vÍrus entÉricos associados À gastroenterite … de carvalho... · ficha catalográfica elaborada...

UNIVERSIDADE DO CEUMA

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

SÃO LUÍS

2012

ROXANA DE CARVALHO VERAS

VÍRUS ENTÉRICOS ASSOCIADOS À

GASTROENTERITE AGUDA INFANTIL

EM SÃO LUÍS - MA


VÍRUS ENTÉRICOS ASSOCIADOS À GASTROENTERITE AGUDA INFANTIL EM

SÃO LUÍS-MA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biologia Parasitária como parte

dos requisitos para a obtenção do título de

Mestre em Biologia Parasitária da

Universidade do CEUMA

Orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto

Coorientador: Profa. Dra. Patrícia de Maria

Silva Figueiredo

SÃO LUÍS

2012

Ficha catalográfica elaborada pela bibliotecária Luciana de Araújo CRB-13/445.

Veras, Roxana de Carvalho.

Vírus entéricos associados à gastroenterite aguda infantil em São

Luís-Ma./ Roxana de Carvalho Veras. São Luís: UNICEUMA, 2012.

105p. il.

Dissertação (Mestrado) – Curso de Biologia Parasitária.

Universidade do CEUMA, 2012.

1. Diarreia Infantil. 2. Vírus Entéricos. 3. Genotipagem I.

Monteiro Neto, Valério (Orientador) II. Título.

CDU: 616.97(812.1)

V473

v


VÍRUS ENTÉRICOS ASSOCIADOS À GASTROENTERITE AGUDA INFANTIL EM

SÃO LUÍS-MA

A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em

Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia 27 / 06 / 2012, considerou a

candidata

( X ) APROVADA ( ) REPROVADA

1) Examinador: Rosimary de Jesus Gomes Turri

2) Examinador: Maria Rosa Quaresma Bomfim

3) Examinador: Cristina de Andrade Monteiro

4) Presidente (Orientador): Valério Monteiro Neto

Aos meus queridos pais José Ribamar

Veras e Celeste Maria de Carvalho Veras

AGRADECIMENTOS

A Deus, pois toda honra, glória e poder sejam dados a ele. Obrigada Senhor por mais

essa vitória na minha vida! Sem Ti nada disso seria possível.

Aos meus queridos pais, José Ribamar Veras e Celeste Mª de Carvalho Veras, pois

vocês são meus principais incentivadores. Obrigada por sempre estarem comigo em

todos os momentos da minha vida. Sem o amor, o cuidado e a paciência de vocês eu

não teria chegado ao final de mais uma conquista. Amo vocês!!!

Ao meu irmão Rogério Veras, pelo exemplo e incentivo.

A minha querida prima Keylla Cristine por ser mais que uma prima pra mim, uma

verdadeira amiga. Sempre com palavras de incentivo e apoio, mostrando-se sempre

presente em todas as etapas da minha vida. Eu sei que a minha vitória é a tua

vitória também. Muito Obrigada!

Ao meu orientador, Prof. Dr. Valério Monteiro Neto pela sua rica orientação e por

acreditar que eu pudesse realizar este trabalho.

As professoras Patrícia de Mª Silva Figueiredo e Cristina de Andrade Monteiro

pelas colaborações na realização deste trabalho e palavras de apoio e incentivo.

A todos os meus colegas de turma do Mestrado Biologia Parasitária Adriana

Marques, Viviane Menezes, Márcia Boor, Inácio Pereira, Kênia Regina e Suzane

Katy pelos momentos de descontração, tornando os momentos difíceis mais

agradáveis. Principalmente Alícia Zaranza e Ione Paiva pela amizade,

companheirismo, apoio e auxílio em todas às horas. Muito obrigada!

A todos os amigos que conquistei no laboratório do UNICEUMA, Márcia Barros,

Jessika Farias, Patrícia Valéria, Iven Neylla, Diogo Marcelo, Monique Santos,

Francyelle Costa e Dália Cristine, por terem me acolhido e me tratarem sempre com

carinho e atenção. Por cooperarem de alguma forma na realização desse trabalho,

ou com palavras de incentivo, ou com uma brincadeira, ou uma saidinha para

lanchar, ou me emprestando a câmara digital, ou fazendo um gel. Obrigada

queridos!

Aos meus colegas do CTA que muita paciência tiveram comigo durante esses dois

anos. Principalmente Andrezza Brito, Tiago Ahid e Marilene Agra, pela

preocupação, amizade e paciência. Valdenide Santos, Márcia Rocha e Angela

Carvalho pelas palavras de carinho e incentivo. Ana Luiza por me liberar do serviço

nos dias de aula, provas e reuniões no mestrado.

A professora Emygdia Rosa e aos meus colegas do LEGH por me incentivarem a ter

gosto pela pesquisa e sempre estarem dispostos a me ajudar, Fernanda de Carvalho,

Fábio França, Ellen Lisboa, Patrícia Azevedo, Fernando Patrício, Bruno Nunes,

Fabiano Monteles, Leidyane Cunha e Maxwellem Ferreira. Especialmente

Alexsandro Santos por ótimas dicas na realização desse trabalho.

A professora Silma Pereira por ter liberado o espaço físico do LABGEN da UFMA

para que eu pudesse concluir os meus experimentos. E a todos os colegas do LABGEN,

principalmente Perla Lopes, Rossy-Eric Soares, Jaqueline Diniz, Marta Belfort,

Mayara Ingrid e Maria Santana pelo acolhimento carinhoso.

Finalmente a todos que direta ou indiretamente contribuíram para confecção e

finalização desse trabalho. Obrigada!

Tudo coopera para o bem daqueles que

amam a Deus”

Romanos 8:28

“Tudo posso Naquele que me fortalece”

Filipenses 4:13

RESUMO

Muitos agentes infecciosos podem estar associados à doença diarréica, mas os vírus são os

principais responsáveis por gastroenterites endêmicas e epidêmicas. Contudo existem poucos

relatos que descrevam a importância desses agentes em nosso meio. Desta forma, o presente

estudo teve por objetivo detectar a presença de vírus entéricos em crianças menores de 5 anos

de idade em São Luís – MA e caracterizar as amostras positivas de rotavírus quanto ao seu

fenótipo e genótipo. Entre maio de 2009 e maio de 2011 foram analisadas 131 amostras de

fezes de crianças, sendo que deste total 76 amostras eram de crianças com diarréia aguda

(grupo caso) e 55 amostras eram de crianças sem diarréia aguda (grupo controle). Para

detecção molecular dos vírus entéricos foi utilizada a técnica de RT-PCR (ou PCR para

adenovírus), utilizando os primers específicos para cada agente. No caso da detecção de

rotavírus também foi empregada à técnica de ELISA e as amostras positivas foram

fenotipadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e genotipadas através de PCR

para os genótipos G e P. Das crianças estudadas, 26,3% (20/76) no grupo caso e 10,9% (6/55)

no grupo controle tiveram positividade para um dos vírus entéricos pesquisados. Entre as

crianças com gastroenterites os vírus mais frequentemente detectados foram: rotavírus

(13,1%) e adenovírus (5,3%), seguido por norovírus (4,0%), Aichi vírus (2,6%) e astrovírus

(1,3%). Das 11 amostras positivas para rotavírus, 4 amostras não apresentaram perfil de

migração eletroforética e 7 amostras apresentaram um perfil de migração compatível com o

fenótipo de rotavírus do grupo A do tipo longo. Como resultado da associação G e P, a

combinação observada foi G2P[4]. Os norovírus detectados foram do genogrupo II. Este

estudo demonstrou que todos esses vírus circularam entre as crianças em nosso meio e que o

rotavírus é ainda um agente significante da gastroenterite mesmo após a introdução da

vacinação, devido ao envolvimento de outros genótipos não incluídos rotineiramente na

vacina usada no Brasil.

Palavras-chave: Diarreia infantil, Vírus entéricos, RT-PCR, Genotipagem.

ABSTRACT

Many infectious agents can be associated to diarrhea disease, but viruses are the main cause

of endemic and epidemic gastroenteritis. However, there are few reports describing the

importance of these agents in our region. Thus, this study aimed to detect the presence of

enteric viruses in children under 5 years old in São Luís – MA and characterize the rotavirus

positive samples according to their phenotype and genotype. Between May 2009 and May

2011 we analyzed 131 stool samples from children, 76 of which were samples from children

with acute diarrhea (case group) and 55 samples were from children without diarrhea (control

group). For molecular detection of enteric viruses, it was used the RT-PCR (or PCR for

adenovirus), having specific primers for each agent. Related to rotavirus detection we also

used ELISA and the positive samples were phenotyped by polyacrylamide agarose gel

electrophoresis (PAGE) and genotyped by PCR for genotypes G e P. Of the children studied,

26.3% (20/76) in the case group and 10.9% (6/55) in the control group were positive for at

least one of the enteric viruses studied. The viruses most frequently detected in children with

gastroenteritis were: rotavirus (13.1%) and adenovirus (5.3%), followed by norovirus (4.0%),

Aichi virus (2.6%), and astrovirus (1.3%). In the control group, norovirus was detected more

often than in cases (7.3%), followed by rotavirus (1.8%), and adenovirus (1.8%). From 11

positive samples for rotavirus, 4 samples showed no electrophoretic migration profile and 7

samples had a migration profile compatible with the phenotype of long type group A

rotavirus. As a result of the association G and P, the combination found was G2P[4]. The

noroviruses detected were from the genogroup II. This study demonstrated that all these

viruses are circulating in children in our region and that rotavirus is still a significant agent of

gastroenteritis even after introduction of vaccination, due to the involvement of other

genotypes not included in the vaccine routinely used in Brazil.

Keywords: Infantile diarrhea, Enteric viruses, RT-PCR, Genotyping.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Representação esquemática da partícula de rotavírus e seus segmentos, com os

respectivos produtos..................................................................................................

19

Figura 2 - Incidência estimada dos casos fatais de diarreia por rotavírus para cada 100.000

crianças menores de 05 anos......................................................................................

23

Figura 3 - Representação da partícula de adenovírus.................................................................

27

Figura 4 - Organização genômica de adenovírus humano..........................................................

28

Figura 5 - Representação esquemática do genoma dos astrovírus .............................................

31

Figura 6 - Representação esquemática do genoma dos norovírus .............................................

35

Figura 7 - Percentual de crianças menores de 05 anos com positividade para um dos vírus

entéricos em São Luís - MA, entre maio de 2009 a maio de

2011............................................................................................................................

53

Figura 8 - Gel de agarose 1,5% mostrando o perfil de detecção por RT-PCR e PCR específico dos

vírus entéricos causadores de gastroenterite em crianças..................................................

54

Figura 9 -Variação sazonal na freqüência dos vírus entéricos detectados em 76 crianças

menores de 05 anos com gastroenterite em relação à pluviosidade em São Luís-

MA, entre maio de 2009 a maio de 2011...................................................................

58

Figura 10 - Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando o perfil eletroforético de amostras fecais de

crianças menores de 05 anos positivas para rotavírus em São Luís-MA. A canaleta A

contém controle negativo. As canaletas B, E, F, H, I e J apresentam amostras

com perfil eletroforético padrão longo...................................................................

60

Figura 11 - Genotipagem de rotavírus visualizada em gel de agarose a 2%. A- genotipagem

P (VP4) de rotavírus usando produtos da 1ªamplificação........................................

