Inserção de nanopartículas de prata em hidroxiapatita: efeito

antibacteriano sobre Staphylococcus aureus

Flávio Augusto Cavadas da Silva Andrade1*, Eliana Cristina da Silva Rigo2, Luci Cristina de

Oliveira Vercik2, Marisa Pires de Melo2, Luciane Tavares da Cunha2, Elaine Toscano

Miranda3, Carla Raquel Fontana3

1Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia, Universidade de São Paulo, São Carlos (SP), Brasil 2Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São

Paulo, Pirassununga (SP), Brasil 3Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, Araraquara (SP), Brasil

*E-mail: flavio.andrade@usp.br

Resumo. Hidroxiapatita contendo nanopartículas de prata (HAAgNPs) foi obtida pelo processo de imersão do pó de HA em soluções diluídas contendo diferentes concentrações de nanopartículas de prata (AgNPs). O pó de hidroxiapatita foi obtido por precipitação química e as AgNPs foram sintetizadas sob duas diferentes condições usando quitosana como agente redutor e estabilizante. As sínteses de nanopartículas de prata foram confirmadas por estudos de espectroscopia Uv-vís e por análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de alta resolução que revelou tamanhos de nanopartículas entre 5 e 10 nm de diâmetro. A presença da prata no pó foi confirmada através de um detector sensível de raios X (EDS) acoplado a um microscópio de alta resolução que também permitiu observar detalhes das características morfológicas do pó. A difração de raios X (DRX) dos pós demonstrou não haver mudança na estrutura cristalina após inserção das AgNPs e apresentou fases majoritárias da HA bem definidas. O efeito antibacteriano foi avaliado nas soluções de AgNPs e pós de HAAgNPs usando cepas de Staphylococcus aureus. Para as soluções de AgNPs usou-se o método de microdiluições seguido do teste bactericida e comparou-se com o efeito de soluções de nitrato de prata. Os halos de inibição foram avaliados pelo teste de disco-difusão nos pós após 24 h do inóculo com S. aureus. Os resultados mostraram efeito bactericida das nanopartículas de prata superior ao do nitrato de prata nas diferentes diluições estudadas e presença de halos de inibição crescentes nas amostras das HAAgNPs. Assim, o método de imersão da HA em AgNPs, mesmo utilizando baixas quantidades de nanopartículas, é promissor para a obtenção de biomateriais usados em preenchimentos e implantes ósseos com propriedades antibacterianas.

Palavras-chave: Hidroxiapatita, Nanopartículas de prata, Efeito antibacteriano, Staphylococcus aureus

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de materiais avançados para aplicações biomédicas está entre um dos problemas mais importantes enfrentados pela engenharia de materiais (Orlovskii; Komlev; Barinov; 2002). Apesar do grande uso de materiais metálicos nas aplicações ortopédicas existe ainda uma série de problemas associadas como corrosão, desgaste e reações negativas (Suchanek; Yoshimura, 1998). Como alternativa, têm-se os biomateriais inorgânicos baseados em fosfatos de cálcio e dentre estes, destaca-se a hidroxiapatita sintética (HA,

Ca10(PO4)6(OH)2) devido a suas propriedades de biocompatibilidade, bioatividade e osteocondutividade (Hench, 1998; Zakharov et.al., 2004; Verret et.al., 2005; apud Ciobanu et.al, 201). Nesse sentido, hidroxiapatita tem sido utilizada amplamente como preenchimento em cirurgias ortopédicas, maxilofaciais e bucais, além de do uso como recobrimento em próteses metálicas com o objetivo de melhorar as propriedades biológicas destes materiais (Tanaskovic et.al, 2007; apud Ciobanu et.al, 2011).

Embora as taxas de sucesso dos implantes sejam dependentes da osteointegração, a sobrevivência longa dos implantes é dependente da prevenção de infecções bacterianas após a colocação dos implantes (Chen et.al., 2006). Em artoplastias as taxas de infecções associadas são altas e causam efeitos devastadores nos pacientes tais como redução do tempo de vida útil e aumento das taxas de falhas das próteses. Essas infecções são ainda responsáveis por enormes custos médicos, aumento de morbidade e diminuição da satisfação dos pacientes (Chen et.al., 2007).

