as frações possuíam atividade inibitória
sobre o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae. Através de processos de
caracterização, os autores observaram a presença de 3 peptídeos com diferentes
massas moleculares na fração F1 e um desses peptídeos apresentou alta homologia
com LTPs de plantas. Devido a alta atividade encontrada nos peptídeos presentes
nestas frações sobre leveduras é que focamos nosso trabalho na fração F3, fração
esta também enriquecida em peptídeos com alta atividade antimicrobiana.
Ribeiro, S.F.F.
19
2. OBJETIVOS
Ribeiro, S.F.F.
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2.1 – Objetivo Geral
Este trabalho tem por objetivo geral o isolamento, a caracterização e o estudo da
atividade antimicrobiana de peptídeos de sementes de pimenta, (Capsicum annuum) –
cultivar UENF 1381, sobre células de leveduras.
2.2 – Objetivos Específicos
- Isolar e caracterizar peptídeos antimicrobianos presentes em sementes de
pimenta, cultivar UENF 1381;
- Estudar o efeito inibitório de frações ricas em peptídeos sobre o crescimento de
diferentes espécies de leveduras;
- Estudar o efeito desses peptídeos sobre a acidificação do meio, por células de
leveduras, estimulada por glicose;
- Avaliar o efeito dos peptídeos sobre a morfologia e ultraestrutura de células de
levedura.
Ribeiro, S.F.F.
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3. MATERIAS
Ribeiro, S.F.F.
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3.1 - MATERIAIS BIOLÓGICOS
3.1.1 – SEMENTES
Sementes de pimenta (Capsicum annuum L.), cultivar UENF 1381, foram
fornecidas pelo Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal, do Centro de Ciências
e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy
Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.
3.1.2 – LEVEDURAS
As espécies de levedura Candida parapsilosis (CE001), Candida parapsilosis
(CE002), Candida guilliermondii (CE004), Candida tropicalis (CE006) Candida
guilliermondii (CE007), Pichia anomala (CE009), Candida krusei (CE010), Candida
guilliermondii (CE013), Pichia membranifaciens (CE015), Candida rugosa (CE016),
Candida tropicalis (CE017), Candida krusei (CE019), Candida albicans (CE022),
Candida guilliermondii (CE023), Kluyveromyces marxiannus (CE025), Kluyveromyces
lactis-similar (CE026), Candida guilliermondii (CE027), killer-Saccharomyces cerevisiae
(K1), Saccharomyces cerevisiae sensível a K1 (CE055), Candida glabrata sensível a K1
(CE1006) e a levedura Saccharomyces cerevisiae (1038) foram cedidas pela Profª Dra
Vânia Maria Maciel Melo, do Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do
Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil. Todas as cepas foram mantidas em cultura e
conservadas no Laboratório de Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos, do Centro
de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy
Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.
Ribeiro, S.F.F.
23
3.2 - REAGENTES E OUTROS MATERIAS
- REAGENTES PARA A EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DAS SEMENTES - NaH2PO4,
Na2HPO4, KCl, EDTA e (NH4)2SO4 foram obtidos da Merck S/A Indústrias Químicas e
Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- PROTEÍNAS - BSA foi obtida através de Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- RESINAS PARA CROMATOGRAFIAS - CM-Sepharose foi adquirida da Pharmacia
Fine Chemicals, Suécia. C2/C18 foi adquirida da Pharmacia Fine Chemicals, Suécia.
- REAGENTES UTILIZADOS NA CROMATOGRAFIA - Foram utilizados para CM-
Sepharose, NaH2PO4 e NaCl obtidos da Sigma Co, St Louis, U.S.A.e para C2/C18
foram utilizados TFA, obtido da Sigma Co, St Louis, U.S.A. e ACN, obtido da Merck S/A.
Indústrias Químicas.
- MATERIAIS PARA ELETROFORESE - Acrilamida, N’-N’metilenobisacrilamida, SDS,
azul de bromofenol, persulfato de amônio, Tris-base, TEMED, tricina, glicerol e
marcadores de peso molecular foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- MATERIAL PARA DIÁLISE - Membranas de celulose para diálise que retém moléculas
com massas moleculares acima de 1.000 Da foram adquiridas da Sigma Co, St Louis,
U.S.A.
- MATERIAS PARA ELETROTRANSFERÊNCIA - Membrana PVDF Immobilon-PSQ,
glicina e Ponceau S foram adquiridas da Sigma Co, St Louis, U.S.A.
- MEIOS DE CULTURA - O Caldo Sabouroud e o Ágar Sabouroud foram adquiridos de
Merck S/A Indústrias Químicas.
Ribeiro, S.F.F.
24
- REAGENTES USADOS PARA ENSAIOS ANTIFÚNGICOS E ACIDIFICAÇÃO -
Glicose, NaH2PO4 e NaCl foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A. e da Merck
S/A Indústrias Químicas.
- MATERIAS E REAGENTES UTILIZADOS PARA MICROSCOPIA - Glutaraldeído e
paraformaldeído foram adquiridos da Sigma Co, St Louis,U.S.A., metanol foi adquirido
da Merck S/A Indústrias Químicas e lâminas e lamínulas foram adquiridas
comercialmente da Fisher Instrumental Ltda.
Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e adquiridos
comercialmente.
Ribeiro, S.F.F.
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3.3 – INSTRUMENTAL
EQUIPAMENTOS MARCA MODELO
Autoclave FABBE PRIMAR 103.02
Balança Sartorius 2100
Balança Sartorius 110S
Banho-maria FANEM 102
Bomba peristáltica Pharmacia RediFrac
Capela de fluxo laminar vertical com
lâmpada germicida
VECO
VLFS 12
Célula de transferência W.E.P. company IMM-1, Semi-dry Blotting
System
Centrífuga Hitachi Himac Cr 21
Environ Shaker Lab-line 3527
Estufa QUIMIS Q316.14
Espectofotômetro Zeiss Specol UV Vis
Faca de diamante Diatome MS 118
RP-HPLC SHIMADSU LC-10AD
Liofilizador Labconco Freeze dry system/freezone
4.5
Microcentrífuga não refrigerada Eppendorf 5415C
Microscópio binocular AusJENA JENAMED 2
Microscópio óptico confocal de
varredura a laser
Zeiss LSM
Microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 900
Microscópio eletrônico de varredura Zeiss DSEM 962
pHmetro QUIMIS 400-A
Placa agitadora/aquecedora CORNING PC 220
Sistema para eletroforese Biorad 150A - Gel Electrophoresis
Cell
Ultramicrótomo Leica Ultracut Reichest S
Ribeiro, S.F.F.
26
4. MÉTODOS
Ribeiro, S.F.F.
27
4.1 - OBTENÇÃO DA FARINHA
Sementes de pimenta, Capsicum annuum L., foram maceradas em presença de
nitrogênio líquido até a obtenção de uma farinha de fina granulação. Após a obtenção
da farinha seguiu-se imediatamente a extração das proteínas.
4.2 – EXTRAÇÃO E OBTENÇÃO DE PROTEÍNAS DE BAIXA MASSA MOLECULAR
A farinha obtida foi extraída em tampão fosfato (Na2HPO4 10 mM, NaH2PO4 15
mM, KCl 100 mM, EDTA 1,5 %) pH 5,4 na proporção de 1:10 (farinha:tampão de
extração) e deixado sob agitação constante por 3 h a 4 °C . Essa metodologia foi
desenvolvida segundo Diz et al. (2004), com algumas modificações (ESQUEMA 1).
Após homogeneização o extrato foi submetido a centrifugação a 15.000 x g por 30 min
a 4 °C e o sobrenadante resultante submetido a precipitação com sulfato de amônio a
90 % de saturação. Após 16 horas este material foi submetido a uma nova
centrifugação a 15.000 x g por 30 min a 4 °C e o precipitado resultante foi ressuspenso
em 10mL de água destilada. Finalmente este material foi aquecido a 80 °C por 15 min e
em seguida centrifugado a 10.000 x g por 10 min a 4 °C. O precipitado resultante desta
última centrifugação foi descartado e o sobrenadante dialisado contra água destilada e
em seguida liofilizado para ser utilizado na purificação dos peptídeos. Este material ao
final deste processo foi denominado extrato rico em peptídeos (ERP), para então ser
utilizado no isolamento dos peptídeos.
Ribeiro, S.F.F.
28
ESQUEMA 1 – Fracionamento com sulfato de amônio dos homogeneizados obtidos a
partir da extração da farinha (Diz et al., 2004).
HOMOGENEIZADO
RESIDUO SOBRENADANTE
- Sulfato de amônio a 90% de saturação - 4 °C; 16 h - centrifugação a 15.000 x g / 30 min
- centrifugação a 15.000 x g / 30
SOBRENADANTE PRECIPITADO
- Ressuspenso em água destilada - 80 °C / 15 min - centrifugação a 10.000 x g / 10 min
PRECIPITADO SOBRENADANTE
DIÁLISE
EXTRATO RICO EM PEPTÍDEOS (ERP)
Ribeiro, S.F.F.
29
4.3 – ISOLAMENTO DOS PEPTÍDEOS
4.3.1 – CROMATOGRAFIA DE TROCA CATIÔNICA (CM-SEPHAROSE)
Uma coluna catiônica CM-Sepharose (1,5 x 50 cm) foi primeiramente empregada
para o isolamento dos peptídeos. A resina foi empacotada com fluxo constante, sendo
lavada seqüencialmente com água destilada, HCl 0,1 M, novamente água destilada,
NaOH 0,1M, água destilada e por fim foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 20
mM pH 8,0.
Após sua ativação, 20 mg do extrato rico em peptídeos (ERP) foram pesados e
dissolvidos em 10 mL de tampão fosfato 20 mM pH 8,0 (tampão de equilíbrio da
coluna). A solução foi centrifugada por 5 minutos a 16.000 x g em temperatura
ambiente e aplicada na coluna. Foram coletadas frações de 3 mL a um fluxo constante
de 30 mL.h-1. Os primeiros 15 tubos (cada um contendo 3 mL) foram eluídos com
tampão fosfato de sódio 20 mM pH 8,0, em seguida, foi feito um gradiente com
molaridades crescentes de 0.1 a 1.0 de NaCl, de 15 em 15 tubos (3 mL cada). As
absorbâncias das frações foram lidas em comprimentos de onda de 280 nm. A fração
F3 obtida nesta cromatografia foi submetida a cromatografia de fase reversa em coluna
C2/C18.
