HABILIDADES BIOMÉDICAS 7° ETAPA: EXTRAÇÃO DE DNA VEGETAL E ANIMAL

O primeiro passo para a aplicação das técnicas que envolvem o estudo do DNA, é a obtenção deste polímero. O objetivo desta prática é demonstrar a partir de um método simplificado e “caseiro” como podemos obter DNA para estudos. A extração de DNA de células eucariontes consta fundamentalmente de três etapas: a) ruptura das células para liberação dos núcleos; b) desmembramento da cromatina em seus componentes básicos, DNA e proteínas; c) separação do DNA dos demais componentes celulares.

1) Materiais para isolamento de DNA vegetal por grupo (7 grupos):a) Água destilada morna (aprox. 37°C);b) Álcool 70% deixado previamente no congelador;c) Bastão de madeira;d) 1 Colher de chá e 1 colher de sopa;e) Detergente (preferencialmente incolor) de cozinha;f) Funil de vidro;g) 3 a 5 morangos maduros;h) Gaze;i) 2 Provetas graduadas de vidro (50 e 250ml);j) Sal doméstico;k) 2 Tubos de microcentrífuga (1ml);l) 2 Tubos tipo Falcon (15ml);m) Micropipeta de 50ul e ponteira de plástico;n) Suporte para tubos.o) Pipeta Pasteur de plásticop) 1 saco do tipo ziploc.q) sal domésticor) Centrífuga para tubos

Procedimento:a) Colocar os morangos em um saco plástico tipo ZipLoc e amassá-los bem.b) Preparar uma solução de lise (proveta de 50 ml) contendo 50 ml de água morna, 5 colheres (chá) de sal e 5 colheres (sopa; aprox. 10ml) de detergente, misturando bem até dissolver completamente;c) Adicionar toda solução de lise aos morangos e homogeneizar durante 10 minutos;d) Filtrar a solução obtida com auxílio de uma gaze acoplada a um funil e uma proveta de 250 ml;e) Adicionar à solução filtrada 50 ml de álcool gelado pelas beiradas da proveta cuidadosamente (aprox. 1:1);f) Esperar de 2 a 3 minutos sem misturar;g) Observar a formação de filamentos esbranquiçados;h) Retirar cuidadosamente, com auxílio da pipeta Pasteur de plástico ou bastão de vidro ou madeira, os filamentos que se formarão (DNA) e colocá-los em tubo tipo Falcon (15ml).i) Centrifugar durante 2 minutos a 2000rpm.j) Retirar o sobrenadante e ressuspender a amostra em aproximadamente 2 ml de água destilada. k) Retirar uma alíquota (20ul) da solução de DNA e incubar com 50ul de DNAse ou 50ul de água destilada em tubo de microcentrífuga de 1ml.l) Armazenar o conteúdo em freezer (-20°C).

2) Materiais para isolamento de DNA genômico da mucosa bucal por grupo (7 grupos):a) Água morna (37°C);b) Álcool 70% deixado previamente no congelador;c) Colher de chá;d) Copo tipo americano de plástico;e) Micropipeta de 1ml e ponteira de plástico;f) Sal doméstico;g) 2 Tubos tipo Falcon (15 ml);h) 2 Tubos de microcentrífuga (2 ml);i) Suporte para tubos;j) Proveta graduada de vidro de 100mlk) sal domésticol) bastão de vidrom) Pipeta Pasteur de plástico.

Procedimento:a) Adicionar duas colheres (chá) de sal em um copo de água (tipo americano - aproximadamente 200 ml), mexendo bem até dissolver completamente;b) Colocar dentro da boca uma boa quantidade da solução salina preparada e fazer movimentos de bochechos por aproximadamente 5 minutos;e) Passado esse tempo, despejar todo conteúdo em proveta de 100ml. f) Adicionar à solução obtida uma quantidade igual de álcool 70% gelado, deixando-o escorrer vagarosamente pela borda. g) Imediatamente, serão formadas duas fases, sendo que fios esbranquiçados, que são aglomerados de moléculas de DNA, tornar-se-ão visíveis na fase superior;h) Coletar esses fios com o auxílio de uma micropipeta ou pipeta Pasteur de plástico a partir de movimentos circulares vagarosos na fase superior;i) Passar o DNA coletado para um tubo tipo Falcon (15ml);i) Centrifugar durante 2 minutos a 2000rpm.j) Retirar o sobrenadante e ressuspender a amostra em aproximadamente 2 ml de água destilada. k) Retirar uma alíquota (50ul) da solução de DNA e incubar com 50ul de DNAse ou 50ul de água destilada em tubo de microcentrífuga de 1ml.l) Armazenar o conteúdo em freezer.(-20°C)

Discussão dos Resultados:a) Por que devemos amassar bem os morangos no início da extração de DNA?b) Quais são as funções do detergente e do sal na solução de extração (solução de lise)?c) O que ocorre quando adicionamos o álcool gelado na amostra?d) Há semelhanças e diferenças entre o DNA de origem animal (humano) e o de origem vegetal (morango)?e) Por que devemos retirar o álcool da amostra de DNA e ressuspender em água destilada?f) Por que devemos adicionar DNAse à amostra de DNA vegetal ou animal?g) Quais as técnicas utilizadas em laboratório para análise do DNA?

Respostas:

a) A maceração rompe a parede celular das células do morango.