61

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Primers utilizados na detecção molecular dos vírus entéricos................................... 48

Tabela 2 - Sequência dos primers utilizados para a definição do genótipo G e P do

rotavírus........................................................................................................... 51

Tabela 3 - Frequência de vírus entéricos em crianças menores de 05 anos com e sem

gastroenterite em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011........ 55

Tabela 4 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças com gastroenterite menores de

05 anos em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011,

distribuídos por faixa etária ............................................................................ 56

Tabela 5 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças menores de 05 anos com

gastroenterite em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011,

distribuídos por sexo..................................................................................... 57

Tabela 6 - Detecção de rotavírus em crianças menores de 05 anos em São Luís – MA,

entre maio de 2009 a maio de 2011, distribuídas de acordo com o estado

vacinal............................................................................................................. 59

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AdV Adenovírus

Aich Aichi vírus

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

DNAc DNA complementar

CVE Centro de Vigilância Epidemiológica

dATP Deoxyadenosine triphosphate (Desoxiadenosina trifosfato)

dCTP Deoxycytidine triphosphate (Desoxicitidina trifosfato)

dGTP Deoxyguanosine triphosphate (Desoxiguanosina trifosfato)

DNA Ácido Desoxirribonucleico

DNase Desoxirribonuclease

dNTP Deoxynucleotide triphosphate (Desoxirribonucleotídeo trifosfato)

dsRNA Double Stranded Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico de fita dupla)

dTTP Deoxythymidine triphosphate (Desoxitimidina trifosfato)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Ácido tetracético etilenodiamino)

EGPA Eletroforese de RNA em Gel de Poliacrilamida.

ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay

EUA Estados Unidos da América

FAPEMA Fundação de Amparo a Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico

do Maranhão

FDA Food and Drug Administration

HCl Ácido Clorídrico

HAst Astrovírus

M Molar

mA Mili Ampére

ME Microscopia Eletrônica

MgCl2 Cloreto de Magnésio

mL Mililitro

MDDA Monitorização das Doenças Diarreicas Agudas

mM Milímetro

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro

MS Ministério da Saúde

NaOH Hidróxido de Sódio

NoV Norovírus

Nm Nanômetro

OMS Organização Mundial de Saúde

ORF Open Reading Frame (Região de leitura aberta)

pb Pares de Base

pH Potencial Hidrogeniônico

PBS Phosphate Buffered Saline (Tampão fosfato salina)

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia de polimerase)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ácido Ribonucleico

RNase Ribonuclease

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia de

polimerase pós-transcrição reversa)

RV Rotavírus

SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sódio)

TBE Tris-Borate-EDTA

TEMED Tetramethylethylenediamine (Tetrametiletilenodiamina)

TRIS Hydroxymethyl-aminomethane (Hidroximetil-aminometano)

μL Microlitro

µM Micromol

V Volt

VP Viral Protein

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 15

2 REVISÃO DE LITERATURA 18

2.1 Rotavírus .................................................................................................................... 18

2.1.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade ............................................... 21

2.1.2 Epidemiologia ..................................................................................................... 22

2.1.3 Diagnóstico Laboratorial ................................................................................... 24

2.1.4 Prevenção, Controle e Tratamento .................................................................... 25

2.2 Adenovírus ................................................................................................................. 26

2.2.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Diagnóstico ............................................. 29

2.2.2 Epidemiologia ..................................................................................................... 29


2.3 Astrovírus ................................................................................................................... 30

2.3.1 Patogenia, Manifestações clínicas e Imunidade ................................................ 32


2.3.3 Epidemiologia ..................................................................................................... 33


2.4 Norovírus ................................................................................................................... 34

2.4.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade ............................................... 36

2.4.2 Epidemiologia ..................................................................................................... 37



2.5 Aichi vírus .................................................................................................................. 38

2.5.1 Epidemiologia ..................................................................................................... 40



3 OBJETIVOS 41

3.1 Geral ........................................................................................................................... 41

3.2 Específicos ................................................................................................................. 41

4 METODOLOGIA 42

4.1 Área de estudo e pacientes ......................................................................................... 42

4.2 Coleta e transporte ..................................................................................................... 42

4.3 Extração do ácido nucleico ........................................................................................ 43

4.3.1 Preparo das suspensões fecais ........................................................................... 43

4.3.2 Extração do DNA viral ....................................................................................... 43

4.3.3 Extração do RNA viral ....................................................................................... 43

4.4 Detecção inicial das amostras para rotavírus ............................................................. 44

4.4.1 Detecção por ensaio imunoenzimático (ELISA) ................................................. 44

4.4.2 Detecção do dsRNA viral em gel de poliacrilamida (EGPA) ............................ 44

4.5 Detecção do adenovírus humano ..................................................................................... 46

4.6 Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR) .............................. 47

4.6.1 Detecção de Rotavírus ............................................................................................. 49

4.6.2 Detecção de Astrovírus ............................................................................................ 49

4.6.3 Detecção de Norovírus ............................................................................................. 49

4.6.4 Detecção de Aichi vírus ........................................................................................... 50

4.6.5 Análise da Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR) .. 50

4.7 Genotipagem de Rotavírus ............................................................................................... 50

4.8 Análise de dados .............................................................................................................. 52

5 RESULTADOS 53

5.1 Detecção e distribuição dos vírus entéricos ..................................................................... 53

5.2 Perfil eletroforético do genoma de rotavírus................................................................... 59

5.3 Genotipagem dos Rotavírus..............................................................................................60

6 DISCUSSÃO 62

7 CONCLUSÃO 69

REFERÊNCIAS 70

APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO..................83

APÊNDICE B - SOLUÇÕES E REAGENTES.......................................................................84

ANEXO A - PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

DO UNICEUMA...................................................................................................................... 89

ANEXO B - CERTIFICADO DO PRÊMIO DE MELHOR PAINEL DO V SIMPÓSIO DE

MICROBIOLOGIA APLICADA.............................................................................................90

ANEXO C - PUBLICAÇÃO DO RESUMO: DETECTION OF ROTAVÍRUS AND

ADENOVÍRUS IN FECAL SAMPLES FROM CHILDREN HOSPITALIZED IN SÃO

LUÍS, MARANHÃO, BRAZIL. REVISTA HOLOS ENVIRONMENTAL...........................91

ANEXO D - PROTOCOLO DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA PEDIATRIC

RESEARCH..............................................................................................................................92

ANEXO E – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO À REVISTA PEDIATRIC

RESEARCH..............................................................................................................................93

ANEXO F – ARTIGO SUBMETIDO CONFORME AS NORMAS DA REVISTA

PEDIATRIC RESEARCH........................................................................................................94

15

1 INTRODUÇÃO

A doença diarreica constitui um grave problema de saúde pública, pois é

reconhecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma causa importante de

morbidade e mortalidade infantil em todo o mundo, atingindo pessoas de todas as classes

sociais (SILVA; LIRA; LIMA, 2004; BRYCE et al., 2005). Embora as evidências

demonstrem o declínio nos índices de mortalidade infantil, nessa última década, tais valores

ainda são considerados altos e os índices de morbidade permanecem tão elevados quanto os

observados há 30 anos, principalmente nas regiões menos desenvolvidas do mundo onde

cerca de um quarto das crianças são mal nutridas, mais de um bilhão de pessoas não têm

acesso a água potável e mais de dois bilhões têm saneamento inadequado ou não tem

saneamento básico (KOSEK; BERN; GUERRANT, 2003; SANTOS; SOARES, 2008).

Estima-se que a mortalidade mundial por diarreia na população menor de cinco

anos esteja em torno de 1,87 milhões, o que corresponde a aproximadamente 19% do total da

mortalidade infantil. Alguns países da África e Sudeste Asiático acumulam juntos 78% (1,46

milhões) de todas as mortes por diarreia registradas entre as crianças no mundo todo; e 73%

dessas mortes estão concentradas em apenas 15 países em desenvolvimento (BOSCHI-

PINTO; VELEBIT; SHIBUYA, 2008). Já nos países desenvolvidos, a importância das

doenças diarreicas está relacionada ao impacto produzido na população, traduzido pelos danos

à saúde, que afetam diretamente o desenvolvimento infantil, bem como a sociedade,

representando um enorme gasto em termos de custos médicos, perdas de dias de trabalho e

escola, gastos com medicamentos, transportes, entre outros (PARASHAR et al., 2006).

No Brasil, apesar dos importantes avanços alcançados na prevenção e no controle

das doenças infecciosas, a doença diarreica aguda continua a ser um dos principais problemas

de saúde pública e um grande desafio para as autoridades de saúde. Em virtude disso, foi

instituído, em 1994, um sistema de vigilância sentinela chamado Monitorização das Doenças

Diarreicas Agudas (MDDA) que é um importante instrumento para o acompanhamento desses

agravos na esfera municipal, cujos objetivos principais são detectar os surtos de forma

precoce e identificar os agentes etiológicos envolvidos. Conforme os dados do Ministério da

Saúde, até março de 2006, a MDDA já havia sido implantada em 78% dos municípios do país

(BRASIL, 2006). Em 2010, foram notificados ao Ministério da Saúde pela MDDA, 4.341.209

casos de diarreia em todo território nacional, dos quais, 1.171.705 foram registrados na região

nordeste do Brasil. Já no Maranhão, de acordo com a Secretaria de Vigilância em Saúde do

16

Estado, foram notificados 74.788 casos de diarreia em crianças menores de 5 anos no ano de

2010, com 10.819 somente em São Luís (BRASIL, 2010).

Geralmente, a diarreia aguda é uma doença autolimitada, isto é, evolui para a cura

espontaneamente, com duração entre 2 a 14 dias, e sua gravidade depende da presença e

intensidade da desidratação ou do tipo de toxina produzida pelo patógeno. É caracterizada por

alterações do volume, consistência e frequência das fezes, mais frequentemente associada

com fezes líquidas e com o aumento no número de evacuações (mais de três episódios por

dia). Frequentemente costuma ser acompanhada de vômitos, febre, cólicas e dor abdominal;

em alguns casos há presença de muco e sangue (THIELMAN; GUEMANT, 2004).

Muitos agentes infecciosos (bactérias, parasitas e vírus) podem ser associados,

mas os vírus são os principais responsáveis por gastroenterites endêmicas e epidêmicas, a

maioria representada por um grupo de rotavírus, os quais provocam infecção em praticamente

todas as crianças nos primeiros 5 anos de vida (GLASS et al., 2006; RIBEIRO et al., 2008).

Porém, outros importantes patógenos virais têm sido associados à infecção diarreica em

crianças, dentre os quais se destacam os norovírus, astrovírus, Aichi vírus e adenovírus

entéricos (MAGALHÃES et al., 2007; VICTORIA et al., 2007A; AMBERT-BALAY et al.,

2008; ANDREASI et al., 2007).

Estes vírus são transmitidos pela via fecal-oral, através de contados íntimos com

pessoas infectadas, ingestão de água e alimentos contaminados e por fômites, com uma dose

infectante extremamente baixa, variando de uma a dez unidades infecciosas. Eles podem

permanecer potencialmente infectantes durante vários meses, resistindo a condições

ambientais adversas e identificados durante todas as estações do ano. Alguns vírus resistem a

processos de tratamento de água e esgoto aplicados no controle bacteriano, inclusive cloração

(TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005).

Clinicamente, não é possível diferenciar as infecções provocadas pelos patógenos

virais, com isso o diagnóstico laboratorial se torna importante para a instituição de medidas de

suporte do paciente com essas infecções, uma vez que não há necessidade de

antibioticoterapia e na maioria das vezes, nem internação, pois não existe tratamento

específico contra esses vírus (CARRARO et al., 2008).