4.3.2 – CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA EM HPLC
Uma coluna de fase reversa C2/C18 equilibrada com 0,1 % de TFA foi
empregada seqüencialmente no processo de isolamento dos peptídeos. A fração F3
obtida na cromatografia em coluna de CM-Sepharose foi solubilizada em TFA 0,1 % e,
150 µL (120 µL de amostra + 30 µL de TFA) desta mistura foram injetados na coluna de
fase reversa. A cromatografia foi desenvolvida utilizando-se um fluxo de 0,7 mL.min-1 a
temperatura de 32 °C em sistema de HPLC. Para a eluição das proteínas da coluna foi
utilizado um gradiente de acetonitrila de 0 a 80 %. Inicialmente (10 primeiros minutos) a
coluna foi lavada com TFA 0,1 % em água ultrapura (solvente A), e em seguida um
gradiente foi sendo formado através da mistura do solvente A e 80 % de acetonitrila em
TFA 0,1 % (solvente B) por cerca de 48 min. Após esse período a coluna foi lavada com
Ribeiro, S.F.F.
30
100 % do solvente B totalizando 60 min. A eluição da coluna foi acompanhada por um
detector do tipo DAD, sendo as absorbâncias lidas a 220 nm.
4.4 – QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
As determinações quantitativas de proteínas foram feitas através do método de
Bradford (1976) sendo a BSA utilizada como padrão.
4.5 – ELETROFORESE EM GEL DE TRICINA NA PRESENÇA DE SDS
A eletroforese em gel de tricina foi feita segundo metodologia de Schagger e Von
Jagow (1987). Foram usadas placas de vidro de 7 x 10 cm e 8 x 10 cm e espaçadores
de 0,5 mm. O gel de separação foi preparado numa concentração de 16,4 % de
Acrilamida/bis-acrilamida e o gel de concentração numa concentração de 3,9 %.
4.5.1 – PREPARO DAS AMOSTRAS E CONDIÇÃO DE CORRIDA
As frações protéicas obtidas nas cromatografias foram concentradas por
liofilização, ressuspensas em tampão de amostra (Tris 0,125 M, SDS 2,5 %, azul de
bromofenol 0,25 %, β- mercaptoetanol 5% e sacarose 15 %), aquecidas por 5 min a 100
°C e centrifugadas a 16.000 x g por 2 min. Após este procedimento, 20 µL das amostras
foram aplicadas no gel de concentração. A eletroforese foi feita a uma voltagem
constante de 18 V por um período de aproximadamente 16 horas. Foram usados os
seguintes marcadores de massa molecular: mioglobina (16.950 Da), mioglobina I + II
(14.400 Da), mioglobina I + III (10.600 Da), mioglobina I (8.460 Da), mioglobina II (6.200
Da), glucagon (3.400 Da) e mioglobina III (2.500 Da).
4.6 – COLORAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DO GEL
Após o término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro
e colocado em uma solução corante (Coomassie Blue R 0,05 %, ácido acético 70 % e
metanol 40 %) por duas horas. Após esse período, o gel foi transferido para uma
Ribeiro, S.F.F.
31
solução descorante (metanol 40 % e ácido acético 7 %) e mantido nesta até a
visualização das bandas de proteína.
4.7 – WESTERN BLOTTING
Após o término da eletroforese, o gel foi retirado das placas e imerso em tampão
de transferência (glicina 182 mM, Tris 25mM e metanol 20 %) por 20 min. Uma
membrana de nitrocelulose, cortada nas mesmas dimensões do gel, foi também imersa
no tampão de transferência por 20 min. Após este período foi montado, sobre uma
célula de transferência, um “sanduíche” com quatro folhas de papel de filtro Whatman 3
MM, previamente embebidas em tampão de transferência. Sobre essa camada de
papel foi colocada a membrana e acima da membrana o gel, sendo então o “sanduíche”
finalizado com mais uma camada de quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, já
embebidas no tampão de transferência. Durante a montagem desse ”sanduíche” as
bolhas de ar foram evitadas e/ou removidas entre as camadas, para que não
interferissem com a transferência das proteínas. Após esse procedimento, a célula de
transferência foi fechada e foi aplicada uma corrente constante de 1 mA/cm2 por 2 h no
sentido gel-membrana. Após a transferência o “sanduíche” foi cuidadosamente desfeito
e a membrana submetida à coloração com Ponceau S (0,1 %) para confirmação da
transferência.
Nessa análise foram empregados os procedimentos descritos por Towbin et al.
(1979).
4.7.1 – REVELAÇÃO DA MEMBRANA
Após coloração com Ponceau S 0,1 %, a membrana foi bloqueada com tampão
bloqueador (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM contendo Tween 20 0,05 %) por 30
min para facilitar a ligação dos anticorpos as proteínas. Após o bloqueio, a membrana
foi incubada com anticorpo primário (1:1000 diluído em tampão bloqueador) contra LTP
presente na fração F1 de sementes de Capsicum annuum L. por 18 h a 4ºC. Após esta
incubação com o anticorpo primário, foram feitas 10 lavagens de 5 min em tampão de
lavagem (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 e NaCl 150 mM. Ao término desta lavagem a
Ribeiro, S.F.F.
32
membrana foi imersa novamente em tampão bloqueador contendo o anticorpo
secundário (1:2000), conjugado com peroxidase por 2 h a temperatura ambiente. Após
esta incubação, foram feitas mais 10 lavagens de 5 min em tampão de lavagem. Ao
término das lavagens foi feita a revelação com diaminobenzidina (DAB) imergindo a
membrana na solução reveladora (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, DAB 1 mg.mL-1, imidazol
100 mM e peróxido de hidrogênio 0,03 %) até a visualização das bandas marcadas.
Nessa análise também foram empregados os procedimentos descritos por
Towbin et al. (1979).
4.8 – PRECIPITAÇÃO COM NITRATO DE PRATA
A precipitação por nitrato de prata foi feita segundo método descrito por
Morrissey (1998).
4.8.1 – PREPARO DAS SOLUÇÕES
Solução 1: foi preparada utilizando-se 10 % de ácido acético, 40 % de etanol absoluto
para um volume total de 40 mL de água ultrapura;
Solução 2: foi preparada utilizando-se 5 % de glutaraldeído para um volume total de 40
mL de água ultrapura;
Solução 3: foi preparada utilizando-se 20 % de etanol absoluto para um volume total de
120 mL de água ultrapura;
Solução 4: chamada de Solução de Coloração, foi preparada utilizando-se 20 % de
etanol, 20 % de nitrato de prata, 30 % de hidróxido de amônio e 4 % de hidróxido
de sódio para um volume total de 73 mL de água ultrapura. Os reagentes foram
colocados nessa ordem e sob agitação. Essa solução foi preparada imediatamente
antes do uso e protegida da luz;
Solução 5: chamada de Solução Reveladora, foi preparada utilizando-se 20 % de
etanol, 37 % de formaldeído e 2,3 M de ácido cítrico para um volume total de 100
mL de água ultrapura. O formaldeído deve ser preparado antes do uso;
Ribeiro, S.F.F.
33
Solução 6: chamada Solução de Fixação, foi preparada utilizando-se 5 mL de ácido
acético e 500 µL de glicerol para um volume total de 50 mL de água ultrapura. Esta
solução foi preparada juntamente com a solução 5.
4.8.2 – PRECIPITAÇÃO
Ao término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas de vidro e:
incubado na solução 1 por 40 min; lavado em água ultra pura por 5 min; incubado na
solução 2 por 20 min; lavado novamente em água ultra pura (2 lavagens de 10 min
cada); incubado na solução 3 por 20 min; incubado na solução 4 (ao abrigo da luz) por
20 min; incubado na solução 3 por 20 min (2 lavagens de 10 min cada); colocado na
solução 5 até obter coloração desejada; deixado na solução 6 por 10 min para fixar a
coloração; e armazenado em água destilada.
4.9 – SEQÜENCIAMENTO DE PROTEÍNAS
4.9.1 – PREPARO DE AMOSTRAS PARA SEQÜENCIAMENTO
Amostras contendo os peptídeos antifúngicos das frações FR1, FR2, FR3 e FR4,
obtidas em coluna C2/C18 (FP-HPLC), foram secas e ressuspensas em 20 µL de
acetonitrila 40 % e logo após aplicadas diretamente sobre uma membrana de PVDF e
então submetidas ao seqüenciamento N-terminal.
4.9.2 – DETERMINAÇÃO DA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS
Foi empregada a metodologia introduzida e desenvolvida por Edman (1950)
utilizando em um seqüenciador automático de proteínas. Este é um processo cíclico de
três etapas onde os resíduos de aminoácidos são clivados um a um, a cada ciclo, a
partir do N-terminal da proteína e são identificados como derivados fenilisotiocianato
(PITC) com resíduo N-terminal; a segunda, a clivagem do resíduo N-terminal via
ciclização em meio ácido; a terceira, a conversão do derivado tiozolinona (ATZ) formado
Ribeiro, S.F.F.
34
para um derivado mais estável, a tioidantoína (PTH), o qual pode ser identificado por
cromatografia (Allen, 1989).
Os alinhamentos das seqüências de aminoácidos foram feitos usando-se o
algorítmo do BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.org/Blast) e do Clustal
(http://www.expasy.org) (Altschul, 1990; Thompson et al., 1994).
4.10 – ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE LEVEDURAS EM MEIO
SÓLIDO
Esta análise foi feita através do método de contagem de colônias em placas que
é utilizada por ser uma técnica que permite determinar a presença de células viáveis.
Foram feitas diluições do pré-inóculo na razão de 1 para10, de modo a se obter
diluições 1/100 ou 10-2 em meio líquido. Em seguida, foi feito o plaqueamento, ou seja,
a distribuição homogênea, com o auxílio de uma alça de Drigalsky, de uma alíquota
(5µL) tanto das células controle quanto das células incubadas com os peptídeos da
fração F3, numa concentração de 16 µg.mL-1, por um período de 18 h. Após distribuição
das células as placas foram deixadas numa estufa a 30 º C por um período de 24 h
para que as colônias pudessem se desenvolver. Após esse período as células ou
pequenos agrupamentos de células idênticas espalharam-se isoladamente dando
origem a colônias que puderam ser contadas na diluição apropriada. Normalmente são
analisadas para contagem, as placas que contem entre 30-300 colônias (Vermelho et
al., 2006).