Uma estratégia comum para tratar e prevenir infecções associadas aos implantes ortopédicos é injetar antibióticos de maneira controlada nos locais dos implantes com o objetivo de administrar altas doses locais sem exceder a toxicidade sistêmica dos medicamentos (Leach; Wilson, 1992). Entretanto, a capacidade de certas cepas bacterianas desenvolverem resistências contra antibióticos tem despertado o interesse em entregas controladas por outros agentes antibacterianos com uma ampla atividade e baixa incidência de resistência, tais como prata e zinco (Zhang; Qiao; Chen, 2007).

O amplo espectro antibacteriano da prata é conhecido há muitos anos na literatura e muitos trabalhos têm se dedicado a explicar como ocorre esse fenômeno (Morones et.al, 2005). O mecanismo mais aceitável indica que as nanopartículas se aderem na superfície carregada negativamente das membranas celulares conduzindo a desnaturação de proteínas e levando a uma consequente morte celular. Em paralelo, vários autores têm sugerido que as nanopartículas possam penetrar no interior celular causando danos pela interação com átomos de enxofre e fósforo presente em ligantes de proteínas e no DNA (Panacek et.al, 2006). As cepas bacterianas comuns envolvidas em infecções estão incluídas na lista de patógenos que a prata pode eliminar. Da mesma maneira, a toxicidade para baixas concentrações de prata para células humanas é bem estabelecida (Sondi; Salopek-Sondi, 2004; Anchun, 2008). Nanopartículas de prata mostram propriedades antimicrobianas mais eficientes que outros sais de prata devido a maior área de superfície e a baixa solubilidade o que permite melhor contato com os microorganismos (Miranda et. al., 2010). Na maioria dos estudos as nanopartículas de prata são relatadas como atóxicas para baixas concentrações e com efeitos tóxicos para altas concentrações.

Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da hidroxiapatita contendo para pequenas quantidades de nanopartículas de prata sobre a bactéria Gram-positiva S. aureus, buscando minimizar os efeitos citotóxicos pela inserção da prata no biomaterial. O efeito antibacteriano foi avaliado usando os métodos de disco-difusão pra os pós e através de microdiluições seguidos de teste bactericida para as soluções.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Foram utilizados os reagentes de grau analítico hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e ácido fosfórico (H3PO4) na etapa de precipitação da hidroxiapatita. Para a obtenção das nanopartículas de prata usou-se quitosana com grau de desacetilação de 85% (Polymar S/A), nitrato de prata (AgNO3) e ácido acético 99,5%, ambos da marca Synth. Para o teste de halo de inibição utilizou-se meio de cultura Ágar Mueller-Hinton (padrão para antibiograma) e

cepa Staphylococcus aureus ATCC 29213 (padrão usada em testes de susceptibilidade) doada pela Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ).

2.1 Síntese do pó de hidroxiapatita

Obteve-se a hidroxiapatita por precipitação química mediante a reação entre ácido fosfórico e hidróxido de cálcio. Uma solução 0,5 M de H3PO4 foi gotejada lentamente em uma solução de Ca(OH)2 na concentração de 0,5 M, sob agitação constante e na temperatura ambiente. Após gotejamento, a solução foi mantida sob agitação constante por 18 horas e ajustou-se o pH para 7,0 com auxílio de uma solução 0,5 M de H3PO4. Em seguida, a suspensão foi filtrada usando papel filtro (Qualy) com 14 µm, lavada duas vezes com água destilada e seca em estufa a 60°C. Esse sólido foi desaglomerado facilmente usando-se pistilo e almofariz de ágata, peneirado (<180 µm) e, finalmente, calcinado a 800°C por um período de 3 horas.

2.2 Síntese de nanopartículas de prata (AgNPs)

Todas as soluções coloidais de nanopartículas de prata utilizadas foram sintetizadas por uma metodologia simples de Wei e Qian (2008). Preparou-se uma solução de quitosana na concentração de 6,92 mg/mL usando-se uma solução de ácido acético a 1% até a completa homogeneização. Para a síntese de nanopartículas foi preparado uma mistura usando a proporção de 4 mL de AgNO3 (52 mM) para 10 mL de solução de quitosana preparada previamente. Após 30 minutos sob agitação e em temperatura ambiente, a mistura foi transferida para tubos de ensaios de vidro em banho-maria na temperatura de 95°C por 6, 12, e 24 horas.