Há muitos testes laboratoriais disponíveis no mercado para a detecção de agentes

virais utilizando métodos enzimáticos para a pesquisa de antígenos virais e com o avanço das

técnicas de biologia molecular e a disponibilidade de dados da sequência de vários sorotipos,

foram desenvolvidos ensaios moleculares de Transcrição Reversa seguida da Reação em

Cadeia de Polimerase (RT-PCR) que empregam primers específicos que permitem em

17

diversas oportunidades, confirmar a presença desses vírus (SDIRI-LOULIZI et al., 2008;

BARLETTA et al., 2009).

Devido ao elevado índice de morbi-mortalidade associada à diarreia causada por

vírus, particularmente rotavírus, ficou evidente a necessidade de medidas urgentes como

desenvolvimento de vacinas, cujo objetivo principal seria à atenuação da gravidade da doença

diarreica (GLASS et al., 2006). Já foram concluídos ensaios clínicos de duas vacinas orais

contra os rotavírus. Uma delas, a Rotatrix®, foi licenciada pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA), em julho de 2005. Em março de 2006, ela foi introduzida no

calendário básico de imunização para crianças brasileiras menores de seis meses de idade,

para proteger antecipadamente as crianças da faixa etária de 6 a 24 meses, nas quais se

observa a maior carga de complicações decorrentes da infecção pelo rotavírus, com

administração de duas doses, com a primeira aos 2 ou 3 meses e a segunda aos 4 ou 5 meses

de idade (BRASIL, 2006; GURGEL et al., 2007).

A pesquisa de enteropatógenos virais envolvidos em casos de doença diarreica

infantil é importante para elucidar a etiologia e fornecer dados que possibilitem intervenções

públicas, no sentido de melhorar a qualidade de vida. A maioria dos estudos no Brasil tem

sido realizada nas regiões norte, centro-oeste e sudeste, sendo escassos os dados na região

nordeste, particularmente no estado do Maranhão. Portanto, a uma lacuna de conhecimentos

na epidemiologia desses vírus que evidenciem a sua importância como agentes etiológicos da

diarreia infantil, não somente para se conhecer a situação em São Luís, Maranhão, mas

também para investigar a sua importância principalmente após a implantação do processo

vacinal para rotavírus.

18

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Rotavírus

O gênero Rotavirus é um dos nove gêneros da família Reoviridae que apresentam

propriedades morfológicas e bioquímicas em comum. O nome rotavírus deriva da palavra

latina “rota” devido possuírem partículas virais com aparência de roda quando observadas em

microscópio eletrônico (FLEWETT et al., 1975).

A partícula viral quando íntegra mede aproximadamente 75 nm de diâmetro, não

possuem envelope lipídico e o capsídeo de simetria icosaédrica é constituído de três camadas

concêntricas de proteínas: o capsídeo externo, o capsídeo interno e o core que envolve o

genoma viral, o qual é composto de 11 segmentos de fita dupla de RNA (dsRNA). Cada

segmento codifica uma proteína (monocistrônico), com exceção do segmento 11 que codifica

duas proteínas (bicistrônico), NSP5 e NSP6 (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001;

LUNDGREN; SUENSSON, 2001; MASCARENHAS et al., 2002; JAYARAM; ESTES;

PRASAD, 2004; FAUQUET et al., 2007; SANTOS; SOARES, 2008).

Seis desses segmentos de dupla fita de RNA encontrados no genoma do rotavírus

codificam seis proteínas virais (Viral Protein) que são as VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e VP7,

sendo que as proteínas VP5 e VP8 são originadas por clivagem da proteína precursora VP4.

Os outros cinco segmentos genômicos dão origem a seis proteínas não estruturais (Not

Structural Protein) NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 e NSP6 que são detectadas nas células

infectadas, mas não nas partículas virais maduras (ESTES, 2001). A estrutura do genoma viral

com a sequência dos segmentos de RNA pode ser visualizada na Figura 1.

19

Figura 1 – Representação esquemática da partícula de rotavírus e seus segmentos, com os respectivos

produtos.

Fonte: GARBAG – CHENON, 2003.

A camada mais interna da partícula viral madura (vírion), denominada de core, é

composta pela proteína VP2, a qual envolve o material genético e interage com as proteínas

VP1 e VP3. As proteínas VP1 e VP3, por sua vez, possuem a capacidade de se ligar ao RNA

e apresentam, respectivamente, as atividades de RNA polimerase-RNA dependente e

guanililtransferase. As proteínas VP1, VP2 e VP3 são codificadas pelos segmentos 1, 2, 3,

respectivamente (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001; ESTES, 2001; SANTOS;

SOARES, 2008).

A camada intermediária, o capsídeo interno, é constituída da proteína VP6 que é

codificada pelo segmento 6 do genoma viral. O seu antígeno que é detectado em testes

diagnósticos como ELISA (Ensaio imunoenzimático) é usado para caracterizar sete diferentes

grupos de rotavírus de A a G, porém os maiores causadores de diarreia no homem são os

pertencentes ao grupo A, embora integrantes dos grupos B e C sejam também encontrados

20

infectando seres humanos (ESTES, 2001; KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001;

RAMIG, 2004).

A camada externa corresponde ao capsídeo externo e é composta pelas proteínas

VP4, as espículas, que determina o tipo P (de sensível a Protease) e VP7, que determina o tipo

G (G de Glicoproteína), ambas importantes para a infectividade viral, já que a infectividade

da partícula depende da integridade do capsídeo externo, que, por sua vez, depende da

presença de íons cálcio (ESTES, 2001; SANTOS; SOARES, 2008).

A glicoproteína VP7 é o principal constituinte da camada protéica mais externa e

o segundo elemento mais abundante na partícula e é codificada pelos segmentos 7, 8 ou 9,

dependendo da amostra viral (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001). Essa estrutura

também é responsável pela determinação de sorotipos virais, designados pela letra G

(glicoproteína). Atualmente, são conhecidos 15 sorotipos G, isto pelo fato de apresentar

diferentes determinantes antigênicos, apresentando uma correlação boa entre a sorologia e as

classificações do genoma, com o sorotipo e genótipo designado por um único número (ex.

G1) (FISHER; GENTSCH, 2004; GLASS, 2006; MUNFORD et al., 2007).

Outra proteína presente no capsídeo externo, denominada VP4, é codificada pelo

quarto segmento genômico que apresenta sítios de clivagem para a enzima tripsina,

produzindo os fragmentos VP5* e VP8*, os quais são responsáveis por aumentar a

infectividade da partícula (VAN REGENMORTEL, 2000; KAPIKIAN; HOSHINO;

CHANOCK, 2001). É a proteína de ligação à célula, com papel de internalização do vírus,

porém a sua correlação entre a sorologia e as classificações do genoma são mais difíceis. Até

o momento são conhecidos 15 sorotipos e 27 genótipos P. O sorotipo é designado por

números e o genótipo é expresso em números entre parênteses (ex. P1[8]) (COLUCHI et al.,

2002; MUNFORD et al., 2007; SANTOS; SOARES, 2008).

Como os genes que codificam as proteínas VP4 e VP7 podem se segregar de

maneira independente, várias combinações, entre P e G podem ser detectadas na natureza. No

entanto a combinação G1P[8] é a mais comum identificada em humanos de tal forma que foi

eleita para compor a vacina monovalente Rotarix® (GLASS; PARASHAR, 2006).

As diferentes espécies de rotavírus apresentam um típico padrão eletroforético de

migração de seus 11 segmentos em eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), o que

permite associar a disposição das bandas às espécies dentro do gênero Rotavirus, já que os

padrões de migração variam em diferentes linhagens dentro de uma mesma espécie. Então a

análise dos perfis eletroforéticos tem sido amplamente utilizada para caracterizar as amostras

21

de rotavírus, com a cocirculação de amostras com perfis diferentes durante uma epidemia

(FAVACHO et al., 2005; GENTSCH et al., 2005).

Observa-se que os segmentos migram em quatro grupos distintos de acordo com a

massa molecular e numerados de 1 a 11 pela ordem de migração no gel: grupo I (genes 1 a 4),

grupo II (genes 5 e 6), grupo III (genes 7 a 9) e finalmente o grupo IV (genes 10 e 11). A

migração desses últimos segmentos define os perfis longo (L), curto (S) e supercurto (SS),

representando um critério útil para a classificação dos rotavírus do grupo A (SANTOS;

SOARES, 2008).

2.1.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade

A transmissão do rotavírus é feita pela via fecal-oral. No entanto, considerando-se

que a taxa de infecção é extremamente alta em todo mundo, tem-se especulado que a

transmissão pode ocorrer também por via respiratória. O período de incubação da doença

varia de um a três dias e a transmissibilidade se dá com a máxima excreção nas fezes entre o

primeiro e quarto dia do início dos sintomas (ANDERSON; WEBER, 2004; RIBEIRO, 2006;

SANTOS; SOARES, 2008).

Os mecanismos de ação patogênica do rotavírus não são bem definidos. Sabe-se

que a sua replicação produz alterações histopatológicas restritas ao intestino delgado, que são

mais pronunciadas nas porções do jejuno e do íleo, nas células epiteliais maduras (enterócitos)

onde a adsorção do vírus acontece (FERNANDES et al., 2000). Nesses sítios de ocorrência da

multiplicação viral, nota-se hiperplasia das glândulas do intestino associada ao encurtamento,

atrofia e desnudamento das vilosidades intestinais, hipertrofia das criptas, infiltração das

células mononucleadas na lâmina própria, dilatação das cisternas do retículo endoplasmático,

dilatação mitocondrial e escassez das microvilosidades (KAPIKIAN; HOSHINO;

CHANOCK, 2001; ESTES, 2001).

As manifestações clínicas mais frequentes são vômitos, febre, dor abdominal e

desidratação. A infecção é autolimitada e após um período de uma semana a dez dias o quadro

se resolve com a completa recuperação da morfologia, função intestinal e secreção de

anticorpos circulantes. O grande problema é quando a doença está associada à desnutrição ou

a quadros graves de desidratação, ou ainda associada à falta de tratamento adequado, o que

pode levar à morte (ESTES et al., 2001).

22

A severidade da doença parece ser influenciada pela idade do paciente. Em

neonatos, a infecção é assintomática ou resulta numa diarreia branda, possivelmente devido à

proteção dos anticorpos maternos adquiridos através do aleitamento materno. As primeiras

infecções sintomáticas geralmente são mais severas e ocorrem entre os 6 e 24 meses de idade,

com um pico de incidência aos 12 meses. Contudo, em locais onde a exposição é mais intensa

e na ausência do aleitamento materno, a doença pode ocorrer mais cedo. A alta prevalência de

anticorpos anti-rotavírus em adultos sugere que ocorram reinfecções subclínicas, apontando

assim, um papel potencialmente importante dos adultos na transmissão e manutenção dos

rotavírus na natureza (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001; SANTOS; SOARES,

2008).

A imunidade à infecção parece requerer, pelo menos parcialmente, a presença de

IgA no lúmen do intestino. Estas imunoglobulinas são anticorpos dirigidos contra a proteína

VP6 que podem ser adquiridos de forma ativa ou passiva, com a capacidade de diminuir a

gravidade da infecção, mas não impedem a reinfecção (GLASS et al., 2005). De acordo com

Linhares e Bresser (2000) e Linhares et al (2002), a imunidade de mucosas, mediada pela IgA

secretora, parece desempenhar papel mais relevante do que a imunidade humoral na proteção

contra os rotavírus.

2.1.2 Epidemiologia

A infecção por rotavírus representa a causa mais comum de diarreia grave na

infância em todo o mundo. Ocorrem por ano cerca de 114 milhões de episódios diarreicos, 24

milhões de consultas ambulatoriais e 2,4 milhões de hospitalizações, com a taxa da doença

semelhante em ambos os países desenvolvidos e em desenvolvimento. Em 2008, o

rotavírus foi responsável por quase 400.000 óbitos, e 4% da mortalidade global ocorreu entre

crianças com idades inferiores a 5 anos (CHANDRAN et al., 2010).

