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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA SANIDADE DE MACACOS-PREGO-GALEGO (Sapajus flavius) MANTIDOS EM CATIVEIRO NO
ESTADO DA PARAÍBA.
Ayodhya Cardoso Ramalho
Médica veterinária
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA SANIDADE DE MACACOS-PREGO-GALEGO (Sapajus flavius) MANTIDOS EM CATIVEIRO NO
ESTADO DA PARAÍBA.
Ayodhya Cardoso Ramalho
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Romão Guerra
Coorientadores: Prof. Dr. Rafael Felipe da Costa Vieira
Prof. Dr. Ricardo Barbosa Lucena
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal da Paraíba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
AYODHYA CARDOSO RAMALHO – Nascida em Maceió, em 30 de dezembro de 1986. Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Alagoas (2011) e residência em Patologia Clínica Veterinária pelo Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco (2013). Desenvolveu trabalhos de Assistência Técnica e Extensão Rural (2011).
DEDICATÓRIA
Aos que conseguem tirar das circunstâncias as melhores experiências, seja
qual for o momento.
Aos que cultivam dentro de si os melhores sentimentos para que eles
prevaleçam sempre sobre os demais.
Aos que carregam seus princípios incondicionalmente.
Aos que se permitem mudar constantemente.
AGRADECIMENTOS
Naturalmente e com toda a gratidão que cabe em mim, aos meus pais e meus
irmãos pelo apoio nos mais variados ciclos da minha vida e agora em mais um que
se encerra.
Aos amigos que tenho e aos que fiz, pela simples companhia e pelas
conversas.
Às minhas amigas Carla Fabiana e Talma Jordana, pelo teto, momentos e
gargalhadas compartilhadas.
Aos que fizeram parte de várias etapas durante este meu percurso e que
foram fundamentais para que tudo desse certo, em especial aos professore Odilon
Vidotto, Rafael Felipe da Costa Vieira e Walter, ao técnico de laboratório Aldair
Calistro de Matos, ao veterinário Thiago Ferreira Lopes Nery, a bióloga Tarsila
Cavalcanti e aos meus amigos de mestrado Max Bruno Bacalhão e Rodrigo Augusto
de Almeida Guimarães.
Ao meu orientador, Ricardo Romão Guerra, por ter sido a ponte para essa
minha conquista.
Por fim, ao mistério da vida que, a sua maneira, faz com que andemos por
diversas estradas, vivendo experiências muito válidas.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS......................................................................................................i
Capítulo I....................................................................................................................i
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................ii
Capítulo II...................................................................................................................ii
RESUMO GERAL........................................................................................................iii
ABSTRACT..................................................................................................................iv
CONSIDERAÇÕES GERAIS.......................................................................................1
CAPÍTULO I – DETECTION OF ‘Candidatus Mycoplasma haemomacaque’ IN CAPTIVE MARCGRAVE'S CAPUCHIN MONKEYS (Sapajus flavius)………………..4
Abstract.....................................................................................................................4
Introduction................................................................................................................4
Materials and methods..............................................................................................6
Results……………………………………………………………………………………...7
Discussion………………….……………………………………………………………….8
References..............................................................................................................10
CAPÍTULO II – FIRST REPORT OF Dipetalonema gracile IN BLOND CAPUCHIN MONKEY (Sapajus flavius) IN NORTHEASTERN BRAZIL …………........................13
Resumo……………………………………………………………………………….......13
Abstract…………………………………………………………………………………....13
References.……………………………………………………………………………….15
CAPÍTULO III – IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS EM MACACOS-PREGO-GALEGO (Sapajus flavius) MANTIDOS EM CATIVEIRO NO ESTADO DA PARAÍBA....................................................................................................................18
Resumo……………………………………………………………………………….......18
Abstract……………………………………………………………………………….......18
Referências…………………………………………………………………………….....22
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................................24
REFERÊNCIAS..........................................................................................................25
LISTA DE TABELAS
Detection of ‘Candidatus mycoplasma haemomacaque’ in captive Marcgrave's capuchin monkeys (Sapajus flavius)
Página
Tabela 1. Hematological and blood biochemistry values from 12 blond capuchin monkeys (Sapajus flavius) with positive and negative PCR for hemotropic mycoplasmas……………………………………………………………………………...
i
LISTA DE FIGURAS
First report of Dipetalonema gracile in blond capuchin monkey (Sapajus flavius) from Northeast Brazil
Página
Figura 1. Dipetalonema gracile (arrows) in abdominal cavity of blond capuchin monkey (Sapajus flavius) from Paraíba State, Brasil…………………………………..23
ii
AVALIAÇÃO DA SANIDADE DE MACACOS-PREGO-GALEGO (Sapajus flavius) MANTIDOS EM CATIVEIRO NO ESTADO DA PARAÍBA.
RESUMO GERAL – Os macacos-prego-galego ou macacos-prego-dourado
(Sapajus flavius), espécie de primata Neotropical recém-descoberta, estão
distribuídos em, aproximadamente, 26 populações, localizadas em fragmentos de
Mata Atlântica nos Estados de Alagoas, Pernambuco e Paraíba. Estes animais estão
classificados como “criticamente ameaçados de extinção” e dados sobre a sanidade
destes animais são escassos. O objetivo deste estudo foi avaliar a sanidade em
duas populações de S. flavius mantidos em cativeiro na Paraíba. Realizou-se uma
pesquisa sobre a ocorrência de hemoplasmas, com avaliação dos perfis
hematológico e bioquímico, um levantamento das enterobactérias presentes nessas
duas populações e investigação da ocorrência de parasitas. Nove de 12 animais,
(75%), apresentaram infecção por ‘Candidatus Mycoplasma haemomacaque’,
apesar do estado de saúde dos animais não indicar nenhuma enfermidade. Quanto
às enterobactérias, foi possível observar a presença dos gêneros Salmonella spp.
em 87,5% (7/8), Shigella spp. em 12,5% (1/8) e Enterobacter spp. em 12,5% (1/8).