4.11 - ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR DE LEVEDURAS EM
MEIO LÍQUIDO
4.11.1 – OBTENÇÃO DAS CELULAS DE LEVEDURA
Células das diferentes espécies de leveduras pertencentes aos gêneros
Candida, Saccharomyces, Pichia e Kluyveromyces foram colocadas para crescer em
placas de Petri contendo Ágar Sabouraud por um período de 48 h a 30 °C para a
obtenção de um crescimento celular homogêneo. Após este período, as células foram
Ribeiro, S.F.F.
35
utilizadas no ensaio onde com o auxilio de uma alça de semeadura, colônias foram
retiradas e adicionadas a 10 mL de salina 0,15 M para que pudéssemos fazer a
quantificação das mesmas em câmara de Newbauer através de um microscópio óptico.
4.11.2 – ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DAS CÉLULAS DE LEVEDURA
Em placas de cultura de células (96 poços), contendo 200 µL de meio de cultura
para o crescimento celular, foram adicionadas as amostras em concentrações variadas
de proteínas a partir do ERP e da fração F3 obtidas de sementes de pimenta e, 1 x 104
células/ mL das leveduras. Para a observação da inibição do crescimento das células,
foi determinada a densidade óptica calculada a partir de leituras em um leitor de ELISA
a 620 nm a cada 6 horas, por um período de 42 horas.
Todo o ensaio foi feito em triplicata e sobre condições de assepsia em capela de
fluxo laminar, segundo metodologia adaptada de Broekaert et al. (1990).
4.12 – ANÁLISE DO EFEITO DOS PEPTÍDEOS SOBRE A INIBIÇÃO DA
ACIDIFICAÇÃO DO MEIO POR CÉLULAS DE LEVEDURA
4.12.1 – MANUTENÇÃO E PREPARO DAS CÉLULAS
Células de Saccharomyces cerevisiae foram transferidas para placas de Petri
contendo Agar Sabouroud, onde cresceram por 48 h a 30 °C. Após este período, 4 mL
de solução salina 0,15 M estéril foram vertidos sobre as colônias e as células
homogeneizadas com o auxílio de uma alça de Drigalski. Posteriormente, 100 µL dessa
suspensão celular foram adicionados em 200 mL de meio de cultura (caldo Sabouroud)
e mantidas sob intensa agitação a 30 °C por aproximadamente 16 h. Após este período
de crescimento, o material foi centrifugado a 3.000 x g por 5 minutos a 4 °C. As células
precipitadas foram lavadas com água ultrapura e centrifugadas (como descrito
anteriormente), sendo este procedimento repetido por mais três vezes, para que todo o
meio de cultura fosse retirado. Ao final das lavagens, as células precipitadas foram
ressuspensas em 3 mL de água ultrapura e utilizadas no ensaio de inibição da
acidificação do meio por células de levedura.
Ribeiro, S.F.F.
36
4.12.2 – ENSAIO DE ACIDIFICAÇÃO
Este ensaio foi feito com células de levedura em meio contendo Tris-HCl 10mM,
pH 6,0. Células de S. cerevisiae (107 cel.mL-1) foram pré-incubadas em diferentes
tempos (1h, 30, 10 e 1 min) em 800 µL deste meio contendo a fração protéica F3, em
diferentes concentrações (0,016; 0,008; 0,004 e 0,002 mg/mL). Após os períodos de
incubação, foram adicionados 200 µL de glicose 0,5 M e em seguida foram feitas
leituras do pH a cada minuto por um tempo de 30 minutos. Um controle negativo sem
adição da fração F3 foi utilizado.
Este ensaio foi feito em triplicata e os cálculos de �pH foram feitos para
determinar a porcentagem de inibição obtida com o experimento. O volume final do
ensaio foi de 1 mL.
Todo o ensaio foi feito segundo metodologia adaptada de Gomes et al, 1998.
4.13 – ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRAESTRUTURAL DE CÉLULAS DE
LEVEDURAS TRATADAS COM OS PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS
4.13.1 - MICROSCOPIA ÓPTICA
Após 42 h de crescimento as células das leveduras, tanto na presença quanto na
ausência da fração F3, foram transferidas para microtubos “eppendorf” de 1,5 mL
contendo fixador (glutaraldeído 2,5 %, paraformaldeído 4 %) e após 1 h este material foi
submetido a uma centrifugação a 1600 x g por 2 min, a temperatura ambiente. O
sobrenadante foi descartado e o precipitado após lavagem com tampão fosfato 20 mM,
pH 8,0 foi colocado sobre lâminas de vidro, coberto com lamínulas e utilizado para
observação em microscópio óptico (Axioplan ZEISS).
4.13.2 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Após ensaio de inibição do crescimento nos tempos de 18 e 42 h, células das
espécies estudadas de leveduras, crescidas na ausência e na presença da fração F3,
foram fixadas em glutaraldeído 2,5 %, paraformaldeído 4 % em tampão fosfato 0,1 m,
Ribeiro, S.F.F.
37
pH 7,3, por um período de 30 min a temperatura ambiente. Após a fixação, as amostras
foram lavadas três vezes de 30 min no mesmo tampão e então aderidos em lamínulas
pré-cobertas com poli-L-lisina 0,01 %, por 10 min. Após este tempo, as células de
leveduras foram pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1 % em tampão fosfato 0,1 M, pH
7,3 por 30 min, protegido da luz. Em seguida a pós-fixação, as lamínulas contendo as
células foram lavadas três vezes com o mesmo tampão acima. As amostras foram
desidratadas em soluções crescentes de acetona (30 %, 50 %, 70 %, 90 % e 100 %)
por 15 min cada (v/v). Em seguida o material foi submetido ao ponto crítico, que
consiste na secagem do material, feito no Critical Point Dryer, onde ocorre a
substituição da acetona por dióxido de carbono. Após a substituição esse é evaporado,
deixando a amostra seca. Em seguida à secagem foi feita a montagem dos materiais
em suportes. A montagem é feita com fita de carbono adesiva em ambas as faces. Uma
face adere a fita ao suporte e a outra face adere o material ao suporte. Após esse
preparo as amostras são metalizadas no Sputter Coaster, onde receberam uma
camada de ouro de 20 nm. Após metalização, os materiais foram visualizados no
microscópio de varredura Zeiss DSEM 962.
4.13.3 – MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
O procedimento foi o mesmo utilizado na microscopia de varredura até a etapa
da desidratação em acetona 100 %. Após a desidratação, o material foi infiltrado em
resina epóxi (Epon): Epon:acetona 100 % (1:3) por 30 min, Epon:acetona 100 % (1:2)
por 30 min, Epon:acetona 100 % (1:1) por 30 min, Epon:acetona 100 % (2:1) por 30
min, Epon:acetona 100 % (3:1) por 30 min e Epon puro por 30 min. Após o Epon puro
as amostras foram transferidas e orientadas no fundo de tubos de microcentrífuga com
a capacidade para 500 µL contendo Epon novo. Bolhas de ar foram retiradas com a
ponta da pipeta Pasteur. A polimerização da resina processou-se por 48 h a 60 ºC.
Cortes ultrafinos foram feitos em um ultramicrótomo, colocados sobre grades de níquel
e então observados no microscópio de transmissão Zeiss 900. Todos os procedimentos
foram executados em temperatura ambiente.
Ribeiro, S.F.F.
38
5. RESULTADOS
Ribeiro, S.F.F.
39
5.1 – PURIFICAÇÃO DOS PEPTÍDEOS
A cromatografia de troca catiônica em coluna de CM-Sepharose do ERP mostrou
a presença de três diferentes picos, os quais foram denominados de F1, F2 e F3
(Figura 2). O primeiro pico denominado F1, foi eluído com o tampão de equilíbrio da
coluna; o segundo pico denominado F2, foi eluído com tampão de equilíbrio acrescido
com 0,1 M de NaCl; e o terceiro pico denominado F3, eluído com tampão de equilíbrio
contendo 0,2 M de NaCl. Os picos obtidos foram dialisados, liofilizados e analisados em
gel de tricina.
Como etapa final no processo de purificação dos peptídeos de baixa massa molecular a
fração F3 obtida em coluna CM-Sepharose foi escolhida e submetida a cromatografia
de fase reversa em coluna C2/C18. A figura 3A mostra que esta fração foi separada em
quatro picos, denominados FR1, FR2, FR3 e FR4, apresentando diferentes tempos de
eluição. As figuras 3B e 3C mostram as recromatografias dos picos FR3 e FR4
apresentando um único pico para ambas as frações. Os picos obtidos foram então
dialisados, liofilizados e analisados através de gel de tricina.
Ribeiro, S.F.F.
40
Figura 2 – Perfil cromatográfico em coluna de troca catiônica em coluna CM-Sepharose
do extrato rico em peptídeos (ERP) de sementes de pimenta. A coluna foi equilibrada
com tampão fosfato 20 mM, pH 8,0. F1 foi eluído da coluna com tampão de equilíbrio,
F2 foi eluído com tampão de equilíbrio contendo 0,1M de NaCl e F3 foi eluído com
tampão de equilíbrio contendo 0,2 M de NaCl.
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 10 20 30 40 50 60
Tubos
F1
F2
F3
NaCl 0,1 M
M
NaCl 0,2 M
M M M
NaCl 1 M
AB
S
Ribeiro, S.F.F.
41
Figura 3 – Perfil cromatográfico em coluna de fase reversa numa coluna C2/C18 da
fração F3 (obtida após cromatografia em coluna CM-Sepharose) em HPLC (A).
Recromatografia das frações FR3 (B) e FR4 (C) em coluna C2/C18 em HPLC. A coluna
foi equilibrada com uma solução de TFA 0,1 %. As frações foram eluidas através de um
gradiente de acetonitrila de 0 a 80 %.
Gra
die
nte
de
ac
eto
nilt
rila
G
rad
ien
te d
e a
ce
ton
iltri
la
Tempo , min
RP 1
RP 3
RP 2 RP 4
C B
RP 4
RP 3
A
60
’
RP4 ’
A
B C
Tempo , min
80 %
80 %
Tempo , min
Ribeiro, S.F.F.
