viviane cristina mello andari - fcmsantacasasp.edu.br · 4.4.4.teste de paternidade ... para uma...
TRANSCRIPT
VIVIANE CRISTINA MELLO ANDARI
“Testes genéticos não invasivos no pré-natal: benefícios e limitações dos exames disponíveis”
Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de Mestra em Ciências da Saúde.
SÃO PAULO
2015
VIVIANE CRISTINA MELLO ANDARI
“Testes genéticos não invasivos no pré-natal: benefícios e limitações dos exames disponíveis”
Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de Mestra em Ciências da Saúde.
Área de Concentração: Ciências da Saúde
Orientador: Prof. Dr. Tsutomu Aoki
Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Claudio de Silva Bussamra
SÃO PAULO
2015
Dedico este trabalho
À minha amada Vó Tude, que agora nos abençoa do céu.
Saudades.
Agradecimentos
− À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo pela oportunidade oferecida.
− Ao Serviço de Medicina Fetal da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, por fornecer o apoio necessário para a realização deste trabalho.
− À CAPES pelo apoio financeiro.
− Ao meu orientador, Prof. Dr. Tsutomu Aoki, pela oportunidade e confiança.
− Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Luiz Claudio de Silva Bussamra, pelo acolhimento e incentivo.
− Às queridas, Dra. Carolina Chaddud e Dra. Giselle Darahem Tedesco, pela amizade e companheirismo.
− Aos meus amados marido e filho, Reinaldo Jr. e João, por me darem força com apenas um sorriso.
− Aos meus pais, Gabriel e Fátima, por incentivarem os meus sonhos.
− À minha irmã, Tissiane, por me mostrar que na vida a gente tem escolhas e que a superação é uma delas.
− Aos meus sogros, Wanda e Reinaldo, pelo apoio e torcida
− À minha família, pelo amor e união.
− Aos meus grandes amigos, Verena e Antônio, pelo carinho e cuidado.
Abreviaturas e Símbolos
A/T/C/G – Bases nitrogenadas Adenina/Timina/Citosina/Guanina aCGH – Array-Comparative Genomic Hybridization ACOG - American College of Obstetricians and Gynecologysts BVC – Biópsia de Vilo Corial CAP - College of American Pathologists
cffDNA - Circulating free fetal DNA CLIA - Clinical Laboratory Improvement Amendments CNV - Copy Number Variations DANSR - Digital Analysis of Selected Regions DHRN – Doença Hemolítica do Recém-Nascido DM - Distrofia Miotônica DNA - Ácido desoxirribonucleico DR – taxa de detecção EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid FC - Fibrose Cística FISH - Fluorescent in situ hybridization FORTE - Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation FPV – Valor Falso-Positivo HAC - Hiperplasia Adrenal Congênita
ISPD - Internacional Society for Prenatal Diagnosis MLPA – Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification mRNA - RNA mensageiro NATUS - Next-generation Aneuploidy Test Using SNPs NGS - Next Generation Sequencing NIPT – Noninvasive prenatal testing PAPP-A - Proteina-A plasmática associada a gestação pb - Pares de base PCR - Polymerase chain reaction PPT - Plasma Preparation Tubes PS - Parental Support Q-PCR - PCR quantitativa fluorescente
RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism RMD - Relative Mutation Dosage RNA - Ácido ribonucleico RT-PCR – Real time PCR SMFM - Society of Maternal-Fetal Medicine
s-MPS - Shotgun Massively Parallel Sequencing SNP - Single Nucleotide Polymorphisms SRY - Gene STR - Short Tandem Repeat t-MPS - Target Massively Parallel Sequencing TN - Translucência Nucal WGA - Wole Genomic Amplification WGS – Whole Genome Sequencing β-HCG - β-gonadotrofina coriônica humana
Sumário
1. Introdução ............................................................................................................................ 1
2. Objetivos .............................................................................................................................. 7
2.1. Objetivo geral: .......................................................................................................................... 7
2.2. Objetivos específicos: ............................................................................................................. 7
3. Método ................................................................................................................................. 8
3.1. Desenho do estudo .................................................................................................................. 8
3.2. Fonte de busca do estudo ...................................................................................................... 8
3.3. Período de busca ..................................................................................................................... 8
4. Resultados ........................................................................................................................... 9
4.1. Testes genéticos aplicados ao pré-natal: benefícios e limitações dos exames invasivos convencionais .......................................................................................................... 9 4.2. Células intactas e ácidos nucléicos livres fetais como recursos para os testes genéticos não invasivos no pré-natal ..................................................................................... 12 4.3. Ferramentas que contornar a baixa concentração de DNA fetal livre no sangue materno .................................................................................................................................. 15 4.4. Aplicação dos testes genéticos pré-natais não invasivos ............................................ 17
4.4.1.Determinação do sexo fetal ................................................................................ 17
4.4.2.Fenotipagem do Gene RHD fetal ....................................................................... 19
4.4.3.Doenças Monogênicas ....................................................................................... 21
4.4.4.Teste de Paternidade ......................................................................................... 24
4.4.5.Aneuploidias ....................................................................................................... 25
4.4.6.Sequenciamento Genômico Total ...................................................................... 36
5. Discussão .......................................................................................................................... 39
5.1. Benefícios e limitações das técnicas s-MPS, t-MPS e SNP ............................................ 41
5.2. Desempenho dos métodos s-MPS, t-MPS e SNP na detecção de alterações cromossômicas .................................................................................................................................. 43
5.3. Fatores que influenciam a falha de resultados dos NIPT ................................................. 45
5.4. O Futuro dos testes genéticos pré-natais não invasivos .................................................. 48
6. Conclusões ........................................................................................................................ 52
7. Referências Bibliográficas ............................................................................................... 53
Resumo ...................................................................................................................................... 69
Abstract .....................................................................................................................................70
Anexos ....................................................................................................................................... 71
1. Introdução
O termo “diagnóstico pré-natal” abrange todas as modalidades de
análises destinadas a obter informações acerca do embrião ou feto (Benn,
2002). Os procedimentos pré-natais, de forma geral, possibilitam a detecção
de alterações fetais; fornecem informação a casais com risco de gerar filhos
com alguma anormalidade; permitem o planejamento adequado do parto;
facilitam o acesso a cuidados neonatais específicos; e permitem, dependendo
do caso, o tratamento pré-natal de uma criança afetada por uma doença
específica (Dhallan et al., 2004).
Considera-se que entre 10-15% das gestações reconhecidas
clinicamente terminam em abortos espontâneos e estima-se que esse índice
possa chegar a 50% se consideradas todas as concepções (Zinaman et al.,
1996). O motivo mais frequente para as perdas gestacionais é a ocorrência de
alterações cromossômicas no feto, que podem ser a causa de mais de 80%
dos casos de abortos espontâneos (Choi et al., 2014). Em um estudo brasileiro
de 2002, Barini e colaboradores encontraram a frequência de 9,1% de
anomalias citogenéticas em fetos com alterações morfológicas à
ultrassonografia. As alterações cromossômicas são ainda as causas de 15%
das anomalias congênitas diagnosticadas antes do primeiro ano de vida
(Wellesley et al., 2012).
As anormalidades cromossômicas mais comuns são as aneuploidias,
definidas como alterações no número dos cromossomos (Sayres e Cho, 2011).
Entre elas, as mais frequentes são: trissomias dos cromossomos 21 (síndrome
de Down) – 53%; 18 (síndrome de Edward) – 13%; 13 (síndrome de Patau) –
5%; monossomia do cromossomo X (síndrome de Turner) – 8%; e trissomia
dos cromossomos sexuais (XXX – triplo X; XXY – síndrome de Klinefelter; XYY
– síndrome de Jacob’s) – 4% (Wellesley et al., 2012).
Há algumas décadas, testemunha-se uma série de avanços no
rastreamento de gestações aneuplóides, particularmente na identificação da
síndrome de Down. O primeiro método de rastreamento do risco para
anomalias cromossômicas fetais, introduzido no início dos anos 70, baseava-se
somente na idade materna avançada, definida como sendo superior a 35 anos.
Nessa época, o grupo considerado de risco abrangia 5% da população de
2
gestantes, englobava 30% das gestações de fetos com a Síndrome de Down e
apenas 2% daquelas submetidas aos diagnósticos invasivos apresentavam
resultado alterado (Nicolaides, 2011; Driscoll e Gross, 2009)
Na década seguinte, combinou-se a concentração de vários produtos
feto-placentários durante o segundo trimestre de gestação – na forma de testes
duplos, triplos e quádruplos – com a idade materna avançada, aumentando
significativamente a performance do rastreamento para aneuploidias. A triagem
sérica materna (teste QUAD) envolve a medida dos níveis de quatro
marcadores bioquímicos na corrente sanguínea da gestante: α-fetoproteína, β-HCG (β-gonadotrofina coriônica humana), estriol não-conjugado e inibina-A, e
fornece o cálculo ajustado do risco de um feto ser aneuploide associado à
idade da mãe, com uma taxa de detecção de 80% para as trissomias dos
cromossomos 21 e 18 e 5% de taxa de falso-positivo (Wald et al., 1996).
Nos anos 90, introduziu-se o rastreamento da Síndrome de Down pela
combinação da idade materna com a medida sonográfica da TN (translucência
nucal) durante o primeiro trimestre de gestação. Esta ferramenta mostrou-se
eficaz na identificação de 75-80% dos fetos alterados cromossomicamente,
para uma taxa de resultado falso positivo de aproximadamente 5% (Nicolaides,
2004).
Na sequência, os parâmetros idade materna e medida da TN foram
associados ao teste bioquímico de dois analitos maternos - a β-hCG (β-
gonadotrofina coriônica humana) e a PAPP-A (proteína-A plasmática associada
a gestação) na forma de testes combinados para a triagem efetiva da trissomia
do 21 durante o primeiro trimestre de gestação. Baseado nesses resultados a
paciente passou a ter acesso ao valor de risco ajustado de carregar um feto
aneuploide, com uma taxa de detecção de 90% para a síndrome de Down e
mais de 80% para a síndrome de Edward, com um índice de screening falso-
positivo de 5% (Kagan et al., 2008). A inclusão de parâmetros adicionais, como
a medida do osso nasal, ângulo facial, acesso ao Doppler da válvula tricúspide
e ducto venoso, permite que as taxas de identificação da trissomia do 21 sejam
elevadas para 95% com a redução simultânea da taxa de screening falso-
positivo para 2% (Nicolaides, 2007).
Atualmente, o “padrão ouro” para o diagnóstico pré-natal para
aneuploidias é fornecido pela técnica de cariótipo, que possui acurácia elevada,
3
mas é dependente de procedimentos invasivos de coleta de amostras de
material fetal diretamente do útero materno, por meio da biópsia de vilo corial
(BVC) durante o primeiro trimestre de gestação ou da coleta de líquido
amniótico, no segundo trimestre. Por serem invasivas, essas ferramentas
carregam risco de 0,5%-1,0% de perda da gestação (Tabor e Alfirevic, 2010).
O interesse no desenvolvimento de ferramentas que possibilitassem o
acesso ao material fetal propriamente dito, sem a necessidade de interferência
à saúde do feto e da mãe por procedimentos invasivos foi impulsionado a partir
de 1969, quando ficou conhecido que células fetais íntegras atravessavam a
barreira placentária e podiam ser encontradas na corrente sanguínea materna
(Walknowska et al., 1969). Em 1997, Lo e colaboradores demonstraram a
presença de cffDNA (DNA fetal livre, do inglês cell free fetal DNA) originário do
cromossomo Y no plasma e soro de gestantes que carregavam fetos
masculinos e estimularam ainda mais o desenvolvimento dessas metodologias
como um atrativo recurso de diagnóstico pré-natal não invasivo (Bianchi, 1999;
Lo et al., 1998a, Chan et al., 2004).
A partir de então, muitos trabalhos sobre a utilização do recurso de
material fetal disponível na circulação materna foram publicados em diversas
áreas do diagnóstico pré-natal não invasivo, visando sempre a sua aplicação
no âmbito clínico, a fim de minimizar os riscos e a necessidade dos
procedimentos invasivos. Inicialmente, os esforços se focaram nas pesquisas
sobre a determinação do sexo fetal e na genotipagem do gene RHD e
resultaram em exames hoje oferecidos por laboratórios acadêmicos e
particulares de muitos países, inclusive do Brasil (Martinhago et al., 2006
Newson, 2008; Hill et al., 2011). Paralelamente, explorou-se a diferenciação da
informação genética fetal na solução e diagnósticos de doenças monogênicas
(Amicucci et al., 2000; Gonzalez-Gonzalez et al., 2003; Lim et al., 2010; Gu et
al., 2014). Outra aplicação dos testes pré-natais não invasivos foi a
possibilidade da exclusão da paternidade por meio do sangue materno, uma
abordagem amplamente investigada que culminou na disponibilização clínica
global dos testes de paternidade com acurácia superior a 99% por empresas
norte-americanas (Ryan et al., 2013).
Desde a demonstração da presença dos ácidos nucléicos, DNA e RNA
(Lo et al., 1997; Lo et al., 1998b) fetais livres no sangue materno observa-se o
4
desenvolvimento de uma série de ferramentas sofisticadas de implementação
de diagnóstico fetal não invasivo com o intuito de tornar disponível um método
eficaz, seguro e acessível para o diagnóstico das principais cromossomopatias,
principalmente da síndrome de Down (Lo, 2012). Em 2011, foi apresentado o
primeiro NIPT (Noninvasive prenatal testing) para triagem de aneuploidias para
uso clínico (Palomaki et al., 2011). No ano seguinte, mais três empresas norte-
americanas entraram nesse mercado (Bianchi et al., 2012; Nicolaides et al.,
2012; Zimmermann et al., 2012). Cada teste utiliza uma ferramenta
metodológica diferente. Em alguns casos o s-MPS (Shotgun Massively Parallel
Sequencing) é a metodologia de sequenciamento escolhida, enquanto que o t-
MPS (Targeted Massively Parallel Sequencing) ou o sequenciamento por SNP
(Single Nucleotide Polymorphisms) é utilizado por outras. Além disso, cada
instituição utiliza um algoritmo exclusivo e patenteado para interpretação dos
dados genéticos. Embora a tecnologia exata possa variar, as implicações para
a prática clínica são as mesmas; ou seja, são todos testes de triagem
realizados por meio da análise do DNA fetal livre em amostras de sangue
materno. As taxas de detecção e valores de resultados falso-positivos
alcançados por cada empresa são diferentes, assim como a quantidade de
aneuploidias cromossômicas disponibilizadas por cada teste (Norwitz e Levy,
2013).
A evolução tecnológica que o NIPT passou até chegar ao advento da
aplicação clínica dos testes para aneuploidias gerou um grande avanço
também na possibilidade de detecção de outras anormalidades genéticas,
como doenças monogênicas, mutações de novo, microdeleções e
microduplicações, menos frequentes e não restritas à variação no número de
cópias cromossômicas (Jensen et al., 2012; Lo et al., 2010). O sequenciamento
genômico total, WGS (Whole Genome Sequencing), aplicado ao diagnostico
pré-natal não invasivo surgiu da necessidade de ampliar o volume e o âmbito
das informações genéticas pré-natais. E hoje, apesar de envolver a
necessidade de abordagens éticas, é visto como o futuro do NIPT (Chen et al.,
2013).
Existem comissões internacionais que orientam e regulamentam as
condições para a implementação dos testes pré-natais não invasivos. Desde
2007, o ACOG (American College of Obstetricians and Gynecologystis)
5
recomenda que sejam oferecidos os exames de triagem pré-natal para
aneuploidias para todas as mulheres grávidas (ACOG, 2007). Em 2012, diante
das novas propostas de NIPT para aneuploidias, o ACOG sugeriu que esses
exames fossem oferecidos à população de mulheres grávidas consideradas de
alto-risco e as definiu como sendo aquelas nas quais existe maior chance de
ser gerado um feto com anormalidades genética, ou seja: quando envolve
gestantes com a idade ≥35 anos; quando for constatado risco para aneuploidia
por ultrassom; quando houver uma gestação prévia com caso de alteração
genética, quando houver resultado positivo para os exames bioquímicos de
triagem pré-natal para aneuploidias; diante do conhecimento de translocação,
inversão ou inserção em um dos pais; ou diante do histórico familiar para
alguma outra doença genética (ACOG, 2012).
Em abril de 2013, o ISPD (Internacional Society for Prenatal Diagnosis)
publicou uma regulamentação compartilhando as condições assinaladas pela
ACOG e também concluiu que, deve ser considerada a condição econômica
local, a possibilidade de acesso ao ultrassom, aos testes invasivos e a recursos
de aconselhamento genético no momento da decisão da utilização das
tecnologias oferecidas por meio do plasma materno (ISPD, 2013).
São considerados cinco os fatores que influenciam o acesso das
pacientes aos NIPT: a disponibilidade de profissionais qualificados para
executar e interpretar os testes; o fornecimento de cuidado pré-natal a tempo
da paciente receber os testes; ser levado em conta o conhecimento e as
preferências de médicos e pacientes; a possibilidade de recursos financeiros; e
a implementação e respeito a políticas regulatórias (ACOG, 2012).
Nas ultimas décadas, acompanha-se algumas mudança no padrão
demográfico das gestantes dos países desenvolvidos. A busca por maior
escolaridade e sucesso profissional, aliados à facilidade de acesso a métodos
seguros de controle de natalidade, avanços tecnológicos na área da
reprodução assistida e uniões mais tardias, aumentaram significativamente o
número de mulheres que optam por postergar a primeira gestação. Nos
Estados Unidos, entre os anos de 1970 e 2000, o índice de nascidos vivos de
mulheres com 35 anos ou mais aumentou de aproximadamente 5% para 13%
de todos os partos (Martin et al., 2002). Segundo o IBGE, no Brasil, passou de
7,95%, em 1996, para 9,55% de todos os nascidos vivos em 2006.
6
A gestação em mulheres com 35 anos ou mais está associada ao risco
aumentado de complicações à saúde materna (obesidade e pré-eclâmpsia),
fetal (anormalidades cromossômicas e abortamentos espontâneos) e do
recém-nascido (baixo peso, internação em UTI e óbito neonatal) (Andrade et
al., 2004). Além de muitas vezes envolverem situações de infertilidade. Por
esses fatores, as gestações desse grupo de mulheres possui um valor
diferenciado a medida que a necessidade de obtenção de informações a
respeito da saúde genética do feto por meio de exames invasivos pode gerar
riscos e perdas gestacionais em uma gravidez que pode não ter sido alcançada
ou mantida facilmente, intensificando a demanda por exames pré-natais não
invasivos.
O tema “testes genéticos não invasivo no pré-natal” é atual e promissor.
Passou por um importante marco histórico recentemente, entre os anos 2011 e
2013, quando foi disponibilizado para o uso clínico diferentes NIPT para
aneuploidias e para a exclusão da paternidade, além da publicação de um novo
método generalizado de NIPT, que possibilita o sequenciamento genômico fetal
completo. É um assunto alvo de interesse não apenas das comunidades
científicas e médicas, mas também tem sido explorado pela mídia e procurado
e questionado por pacientes interessadas. Os dados gerados pelo grande
volume de publicações envolvendo esses testes modificaram o cenário global
ao seu respeito e motivaram, mundialmente a atualização e busca por
informação. Deste modo, observou-se a importância e relevância da
compilação dos dados literários, que permitissem abordar a evolução, os
avanços técnicos e metodológicos e as perspectivas futuras a respeito dos
testes genéticos não invasivos no pré-natal.
7
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral:
Realizar uma revisão narrativa sobre o assunto: diagnóstico pré-natal
não invasivo.
2.2. Objetivos específicos:
1- Explicar as principais técnicas envolvidas nos testes pré-natais não
invasivos disponíveis;
2- Reconhecer os benefícios e limitações das técnicas oferecidas
atualmente;
3- Discutir futuras aplicações para os testes pré-natais não invasivos;
8
3. Método
3.1. Desenho do estudo
Trata-se de um estudo de revisão narrativa assistemática da literatura
científica.