Os nematoides encontrados foram identificados como sendo da espécie
Dipetalonema gracile. Assim, observa-se a importância de estudos como estes para
conhecer melhor os aspectos sanitários destes animais, ajudando na elaboração de
programas de conservação e manejo desta espécie em cativeiro visando projetos de
soltura.
Palavras-chave: CONSERVAÇÃO, MACACO-PREGO-DOURADO, SAÚDE
ANIMAL
iii
EVALUATION OF HEALTH OF BLOND CAPUCHIN MONKEYS (Sapajus flavius) MAINTAINED IN CAPTIVITY IN THE STATE OF PARAÍBA.
ABSTRACT – Marcgrave’s capuchin monkeys or blond capuchin monkeys (Sapajus
flavius), Neotropical primate species newly discovered, are distributed in
approximately 26 populations located in fragments of Atlantic Forest in the States of
Alagoas, Pernambuco and Paraíba. These animals are classified as "critically
endangered" and data on the health of these animals are scarce. The aim of this
study was to evaluate the sanity of two populations of S. flavius kept in captivity in
Paraíba. Research on the occurrence of hemoplasmas, with evaluation of
hematologic and biochemical profiles, a survey of enterobacteria present in these two
populations and investigate the occurrence of parasites was performed. Nine of 12
animals (75%) had infection 'Candidatus Mycoplasma haemomacaque ', despite the
state of health of the animals did not indicate any disease. Regarding enterobacteria,
we observed the presence of the genera Salmonella spp. in 87.5% (7/8), Shigella
spp. in 12.5% (1/8) and Enterobacter spp. in 12.5% (1/8). Nematodes findings were
identified as the species Dipetalonema gracile. Thus, we observe the importance of
studies like these to learn more about the health aspects of these animals, helping in
the development of management and conservation of this species in captivity
projects aiming to release programs.
Keywords: CONSERVATION, HEALTH ANIMAL, MARCGRAVE’S CAPUCHIN
MONKEY
iv
CONSIDERAÇÕES GERAIS
O Brasil é um país que apresenta importante papel na realização de estudos
com primatas não humanos, pois sua fauna é constituída por 133 espécies e
subespécies destes animais, das 414 espécies conhecidas no mundo (IUCN, 2011),
sendo as pesquisas fontes fundamentais para levantamento de dados que
subsidiam o desenvolvimento de trabalhos para a conservação primatológica.
Os macacos-prego-galego ou macacos-prego-dourado foram descritos pela
primeira vez pelo pesquisador Georg Marcgrave, em 1648. Posteriormente, outros
pesquisadores descreveram este mesmo animal, mas, sem uma comprovação
científica da sua existência ele acabou sendo esquecido ou dado por extinto
(OLIVEIRA; LANGGUTH, 2006). Em 2006, pesquisadores identificaram uma nova
espécie de macaco-prego, a qual classificaram como Cebus queirozi (PONTES et.
al., 2006), mas logo em seguida foi verificado que se tratava de uma redescoberta
do macaco-prego-galego, classificado como C. flavius (OLIVEIRA; LANGGUTH,
2006; VALENÇA-MONTENEGRO, 2011).
Recentemente, os macacos-prego passaram por uma nova classificação.
Antes a taxonomia destes animais seguia o trabalho dos naturalistas no qual
macacos-prego e caiararas se agrupavam no mesmo gênero, Cebus. Em 2012 foi
sugerida uma reclassificação e divisão em dois gêneros, Cebus para caiararas e
Sapajus para os macacos-prego. De acordo com a nova classificação, as espécies
de Cebus são: C. albifrons, C. capucinus, C. olivaceus e C. kaapori. Para o Sapajus
são 8 espécies: S. macrocephalus, S. apella, S. libidinosus, S. flavius, S.
xanthosternos, S. robustus, S. nigritus e S. cay (GUIMARÃES, 2012).
Segundo a última revisão da Redlist feita pela International Union for
Conservation of Nature and Nature Resources (IUCN), quatro espécies do gênero
Cebus estão ameaçadas de extinção: C. robustus, classificado como “em perigo”; e
C. kaapori, C. xanthosternos e C.flavius como “criticamente em perigo” (IUCN,
2011).
A Mata Atlântica, habitat natural do S. flavius, está entre os 25 hotspots
mundiais, ou seja, regiões com grande biodiversidade e que estão ameaçadas
1
(MMA, 2000). Atualmente, estima-se que os S. flavius estão distribuídos em 26
fragmentos de floresta de Mata Atlântica (CPB, 2009).
Evidências sugerem que as doenças estão aumentando em face da crescente
degradação ambiental e homogeneização dos ecossistemas em todo o mundo
(DASZAK et al. 2000). Quase 75% de todas as doenças infecciosas emergentes
(DIEs) que impactam ou ameaçam a saúde humana são zoonóticas. A maioria se
espalhou a partir de reservatórios como animal selvagem, diretamente para os seres
humanos ou através de animais domésticos (FIELD, 2008).