42
5.2 – VISUALIZAÇÃO DAS FRAÇÕES PROTÉICAS ATRAVÉS DE ELETROFORESE
EM GEL DE TRICINA
As proteínas presentes no ERP e também nas frações obtidas após
cromatografia de troca catiônica CM-Sepharose forma inicialmente analisadas em gel
de tricina, como pode ser observado na figura 4. Ao visualizarmos o ERP através do gel
de tricina observamos a presença de bandas protéicas de alta massa molecular e
também bandas de baixa massa molecular que variaram aproximadamente de 6 a 11
kDa. Também foram visualizadas através de gel de tricina as frações obtidas nesta
cromatografia onde observamos a presença de três diferentes bandas protéicas, sendo
que para a fração F1, duas bandas variam entre 6 e 14 kDa e uma abaixo de 6 kDa.
Para a fração F2 visualizamos a presença de duas bandas protéicas de alta massa e
uma única banda de baixo peso variando entre 6 e 8 kDa. Para a fração F3 foi possível
observarmos a presença de quatro diferentes bandas protéicas de baixa massa
molecular, uma em torno de 12 kDa, uma segunda próxima a 8 kDa, uma terceira
próxima a 6 kDa e uma quarta com massa molecular abaixo de 6 kDa. Todas as
amostras foram tratadas com β-mercaptoetanol.
Na figura 5 observamos o perfil eletroforético dos peptídeos obtidos após
cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 da fração F3. Nesta figura podemos
observar que para a fração FR1 não foi possível a definição de nenhuma marcação
característica para proteína. Para a fração FR2 notamos a presença de uma única
banda protéica com massa molecular próxima a 7 kDa, para a fração FR3 notamos a
presença de uma banda protéica de aproximadamente 6 kDa e para a fração FR4
observamos a presença 3 bandas protéicas, uma de 12 kDa, uma segunda de 8 kDa e
uma terceira com massa molecular abaixo de 6 kDa.
Ribeiro, S.F.F.
43
Figura 4 – Eletroforese em gel de tricina na presença de SDS do ERP e das frações
obtidas após cromatografia em coluna CM-Sepharose. Todas as amostras foram
tratadas com β-mercaptoetanol. (M) refere-se ao marcador de massa molecular (Da);
(ERP) refere-se ao extrato rico em peptídeos das sementes de pimenta e, (F1) refere –
se a primeira fração eluída com tampão fosfato 20 mM; (F2) refere-se a segunda fração
eluída com tampão fosfato contendo 0,1 M de NaCl e (F3) refere-se a terceira fração
eluída com tampão fosfato contendo 0,2 M de NaCl.
16.950 14.400
10.600 8.160
6.200
M ERP F1 F2 F3
Ribeiro, S.F.F.
44
Figura 5 – Eletroforese em gel de Tricina na presença de SDS das frações obtidas
após cromatografia em coluna C2/C18 por HPLC. Todas as amostras foram tratadas
com β-mercaptoetanol. (M) refere-se ao marcador de massa molecular (Da); (FR1)
refere-se ao primeiro pico obtido em coluna C2/C18; (FR2) refere-se ao segundo pico
obtido em coluna C2/C18, (FR3) refere-se ao terceiro pico obtido em coluna C2/C18 e,
(FR4) refere-se ao quarto pico obtido em coluna C2/C18.
16.950 14.400
10.600 8.160
6.200
M FR1 FR2 FR3 FR4
Ribeiro, S.F.F.
45
5.3 – WESTERN BLOTTING
Através deste ensaio não foi detectada nenhuma marcação para LTP em
nenhum dos peptídeos presentes na fração F3 (2). Porém uma forte marcação pode ser
visualizada na fração F1 (1), a qual foi usada como controle positivo e que apresenta
uma LTP já purificada por Diz et al., 2006 (Figura 6).
Figura 6 – Western blotting de peptídeos obtidos na fração F3 após cromatografia de
troca iônica em coluna CM-Sepharose. 1 - fração F1, C. annuum e 2 - fração F3, C.
annuum
1 2
Ribeiro, S.F.F.
46
5.4 – SEQUENCIAMENTO PROTEICO AMINO TERMINAL
Os peptídeos presentes nas frações FR2, FR3 e FR4 foram eletrotransferidas
para membranas de PVDF e posteriormente utilizadas para a determinação da
seqüência de aminoácidos a partir da região N-terminal pelo método de degradação de
Edman.
A comparação da seqüência em banco de dados dos resíduos seqüenciados a
partir da fração FR3 e da fração FR4 a partir da região N-terminal mostrou que estas
proteínas possuem homologia com inibidores de proteinases e napinas (albuminas 2S)
de diferentes espécies de plantas, respectivamente. A seqüência obtida a partir da
fração FR3 foi Ser-Glu-Pro-Arg-Asn-Glu-Pro-Thr-Glu-Ile-Ser-Tyr-Ser-Val-Ala-Pro-Ser-
Val-Ser e para a fração FR4 foi Pro-Gln-Cys-Pro-Arg-Cys-Ser-Gln-Gln-Phe-Gln-Gln-Ala-
Lys-Gln-Leu-Arg-Cys-Ser-Cys-Gln-Ser. As Figuras 7 e 8 mostram as seqüências
obtidas das proteínas eletrotransferidas e as seqüências das proteínas homólogas para
que elas possam ser analisadas comparativamente. Nenhuma seqüência pode ser
obtida para a fração FR-2.
Vale ressaltar que o resultado obtido para a seqüência da fração FR4 está de
acordo com o obtido em gel de tricina (Figura 5), visto que esta classe de proteínas, do
tipo napina, é composta de duas cadeias próximas de 8 e 4 kDa. A banda de 12 kDa
visualizada na fração FR4 pode representar a forma nativa desta que não foi
completamente separada.
Ribeiro, S.F.F.
47
Figura 7 – Alinhamento parcial da seqüência de aminoácidos da fração FR3 de sementes de
pimenta com outras seqüências de inibidores de proteinase de plantas. Os resíduos apresentados
em azul são idênticos. Os resíduos apresentados em vermelho são os positivos e em preto são os
que não apresentam homologia. I (identidade) indicam os resíduos idênticos; P (positividade)
indicam os resíduos com as mesmas características. As seguintes seqüências são apresentadas
com o número do acesso no banco de dados (Clustal W), que foram utilizadas para comparação: 1-
Capsicum annum (46396269); 2- Capsicum annuum (Q9SDL4); 3- Nicotiana tabacum (Q40561); 4-
Capsicum annuum (fração FR3); 5- Erythrina latíssima (P68171); 6- Erythrina variegate (P81366);
7- Psophocarpus tetragonolobus (P10822).
I P 1 1 K A C P R N C D T D I A Y M V C P S S G 20 17.3 % 23.1 % 2 128 ― A C P R N C D T R I A Y S K C P R S E 146 3.9 % 4.9 % 3 76 ― S D P K N D P ― D I A Y S K C P R S E 93 4 % 6.6 %
4 FR3 1 ― S E P R N E P T E I S Y S V A P S V S 19 5 66 ― F I P D D D E V R I G F A Y A P K C A 84 2.3 % 5.2 % 6 66 ― F I P D D D K V R I G F A Y A P K C A 84 2.3 % 5.2 % 7 58 ― A K T G N E P C P L T V V R S P N V S 77 2.9 % 5.8 %
Alinhamento Homologia
Ribeiro, S.F.F.
48
Figura 8 – Alinhamento parcial da seqüência de aminoácidos da fração FR4 de sementes de
pimenta com outras seqüências de napinas (Albuminas 2S) de plantas. Os resíduos apresentados
em azul são idênticos. Os resíduos apresentados em vermelho são os positivos e em preto são os
que não apresentam homologia. I (identidade) indicam os resíduos idênticos; P (positividade)
indicam os resíduos com as mesmas características. As seguintes seqüências são apresentadas
com o número do acesso no banco de dados (Clustal W), que foram utilizadas para comparação: 1-
Brassica napus (P01090); 2- Brassica juncea (Q42413); 3- Raphanus sativus (AAA32745); 4-
Capsicum annuum (fração FR4); 5- Passiflora edulis f. flaviarpa (Agizzio et al., 2003); 6- Sesamum
indicum (Tai et al., 1999) e 7- Glycine Max (Odani et al., 1987).
I P 1 1 P F R I P K C R K E F Q Q A Q H L R ― A C Q Q 22 13.6 % 21% 2 1 P F R I P K C R K E F Q Q A Q H L R V ― C Q Q 22 13.6 % 19.8 % 3 1 P ― R ― Q R C Q K E F Q Q S Q H L R ― A C Q R 22 13.9 % 22.2 %
4 FR4 1 P ― Q C P R C S Q Q F Q Q A K Q L R C S C Q S 22 5 1 ― ― P S E R C R R Q M Q G Q D F S ― ― ― ― ― 15 18.2 % 22.7 % 6 1 ― ― Q S Q Q C R Q Q L ― Q G R Q F R S ― ― ― ― 16 31.8 % 40 % 7 1 ― ― Q Q D S C R K Q L Q G V N L T P ― ― ― ― 16 18.2 % 22.7 %
Alinhamento Homologia
Ribeiro, S.F.F.
49
5.5 - ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR DE LEVEDURAS EM
MEIO LÍQUIDO
5.5.1 – EXTRATO RICO EM PEPTÍDEOS
Na tabela 3 observamos o efeito inibitório do ERP sobre as diferentes leveduras
testadas. Nesta tabela podemos observar o efeito do ERP na presença das leveduras
Candida krusei e Kluyveromyces lactis-similar. Notamos que somente na presença de
concentrações abaixo de 50 µg.mL-1 é que este extrato foi capaz de inibir 50 % do
crescimento destas leveduras. Podemos notar também um efeito bem acentuado sobre
a levedura Candida glabrata sensível onde notamos que utilizando concentrações menores
que 20 µg.mL-1 é que iremos atingir o seu IC50. Ao analisarmos o efeito do ERP sobre o
crescimento das leveduras Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Candida
parapsilosis, Candida rugosa, Candida tropicalis, S. cerevisiae sensível a K1,
Saccharomyces cerevisiae killer (K1) e Pichia anomala observamos que utilizando
concentrações menores que 9 µg.mL-1. O ERP foi capaz de inibir em 50 % o
crescimento destas leveduras. Quando analisamos o crescimento das leveduras
Candida guilliermondii, Pichia membranifaciens e Candida krusei na presença do ERP,
notamos que este foi capaz de inibir em 50 % o crescimento destas leveduras,
utilizando-se concentrações entre 20 µg.mL-1 e 50 µg.mL-1. Notamos também que o IC50
foi atingido quando utilizamos 20 µg.mL-1 do ERP para a levedura Kluyveromyces
marxiannus. O efeito deste ERP é menos evidente no crescimento das leveduras
Candida albicans, Candida krusei (está no de 20<50), Candida guilliermondii e Candida
parapsilosis onde somente em concentrações maiores que 50 µg.mL-1 é que este ERP
irá induzir uma inibição de aproximadamente 50 % destas leveduras.