3.2. Fonte de busca do estudo
A busca por artigos científicos se deu na fonte PubMed/MEDLINE,
serviço da US National Library of Medicine e do National Institutes of Health
dos Estados Unidos.
3.3. Período de busca
A pesquisa por referências não limitou o período de buscas pela data de
publicação dos artigos.
9
4. Resultados
4.1. Testes genéticos aplicados ao pré-natal: benefícios e limitações dos exames invasivos convencionais
Os testes pré-natais são parte dos cuidados obstétricos desenvolvidos
em muitos países da Europa, Estados Unidos, China e Brasil (Chan et al.,
2004). Os procedimentos invasivos para obtenção de material fetal possibilitam
a aplicação das técnicas de diagnósticos genéticos nos casos em que são
constatados riscos potenciais para uma desordem fetal específica (Pertl e
Bianchi, 2001). A Tabela 1 compara os principais testes genéticos pré-natais
invasivos disponíveis.
O cariótipo pré-natal é considerado o “padrão ouro” no diagnóstico de
gestações alteradas. É um procedimento confiável, no qual é feita a análise
cromossômica da cultura das células do feto obtidas por meio da BVC e da
coleta de líquido amniótico. Essa técnica de citogenética convencional tem a
finalidade de identificar alterações numéricas (aneuploidias) e estruturais
(translocações, inversões e grandes duplicações ou deleções) nos
cromossomos do feto. Sua sensibilidade depende do número de células
estabelecidas na cultura e está limitada a resolução óptica dos cromossomos,
ou seja, microdeleções e microduplicações não são detectadas. A acurácia do
diagnóstico por cariótipo de cultura de células obtidas por procedimentos
invasivos está entre 97,5%-99.6% para o BVC e 99,4%-99,8% para a cultura
de líquido amniótico (Hahnermann e Vejerslev, 1997).
A análise cromossômica das células da BVC fornece vantagem uma vez
que permite o diagnóstico fetal precoce durante o primeiro trimestre de
gestação. O resultado do diagnóstico preliminar pode ser obtido em 1-2 dias
com a preparação de uma cultura rápida de células do citotrofoblasto do vilo.
Mas na maioria dos casos, o resultado final é obtido em 7-10 dias após o
crescimento de uma cultura longa de células mesenquimais. A grande
desvantagem desse procedimento está no fato das células do vilo corial se
originarem da trofectoderma e não do feto propriamente dito, o que pode
10
ocasionar em 1,0%-2,0% dos casos uma ambiguidade de resultados, no que é
chamado de mosaicismo confinado a placenta (Goldberg e Wohlferd, 1997).
Por esse fato e devido à maior possibilidade de contaminação por células
maternas e pela baixa resolução das bandas cromossômicas, a taxa de erro
inerente a análise de células de BVC é mais elevada se comparada à taxa de
erro do cariótipo de células do líquido amniótico, menor que 0,01%-0,02%, por
isso, mais eficiente no diagnóstico genético pré-natal (Benn et al., 2013).
O FISH (Fluorescent in situ Hybridization) é uma técnica de citogenética
molecular que utiliza sondas cromossômicas com fluorescência específica
capazes de detectar as aneuploidias fetais mais comuns durante o período pré-
natal. O painel de teste pré-natal por FISH normalmente inclui sondas para os
cromossomos 13, 18, 21, X e Y. E o resultado da análise gerada por esse
procedimento para os núcleos interfásicos das células de vilo corial ou
amniócitos estão geralmente disponíveis em 24-48 horas. Em um estudo
multicêntrico, Tepperberg e colaboradores (2001) observaram que a
sensibilidade e a especificidade da detecção pré-natal das aneuploidias mais
Tabela 1. Comparação entre os exames genéticos pré-‐natais invasivos. Cariótipo FISH MLPA Array
Concordância com cariótipo
Acurácia 97,5-‐99,8% 99,8% 97,7% 100%
Abrangência Todo genoma Regiões específicas
Regiões específicas Todo genoma
Aplicação
Aneuploidia Triploidia
Mosaicismo Alterações balanceadas
Aneuploidia Triloidia
Mosaicismo
Aneuploidia Triploidia Alterações
submicros-‐cópicas
(duplicações/ deleções)
a-‐CGH SNP
Aneuploidia Alterações submicros-‐cópicas
Aneuploidia Triloidia
Alterações submicros-‐ cópicas
ou balanceadas Dissomia
uniparental Consanguinidade
Limitação Alterações submicros-‐cópicas
Alterações submicros-‐cópicas,
balanceadas ou em outras
regiões
Mosaicismo Alterações balanceadas ou em outras
regiões
Baixo nível de mosaicismo
Fontes: Hahnermann et al.,1997; Goldberg et al., 1997; Benn et al. 2013; Tepperberg et al., 2001; Yan et a.l, 2011; Wapner et al., 2012.
11
comuns por FISH era >99,6% e >99.98%, respectivamente. E demonstraram
uma elevada concordância (99.8%) entre os resultados obtidos por meio do
FISH e pelas análises de citogenética padrão. No entanto, alterações
citogenéticas menos comuns (eg, translocações Robertsonianas, inversões,
cromossomos marcadores) não podem ser detectadas por essa técnica,
exigindo que o FISH seja acompanhado de uma avaliação citogenética
completa dentro da rotina de diagnostico pré-natal.
O MLPA (Multiplex Ligation Probe-dependent Amplification) é uma
técnica de biologia molecular em que o DNA avaliado é hibridizado a uma
mistura de sondas de regiões cromossômicas especificas. É uma ferramenta
alternativa de diagnóstico genético pré-natal aplicado, não somente ao
diagnóstico para aneuploidias, mas também é considerada eficiente na
detecção de deleções e duplicações de genes como nos casos de distrofia
muscular de Duchenne, ataxia spinocerebelar tipo 15, na esclerose tuberosa e
malformações cerebrais familiares. Yan e colaboradores (2011) foram capazes
de demonstrar uma concordância de 97.7% entre as técnicas de MLPA e
cariótipo em amostras de líquido amniótico. Trata-se de uma técnica simples e
rápida, que permite a análise de muitas amostras ao mesmo tempo. No
entanto, assim como o FISH, é uma ferramenta de diagnóstico destinada a
uma avaliação específica, sendo mais adequada como um teste de triagem e
que necessita do cariótipo para avaliação do diagnóstico.
Em contraste às limitações ópticas do cariótipo, outras ferramentas
moleculares surgiram para melhorar substancialmente a detecção de
desequilíbrios genéticos submicroscópicos clinicamente significativos. São
elas, as análises cromossômicas por microarray, que podem ser realizadas por
meio dos procedimentos aCGH (Array-Comparative Genomic Hybridization) ou
por SNP array (Single Nucleotide Polymorphism), que em sua essência são
técnicas que interrogam o genoma com milhares de sondas fixadas em um chip
durante um único ensaio experimental. As duas técnicas permitem a detecção
comparativa de desequilíbrios genômicos em variações de números de cópias
(CNV – Copy Number Variations) e fornecem, no caso do SNP array, a
possibilidade do diagnóstico de triploidia, dissomia uniparental, e
consanguinidade; além de permitir a detecção de contaminação por células
maternas. Um recente estudo prospectivo multicêntrico foi capaz de indicar
12
100% de concordância entre os procedimentos de análise por microarray e a
análise de citogenética convencional na detecção das aneuploidias mais
comuns. Além disso, o uso do microarray resultou na identificação adicional de
desequilíbrios genômicos clinicamente relevantes em 2,5% dos casos com
cariótipo normal (Wapner et al., 2012). No entanto, a limitação de todas as
plataformas disponíveis de aCGH e SNP array está na identificação das
variações com significância incerta.
4.2. Células intactas e ácidos nucléicos livres fetais como recursos para os testes genéticos não invasivos no pré-natal
Durante as últimas décadas, muitos trabalhos exploraram a
possibilidade de desenvolvimento de métodos de diagnósticos pré-natais não
invasivos (NIPT – noninvasive prenatal testing), permitindo a análise do
material genético fetal por meio da coleta de sangue materno durante o
primeiro trimestre de gestação (Lo, 2008). Durante a gravidez, o sistema
circulatório da mãe e do feto é separado pela membrana placentária. No
entanto, evidências apontaram a existência de tráfego bidirecional pela
interface materno-fetal (Lo et al. 1996). Estudos demonstraram que tanto as
células fetais intactas quanto o cffDNA cruzam a placenta e atingem a
circulação materna (Bianchi et al, 1990; Lo et al., 1997).
A existência de células fetais no sangue materno é conhecida desde
1969 (Walknowska et al., 1969). O isolamento de eritrócitos nucleados fetais
intactos para propósitos de diagnóstico pré-natal foi reportado pela primeira vez
em 1990, por Bianchi e colaboradores. A partir de então, o isolamento e
detecção deste tipo de material fetal foi extensamente estudado e se
apresentou como um atrativo recurso de diagnóstico pré-natal não invasivo
(Bianchi, 1999; Samura et al., 2001).
No entanto, fatores limitaram o êxito da aplicação dessa estratégia como
recurso de diagnóstico fetal não invasivo, tais como: a raridade de células fetais
intactas no sangue materno (de uma a duas células por mililitro); a baixa
eficiência dos protocolos de enriquecimento celular; a dificuldade de análise
devido à qualidade do resultado obtido (Bianchi et al., 1997). Além disso, foram
observados que certos tipos celulares – especialmente, eritrócitos nucleados –
13
possuem curta duração no sangue materno (Lurie e Mamet, 2000), enquanto
outros tipos persistem no sistema circulatório materno por décadas após a
gravidez, potencializando as causas de resultados falso-positivos em
gestações subsequentes (Bianchi et al., 1996). Essas dificuldades diminuíram
consideravelmente o número de publicações a esse respeito nos últimos anos.
E hoje, ainda não existe um protocolo ou tecnologia confiável, consistente e
eficiente para a captura e aplicação das células fetais no sangue materno para
procedimentos de diagnóstico pré-natal para o uso clínico (Fidder, 2014).
Apesar da maior parte do DNA humano estar localizado dentro de
células, existe uma pequena quantidade de DNA extracelular na circulação de
todos os indivíduos, saudáveis ou não (Mandel e Metais, 1948 apud Pertl et al.,
2000). As bases biológicas desse material genômico extracelular e suas
potenciais funções permanecem incertas; são, possivelmente, produto de
apoptose (morte celular programada), resultado da fragmentação e ejeção do
DNA cromossômico presente nas células (Jahr et al., 2001). A liberação de
DNA fetal livre no plasma materno, possivelmente, ocorre devido ao contínuo
escape de células fetais através da placenta, que são rapidamente destruídas
pelo sistema imune da mãe (Pertl et al., 2000).
Em 1977, Leon e colaboradores reportaram uma grande concentração
de DNA livre circulante no soro de pacientes com câncer. Em 1996, Chen e
colaboradores detectaram mutações em oncogenes associados a tumores no
DNA do plasma de mulheres com câncer. O interesse gerado por essas
pesquisas impulsionou Lo e colaboradores (1997) a demostrarem a presença
de cffDNA masculino no plasma e soro de gestantes que carregavam fetos
desse sexo, abrindo novas possibilidades para o desenvolvimento de
ferramentas de diagnóstico pré-natal não invasivo.
Lo e colaboradores, em 1997, demostraram ainda que a concentração
absoluta de cffDNA era similar no plasma e soro maternos. No entanto, por ser
a porção acelular do sangue, o plasma apresentava menor quantidade de DNA
materno, consequentemente, gerava menores interferências nos resultados,
sendo mais apropriado para a maioria das pesquisas da área.
Essas moléculas fetais livres são detectadas no sangue materno, com
segurança, a partir da 7ª semana de gestação, mas já podem ser identificadas
na corrente sanguínea materna desde a 4a semana gestacional (Illanes et al.,
14
2007). Sua concentração aumenta com a idade gestacional, chegando ao pico
nas últimas oito semanas de gestação (Lo et al., 1998a). Apresenta uma rápida
eliminação na circulação materna, com meia-vida de 16,3 minutos, sendo
indetectáveis duas horas após o parto (Lo et al., 1999).
A maior parte do DNA livre no sangue de gestantes é materna. Lo e
colaboradores (1998a) descreveram que o cffDNA compunha em média 3,4%
(de 0,39-11,9%) do total de DNA do plasma materno em gestações de primeiro
e segundo trimestres e 6,2% (de 2,33-11,4%) em gestações de terceiro
trimestre. Um estudo posterior, de Lun e colaboradores (2008), utilizou uma
técnica mais precisa e demonstrou que a concentração média da fração do
cffDNA para o primeiro, segundo e terceiro trimestres era de 9,7%; 9,0% e
20,4% do total de DNA do plasma materno, respectivamente.
Além de estarem em menor concentração no sangue materno, as
moléculas de cffDNA são menores do que as moléculas derivadas do DNA da
mãe. Ao analisar amostras de DNA livre no sangue de mulheres não gestantes,
Chan e colaboradores (2004) concluíram que essas moléculas são
relativamente pequenas em comprimento, <200 pb (pares de base). E que as
moléculas derivadas do cffDNA são constituídas, predominantemente, de
pequenos fragmentos de DNA livres <300pb. Mais recentemente, os avanços
tecnológicos permitiram o estudo da distribuição das moléculas de DNA
materno e fetal por distinção de comprimento. A maior diferença reportada
entre o DNA circulante materno e fetal é que o DNA do feto apresenta uma
reduzida proporção de moléculas de 166 pb e uma elevada proporção de
moléculas de menos de 150 pb (Lo et al., 2010).
Um terceiro recurso de material genético fetal para o diagnóstico pré-
natal não invasivo surgiu quando, além do emprego do cffDNA (ácido
desoxirribonucléico), Poon e colaboradores (2000) demostraram a presença de
RNA fetal (ácido ribonucleico) específico masculino em plasma de mulheres
que carregavam fetos deste sexo. Neste trabalho, o mRNA (RNA mensageiro)
fetal livre pôde ser identificado em 22% das gestações de primeiro e segundo
trimestres e em 63% das gestações de terceiro trimestre. A dinâmica natural
das moléculas de mRNA foi aplicada às pesquisas sobre expressão de genes
fetais e àquelas relacionadas a saúde materna durante a gestação (Lo et al.,
2007; Tong et al., 2010; Go et al., 2011). A grande dificuldade no emprego do
15
RNA como ferramenta de diagnóstico é devido a instabilidade de suas
moléculas e à sua variável transcrição durante o desenvolvimento fetal, são
moléculas suscetíveis a degradação e como resultado estão em quantidade
ainda menores no plasma materno se comparadas às moléculas de DNA
(Maron et al., 2007).
Em geral, as aplicações clínicas de diagnóstico pré-natal pelo sangue
materno focam na medida quantitativa da concentração de cffDNA e na
detecção qualitativa de sequências ou genes específicos dessas moléculas.
Existem desafios associados à aplicação do diagnósticos pré-natais não
invasivos pelo sangue materno, pois: a concentração de todo DNA livre é
relativamente baixa no sangue materno; a quantidade total de cffDNA varia
entre indivíduos; existem 20 vezes mais moléculas de DNA materno livre do
que moléculas de cffDNA no sangue materno; além disso, o feto herda e
compartilha metade do genoma da mãe (Wright e Burton, 2009),
A concentração do cffDNA no sangue materno é um importante
parâmetro que afeta a acurácia dos testes genéticos pré-natais não invasivos,
principalmente, porque resultados falso-negativos podem aparecer em
amostras nas quais há uma fração baixa da molécula fetal (McCullough et al.,
2014).
4.3. Ferramentas que contornar a baixa concentração de DNA fetal livre no sangue materno
Os exames pré-natais não invasivos por meio do sangue materno
surgiram como propostas capazes de substituir ou diminuir os procedimentos
fetais invasivos (Wright e Burton, 2009). No entanto, o diagnóstico pré-natal,
seja ele invasivo ou não, tem melhor aproveitamento clínico quando aplicado
durante o início da gestação, no primeiro trimestre (Lo, 2012), quando, porém,
a quantidade relativa de cffDNA no sangue materno é mais baixa (Lo et al.
1998a).
A fim de contornar esta questão, na literatura são propostas algumas
ferramentas alternativas de incremento da quantidade relativa de cffDNA em
amostras de sangue de gestantes. Alternativas estas, que associadas a outras
técnicas moleculares, são capazes de melhorar a acurácia e segurança dos
16
procedimentos de detecção do cffDNA no sangue materno (Jorgez & Bischoff,
2009).
Chan e colaboradores (2005) propuseram um estudo sobre o efeito dos
fatores pré-analíticos no tamanho das moléculas de cffDNA no sangue
materno. Nele, concluíram que a concentração e integridade do cffDNA são
mantidas quando o plasma é rapidamente separado do sangue materno e
aliquotado em pequenas amostras, que devem ser congeladas, além disso,
observaram que repetidos descongelamentos geram a fragmentação dessas
pequenas moléculas. Uma recente pesquisa realizada no Brasil não encontrou
relevância estatística ao comparar a concentração de cffDNA circulante no
sangue de gestantes de primeiro trimestre quando coletados em tubos comuns
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid) e em tubos com separadores
plasmáticos PPT (Plasma Preparation Tubes) (Chadud et al., 2014).
O enriquecimento seletivo do DNA fetal, baseado na diferença de
tamanho dos fragmentos de DNA fetal e materno, utiliza o recurso de
fracionamento para separação do DNA do plasma materno por tamanho, por
meio da eletroforese em gel de agarose, seguida da extração independente
dos fragmentos <300 pb, ou seja, dos fragmentos de cffDNA (Li et al., 2004a).
Este método é aplicado a estudos de detecção de mutações herdadas
paternalmente em plasma materno (Li et al., 2005). No entanto, relata-se que
além se ser uma metodologia trabalhosa, também é propensa a contaminação
(Lo e Chiu, 2008).
No que diz respeito à supressão do background de DNA materno,
Dhallan e colaboradores (2004) sugeriram que a adição de formaldeído ao
sangue materno pudesse estabilizar os leucócitos da mãe e reduzir a liberação
do DNA da gestante no plasma, evitando a maior diluição do DNA fetal no
sangue materno. No entanto, para esta proposta foram alcançados resultados
variáveis, não reproduzidos entre grupos independentes (Chung et al., 2005;
Chinnapapagari et al., 2005).
A Amplificação Genômica Total (WGA - Wole Genomic Amplification) é
outro método de enriquecimento da quantidade de DNA, que combinada à
eletroforese em gel de agarose, tem a capacidade de melhorar a qualidade e a
quantidade das moléculas de DNA recuperadas para análise (Jorgez &
Bischoff, 2009). É uma técnica capaz de contornar a questão de baixa
17
quantidade de cópias de DNA, pois utiliza oligos degenerados (sequências
aleatórias de DNA) e amplifica o DNA genômico em pelo menos 30 vezes
(Hanson et al, 2005).
4.4. Aplicação dos testes genéticos pré-natais não invasivos
4.4.1. Determinação do sexo fetal
A determinação do sexo fetal é a aplicação clínica mais comum de
diagnóstico pré-natal não invasivo utilizando cffDNA no sangue materno. Na
China, por razões éticas, este teste é proibido, ao menos que ofereça
possibilidade de tratamento intrauterino (Newson, 2008). Em alguns países da
Europa, ele é oferecido gratuitamente no sistema público de saúde para
investigação de doenças ligadas ao sexo (Hill et al., 2011). No Brasil, foi
descrito pela primeira vez por Levi e colaboradores (2003), que relataram um
índice de acerto de 100% dos casos com idade gestacional acima de 8
semanas.