Pouco ainda se sabe sobre as enfermidades que acometem os primatas do
novo mundo (ANDRIOLO, 2006). Em programas de conservação, as avaliações de
saúde são dificultadas pelo conhecimento insuficiente da biologia das espécies e à
capacidade de animais silvestres para mascarar sintomas clínicos (LISBOA et al.
2004).
O estabelecimento de parâmetros fisiológicos normais, além de pesquisas
para avaliação da presença ou não de doenças de relevância regional e nacional
tem sido motivo de diversos trabalhos que objetivam, através do levantamento de
dados, desenvolver estratégias efetivas de conservação e manejo dos animais
selvagens (NAVES et al. 2006; FERREIRA, 2009; RIBEIRO, 2013).
Na avaliação das condições de saúde dos animais é necessário realizar um
levantamento com o maior número possível de informações sobre os indivíduos. Os
dados podem incluir desde parâmetros fisiológicos até análises mais aprofundadas
como a avaliação hematológica, que permite analisar, de forma complementar, o
estado de saúde dos animais e ajudar no diagnostico de doenças, mesmo antes do
aparecimento dos sintomas (NAVES et al., 2006).
Animais de cativeiro que se encontram com alguma doença infecto-
contagiosa, podem, devido a densidade populacional do ambiente, disseminar mais
facilmente uma doença, causando problemas em todo o grupo. Enterobactérias
presentes nas espécies selvagens mantidas em cativeiro são continuamente
estudadas a fim de encontrar um manejo ideal que torne os animais menos
vulneráveis a esses microrganismos (GOMES, 2005). Os membros da família
Enterobacteriaceae podem ser divididos em: patógenos principais, que podem
causar doenças entéricas e sistêmicas; patógenos oportunistas, que ocasionalmente
2
causam doença clínica fora do trato alimentar; e não-patógenos (QUINN et al.,
2005). Estas bactérias estão distribuídas no solo, água, vegetais e no trato intestinal
de seres humanos e animais (WINN et al., 2010). Estudos relatam a ocorrência de
enterobactérias de importância clínica como, Salmonella spp., em primatas mantidos
em cativeiro, alertando sobre maiores cuidados no manejo sanitário e sobre a
necessidade de ser realizar investigações constantes em todo o plantel para
averiguação da condição clínica (GOMES et al., 2011; FERREIRA et al., 2012).
Outra enfermidade já relata em primatas é a hemoplasmose (NEIMARK et al.,
2002; BARKER et al., 2011; MAGGI et al., 2013; SANTOS et al., 2013; SASHIDA et
al., 2014), causada por micoplasmas hemotrópicos (MH) ou hemoplasmas,
pequenas bactérias que pertencem ao gênero Mycoplasma, parasitas obrigatórios
de hemácias capazes de causar uma anemia infecciosa hemolítica em várias
espécies de mamíferos (WILLI et al., 2006), sendo sua transmissão por meio de
artrópodes (NEIMARK et al., 2001). A hemoplasmose em animais pode se
apresentar de forma aguda, com uma anemia grave, ou crônica, assintomática
(HOELZLE, 2008) e nesse último caso, quando os animais são submetidos a algum
tipo de estresse ou ficam imunossuprimidos, os sinais clínicos da doença tendem a
aparecer (MESSIK, 2004).
Os nematoides filarídeos do gênero Dipetalonema já foram descritos em
várias espécies de primatas Neotropicais e para a espécie D. gracile, já foram
encontrados como hospedeiros macacos dos gêneros Cebus, Sapajus, Saimiri,
Lagothrix, Ateles, Saguinus (NOTARNICOLA et al., 2008). Microfilárias de
Dipetalonema spp. são capazes de se desenvolver para o estágio infeccioso (L3) em
artrópodes do gênero Culicoides (EBERHARD; LOWRIE; ORIHEL, 1979) e em
primatas, o parasita adulto, que se apresenta como um grande verme, habita a
cavidade peritoneal (TRAVI; EBERHARD; LOWRIE, 1985).
O objetivo deste estudo, realizado em duas populações de macacos-prego-
galego mantidos em cativeiros no Estado da Paraíba, foi observar o estado geral de
saúde destes animais, mediante a realização de procedimentos/exames
investigativos.
2
CAPÍTULO I - DETECTION OF ‘Candidatus Mycoplasma haemomacaque’ IN
CAPTIVE MARCGRAVE'S CAPUCHIN MONKEYS (Sapajus flavius)
ARTIGO A SER SUBMETIDO PARA A VETERINARY MICROBIOLOGY
Detection of ‘Candidatus Mycoplasma haemomacaque’ in captive Marcgrave's capuchin
monkeys (Sapajus flavius)
Abstract
Hemotropic mycoplasmas or hemoplasmas are epicellular parasites of erythrocytes
and can cause variable degrees of hemolytic anemia in infected hosts. Three species of
hemoplasmas are known to infect monkeys, ‘Candidatus Mycoplasma kahanei’, ‘Ca.
Mycoplasma haemomacaque’ and ‘Ca. Mycoplasma aoti’. Marcgrave’s capuchin monkey
(Sapajus flavius) is a Neotropical primate species of the Atlantic Forest and it is critically
endangered. The aim of this study was to determinate the occurrence of hemoplasmas in two
populations of S. flavius kept in captivity in Paraíba State, northeastern Brazil. Blood samples
from 12 animals were collected and the research of hemoplasmas by PCR was performed. The
sequences the infective agents isolated confirmed that 9/12 (75%) of samples were positive
para ‘Ca. Mycoplasma haemomacaque’. This is the first description of a hemoplasmas
infection in S. flavius.