Estima-se que de 54 a 55 mil crianças que são hospitalizadas por diarreia,

anualmente nos EUA, menos de 40 morrem pela infecção por rotavírus. No entanto, a

mortalidade é predominante nos países em desenvolvimento onde o acesso aos cuidados é

limitado e os fatores de risco para doença são elevados (CHANDRAN et al., 2010;

OLIVEIRA; MELO; SIMONETTI, 2010). Cerca de 90% dessas mortes ocorrem na África e

Ásia; mais de 100.000 ocorrem na Índia e África subsaariana e 35.000 ocorrem na China,

enquanto que menos de 1.000 mortes por rotavírus ocorrem em países de alta renda

23

(SANTOS; SOARES, 2008; CHANDRAN et al., 2010). A Figura 2 mostra a incidência de

casos de mortes por região do mundo.

Figura 2 - Incidência estimada dos casos fatais de diarreia por rotavírus para cada 100.000

crianças menores de 5 anos.

Fonte: CHANDRAN et al., 2010.

Nos países em desenvolvimento, a idade média da infecção grave está entre 6 a 9

meses, enquanto nos países industrializados está entre 9 a 15 meses. Em contrapartida, as

crianças mais velhas estão protegidas contra a doença grave pela exposição anterior e

infecção aparente e se ocorrer, ela é geralmente leve. Da mesma forma, a doença pode ocorrer

em recém-nascidos e lactentes de 3-4 meses, mas é geralmente leve ou assintomática. As

rotaviroses também mostram uma grande variação sazonal em países de clima temperado de

alta renda, com uma maior ocorrência durante o inverno; enquanto que a sazonalidade é

menos acentuada em países de clima tropical e de baixa renda (FARHAT; CARVALHO;

SUCCI, 2007; CHANDRAN et al., 2010).

Em termos gerais, a frequência de diarreias associadas aos rotavírus variou de

12% a 42% e considerando as médias dos índices de positividade por região, ressalta-se

36,5% para a região norte e 25%, 24%, 22% e 42%, para as regiões nordeste, centro-oeste,

sudeste e sul, respectivamente (LUZ et al., 2005; CARMO, 2006). No entanto, desde que as

vacinas foram introduzidas em 2006, houve uma redução global nas consultas e

hospitalizações causadas por diarreia com as maiores reduções em crianças com idade inferior

a 5 anos, isso pode ser resultado de vacinação e saneamento básico (GURGEL et al., 2009).

24

Devido ao elevado impacto da rotavirose em todo o mundo e ao esforço da

comunidade científica para o desenvolvimento de medidas de prevenção seguras e eficientes,

diversos programas de vigilância epidemiológica tem sido criados com o objetivo de

monitorar a diversidade dos rotavírus que circulam na população (SANTOS; SOARES,

2008).

Os dados publicados até o momento demonstram que os rotavírus do grupo A,

com especificidade G1P[8], G2P[4], G3P[8] e G4P[8], são responsáveis por 92% das

infecções entre humanos. E recentemente, tem sido observado um aumento da incidência de

infecções por rotavírus, com especificidade G9P[8] ou G9P[6]. As infecções por rotavírus dos

grupos B e C em humanos não parecem ser epidemiologicamente importantes, exceto na

China, onde os rotavírus do grupo B estão associados a diversos surtos de diarreia grave,

predominantemente em adultos (SANTOS; SOARES, 2008).

A mais extensa investigação realizada no Brasil, com vistas à caracterização

genotípica do rotavírus, abrangeu nove estados, além do Distrito Federal, e os achados foram

os que seguem: G1[P8]: 43%; G2[P4]: 12%; G3[P8]: 6% e G4[P8]: 6%. Estudo longitudinal

realizado na região norte, no período de 1983 a 1985, também observou que os tipos G1 e G2

prevaleceram com 50% e 30%, respectivamente. Por outro lado, estudo subsequente,

realizado no período de 1992 a 1994, revelou inversão, predominando o tipo G2 com 80%,

seguido do G1 com 20% (MUNFORD et al., 2007; ARAÚJO et al., 2010).

2.1.3 Diagnóstico Laboratorial

A doença diarreica causada pelos rotavírus não gera sintomas característicos e

específicos suficientes para que se possa fechar um diagnóstico apenas com base nas

manifestações clínicas. Isso porque outros agentes etiológicos também causam sintomas de

gastroenterites semelhantes aos causados durante uma infecção por rotavírus, o que torna

imprescindível o diagnóstico laboratorial para a definição do agente causador (ESTES, 2001;

FISCHER; GENTSCH, 2004; ESTES; KAPIKIAN, 2007).

A altíssima concentração de partículas de rotavírus excretadas nas fezes durante a

fase aguda da enfermidade possibilitou a padronização de metodologias rápidas para o

diagnóstico laboratorial feito diretamente a partir de amostras fecais, utilizando técnicas

imunológicas e não imunológicas como o ensaio imunoenzimático (EIE), a aglutinação de

partículas de látex e a EGPA (LUZ et al., 2005; SILVEIRA 2005). Outras técnicas, incluindo

25

microscopia eletrônica, RT-PCR e cultura são usadas principalmente em centros de pesquisas

(CIARLET; ESTES, 2001; MASCARENHAS et al., 2002; LANDAETA et al., 2003).

2.1.4 Prevenção, Controle e Tratamento

Apesar das medidas de higiene se mostrarem pouco eficazes na prevenção da

doença diarreica por rotavírus, algumas medidas são estabelecidas como conduta para o

controle da doença, como o saneamento básico, a utilização de água tratada, o destino

adequado de dejetos, a desinfecção concorrente de superfícies e objetos que entram em

contato com fezes humanas, no entanto, o conceito de que o recurso mais efetivo de profilaxia

das diarréias por rotavírus reside na obtenção de uma imunização eficaz (ESTES et al., 2001;

RIBEIRO, 2006).

A primeira vacina contra rotavírus foi licenciada nos EUA em 1998, nomeada

como RotaShield®. Era uma vacina oral atenuada tetravalente, com rearranjo símio e

humano, contendo os antígenos G1 a G4, aplicada no esquema de três doses aos 2, 4 e 6

meses de idade. Os estudos realizados sugeriram uma baixa reatividade da vacina o que a

tornaria segura para uso em crianças. Porém, em 1999, a vacina foi suspensa, depois que se

encontrou uma associação entre a sua utilização e um tipo raro de intussuscepção intestinal

que é uma forma de obstrução intestinal na qual um segmento do intestino invagina sobre o

outro segmento, localizado mais distalmente, causando obstrução intestinal e compressão

vascular da alça invaginada. Com isso, foram reiniciadas as pesquisas com a finalidade de

desenvolver uma vacina mais segura e eficaz (LINHARES, 2000; GLASS, 2006).

Assim, a GlaxoSmithKline lançou, em 2004, a vacina RotaRix®, que foi testada

principalmente na América Latina, que determinou a segurança da vacina em relação ao risco

de intussuscepção e uma eficácia de 85% até 100% nos casos de gastroenterite grave, além de

reduzir significativamente o número de infecções. É uma vacina monovalente, e tem como

base uma amostra isolada de humano atenuada, com especificidade G1[P8], cepa RIX4414

(BRASIL, 2006; RUIZ-PALACIOS et al., 2006).

Outra vacina, denominada Rotateq®, desenvolvida pela MerkSharpDome, foi

licenciada para comercialização nos Estados Unidos pela FDA (Food and Drug

Administration) em fevereiro de 2006. É uma vacina pentavalente, preparada a partir de

recombinantes de rotavírus de bovino (cepa WC3) e de humanos. Desse modo, cada um dos

vírus recombinantes contém um gene que codifica uma variante da proteína VP7 que confere

imunidade contra os genótipos G1, G2, G3 e G4, além de carregar um gene de vírus humano

26

na forma de P[8] da proteína VP4. É administrada por via oral em três doses, a primeira entre

6 a 12 semanas de idade e as doses subsequentes com 4 a 10 semanas de intervalo (GLASS,

2006). Esta se revelou 94,5% eficaz frente às hospitalizações e consultas nas emergências

relacionadas aos tipos virais G1 a G4, reduziu em 74% as gastroenterites associadas a esses

sorotipos e exibiu níveis protetores de 98% referentes aos episódios graves causados por

rotavírus (VESIKARI et al., 2006).

O tratamento é sintomático, consistindo em reposição de fluídos e eletrólitos

perdidos por vômito e diarreia. Não se recomenda o uso de antimicrobianos, antidiarreicos e

não há terapêutica específica para combater os rotavírus (SANTOS; SOARES, 2008).

Entretanto, uma droga recentemente lançada no mercado, denominada nitazoxanida, com

nome de fantasia Annita®, já em utilização para tratamento de várias parasitoses, tem sido

indicada para tratamento de rotavírus e norovírus. Segundo alguns estudos, essa droga

mostrou ser efetiva na redução do tempo de duração da doença, com atividade anti‐viral

decorrente de um mecanismo de provável atuação na síntese da proteína viral, inibindo a

replicação viral, e podendo reduzir a excreção do vírus (ROSSIGNOL; EL-GOHARY, 2006).

2.2 Adenovírus

Embora os adenovírus humanos sejam mais associados a infecções respiratórias, a

relação entre estes e a doença diarreica tem uma história longa e complicada porque muitos

adenovírus são replicados no intestino e são excretados nas fezes, sem que a doença diarreica

seja observada. No entanto, alguns sorotipos causam gastroenterites e são considerados

relevantes em surtos esporádicos de gastroenterites agudas no mundo afetando jovens e

adultos. Atualmente, os adenovírus entéricos são considerados agentes etiológicos

importantes da doença diarreica infantil em todo o mundo (HORWITZ, 2001; SOARES et al.,

2002).

Os adenovírus entéricos fazem parte da família Adenoviridae e do gênero

Mastadenovírus, constituído de 51 sorotipos humanos classificados em seis espécies de A a F

de acordo com as suas propriedades físico-químicas, imunológicas e bioquímicas. A espécie F

é formada por sorotipos de adenovírus entéricos 40 e 41 que crescem em culturas celulares

(HORWITZ, 2001; JONES, 2007).

As partículas virais são icosaédricas, não possuem envelope lipídico, com

aproximadamente 90 nm de diâmetro. O virion consiste em um capsídio proteico que envolve

um core contendo o DNA viral. O capsídio é constituído de 252 capsômeros, 240 do tipo

27

hexon que formam as 20 faces triangulares do icosaedro e 12 do tipo penton que formam os

vértices do icosaedro (TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005).

O virion possui 11 proteínas, as quais são convencionalmente numeradas

iniciando pelo polipeptídio II a IX, IIIa, µ, TP (proteína terminal) e mais a p53 (protease

viral). Sete desses peptídeos formam o capsídio: o hexon é formado pelo trímero do

polipeptídio II, unido por ligações covalentes. O penton consiste em duas estruturas distintas:

a base que é um pentâmero do polipeptídio III e é responsável por ancorar o penton ao

capsídio. Da base de cada penton projeta-se uma estrutura protéica denominada fibra, um

trímero do polipeptídio IV, que apresenta na sua extremidade sendo uma protuberância que

possui propriedade imunogênica e função de adsorção do vírus à célula hospedeira

(TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005). Os polipeptídios VI, VIII e IX estabilizam as faces

do capsídio e interagem com o hexon na face externa do capsídio. O core da partícula viral

consiste em cinco proteínas: os polipeptídios V, VII, µ, TP e p23 (protease) (Figura 3)

(SANTOS; SOARES, 2008).