A detecção e quantificação do DNA fetal no plasma materno envolvem
normalmente sistemas de quantificação que usam sequências derivadas do
cromossomo Y, ausentes no genótipo materno e, portanto, herdadas
paternalmente pelo feto. Esses sistemas são sensíveis o suficiente para
detectar o DNA fetal equivalente ao de uma única célula (Martinhago et al.,
2006). Na maioria das pesquisas, as sequencias do cromossomo Y utilizadas
foram o gene de cópia única SRY ou a sequência de múltiplas cópias DYS14
do gene TSPY. Picchiassi e colaboradores (2008) ao comparar a performance
da detecção do sexo fetal entre o SRY e o DSY14 concluíram que a eficiência
na detecção foi de 97,9% para o DYS14 contra 80% para o SRY. A mesma
constatação foi observada por Zimmermann e colegas (2005). Apesar de ser
um sistema de detecção de DNA fetal livre mais sensível, acurado e eficiente,
particularmente durante o primeiro trimestre, quando a concentração da
molécula fetal é mais baixa, a sequência DYS14 apresenta considerável
homologia com outras sequências que não são do cromossomo Y, o que pode
gerar resultados falso positivos (Zimmermann et al., 2005). Um recente estudo
com gestantes entre 7-31 semanas gestacionais utilizou a combinação dessas
18
mesmas sequências - DYS14 e SRY – a fim de melhorar a detecção de fetos
masculinos, o que possibilitou a redução dos índices de resultados falso-
positivos (Scheffer et al., 2010)
A acurácia desta técnica é sempre elevada nas publicações que fazem
uso da PCR (fluorescente convencional ou real-time) como método de
detecção. Sekizawa e colaboradores, 2001, demonstraram num estudo
representativo com pacientes entre 7-16 semanas de gestação, uma
sensibilidade de 97.2% e especificidade de 100%. Em 2006, um grupo
brasileiro demonstrou o diagnóstico do sexo fetal a partir da 5ª semana de
gestação pela técnica de PCR em tempo real (RT-PCR), com boa sensibilidade
e especificidade (87% e 92,6%, respectivamente). E recomendaram que, nos
casos em que o resultado fosse do sexo feminino e a idade gestacional
estivesse entre 5 e 6 semanas, o exame deveria ser repetido a partir da 7a
semana gestacional para uma maior precisão diagnóstica (Martinhago et al.,
2006).
Akolekar e colaboradores (2010) examinaram a performance da
detecção do sexo fetal por meio de uma plataforma baseada em
espectrometria, utilizando três sequências do cromossomo Y (SRY, DBY e
TTTY2) ao mesmo tempo, durante o primeiro trimestre de gestação e
encontraram uma acurácia de 99,1%; sensibilidade de 98,9% e especificidade
de 99,2%.
Além de responder à curiosidade dos pais em saber qual o sexo do feto,
o diagnóstico para determinação do sexo fetal é, predominantemente, utilizado
quando existe o risco do feto masculino ser afetado por doenças genéticas
ligadas ao sexo, como: a Distrofia Muscular de Duchenne, Hemofilia, retardo
mental ligado ao X, Adrenoleucodistrofia, síndrome de Alport, imunodeficiência
ligada ao X, Retinite Pigmentosa, hidrocefalia ligado ao X, síndrome de Hunter,
síndrome de Menke e síndrome de Lesch-Nyhan (Costa et al., 2002). Esta
proposta diagnostica também é aplicada ao estudo da Hiperplasia Adrenal
Congênita (HAC), na qual há desenvolvimento externo ambíguo da genitália,
gerando masculinização de fetos femininos. Nos casos em que a família tem
risco para a doença, a determinação do feto feminino permite a administração
de dexamethasona para a gestante antes da 9ª semana e pode prevenir a
consequente virilização fetal (Sayres e Cho, 2011).
19
Nesse sentido, a determinação do sexo do feto tem a capacidade de
reduzir pela metade o número de diagnósticos invasivos para doenças
específicas, uma vez que poupa muitos fetos femininos do diagnóstico invasivo
desnecessário (Hyett et al., 2005).
4.4.2. Fenotipagem do Gene RHD fetal
Algumas doenças relacionadas à gestação podem, rotineiramente, ser
inferidas pelo do uso de técnicas não invasivas de detecção do cffDNA no
sangue materno, uma vez que são geradas a partir de uma sequência de DNA
que o feto herdou do pai, mas que não está presente na mãe. A doença
hemolítica do recém-nascido (DHRN) é uma delas, uma doença
potencialmente fatal, caracterizada por anemia grave (Wright e Burton, 2009).
O fator sanguíneo positivo ou negativo é determinado pelo gene
dominante RHD. Se as células fetais que carregam o antígeno RHD herdado
paternalmente entram em contato com a circulação materna (seja durante o
parto ou após um procedimento invasivo) a mãe, que é Rh negativa, produz
uma resposta imune contra o feto. Esses anticorpos maternos cruzam a
placenta e iniciam a destruição das células vermelhas fetais positivas,
colocando o feto em risco da DHRN (Wright e Burton, 2009). Na população
caucasiana, 10% das gestações envolvem mães Rh-negativas e fetos Rh-
positivos, colocando a grávida sobre o risco da aloimunização e o feto sobre o
risco da doença (Freeman et al., 2009).
Atualmente, a resposta imune materna é tratada, profilaticamente, pela
administração de anticorpos anti-D durante o terceiro trimestre de gestação ou
imediatamente após o parto (Bowman, 2003). No entanto, pressupõem-se que
40% da população caucasiana de mulheres Rh negativas recebam
desnecessariamente a medida profilática anti-D durante o pré-natal, pois
carregam fetos Rh negativos (Van der Schoot et al., 2006).
O diagnóstico pré-natal não invasivo para determinação do genótipo
RhD fetal em mulheres Rh negativas foi demonstrado pela primeira vez por Lo
e colaboradores (1998b). É um procedimento capaz de minimizar a imunização
profilática desnecessária, além de diminuir riscos de contaminação envolvidos
na técnica (Van der Schoot et al., 2006).
20
Em 2006 foi publicada uma meta-análise com 37 trabalhos e 44
protocolos de diagnósticos não invasivos para genotipagem do gene RHD fetal
em sangue materno, incluindo tanto pesquisas com células fetais intactas,
como aquelas com cffDNA. Foi estimada a sensibilidade e especificidade
gerais do diagnóstico como sendo 95,4% e 98,6%, respectivamente. A técnica
empregada ao cffDNA no plasma e soro maternos apresentou-se como
procedimento diagnóstico de maior acurácia (96,1% de sensibilidade e 96,5%
de especificidade), com destaque para a detecção no primeiro trimestre
(Geifman-Holzman et al., 2006).
Rouillac-Le Sciellour e colaboradores (2007) destacaram a existência de
uma variante silenciosa do gene RHD denominada RHDΨ (pseudogene),
capaz de gerar resultados falso-positivos quando fornece a amplificação dos
exons gênicos fora dos parâmetros padronizados para a técnica.
Devido a alta complexidade do sistema Rh e à possibilidade de
resultados falsos, foi sugerido examinar mais de uma região do gene RHD para
se obter a tipagem Rh (Avent, 1999). Aykut e colegas (2013) analisaram duas
regiões especifica do gene RHD, os exons 7 e 10 no sangue de grávidas Rh-
negativo entre 9-39 semanas de gestação e relataram 100% de sensibilidade e
especificidade. Em 2011, um grupo brasileiro (Amaral et al., 2011) publicou
uma pesquisa utilizando três regiões do gene RHD (exons 4, 5 e 10) e
relataram uma acurácia de 100%, com a possibilidade de detecção a partir da
11ª semana gestacional.
Hoje este teste é oferecido no sistema de saúde pública de diversos
centros da Europa (Bélgica, Reino Unido, França, Holanda, Alemanha,
Espanha) com alta precisão (sensibilidade de 100% e especificidade de 98,6%)
(Macher et al., 2012). No entanto, no Brasil o teste tem sido estudado por
alguns grupos (Machado et al., 2006; Chinen et al., 2010; Amaral et al., 2011,
Schimidt et al., 2014) e poucos laboratórios particulares o disponibilizam
comercialmente. A determinação genética do Rh fetal pelo sangue materno
como profilaxia pré-natal é considerado um procedimento caro e inviável para o
sistema publico de saúde brasileiro (Schimidt et al., 2014).
21
4.4.3. Doenças Monogênicas
Doenças monogênicas são as doenças genéticas causadas por
mutações em um único gene (locus) (Gonzalez-Gonzalez et al., 2003). Estima-
se ocorrer com uma frequência de 3,6 a cada 1000 nascidos vivos (Baird et al.,
1988 apud Gonzalez-Gonzalez et al., 2003). O uso de NIPT para avaliação de
desordens monogênicas é parte da prática clínica em genética médica,
principalmente quando há histórico familiar de alguma doença específica (Li et
al., 2004b). Até o momento, o NIPT tem se direcionado para a análise de
mutações de novo (novas) ou herdada paternalmente para garantir a origem
fetal (Bustamante-Aragonés et al., 2012). Neste contexto, observa-se na
literatura grande interesse dos pesquisadores em desenvolverem ferramentas
não invasivas para detecção de mutações específicas pelo sangue materno.
Em 2000 um grupo italiano, aplicando a técnicas de PCR e eletroforese,
utilizou pela primeira vez o DNA fetal livre no sangue materno para detectar
durante o primeiro trimestre de gestação uma mutação para a Distrofia
Miotônica (DM), uma doença monogênica dominante associada a expansão de
uma sequência de repetição de trinucleotídeos CTG no gene DMPK (Amicucci
et al., 2000). O diagnostico não invasivo da doença foi possível pois a mutação
era conhecida e herdada do pai, portanto, o alelo alterado (mutado) estava
ausente no genoma da mãe (sangue materno).
Posteriormente, outras técnicas moleculares (RFLP–Restriction
Fragment Length Polymorphism, touchdown PCR, fracionamento de DNA, PCR
quantitativa fluorescente – Q-PCR) possibilitaram a detecção pré-natal não
invasiva de uma mutação de ponto conhecida e presente em mais de 98% dos
casos de acondroplasia, outra doença com herança dominante (Saito et al.,
2000; Li et al., 2004b, Lim et al., 2010).
O NIPT para doenças monogênicas também foi aplicado à detecção da
doença de Huntington, uma doença autossômica dominante degenerativa,
gerada por uma expansão de trinucleotídeos (CAG) no gene IT-15 (Gonzalez-
Gonzales et al., 2003). O mesmo grupo espanhol reportou uma nova estratégia
diagnóstica com o uso de um sistema de detecção indireta da mutação,
baseada na aplicação de marcadores polimórficos STR (Short Tandem
Repeats) próximos ao gene HD, utilizando a análise do DNA de pais e parentes
22
afetados pela doença. A vantagem desse modelo está no fato de, segundo
experiência do autor, a análise direta da mutação, apesar de mais segura,
poder fornecer um resultado não informativo quando, por exemplo, a mutação
for gerada por uma expansão muito longa, incapaz de ser detectada no
fragmentado DNA fetal (Gonzalez-Gonzalez et al., 2008).
As doenças monogênicas de herança autossômicas recessivas são
difíceis de serem detectadas, pois nesses casos a mãe e o pai são portadores
de mutações e o feto será afetado se herdar dos pais ambas as mutações.
Quando estas mutações são idênticas entre o casal, o diagnóstico torna-se
complexo, uma vez que o feto e a mãe apresentam os mesmos alelos,
indistinguíveis pelo plasma (Wright e Burton, 2009).
Em 2002, Gonzalez-Gonzalez e colaboradores reportaram sua
experiência no diagnóstico não invasivo pré-natal da Fibrose Cística (FC), uma
doença autossômica recessiva, após analisarem a mutação Q890X herdada
paternalmente no plasma de uma grávida com 13 semanas de gestação. Eles
concluíram serem capazes de detectar a mutação e a condição portador do
feto, desta forma, fez-se possível excluir a chance do feto ser afetado pela
doença quando ele não apresentasse a mutação herdada paternalmente.
A mesma estratégia foi aplicada ao NIPT de outras doenças com
herança recessiva. A Hiperplasia Adrenal Congênita (HAC) foi estudada por
Chiu e colaboradores (2002a) em gestantes entre a 11ª e a 17ª semanas de
gestação e possibilitou, por meio de sistemas de PCR alelo-específicos, a
exclusão da doença e redução da terapia com dexametasona desnecessárias
para fetos femininos não afetados. No mesmo ano, esse grupo descreveu a
possibilidade de exclusão da β-talassemia major pelo exame do sangue
materno utilizando a técnica de PCR em tempo real alelo-específica (Chiu et
al., 2002b).
Os grandes desafios relacionados ao diagnóstico genético pré-natal não
invasivo para as doenças monogênicas são: a distinção da informação genética
fetal nos casos em que a herança dominante for transmitida pela mãe ou nos
casos em que ambos os pais são portadores da mesma mutação recessiva. A
solução para essa dificuldade foi proposta por Lun e colegas (2008), por meio
de uma estratégia molecular de PCR digital, que ele denominou de RMD
(Relative Mutation Dosage), na qual é quantificado o número relativo de alelos
23
(sequência de DNA em um locus específico) presentes no DNA livre, então, é
estabelecido que existe um excesso estatisticamente significante de um tipo de
alelo (mutado) sobre o outro (selvagem), consistente com a presença de uma
ou duas mutações no feto.
Essa ferramenta foi empregada ao diagnóstico pré-natal pelo sangue
materno para identificar direta e acuradamente os alelos mutantes ou
selvagens herdados por fetos masculinos com risco para hemofilia a partir da
11ª semana gestacional (Tsui et al., 2011).
Recentemente, Gu e colaboradores (2014) reportaram sua experiência
no diagnostico pré-natal de um feto que apresentava 25% de chance de herdar
duas mutações para acidemia metilmalônica, iguais em ambos os pais. Nesse
estudo, a PCR digital foi empregada para quantificar a fração de DNA fetal
utilizando a contagem de SNPs (Single Nucleotide polymorphisms) herdados
paternalmente e também, a contagem estatisticamente significante do excesso
de fragmentos mutados ou selvagens. O emprego de SNPs ligados à mutação
forneceu suporte adicional para o diagnóstico e a distinção entre os alelos
maternos e paternos, que apresentavam a mesma mutação. Além disso, o
autor concluiu que esse procedimento pode ser aplicado ao diagnóstico de
outras doenças genéticas de forma confiável, relativamente fácil, rápido e
barato.
Na literatura observa-se a exploração de procedimentos
consideravelmente precisos, que teoricamente permitem que a análise seja
aplicada ao diagnóstico das doenças monogênicas, pois não fornecem
meramente a exclusão. No entanto, a análise dessas doenças é caso-
específica e, por isso, limita a aplicação do NIPT para um maior número de
gestações de alto-risco, além de requerer a utilização de equipamentos caros e
não disponíveis na maioria dos laboratórios (Wright e Burton, 2009).
Atualmente, essas abordagens são oferecidas e pesquisadas por
laboratórios acadêmicos da Europa e da China. Nos Estados Unidos, uma
empresa disponibiliza clinicamente o NIPT para doenças monogênicas,
incluindo a fibrose cística e a anemia falciforme (Columbia, SC, USA). No Brasil
ainda não existem relatos da utilização de DNA fetal livre no sangue materno
para o diagnóstico pré-natal não invasivo de doenças monogênicas, sejam elas
de herança dominante ou recessiva.
24
4.4.4. Teste de Paternidade
Outra aplicação dos testes pré-natais não invasivos é a
possibilidade da exclusão da paternidade por meio do sangue materno. A
detecção de alelos (sequência de DNA em um locus específico) fetais herdado
paternalmente, pelo plasma materno, foi pela primeira vez sugerida utilizando-
se sistemas de marcadores polimórficos STRs. Tang e colaboradores (1999)
demonstraram a detecção de microssatélites (STRs) do cromossomo X, em um
sistema independente do sexo, no plasma de gestantes de fetos femininos.
Enquanto Pertl e colaboradores (2000) descreveram a detecção de sequências
de DNA fetais herdadas do pai para STRs dos cromossomos 13, 18 e 21 em 12
gestantes com mais de 37 semanas de gestação. Estes resultados precederam
a aplicação do DNA fetal livre no plasma materno como recurso de exclusão de
paternidade por métodos não invasivos.
Mais de dez anos se passaram, desde a demonstração da presença de
DNA fetal livre no sangue materno, até o desenvolvimento de um teste de
paternidade pré-natal não invasivo confiável (Lo et al., 1997). Em 2009,
Wagner e colaboradores reportaram a primeira experiência no desenvolvimento
de um teste de paternidade pré-natal não invasivo pelo sangue materno. Este
trabalho demonstrou a amplificação e detecção de 6-16 alelos específicos
fetais para um locus homólogo dos cromossomos X e Y. No entanto, não
incluiu quantidade suficiente de alelos para determinar acuradamente a
paternidade avaliada.
Recentemente, Guo e colaboradores (2012) publicaram um estudo com
30 casos, no qual utilizaram marcadores SNPs e identificaram corretamente os
alelos específicos herdados paternalmente. No entanto, este estudo comparou
o suposto pai a apenas um homem não relacionado.
Ryan e colaboradores (2013) reportaram o que eles mesmos
denominaram de primeiro - altamente acurado - teste de paternidade pré-natal
não invasivo disponível clinicamente. No qual, testaram a paternidade de 21
casos contra uma população de 5.000 homens aleatórios. E foram capazes de
detectar os alelos herdados paternalmente com 100% de acurácia em
gestações de primeiro trimestre.
25
Atualmente, os testes pré-natais não invasivos para a exclusão da
paternidade são oferecidos por alguns laboratórios do Brasil, mas os exames
são realizados por laboratórios nos EUA. Duas empresas norte-americanas
oferecem esse exame a partir da 8ª e 9ª semana de gestação,
respectivamente, com uma acurácia de >99% (Columbia, SC, USA e San
Carlos, CA, USA).
4.4.5. Aneuploidias
O termo Aneuploidia refere-se à mudança no número de cromossomos
presentes nas células. É, frequentemente, causada por não disjunção dos
cromossomos na meiose durante a produção dos gametas. Afeta um em cada
300 recém-nascidos, é responsável por pelo menos 35% das perdas
gestacionais, sendo a causa mais comum de retardo mental (Sayres e Cho,
2011). As Aneuploidias mais comuns são: trissomia dos cromossomos 21
(síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) e 18 (síndrome de Edwards);
trissomia dos cromossomos sexuais (XXX – triploX; XXY – síndrome de
Klinefelter; e XYY – síndrome de Jacob’s); e Monossomia do cromossomo X
(Wellesley et al., 2012), responsáveis por até 95% das Aneuploidias ao
nascimento (Martinhago, 2006b)
O padrão ouro para o diagnóstico genético pré-natal de qualquer
aneuploidia é atualmente fornecido por procedimentos invasivos, como a coleta
de vilosidade corial ou líquido amniótico; seguidos da aplicação das técnicas de
cariotipagem, FISH (Fluorescent in situ Hybridization) ou Arrays (Wright e
Burton, 2009).
A disponibilidade de um método de diagnóstico pré-natal não invasivo
para aneuploidias sempre foi de grande interesse da prática e pesquisa
clínicas. E desde a demonstração da presença do DNA e RNA fetal livre no
sangue materno (Lo et al., 1997; Lo et al., 1998a) observa-se o
desenvolvimento de uma série de ferramentas sofisticadas de implementação
de diagnóstico fetal não invasivo com o intuito de tornar disponível um método
de diagnóstico eficaz, seguro e acessível para o diagnóstico das principais
cromossomopatias (Lo, 2012).
26
O grande desafio no diagnóstico pré-natal não invasivo para
aneuploidias pelo sangue materno está em mensurar quantas cópias de um
determinado cromossomo estão presentes no sangue materno e distinguir as
cópias maternas e fetais, uma vez que o feto compartilha, pelo menos, metade
de seu genoma com a mãe, além de poder herdar dela ou do pai a cópia
cromossômica aneuploide (Jorgez et al., 2007).