Ribeiro, S.F.F.
50
Tabela 3: Atividade antifúngica do extrato rico em peptídeos (ERP)
LEVEDURAS Valores de IC50 (µµµµg.mL-1) *
Candida krusei (CE019)
< 50
Kluyveromyces lactis-similar (CE026)
Candida glabrata sensível K1 (CE030)
< 20
Candida tropicalis (CE006)
Saccharomyces cerevisiae (CE1038)
Candida parapsilosis (CE002)
Candida rugosa (CE016) < 9
Candida tropicalis (CE017)
S. cerevisiae sensível K1 (CE029)
Pichia anômala (CE009)
Saccharomyces cerevisiae killer (CE028)
Candida guilliermondii (CE004)
Candida guilliermondii (CE007)
Pichia membranifaciens (CE015) < 20, > 50
Candida krusei (CE010)
Candida guilliermondii (CE023)
Candida guilliermondii (CE027)
Kluyveromyces marxiannus (CE025)
20
Candida albicans (CE022)
Candida guilliermondii (CE013) > 50
Candida parapsilosis (CE002)
* Concentração de proteína mínima necessária para se obter 50 % de inibição do crescimento
após 42 h a 30 ºC.
Ribeiro, S.F.F.
51
5.5.2 – FRAÇÃO F3
Na figura 9A podemos analisar o efeito da fração F3 sobre o crescimento da
levedura S. cerevisiae, onde notamos que quando utilizamos 64 µg.mL-1 desta fração, a
inibição chegou a 100 % enquanto que na presença de 8, 16 e 32 µg.mL-1 nenhuma
inibição foi observada.
Na figura 9B notamos o efeito inibitório sobre as células da levedura C.
parapsilosis onde notamos uma leve inibição em todas as concentrações testadas (8,
16, 32 e 64 µg.mL-1).
Na figura 9C notamos que a fração F3 interferiu no crescimento da levedura P.
membranifaciens em todas as concentrações utilizadas 8, 16, 32 e 64 µg.mL-1 onde é
possível observarmos uma inibição de 10 a 30 % do seu crescimento.
Na figura 9D observamos o efeito inibitório sobre a levedura C. tropicalis. Nela
observamos que na presença de todas as concentrações utilizadas, não houve inibição
do crescimento desta levedura, parecendo estar havendo uma estimulação do seu
crescimento celular.
Na figura 10A podemos observar o efeito inibitório sobre as células da levedura
K. marxiannus. Notamos que houve uma inibição de 50 % das células quando crescidas
na presença de 8 e 16 µg.mL-1.
Na figura 10B e 10C notamos o efeito da fração F3 sobre o crescimento das
leveduras C. albicans e C. guilliermondii, respectivamente. Observamos uma inibição de
50 % na presença de 8 e 16 µg.mL-1.
Ribeiro, S.F.F.
52
Figura 9 – Gráfico do crescimento das leveduras (A) S. cerevisiae (CE1038), (B) C. parapsilosis
(CE002), (C) P. membranifaciens (CE015) e (D) C. tropicalis (CE017) até 42 h na presença da
fração F3. (-����-) controle, (-����-) 8 µg.mL-1, (-����-) 16 µg.mL-1, (-����-) 32 µg.mL-1, (-����-) 64 µg.mL-1.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(60
0 n
m) A
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(60
0 n
m) D
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(60
0 n
m) B
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(60
0 n
m) C
Ribeiro, S.F.F.
53
Figura 10 – Gráfico do crescimento das leveduras (A) K. marxiannus (CE025), (B)
C. albicans (CE022) e (C) C. guilliermondii (CE013) até 42 h na presença da fração
F3. (-����-) controle, (-����-) 8 µg.mL-1, (-����-) 16 µg.mL-1
0
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(600
nm
) A
0
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(60
0 nm
) B
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
AN
CIA
(60
0 nm
) C
Ribeiro, S.F.F.
54
5.5.3 – FRAÇÕES FR3 e FR4
Na figura 11A podemos analisar o efeito das frações FR3 e FR4 sobre o
crescimento da levedura S. cerevisiae, onde a fração FR3 foi capaz de inibir em
aproximadamente 100 % o seu crescimento enquanto FR4 apresentou um efeito bem
menos acentuado, apresentando um menor efeito sobre o crescimento desta levedura.
Na figura 11B notamos o efeito das frações FR3 e FR4 sobre o crescimento da
levedura C. albicans. Observamos que ambas as frações não foram capazes de atuar
fortemente sobre o crescimento desta levedura, que não teve seu crescimento inibido.
Ribeiro, S.F.F.
55
Figura 11 – Gráfico do crescimento das leveduras (A) S. cerevisiae (CE 1038), (B) C.
albicans (CE022), até 42 h na presença das frações FR3 e FR4. (-����-) controle, (-����-) 30
µL da fração FR3 e (-����-) 30 µL da fração FR4.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(600
nm
) A
0
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50
TEMPO
AB
SO
RB
ÂN
CIA
(600
nm
)
B
Ribeiro, S.F.F.
56
5.6 – AVALIAÇÃO DA PORCENTAGEM DE MORTE DE LEVEDURAS TRATADAS
COM A FRAÇÃO F3
Na figura 12 observamos o efeito inibitório sobre o crescimento, em meio sólido,
das diferentes leveduras após 18 h de incubação na presença de 16 µg.mL-1 da fração
F3. Para a levedura P. membranifaciens (Figura 12A), notamos que esta fração
promoveu uma pequena inibição na formação de colônias quando comparadas à
formação de colônias da placa controle.
A figura 12 (B) mostra o efeito inibitório da fração F3 sobre o crescimento da
levedura S. cerevisiae, onde podemos observamos a inibição da formação de colônias
desta levedura ao compararmos com as células crescidas na ausência desta fração.
Para a levedura C. albicans, figura 12 (C) foi possível observarmos que também
houve uma inibição sobre a formação de colônias desta levedura, porém menos
acentuada do que a observada para S. cerevisiae.
Na figura 12 (D) notamos o efeito da fração F3 sobre o crescimento da levedura
K. marxiannus. Observamos uma grande inibição do número de colônias desta
levedura, se comparadas a placa controle.
Na tabela 4 podemos confirmar os resultados obtidos no ensaio em placa através
da análise do número de colônias que se desenvolveram, onde temos uma noção
quantitativa da porcentagem de morte das células quando crescidas na presença da
fração F3 confirmando a informação visual das observações das placas.
Ribeiro, S.F.F.
57
Figura 12 – Ensaio em placas das leveduras crescidas após 18 h de
tratamento com 16 µg.mL-1 da fração F3. (A) P. membranifaciens (CE015),
(B) S. cerevisiae (CE1038), (C) C. albicans (CE022) e (D) K. marxiannus
(CE025).
Tabela 4: Atividade fungicida de peptídeos da fração F3 sobre as células de levedura
% de morte das
Leveduras células tratadas
Pichia membranifaciens............................................10
Saccharomyces cerevisiae........................................94
Candida albicans.............................................................50
Kluyveromyces marxiannus...........................................95
*Os valores representam a média de experimentos realizados em triplicata
A B C D
CONTROLE
TESTE
Ribeiro, S.F.F.
58
5.7 – ANÁLISE DO EFEITO DOS PEPTÍDEOS SOBRE A INIBIÇÃO DA
ACIDIFICAÇÃO DO MEIO POR CÉLULAS DE LEVEDURA
A figura 13 apresenta o efeito da fração F3 sobre a acidificação do meio induzido
por glicose em células da levedura S. cerevisiae, que foi utilizada como modelo. Foram
realizados testes utilizando diferentes tempos de incubação, onde em (A) temos um
tempo de incubação de 60 minutos, em (B) um tempo de incubação de 30 minutos e,
em (C) um tempo de incubação de 10 minutos, para todas as concentrações usadas (2;
4; 8 e 16 µg.mL-1). Observamos que os peptídeos presentes nesta fração F3 inibiram
fortemente a acidificação do meio em todas as concentrações testadas e também em
todos os tempos de incubação testados.
Ribeiro, S.F.F.
59
Figura 13 – Gráfico da % de acidificação do meio por células da levedura S. cervisiae, na
presença da fração F3 de sementes de pimenta obtida após cromatografia em coluna CM-
Sepharose, nas várias concentrações testadas. (1) Controle; (2) 2 µg.mL-1 da fração F3;
(3) 4 µg.mL-1 da fração F3; (4) 8 µg.mL-1 da fração F3 e (5) 16 µg.mL-1 da fração F3. (A)
Tempo de incubação de 60 minutos, (B) Tempo de incubação de 30 minutos e, (C) Tempo
de incubação de 10 minutos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% A
CID
IFIC
AÇ
ÃO
1 2 3 4 5CONCENTRAÇÕES
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% A
CID
IFIC
AÇ
ÃO
1 2 3 4 5CONCENTRAÇÕES
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% A
CID
IFIC
AÇ
ÃO
1 2 3 4 5CONCENTRAÇÕES
A
B
C
Ribeiro, S.F.F.
60
5.8 - ANÁLISE MORFOLÓGICA E ULTRAESTRUTURAL DE CÉLULAS DE
LEVEDURAS TRATADAS COM OS PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS
5.8.1 - MICROSCOPIA ÓPTICA
Nas figuras 14 e 14’ podemos visualizar as imagens feitas através de
microscopia óptica das diferentes espécies de leveduras crescidas em meio controle
(sem adição de proteína) e em meio contendo a fração F3 na concentração de 8 µg.mL-
1 após 42 h de incubação.