2.3 Inserção da AgNPs na matriz de hidroxiapatita

Foram preparadas quatro diluições com quantidades crescentes de nanopartículas de prata a partir da solução coloidal de AgNPs sintetizada previamente. Usou-se a solução sintetizada com síntese de 6 horas para a imersão de 10 g da hidroxiapatita, preparada via precipitação química, à temperatura ambiente por 30 minutos. Todas as diluições tinham como volume final 50 mL e para cada uma foi feito um cálculo das concentrações de prata adicionadas. Logo em seguida, a suspensão foi filtrada, seca em estufa a 60°C por 24 horas e calcinadas novamente a 800°C. Parte do pó foi prensado em forma de discos com 10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura para o teste de disco-difusão.

2.4 Avaliação antibacteriana – halo de inibição e teste bactericida

A metodologia seguida para halo de inibição foi adaptada da norma global consensual M2-A8 do NCCLS (2003). O meio Ágar Mueller-Hinton foi preparado conforme as instruções do fabricante, esterilizado e distribuído em placas de Petri. Para a obtenção da bactéria, 100 µL da solução estoque de S. aureus (armazenada em glicerol 10% e mantida sob congelamento) foram incubadas em 10 mL de caldo BHI (infusão de cérebro e coração) e ficaram sob agitação constante por 18 horas a 37ºC até atingir exponencial do crescimento. A cultura foi diluída para 3x108 UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônia/mL) e 100 µL desta suspensão foram inoculadas nas placas de Petri preparadas previamente. Sobre a superfície da placa semeada foram depositados discos com 10 mm de diâmetro, sendo uma desses a hidroxiapatita pura (controle negativo) e as demais referentes a cada uma das amostras dos pós (HAAgNPs). As placas foram incubadas a 37ºC, por 24 horas e após este período, foram

registradas imagens fotográficas dos halos de inibição. Os resultados foram feitos em triplicata e os halos de inibição foram comparados entre si.

Para o teste bactericida das soluções coloidais foi utilizando placas de microdiluição (96 poços) contendo diluições em série da solução de nanopartículas de prata sintetizada com 6 horas e diluições para o nitrato de prata, sob as mesmas condições, em caldo de Mueller-Hinton (Becton Dickinson, Sparks, MD) de acordo com as normas atuais da CLSI (2012) (anteriormente NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003). As bactérias adicionadas foram provenientes de colônias de placas frescas, no qual um inóculo de aproximadamente 1x108 unidades formadoras de colônias por mililitro (CFU / mL) foi obtido e diluído 10 vezes para a obtenção final de um meio liquido de 1x107 UFC / mL.

Volumes iguais de diferentes concentrações em série de nanopartículas de prata e de nitrato de prata foram preparadas para resultar nas concentrações finais desejadas (1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64). Para cada ensaio, placas de 96 poços, contendo 0,1 ml de cultura em crescimento exponencial de S. aureus em caldo de Mueller-Hinton foram inoculados com 0,1 ml das diluições em série contendo as substancias nanopartículas de prata e de nitrato de prata. Utilizando o mesmo meio de cultura (Mueller-Hinton), 5 μl de cada diluição foi testada em placas de Petri para o teste bactericida usando S. aureus.

2.5 Caracterização

As propriedades ópticas das soluções de nanopartículas foram medidas usando espectrofotômetro Uv-vís (Beckman Coulter, DU 800 Spectrophotometer) e em todas as leituras contendo as soluções coloidais sintetizadas utilizou-se a mesma diluição de 1:10.

As amostras dos pós (antes e após a inserção) foram caracterizadas por difração de raios X (Analytical X-Ray Systems, Siemens D5005, Germany). Os dados foram coletados fazendo o ângulo (2θ) variar de de 20° a 60° com passos de 0,033° a cada segundo.