Em 1999, foi demonstrado que mulheres grávidas de fetos que
apresentavam a síndrome de Down possuíam uma concentração absoluta de
cffDNA (circulating free fetal DNA) maior em seus plasma e soro do que em
gestações de fetos euplóides (Lo et al., 1999). O mesmo foi observado nas
gestações de fetos com trissomia do cromossomo 13, mas não com as
gestações de fetos que apresentavam a trissomia do cromossomo 18
(Wataganara et al., 2003). Essa variação foi mais tarde atribuída a diferentes
protocolos experimentais, não havendo significante correlação entre o nível de
cffDNA ou da quantidade total de DNA livre no sangue materno e as trissomias
dos cromossomos 21, 18 e 13 (Gerovassili et al., 2007).
Posteriormente, as estratégias de diagnóstico se voltaram para a
detecção e quantificação de marcadores específicos dos cromossomos
envolvidos nas aneuploidias mais comuns. Em 2000, Poon e colaboradores
demonstraram a detecção de mRNA transcrito do cromossomo Y no plasma de
gestantes de fetos do sexo masculino. Desde então, estudos subsequentes
foram capazes de sugerir que a placenta seria o tecido de maior recurso de
RNA fetal circulante no plasma materno (Ng et al., 2003). Em 2004 foi
desenvolvida uma ferramenta de identificação sistemática de marcadores de
mRNA fetais do plasma materno baseada em microarrays (Tsui et al., 2004).
Esta ferramenta tornou capaz a detecção e quantificação do mRNA fetal
PLAC4, expresso unicamente na placenta, localizado no cromossomo 21 e
aplicado à detecção pré-natal da síndrome de Down (Lo et al., 2007). Go e
colaboradores (2007) e Chim e colaboradores (2008), detectaram outros genes
expressos exclusivamente no tecido placentário, oferecendo uma ampla
variedade de recursos de RNA fetais livres pelo sangue materno. Porém, esse
método apresentava limitada aplicação, uma vez que requeria marcadores
polimórficos informativos em fetos heterozigotos para a informação gênica (Lo
et al., 2007).
27
Outra alternativa explorada foi a utilização de marcadores epigenéticos.
A Epigenética é o estudo de fenômenos que afetam a expressão gênica, mas
não envolvem a modificação da sequência do DNA (Poon et al., 2002). Um
importante exemplo de estudos epigenéticos é o processo de metilação do
DNA. É conhecido que o padrão de metilação do DNA é tecido-específico. Em
2002, Poon e colaboradores demostraram, por meio da identificação do gene
SERPINB5, localizado no cromossomo 18, a possibilidade de desenvolver
marcadores de DNA fetais baseados na diferença do padrão de metilação entre
o tecido materno e fetal. Em 2006, Tong e colaboradores, explorando o
diferencial epigenético entre o DNA do feto e da mãe, demonstraram o
diagnóstico da trissomia do cromossomo 18 (síndrome de Edward) por meio da
razão alélica fornecida pela PCR metilação-específica do promotor gênico
placentário maspin. Chim e colaboradores, 2008, por sua vez, formularam um
estudo sistemático e foram capazes de sugerir marcadores de metilação de
DNA como recurso pré-natal não invasivo pelo sangue materno para o
diagnóstico da trissomia do cromossomo 21. No entanto, essa ferramenta
apresenta a desvantagem de estar sujeita a resultados falso-positivos devido à
digestão incompleta (e vieses na diferença no padrão de metiliação) do DNA
materno, além de apresentar aplicação limitada e barreiras técnicas (Tong et
al., 2006).
Dhallan e colaboradores (2007) demonstraram a detecção simultânea de
milhares de SNPs dos cromossomos 13 e 21 herdados paternalmente, usando
formaldeído para suprimir as células maternas do sangue. Os genótipos
materno e paterno foram comparados e quantificados, e a razão entre os
diferentes alelos do casal foi determinada para especificar o número de
cromossomos do feto.
Uma ferramenta similar foi aplicada à pesquisa de Ghanta e
colaboradores (2010), que identificaram combinações de SNPs pareados, eles
focaram em regiões altamente polimórficas e informativas do genoma e, pela
técnica de eletroforese capilar, avaliaram a dosagem e a fração do DNA fetal,
fornecendo uma metodologia aplicável a situações em que a fração fetal era
tão baixa quanto 2%.
As metodologias citadas anteriormente baseiam-se na limitada precisão
dos métodos convencionais de detecção do cffDNA. Em 2007, Lo e
28
colaboradores propuseram uma abordagem técnica baseada na contagem
molecular por PCR Digital para a detecção da trissomia do cromossomo 21. O
conceito básico por trás desta abordagem é que quanto maior for o número de
moléculas contadas, maior será o poder de discriminação da técnica analítica.
Além disso, o número de moléculas de DNA no plasma materno que precisam
ser contadas para detectar um feto com Síndrome de Down, por exemplo, é
inversamente correlacionada com a porcentagem de cffDNA. Parte da
explicação para o sucesso desta técnica resulta da constatação de que a
proporção de DNA livre que é fetal é mais elevada do que se pensava
inicialmente (Fan e Quake, 2007). No entanto, a proporção do DNA da amostra
ainda tem um forte efeito sobre a confiabilidade dos NIPT para aneuploidias
(Lun et al., 2008). Em 2008, foi demostrado pela primeira vez a detecção das
trissomias dos cromossomos 21, 18 e 13 por sequenciamento (Chiu et al.,
2008).
Atualmente, três diferentes ferramentas de teste são aplicadas ao NIPT
para aneuploidias.
O s-MPS (Shotgun Massively Parallel Sequencing), baseado no método
de sequenciamento por MPS (Figura 1), sequencia fragmentos de DNA de todo
o genoma. É uma técnica baseada na identificação e contagem de um grande
número de fragmentos de DNA das amostras de plasma maternos. Milhões de
fragmentos de DNA fetais e maternos (com o tamanho de ∼25pb) podem ser
sequenciados simultaneamente e, uma vez que o genoma humano completo é
conhecido, cada sequência que mapeia um locus específico desse genoma
pode ser atribuída ao cromossomo a partir do qual se originou (Fan et al.,
2008). Se existir alguma aneuploidia, haverá um excesso ou déficit relativos do
cromossomo de interesse, comparado ao esperado como padrão para casos
euplóides. Uma grande quantidade de fragmentos precisa ser contada devido a
pequena diferença existente entre gestações aneuplóides e euplóides,
especialmente quando a fração fetal do DNA livre no sangue materno é baixa,
uma consideração particularmente importante em gestações de primeiro e
segundo trimestres. Por exemplo, para o cromossomo 21, estima-se ser
necessária a contagem de >95.000 fragmentos para que a habilidade de
distinção entre as sequências tenha elevado grau de confiança. A análise e
interpretação dos dados do sequenciamento são avaliados com base na
29
escolha de plataformas de bioinformática (eg. z-score). E o refinamento na
análise estatística inclui, muitas vezes, ajustes do conteúdo de bases guanina-
citosina (GC) das sequencias de DNA (Fan e Quake, 2010).
Figura 1. Esquema ilustrativo do sequenciamento por MPS. (a) No
sangue da mãe existem os fragmentos de DNA livres de origem fetal e
materna; (b) todos os fragmentos são sequenciados simultaneamente; (c) cada
sequência é atribuída ao cromossomo que a originou e o excesso ou déficit na
quantidade de fragmentos, com relação a um limitar esperado para gestações
euplóide, é considerado uma aneuploidia. Adaptado do portfólio de Redwood
City, CA, USA.
A segunda metodologia disponível é o t-MPS (Target Massively Parallel
Sequencing), que ao contrário do s-MPS, que sequencia aleatoriamente
fragmentos genômicos de todos os cromossomos, o t-MPS sequencia
seletivamente sequências marcadas de regiões genômica especifica de
interesse (eg. cromossomos 21, 18, 13, X e Y), então conta apenas essas
sequências e avalia quando existe um excesso relativo de um cromossomo
sobre outro. O t-MPS também faz uso de metodologia de contagem de reads,
30
mas incliu um passo inicial de sequenciamento-alvo, no qual aproximadamente
400 locus gênicos de cada cromossomo de interesse é seletivamente
amplificado. A Figura 2 representa a diferença entre os métodos por s-MPS e
t-MPS. As vantagens dessa ferramenta mais seletiva são: o baixo custo do
sequenciamento (até 10 vezes menor), pois nem todas as regiões do genoma
precisam ser sequenciadas; e o aumento na eficiência, pois realiza-se a
contagem alternativa de um maior número de fragmentos de DNA, que
correspondem às regiões específicas dos cromossomos de interesse (Sparks
et al., 2012a).
Figura 2. Esquema ilustrativo da diferença entre as técnicas de s-MPS e
t-MPS. (a) a metodologia s-MPS analisa os fragmentos de cffDNA de todos os
cromossomos; (b) a metodologia t-MPS analisa apenas os fragmentos de
cffDNA dos cromossomos de interesse, pois inclui um passo inicial de
sequenciamento-alvo, no qual regiões específicas de cada cromossomo de
interesse é seletivamente amplificada. Adaptado do portfólio de San Jose, CA,
USA.
O terceiro método desenvolvido para o NIPT para aneuploidias se
fundamenta na análise de SNPs (Figura 3) - polimorfismos de base única - e
31
determina a contribuição quantitativa relativa dos DNAs fetal e materno
circulantes no sangue materno. É o único capaz de distinguir o DNA livre fetal e
materno. Essa ferramenta envolve a amplificação simultânea de cerca de
20.000 sequências de SNPs em uma única reação de PCR realizada com o
DNA do plasma da mãe seguido de sequenciamento. Cada produto da PCR é
avaliado tendo-se como base a hipótese de que o feto é monossômico,
dissômico ou trissômico. Após considerar a posição dos SNPs nos
cromossomos e a possibilidade de recombinação entre eles, são calculadas as
probabilidades dos fetos serem euplóides, aneuplóides ou triploides. Pode
ainda identificar regiões de homologia dos cromossomos fetais que indicam
consanguinidade ou dissomia uniparental. A tecnologia que utiliza SNP permite
fornecer informação sobre a origem da aneuploidia, sobre eventos de
recombinação e mutações herdadas (Samango-Sprouse et al., 2013).
Figura 3. Esquema representativo do funcionamento do NIPT para
aneuploidias por SNP. (a) SNPs são polimorfismos em uma única base
nitrogenada; (b) são sequenciados os DNAs livres do plasma materno, ou seja,
do feto e da mãe; e separadamente, é sequenciado apenas o DNA das células
brancas maternas; (c) após considerar a posição dos SNPs nos cromossomos
32
e a possibilidade de recombinação entre eles, é determinada a contribuição
quantitativa relativa dos DNAs fetal e materno, pelo cruzamento de informações
entre os dois sequenciamentos e, então, são calculadas as probabilidades dos
fetos serem euplóides, aneuplóides ou triploides. Adaptado do portfólio de San
Carlos, CA, USA.
O interesse no desenvolvimento dessas tecnologias cresceu
rapidamente e pelo menos quatro empresas introduziram o NIPT para
aneuploidias no mercado nos últimos três anos. As quatro empresas sediadas
nos Estados Unidos comercializam testes baseados em PCR e métodos de
sequenciamento para reunir a informação genética contida no DNA fetal livre.
Cada instituição utiliza uma metodologia diferente e algoritmos exclusivo e
patenteado para interpretação dos dados genéticos (Norwitz e Levy, 2013). A
Tabela 2 compara os NIPT para aneuploidias disponíveis para uso clínico.
A primeira empresa lançou, em outubro de 2011, o teste T1, que é
baseado no método s-MPS e no algoritmo de correção de bases z-score GC,
possibilita a detecção das aneuploidias mais comuns: trissomias dos
cromossomos 21, 18, 13 e cromossomos sexuais (XXY - síndrome de
Klinefelter; XXX - Triplo X; e XYY), monossomia do cromossomo X - síndrome
de Turner; além das trissomia dos cromossomos 16, 22 e microdeleções (22q –
síndrome DiGeorge; 15q - síndrome Prader-Willi/Angelman; 11q – síndrome
Jacobsen; 8q - síndrome Langer-Giedion; 5p – síndrome Cri-du-chat; 4p –
síndrome Wolf-Hirschhorn; e síndrome da deleção 1p36). Este teste está
disponível a partir da 10ª semana gestacional e fornece o resultado 5 dias após
o recebimento das amostras. Os laboratórios de teste são certificados pela
CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) e creditados pela CAP
(College of American Pathologists) (San Diego, CA, USA).
Estudos de validação independentes deste primeiro NIPT demonstram
que a sensibilidade e especificidade de detecção para a trissomia do
cromossomo 21 são de 99,1%/99.9%; para a trissomia do cromossomo 18 são
>99,9%/99,6%; e para a trissomia do cromossomo 13 são 91,7%/99,7%. As
taxas de resultados falso-positivo para os cromossomos 21, 18 e 13 são
respectivamente, 0,1%; 0,3%; e 0,9%. E a taxa de detecção para as três
33
aneuploidias ao mesmo tempo é reportada como sendo de 98,9%, com a
redução do índice de resultado falso-positivo para 0,1%. A acurácia da
determinação sexual do feto é de 99,4% e na detecção das aneuploidias dos
cromossomos sexuais o exame tem 96,2% de sensibilidade e 99,7% de
especificidade. No estudo das microdeleções, o teste possui uma acurácia de
60-90% dependendo da síndrome avaliada (Palomaki et al., 2011; Ehrich et al.,
2011; Chiu et al., 2011; Palomaki et al., 2012; McCullough et al., 2014).
O segundo NIPT para aneuploidias entrou no mercado em março de
2012, com o teste T2 e também faz uso da ferramenta s-MPS, mas de outro
algoritmo próprio, o SAFeR. Detecta as aneuploidias dos cromossomos 21, 18,
13 e sexuais e fornece a opção de inclusão do gênero do feto no resultado. O
laboratório do grupo é certificado e creditado pela CLIA e CAP. É indicado às
gestantes com risco para aneuploidias a partir da 10ª semana gestacional e
apresenta o resultado do exame de 7 a10 dias (Redwood City, CA, USA).
Estudos do grupo de pesquisadores responsáveis por esse teste
concluem que ele apresenta sensibilidade e especificidade de >99,9%/99,8%
para a detecção da síndrome de Down; de 97,4%/99,6% para a detecção da
síndrome de Edward; e de 87,5%/>99,9% para a detecção da síndrome de
Patau. O teste ainda fornece a detecção de fetos masculinos com 99% de
acurácia e de fetos femininos com 98,4% de acurácia. E a detecção da
síndrome de Turner é possível com 95,0% de sensibilidade e 99,0% de
especificidade (Fan e Quake, 2010; Sehnert et al., 2011; Bianchi et al., 2012;
Bianchi et al., 2014)
A terceira empresa passou a oferecer o NIPT para aneuploidias teste T3
a partir de maio de 2012. Esse teste pré-natal utiliza a metodologia t-MPS,
denominada DANSR (Digital Analysis of Selected Regions) aliado ao algoritmo
de bioinformática FORTE (Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy
Evaluation), que seleciona locus cromossômicos e detecta aneuploidias dos
cromossomos 21, 18, 13 e sexuais, além de também possibilitar a
determinação sexual do feto. Assim como os outros testes, é oferecido a partir
da 10ª semana gestacional e o resultado é disponibilizado para a paciente de 8
a 10 dias após a coleta do sangue (San Jose, CA, USA).
Ele possui sensibilidade de >99,9% e taxa de falso-positivo de 0,1% na
detecção da trissomia do cromossomo 21; para a trissomia do cromossomo 18,
34
a sensibilidade e taxa de falso-positivo são reportadas como 98,0% e 0,07%; e
para o cromossomo 13 a taxa de detecção é de 80% e o valor falso-preditivo
(FPV) é de 0,05%. Juntas, para as três trissomias o teste tem a acurácia de
>99,0% e índice de falso-positivo de 0,15%. Tem 99,0% de acurácia na
determinação do sexo fetal e para a detecção das aneuploidias dos
cromossomos sexuais as taxas de detecção e valores dos índices de falso-
positivos são de 96,7%/0,5% para a monossomia do cromossomo X;
100%/0,5% para XXX (triplo X); e 100%/0% para XXY (síndrome de Klinefelter)
(Sparks et al., 2012a; Sparks et al., 2012b; Ashoor et al., 2012; Ashoor et al.,
2013; Nicolaides et al., 2012; Norton et al., 2012, Gil et al., 2013; Fairbrother et
al., 2013; Hooks at al., 2014; Quezada et al., 2014).
Há pouco mais de um ano, a quarta empresa desenvolveu para o teste
T4 uma plataforma de sequenciamento de última geração baseada na
ferramenta molecular SNP – NATUS (Next-generation Aneuploidy Test Using
SNPs) - e no algoritmo patenteado PS (Parental Support) que detecta, de
forma não invasiva, as trissomias dos cromossomos 21, 18, 13 e alteração nos
cromossomos sexuais. Possibilita ainda a detecção de microdeleções (22q –
síndrome DiGeorge; 15q - síndrome Prader-Willi/Angelman; 5p – síndrome Cri-
du-chat; e síndrome da deleção 1p36) e, adicionalmente aos outros testes,
fornece resultado nos casos de triploidia e nos casos de Gêmeos
desaparecidos. É o exame com a detecção mais precoce na gestação, a partir
da 9ª semana. E seus laboratórios têm a certificação da CLIA e são creditados
pela CAP (San Carlos, CA, USA).
Este NIPT para aneuploidias oferece >99,0% de sensibilidade e 0% de
taxa de falso-positivo na detecção das trissomias dos cromossomos 21 e 13 e
96,4% de sensibilidade e <0,1% de taxa de falso-positivo para a detecção da
trissomia do cromosso 18. Esse teste tem >99,9% de acurácia na determinação
do sexo do feto e as aneuploidias relacionadas aos cromossomos sexuais são
detectáveis com 92,9% de sensibilidade e <0,1% de taxa de falso-positivo no
caso da monossomia do cromossomo X e >99,0% de acurácia para as outras
trissomias sexuais. Como diferencial, o exame detecta os casos de triploidia
com >99,0% de acurácia. A taxa de detecção desse teste para as
microdeleções ou duplicações varia de 93,8%-99% dependendo da alteração
35
cromossômica submicroscópica avaliada (Zimmermann et al., 2012; Nicolaides
et al., 2013; Wapner et al., 2014; Dar et al., 2014; Rabnowitz et al., 2014a;
Rabnowitz et al., 2014b; Hall et al., 2014; Pergament et al., 2014).