Na figura 14 (A e B) observamos as células da levedura S. cerevisiae. Notamos
que na presença da fração F3 (Figura 14B) há uma leve redução do número de células
assim como podemos observar também a presença de algumas células com diferentes
aspectos em relação às demais, apresentando-se um pouco mais escuras e mais
alongadas.
Na figura 14 (C e D) observamos as células da levedura C. albicans. Notamos
que na presença da fração F3 (Figura 14D) houve uma aglomeração bem evidente das
células e a presença de células com diferentes aspectos se compararmos com as
células controle (Figura 14C), que apresentam uma distribuição celular bem diferente,
apresentando células bem isoladas umas das outras.
Na figura 14 (E e F) observamos as células da levedura C. tropicalis. Notamos
que na presença da fração F3 (Figura 14F) há uma diferença relevante quanto ao
número de células em relação as células controle (Figura 14E). Podemos observar
também uma evidente diferenciação quanto a morfologia das células, que quando
crescidas na presença da fração F3, encontram-se mais alongadas que as células
crescidas na ausência desta fração.
Na figura 14’ (G e H) observamos as células da levedura K. marxiannus.
Notamos uma redução significativa do número de células na presença da fração F3
(Figura 14’H). Também observamos de uma leve alteração no tamanho dessas células
ao compararmos com as células controle (Figura 14’G).
Na figura 14’ (I e J) podemos notar as células da levedura P. membranifaciens.
Podemos notar que na presença da fração F3 (Figura 14’J) houve uma aglomeração
celular, porém, diferente das demais espécies de levedura estudadas, não foi possível
Ribeiro, S.F.F.
61
notar uma redução no número de células crescidas na presença da fração F3 quando
comparadas com as células controle.
Na figura 15 podemos visualizar, através de microscopia óptica confocal o efeito
da fração F3, na concentração de 32 µg.mL-1, sobre as células da levedura S.
cerevisiae. Na figura 15 (A e B) podemos observar as células da levedura S. cerevsiae
crescidas por um período de 42 h, neste tempo há uma redução bem evidente do
número de células crescidas na presença da fração F3, assim como uma forte
aglomeração dessas células (Figura 15B). Também foi possível observar uma diferença
a nível nuclear onde, nas células controle pode-se visualizar o núcleo de forma bem
definida fato que não ocorre nas células incubadas com a fração F3.
Na figura 15 (C e D) observamos as células da levedura S. cerevisiae crescidas
por um período de 60 h. Podemos observar que neste tempo também ocorreu uma
aglomeração das células em presença da fração F3 (Figura 15D) assim como uma
ampla desestruturação do núcleo, quando comparada as células controle (Figura 15C).
Ribeiro, S.F.F.
62
Figura 14 – Células de leveduras visualizadas em microscopia óptica após ensaio de
inibição do crescimento. (A) S. cerevisiae (CE1038) controle (sem adição de proteína);
(B) S. cerevisiae (CE1038) incubadas com 8 µg.mL-1 da fração F3; (C) C. albicans
(CE022) controle (sem adição de proteína); (D) C. albicans (CE022) incubadas com 8
µg.mL-1 da fração F3; (E) C. tropicalis (CE017) controle (sem adição de proteína); (F) C.
tropicalis (CE017) incubadas com 8 µg.mL-1 da fração F3. Barra = 20 µm.
AB
C D
E F
Ribeiro, S.F.F.
63
Figura 14’ – Células de leveduras visualizadas em microscopia óptica após ensaio de
inibição do crescimento. (G) K. marxiannus (CE025) controle (sem adição de proteína);
(H) K. marxiannus (CE025) incubadas com 8 µg.mL-1 da fração F3; (I) P.
membranifaciens (CE015) controle (sem adição de proteína); (J) P. membranifaciens
(CE015) incubadas com 8 µg.mL-1 da fração F3. Barra = 20 µm.
G H
I J
Ribeiro, S.F.F.
64
Figura 15 – Células da levedura S. cerevisiae (CE1038) visualizadas em microscopia
óptica confocal. (A e B) S. cerevisiae crescidas por um período de 42 h, sendo (A)
células controle (sem adição da proteína) e (B) células da levedura S. cerevisiae
incubadas com 32 µg.mL-1 da fração F3. (C e D) S. cerevisiae crescidas por um período
de 60 h, sendo (C) células controle (sem adição da proteína) e (D) células da levedura
S. cerevisiae incubadas com 32 µg.mL-1 da fração F3. Barra = 10 µm
A B
C D
Ribeiro, S.F.F.
65
5.8.2 - MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VERREDURA
Nas figuras 16 e 16’ podemos visualizar as imagens feitas através de microscopia
eletrônica de varredura, das diferentes espécies de leveduras provenientes do ensaio
de inibição do crescimento, por um período de 18 h, onde observamos as células
crescidas em meio controle (sem adição de proteína) e em meio contendo a fração
F3 numa concentração de 16 µg.mL-1. Na figura 16 (A e B) observamos as células da
levedura C. guilliermondii, onde na presença de F3 (Figura 16B), as células
encontram-se ligadas umas as outras, parecendo haver uma dificuldade quanto a
liberação de seus brotos. Ao compararmos com as células controle (Figura 16A)
também é possível observar uma variação e alteração no formato das células,
apresentando-se mais alongadas, tornando-se diferenciadas.
Na figura 16 (C e D) observamos as células da levedura C. parapsilosis. Não houve
nenhum tipo de alteração entre as células incubadas com a fração F3 (Figura 16D) e
as células controle (Figura 16C). A disposição em que elas se encontram e seus
tamanhos parecem muito semelhantes.
Na figura 16 (E e F) observamos as células da levedura C. tropicalis, onde notamos
uma alteração bem significativa entre estas células, na presença da fração F3
(Figura 16F) é observada a formação de estruturas bem alongadas, que acreditamos
ser pseudohifas, estrutura que não foi observada nas células controle (Figura 16E),
que se desenvolveram apenas na forma leveduriforme.
Na figura 16’ (G e H) observamos as células da levedura K. marxiannus.
Observamos na presença da fração F3 (Figura 16’H) onde as células encontram-se
completamente agrupadas evidenciando uma dificuldade na separação do broto da
célula mãe assim como, é observada uma diferença quanto ao tamanho das células
quando comparadas as células controle (Figura 16’G).
Na figura 16’ (I e J) observamos as células da levedura P. membranifaciens, onde
houve uma leve alteração entre as células controle (Figura 16’I) e as células
incubadas (Figura 16’J). É observada uma diminuição no número de células
crescidas na presença da fração F3 e, além disso, as células encontram-se mais
espalhadas uma vez que as células controle encontram-se aglomeradas.
Ribeiro, S.F.F.
66
Na figura 16’ (K e L) são observadas as células da levedura S. cerevisiae na
presença (Figura 16’L) e na ausência da fração F3 (Figura 16’K). As células
crescidas na presença de F3 encontram-se ligadas umas as outras, parecendo haver
uma dificuldade na liberação do broto, porém elas não se encontram aglomeradas
como em algumas espécies de leveduras já observadas e isso pode ser observado
quando comparadas células controle (Figura 16’K), que encontram-se isoladas umas
das outras.
Ribeiro, S.F.F.
67
Figura 16 – Células de leveduras visualizadas em microscopia eletrônica de varredura.
(A) C. guilliermondii (CE013) controle (sem adição da proteína); (B) C. guilliermondii
(CE013) incubadas com 16 µg.mL-1 da fração F3; (C) C. parapsilosis (CE002) controle
(sem adição da proteína); (D) C. parapsilosis (CE002) incubadas com 16 µg.mL-1 da
fração F3; (E) C. tropicalis (CE017) controle (sem adição da proteína); (F) C. tropicalis
(CE017) incubadas com 16 µg.mL-1 da fração F3. A-D Barra = 1 µm; E-F Barra = 3 µm.
A B
C D
E F
Ribeiro, S.F.F.
68
Figura 16’ – Células de leveduras visualizadas em microscopia eletrônica de varredura.
(G) K. marxiannus (CE025) controle (sem adição da proteína); (H) K. marxiannus
(CE025) incubadas com 16 µg.mL-1 da fração F3; (I) P. membranifaciens (CE015)
controle (sem adição da proteína); (J) P. membranifaciens (CE015) incubadas com 16
µg.mL-1 da fração F3; (K) S. cerevisiae (CE1038) controle (sem adição da proteína); (L)
S. cerevisiae (CE1038) incubadas com 16 µg.mL-1 da fração F3. G-L Barra = 1 µm.
G H
I J
K L
Ribeiro, S.F.F.
69
5.8.3 - MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Na figura 17 podemos visualizar as imagens feitas através de microscopia
eletrônica de transmissão, das leveduras S. cerevisiae (Figura 17A, B e C) e C.
tropicalis (Figura 17D e E), crescidas por um período de 18 h, em meio controle (sem
adição de proteína) e em meio contendo a fração F3 numa concentração de 16 µg.mL-
1. A figura 17 B mostra que as células da levedura S. cerevisiae apresentam um
material nuclear desestruturado e organelas desorganizadas quando comparadas as
células controle (Figura 17 A). Na figura 17 C observamos uma leve descontinuidade
da membrana plasmática e provavelmente um extravasamento do material
citoplasmático. Na figura 17E observamos que quando a célula da levedura C.
tropicalis cresceu em presença da fração F3 seu material nuclear apresenta-se
alterado e também notamos uma leve descontinuidade da membrana plasmática, se
compararmos com as células controle (Figura 17 D).
Ribeiro, S.F.F.
70
Figura 17 – Células da levedura S. cerevisiae (CE1038) (A, B e C) e C. tropicalis
(CE017) (D e E) visualizadas em microscopia eletrônica de transmissão. (A) representa
a célula controle (sem adição de proteína) e, (B e C) representam as células incubadas
com 16 µg.mL-1 da fração F3. (B) Célula com alteração no material nuclear (estrela); (C)
Células com aparentes descontinuidades da membrana plasmática (setas). Em (D)
Observamos as células controle (sem adição de proteína) e, (E) representam as células
incubadas com 16 µg.mL-1 da fração F3. (E) Célula com alteração no material nuclear
(estrela). A, B e D Barra = 71 µm; C Barra = 25 µm e E Barra = 42 µm.