O tamanho das nanopartículas e a morfologia do pó foram examinados usando um microscópio eletrônico de varredura de alta resolução com módulo de transmissão (SEM, FEI Company, MAGELAN 400L) que possui detector de energia dispersiva (EDS) acoplado. Para a preparação, as amostras foram dispersas com auxílio de ultra-som de banho em etanol por 5 minutos para formar suspensões bem diluídas. Uma parte retirada da suspensão foi depositada em grades de cobre recobertas com fita de carbono próprias para microscopia de transmissão.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A síntese de nanopartículas foi evidenciada através da cor amarelo-marrom formada pelo colóide após cada síntese e confirmada com o auxílio de um espectrofotômetro usando uma varredura no espectro do Uv-vís. Na Fig. 1 é possível notar o espectro de absorção da banda plasmônica das nanopartículas de prata e o valor máximo da absorção da luz para cada uma das AgNPs sintetizadas que corresponde a valores próximos de 420 nm. Para obter valores de absorção máxima (Amáx) abaixo de 1,0 u.a. como na Fig. 1 e assim possibilitar melhor comparações entre os espectros (linearidade da Lei de Beer), as todas leituras no espectrofotômetro foram diluídas na proporção de 1:10, como descrito anteriormente.

Figura 1. Espectro de absorção do Uv-vís para nanopartículas sintetizadas em 6 h (inferior), 12 h (intermediária) e 24 h (superior)

A posição e a forma da banda de absorção da superfície plasmônica obtida é similar a nanopartículas de prata esféricas encontrada na literatura. Avaliando o comprimento de onda no máximo de absorção das diferentes soluções sintetizadas (λmax), podemos retirar informações sobre o número de partículas formadas em cada síntese e sugerir tamanhos médios do diâmetro das nanopartículas formadas. As nanopartículas que possuem menor diâmetro tendem a ter o comprimento de onda do máximo de absorção deslocado para a região do espectro de luz do ultravioleta, enquanto um aumento do tamanho médio das nanopartículas é seguido por um deslocamento para a região do espectro de luz do vermelho (colóide sintetizado com 12 h na Fig. 1). Assim, com o aumento do tempo de síntese das AgNPs é possível estimar uma maior quantidade de nanopartículas formadas, e um provável aumento do diâmetro médio de nanopartículas que não é interessante. Como desejamos partículas de menores tamanhos e em baixa quantidade com o objetivo de aumentar a área superficial total da prata e obter baixa citotoxicidade, a síntese com 6 horas mostra-se mais interessante para o processo de impregnação de nanopartículas na hidroxiapatita.

Usando a solução de nanopartículas sintetizada em 6 horas, foram feitas diluições e acrescentado o pó em determinadas proporções, conforme a Tabela 1.

Tabela 1. Relação das amostras de hidroxiapatita contendo soluções coloidais de AgNPs durante o processo de imersão. As concentrações máximas de prata (partes por milhão) nas soluções diluídas foram calculadas para cada caso.

Amostra Volume de AgNPs (mL)

Volume de água destilada (mL)

Proporção das diluições

Concetração de prata máx

(ppm)1 1 49 1:50 502 5 45 1:10 2513 10 40 1:5 5044 25 25 1:2 1260

Foi feito a leitura do espectro Uv-vís das diluições contendo diferentes quantidades de

nanopartículas no momento inicial do contato com a hidroxiapatita (antes da imersão) e logo

300 400 500 600 7000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Inte

nsida

de

Comprimento de onda (nm)

filtrado 4 filtrado 3 filtrado 2 filtrado 1

300 400 500 600 7000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Inte

nsida

de

Comprimento de onda (nm)

Amostra 4 Amostra 3 Amostra 2 Amostra 1

após 30 minutos da imersão (a solução após ser filtrada). Os espectros são mostrados na Fig. 2.

Figura 2. Espectro de absorção do Uv-vís para as soluções diluídas do colóide sintetizado com 6 horas antes da imersão (esquerda) e após (direita).

Nota-se que houve absorção total das nanopartículas na matriz da hidroxiapatita para as amostras 1, 2 e 3 já que o sinal foi para zero após a imersão da HA (lado direito da Fig. 2). Para a amostra 4 (mais concentrada e com diluição 1:2, conforme Tabela 1), nota-se apenas uma diminuição do da intensidade da curva Uv-vís indicando uma provável saturação da matriz no processo quando uma quantidade bem maior de AgNPs é usado.

Todos os pós dopados, inclusive a hidroxiapatita pura obtida por precipitação química, foram analisados pela técnica de DRX. Foi obtido majoritariamente a fase da HA tanto para o pó precipitado quimicamente quanto para as amostras após a imersão com AgNPs. Os picos característicos da hidroxiapatita (2θ=31,7°; 32,9°; 32,2°; 25,9°; 49,4°; 46,7°; 39,8°; 34°; 28,9°) podem ser observados na Figura 3 que contém os espectros de DRX para o pó puro da amostra 4 (maior concentração) que é igual ao espectro das outras amostras dopadas. Como a quantidade adicionada de nanopartículas na dopagem foi bem pequena não é possível detectar no espectro as reflexões de Bragg para a prata metálica.