Tabela 2. Desempenho dos métodos s-MPS, t-MPS e SNP na detecção de alterações cromossômicas Métodos s-‐MPS t-‐MPS SNP Testes T1 T2 T3 T4 Nome da técnica -‐ -‐ DANSR NATUS Algorítmo z-‐score GC SAFeR FORTE PS Tempo gestacional >10 semanas >10 semanas > 10 semanas >9 semanas T21 99,1%
(0,1%) >99,9% (0,2%)
>99,9% (0,1%)
> 99,9% (0%)
T18
>99,9% (0,3%)
97,4% (0,4%)
>98,0% (<0,1%)
96,4% (<0,1%)
T13 91,7% (0,9%)
87,5% (0,1%)
80,0% (<0,1%)
>99,9% (0%)
45X 94,4% (0,6%)
95,0% (1,0%)
96,7% (0,5%)
92,9% (<0,1%)
TX/Y 96,2% 67-‐100% >99,0% >99,0% Triploidia -‐-‐-‐ -‐-‐-‐ -‐-‐-‐ >99,9% Microdeleção 60-‐90% -‐-‐-‐ -‐-‐-‐ 93,8-‐99,0% Referências Chiu et al. 2011
Ehrich et al. 2011 Palomaki et al. 2011 Palomaki et al. 2012 Chen et al. 2011
Sehnert et al. 2011 Bianchi et al. 2012 Bianchi et al. 2014
Sparks et al. 2012a Sparks et al. 2012b Ashoor et al. 2012 Ashoor et al. 2013 Nicolaides et al. 2012 Norton et al. 2012 Fairbrother et al. 2013 Hooks et al. 2014 Quezada et al. 2014
Zimmermann et al. 2012 Nicolaides et al. 2013 Wapner et al. 2014 Dar et al.2014 Rabnowtz et al. 2014a Rabnowtz et al. 2014b Hall et al. 2014 Pergament et al. 2014
Desempenho mostrado como valor da acurácia e, entre parênteses, a taxa de falso-‐positivo. DANSR (Digital Analysis of Selected Regions); NATUS (Next-‐generation Aneuploidy Test Using SNPs); FORTE (Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation); PS (Parental Support); T21 (trissomia do cromossomo 21); T18 (trissomia do cromossomo 18); T13 (trissomia do cromossomo 13); 45X (monossomia do cromossomo X); TX/Y (trissomia dos cromossomos sexuais).
Segundo um levantamento realizado por Agarwal e colaboradores
(2013), pelo menos mais três empresas dos Estados Unidos têm expressado
interesse no desenvolvimento de NIPT para aneuploidias cromossômicas: uma
delas é a empresa que hoje oferece o NIPT para a exclusão de paternidade e
testes para algumas doenças monogênicas; a outra busca desenvolver um
36
teste baseado em microarray para detecção da trissomia do 21 e outros
cromossomos; além de uma empresa que pesquisa, na urina materna, a
análise de fragmentos do DNA por meio da técnica MPS. Fora dos Estados
Unidos, alguns laboratórios comerciais e acadêmicos oferecem e desenvolvem
NIPT para aneuploidias e outras condições genéticas.
4.4.6. Sequenciamento Genômico Total
O genoma do feto é consequência da combinação de quatro linhagens
cromossômicas ou haplótipos (duas maternas e duas paternas), resultado de
arranjos aleatórios e recombinações durante a divisão celular (Fan et al., 2012).
No plasma materno existe uma mistura de moléculas de DNA da mãe e do feto,
sendo que a fração fetal compreende cerca de 10% de todo DNA livre (Lun et
al., 2008). Nesse plasma, existem três haplótipos por região genômica: o
haplótipo materno; o haplótipo materno transmitido para o feto; e o haplótipo
paterno herdado pelo feto.
O recente advento de técnicas mais robustas (MPS e SNP) aplicadas às
diversas áreas do diagnóstico pré-natal não invasivo permitiu que a análise do
cffDNA fosse realizada com sensibilidade e precisão sem precedentes (Lo,
2013). Durante a evolução dessas metodologias observou-se a possibilidade
de expansão da quantidade de informações obtidas a partir do material fetal,
permitindo que fosse incorporado conteúdo adicional ao NIPT, como no estudo
de síndromes envolvendo microdeleções e duplicações e na pesquisa de
doenças monogênicas (Jensen et al., 2012; Lo et al., 2010). Assim, o grande
avanço gerado a partir das pesquisas sobre o NIPT para aneuploidias tornou
possível que outras anormalidades, menos frequentes e não restritas a
mudanças no número de cópias genéticas pudessem ser detectadas com
confiança.
A implementação de tecnologias de sequenciamento de última geração
NGS (Next Generation Sequencing) no desenvolvimento de NIPT contribuíram
para o incremento de novos conhecimentos na área pré-natal. Em 2010, Lo e
colaboradores reportaram a utilização de técnicas de NGS para vasculhar o
genoma fetal completo pela primeira vez. Neste estudo, os autores concluíram
que o genoma fetal está inteiramente representado por pequenos fragmentos
37
de cffDNA no plasma materno, presentes em uma proporção relativa constante
e sugeriram que sua reconstrução técnica era viável, inclusive possibilitando a
detecção de desordens genéticas. No entanto, requeria procedimentos
invasivos em sua pesquisa.
Em 2012, outro grupo de pesquisadores combinou o sequenciamento
genômico total dos pais (WGS – Whole Genome Sequencing) e a pesquisa por
haplótipos genômicos maternos para demonstrar o WGS de um feto de 18
semanas gestacionais com 98,1% de acurácia (Kitzman et al., 2012).
Posteriormente, Fan e Quake (2012) descreveram que o princípio da contagem
cromossômica planejado para a detecção de aneuploidias poderia também ser
aplicada à investigação não invasiva completa do genoma fetal. Ambos os
estudos inferiram o genótipo fetal, primeiramente sequenciaram o genoma
materno com a finalidade de identificar alelos que pudessem ser transferidos
para o feto e posteriormente, analisaram o DNA livre do plasma materno para,
então, determinar quais alelos foram de fato herdados pelo feto.
Chen e colaboradores, no ano seguinte (2013), desenvolveram uma
nova estratégia de NIPT para expandir a cobertura do genoma fetal, inferindo o
genótipo e o fenótipo do feto em um único passo. Eles utilizaram, pela primeira
vez, uma estratégia combinada de trios e indivíduos não relacionados para
construir os haplótipos paternos. Esse estudo permitiu a caracterização mais
robusta e acurada dos alelos dos pais, mostrando que 98,57% dos alelos
autossômicos paternos, 95,37% dos alelos autossômicos maternos e 98,45%
do haplótipo fetal do cromossomo X materno foram avaliados.
Mais recentemente, Lau e colaboradores (2014) revisaram a aplicação
de uma plataforma de WGS de baixa cobertura ao NIPT para a detecção das
aneuploidias frente a uma experiência clínica real. Nessa publicação ficou
demonstrado que esse procedimento tem 100% de acurácia na detecção das
trissomias comuns e permite a detecção de outras aneuploidias e
anormalidades cromossômicas estruturais com elevado valor preditivo positivo
(PPV), foi reportado ainda que a concordância dos dados da pesquisa com os
resultados dos cariótipos dos fetos analisados foi de 100%.
O NIPT aplicado ao WGS difere das outras aplicações de NIPT no que
diz respeito aos aspectos éticos, uma vez que amplia consideravelmente o
volume e o âmbito das informações genéticas pré-natais, é visto como o futuro
38
do NIPT e, também, como um assunto polêmico que exige regulamentação.
Sua prática clínica requer o desenvolvimento de novos projetos experimentais
e o incremento de ferramentas analíticas. Atualmente, sua aplicação restringe-
se ao escopo de publicações dos laboratórios acadêmicos de fora do Brasil.
39
5. Discussão
Nas últimas décadas, acompanha-se a explosão de uma série de
avanços tecnológicos, que influenciaram tanto as ciências médicas, com o
desenvolvimento de metodologias mais seguras e precisas; como a sociedade
em seu cotidiano, com o acesso mais fácil à informação. Atualmente, no âmbito
pré-natal, nota-se uma geração de gestantes mais maduras e interessadas,
que procura maior esclarecimento e melhores possibilidades de cuidados
obstétricos. Fomentando esse interesse, vemos a existência de exames que
possibilitam o acesso de uma quantidade maior de informação sobre a saúde
genômica do feto.
Até recentemente, gestantes do grupo de risco que desejassem
informação a respeito da saúde genética de seus fetos tinham a sua
disposição: a ultrassonografia fetal, que não tem a capacidade de detectar
alterações cromossômicas que não geram malformações; as triagens para
aneuploidias por marcadores bioquímicos maternos, que são métodos não
invasivos, mas com elevadas taxas de falso-positivos e negativos e que
apresentam limitada aplicação entre as doenças genéticas; e os exames
genéticos aplicados aos procedimentos invasivos de punção de vilo corial e
líquido amniótico, que apresentam elevada acurácia, mas acrescem risco de
perda gestacional (Malone et al., 2005, Kagan et al., 2008; Tabor e Alfirevic,
2010; Nicolaides et al., 2011).
Ao longo dos anos, vê-se que as condutas de cuidados obstétricos
modificaram-se à medida que foram capazes de combinar parâmetros e
informações a respeito da gestação e do feto e reduziram o número de
procedimentos invasivos para a obtenção de diagnósticos –
consequentemente, diminuindo as chances de perdas fetais em decorrência
dos métodos invasivos.
Os NIPT surgiram da intenção de identificar com mais eficiência as
gestações de risco, a fim de facilitar as decisões no momento da escolha por
procedimentos invasivos (Gil et al., 2013). A Tabela 3 faz a comparação entre
os testes pré-natais para aneuploidias oferecidos durante o primeiro trimestre
de gestação. Durante o primeiro trimestre de gestação, período mais crítico e
de maior interesse de médicos e pacientes em identificar as gestações de fetos
40
alterados, o NIPT se diferencia dos também não invasivos testes bioquímicos
combinados (realizado entre 11ª e 14ª semanas gestacionais) por poderem ser
realizados a partir da 9ª semana gestacional, com elevada acurácia (98,2%-
99,2%) e baixa taxa de falso-positivo (0,03%-0,21%) para o cálculo do risco de
trissomias dos cromossomos 21, 18 e 13 (Benn, 2013). Essas taxas se
aproximam daquelas do procedimento “padrão” cariótipo de vilo corial, que
inclui ainda a desvantagem do erro de diagnóstico de 1% a 2% devido a
ocorrência de casos de mosaicismo confinado à placenta. Além disso, os NIPT
viabilizam a pesquisa de um maior número de alterações fetais, além das
aneuploidias comuns, como as doenças ligadas ao sexo, as doenças
monogênicas, alterações em outros cromossomos e triploidia; possibilitam
ainda a fenotipagem do Rh e exclusão da paternidade. Por fim, viabilizam a
detecção de outras anormalidades genéticas, como as síndromes de
microdeleções, que podem ter a prevalência mais elevada do que as trissomias
dos cromossomos 18 e 13 juntas e que não apresentam correlação com a
idade materna (Jensen et al., 2012).
Tabela 3. Comparação dos testes pré-natais para aneuploidias oferecidos durante o primeiro trimestre de gestação.
Cariótipo vilo corial Teste combinado NIPT
Semana gestacional 10ª – 13ª 11ª – 14ª 9ª – 10ª
Tipo de teste Diagnóstico Invasivo (risco<1/100)
Triagem Não invasivo
Triagem Não Invasivo
Tempo de resultado 7–10 dias (final) 1-‐5 dias 7–10 dias
Acurácia 97,5%-‐99.6% 90% 98,2%-‐99,2%
Falso-‐positivo Mínimo
1 – 2% de mosaicismo placentário
5% 0,03%-‐0,21%
Aplicação
Alteração em todos os cromossomos Exceto as
submicroscópicas
Trissomia 21/18
Aneuploidias comuns Síndromes de microdeleção Triploidia
Fontes: Hahnermann e Vejerslev, 1997; Kagan et al., 2008; Benn, 2013
41
5.1. Benefícios e limitações das técnicas s-MPS, t-MPS e SNP
A Tabela 4 mostra os benefícios e limitações de cada um dos métodos
utilizados nos NIPT para aneuploidias.
Tabela 4. Benefícios e limitações dos métodos aplicados aos testes genéticos pré-natais não invasivos para aneuploidias. Métodos s-‐MPS t-‐MPS SNP
Benefícios
-‐ todos os cromossomos são
avaliados -‐ aneuploidias -‐ microdeleções
-‐ mais fragmentos são avaliados por cromossomo
-‐ mais amostras são analisadas por ensaio
-‐ custo da avaliação é menor
-‐ técnica baseada no padrão de distribuição
dos alelos -‐ a partir da 9ª semana -‐ risco individualizado -‐ origem da alteração (consanguinidade e dissomia uniparental)
-‐microdeleções -‐aneuploidias -‐-‐triploidias
-‐ gêmeo desaparecido
Limitações
-‐ técnica de contagem de fragmento
-‐ ajuste de bases GC -‐ menos amostras são avaliadas por ensaio -‐ custo da avaliação é
maior
-‐ técnica de contagem de fragmentos
-‐ apenas cromossomos envolvidos nas principais síndromes são avaliados
-‐ não distingue triploidia de gêmeo desaparecido
Fontes: Chiu et al., 2008; Bianchi et al., 2012; Sparks et al., 2012b; Nicolaides et al., 2012; Zimmermann et al., 2012
Dos quatro NIPT para aneuploidias oferecidos hoje para uso comercial,
dois deles, o teste T1 e o teste T2, fazem uso da ferramenta s-MPS, que
diferencia-se por avaliar o genoma por completo. No entanto, requer,
aproximadamente, 25 milhões de fragmentos (reads) de DNA de cada amostra
avaliada, o que limita o rendimento da técnica a 4-6 amostras por ensaio (Chiu
et al., 2008; Bianchi et al., 2012). Apesar da mesma metodologia, os testes
utilizam diferentes algoritmos patenteados para a análise dos dados: o teste T1
utiliza o z-score e o teste T2 utiliza o SAFeR. A técnica de contagem de
fragmentos de DNA da metodologia MPS e os recursos de bioinformática
empregados nesses testes são influenciados pela baixa variabilidade
cromossômica (relacionado ao conteúdo de bases GC), o que pode limitar a
42
acurácia dos resultados para alguns cromossomos. O teste T1 caracteriza-se
por ser mais abrangente do que o teste T2, por incluir opcionalmente a adição
da avaliação de algumas síndromes de microdeleção.
O terceiro teste, T3, utiliza a ferramenta de sequenciamento por t-MPS
denominada DANSR, que também faz uso de metodologia de contagem de
reads e por isso, limita-se pela variabilidade da amplificação dos fragmentos de
DNA. Entretanto, esse teste inclui um passo inicial de sequenciamento-alvo, no
qual aproximadamente 400 loci gênicos de cada cromossomo de interesse são
seletivamente amplificados. Esse passo permite o aumento na eficiência do
sequenciamento, com 100-300 mil reads por cromossomo. Outra vantagem
desse procedimento é seu melhor rendimento, pois permite a detecção de
aneuploidias usando aproximadamente um milhão de reads por amostra,
possibilitando a análise de 96 amostras por ensaio, resultando em diminuição
do custo do procedimento (Sparks et al., 2012b). Apesar de refletir em melhora
de eficiência e rendimento, a análise somente dos cromossomos envolvidos
nas principais síndromes cromossômicas limita a abrangência desse teste.
O quarto NIPT, T4, utiliza a nova ferramenta de sequenciamento por
SNP, chamada NATUS, que combina passos de sequenciamento-alvo com
uma sofisticada análise estatística (PS). Essa técnica utiliza entre 500 mil e 2
milhões de reads por cromossomos para selecionar cerca de 2 mil loci
polimórficos em cada um, o que garante a esse teste grandes vantagens sobre
os outros NIPT para aneuploidias (Nicolaides et al., 2012; Zimmermann et al.,
2012). Esse método é baseado no padrão de distribuição dos alelos e não na
contagem de fragmentos cromossômicos específicos: sendo assim, não está
sujeito à variabilidade da amplificação cromossômica. É um NIPT mais sensível
– possibilita a realização do exame a partir da 9ª semana gestacional – e é
ainda capaz de determinar, com quase a mesma acurácia, o número de cópias
fetais dos cromossomos 21, 18, 13, X e Y. Outro benefício é que a metodologia
de análise associada a essa ferramenta, o PS, faz o cálculo da acurácia por
amostra e por cromossomo, fornecendo o resultado do risco individualizado
para cada paciente e para cada aneuploidia investigada, levando em conta
outras variáveis, como a idade materna e a fração fetal do cffDNA. Além disso,
é uma ferramenta capaz de indicar a origem da alteração genética,
consanguinidade e dissomia uniparental, pois acessa o haplótipo materno e o
43
haplótipo que o feto herdou do pai. A metodologia de teste por SNP é a única
que possibilita a detecção de casos de gestações triploides ou envolvendo
“gêmeos desaparecidos” e tem potencial para detectar alterações em todos os
outros cromossomos, incluindo microdeleções, além das aneuploidias mais
comuns.
5.2. Desempenho dos métodos s-MPS, t-MPS e SNP na detecção de alterações cromossômicas
Ao comparar o desempenho dos quatro testes disponíveis
comercialmente para a detecção das principais trissomias (Tabela 1), observa-
se que a acurácia e a taxa de falso-positivos para a detecção dos
cromossomos 21 e 18 são muito próximas entre eles, ao redor de 97,0%-99,0%
e 0,0%-0,2%, respectivamente (Erich et al., 2011; Palomaki et al., 2011;
Bianchi et al., 2012; Sparks et al., 2012; Zimmemann et al., 2012). Em
contrapartida, os testes baseados em MPS (T1, T2 e T3) apresentam o
desempenho mais fraca na detecção para a trissomia do cromossomo 13 (por
volta da acurácia de 80,0%-92,0% e taxa de falso-positivo entre 0,0%-1,0%)
em relação à detecção das síndromes de Down e Edwards (Chen et al., 2011,
Sehnert et al., 2011; Palomaki et al., 2012; Bianchi et al., 2012; Ashoor et al.,
2013). Esse acontecimento pode ser atribuído à limitação do método de
contagem de fragmentos utilizado pelos três NIPT, pois a eficiência desses
métodos é dependente da variação na amplificação dos fragmentos de DNA do
cromossomo indagado. Por sua vez, o NIPT que utiliza a ferramenta SNP, com
o sistema NATUS, calcula o risco específico da amostra para a aneuploidia
indagada, dando mais confiabilidade à técnica, principalmente nas amostras
com baixa fração de cffDNA, como é o caso das amostras alteradas para o
cromossomo 13, segundo Hall e colaboradores (2014).
O método de contagem dos testes baseados na ferramenta MPS, sejam
por s-MPS ou t-MPS, também parece limitar a eficiência para a detecção das
alterações nos cromossomos sexuais. A acurácia da detecção da monossomia
do cromossomo X, por exemplo, é variável entre as publicações, reportando-
se: taxa de detecção (DR) de 75%, taxa de falso-positivo (FPR) de 0,2% e
44
10,2% de amostras não classificadas (incluindo 4 afetados e 45 controles)
(Bianchi et al., 2012); DR de 81%, FPR de 0,3%, com 5,1% de amostras não
classificadas (3 afetados e 18 controles) (Mazloom et al. 2013); DR 91,5%,
FPR 0,0% e 2,8% de amostras não classificadas (Nicolaides et al., 2013); DR
92%, FPR de 0,1% e taxa de não classificação de 8,3% (Samango-Sprouse et
al., 2013; Pergament et al., 2014).
Pequenas duplicações e deleções clinicamente relevantes podem ser
potencialmente detectadas por NIPT: duas empresas oferecem esse exame
atualmente. O teste T1 oferece a detecção de microdeleções e microduplicação
pelo aprofundamento do método padrão de contagem de fragmentos, com uma
acurácia entre 80-86% dependendo da região avaliada. O teste T4, por sua
vez, possibilita a identificação dos mesmos desequilíbrios analisados pelo teste
T1, mas empregando a metodologia de SNP, que analisa uma quantidade
suficiente de informação genética dentro da região de interesse com uma
acurácia entre 93,0%-99,0%. A diferença de performance dos dois testes está
na metodologia utilizada: as regiões envolvidas nas microdeleções são
consideravelmente menores do que aquelas avaliadas para o diagnóstico de
aneuploidias (Peters et al., 2011). A metodologia baseada em s-MPS é mais
limitada, pois a única forma de acessar o número de informação suficiente para
dar confiabilidade ao exame é aumentando de 20-50x a quantidade de
fragmentos de DNA avaliados, o que resulta também em aumento de tempo e
custo da técnica (Jensen et al., 2012; Srinivansan et al., 2013).