Keywords: Blond capuchin monkey, Haemotropic Mycoplasma, Hemoplasmas
1. Introduction
Marcgrave’s capuchin monkey (Sapajus flavius) (formerly Cebus flavius) are found in
parts of the Atlantic Forest of northeastern Brazil (Oliveira and Langguth, 2006). The species
4
is listed in the Red List of Threatened Species as critically endangered (IUCN, 2014), and
thus sustained efforts are needed to protect the health and well-being of these animals.
Hemotropic mycoplasmas (HM) or hemoplasmas, the etiological agent of
hemoplasmosis, are small pleomorphic bacteria that infects a wide range of mammalian
species worldwide (Messick, 2004). Three species have been described to infect monkeys,
‘Candidatus Mycoplasma kahanei’ (Neimark et al., 2002; Santos et al., 2013), ‘Candidatus
Mycoplasma haemomacaque’ (Maggi et al., 2013; Sashida et al., 2014) and ‘Candidatus
Mycoplasma aoti’ (Barker et al., 2011). In Brazil, a HM closely related to ‘Ca. M. kahanei’
was detected in a free-ranging black howler monkey (Alouatta caraya) (Santos et al., 2013).
Considering that HM may cause in monkeys a disease characterized by hemolytic
anemia, particularly when stressed, the aim of the present study was to determine the
occurrence of this bacteria in two populations of captive S. flavius from Paraíba State,
Northeastern Brazil.
2. Materials and methods
2.1. Animals and sampling
A total of 12 captive Macgrave's capuchin monkey (Sapajus flavus) were sampled, six
from the Zoo Arruda Câmara, located in the city of João Pessoa, and six from the Screening
Center of Wild Animals (CETAS), located in the city of Cabedelo, both situated in the State
of Paraíba, Northeastern Brazil. All of the animals were anesthetized with ketamine (10
mg/kg) and xilazyne (2 mg/kg) and were submitted to a complete physical examination.
Blood samples were collected in tubes with and without EDTA by saphenous venipuncture,
and stored at 4 °C for 2 h until hematologic and biochemistry analysis. Thereafter, samples
were stored at -20 °C until molecular procedures were performed. Animal and laboratory
5
procedures were approved and performed under regulations of the Brazilian Institute for the
Environment and the Renewable Resources (Sisbio/IBAMA protocol number 35565-1of
11/July/12) and Animal Ethics Committees from Federal University of Paraíba (UFPB -
protocol number 0710/12 of 09/August/2013).
2.2. DNA extraction
DNA was extracted from 200 µl blood using a commercially available kit (PureLink®,
Genomic DNA Minikit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), according to the manufacturer's
instruction. Negative control purifications using ultra-pure water were performed in parallel to
monitor cross-contamination.
2.3. PCR assays
All samples were screened by conventional PCR using a primer set targeting the 16S
rDNA regions specific for hemoplasmas (Dieckmann et al., 2010). The PCR mixture for
amplification of the 16S rRNA gene contained 100 µL of 10x PCR buffer (10 mM Tris-HCl,
50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 8.3), 2,0 mM of each dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
0.4 uM of each primer, 1.0 U of Platinum® Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA), 1 µL of DNA template made up to 25 µL with water. Cycling conditions consisted of a
5 min denaturation at 95 °C followed by 35 cycles of 95 ºC for 1 min, 60 ºC for 45 sec, and 68
ºC for 1.5 min with a final extension of 68 ºC for 5 min and cooling at 4 °C (Veriti® Thermal
Cycler, Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA). Nuclease-free water was used as
negative control, while DNA of M. haemocanis was used as positive control. The amplified
products were separated by electrophoresis in a 1.5% agarose gel containing 0.5 µg/mL
ethidium bromide and visualized under UV light.
6
2.4. Sequencing
The amplified products (977 base pairs) were separated by electrophoresis and purified
from the gel using a commercial kit (PureLink®, Quick Gel Extraction Kit, Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA). Purified PCR products were cloned using pGEM-T1 Easy Vector
(Promega Corporation, Madison, WI, USA) for 16S rRNA. The cloned products were purified
using a commercial kit (PureLink®, Quick Gel Extraction Kit, Invitrogen) and then sequenced
in both directions. The nucleotide sequences of hemoplasmas from these deer were submitted
to the GenBank database.
2.5. Statistical analysis
A descriptive analysis of the data collected was performed. To analyze the impact of
infection for HM, comparisons were made: non infected vs. infected. Data were analyzed
using SISVAR program, with Tukey and Sidak tests. P values <0.05 were considered to be
statistically significant.
3. Results
3.1. Clinical, hematological and biochemistry findings
During the clinical and physical examination there was no presence of ectoparasites,
all monkeys were considered healthy. The haematological and biochemical parameters are
shown in Table 1.
7
Table 1. Hematological and blood biochemistry values from 12 blond capuchin monkeys
(Sapajus flavius) with positive and negative PCR results for hemotropic mycoplasmas.