Figura 3. Comparativo dos espectros de DRX obtidos através da HA pura e da amostra 4 dopada. A estrutura cristalina é majoritária para a hidroxiapatita.

Figura 4. Micrografias eletrônicas de varredura para dois aumentos diferentes. Na direita, detalhes da morfologia do MEV com módulo de transmissão de uma estrutura da amostra 4

após desaglomeração no ultra-som. etrônicas de varredura com módulo de transmissão para as AgNPs sintetizadas após 6h.

Figura 5: Micrografias eletrônicas de varredura com módulo de transmissão para as AgNPs sintetizadas após 6h. A barra da escala corresponde a 100 nm.

As imagens da micrografia eletrônica de varredura (MEV) usando o modo elétrons secundários (SE) evidenciaram a presença de prata para a amostra contendo maior concentração de prata (amostra 4). Na Fig. 4 é possível tem-se ao lado esquerdo o pó aglomerado usando um aumento de 5.000x. Após desaglomeração com etanol e usando MEV com módulo de transmissão (STEM), é possível observar maiores detalhes da morfologia dão

pó de HAAgNPs (lado direito da Fig. 4). Esse pó possui boa estrutura cristalina com tamanhos médios de 50nm e com formas variadas.

Na Fig. 5 é possível visualizar as nanopartículas de prata (pontos escuros) provenientes da solução sintetizada com 6 horas, sendo a maioria de formatos esféricos e com tamanhos médios de diâmetros de 10 nm. A imagem foi obtida por microscopia eletrônica com módulo de transmissão (STEM) usando o modo de campo claro (BF) que revela as nanopartículas de prata como os pontos escuros já que estas por terem alta densidade absorvem a luz transmitida.

Com o espectro de EDS avaliada na amostra 4 também foi possível confirmar a presença de prata após a inserção no pó. O mapeamento da distribuição simultânea dos elementos numa região do pó é evidenciado na Fig. 6-a. Para um bom mapeamento como o da Fig. 6 foi necessário um tempo mínimo de 30 minutos para o detector acoplado ao equipamento atingir o máximo de contagem dos elementos. Já na Fig. 6-b temos informações das quantificações dos elementos para a amostra 4.

A avaliação dos efeitos antimicrobianos do pó para o método de disco-difusão com S. aureus evidenciou halos de inibição circulares e crescentes ao redor dos discos, após 24 horas de incubação com as cepas bacterianas. O restante da Placa de Petri que não teve contato com os discos do pó de HAAgNPs cresceu colônias de forma confluente, sem qualquer outra contaminção, inclusive para o controle negativo (HA pura).

Foi observado uma relação direta entre as amostras dos pós contendo AgNPs e os halos de inibição formados. Com base na Fig. 7 observa-se que a inserção de maiores quantidades de AgNPs na matriz da HA resulta em aumento gradativo do halo de inibição contra a S. aureus. Tem-se, assim, halos crescentes da amostra 1 até a amostra 4, no qual o efeito torna-se mais nítido.

O teste de microdiluições usando a solução de AgNPs com 6 horas de síntese permitiu comprovar que o efeito antibacteriano é proveniente da prata adicionada na matriz da HA. Permitiu também mostrar que o efeito dos íons Ag+2 contido na solução coloidal de AgNPs é superior quando comparado aos íons Ag+2 de soluções de prata para cepas de bactérias de S. aureus.

Os discos contendo pó de HAAgNPs prensado apresentarem menor solubilidade e menor coeficiente de difusão no meio de cultura sólido quando comparados com os testes bactericidas feitos com as microdiluições. Em solução estas substâncias apresentam contato íntimo com S. aureus e proporcionaram inibições mais significativas. Dentre as cinco diluições testadas, três delas (1:4, 1:8, 1:16) apresentaram efeito bactericida para AgNPs e apenas uma (1:4) delas para o AgNO3. Os resultados são sumarizados na Tabela 2 a seguir:

Tabela 2: Resumo do teste bactericida para Staphylococcus aureus ATCC 25923. Os testes seguiram as normas de desempenho para testes de sensibilidade antimicrobiana (M100-S15) e os microrganismos cresceram após 24h em contato com as soluções testes de nanopartículas de prata e de nitrato de prata (AgNPs e AgNO3). O sinal (-) significa que inibiu o crescimento e o sinal (+) indica que houve crescimento do microrganismo.