Figura 3 – Representação da partícula de adenovírus.

O genoma é composto por DNA de fita dupla, linear e não-segmentado, com

aproximadamente 36.000 pares de bases (pb). Nas extremidades do DNA, há sequências

terminais (3’e 5’) repetidas e invertidas que variam de tamanho de acordo com o sorotipo de

adenovírus. Essas regiões invertidas permitem a circularização da fita simples do DNA viral

Fonte: SANTOS; SOARES, 2008.

28

que formam uma estrutura redobrada, importante para a replicação do genoma (SANTOS;

SOARES, 2008).

A sequência do DNA viral é bastante conservada entre todos adenovírus e

codifica proteínas estruturais, além de proteínas envolvidas na replicação do DNA e

montagem do vírus. O genoma codifica cinco unidades de transcrição iniciais (E1A, E1B, E2,

E3 e E4), três unidades iniciais tardias (IX, Iva2 e E2 tardio) e uma unidade tardia que em seu

processamento, gera cinco famílias de RNA mensageiros tardios (L1 a L5), todos transcritos

pela RNA polimerase II (SHENK, 2001).

O gene E1A codifica duas proteínas (253R e 191R) que ativam a transcrição de

outros genes; E1B codifica duas proteínas que bloqueiam a apoptose. E2 codifica proteínas

que sinalizam para a replicação do DNA, dessa forma na região E2A é codificada uma

proteína, DPB, que se liga a fita simples do DNA e na E2B uma DNA polimerase, além de

uma proteína precursora terminal. Os produtos de E3 modulam a resposta do hospedeiro para

a infecção viral. E4 possui cinco regiões de leitura aberta (ORFs), podendo variar com a

espécie, cujos produtos possuem funções de regulação transcricional, transporte de mRNA,

modulação da replicação do DNA e apoptose celular. As regiões iniciais tardias estabilizam as

interações hexon-hexon e ainda tem função na encapsidação do DNA e os mRNA tardios (L1

a L5) são responsáveis pela produção e montagem dos componentes do capsídeo (Figura 4)

(SHENK, 2001; REDDY et al., 2005).

Figura 4 – Organização genômica de adenovírus humano.

Fonte: DAVISON; BENKO; HARRACH, 2003.

29

2.2.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Diagnóstico

A transmissão dos adenovírus entéricos ocorre pela via fecal-oral, através de água

ou alimentos contaminados (BERK, 2007). E o período de incubação é de aproximadamente 8

dias. Essa infecção está menos associada à febre alta e desidratação do que a doença diarreica

causada por rotavírus, ou seja, caracteriza-se como uma doença branda; vômito e febre são

sintomas que podem preceder ou acompanhar a diarreia (HORWITZ, 2001; SANTOS;

SOARES, 2008).

Uma característica única do adenovírus é que a sua proteína estrutural penton tem

um efeito tóxico sobre as células mas a sua importância na doença não foi esclarecida. A

gastroenterite causada por adenovírus dos sorotipos 40 e 41 produz lesões no trato

gastrointestinal que levam a atrofia das vilosidades e hiperplasia compensatória das criptas,

com subsequente malabsorção e perda de fluidos (SANTOS; SOARES, 2008).

O cultivo celular, além de promover o isolamento viral, apresenta a vantagem de

aumentar a quantidade de partículas virais para posterior identificação por imunofluorescência

(IF), fixação do complemento (FC), inibição da hemaglutinação (HI) e soroneutralização (SN)

(HIERHOLZER, 1995).

A ME tem sido usada para detectar adenovírus tanto de material de cultivo quanto

de espécime clínico, onde se observa a morfologia característica destes agentes (FLEWETT et

al., 1975). A genotipagem das amostras isoladas de espécimes clínicos pode ser feita por

diversos métodos tais como sequenciamento do genoma viral, reação em cadeia de polimerase

(PCR), digestão enzimática do DNA total (RFLP-Restriction Fragment Length

Polymorphism) (LI et al., 2005).

2.2.2 Epidemiologia

Em geral, a gastroenterite associada a adenovírus é tão prevalente quanto a

causada por rotavírus e ocorre mais frequentemente em crianças com menos de 4 anos. Em

regiões de clima temperado, a prevalência de adenovírus entéricos é maior. No entanto, em

países de clima tropical, como o Brasil, adenovírus veiculados pela água têm sido detectados

durante todos os meses do ano (SOARES et al., 2002).

Sabe-se que os adenovírus apresentam maior estabilidade na água do que os

outros enterovírus, porém têm sido evidenciados poucos surtos de gastroenterites causados

por adenovírus associados a águas destinadas ao consumo humano (TAVARES; CARDOSO;

30

BRITO, 2005). Entretanto, várias espécies e sorotipos de adenovírus foram encontrados em

águas de instituíções públicas de diversões, incluindo os sorotipos 40 e 41, na região dos

grandes lagos nos EUA (XAGORAKI et al., 2007).

As taxas de adenovírus entéricos isolados de amostras de crianças com diarreia

aguda variam de 1,1% a 12% em todas as partes do mundo com predominância do sorotipo 41

(FUKUDA et al., 2006). No Brasil, pouco se sabe quanto a incidência desse vírus em

associação a quadros de diarreia. Além disso, são poucos os estudos que além de detecção têm

como objetivo a caracterização dos sorotipos isolados, o que ampliaria a visão epidemiológica

da doença. Apesar dessa dificuldade, foi demonstrada a circulação de adenovírus causando

diarreia na população com taxas de incidência aproximada a 4 e 6% (MAGALHÃES et al.,



As boas condições sanitárias e de higiene pessoal ainda são as melhores maneiras

para redução de casos. Até o momento não existe uma vacina contra a infecção entérica por

adenovírus, pois o risco para a população em geral é tão baixo que a vacinação não é uma

proposição viável (HORWITZ, 2001).

O tratamento das infecções entéricas por adenovírus é sintomático. É necessário o

diagnóstico precoce, o acesso rápido aos sistemas de saúde, para que se evite a desidratação

com reposição dos eletrólitos perdidos em decorrência de vômitos e diarreia constantes

(HORWITZ, 2001; DENNO et al., 2005).

2.3 Astrovírus

A primeira evidência da associação de astrovírus com casos de gastroenterite

aguda foi relatada por Appleton e Higgins, em 1975, em maternidade localizada no sul da

Inglaterra, onde observaram, por microscopia eletrônica, a presença de partículas virais

pequenas e sem nenhuma semelhança estrutural com os previamente identificados rotavírus e

norovírus. (SANTOS; CARDOSO, 2005).

Os Astrovírus pertencem à família Astroviridae que está dividida em dois

gêneros: Mamastrovírus e Avastrovírus. O gênero Mamastrovírus compreende todos os

astrovírus de mamíferos: os oito sorotipos de astrovírus humanos e aqueles que acometem

31

suínos, felinos, caninos, bovinos e ovinos. O gênero Avastrovírus engloba astrovírus que

infectam aves como patos, perus e galinhas (vírus da nefrite aviária) (LUKASHOV;

GOUDSMIT, 2000; WALTER; MITCHELL, 2003).

As partículas de astrovírus são esféricas, pequenas, com diâmetro de 28 nm a 30

nm. Não possuem envelope lipídico e são constituídos de capsídios icosaédricos formados por

dois ou três tipos de proteínas (P1, P2 e P3). Apresentam uma morfologia peculiar de estrela

de cinco a seis pontas que é observada somente em 10% das partículas virais quando

visualizadas sob microscopia eletrônica ou quando submetidas a soluções alcalinas

concentradas (SANTOS; SOARES, 2008).

O material genético é composto por uma molécula de RNA de fita simples

(ssRNA), linear de polaridade positiva, com aproximadamente 6.800 nucleotídios,

poliadenilada na sua extremidade 3’. O genoma dos astrovírus é composto por três ORFs,

denominadas ORF1a, ORF1b e ORF2. Cada uma delas codifica pelo menos uma poliproteína

viral (Figura 5) (MENDEZ et al., 2003).

Figura 5 - Representação esquemática do genoma dos astrovírus.


As ORF1a e ORF1b, localizadas próximas à extremidade 5’ do genoma, são

responsáveis pela codificação de uma poliproteína não-estrutural denominada NSP1ab de 160

kDa, a qual é clivada em duas proteínas NSP1a (103 kDa) e exibe uma sequência codificante

para a serina protease viral e uma outra de 57 kDa que apresenta motivos de uma RNA

polimerase-RNA dependente. A ORF2, localizada na terminação 3’ do genoma, codifica as

proteínas estruturais dos astrovírus (MATSUI; GREENBERG, 2001; MENDEZ et al., 2003).

32

2.3.1 Patogenia, Manifestações clínicas e Imunidade

As infecções por astrovírus são transmitidas pela via fecal-oral, geralmente

através do contato pessoa a pessoa ou por água e alimentos contaminados, acometendo uma

variada gama de populações. Entretanto, o grupo populacional mais afetado por essas

infecções são crianças menores de dois anos de idade (SANTOS et al., 2007).

A patogênese ainda não está totalmente esclarecida. No entanto, parece que a

patogênese de astrovírus associados à diarreia em humanos não é de natureza inflamatória e

que não há envolvimento gástrico, apenas células do intestino delgado são atingidas, com uma

extensão maior da infecção nas células do jejuno-íleo se comparadas com o duodeno


O período de incubação dos astrovírus varia de um a quatro dias. A enfermidade

causada pelo astrovírus é menos grave do que a causada pela infecção por rotavírus e se

resolve espontaneamente. A infecção produz um quadro de gastroenterite aguda, no qual o

sintoma típico é diarreia aquosa e leve que pode persistir por dois a três dias. Além disso,

outros sintomas como vômito, febre, anorexia e dor abdominal também são ocasionalmente

observados (SANTOS; CARDOSO, 2005).

Os aspectos determinantes na imunidade de astrovírus não são bem

compreendidos. Estudos sugerem que anticorpos adquiridos nos primeiros anos de vida

conferem proteção contra a doença impedindo reinfecções ocasionadas por este agente viral

até a fase adulta do indivíduo e que a imunidade relacionada com esses vírus tende a diminuir

em pessoas com idade mais avançada (MATSUI; GREENBERG, 2001).


Os astrovírus eram detectados em amostras fecais por microscopia eletrônica

(ME). Trata-se de um procedimento rápido que não exige partículas virais viáveis, mas requer

alta concentração de vírus no espécime clínico e um microscopista muito bem treinado

(MATSUI; GREENBERG, 2001; RÁCZ, 2004).

O diagnóstico também pode ser feito por ensaios imunoenzimáticos com o

emprego de anticorpos monoclonais ou policlonais detectando antígenos comuns a todos os

sorotipos de astrovírus; e, testes que empregam a aglutinação em látex que são considerados

procedimentos simples, rápidos, menos dispendiosos e com elevados índices de

especificidade, além de também permitirem a análise de grande número de amostras. Esses

33

testes, quando comparados à técnica de ME, revelam ser mais sensíveis e específicos

(KOMORIYA et al., 2003; SANTOS; CARDOSO, 2005).

O desenvolvimento de técnicas moleculares como RT-PCR permitiram um grande

avanço na detecção e na caracterização do genoma desses agentes por serem métodos bastante

sensíveis e específicos do que os testes imunoenzimáticos comerciais, embora seja vulnerável

à contaminação de seus produtos e à presença de agentes inibidores que podem produzir

resultados falso-negativos (TAI et al., 2003; GRIMM et al., 2004). Alguns pesquisadores

utilizam regiões conservadas da ORF1a como região alvo, outros grupos utilizam

oligonucleotídeos para uma região relativamente conservada dentro da região variável do

gene do capsídio que pode ser sequenciada para determinação do genótipo de astrovírus


2.3.3 Epidemiologia

Os astrovírus são reconhecidos como uma das causas mais comuns de

gastroenterite viral em crianças em todo mundo. Geralmente, a faixa etária em que mais se

observa infecção por este agente viral é a de crianças com menos de 5 anos de idade,

conforme já foi demonstrado em estudos realizados em vários países (DE GRAZIA et al.,

2004; GIORDANO et al., 2004). Estudos de soroprevalência também têm demonstrado que

até 90% das crianças nesta faixa etária já foram infectadas por este enteropatógeno

(MITCHELL, 2002).