B C
D E
Ribeiro, S.F.F.
71
6. DISCUSSÃO
Ribeiro, S.F.F.
72
6.1 – Isolamento, purificação e caracterização dos peptídeos
Peptídeos antimicrobianos constituem um grupo de moléculas, produzidas por
diversos organismos, que têm sido utilizadas especialmente como agentes terapêuticos
por apresentarem uma vasta atividade antimicrobiana contra diversos fungos, bactérias
e vírus (Izadphanah e Gallo, 2005).
Devido ao grande número de peptídeos presentes em plantas, especialmente em
suas sementes, é que focamos o nosso trabalho no isolamento e na caracterização
desses peptídeos a partir de sementes de pimenta. Inicialmente através da maceração
dessas sementes e obtenção de uma farinha iniciamos todo o processo de purificação.
O processo de extração dos peptídeos foi realizado segundo metodologia descrita por
Diz et al., 2004. As proteínas obtidas a partir de um extrato rico em peptídeos (ERP)
foram inicialmente separadas utilizando métodos cromatográficos. A cromatografia em
CM-Sepharose resultou em 3 diferentes frações denominadas F1, F2 e F3 (Figura 2).
Em um trabalho recente, Diz et al. (2006) isolaram e caracterizaram um dos peptídeos
presentes na fração F1 obtida a partir dessa semente. Este peptídeo, uma proteína de 9
kDa, mostrou ser uma proteína transportadora de lipídeo (LTP) e apresentou alta
homologia com outras LTPs isoladas de plantas. Em continuidade aos nossos estudos
de purificação os peptídeos presentes na fração F3 foram separados através de uma
cromatografia em coluna de fase reversa C2/C18, onde obtivemos a presença de 4
frações distintas denominadas FR1, FR2, FR3 e FR4 (Fig. 3). Todas essas frações
mostraram através de eletroforese a presença de peptídeos isolados com massas
moleculares entre 6 e 10 kDa. Na tentativa de melhor caracterizar esses peptídeos
essas frações foram submetidas ao seqüenciamento N-terminal. Uma posterior
comparação em banco de dados indicou que a proteína de massa molecular próxima a
6 kDa, presente na fração FR3, apresentava homologia com alguns inibidores de
proteinase (Fig. 7) e que a proteína presente na fração FR4, de massa molecular
próxima a 8 kDa, apresentava homologia com proteínas de reserva do tipo napina
(denominadas albuminas 2S) (Fig.8). Ainda não foi possível obtermos uma seqüência
para as frações FR1 e FR2. As massas moleculares e as seqüências encontradas para
as proteínas presentes em cada uma das frações obtidas estão de acordo com outras
proteínas já isoladas de plantas e que apresentam massas moleculares esperadas para
Ribeiro, S.F.F.
73
peptídeos que possuem atividade antimicrobiana (Broekaert et al., 1997). A banda
protéica obtida na fração FR3 pertencente a família dos inibidores de proteinase,
apresenta homologia com outras proteínas dessa família isoladas de diferentes
espécies de plantas como N. tabacum, E. variegata; E. latissima; C. annuum; C.
annuum e P. tetragonolobus. Os membros da família dos inibidores de proteinase têm
sido estudados por apresentarem diversas funções, além de serem reguladores de
proteinases endógenas também estão relacionados a atividade de defesa de plantas
contra determinadas pragas e patógenos (Antcheva et al., 2001; Mosolov et al., 2001).
Já a banda protéica obtida na fração FR4 pertencente a família das napinas apresentou
homologia com proteínas dessa mesma família também isoladas de diferentes espécies
de planta como B. napus; B. juncea; R. sativus; P. edulis f. flavicarpa, S. indicum e G.
max. As proteínas da família das napinas também possuem essa atividade biológica
contra determinados agentes fitopatogênicos, porém também tem a função de atuarem
como fonte de nitrogênio para a planta durante a sua germinação (Neumann et al.,
1996; Ngai e Ng, 2004). Outros membros de proteínas antimicrobianas de baixa massa
molecular pertencentes a família das albuminas 2S também vêm sendo isolados de
outras plantas. Diferentes proteínas foram purificadas a partir de sementes de Malva
parviflora. Estas foram denominadas CW1 e CW4 e através de pesquisas em bancos
de dados verificaram que ambas possuem alta homologia com albuminas 2S, onde
CW1 apresentou 100 % de identidade de sua subunidade maior com albuminas de
Brassica napus e, CW4 mostrou 57 % de identidade com albuminas 2S presentes em
algodão (Wang e Bunkers, 2000). Uma proteína de 5 kDa, denominada Pe-AFP1, foi
purificada e caracterizada a partir de sementes de Passiflora edulis, e também mostrou
apresentar homologia com albuminas 2S de planta (Pelegrini et al., 2006). Agizzio et al.
(2003) isolaram e caracterizaram uma proteína a partir de sementes de Passiflora edulis
f. flavicarpa que apresentou homologia com albuminas 2S. Essa proteína de peso
molecular em torno de 12 kDa apresenta 2 cadeias, uma pesada de aproximadamente
8 kDa e outra leve de aproximadamente 4 kDa.
Ribeiro, S.F.F.
74
6.2 – Inibição do crescimento e acidificação do meio estimulado por glicose
Diferentes peptídeos têm sido estudados por apresentarem algum tipo de
atividade biológica in vitro contra uma variedade de patógenos fúngicos. Entre os
principais peptídeos estudados podemos destacar alguns grupos encontrados em
plantas como as tioninas, as defensinas, as proteínas transportadoras de lipídeos
(LTPs), entre outros (Broekaert et al., 1997; Castro e Fontes, 2005).
Durante o processo de purificação, foram testadas as atividades antifúngicas dos
peptídeos presentes no extrato rico em peptídeos (ERP), na fração F3 e
posteriormente, das frações FR3 e FR4 contra diferentes espécies de leveduras.
Notamos que na presença de concentrações que variavam entre 9 e 50 µg.mL-1 do
ERP várias das leveduras testadas tiveram o seu IC50 determinado em concentrações
inferiores a 50 µg.mL-1 enquanto outras somente foram capazes de atingir 50 % do seu
crescimento em concentrações maiores que 50 µg.mL-1 (Tabela 3). A partir desses
resultados fomos então testar o efeito da fração F3 sobre o crescimento de algumas
dessas leveduras. A partir desses resultados observamos, por exemplo, uma inibição
de 100 % das células da levedura S. cerevisiae em presença da fração F3 em todas as
concentrações testadas (Fig. 9A), como também observamos uma redução bem
acentuada do crescimento para as leveduras K. marxiannus (Fig. 10A), C. albicans (Fig.
10B) e C. guilliermondii (Fig. 10C) na presença da fração F3. Já para a levedura C.
tropicalis (Fig. 9D) nenhum efeito inibitório foi observado. Além desses resultados foi
testada também a atividade da fração FR3 e FR4 sobre o crescimento das leveduras S.
cerevisiae (Fig. 11A) e C. albicans (Fig. 11B), onde foi possível visualizar um efeito
inibitório maior da fração FR3. Essas variações encontradas no crescimento das
diferentes espécies de leveduras são influenciadas principalmente pelo
desenvolvimento diferenciado de suas células. Essa diferenciação ocorre
provavelmente devido a alterações morfológicas provocadas pelas frações ricas em
peptídeos no meio de crescimento. Nos últimos anos foi reportado que albuminas 2S
presentes em sementes de maracujá amarelo possuíam atividade antifúngica contra os
fungos F. oxysporum, C. lindemuthianum, C. musae e contra a levedura S. cerevisiae,
tanto inibindo seu crescimento quanto induzindo diversas alterações morfológicas de
suas células (Agizzio et al., 2003; 2006). Uma segunda albumina 2S também isolada de
Ribeiro, S.F.F.
75
sementes de Passiflora edulis denominada Pe-AFP1 e apresentando massa molecular
de 5 kDa também apresentava atividade antimicrobiana contra diferentes fungos
fitopatogênicos (Pelegrini et al., 2006). Foi também reportado que LTPs em sinergismo
com uma defensina, ambos isolados de sementes de feijão-de-corda, apresentavam
uma alta atividade antimicrobiana contra os patógenos fúngicos F. oxysporum e F.
solani induzindo várias alterações morfológicas de suas hifas (Carvalho et al., 2001).
Além dessas proteínas acima descritas nos últimos anos proteínas associadas a
inibidores de tripsina também tem mostrado possuírem a habilidade de inibir a
germinação de esporos de fungos em concentrações de 5 µg.mL-1, como é o caso da
proteína SAP16 (Giudici et al., 2000). Também foi visto recentemente que uma outra
proteína, denominada Psc-AFP, além de possuir atividade associada a inibidores de
tripsina foi também capaz de inibir o crescimento dos fungos Alternari brassicae,
Aspergillus nuger, Fusarium oxysporum e Rhizoctonia cerealis (Yang, et al., 2006).
Na membrana plasmática dos fungos estão presentes H+-ATPases que
desempenham um papel essencial em sua fisiologia celular, interferências no
funcionamento destas bombas podem levar a morte do fungo. Em função deste papel
das H+-ATPases, monitoramos a acidificação do meio estimulado por glicose de células
da levedura S. cerevisiae na presença de várias concentrações da fração F3, variando
de 2 a 16 µg.mL-1, e verificamos que esta foi capaz de inibir em 100 % a acidificação do
meio em todas as concentrações utilizadas, independente do tempo em que as células
permaneceram incubadas (Fig. 13). Este fato pode ocorrer pela indicação de que a
inibição da levedura por essa fração pode ser mediada tanto por uma inibição da H+-
ATPase presente na membrana plasmática da levedura quanto por um aumento da
permeabilidade de H+ também nesta membrana. Dessa forma, o efeito inibitório da
fração F3 sobre a acidificação do meio das células da levedura S. cerevisiae pode estar
correlacionada com a inibição do crescimento celular das diferentes leveduras
estudadas. Até o momento, a informação sobre os mecanismos de ação dos peptídeos
antimicrobianos ainda é muito limitada. Diferentes peptídeos têm sido estudados e
observa-se a habilidade que alguns deles possuem de agir ao nível da membrana
plasmática, além de promoverem um fluxo de íons através desta membrana. Thevissen
et al. (1999) demonstraram que quando os fungos Neurospora crassa e Fusarium
culmorum foram testados com defensinas de planta, Rs-AFP2 e Dm-AMP1, um fluxo de
Ribeiro, S.F.F.