O método baseado em SNP, do teste T4, diferencia-se também por ser
o único que possibilita inferir sobre os casos que envolvem gestação triploide
ou nos casos de “gêmeos desaparecidos”, pois é capaz de detectar haplótipos
fetais adicionais nas amostras maternas. Esse exame apenas detecta as duas
possibilidades, mas é a investigação por ultrassom que permitirá a distinção
entre os casos (Curnow et al., 2014). Os casos que envolvem material
genômico fetal adicional originário de fetos triplóides resultam em severas
anormalidades e elevado risco de abortos espontâneos, preeclâmpsia,
sangramento excessivo pós-parto e neoplasia trofoblástica gestacional (Secki
et al., 2010). Por isso, a detecção oportuna da triploidia pode alterar o manejo
clínico da gestação.
45
Alguns NIPT baseados em métodos de contagem de fragmentos de
DNA oferecem a avaliação para aneuploidias também para gestações
gemelares. A incidência de gestações múltiplas cresceu nos últimos 20 anos
em decorrência do aumento da idade materna e da maior procura por métodos
de reprodução assistida (Gil et al., 2014). Em consequência disso, a proporção
de gestações múltiplas com resultado positivo para os testes tradicionais de
triagem é consideravelmente maior se comparado aos casos com gestações
únicas (Lau et al., 2013). Em gestações gemelares, os testes por cffDNA são
mais complexos do que em gestações únicas: os fetos podem ser
monozigóticos e, nesse caso, ambos serão afetados – ou não – para uma
doença específica, e a concentração do cffDNA no sangue materno será
aproximadamente o dobro se comparado ao de gestações únicas (Attilakos et
al., 2011). Nesse caso, o acesso ao risco para as aneuploidias poderá ser
desenvolvido da mesma maneira que em gestações de um único feto. No
entanto, quando os fetos são dizigóticos eles podem ser discordantes, isto é,
apenas um deles poderá ter a alteração genética. Nessa situação, cada feto
contribui diferentemente com a quantidade de moléculas de cffDNA na
circulação materna e essa diferença pode ocorrer em até 2 vezes (Leung et al,
2013). O NIPT, nesses casos, será capaz de identificar a alteração, mas não
poderá especificar qual feto será afetado. Teoricamente, o método baseado em
SNP teria a capacidade de identificar múltiplos fetos, mas essa ferramenta
ainda não é oferecida.
5.3. Fatores que influenciam a falha de resultados dos NIPT
A baixa concentração da fração fetal do DNA livre é a causa mais
comum de falhas na obtenção de resultado dos NIPT. Os fatores
correlacionados com a quantidade de cffDNA no sangue materno são: idade
gestacional, peso materno e marcadores séricos PAPP-A e β-HCG (Wegrzyn et
al., 2005; Palomaki et al., 2011; Ashoor et al., 2012; Wang et al., 2013). O
critério do controle de qualidade da fração fetal varia entre as empresas: há
aquela que não mede e não informa a fração fetal; a que mede a fração para
cada amostra, mas não reporta este resultado; e as que medem e reportam os
46
resultados encontrados de frações fetais e incorporam essa fração ao escore
de predição de risco.
Desde o início das pesquisas na área do diagnóstico pré-natal não
invasivo, é conhecido que a concentração de cffDNA aumenta com a idade
gestacional (Lo et al., 1998; Lum et al., 2008; Wang et al., 2013). Os NIPT
baseados em MPS disponíveis comercialmente realizam os testes a partir da
10ª semana gestacional e o baseado em SNP, que utiliza uma metodologia
cromossomo-específica e, por isso, é mais sensível, oferece o benefício de
realizar o NIPT para aneuploidias uma semana gestacional mais cedo.
A fração fetal do cffDNA diminiu com o aumento do peso materno: tem
média de 12% em gestantes com 60kg e 6% em gestantes com 120kg (Ashoor
et al., 2012). As explicações ainda são incertas, mas um estudo com mais de
22 mil gestantes relatou que o aumento do número de adipócitos maternos na
circulação pode elevar a concentração de DNA materno livre ou ainda, que
esse excesso de células de gordura acresce volume às amostras de sangue
maternas, diluindo o cffDNA (Wang et al, 2013).
Os marcadores séricos PAPP-A e β-HCG são produzidos na placenta e
as suas concentrações permitem presumir o volume placentário. Um estudo
com ultrassom 3D reportou que em gestações com trissomia do 21, o volume
da placenta entre 11-13 semanas gestacionais não é significantemente
diferente de gestações euploides. Na trissomia do 18, a fração fetal foi
significantemente mais baixa, havendo correlação com a concentração dos
metabólitos placentários (Wegrzyn et al., 2005). Como já citado, o mesmo
acontece para gestações triploides e com trissomia do 13 (Nicolaides et al.,
2014; Hall et al., 2014). Portanto, uma amostra inicial com baixa fração fetal
terá grande chance de ter o mesmo resultado após ser coletada pela segunda
vez, principalmente se a gestação apresentar resultado positivo para os
exames de triagem convencionais ou alteração pelo ultrassom (Wang et al,
2013).
Apesar de ser possível a avaliação para aneuploidias em gestações
múltiplas, tratam-se de casos em que a confiança do teste é abalada pela
maior probabilidade de resultados falso-positivos. No caso de gêmeos
discordantes para aneuploidias, a fração de cffDNA do feto afetado é menor do
que o cut-off estimado para o sucesso da técnica, que para a maioria dos NIPT
47
está em torno de 3-4% em gestações de um único feto (Ashoor et al., 2012;
Ehrich et al., 2011; Palomaki et al., 2011; Sparks et al., 2012). Por isso, é
sugerida uma concentração da fração fetal mínima de 6% em gestações
gemelares para que a aplicação do NIPT para aneuploidias possa ter confiança
(Canick et al., 2012). Além disso, quando um dos fetos, aneuplóide e inviável,
não é reconhecido (“gêmeo desaparecido”), pode haver discrepância de
resultados com os testes invasivos como consequência. Recentemente, dois
estudos com a metodologia de contagem, MPS, atribuíram a significativa taxa
de resultados falso-positivos à ocorrência de casos de “gêmeos
desaparecidos”. No primeiro, Futch e colaboradores (2013) relataram uma taxa
de falso-positivo de 15%, enquanto que no segundo, Porreco e colaboradores
(2014) atribuíram 33% de resultados falso-positivos – em um estudo sobre o
risco para a trissomia do cromossomo 21 – ao excesso de material genômico
fetal originário de “gêmeo desaparecido”.
A ocorrência de mosaicismos fetais e maternos também pode confundir
a acurácia da detecção das síndromes dos cromossomos sexuais. Mais de
90% das mulheres com cariótipo 47,XXX não estão cientes de que carregam
uma cópia extra do cromossomo X, pois são férteis. Menos comum de não ser
identificado, mulheres com mosaicismo para a monossomia do cromossomo X
também podem ser férteis. Além disso, em mulheres com cariótipo normal, é
conhecido que existe a perda do cromossomo X nas células sanguíneas
brancas relacionada à idade (Russell et al., 2007). As análises dos NIPT para
aneuploidias de mulheres com essas alterações vão indicar um ganho ou perda
de cópias de DNA do cromossomo X, que será atribuído ao feto e resultarão
em diagnóstico falso-positivo quando, no entanto, a alteração é materna
(Hooks et al., 2014). Quando o mosaicismo é de fato fetal – em 50% dos casos
diagnosticados de monossomia do cromossomo X, 15% dos casos de XXY e
10% dos casos de XXX – também pode haver confusão na análise, pois os
exames não são validados para a detecção e determinação do grau de
mosaicismo, uma vez que não existe uniformização na distribuição dos
cromossomos X e Y (Nicolaides et al., 2014).
48
5.4. O Futuro dos testes genéticos pré-natais não invasivos
Muitos estudos demonstram a necessidade de confirmar os resultados
positivos para aneuploidias dos NIPT por cariótipo, pois são reportados casos
suspeitos para alterações cromossômicas com resultado de cariótipo normal
(Chiu et al., 2011; Palomaki et al., 2011; Bianchi et al., 2012; Sparks et al.,
2012a; Ashoor et al., 2012; Gil et al., 2013). Recentemente, o ACOG e o SMFM
(Society of Maternal-Fetal Medicine), dos Estados Unidos, emitiram um
comunicado destacando o papel do NIPT para aneuploidias como um teste de
triagem e não de diagnóstico (ACOG, 2012; Fairbrother et al., 2013). Os quatro
NIPT disponíveis comercialmente são ferramentas creditadas e certificadas por
órgãos competentes dos Estados Unidos, mas não são aprovadas pela OMS
(Organização Mundial de Saúde) (Agarwal et al., 2013).
Uma vez que se tratam de metodologias novas, disponibilizadas para
uso clínico há pouco mais de três anos, os NIPT agrupam alguns
questionamentos a respeito de sua introdução no cenário de cuidados pré-
natais. São discutidas no âmbito clínico, acadêmico e também por comissões
regulamentadoras (ACOG e ISPD) as opções de implementação dos NIPT para
aneuploidias dentro do panorama atual. Poderiam ser introduzidos como uma
ferramenta de triagem gradual, no qual os testes combinados continuariam a
ser oferecidos à população de gestantes de alto risco e os NIPT seriam
destinados a um subgrupo de maior risco, a fim de diminuir o número e os
custos com procedimentos invasivos. Poderiam ainda ser incluídos nos testes
combinados, possibilitando uma troca das informações obtidas a partir dos
valores das proteínas maternas pela informação fornecida pelo NIPT. Por fim,
os NIPT poderiam ser empregados como o primeiro teste de triagem para
aneuploidias, o que geraria o benefício da continuidade do decréscimo no
número de procedimentos invasivos e perdas gestacionais decorrentes desses
procedimentos, mas com acréscimo do custo da aplicação dessas recentes
tecnologias (ACOG, 2012; ISPD, 2013; Sparks et al., 2012a; Sparks et al.,
2012b).
Ainda nesse contexto, um grande número de testes clínicos
estabelecem que os NIPT para aneuploidias podem ser oferecidos à população
de gestantes em geral, incluindo as grávidas que não estão sob alto risco de
49
uma gestação aneuploide, pois os dois grupos (baixo e alto risco) apresentam
a mesma eficiência para os testes e porque não existe diferença significante
entre a fração fetal dos dois grupos (Nicolaides et al., 2012; Lau et al., 2012;
Dan et al., 2012; Gil et al., 2013; Bar et al., 2013; Fairbrother et al., 2013).
O maior entrave para a aplicação do NIPT no sistema de saúde pública
de muitos países ou o seu oferecimento para a população de gestantes em
geral é o custo. Muitos estudos demonstram a antecipação, segurança,
sensibilidade e abrangência dos NIPT, o que justifica seu uso pela população
de gestantes de alto risco genético. No entanto, reconhece-se que modalidades
tradicionais de triagem para aneuploidia, como a ultrassonografia, oferecem
vantagens na detecção de anormalidades fetais e gestacionais que não são
identificadas pelos NIPT, a um custo mais baixo.
Os avanços das tecnologias de detecção, quantificação e análise do
cffDNA voltadas à triagem para aneuploidias permitiram, ao longo dos anos,
que mais informação a respeito do material fetal pudesse ser acessada em um
mesmo exame pré-natal (Lo, 2013). A partir de então, o sequenciamento do
genoma completo tornou-se o futuro do diagnóstico genético pré-natal não
invasivo, um método generalizado, robusto e acurado de NIPT, que permitirá
solucionar diferentes níveis de questionamento genético, como: microdeleções,
microduplicações e mutações de ponto, no nível do DNA; a metilação, no nível
das modificações epigenéticas; e o mRNA e microRNA, no nível da expressão
gênica (Chen et al., 2013). O WGS vai possibilitar mais do que diagnosticar
outras anormalidades fetais, incluindo doenças mendelianas, o rastreio de
doenças complexas e a identificação de CNV de novo; vai produzir variantes
com significância clínica desconhecida, marcadores genéticos sem relevância
médica, status de portador, genes de susceptibilidade e genes que expressam
condições graves tardiamente (Lo et al., 2013). Conhecer o genótipo fetal antes
do nascimento, por exemplo, nos casos de diagnóstico de doenças metabólicas
e imunológicas, possibilitará fornecer para o feto tratamento imediatamente
após o parto (Fan e Quake et al., 2012). Se por um lado a possibilidade de
acesso a mais informações sobre a saúde genética dos fetos parece favorecer
a tomada de decisão a respeito da gestação, do outro, o excesso de
informações, muitas delas sem relevância médica conhecida, pode aumentar a
ansiedade e a confusão no momento da tomada de decisões reprodutivas.
50
Existem substanciais aspectos éticos envolvidos na aplicação do WGS como
NIPT, que precisam ser debatidos e regulamentados por comissões
competentes. Atualmente, esta é uma ferramenta que ainda não está
disponível para uso comercial – sua aplicação restringe-se ao escopo de
publicações dos laboratórios acadêmicos dos Estados Unidos e China – e sua
aplicação clínica ainda requer o desenvolvimento de novos projetos
experimentais e o incremento de ferramentas analíticas.
O desenvolvimento de testes genéticos não invasivos gerou grandes
avanços dentro do cenário de cuidados pré-natais. A disponibilidade de
exames mais precisos e abrangentes, aliada aos progressos das áreas do
diagnóstico fetal e da genética reprodutiva, como o desenvolvimento do
sequenciamento completo do exoma e de testes de rastreamento para o status
de portador, agrupam o potencial de diminuir significativamente o estresse
envolvido na tomada de decisão por gestantes com risco de gerar fetos
alterados. Pode ser considerado que a área de desenvolvimento de terapias
fetais também foi influenciada positivamente pelos benefícios oferecidos pelos
avanços dos testes genéticos pré-natais não invasivos, com a possibilidade de
identificação mais precoce de anormalidades fetais. Além disso, os avanços
das técnicas e metodologias de reprodução assistida associadas ao
desenvolvimento recente dos NIPT, tornam mais seguras e confortáveis as
escolhas a favor das mulheres que optam por buscar a gestação depois de se
estabelecerem pessoal ou profissionalmente.
O grande desafio diante dos recentes progressos dessa área está em
estabelecer a introdução clínica dos NIPT pela comunidade médica. A decisão
de incluir os exames dentro dos cuidados clínicos da gestante deve ser dos
médicos e não dos laboratórios. Existe a dificuldade em separar o conteúdo de
promoção comercial do exame, do objetivo da avaliação fornecida pelo teste.
Com frequência, os NIPT são oferecidos às gestantes sem que exista uma
regulamentação, o entendimento ou, ainda, a existência de um guia de
esclarecimento sobre suas implicações.
Os NIPT, assim como a maior parte dos exames genéticos, envolvem
metodologias aprimoradas, que ao contrário do que se pensa, podem ser
aplicadas para diminuir os custos com a quantidade de exames e tratamentos
necessários para um diagnóstico preciso e seguro, como é o caso dos testes
51
não invasivos de determinação do sexo e Rh fetais, que podem reduzir os
gastos com a profilaxia Rh desnecessária em gestantes Rh negativas e a
terapia para HAC em fetos do sexo masculino.
Em genética, especialmente na genética médica, é comum a existência
de casos nos quais é possível identificar e localizar precisamente uma
alteração no material genético responsável por uma patologia específica e
complexa, normalmente por meio de tecnologias caras, e não ser possível
fazer nada para reverter ou contornar a doença. Na genética pré-natal, os NIPT
atuais têm potencial de melhorar e beneficiar a vida da paciente, pois não são
exames que apenas apontam a existência ou a origem da doença, mas
também facilitam decisões reprodutivas e o planejamento das gestações, com
acesso a cuidados, terapias ou tratamentos específicos pré-natais ou
imediatamente após o parto. Além disso, amenizam os transtornos da
continuidade de uma gestação de fetos inviáveis, nos países em que a
interrupção da gravidez é permitida. Nesse sentido, é necessário, no entanto,
que exames de triagem ou diagnóstico de doenças que tenham um programa
de cuidado e acompanhamento bem estabelecidos, como é o caso da
síndrome de Down, ou ainda, um protocolo de tratamento bem estruturado,
recebam os devidos esforços financeiros para o seu desenvolvimento e que
sejam aplicados ao setor público de saúde.
52
6. Conclusões
- Foram expostas as principais técnicas empregadas aos exames genéticos pré-natais não invasivos. Além das técnicas baseadas em RT-PCR aplicadas à determinação do sexo e Rh fetais e dos instrumentos de PCR alelo-específicos dirigidos ao estudo de doenças monogênicas e exclusão de paternidades, existem três ferramentas metodológicas para a avaliação do risco para aneuploidias: o s-MPS e o t-MPS, que são métodos de contagem de fragmentos de DNA e o sequenciamento por SNP, que é um método embasado no padrão de distribuição dos alelos.
- De forma geral, os testes genéticos pré-natais não invasivos destacam-se por serem realizados mais precocemente na gestação, com elevada acurácia, baixa taxa de falso positivo e abrangem um espectro amplo de aplicações clínicas, porém são limitados pelo seu elevado custo.
- Dentre as técnicas recentes aplicadas ao risco para aneuploidias, o t-MPS apresenta melhor rendimento e custo mais baixo do que o s-MPS, mas limita-se por ser aplicado apenas às aneuploidias mais comuns. E a técnica de SNP possibilita a pesquisa por mais condições genéticas, além de apresentar melhor acurácia.
- O sequenciamento genômico total representa, para um futuro próximo, um método generalizado de diagnóstico genético fetal não invasivo, no qual mais informação sobre a saúde fetal poderá ser acessada e aplicada, não somente na detecção de aneuploidias, mas também em um número maior de condições genéticas.
53
7. Referências Bibliográficas ACOG. American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics, Society for Maternal-Fetal Medicine Publications Committee. Committee opinion no. 363: Patient testing: Ethical issues in selection and counseling. Obstet Gynecol. 2007;109(4):1021–1023. ACOG. American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics, Society for Maternal-Fetal Medicine Publications Committee. Committee opinion No. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstet Gynecol 2012;120:1532–1534. Agarwal A, Sayres L, Cho MK, Cook-Deegan R, Chandrasekharan S. Commercial landscape of noninvasive prenatal testing in the United States. Prenat Diagn. 2013;33(6):521-531. Akolekar R, Farkas DH, VanAgtmael AL, Bombard AT and Nicolaides KH Fetal sex determination using circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) at 11 to 13 weeks of gestation Prenat Diagn. 2010;30:918–923. Amaral DR, Credidio DC, Pellegrino Jr J, Castilho L. Fetal RHD genotyping by analysis of maternal plasma in a mixed population. J Clin Lab Anal. 2011;25:100-104. Amicucci P, Gennarelli M, Novelli G, Dallapiccola B. Prenatal diagnosis of Myotonic Dystrophy using fetal DNA obtained from maternal plasma. Clin Chem. 2000;46:301–302. Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, Birdir C, Nicolaides KH. Chromosome selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012;206: 322.e1-5. Ashoor G, Syngelaki A, Poon LC, Rezende JC, Nicolaides KH. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks’ gestation: relation to maternal and fetal characteristics. Ultras Obstet Gynecol. 2013;41:26-32. Avent ND. The Rhesus blood group system: insights from recent advantages in molecular biology. Transfus Med Rev. 1999;13(4):245-266. Attilakos G, Maddocks DG, Davies T, Hunt LP, Avent ND, Soothill PW, Grant SR. Quantification of free fetal DNA in multiple pregnancies and relationship with chorionicity. Prenat Diagn. 2011;31:967-972. Aykut A, Onay H, Sagol S, Gunduz C, Ozkinay F, Cogulu O. Determination of fetal Resus D status by maternal plasma DNA Analysis. BJMG.2013,16(2):33-38. Baird PA, Anderson TW, Newcombe HB, Lowry RB. Genetic disorders in children and young adults: a population study. 1988 apud Gonzalez-Gonzalez
54
MC, Trujillo MJ, Rodriguez de Alba M, Garcia-Hoyos M, Lorda-Sanchez I, Diaz-Recasens J, Ayuso C, et al. In: Huntington disease-unaffected fetus diagnosed from maternal plasma using QF-PCR. Prenat Diagn. 2003;23:232-234. Bar H, Wang E, Struble C, Musci T, Norton M. The fetal fraction of cell-free DNA in maternal plasma is not affected by a priori risk of trisomy. J Mater Fet and Neonat Med. 2013;26(1-2):143-145. Barini R, Horschutz JS, Ribeiro ST, BotcherLuiz F, Isfer EV, Sanchez RC, Faúndes A, Pinto e Silva JL. Desempenho da Ultra-sonografia Pré-natal no Diagnóstico de Cromossomopatias Fetais em Serviço Terciário. RBGO. 2002;24(2):121-127 Benn PA. Advances in prenatal screening for Down syndrome:General principles and second trimester testing. Clin Chim Acta. 2002;32:1-16. Benn P, Cuckle H, Pergament E. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects. Ultras Obstet Gynecol. 2013;42:15–33. Bianchi DW, Flint AF, Pizzimenti MF, Knoll JH, Latt SA. Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:3279–3283. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93:705– 708. Bianchi DW, Williams JM, Sullivan LM, Hanson FW, Klinger KW, Shuber AP. PCR quantitation of fetal cells in maternal blood in normal and aneuploidy pregnancies. Am J Hum Genet. 1997;61:822-829. Bianchi DW. Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis. Br J Haematol. 1999;105:574–583. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, Abuhamad AZ, Sehnert AJ, Rava RP, et al. Genome wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012;119:890-901. Bianchi DW, Parker RL, Wentworth J, Madankumar R, Saffer C, Das AF, Craig JA, Chudova DI, Devers PL, Jones KW, Oliver K, Rava RP, Sehnert AJ; CARE Study Group. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N Engl J Med. 2014;370(9):799-808. Bowman J. Thirty-five years of Rh prophylaxis. Transfusion. 2003;43:1661-1666. Bustamante-Aragonés A, Marta Rodríguez-de-Alba M, Perlado S, Trujillo-Tiebas MJ, Arranz JP, Díaz-Recasens J, Troyano-Luque J, Ramos C. Non-invasive prenatal diagnosis of single-gene disorders from maternal blood. Gene. 2012;504:144–149.