Estudos realizados em países asiáticos demonstraram índices de detecção que

variaram de 4 a 11%, enquanto que em países do continente europeu a estimativa foi de 3% a

7%. Já na América Latina, segundo alguns estudos realizados, a ocorrência de astrovírus

variou de 4% a 17% (OH; GAEDICKE; SCHREIER, 2003; ESPUL et al., 2004; DE

GRAZIA et al., 2004; LIU et al., 2004; PHAN et al., 2004).

No Brasil, há poucos trabalhos descrevendo o papel dessa infecção. Até o ano de

2001, os poucos trabalhos que foram publicados utilizaram a microscopia eletrônica como

método de detecção, com uma taxa de detecção em torno de 2 a 5% (SILVA et al., 2001).

Com o advento de métodos mais sensíveis como os ensaios imunoenzimáticos as taxas

encontradas podem chegar a 9% de detecção. E com o emprego de técnicas moleculares a

importância dos astrovírus como agentes etiológicos de gastroenterite infantil só foi

reafirmada (SANTOS; SOARES, 2008).

34

A sazonalidade das infecções atribuídas a astrovírus parece variar de acordo com

a região geográfica. Os picos de incidência da doença ocorrem no inverno nas regiões

temperadas e nas estações chuvosas nos países tropicais (CARDOSO et al., 2002; GUIX et

al., 2002).

Apesar do sorotipo 1 (HastV-1) ser o tipo mais prevalente em vários países,

inclusive no Brasil, outros sorotipos também circulam na população, tendo sido já descritos os

sorotipos de 2 a 5 e 8 (SILVA et al., 2001; CARDOSO et al., 2002; DALTON et al., 2002;

DE GRAZIA et al., 2004).


As medidas que visam prevenir e controlar epidemias de gastroenterite viral

associada à astrovírus devem ter como foco a interrupção da transmissão por meio de ações

como: saneamento básico, boas práticas de higiene pessoal reforçadas em hospitais, creches e

controle de indivíduos que sejam manipuladores de alimentos, já que os astrovírus podem

começar a ser excretados pelas fezes um dia antes do surgimento da diarreia (MATSUI;

GREENBERG, 2001; WALTER; MITCHELL, 2003). Medidas efetivas e apropriadas de

isolamento de crianças que apresentem quadros diarreicos severos, assim como de pacientes

imunocomprometidos, são fundamentais para a prevenção de infecções nosocomiais

(MITCHELL, 2002).

Geralmente, a gastroenterite causada pelos astrovírus, não requer na maioria dos

casos, a utilização de uma terapia específica, a não ser em pacientes que ficam desidratados,

nos quais a reposição de eletrólitos e fluidos perdidos durante a doença se faz necessário

(MATSUI; GREENBERG, 2001; MITCHELL, 2002; WALTER; MITCHELL, 2003).

2.4 Norovírus

Estudos que utilizavam a imunoeletromicroscopia, em 1972, observaram uma

partícula viral pequena que foi relacionada com a doença ocorrida em 1968 na escola de

Norwalk, semelhante à síndrome descrita por Zahorsky em 1929, a qual foi denominada

agente Norwalk (LOPMAN; BROWN; KOOPMANS, 2002).

No entanto, somente em 1990, com a clonagem e caracterização do genoma do

vírus Norwalk é que ele foi caracterizado como membro da família Caliciviridae. Essa família

é composta por cinco gêneros: Norovírus, Lagovírus, Sapovírus, Vesivírus e Nebovírus. Os

35

vírus dos gêneros Lagovírus, Vesivírus e Nebovírus são até o momento, exclusivo de animais,

enquanto que os vírus dos gêneros Sapovírus e Norovírus, infectam principalmente seres

humanos (SANTOS; SOARES, 2008). Os norovírus são divididos em 5 genogrupos

geneticamente distintos (GI, GII, GIII, GIV e GV), com pelo menos 31 genótipos. Os

genogrupos GI e GII e GIV infectam humanos, com a predominância dos genogrupos GI e

GII. Os animais são infectados pelos genogrupos GIII (suínos e bovinos) e GV,

encontrando‐se GIV em cães (ATMAR; ESTES, 2006; VICTORIA et al., 2007B).

As partículas de norovírus apresentam cerca de 27-40 nm de diâmetro, capsídio de

simetria icosaédrica, não contém envelope lipídico e possuem material genético composto por

uma molécula de RNA fita simples, linear, de polaridade positiva poliadenilada com

aproximadamente 7,6 kb (ATMAR; ESTES, 2006).

O genoma é organizado em três ORFs distintas: a ORF1 codifica uma poliproteína

não estrutural de 1738 aminoácidos (aa) com um peso molecular de 193,5 kD. Essa

poliproteína contém regiões similares às proteínas 2C (helicase), 3C (cisteíno-protease) e 3D

(RNA polimerase-RNA dependente) dos picornavírus; a ORF2 codifica a proteína do capsídio

(VP1), com 530 aa (56,6 kD); a ORF3 considerada a região mais variável do genoma,codifica

uma proteína estrutural menor de 212 aa (22,5 kD) que está associada à estabilidade da VP1 e

possivelmente têm as funções de encapsidação do RNA viral e de regulagem da montagem do

vírus (Figura 6) (GLASS et al., 2000; GREEN et al., 2000).

Figura 6 – Representação esquemática do genoma dos norovírus.


36

2.4.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade

Sobre a patogênese da infecção por norovírus, sabe-se que é proveniente de

estudos em voluntários. Com base nesses estudos, a infecção é autolimitada, com duração dos

sintomas de 24 a 48 horas, precedidos de um período de incubação semelhante (TAVARES;

CARDOSO; BRITO, 2005). São transmitidos primariamente por via fecal‐oral, por consumo

de água ou alimentos contaminados com fezes humanas (principalmente crustáceos), ou

diretamente disseminados de pessoa para pessoa. Contaminação ambiental por esgotos ou de

objetos que podem ser levados à boca também são fontes de infecção. Aerossóis gerados

durante os episódios de vômitos podem contaminar as superfícies ou alcançarem a mucosa

oral e serem engolidas explicam a rápida disseminação em hospitais e intradomicílios


O sítio primário de replicação no homem não é bem conhecido, mas com base em

estudos da biópsia intestinal de voluntários, na fase aguda da doença, a mucosa intestinal

apresentou anormalidades como achatamento e alargamento das vilosidades do intestino

delgado, desorganização das células epiteliais e infiltração da lâmina própria por células

mononucleares. Observou-se também uma dilatação do retículo endoplasmático liso e rugoso

com concomitante aumento no número de corpos multivesiculados. Houve também um

decréscimo significativo da atividade enzimática condizentes com a lesão histológica

transitória descrita anteriormente que voltou ao normal após a recuperação (BORGES;

CARDOSO, 2005; SANTOS; SOARES, 2008).

A doença é caracterizada por náusea, vômito, diarreia, dores epigástrica e

abdominal. Podem ocorrer também dores musculares, sensação de fadiga, cefaleia e febre

baixa. Um alto percentual de casos pode apresentar apenas vômitos, frequentemente muito

intensos. Embora esses sintomas sejam vistos em pacientes de todas as faixas etárias, o

vômito é mais frequente entre as crianças e a diarreia, entre adultos. Estudos mostram que em

30% das infecções os casos são assintomáticos (CHRIS, 2003; ATMAR et al., 2008).

Todos os indivíduos são susceptíveis. Mecanismos de imunidade não são claros, e

ocorrem reinfecções, devido inclusive, à grande variedade genética. Observa‐se uma curta

imunidade por um período de 14 semanas. Níveis de anticorpos pré‐existentes ao norovírus

não indicam o grau de susceptibilidade ou resistência (ATMAR; ESTES, 2006).

37

2.4.2 Epidemiologia

Os norovírus têm sido descritos como importantes agentes etiológicos de

gastroenterite aguda em todos os países estudados. São responsáveis por grandes surtos

epidêmicos de gastroenterite não-bacteriana, acometendo pessoas de todas as idades, uma

característica que os distingue de outros vírus causadores de gastroenterite, como os rotavírus,

adenovírus e astrovírus que infectam preferencialmente crianças de até 5 anos de idade

(GLASS et al., 2000).

A gastroenterite causada por infecções por norovírus é descrita como uma

síndrome que apresenta um perfil sazonal bem definido, ocorrendo nos meses mais frios do

ano (MOUNTS et al., 2000). Porém, Loopman et al., em 2004, em estudo desenvolvido na

Europa, observaram uma sazonalidade de uma amostras mutante do GII, que foi detectado

pela primeira vez em janeiro de 2002, com um pico atípico na primavera.

Estudos de surtos e casos esporádicos no mundo todo revelam taxas de incidência

de norovírus muito variadas, dependendo do país, da população estudada e dos métodos de

detecção utilizados. De 1999 a 2008, entre o total de surtos de doenças de transmissão hídrica

e alimentar (DTA) notificados em São Paulo, foram diagnosticados apenas 3 surtos (0,1%)

por norovírus, com 254 (9,4%) casos identificados a partir da padronização e implantação da

técnica de RT‐PCR no Instituto Adolfo Lutz (IAL) para diagnóstico do norovírus (MORILLO

et al., 2008). Já Ribeiro et al., 2008, através da mesma técnica de RT-PCR, observaram um

percentual de 39,7% de norovírus em amostras fecais de crianças com gastroenterite aguda

hospitalizadas na cidade de Vitória, Espírito Santo, entre julho de 2004 a novembro de 2006.

Por outro lado, os dados epidemiológicos das infecções por norovírus mostram

que apesar de ocorrer a cocirculação de genogrupos, o genogrupo II é predominante na

Europa e no resto do mundo (BUESA et al., 2002).


O diagnóstico laboratorial hoje em uso compreende tanto ensaios moleculares

quanto não moleculares. Dentre os ensaios não moleculares, tem-se a microscopia eletrônica,

a imunomicroscopia eletrônica, o radioimunoensaio e o ensaio imunoenzimático (ATMAR;

ESTES, 2001; KOOPMANS et al., 2002; RICHARDS et al., 2003).

No entanto, esses testes são menos efetivos em função da diversidade molecular

desses vírus o que leva a uma baixa detecção de antígenos e à necessidade de um painel de

38

antissoros hiperimunes para múltiplos tipos antigênicos dos calicivírus humanos (GUO et al.,

2000).

Desde a década de 90, com a disponibilidade de técnicas moleculares de

amplificação, sequenciamento e expressão genômica, tem sido possível a caracterização

genômica e antigênica dos calicivírus humanos. O ensaio de hibridização e a RT-PCR têm

sido os métodos mais utilizados para detecção de genoma de calicivírus em amostras clínicas

e ambientais. Em comparação com os EIE, a RT-PCR e suas variações é muito mais sensível

e mais rápida, e ainda é usada para identificação dos genogrupos de norovírus (TRUJILLO;

MCCAUSTLAND; ZHENG, 2006).