DiluiçõesEfeito Bactericida para Staphylococcus aureus

AgNPs AgNO3

1:4 ( ̶ ) ( ̶ )1:8 ( ̶ ) (+)1:16 ( ̶ ) (+)1:32 (+) (+)1:64 (+) (+)

Figura 6. Resultado do EDAX para a amostra 4 do pó de HAAgNPs (maior concentração de nanopartículas). Na figura (a) tem-se a imagem do mapeamento da distribuição simultânea dos elementos baseados numa região da amostra e na figura (b) o espectro da quantificação

dos elementos normalizados.

Figura 7. Halos de inibição do crescimento de Staphylococcus aureus utilizando discos de hidroxiapatita contendo concentrações crescentes de AgNPs.

4. CONCLUSÕES

Neste trabalho, descreveu-se um método simples, fácil e de baixo custo para impregnar nanopartículas de prata na matriz da hidroxiapatita. A atividade antibacteriana in vitro foi avaliada sobre S. aureus para os pós contendo AgNPs e para soluções contendo íons prata.

O efeito bactericida foi maior para a solução de nanopartículas de prata sintetizada quando comparado com nitrato de prata, nas mesmas diluições, e é justificado pelo aumento da área superficial sobre as bactérias.

Foi encontrada uma relação direta entre as quantidades de nanopartículas de prata adicionadas no pó (HAAgNPs) e o halo de inibição para S. aureus. A amostra com a concentração teórica máxima de 1260 ppm de prata apresentou maior halo de inibição.

As análises por microscopias avançadas e DRX feitas com base na amostra do pó com maior quantidade de nanopartículas mostraram que a inserção de AgNPs na HA não modifica efetivamente sua microestrutura, nem forma novas fases. Além disso, os tamanhos encontrados para os diâmetros das nanopartículas de 10 nm foram condizentes com o estudo das sínteses realizadas.

O método de imersão da HA em soluções contendo pequenas quantidades de AgNPs mostra-se promissor para a obtenção de materiais com características antimicrobianas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a CAPES pelo suporte financeiro.

REFERÊNCIAS

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Hydroxyapatite loaded with silver nanoparticles: antibacterial effect against Staphylococcus aureus

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2Departamento de Ciências Básicas, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Pirassununga (SP), Brasil

3Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Universidade Estadual Paulista, Araraquara (SP), Brasil*E-mail: flavio.andrade@usp.br

Abstract. Hydroxyapatite loaded with silver nanoparticles (HAAgNPs) was obtained by the immersion of the powder in diluted solutions containing different concentrations of silver nanoparticles (AgNPs). The hydroxyapatite powder was obtained by chemical precipitation and AgNPs were synthesized under two different conditions through chitosan as a reducing agent and stabilizer. The synthesis of silver nanoparticles were confirmed by studies of UV-vis spectroscopy and analysis of high-resolution scanning electron microscopy (SEM) revealed nanoparticle sizes about 5-10 nm in diameter. The presence of silver in powder was confirmed by X-ray sensitive detector (EDS) coupled to a high resolution microscope that also allowed to observe details of the morphological characteristics of powder. X-ray diffraction (XRD) analyses of powders showed no change in crystalline structure after insertion of AgNPs and presented majority phases of HA well defined. The antibacterial effect was measured for solutions of AgNPs and for powder (HAAgNPs) using Staphylococcus aureus. For solutions of AgNPs was used microdilution method followed by bactericidal assay and compared with effect of silver nitrate solutions and for the powder was used disk diffusion test method to evaluated the zone of inhibition, after 24 h of inoculation with S. aureus. The results showed bactericidal effect of silver nanoparticles higher than silver nitrate and the zone of inhibition was found to vary with the amount of silver nanoparticles in the powder. Thus, the hydroxyapatite loaded with silver nanoparticles, even using low amounts of nanoparticles, is promising to obtain biomaterials for implant and reconstructive surgery with antibacterial properties.

Keywords: Hydroxyapatite, Silver nanoparticles, Antibacterial effect, Staphylococcus aureus