Positive PCR Negative PCRParameters (units) Mean ± SD Range Mean ± SD RangeHematologial analysisErythrocytes (x10⁶/mm3) 5.3 ± 0.94a 4.1-6.39a 5.7±0.61a 4.7-6.61aHemoglobin (g%) 12.8 ± 1.87a 10.3-14.8a 13.78±1.42a 11.4-15.5aHematocrit (%) 36.53 ± 8.48a 27-47.6a 41.41±6.41a 31-51.2aMCV (fL) 68.5 ± 4.26a 65-74.5a 71.76±6.36a 60-79.8aMHCH (%) 35.67 ± 3.3a 31-38a 33.74±3.46a 30-39aLeukocytes (cel/mm³) 10.800 ± 1.131a 10.000-11.600a 10.150±2.287a 7.100-13.500aNeutrophils (cel/mm³) 4.724±2.014a 4.724-2.013a 5.132±1.345a 3.074-7.500aEosinophils (cel/mm³) 1.690±1570a 580-2.800a 903±536a 213-1.908aBasophils (cel/mm³) 0a 0a 0a 0aLymphocytes (cel/mm³) 3.612±1.290a 2.700-4.524a 3.929±1.528a 2.343-6.480aMonocytes (cel/mm³) 274±105a 200 – 348a 186±153a 71-424aPlateletes (x10³/mm³) 341.33±199.20a 196.00-623.00a 224.66±97.97a 70.00-403.00aBiochemistry analysisAlbumin (g/dl) 3.83±0.18a 3.58-4.2a 3.75±0.34a 3.36-4aAST (U/l) 57.14±20.61a 36-92a 31±5.66a 27-35aCreatinine (mg/dl) 1.08±0.21a 0.87-1.5a 0.88±0.17a 0.7-1.04aGGT(U/l) 65.5±23.26a 33-95a 41.67±6.11a 35-47aTotal Protein (g/dl) 8.18±0.41a 7.8-8.9a 7.57±0.06a 7.5-7.6aAlkalina phosphatase (U/l) 178±138.28a 85-381a 107.5±24.75a 90-125aN – number of animals; SD – Standard Deviation; MVC – Mean Corpuscular Volume; MHCH - Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration; GGT - Gamma-glutamyl transpeptidase; AST - Aspartate aminotransferase
3.2. PCR results and sequence analysis
The PCR test for detection of hemoplasmas showed that 9/12 (75%) samples were
positive for Mycoplasma spp., including 5/6 (83.3%) originating from the CETAS and 4/6
(66.7%) from Zoo. Positive animals, 6/9 (66,7%) were males and 3/9 (33,3%) were females,
whereas 2/9 (22,2%) were youngs and 7/9 (77,8%) were adults. Fragments of approximately
997 bp were amplified from samples of monkeys and subsequently sequenced. BLAST
sequences analyzed showed 96% identity with the ‘Ca. Mycoplasma haemomacaque’.
8
4. Discussion
In both populations studied of S. flavius was detected Mycoplasma spp., although the
animals do not show clinical signs that characterize any disease. Mean hematological values
of animals positive and negative in the PCR test for HM are within the normal range when
compared with other studies with healthy S. flavius (Teixeira et al., 2013) and S. apella
(Naves et al., 2006; Riviello & Wirz, 2001; Wirz et al., 2008) despite having knowledge that
hosts infected with HM may have varying levels of anemia (Sykes and Tasker, 2014).
Cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) infected with hemoplasma had a decrease in
their hematocrit from 35% to 22% (Dillberber et al., 1994). In agree with our findings,
hematological parameters of black howler monkey (Alouatta caraya), positive for ‘Ca.
Mycoplasma kahanei’, also showed no changes (Santos et al., 2013). The ‘Ca. Mycoplasma
kahanei’ produces a chronic latent infection in monkeys that may be evidenced in
splenectomy, observing subsequent intense parasitaemia and during the resolution phase, a
moderate anemia associated with monocytosis and erythrophagocytosis (Neimark et al.,
2002). In squirrel monkeys (Saimiri sciureus) asymptomatic for hemoplasmose when
splenectomy, the infection becomes evident with anemia (Contamin and Michel, 1999;
Neimark et al., 2002).
Biochemical values also were normal when compared with studies performed with S.
flavius (Teixeira et al., 2013) e S. apella (Naves et al., 2006; Riviello & Wirz, 2001, Wirz et
al., 2008).
For the reintroduction of wild animals in nature is essential to ensure that they are in
good health so they can readapt to the new habitat, and especially not transmit infectious
agents to free-living specimens. For this it is necessary to perform physical and clinical
exams, investigative tests on major diseases that affect the species being reintroduced. Thus,
9
as demonstrated in this study, in which animals positive for HM are asymptomatic, it is
important to include in the list required for the release of primate research of HM tests, mainly
because it is a species in a critical extinction.
References
Barker, E.N., Helps, C.R., Neimark, H., Peters, I.R., Peters, W., Tasker, S., 2011. A novel
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Hoelzle, K., Wittenbrink, M.M., Hoelzle, L. E., 2010. Haemotrophic Mycoplasma infection in
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quintana Bacteremia in Cynomolgus Monkeys. J. Clin. Microbiol., 51, 1408-1411.
10
Naves, E.A., Ferreira, F.A., Mundim, A.V., Guimarães, E.C., 2006. Valores hematológicos de
macaco prego (Cebus apella – Línnaeus, 1758) em cativeiro. Biosci. J., 22, 125-131.
Neimark, H., Barnaud, A., Gounon, P., Michel, J-C., Contamin, H., 2002. The putative
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12
CAPÍTULO II – FIRST REPORT OF Dipetalonema gracile IN BLOND CAPUCHIN MONKEY (Sapajus flavius) IN NORTHEASTERN BRAZIL
ABSTRACT
Parasitic infections are an important issue in Conservation Biology and Conservation
Medicine. This article reports on parasitism by Dipetalonema gracile Rudolphi, 1809
(Spirurida, Filarioidea, Onchocercidae) in the peritoneal cavity of a blond capuchin monkey
(Sapajus flavius) that died at the Wild Animal Screening Center (CETAS) of the Brazilian
Institute of Environment and Renewable Natural Resources (IBAMA) in the city of Cabedelo,
state of Paraíba, Brazil. This is the first report of parasitism by this nematode in S. flavius, a
critically endangered species.