55
Canick JA, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Ehrich M, van den Boom D, Bombard AT, Deciu C, Palomaki GE. DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations. Prenat Diagn. 2012;32(8):730-734. Chadud CS, Araujo-Júnior E, Martinhago CD, Andari VCM, Tedesco GD, Bussamra LCS e Aoki T. Assessment of free fetal DNA concentration in maternal plasma during the first trimester of pregnancy: comparative study between EDTA and PPT tubes – pilot study. J Matern Fetal Neonatal Med.2014;14:1-5. Chan KC, Zhang J, Hui AB, Wong N, Lau TK, Leung TN, et al. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2004;50:88-92. Chan KC1, Yeung SW, Lui WB, Rainer TH, Lo YM. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood Clin Chem. 2005;51(4):781-784. Chen XQ, Stroun M, Magnenat JL, Nicod LP, Kurt AM, Lyautey J, Lederrey C, Anker P. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med. 1996;2:1033–1035. Chen EZ, Chiu RW, Sun H, Akolekar R, Chan KC, Leung TY, Jiang P, Zheng YW, Lun FM, Chan LY, Jin Y, Go AT, Lau ET, To WW, Leung WC, Tang RY, Au-Yeung SK, Lam H, Kung YY, Zhang X, van Vugt JM, Minekawa R, Tang MH, Wang J, Oudejans CB, Lau TK, Nicolaides KH, Lo YM. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 18 and trisomy 13 by maternal plasma DNA sequencing. PLoS One. 2011;6(7):e21791. Chen S, Ge H, Wang X, Pan X, Yao X, Li X, Zhang C, Chen F, Jiang F, Li P, Jiang H, Zheng H, Zhang L, Zhao L, Wang W, Li S, Wang J, Wang J, Yang H, Li Y, Zhang X. Haplotype-assisted accurate non-invasive fetal whole genome recovery through maternal plasma sequencing. Genome Med. 2013;27-5(2):18. Chim SS, Shing TK, Hung EC, Leung TY, Lau TK, Chiu RW et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin Chem. 2008;54:482-490. Chinen PA, Nardozza LM, Martinhago CD, Camano L, Daher S, Pares DB et al. Noninvasive determination of fetal Rh blood group, D antigen status by cell-free DNA analysis in maternal plasma: experience in a Brazilian population. Am J Perinatol. 2010;27:759-762. Chinnapapagari SKR, Holzgreve W, Lapaire O, Zimmermann B, Hahn S. Treatment of maternal blood samples with formaldehyde does not alter the proportion of circulatory fetal nucleic acids (DNA and mRNA) in maternal plasma. Clin Chem. 2005;51:652–655.
56
Chiu RW, Lau TK, Cheung PT, Gong ZQ, Leung TN, Lo YM. Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study. Clin Chem. 2002a;48:778-780. Chiu RWK, Lau TK, Leung TN, Chow KCK, Chiu DHK, Lo YMD. Prenatal exclusion of beta-thalassaemia major by examination of maternal plasma. Lancet. 2002b;360:998-1000. Chiu RW, Chan KC, Gao Y, Lau VY, Zheng W, Leung TY, Foo CH, Xie B, Tsui NB, Lun FM, Zee BC, Lau TK, Cantor CR, Lo YM. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105: 20458–20463.
Chiu RW, Lo YM. Non-invasive prenatal diagnosis by fetal nucleic acid analysis in maternal plasma: the coming of age. Semin Fetal Neonatal Med. 2011;16:88-93. Choi TY, Lee HM, Park WK, Jeong SY, Moon HS. Spontaneous abortion and recurrent miscarriage: A comparison of cytogenetic diagnosis in 250 cases. Obstet Gynecol Sci. 2014;57(6):518-525. Chung GTY, Chiu RWK, Chan KCA, Lau TK, Leung TN, Lo YMD. Lack of dramatic enrichment of fetal DNA in maternal plasma by formaldehyde treatment. Clin Chem. 2005;51:655–658. Columbia, SC, USA [online].; 2014. [citado novembro 2014]. Disponível em: http://www.ravgen.com/prenatal-dna-paternity-test/ Costa JM, Benachi A, Gautier E. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders. N Engl J Med. 2002;346:1502. Curnow KJ, Wilkins-Haug L, Ryan A, Kırkızlar E, Stosic M, Hall MP, Sigurjonsson S, Demko Z, Rabinowitz M, Gross SJ. Detection of triploid, molar, and vanishing twin pregnancies by a single-nucleotide polymorphismebased noninvasive prenatal test. Am J Obstet Gynecol. 2014;211:1.e1-1.e9.
Dan S, Wang W, Ren J, Li Y, Hu H, Xu Z, Lau TK, Xie J, Zhao W, Huang H, Xie J, Sun L, Zhang X, Wang W, Liao S, Qiang R, Cao J, Zhang Q, Zhou Y, Zhu H, Zhong M, Guo Y, Lin L, Gao Z, Yao H, Zhang H, Zhao L, Jiang F, Chen F, Jiang H, Li S, Li Y, Wang J, Wang J, Duan T, Su Y, Zhang X. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat Diagn. 2012;32(13):1225-12232.
Dar P, Curnow KJ, Gross SJ, Hall MP, Stosic M, Demko Z, Zimmermann B, Hill M, Sigurjonsson S, Rayn A, Banjevic M, Kolacki PL, Koch S, Strom CM, Rabinowitz M, Benn P. Clinical experience and follow-up with large scale single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal aneuploidy testing. Am J Obstet Gynecol. 2014;527:e1-e17.
57
Dhallan R, Au WC, Mattagajasingh S, Emche S, Bayliss P, Damewood M, Cronin M, et al. Methods to increase the percentage of free fetal DNA recovered from the maternal circulation. JAMA. 2004;291:1114-1119. Dhallan R, Guo X, Emche S, Damewood M, Bayliss P, Cronin M, Berry J, Betz J, Franz K, Gold K, Vallecillo B, Varney J. A non-invasive test for prenatal diagnosis based on fetal DNA present in maternal blood: a preliminary study. Lancet. 2007;369(9560):474-481. Driscoll DA, Gross S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. N Engl J Med. 2009;360:2556-2562. Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol. 2011;204:205.e1–205.11. Fairbrother G, Johnson S, Musci TJ, Song K. Clinical experience of noninvasive prenatal testing with cell-free DNA for fetal trisomies 21, 18, and 13, in a general screening population. Prenat Diagn. 2013;33(6):580-583. Fan HC, Quake SR. Detection of aneuploidy with digital polymerase chain reaction. Anal Chem. 2007;79:7576–7579. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:16266 –16271. Fan HC, Quake SR. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics. PLoS One. 2010;5(5):e10439. Fan HC, Gu W, Wang J, Blumenfeld YJ, El-Sayed YY, Quake SR. Non-invasive prenatal measurement of the fetal genome. Nature. 2012;487:320–324. Freeman K, Szczepura A and Osipenko L. Non-invasive fetal RHD genotyping tests: a systematic review of the quality of reporting of diagnostic accuracy in published studies. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2009;142:91-98. Futch T, Spinosa J, Bhatt S, de Feo E, Rava RP, Sehnert AJ. Initial clinical laboratory experience in noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy from maternal plasma DNA samples. Prenat Diagn. 2013;33:569-574.
Ghanta S, Mitchell ME, Ames M, Hidestrand M, Simpson P, et al. Non-Invasive Prenatal Detection of Trisomy 21 Using Tandem Single Nucleotide Polymorphisms. PLoS ONE. 2010;5(10):e13184.
Geifman-Holzman O, Grotegut CA, Gaughan JP. Diagnostic accuracy ofnoninvasive fetal Rh genotyping from maternal blood - a meta-analysis. Am J Obstet Gynecol. 2006;195:1163–1173.
58
Gerovassili A, Garner C, Nicolaides KH, Thein SL, Rees DC. Free fetal DNA in maternal circulation: a potential prognostic marker for chromosomal abnormalities? Prenat Diagn. 2007;27:104–110. Gil MM, Quezada MS, Bregant B, Ferraro M, Nicolaides KH. Implementation of maternal blood cell-free DNA testing in early screening for aneuploidies. Ultras Obstet Gynecol. 2013;42:34-40. Gil MM, Akolekar R, Quezada MS, Bregant B, Nicolaides KH. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for aneuploidies: meta-analysis. Fetal Diagn Ther. 2014;35(3):156-173. Go ATJI, Visser A, Mulders MAM, Blankenstein MA, van Vught JMG, Oudejans CBM. 44 Single-nucleotide polymorphisms expressed by placental RNA: assessment for use in noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Clin Chem. 2007;53:2223-2224. Go AT, van Vugt JM, Oudejans CB. Non-invasive aneuploidy detection using free fetal DNA and RNA in maternal plasma: recent progress and future possibilities. Hum Reprod Update. 2011;17(3):372-82. Goldberg JD, Wohlferd MM. Incidence and outcome of chromosomal mosaicism found at the time of chorionic villus sampling. Am J Obstet Gynecol. 1997;176:1349-1353. Gonzalez-Gonzalez MC, Garcia-Hoyos M, Trujillo MJ, Rodriguez-de-Alba M, Lorda-Sanchez I, Diaz-Recasens J, Gallardo E, et al. Prenatal detection of a cystic fibrosis mutation in fetal DNA from maternal plasma. Prenat Diagn. 2002;22:946-948. Gonzalez-Gonzalez MC, Trujillo MJ, Rodriguez de Alba M, Garcia-Hoyos M, Lorda-Sanchez I, Diaz-Recasens J, Ayuso C, et al. Huntington disease-unaffected fetus diagnosed from maternal plasma using QF-PCR. Prenat Diagn. 2003;23:232-234. Gonzalez-Gonzalez MC, Garcia-Hoyos M, Trujillo-Tiebas MJ, Bustamante-Aragones A, Rodriguez-de-Alba M, Alvarez D et al. Improvement in strategies for the non-invasive prenatal diagnosis of Huntington disease. J Assist Reprod Genet. 2008;25:477-481. Gu W, Koh W, Blumenfeld YJ, El-Sayed YY, Hudgins L, Hintz SR, Quake SR. Noninvasive prenatal diagnosis in a fetus at risk for methylmalonic acidemia. Genet Med. 2014;16(7):564-567. Guo X, Bayliss P, Damewood M, et al. A noninvasive test to determine paternity in pregnancy. N Engl J Med. 2012;366:1743–1745. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS) diagnostic consequences of CVS mosaicism and non-
59
mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997;17:801-820. Hall MP, Hill M, Zimmermann B, Sigurjonsson S, Westemeyer M, Saucier J, Demko Z, Rabinowitz M. Non-invasive prenatal detection of trisomy 13 using a single nucleotide polymorphism and informatics-based approach. PLoS One. 2014;9(5):e96677. Hanson EK, Ballantyne J. Whole genome amplification strategy for forensic genetic analysis using single or few cell equivalents of genomic DNA. Anal Biochem. 2005;346: 246–257. Hill M, Finning K, Martin P, Hogg J, Meaney C, Norbury G et al. Non-invasive prenatal determination of fetal sex: translating research into clinical practice. Clin Genet. 2011;80:68-75. Hooks J, Wolfberg AJ, Wang ET, Struble CA, Zahn J, Juneau K, Mohseni M, Huang S, Bogard P, Song K, Oliphant A, Musci TJ. Non-invasive risk assessment of fetal sex chromosome aneuploidy through directed analysis and incorporation of fetal fraction. Prenat Diagn. 2014;34(5):496-499. Hyett JA, Gardener G, Stojilkovic-Mikic T, Finning KM, Martin PG, Rodeck CH et al. Reduction in diagnostic and therapeutic interventions by non-invasive determination of fetal sex in early pregnancy. Prenat Diagn. 2005;25:1111-1116. Illanes S, Denbow M, Kailasam C, Finning K, Soothill PW. Early detection of cell-free fetal DNA in maternal plasma. Early Hum Dev. 2007;83:563–566. ISPD. Benn P, Borell A, Chiu R, Cuckle H, Dugoff L, Faas B, et al. Position statement from the aneuploidy screening committee on behalf of the board of the International Society for Prenatal Diagnosis. 2013. [http://ispdhome.org/public/news/2013/PositionStatementAneuploidy4apr2013.pdf]. Jahr S, Hentze H, Englisch S, Hardt D, Fackelmayer FO, Hesch RD, Knippers R. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res 2001; 61:1659–1665. Jensen TJ, Dzakula Z, Deciu C, van den Boom D, Ehrich M. Detection of microdeletion 22q11.2 in a fetus by next-generation sequencing of maternal plasma. Clin Chem. 2012;58(7):1148–1151. Jorgez CJ, Dang DD, Wapner R, Farina A, Simpson JL, Bischoff FZ. Elevated levels of total (maternal and fetal) beta-globin DNA in maternal blood from first trimester pregnancies with trisomy 21. Human Reproduction. 2007;22(8):2267-2272.
60
Jorgez CJ, Bischoff FZ. Improving enrichment of circulating fetal DNA for genetic testing: Size Fractionation followed by whole gene amplification. Fetal Diag Ther. 2009;25:314-319. Kagan KO, Wright D, Baker A, Sahota D, Nicilaides KH. Screening for trisomy 21 by maternal age, fetal nuchal translucency thickness, free beta-human chorionic gonadotropin and pregnancy-associated plasma protein-A. Ultrasound Obstet Gynecol. 2008;31:618–624. Kitzman JO, Snyder MW, Ventura M, Lewis AP, Qiu R, Simmons LE, Gammill HS, Rubens CE, Santillan DA, Murray JC, Tabor HK, Bamshad MJ, Eichler EE, Shendure J. Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus. Sci Transl Med. 2012;4(137):137ra76. Lau TK, Chen F, Pan X, Pooh RK, Jiang F, Li Y, Jiang H, Li X, Chen S, Zhang X. Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing. J Matern Fetal Neonatal Med. 2012;25:1370-1374. Lau TK, Jiang F, Chan MK, Zhang H, Lo PS, Wang W. Non-invasive prenatal screening of fetal Down syndrome by maternal plasma DNA sequencing in twin pregnancies. J Matern Fetal Neonatal Med. 2013;26(4):434–437. Lau TK1, Cheung SW, Lo PS, Pursley AN, Chan MK, Jiang F, Zhang H, Wang W, Jong LF, Yuen OK, Chan HY, Chan WS, Choy KW. Non-invasive prenatal testing for fetal chromosomal abnormalities by low-coverage whole-genome sequencing of maternal plasma DNA: review of 1982 consecutive cases in a single center. Ultrasound Obstet Gynecol. 2014;43(3):254-264. Leung TY, Qu JZ, Liao GJ, Jiang P, Cheng YK, Chan KC, Chiu RW, Lo YM. Noninvasive twin zygosity assessment and aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Prenat Diagn. 2013;33(7):675-681. Levi J.E., Wendel S., Takaoka D.T. Determinação pré-natal do sexo fetal por meio da análise de DNA no plasma materno. Rev Bras Ginecol Obstet. 2003;25:687-690. Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 1977;37:646-650. Li Y, Zimmerman B, Rusterholz C, Kang A, Holzgreve W, Hahn S. Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms. Clin Chem. 2004a;50:1002–1011. Li Y, Holzgreve W, Page-Christiaens GC, Gille JJ, Hahn S. Improved prenatal detection of a fetal point mutation for achondroplasia by the use of size-fractionated circulatory DNA in maternal plasma--case report. Prenat Diagn. 2004b;24:896-898.
61
Li Y, Di Naro E, Zimmermann B, Holzegreve W and Hahn S. Detection of paternally inherited fetal point mutations for beta-thalassemia using size fractionated cell-free DNA in maternal plasma. JAMA. 2005;293:843–849. . Lim JH, Kim MJ, Kim SY, Kim HO, Song MJ, Kim MH, Park SY, Yang JH, Ryu HM. Non-invasive prenatal detection of achondroplasia using circulating fetal DNA in maternal plasma. J Assist Reprod Genet. 2010;28(2):167-172. Lo YMD, Lo ESF, Watson N, Noakes L, Sargent IL, Thilaganthan B, Wainscot JS. Two-way cell traffic between mother and fetus: biologic and clinical implications. Blood. 1996;88:4390–4395. Lo YMD, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CWG, Wainscoat JS. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997;350:485–487. Lo YMD, Tein MSC, Lau TK, Haines CJ, Leung TN, Poon PMK, Wainscoat JS, Johnson PJ, Chang AMZ, Hjelm NM. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet. 1998a;62:768–775. Lo YMD, Hjelm NM, Fidler C, Sargent IL, Murphy MF, Chamberlain PF, et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl J Med. 1998b;339:1734–1738. Lo YMD, Leung TN, Tein MSC, Sargent IL, Zhang J, Lau TK, Haines CJ, Redman CWG. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal plasma in preeclampsia. Clin Chem. 1999;45:184-188. Lo YMD, Lun FMF, Chan KCA, Tsui NBY, Chong KC, Tze KL, Leung TY, Zee BCY, Cantor CR, Chiu RWR. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(32):1316-1321. Lo Y. Noninvasive prenatal detection of fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma nucleic acid analysis: a review of the current state of art. BJOG. 2008;116:152-157. Lo YMD e Chiu RWK. Noinvasive Prenatal Diagnosis of Fetal Chromosomal Aneuploidies by Maternal Plasma Nucleic Acid Analysis. Clin Chem. 2008;54:3 461-466. Lo YM, Chan KC, Sun H, Chen EZ, Jiang P, Lun FM, Zheng YW, Leung TY, Lau TK, Cantor CR, Chiu RW. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus. Sci Transl Med. 2010;2(61):61ra91. Lo YMD. Non-invasive prenatal diagnosis by massively parallel sequencing of maternal plasma DNA. Open Biol. 2012;2:120086.