A fonte primária mais comum dos surtos tem sido a água, tais como a água de

abastecimento de cidades, lagos, piscinas, água armazenada por navios, etc. Por isso conhecer

a origem da contaminação dos alimentos tem sido importante para a prevenção e controle das

infecções por norovírus. Frutas, verduras, legumes e frutos do mar, ingeridos crus ou mal

cozidos, são frequentemente implicados em surtos de origem alimentar, por isso cuidados

especiais devem ser tomados para o processamento higiênico de alimentos (LOPMAN et al.,

2004).

O principal tratamento para as gastroenterites virais consiste de hidratação e

reposição de eletrólitos, por meio de sais orais ou soro caseiro, e hidratação endovenosa nos

casos mais graves. Não há vacina para prevenir o norovírus, assim como não há um

medicamento específico desenvolvido para este vírus (SANTOS; SOARES, 2008).

2.5 Aichi vírus

O Aichi vírus foi isolado pela primeira vez em 1989 a partir de uma amostra de

fezes de um paciente com gastroenterite não bacteriana associada ao consumo de ostras na

província de Aichi, no Japão (YAMASHITA et al., 1991). Em 1993, Yamashita e

colaboradores relataram que no Japão, 32% das amostras de fezes coletadas em um surto de

gastroenterite apresentaram antígenos específicos do vírus, sugerindo que infecções com este

agente são bastante frequentes (YAMASHITA et al., 1993). O vírus também foi isolado de

crianças paquistanesas e de turistas que retornaram de países do Sudeste Asiático,com

sintomas de gastroenterite (YAMASHITA et al., 1995). Desde então, estes vírus foram

39

associados com casos de gastroenterite em adultos e crianças em diferentes países da Europa,

Norte da África e América do Sul (OH et al., 2006; LE GUYADER et al., 2008; SDIRI-

LOULIZI et al., 2008).

É um membro do gênero Kobuvírus da família Picornaviridae. Quando

examinado por microscopia eletrônica é morfologicamente semelhante aos astrovírus:

pequeno, redondo, sem envelope com cerca de 30nm de diâmetro. Seu genoma consiste de

uma molécula de RNA fita simples de sentido positivo de 8.280 nucleotídeos e uma

extremidade de poliadenilada. A única grande ORF codifica uma poliproteína de 2.432

aminoácidos que é clivada resultando nas proteínas estruturais VP0, VP3, VP1, e nas

proteínas não estruturais 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C e 3D do típico picornavírus (YAMASHITA

et al., 1998; SASAKI et al., 2001).

Com base na análise filogenética da sequência de 519 pb na junção 3C-3D (3CD)

de 17 isolados, Yamashita et al. (2000) propuseram que o Aichi vírus pode ser dividido em

dois genótipos A e B, com homologia de aproximadamente 90%. Recentemente, um terceiro

genótipo (C) foi proposto. A análise filogenética de 13 cepas de Aichi vírus usando uma

sequência do gene VP1 de 699 pb mostrou uma boa correlação com o sistema de classificação

3C/3D, apoiando a proposta do terceiro genótipo (AMBERT-BALAY et al., 2008).

A presença do Aichi vírus em amostras pediátricas e em um surto, não associados

com o consumo de ostras, pode significar que o Aichi vírus poderia ser transmitido por outras

vias além do consumo de ostras (YAMASHITA et al., 2000; OH et al., 2006; PHAM et al.,

2007; AMBERT-BALAY et al., 2008).

Reuter et al. (2009) propôs duas hipóteses possíveis: 1) infecção por Aichi vírus pode

ser geralmente assintomática, e 2) a infecção por Aichi vírus é sintomática, mas também é

associada a outros sintomas, em vez de só gastroenterite, porém mais estudos devem ser

realizados para que se possa avaliar o significado clínico desses vírus.

A alta prevalência de anticorpos contra Aichi vírus na população em comparação

com a taxa de detecção em casos de gastroenterite levanta questões sobre a etiologia,

virulência e patogenicidade de Aichi vírus em gastroenterite sintomática (OH et al., 2006;

AMBERT-BALAY et al., 2008; REUTER et al., 2009). E embora o Aichi vírus seja detectado

em casos esporádicos de gastroenterite em adultos, acredita-se que a exposição ao vírus

ocorre principalmente durante a infância, com soroprevalência de anticorpos contra Aichi

vírus aumentando com a idade (YAMASHITA et al., 1993; YAMASHITA et al., 2000; OH et

al., 2006).

40

2.5.1 Epidemiologia

Pouco se sabe sobre a epidemiologia do Aichi vírus, pois poucos estudos sobre a

soroprevalência de anticorpos têm sido realizados para avaliar a importância epidemiológica

do vírus. No entanto, no Japão, o uso do ELISA mostrou a presença do vírus em 18,8% dos

pacientes adultos envolvidos em surtos de gastroenterite. Em outro estudo o RNA viral foi

detectado por RT-PCR em 20,5% dos adultos japoneses envolvidos em surtos de

gastroenterite. Na Alemanha, o Aichi vírus foi detectado em amostras de fezes de pacientes

envolvidos em um surto. Este vírus também foi isolado de casos esporádicos de gastroenterite

em crianças e adultos em países asiáticos e no Brasil (YAMASHITA et al., 1993;

YAMASHITA et al., 1995; YAMASHITA et al., 2000; OH et al., 2006).


Até agora, a maioria dos estudos tem utilizado a RT-PCR para a detecção do RNA

de Aichi vírus. Os primers para a RT-PCR são desenhados na junção 3C/3D do genoma do

Aichi vírus. O par de primers 6261-6779 produz um fragmento de DNAc de 519 pb que

também é usado para genotipagem molecular das cepas de Aichi vírus (YAMASHITA et al

2000).


Saneamento básico e boas práticas de higiene pessoal são as principais medidas de

prevenção e controle das infecções gastrointestinais e no caso das infecções causadas por

Aichi vírus, já foram descritos surtos epidemiológicos de Aichi vírus associados à ingestão de

ostras, portanto esse tipo de alimento deve ser bem cozido e preparado com cuidado, uma vez

que são capazes de concentrar microrganismos patogênicos, especialmente quando extraído

ou cultivado em regiões costeiras contaminadas por esgotos (YAMASHITA et al., 1995;

TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005).

Nenhum tratamento específico é necessário, a não ser em pacientes que ficam

desidratados, nos quais a reposição de fluidos e eletrólitos perdidos durante a doença se faz

necessário, por meio de sais orais ou soro caseiro (SANTOS; SOARES, 2008).

41

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Detectar a presença de rotavírus, adenovírus, astrovírus, norovírus e Aichi vírus

em amostras de fezes de crianças com ou sem gastroenterite aguda, menores de 5 anos de

idade, em São Luís - MA.

3.2 Específicos

Avaliar a incidência dos vírus entéricos em crianças atendidas em postos localizados

na comunidade do bairro da Cidade Olímpica e em dois hospitais públicos de São

Luís - MA;

Investigar a ocorrência de sazonalidade das infecções causadas por vírus entéricos

em relação à pluviosidade no período estudado;

Caracterizar as amostras positivas de rotavírus quanto ao seu fenótipo e genótipo.

42

4 METODOLOGIA

4.1 Área de estudo e pacientes

O estudo foi realizado na área metropolitana de São Luís, capital do Estado do

Maranhão, que possui uma população estimada em 966.989 habitantes em uma área de

827km2

(IBGE, 2010). O clima é tropical, quente e úmido, com uma pluviosidade total

durante o período de estudo de 4.060 mm (variando de 0,2 a 484 mm por mês). Possui apenas

duas estações, uma de chuvas (Janeiro a Junho) e outra de seca (Julho a Dezembro). As

temperaturas médias variaram entre de 24 oC a 29 ºC e com umidade relativa do ar alta

durante todo ano geralmente superior a 80% (Dados fornecidos pelo Laboratório de

Meteorologia da Universidade Estadual do Maranhão).

Foram analisadas, entre maio de 2009 e maio de 2011, 131 amostras fecais de

crianças menores de cinco anos de idade, atendidas em postos da pesquisa, localizados em

dois Hospitais Públicos de São Luís e na comunidade do bairro da Cidade Olímpica. No

momento de cada coleta os responsáveis preencheram uma ficha de identificação com

informações pessoais e clínicas do paciente e assinaram um termo de consentimento livre e

esclarecido (APÊNDICE A), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do UNICEUMA

(Nº do parecer consubstanciado: CEP 00559/09 – ANEXO A), concordando com a

participação das crianças na pesquisa. Foi estabelecido como caso de diarréia todas as

crianças que apresentaram três ou mais evacuações de fezes não formadas em um período de

24 h, até sete dias e foram incluídas como controle crianças que não tinham apresentado

distúrbios no trato intestinal nos últimos 30 dias que foram examinadas em razão de outros

motivos, que não eram distúrbios gastrointestinais.

4.2 Coleta e transporte

As amostras fecais foram coletadas em um recipiente plástico estéril e

transportadas em recipiente isotérmico, sob refrigeração, ao Laboratório de Microbiologia

Médica do UNICEUMA, aonde as mesmas foram devidamente registradas, rotuladas e

mantidas estocadas a -20 ºC até o momento da análise.

43

4.3 Extração do ácido nucleico

4.3.1 Preparo das suspensões fecais

Foram preparadas suspensões fecais de 10-20% das fezes semi-sólidas e 50% das

fezes líquidas em tampão fosfato salina (PBS) pH 7,4. Centrifugadas por 10 minutos a 3500 x

g (5500 rpm) e o sobrenadante estocado a -20 ºC até o momento do uso (SANTOS et al.,

2008).

4.3.2 Extração do DNA viral

Para a extração do DNA do adenovírus, 100 μL da suspensão foram colocadas em

tubo de microcentrífuga com água estéril (1 ml) e deixadas por 8 a 10 min em água em

ebulição. Em seguida estocados a -20 ºC até a análise.

4.3.3 Extração do RNA viral

O RNA viral (rotavírus, astrovírus, norovírus e Aichi vírus) foi extraído das

suspensões fecais seguindo o protocolo do kit QIAamp viral RNA (Qiagen), com todas as

etapas realizadas na capela de fluxo laminar.

Alíquotas de 140 µL de cada suspensão fecal foram adicionadas em um tubo de

microcentrífuga com 560 µL de tampão RNA Carrier-AVL. Cada tubo teve seu conteúdo

homogeneizado e a mistura incubada a temperatura ambiente (15º-25 ºC) por 10 min. Em

seguida, adicionou-se 560 µL de etanol absoluto e transferida 630 µL dessa mistura para uma

mini coluna (QIAamp). Após centrifugação a 6000 x g (8000 rpm) por 1 min, descartou-se o

filtrado coletado em tubo coletor e esse procedimento se repetiu por mais duas vezes. Para a

lavagem do RNA adicionou-se à mini coluna 500 µL de tampão AW1. Repetiu-se a mesma

centrifugação, descartando o filtrado. Logo após, adicionou-se 500 µL de tampão AW2

centrifugando a velocidade máxima por 3 min e desprezou-se novamente o filtrado. Para

eluição do RNA, adicionou-se à mini coluna 60 µL de tampão AVE e centrifugou-se a 6000 x

g (8000 rpm) por 1 min. O filtrado coletado em um tubo Eppendorf foi armazenado a -20 ºC.

44

4.4 Detecção inicial das amostras para rotavírus

Para a detecção inicial dos rotavírus, as amostras foram submetidas à técnica de

ELISA sandwich e a EGPA.