Keywords: Nematoda, endoparasites, neotropical primates, Marcgrave’s capuchin monkey,
conservation.
RESUMO
As infecções parasitárias são um importante aspecto a ser considerado tanto na Biologia da
Conservação quanto na Medicina da Conservação. No presente trabalho, relata-seo
parasitismo por Dipetalonema gracile Rudolphi, 1809 (Spirurida, Filarioidea, Onchocercidae)
na cavidade peritoneal de um macaco-prego-galego (Sapajus flavius) que veio a óbito no
Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) da cidade de Cabedelo, Paraíba, Brasil. Este é
o primeiro registro do parasitismo por este nematoide em S. flavius, espécie que se encontra
criticamente ameaçada de extinção.
Palavras-Chave:Nematoda, endoparasitos, primatas neotropicais, macaco-prego-dourado,
conservação.
Marcgrave’s capuchin monkey (Sapajus flavius) occurs in fragments of Atlantic Forest
in the states of Paraíba, Pernambuco and Alagoas, Brazil (OLIVEIRA & LANGGUTH,
13
2006). Recent studies have shown that this species is critically endangered (IUCN, 2008),
requiring in situ and ex situ conservation actions.
Wild animals are hosts to a wide range of parasites (CUNNINGHAM et al., 2003;
SMITH et al., 2006; PEDERSEN et al., 2007), which can act as primary or opportunistic
agents of disease (FREITAS et al., 2001; CATÃO-DIAS, 2003; OLIVEIRA et al., 2011). In
both these situations, they represent an obstacle to management programs and to the recovery
of populations of endangered species (DASZAK et al., 2000; CUNNINGHAM et al., 2003;
SMITH et al., 2006; PEDERSEN et al., 2007; MUNIZ-PEREIRA et al., 2009). Parasitic
diseases are significant pathologies that affect wild animals living in captivity. Morbidity and
mortality depend on parasite species, parasite load, nutritional status, immune response and
physiological conditions of the host (CATÃO-DIAS, 2003; GODOY & CUBAS, 2011).
Therefore, reintroduction protocols require the identification of parasitic fauna (IUCN, 1998;
FELASA, 1999).
Various species of filarial nematodes of the genera Dipetalonema and Mansonella
(Tetrapetalonema) have been described in New World primates (TOFT & EBERHARD,
1998), including endangered species (MUNIZ-PEREIRA et al., 2009). Six species of
Dipetalonema have been described: D. gracile, D. caudispina, D. graciliformis, D. robini, D.
freitasi and D. yatesi (NOTARNICOLA et al., 2008; MUNIZ-PEREIRA et al., 2009).
Microfilariae of D. gracile develop to the infectious stage (L3) in arthropods of the genus
Culicoides and can act as vectors in enzootic areas (EBERHARD et al., 1979). The adult
parasites live in the peritoneal cavity of primates (TRAVI et al., 1985).
In 2013, an individual in a population of blond capuchin monkeys kept at the Wild
Animal Screening Center (CETAS) of the Brazilian Institute of Environment and Renewable
Natural Resources (IBAMA) in Cabedelo, state of Paraíba, Brazil, died and was necropsied at
the Veterinary Hospital of the Federal University of Paraíba (UFPB) in the city of Areia,
Paraíba. This necropsy revealed nematodes in the abdominal cavity (Figure 1), which were
fixed in AFA (ethanol 70º GL, 37% formalin and glacial acetic acid) and were sent for
identification to the Laboratory of Parasitology (LAPAR) of the Federal Rural University of
Pernambuco (UFRPE), where the material was processed according to a widely accepted
methodology (HOFFMANN, 1987; AMATO et al., 1991). The parasites were identified
based on morphological descriptions previously reported (VICENTE et al., 1997;
ANDERSON et al., 2009) and were deposited in the LAPAR Parasite Collection.
14
The nematodes were identified as D. gracile Rudolphi, 1809 (Spirurida, Filarioidea:
Onchocercidae). In Brazil, parasitism by D. gracile (syn. D. gracilis) has been reported in C.
capucinus, L. lagotricha, Callithrix jacchus, A. paniscus, Brachyteles arachnoides,
Leontopithecus chrysopygus, L. rosalia and Saguinus bicolor (VICENTE et al., 1997;
MUNIZ-PEREIRA et al., 2009), and in other New World primates in other countries
(CHINCHILLA et al., 2007; NOTARNICOLA et al., 2008). This paper, which describes S.
flavius as a new host of D. gracile, is the first report of the occurrence of this nematode in
northeastern Brazil. Although there are no reports of mortality in primates affected by D.
gracile, the parasitism recorded in this study reinforces the importance of periodic
parasitological diagnosis as a tool for the evaluation the health of wild animals living in
captivity (FELASA, 1999; DEEM et al., 2008; SIBAJA-MORALES et al, 2009;. OLIVEIRA
et al., 2011).
Studies of this nature contribute significantly to the body of knowledge about the
parasitic fauna of endangered species and also help underpin the formulation of conservation
strategies (in situ and ex situ) and the record of new hosts and new areas of occurrence of
parasites (MELO et al., 2012, 2013). Knowledge about the parasitic fauna of wild animals is
essential for studies in the fields of Conservation Biology and Conservation Medicine
(SMITH et al., 2006; PEDERSEN et al., 2007; MUNIZ-PEREIRA et al., 2009), with respect
to the prevention of impacts on biodiversity, human and ecosystem health (AGUIRRE et al.,
2002; CATÃO-DIAS, 2003).