76
íons através da membrana plasmática foi observado. Também tem sido estudada a
atividade antifúngica da osmotina e acredita-se que ela também esteja envolvida em
atividades ao nível da membrana plasmática. Yun et al. (1997) mostraram que
osmotinas tanto induzem a lise de esporo, inibindo a sua germinação quanto reduzem a
viabilidade em muitas espécies fúngicas que exibiram algum grau de sensibilidade na
inibição do crescimento das hifas. A inibição do crescimento de determinadas espécies
fúngicas foi correlacionada com a habilidade das osmotinas de dissiparem um gradiente
de pH na membrana fúngica. Experimentos genéticos também mostraram que a
suscetibilidade de alguns microrganismos é regulada por proteínas que controlam a
composição da parede celular (Yun et al., 1998; Ibeas et al., 2000 e 2001). Em adição,
albuminas 2S presentes em sementes de maracujá amarelo também destacaram-se por
apresentarem a capacidade de inibir a acidificação do meio estimulado por glicose de
células da levedura S. cerevisiae e também de fungos fitopatogênicos. Além de
estarem envolvidas na inibição, também estão relacionadas ao fato de promoverem a
permeabilização da membrana dos fungos os quais tiveram contato (Agizzio et al., 2003
e 2006). Recentemente, foi demonstrado por Diz et al. (2006) que peptídeos presentes
em sementes de pimenta inibem em até 100 % a acidificação do meio de células da
levedura S. cerevisiae utilizando-se uma concentração de 160 µg.mL-1 da fração F1 que
em contato com as células da levedura mostrou-se responsável por promover a
permeabilização através da membrana plasmática.
6.3 – Análise morfológica e ultraestrutural de células de leveduras induzidas pelos peptídeos presentes na fração F3
Nos últimos anos, diversos autores têm demonstrado a habilidade que
determinados peptídeos possuem de inibir o crescimento de determinados patógenos e
promoverem uma alteração morfologia em suas células.
Neste trabalho foram realizados testes adicionais para avaliar a ação da fração
F3 sobre as células das leveduras estudadas. Através de microscopias ópticas e
eletrônicas verificarmos possíveis alterações provocadas por esta fração sobre suas
células. Análises feitas através de microscopia óptica das leveduras S. cerevisiae (Fig.
14 A), C. albicans (Fig. 14 C), C. topicalis (Fig. 14 E), K. marxiannus (Fig. 14’ G) e P.
membranifaciens (Fig. 14’ I) mostraram que as culturas incubadas com a fração F3
Ribeiro, S.F.F.
77
exibiram uma notável inibição do crescimento assim como algumas alterações
morfológicas como pode ser observado para a levedura C. tropicalis (Fig. 14 F) que
além de apresentar uma redução no número de células também apresentou alteração
em sua morfologia. Observações através de microscopia óptica indicaram que quando
tratadas com a fração F3 as células encontram-se agrupadas e com o citoplasma
bastante desorganizado (Fig. 15). Ao analisarmos as células através de microscopia
eletrônica de varredura, observamos também diversas alterações morfológicas
especialmente na superfície das células. Alterações na formação e liberação dos brotos
foram observadas para as leveduras C. guilliermondii (Fig. 16 B), K. marxiannus (Fig.
16’ H) e S. cerevisiae (Fig. 16 F). Além disso, transições dimórficas com o
desenvolvimento de pseudohifas foram observadas no crescimento da levedura C.
tropicalis (Fig. 16 F) na presença da fração F3. É interessante ressaltar que esse
dimorfismo celular pode ocorrer devido a alterações no pH do meio em que estas
células se encontram e isso pode ser confirmado pelo fato dessa fração F3 estar
provavelmente atuando na membrana plasmática dessas leveduras alterando
diretamente o funcionamento das H+-ATPases, que são responsáveis pelo
bombeamento de H+ através dessa membrana, ou promovendo de alguma forma a
permeabilização direta desta. Transições dimórficas têm sido encontradas como sendo
controladas pelo pH de células da levedura C. albicans, o crescimento micelial é
favorecido pela incubação em pH, sobre condições ácidas, mas somente no meio
contendo glicose o fungo cresce em sua forma leveduriforme (Soll, 1985). Osborn et al.
(1995) relataram que defensinas de planta isoladas de diferentes sementes causam
alterações morfológicas muito distintas em alguns, mas não em todos os fungos
testados. Baseado nos efeitos antimicrobianos observados, duas classes de defensinas
podem ser distinguidas: as defensinas morfogênicas, as quais causam elongação das
hifas reduzidas com um concomitante aumento da ramificação das hifas, e as
defensinas não morfogênicas, que somente reduzem a elongação da hifa, mas não
induzem nenhum tipo de alteração morfológica. Diz et al. (2006) também demonstraram
que peptídeos presentes na fração F1 de sementes de C. annuum promovem a
transição das formas levedura-pseudohifas de culturas da levedura C. albicans e
acreditam que essa transição ocorra devido a inibição da acidificação do meio como
conseqüência da permeabilização da membrana plasmática promovido pelos peptídeos
Ribeiro, S.F.F.
78
da fração F1. Em adição ao desenvolvimento de pseudohifas observou-se também uma
dificuldade que determinadas espécies apresentam em liberarem seu broto. Já foi
demonstrado por Baladrón et al. (2002) que mutantes da levedura S. cerevisiae
possuem um defeito na separação celular entre as células mãe e o seu broto
acreditando-se que isso ocorra devido a presença de sistemas complexos de enzimas
que podem estar reestruturando a parede celular da levedura, contribuindo assim para
que haja a formação de cadeias celulares lineares, assemelhando-se ao crescimento
de pseudohifas.
Quando observamos através de microscopia eletrônica de transmissão as
células das leveduras S. cerevisae (Fig. 17 A) e C. tropicalis (Fig. 17 A) notamos que
quando incubadas com a fração F3, há um encolhimento do citosol, desorganização do
material nuclear e também de outras organelas e uma membrana plasmática levemente
deformada. É importante ressaltar que nem todas estas características foram
observadas em todas as células, mas ocorreram com bastante freqüência, estas
características são muito similares as observadas nas células que sofrem apoptose.
Apoptose ou morte celular programada é um processo distinto no qual a célula ativa um
programa suicida intrínseco resultando em alterações seqüenciais que levam a morte
celular com um empacotamento dos constituintes celulares em pedaços ligados a
membrana (Yun et al., 1998). Tem sido demonstrado que osmotinas não somente
induzem a uma rápida morte celular em leveduras, como também existe uma
especificidade entre a atividade antifúngica de uma proteína da família PR-5 e a
membrana de sua célula alvo (Abad et al., 1996; Yun et al., 1998; Anzlovar et al., 1998).
Também tem sido demonstrado que componentes da parede celular são importantes
determinantes da resistência a osmotina e que resistências diferenciadas entre as
diferentes espécies de levedura com a membrana plasmática como sendo alvo para a
osmotina é determinado por variações na arquitetura da parede celular. Entre os
determinantes de resistência previamente identificados, encontra-se a família das
proteínas localizadas na parede celular das leveduras, denominadas proteínas PIR
(Yun et al., 1998; Anzlovar et al., 1998). Interessantemente, resultados obtidos por Crimi
et al (2006) também mostraram o efeito de uma LTP de planta induzindo uma cascata
apoptótica a nível mitocondrial. Albuminas 2S também foram capazes de causar
Ribeiro, S.F.F.
79
modificações semelhantes a processos apoptóticos como mostrado por Agizzio et al.
(2006).
Assim, o estudo da atividade antimicrobiana e das diferentes características
moleculares presentes nos diferentes grupos de proteínas e peptídeos é de
fundamental importância para que possamos compreender os mecanismos pelos quais
estes agem sobre o desenvolvimento de patógenos. Dessa forma, será possível utiliza-
los como agentes terapêuticos no tratamento de determinadas infecções causadas por
certos agentes patogênicos, especialmente de leveduras.
Ribeiro, S.F.F.
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7. CONCLUSÕES
Ribeiro, S.F.F.
81
•••• Foram isoladas três proteínas de baixa massa molecular, denominadas FR2, FR3 e
FR4 a partir da fração F3 isolada do extrato rico em peptídeos de sementes de pimenta
e essas proteínas apresentaram valores de massas moleculares entre 8 e 6 kDa;
•••• As seqüências de aminoácidos obtidas a partir de dois dos peptídeos isolados, FR3 e
FR4, da fração F3 apresentaram homologia com inibidores de proteinase e com
napinas, respectivamente, de diferentes espécies de plantas;
•••• O extrato rico em peptídeos foi capaz de induzir uma inibição de aproximadamente 50
% o crescimento de algumas das leveduras testadas em concentrações inferiores a 9
µg.mL-1 enquanto outras foram inibidas apenas com concentrações superiores a 50
µg.mL-1;
•••• A fração F3 também foi capaz de inibir o crescimento das leveduras nas várias
concentrações utilizadas, atingindo uma inibição de 100 % em algumas delas;
•••• A fração F3 inibiu fortemente a acidificação do meio estimulado por glicose de células
da levedura S. cerevisiae, nos diferentes tempos e nas diferentes concentrações
utilizadas;
•••• As células das leveduras C. guilliermondii, K. marxiannus e S. cerervisiae
apresentaram alterações morfológicas quando crescidas na presença da fração F3,
apresentando-se agrupadas, sugerindo uma deficiência na liberação do broto.
•••• Células da levedura C. tropicalis apresentaram alterações morfológicas com a
formação de estruturas denominadas pseudohifas quando crescidas na presença da
fração F3.
•••• Células das leveduras S. cerevisae e C. tropicalis quando crescidas em presença da
fração F3 apresentaram modificações ultraestruturais apresentando uma leve
desorganização da membrana plasmática além de uma alteração do material nuclear.
Ribeiro, S.F.F.
82
•••• A fração FR3 foi capaz de inibir fortemente o crescimento da levedura S. cerevisiae na
concentração utilizada, atingindo 100 % de sua inibição.
Ribeiro, S.F.F.
83
8. BIBLIOGRAFIA
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