62
Lo YM. Non-invasive prenatal testing using massively parallel sequencing of maternal plasma DNA: from molecular karyotyping to fetal whole-genome sequencing. Reprod Biomed Online. 2013;27(6):593-598. Lun FMF, Tsui NBY, Chan KCA, Leung TY, Lau TK, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection and relative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:19920–19925. Lurie S, Mamet Y. Red blood cell survival and kinetics during pregnancy. European J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2000;93:185–192. Machado IN, Castilho L, Pellegrino Jr J, Barini R. Fetal RhD genotyping from maternal plasma in a population with a highly diverse ethnic background. Rev Assoc Med Bras. 2006;52:232-235. Macher HC, Noguerol P, Medrano-Campillo P, Garrido-Marquez MR, Rubio-Calvo A, Carmona-Gonzalez M et al. Standardization non-invasive fetal RhD and SRY determination into clinical routine using a new multiplex RT-PCR assay for fetal cell-free DNA in pregnant women plasma: results in clinical benefits and cost saving. Clin Chim Acta. 2012;413:490-494. Malone FD, Canick JA, Ball RH, et al. First-trimester or secondtrimester screening, or both, for Down’s syndrome. N Engl J Med. 2005;353:2001–11. Mandel P, Metais P. Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme. 1948 apud Pertl B, Sikizawa A, Samura O, Orescovic I, Rahaim PT, Bianchi DW. In: Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats. Hum Genet. 2000;106:45-49. Maron JL, Johnson KL, Slonim D, Lai CQ, Ramoni M, Alterovitz G, Jarrah Z, Yang Z e Bianchi DW. Gene expression analysis in pregnant women and their infants identifies unique fetal biomarkers that circulate in maternal blood. J Clini Investig. 2007;17(10):3007-3019. Martinhago CD, Oliveira RM, Canas MCT, Vagnini LD, Oliveira JBA, Petersen CG, Franco-Junior JG. Accuracy of fetal gender determination in maternal plasma at 5 and 6 weeks of pregnancy. Prenat Diagn. 2006;26:1219–1223. Martinhago CD. Identificação do sexo de embriões humanos através da análise de blastômero pelas técnicas da reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em tempo real) e hibridização in situ fluorescente (FISH). Tese (Doutorado). Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp; 2006b. Mazloom AR, Džakula Ž, Oeth P, Wang H, Jensen T, Tynan J, McCullough R, Saldivar JS, Ehrich M, van den Boom D, Bombard AT, Maeder M, McLennan G, Meschino W, Palomaki GE, Canick JA, Deciu C. Noninvasive prenatal detection of sex chromosomal aneuploidies by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma. Prenat Diagn. 2013;33(6):591-597.
63
McCullough RM, Almasri EA, Guan X, Geis JA, Hicks SC, et al. Non-Invasive Prenatal Chromosomal Aneuploidy Testing - Clinical Experience: 100,000 Clinical Samples. PLoS ONE. 2014;9(10):e109173. Newson AJ. Ethical aspects arising from non-invasive fetal diagnosis. Semin Fetal Neonatal Med. 2008;13:103-108. Ng EKO, Tsui NBY, Lau TK, Leung TN, Chiu RWK, Panesar NS, Lit LCW, et al. mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:4748–4753. Nicolaides K. Some thoughts on the true value of ultrasound. Ultras Obstet Gynecol. 2007;30:671–674. Nicolaides KH. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn. 2011;31(1):7-15. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G, Birdir C, Touzet G. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first-trimester population. Am J Obstet Gynecol. 2012;207:374.e1–374.e6. Nicolaides KH, Syngelaki A, Gil M, Atanasova V, Markova D. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y. PrenatDiagn. 2013;33:575-579. Nicolaides KH, Syngelaki A, Gil MD, Quezada MS, Zinevich Y. Prenatal detection of fetal triploidy from cell-free DNA testing in maternal blood. Fetal Diagn Ther. 2014;35: 212-7. Norton ME, Brar H, Weiss J, Karimi A, Laurent LC, Caughey AB, Rodriguez MH, Williams J 3rd, Mitchell ME, Adair CD, Lee H, Jacobsson B, Tomlinson MW, Oepkes D, Hollemon D, Sparks AB, Oliphant A, Song K. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012;207:137.e1–137.e8. Norwitz ER, Levy B. Noninvasive Prenatal Testing: The Future Is Now. Reviews in Obstet Gynecol. 2013;6:48-62. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 2011;13:913-920. Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet Med. 2012;14:296-305. Pergament E, Cuckle H, Zimmermann B, Banjevic M, Sigurjonsson S, Ryan A,
64
Hall MP, Dodd M, Lacroute P, Stosic M, Chopra N, Hunkapiller N, Prosen DE, McAdoo S, Demko Z, Siddiqui A, Hill M, Rabinowitz M.Single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal testing in a high-risk and low-risk cohort. Obstet Gynecol. 2014;124:210-218. Pertl B, Sikizawa A, Samura O, Orescovic I, Rahaim PT, Bianchi DW. Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats. Hum Genet. 2000;106:45-49. Pertl B, Bianchi DW. Fetal DNA in maternal plasma: emerging clinical applications. Obstet Gynecol. 2001;98:483-490. Peters D, Chu T, Yatsenko SA, Hendrix N, Hogge WA, Surti U, Bunce K, Dunkel M, Shaw P, Rajkovic A. Noninvasive prenatal diagnosis of a fetal microdele- tion syndrome. N Engl J Med. 2011;365:1847–1848. Picchiassi E, Coata G, Fanetti A, Centra M, Pennacchi L, Di Renzo GC. The best approach for early prediction of fetal gender by using free fetal DNA from maternal plasma. Prenat Diagn. 2008;28:525–530. Poon LL, Leung TN, Lau TK, Lo YM. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin Chem. 2000; 46:1832-1834. Poon LLM, Leung TN, Lau TK, Chow KCK, Lo YMD. Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2002;48:35-41. Porreco RP, Garite TJ, Maurel K, Marusiak B; Obstetrix Collaborative Research Network, Ehrich M, van den Boom D, Deciu C, Bombard. Noninvasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA. Am J Obstet Gynecol. 2014;211:365.e1-12. Quezada MS, Gil MM, Francisco C, Oròsz G, Nicolaides KH. Screening for trisomies 21, 18 and 13 by cell-free DNA analysis of maternal blood at 10-11 weeks' gestation and the combined test at 11-13 weeks. Ultras Obstet Gynecol. 2014. doi: 10.1002/uog.14664. [Epub ahead of print] Rabinowitz M, Valenti E, Pettersen B, Sigurjonsson S, Hill M, Zimmermann B. Noninvasive aneuploidy detection by multiplexed amplification and sequencing of polymorphic Loci. Obstet Gynecol. 2014;123Suppl1:167S. Rabinowitz M, Savage M, Pettersen B, Sigurjonsson S, Hill M, Zimmermann B. Noninvasive Cell-Free DNA-Based Prenatal Detection of Microdeletions Using Single Nucleotide Polymorphism-Targeted Sequencing. Obstet Gynecol. 2014;123Suppl1:167S. Redwood City, CA, USA [online] ;2014. [citado novembro 2014]. Disponível em: http://www.verifitest.com/clinical-data/
65
Rouillac-Le Sciellour C, Sérazin V, Brossard Y, Oudin O, Le Van Kim C, Colin Y, et al. Noninvasive fetal RHD genotyping from maternal plasma. Use of a new developed Free DNA Fetal Kit RhD. Transfus Clin Biol. 2007;4(6):572-577. Russell LM, Strike P, Browne CE, Jacobs PA. X chromosome loss and aging. Cytogenet Genome Res. 2007;116:181-155. Ryan A, Baner J, Demko Z, Hill M, Sigurjonsson S, Baird ML, Rabinowitz M. Informatics-based, highly accurate, noninvasive prenatal paternity testing Genet Med. 2013;15(6):473-477. Saito H, Sekizawa A, Morimoto T, Suzuki M, Yanaihara T. Prenatal DNA diagnosis of a single-gene disorder from maternal plasma. Lancet. 2000;356:1170. Samango-Sprouse C, Banjevic M, Ryan A, et al. SNP-based non-invasive prenatal testing detects sex chromosome aneuploidies with high accuracy. Prenat Diagn. 2013;33:643-649. Samura O, Sohda S, Johnson KL, Pertl B, Ralston S, Delli-Bovi LC, Bianchi DW. Diagnosis of trisomy 21 in fetal nucleated erythrocytes from maternal blood by use of short tandem repeat sequences. Clinical Chemistry. 2001 47(9):1622-1626. San Carlos, CA; USA [online]. 2014. [citado novembro 2014]. Disponível em: http://www.panoramatest.com/en/healthcare-provider#about San Diego, CA; USA [online]. 2014. [citado novembro 2014]. Disponível em: http://laboratories. sequenom.com/maternit21plus/prenatal-test-information-for-providers San Jose, CA; USA. [online] 2014. [citado novembro 2014]. Disponível em: http://www.ariosadx.com/healthcare-professionals/ Sayres LC, Cho, MK. Cell-free fetal nucleic acid testing: A review of the technology and its applications. Obstet Gynecol. 2011;66:431-442. Scheffer PG, van der Schoot CE, Page-Christiaens GC, Bossers B, van Erp F, de Haas M. Reliability of fetal sex determination using maternal plasma. Obstet Gynecol. 2010;115:117–126. Schmidt LC, Cabral AC, Faria MA, Monken F, Tarazona-Santos E, Martins ML. Noninvasive fetal RHD genotyping from maternal plasma in an admixed Brazilian population. Genet Mol Res. 2014;13(1):799-805. Secki MJ, Sebire NJ, Berkowitz RS. Gestational trophoblastic disease. Lancet. 2010;376(9742):717-729. Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, de Feo E, Heilek G, Burke J, Rava RP.
66
Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem. 2011;57(7):1042-1049. Sekizawa A, Kondo T, Iwasaki M, Watanabe A, Jimbo M, Saito H et al. Accu-racy of fetal gender determination by analysis of DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2001;47:1856-1858. Sparks AB, Struble cA, Wang ET, Song K, Oliphant A. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012a;206:319e1–319.e9. Sparks AB, Wang ET, Struble CA, et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn. 2012b;32:3-9. Srinivasan A, Bianchi DW, Huang H, Sehnert AJ, Rava RP. Noninvasive detection of fetal subchromosome abnormalities via deep sequencing of maternal plasma. Am J Hum Genet. 2013;92(2):167-176. Tabor A, Alfirevic Z. Update on procedure-related risks for prenatal diagnosis techniques. Fetal Diagn Ther. 2010;27:1–7. Tang NLS, Leung TN, Zhang J, Lau TK, Lo YMD. Detection of fetal-derived paternally inherited X-chromosome polymorphisms in maternal plasma. Clin Chem. 1999;45:2033–2035. Tepperberg J, Pettenati MJ, Rao PN, et al. Prenatal diagnosis using interphase fluorescence in situ hybridization (FISH): 2-year multi-center retrospective study and review of the literature. Prenat Diagn. 2001;21:293-301. Tong YK, Lo YM. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids. Clin Chim Acta. 2006;363:187–196. Tong YK, Chiu RW, Akolekar R, Leung TY, Lau TK, Nicolaides KH, Lo YM. Epigenetic-genetic chromosome dosage approach for fetal trisomy 21 detection using an autosomal genetic reference marker. PLoS One. 2010;5:e15244. Tsui NB, Chim SS, Chiu RW, Lau TK, Ng EK, Leung TN, Tong YK, Chan KC, Lo YM. Systematic micro-array based identification of placental mRNA in maternal plasma: towards non-invasive prenatal gene expression profiling. J Med Genet. 2004;41(6):461-467. Tsui NB, Kadir RA, Chan KC, Chi C, Mellars G, Tuddenham EG et al. Nonin-vasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasma DNA. Blood. 2011;117:3684-3691. Van der Schoot CE, Soussan AA, Koelewijin J, Bonsel G, Paget-Christiaens LGC, de Haas M. Non-invasive antenatal RHD typing. Transfus Clin Biol. 2006;13:53-57.
67
Wagner J, Dzijan S, Marjanovic D, et al. Non-invasive prenatal paternity testing from maternal blood. Int J Legal Med. 2009;123:75–79. Wald NJ, Densem JW, George L, Muttukrishna S, Knight PG. Prenatal screening for Down ́s syndrome using inhibin-A as a serum marker. Prenat Diagn. 1996;16:143–152. Walknowska J, Conte FA, Grumbach MM. Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer. Lancet. 1969;1:1119-1122. Wang E, Batey A, Struble C, Musci T, Song K, Oliphant A. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma. Prenat Diagn. 2013;33:662-666. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, Ballif BC, Eng CM, Zachary JM, Savage M, Platt LD, Saltzman D, Grobman WA, Klugman S, Scholl T, Simpson JL, McCall K, Aggarwal VS, Bunke B, Nahum O, Patel A, Lamb AN, Thom EA, Beaudet AL, Ledbetter DH, Shaffer LG, Jackson L. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med. 2012;367:2175-2184. Wapner RJ, Babiarz JE, Levy B, Stosic M, Zimmermann B, Sigurjonsson S, Wayham N, Ryan A, Banjevic M, Lacroute P, Hu J, Hall MP, Demko Z, Siddiqui A, Rabinowitz M, Gross SJ, Hill M, Benn P. Expanding the scope of non-invasive prenatal testing: Detection of fetal microdeletion syndromes. Am J Obstet Gynecol. 2014. pii: S0002-9378(14)02374-6. doi: 10.1016/j.ajog.2014.11.041. [Epub ahead of print] Wataganara T, LeShane ES, Farina A, Messerlian GM, Lee T, Canick JA, Bianchi DW. Maternal serum cell-free fetal DNA levels are increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18. Hum Genet. 2003;112:204–208. Wegrzyn P, Faro C, Falcon O, Peralta CF, Nicolaides KH. Placental volume measured by three-dimensional ultrasound at 11 to 13+6weeks of gestation: relation to chromosomal defects. Ultrasound Obstet Gynecol. 2005;26:28–32. Wellesley D, Dolk H, Boyd PA, et al. Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J Hum Genet. 2012;20(5):521-526. Wright CF, Burton H. The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis. Hum Reprod Update. 2009;15:139–151. Yan J B, Xu M, Xiong C, Zhou D, Ren Z, Huang Y, Mommersteeg M, Beuningen R, Wang Y, Liao S, Zeng F, Wu Y e Zeng Y. Rapid screening for chromosomal aneuploidies using array-MLPA. BMC Medical Genetics. 2011; 12:68.
68
Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K, Holzgreve W, Hahn S. Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2005;51:1598–1604. Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, Demko Z, Banjevic M, Baner J, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphicloci. Prenat Diagn. 2012;32(13):1233–1241. Zinaman MJ, Clegg ED, Brown CC, O'Connor J, Selevan SG. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertil Steril. 1996;65(3):503-509.
69
Resumo
Andari, VCM “Testes genéticos não invasivos no pré-natal: benefícios e limitações dos exames disponíveis” 2015. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Há algumas décadas, testemunha-se uma série de avanços no diagnóstico e rastreamento de gestações alteradas, particularmente na identificação da síndrome de Down. O “padrão ouro” para o diagnóstico pré-natal para aneuploidias é fornecido pela técnica de cariótipo, que possui acurácia elevada, mas é dependente de procedimentos invasivos, que geram risco de perdas fetais. Nos anos 90, os ácidos nucléicos fetais circulantes no sangue materno foram reportados como recurso para o desenvolvimento de testes genéticos pré-natais não invasivos (NIPT). Recentemente, em 2011, esta área passou por um importante marco histórico, quando foi disponibilizado para o uso clínico diferentes metodologias de NIPT para aneuploidias e para a exclusão da paternidade, além da publicação de um novo método generalizado de NIPT, que possibilita o sequenciamento genômico fetal completo. Esses novos avanços despertaram o interesse das comunidades médicas e científicas mundialmente. Por isso, este trabalho objetivou a compilação dos dados literários, que permitissem abordar a evolução e os avanços técnicos e metodológicos dos exames disponíveis, para o reconhecimento de seus benefícios e limitações e das perspectivas futuras a respeito dos NIPT. Trata-se de uma revisão assistemática da literatura científica, que buscou como fonte de pesquisa o PubMed/MEDLINE. Os NIPT aplicam-se ao estudo das doenças ligadas ao sexo, da doença hemolítica do recém-nascido, algumas doenças monogênicas de herança dominante e recessiva, à exclusão da paternidade e na triagem de gestações com risco para as aneuploidias mais comuns, inclusive envolvendo os cromossomos sexuais, para algumas microdeleções e triploidia. Estão disponíveis para uso clínico quatro NIPT para a avaliação do risco para aneuploidias. Estes exames fazem uso de três ferramentas metodológicas: o s-MPS, o t-MPS e o SNP. Os testes genéticos apresentam a vantagem de poderem ser realizados precocemente, com elevada acurácia, baixa taxa de falso positivo, além de abrangerem um espectro maior de aplicações clínicas. Mas limitam-se pelo seu elevado custo. A técnica de SNP é a mais acurada, por ser baseada no padrão de distribuição dos alelos, enquanto que as técnicas que utilizam MPS limitam-se por serem dependentes da amplificação e da contagem de fragmentos de DNA. O sequenciamento genômico total representa o futuro dos NIPT, é um método generalizado de diagnóstico, no qual mais informação sobre a saúde fetal poderá ser acessada e aplicada, não somente na detecção de aneuploidias, mas também em um número maior de condições genéticas. Palavras chave: Diagnóstico pré-natal, Teste genético, DNA/sangue, Doenças fetais/diagnóstico.
70
Abstract Andari, VCM " Non-invasive prenatal genetic testing: benefits and limitations of the available tests " 2015. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Over the past decades a series of advances in diagnosis and screening of abnormal pregnancies have been witnessed by the medical area, especially in the identification of Down syndrome. The gold standard for prenatal aneuploidy diagnosis is provided by karyotype, which has high accuracy, but it is dependent on invasive procedures which rise the risk of fetal loss. In the 1990s, circulating fetal nucleic acids in maternal blood was first reported as a resource for development of non-invasive prenatal genetic tests (NIPT). Recently, in 2011, the area underwent a major milestone when different NIPT methodologies for aneuploidies and misattributed paternity were available for clinical use, besides the publication of a new generalized method of NIPT, which enables whole-genome sequencing for human fetus. These new advances fomented the interest of medical and scientific worldwide communities. Therefore, this study is aimed at compiling the literary data which enable to approach the evolution and the technical and methodological advances of the available tests for the recognition of its benefits and limitations and future prospects regarding NIPT. This is an unsystematic review of scientific literature which was based on PubMed / MEDLINE research sources. NIPT is applied to the study of sex-linked diseases, hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), some monogenic diseases from dominant or recessive inheritance, misattributed paternity, and the screening for high-risk pregnancies for the most common aneuploidies, including sex chromosomal aneuploidies, some microdeletion syndromes and triploid. There are four NIPT for aneuploidy available for clinical use. These tests use three methodological tools: the s-MPS, T-MPS and the SNP. The advantage of NIPT tests is that they can be performed earlier in pregnancy with high accuracy, low false-positive rate and covering a broader range of clinical applications. However, they are limited by their high cost. The SNP technique is the most accurate and it is based on the pattern of distribution of the alleles, while MPS techniques are limited and they depend on amplifying and counting of DNA fragments. The whole-genome sequencing NIPT represents the future, it is a widespread diagnostic method in which more information about fetal health can be accessed and applied, not only in detection of aneuploidies, but also in a larger number of genetic conditions. Keywords: Prenatal diagnosis, Genetic testing, DNA/blood, Fetal diseases/diagnosis.
71
Anexos
72