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Figure 1. Dipetalonema gracile (arrows) in the abdominal cavity of a blond capuchin monkey (Sapajus flavius) in the state of Paraíba, Brazil.
17
CAPÍTULO III – IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS EM MACACOS-PREGO-GALEGO (Sapajus flavius) MANTIDOS EM CATIVEIRO NO ESTADO DA PARAÍBA
Resumo
O objetivo do presente estudo foi isolar e identificar enterobactérias presentes em duas
populações de macaco-prego-galego (Sapajus flavius) mantidas em cativeiro. O estudo foi
realizado em duas populações de animais mantidas em cativeiro no Estado da Paraíba. A coleta
das amostras de fezes foi realizada diretamente da ampola retal com o auxílio de swabs estéreis e
processadas para o isolamento das bactérias em meios seletivos, seguida da identificação por
provas bioquímicas. Foi possível observar o crescimento de colônias em oito amostras fecais, com
a presença dos gêneros Salmonella spp. em 87,5% (7/8), Shigella spp. em 12,5% (1/8) e
Enterobacter spp. em 12,5% (1/8). Confirma-se assim que estas enterobactérias são causadoras de
infecções nos animais estudados, o que justifica a necessidade de melhorar o monitoramento da
saúde desses animais, com investigações periódicas nos Centros de Triagem de Animais
Selvagens e Zoológicos.
Palavras-chave: Animais Selvagens; Bactérias Gram-positivas; Bactérias Gram-negativas;
Isolamento
Abstract
Identification of enterobacteria in blond capuchin monkeys (Sapajus flavius) kept in
captivity in the State of Paraíba. The aim of this study was to isolate and identify enterobacteria
in two populations of blond capuchin monkeys (Sapajus flavius) kept in captivity. The study was
performed in two populations of animals kept in captivity in the State of Paraíba. The collection
of stool samples was performed directly of the rectum with sterile swabs and processed for the
isolation of bacteria in selective media, followed by identification by biochemical tests. It was
possible to observe the growth of colonies in eight fecal samples, with the presence of the genera
Salmonella spp. in 87.5% (7/8), Shigella spp. in 12.5% (1/8) and Enterobacter spp. in 12.5%
(1/8). It is confirmed so these enterobacteria are causing infections in animal studies, which
18
justifies the need to improve the monitoring of the health of these animals, with periodic
investigations in Zoos and Wild Animal Screening Centers.
Key words: Wildlife; Bacteria Gram-positive; Bacteria Gram-negative; Isolation
Título Abreviado: Enterobactérias em macacos-prego-galego
Os macacos-prego-galego (Sapajus flavius), espécie criticamente ameaçada de extinção
(IUCN, 2008), encontram-se distribuídos em apenas 26 fragmentos de Mata Atlântica
(VALENÇA-MONTENEGRO, 2011) nos Estados da Paraíba, Pernambuco e Alagoas
(OLIVEIRA; LANGGUTH, 2006). Na natureza, esses animais são onívoros, mas
primordialmente frutívoro-insetívoro (VALENÇA-MONTENEGRO, 2011). Diferentemente do
seu ambiente natural, em cativeiro os primatas devem receber um manejo alimentar adequado,
com rigorosa inspeção da qualidade dos itens fornecidos, a fim de se evitar distúrbios alimentares
ou outras doenças (VIEIRA et al., 2008).
Animais criados em cativeiro, como em zoológicos, devem ser submetidos à implantação
de um sistema de gestão ambiental (SGA) que visa à sanidade e o bem-estar dos mesmos com
ações associadas ao seu manejo e alimentação (CUBAS et al., 2006). O fato de animais de
cativeiro viverem em ambientes restritos torna-os mais vulneráveis a várias doenças que podem
afetar todo o grupo (ANDRADE, 2002).
Bactérias da família Enterobacteriaceae estão amplamente distribuídas na natureza,
encontradas no solo, água, vegetais e no trato intestinal de seres humanos e animais (WINN et al.,
2010). Agrupados, arbitrariamente, em três categorias, os membros desta família podem ser:
patógenos principais, que podem causar doenças entéricas e sistêmicas; patógenos oportunistas,
que ocasionalmente causam doenças clínicas fora do trato alimentar; e não-patógenos (QUINN et
al., 2005). Estudos epidemiológicos têm sido realizados a fim de se investigar e determinar a
ocorrência de enterobactérias em grupos de animais selvagens mantidos em cativeiro visto a
possibilidade de comprometimento da saúde desses animais (GOMES et al., 2011; FERREIRA et
al., 2012). Assim, o objetivo deste estudo foi isolar e identificar enterobactérias em duas
populações de S. flavius mantidos em cativeiro e, desta forma, observar a relação com o estado
geral de saúde desses animais.
19
A pesquisa foi realizada após prévia autorização do IBAMA (Sisbio/IBAMA protocolo
35565-1 de 11/07/2012 e Comissão de Ética da UFPB protocolo 0710/12 de 18/09/2013).
O presente estudo foi realizado no ano de 2014 com duas populações de macacos-prego-
galego, sendo seis do Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS) do Instituto Brasileiro
do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), localizado no município de
Cabedelo e seis do Parque Zoobotânico Arruda Câmara, em João Pessoa, ambos localizados no
Estado da Paraíba.
Após contenção física com puçá e química com cloridrato de cetamina (10mg/kg) e
xilazina (2mg/kg), os animais foram submetidos a exames físicos e clínicos e,
concomitantemente, foi realizada a coleta das amostras de fezes diretamente da ampola retal com
o auxílio de swabs estéreis. As amostras foram refrigeradas em caixa isotérmica até que fossem
feitas as análises microbiológicas no Laboratório de Medicina Veterin do Hospital Veterinário da
Universidade Federal da Paraíba, Areia – PB, Brasil.
Para realização da análise microbiológica, as amostras foram pré-enriquecidas em caldo
Brain Heart Infusion (BHI) e incubadas a 37º C por 24 horas. Em seguida foram semeadas em
placas com o meio Levine e incubadas a 37,5º C por 24 horas. Posteriormente, as placas foram
avaliadas e as colônias sugestivas para enterobactérias foram submetidas à análise bioquímica em
meio TSI, Citrato, SIM, VM e VP, sendo a leitura realizada após 24 horas com interpretação dos
resultados de acordo com o Manual Bergey (WHITMAN et al., 2012).
Não foram observadas alterações durante o exame físico e clínico procedido nos animais.
Apenas um animal pertencente ao CETAS apresentou fezes diarreicas no momento da coleta. Em
quatro de 12 amostras coletadas não foi observado nenhum crescimento de colônia sugestiva para
enterobactérias. Em oito amostras nas quais foi possível observar o crescimento colonial, foram
isolados quatro diferentes gêneros bacterianos. A frequência observada nas amostras do CETAS
foi de: 60% (3/5) para Salmonella spp.; 20% (1/5) para Shigella spp.; e 20% (1/5) para
Enterobacter spp. Já no Zoológico, a frequência observada foi de 100% (3/3) para Salmonella
spp. Em uma amostra fecal coletada de um animal do CETAS não foi confirmado nenhum gênero
por meio de testes bioquímicos.
Observou-se no presente estudo maior detecção, 75% (6/8), para o gênero Salmonella,
sendo identificado em 60% (3/5) dos animais do CETAS e em 100% (3/3) dos animais do
20
Zoológico. O primeiro e único registro de Salmonella spp. em S. flavius ocorreu em um estudo
realizado nos CETAS dos Estados de Alagoas e Paraíba. Neste trabalho, que também avaliou
amostras de S. libidinosus, a ocorrência de Salmonella spp. foi de 17,9% (5/28) (FERREIRA et
al., 2012). Apesar do presente estudo não demonstrar animais com sinais clínicos para
salmonelose, a frequência foi considerada alta quando comparada ao estudo citado anteriormente.
Animais de zoológico são portadores de um conjunto diversificado de sorotipos de Salmonella
spp. e podem se apresentar aparentemente saudáveis, o que pode influenciar na clínica e
terapêutica de outros animais, como também dos trabalhadores desses locais (SILVA-HIDALGO
et al., 2012).
Primatas não humanos mantidos em cativeiro, quando infectados por Shigella spp.
propiciam a contaminação de outros animais e de tratadores (LOUREIRO; CARVALHO, 1984).
Assim, como foi isolado o gênero Shigella na amostra fecal de um animal, é possível que o
mesmo favoreça a propagação do patógeno aos demais animais e funcionários envolvidos no
manejo. O único hospedeiro natural de Shigella spp. é o ser humano, sendo a doença transmitida
pela ingestão dos microrganismos via fecal-oral (KONEMAN, 2010). A shigelose, uma
importante zoonose, causa elevados índices de morbidade e mortalidade nos símios durante o
período de quarentena e se propaga rapidamente entre os membros da colônia, sendo necessário
tratamento dos animais afetados, além de higienização do ambiente. Essa enfermidade pode
ocorrer em animais sem que os mesmos apresentem sinais clínicos e desta forma é importante que
se faça a identificação dos indivíduos assintomáticos (ANDRADE, 2002).
O gênero Enterobacter, pode ser classificado como patógeno oportunista, ou seja,
raramente causa doença entérica (QUINN et al., 2005). As espécies E. aerogenes e E. cloacae já
foram relatadas em S. apella em um estudo que avaliou 38 animais, porém não foram as bactérias
mais prevalentes (LOUREIRO et al., 1985). Os resultados deste estudo foram semelhantes aos
obtidos no presente trabalho, sendo também baixa a prevalência desse agente, em que apenas uma
amostra das oito analisadas, foi isolado Enterobacter spp.. Este é o primeiro trabalho a relatar a
ocorrência dos gêneros Shigella spp. e Enterobacter spp. em S. flavius.
Os resultados obtidos apontam a necessidade de aperfeiçoar o monitoramento da sanidade
de animais mantidos em cativeiro, por meio de investigações periódicas do estado clínico dos
mesmos e com a implantação de medidas profiláticas que possam manter a sanidade dos animais,
21
já que surtos de salmonelose ou shigelose podem comprometer a manutenção destes animais em
cativeiro, ainda mais quando se trata de animais criticamente ameaçados de extinção.
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23
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo possibilitou a investigação das condições sanitárias de
duas populações de macacos-prego-galego (Sapajus flavius) mantidas em cativeiro
no Estado da Paraíba, através da realização de exames simples como hematologia,
bioquímica sanguínea, identificação de enterobactérias e de parasitas, até
procedimentos mais complexos como o teste de PCR para identificação de
hemoplasmas. Considerando o fato do S. flavius se encontrar criticamente
ameaçado de extinção, com a estimativa da existência de apenas 1.000 indivíduos
em fragmentos da Mata Atlântica do Nordeste brasileiro, o estudo mostra a
necessidade de conhecer melhor os aspectos sanitários desta espécie animal, para
que seja possível montar estratégias de conservação mais adequadas.
24
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