4.4.1 Detecção por ensaio imunoenzimático (ELISA)

Foram preparadas suspensões fecais a 10% em tampão de diluição de amostras,

conforme recomendações do fabricante do kit RIDASCREEN® (R-Biopharm). Estas foram

clarificadas por centrifugação a 3000 xg (5000 RPM) por 5 min. A seguir, adicionaram-se nos

poços da microplaca (poços sensibilizados com anticorpos monoclonais contra a proteína do

capsídeo do rotavírus -VP6), as suspensões fecais a serem testadas, os controles positivos e os

negativos. Nesta mesma etapa foi adicionado o conjugado (anticorpo monoclonal anti-

rotavírus, conjugado com peroxidase). A reação foi revelada com a solução substrato,

composta pelo cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) e pelo peróxido de hidrogênio (H2O2).

E quando apareceu uma tonalidade azul no controle positivo, a reação foi interrompida pela

adição do reagente bloqueador (ácido sulfúrico 1N), que mudou a cor azul para amarelo. A

leitura foi feita visualmente e por medida de densidade ótica (DO) em leitor

espectrofotômetro (PR2100 da BioRad), utilizando filtro simples no comprimento de onda de

450nm. As amostras foram consideradas positivas para rotavírus quando apresentaram DO

maior que o valor do ponto de corte (cut-off), calculado de acordo com a fórmula (valor de

absorbância do controle negativo + 0,15), respeitando uma margem de erro de 10%.

4.4.2 Detecção do dsRNA viral em gel de poliacrilamida (EGPA)

As amostras positivas para rotavírus foram submetidas à EGPA para a obtenção

dos perfis eletroforéticos de migração do dsRNA viral e realização do estudo fenotípico dessas

amostras, de acordo com a metodologia descrita previamente por Herring et al. (1982) e

Costa, Candeias e Capeletti (1990), com algumas modificações.

45

Montagem da placa vertical e preparação do gel de poliacrilamida

As placas de vidro para géis foram limpas com detergente, seguida de uma

solução de álcool a 70% e água destilada e então montadas, separadas por espaçadores de 0,75

mm dando forma ao gel.

Para preparação de um gel de 7,5% foram utilizadas (APÊNDICE B):

2,4 ml de água destilada;

1, 25 ml de Tris-HCL 1,5 M em pH 8,8;

50 µl de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 10%

1,25 ml de acrilamida/bis 30%;

50 µl de persulfato de amônia (PA) 10%

5 µl de TEMED (tetrametiletilenodiamina);

As soluções foram adicionadas nessa ordem, homogenizadas e imediatamente

vertidas até a borda do vidro menor, sem formar bolhas. Um pente de 0,75 mm de espessura

com dez dentes foi colocado entre as placas de vidro para a formação de canaletas, para a

aplicação das amostras. Deixando o gel polimerizar por 30 min.

Tratamento das amostras

Após esse período, 20 µL da amostra foi diluída em 20 µL do tampão de

tratamento das amostras (TTA), (água destilada, Tris-HCl pH 6,8, glicerol, SDS 10%, 2-β

Mercaptoetano, azul bromofenol 1%), seguida de homogenização e posterior incubação a

56ºC por 10 min e imediata aplicação em gel de poliacrilamida.

Eletroforese das amostras

Na sequência, foi retirado o pente e adicionado 20 μL de cada amostra em cada

canaleta do gel. Depois de todas as amostras colocadas, a fonte de energia foi ligada, e as

amostras corridas em tampão de corrida Tris/Glicina 1X com uma voltagem em torno de 60V-

80V e 30 mA. Após a saída do corante azul de bromofenol do gel, a fonte foi mantida ligada

46

por mais 1h para finalizar a corrida de eletroforese, com um tempo total de aproximadamente

5-6 horas.

Coloração do gel com nitrato de prata

Após a eletroforese, as placas foram retiradas da cuba e o pente removido

cuidadosamente para não causar danos ao gel e então às placas foram separadas. Fez-se uma

pequena marcação no gel recém retirado para que se pudesse identificar a ordem em que as

amostras foram adicionadas nas caneletas. Em seguida, transferido para um recipiente que

continha uma solução fixadora (etanol 10% e ácido acético 0,5%), agitando-o por 30 minutos.

A seguir, o gel foi submetido à coloração de nitrato de prata 0,01 M de acordo com Herring et

al. (1982) por mais 30 min, com agitações periódicas. Desprezou-se a solução corante e o gel

foi lavado com 500 mL de água destilada e remanejado para uma solução reveladora de

hidróxido de sódio (NaOH) 0,75 M e formaldeído 0,95%. Após o aparecimento das bandas a

revelação foi interrompida com a solução fixadora.

Secagem e Conservação do gel

Após esse procedimento, o gel foi desidratado. Duas folhas de celofane foram

embebidas no álcool 20%, uma das folhas de celofane foi usada para recobrir uma placa de

vidro, com o gel colocado sobre ela e sobre o gel foi colocada a outra folha de celofane. O gel

corado foi identificado, lido em um transluminador de luz branca e fotografado com câmara

digital para posterior análise.

4.5 Detecção do adenovírus humano

A detecção do adenovírus humano através da PCR foi realizada conforme

procedimento descrito por Allard, Albinsson e Wadell (2001): 0,6 µL de cada primer (0,5

μM) (Tabela 1), 2 µL MgCl2 (3 mM), 2,5 µL dNTPs (0,2 mM), 0,2µL Taq DNA polimerase

(5u/µL), 5 µL do tampão de reação 5X para um volume final de 25 μL com 7,5 μL do DNA.

Em cada reação foi utilizado água estéril como controle negativo e uma amostra

reconhecidamente positiva para adenovírus foi empregada como controle positivo. As

amostras foram amplificadas utilizando o termociclador (Mycycler Thermal Cycler – BioRad)

47

nas seguintes condições: um ciclo a 94 ºC por 3 minutos, 35 ciclos a 94 ºC por 30 segundos,

55 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 1 minuto e um ciclo final a 72 ºC por 5 minutos.

O produto amplificado foi verificado através de eletroforese a partir de gel de

agarose a 1,5% usando como corante o azul de bromofenol e como tampão de corrida o

Tri/Borato/EDTA (TBE) 0,5X. Após a corrida, as amostras foram coradas com brometo de

etídeo na concentração de 10 mg/mL de água e em seguida, o gel foi visualizado em

transluminador UV e fotodocumentado com câmara digital. Como padrão de peso molecular

em cada corrida eletroforética, foi utilizado o DNA ladder de 100 pb e 50 pb (Promega).

4.6 Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR)

A reação de RT-PCR foi feita conforme a recomendação do fabricante do kit

Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen), onde a transcrição reversa e a PCR foram realizadas de

forma sequencial no mesmo tubo. Todos os componentes necessários para ambas às reações

foram adicionados durante o procedimento, utilizando os primers específicos para cada

agente, citados na Tabela 1, com exceção dos primers para adenovírus.

A reação foi realizada em 25 μL da mistura de reação contendo 11,5 μL de água

estéril, 5 μL do tampão 5X, 1 μL da mistura de dNTPs (0,4 mM), 1 μL do mix de enzimas,

especialmente formulada tanto para a transcrição reversa e amplificação por PCR, 0,75 μL de

cada primer (0,6 mM), e 5 μl do RNA extraído.

Entretanto antes de se adicionar o mix de enzimas, essa mistura foi submetida à

temperatura de 97 °C por 5 minutos para desnaturação do RNA dupla-fita viral (dsRNA) do

rotavírus e a 80 ºC por 10 minutos para desnaturação do RNA fita simples (ssRNA) dos

outros enterovírus pesquisados (GOUVEA et al., 1990; NOEL et al.,1995).

Logo depois, os tubos de reação foram transferidos para banho de gelo por 5 min.

Em seguida, foi adicionado 1µL do mix de enzimas e então levados ao termociclador

(Mycycler Thermal Cycler – BioRad) e as condições de reação foram constituídas por uma

etapa de transcrição reversa, a 50 °C por 30 min, seguido por uma etapa inicial de

desnaturação do DNAc a 95 ºC por 15 min onde ocorreram também a inativação das

transcriptases reversas e ativação da HotStarTaq DNA polimerase. A partir daí, os ciclos

utilizados para PCR foram de acordo com os primers específicos utilizados para a pesquisa do

enteropatógeno viral.

48

Tabela 1 - Primers utilizados na detecção molecular dos vírus entéricos.

Agente Gene alvo ou

sequência específica Primers Sequência (5'-3')

Amplicon

(pb) Referências

Adenovírus Hexon hex1deg GCCSCARTGGKCWTACATGCACATC 301 (ALLARD et al., 2001)

hex2deg CAGCACSCCICGRATGTCAAA

Rotavírus Gene 4 Con 3 TGGCTTCGCCATTTTATAGACA 876 (GENTSCH et al., 1992)

Con 2 ATTTCGGACCATTTATAACC

Gene 9 (ou 8) Beg9 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG 1.062 (GOUVEA et al., 1990)

End9 GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG

Astrovírus ORF2 Mon 244 GGTGTCACAGGACCAAAACC 413 (NOEL et al., 1995)

Mon 245 TTAGTGAGCCACCAGCCATC

Norovírus Região do capsídeo G1SKF CTGCCCGAATTYGTAAATGA 330 (KOJIMA et al., 2002)

G1SKR CCAACCCARCCATTRTACA

G2SKF CNTGGGAGGGCGATCGCAA 344 (KOJIMA et al., 2002)

G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT

Aichi vírus RNA polymerase 6261 ACACTCCCACCTCCCGCCAGTA

519 (YAMASHITA et al., 2000) 6779 GGAAGAGCTGGGTGTCAAGA

49

4.6.1 Detecção de Rotavírus

Para a pesquisa de rotavírus foram utilizados os primers consensuais (Con2

e Con3) e (Beg9 e End9), que resultou em um produto de 876 pb e 1062 pb,

respectivamente.

Para o primer consensual (Con2 e Con3), a reação de PCR foi processada

através dos seguintes ciclos: 40 ciclos (94 ºC por 45 s, 50 °C por 45 s, e 72 °C por 60 s)

e ao final dos ciclos de amplificação, foram programados mais 10 minutos a 72 °C para

a extensão final das moléculas de DNAc amplificadas. Quando foi utilizado o primer

consensual (Beg9 e End9) às condições foram: 35 ciclos a 94 °C por 1 minuto, 42 °C

por 2 minutos e 72 °C por 1 minuto, um ciclo de extensão a 72 °C por 7 minutos. Para o

controle de qualidade de cada PCR, foram utilizados um controle negativo (água miliQ)

e um controle positivo (RNA preparado de uma amostra fecal reconhecidamente

positiva para rotavírus) (GOUVEA et al., 1990; GENTSCH et al., 1992; VAN DOORN

et al., 2009).

4.6.2 Detecção de Astrovírus

Foram utilizados para a detecção dos astrovírus, os primers específicos Mon

244 e Mon 245 direcionados para a ORF2 do genoma viral, conforme descrito por Noel

et al. (1995). E após as etapas de transcrição reversa e desnaturação inicial do DNAc às

condições de reação seguidas para a PCR foi de 40 ciclos de amplificação (94 ºC por 60

s, 50 ºC por 60 s e 72 ºC por 60 s), seguindo-se uma elongação final a 72 ºC por 10

minutos. Resultando em um produto final amplificado de 413 pb.

4.6.3 Detecção de Norovírus

Para a detecção de norovírus, utilizou-se separadamente os pares de primers

G1SKF / G1SKR e G2SKF / G2SKR, que amplificam um fragmento do gene do

capsídeo do genogrupo I (GI) e genogrupo II (GII), com um tamanho de 330 pb e 344

pb, respectivamente. As condições de reação foram às mesmas para ambos pares de

primers que após a transcrição reversa e a desnaturação inicial, segue os 40 ciclos de

amplificação da PCR (94° C por 30 s, 50 °C por 30 s, e 72 °C por 60 s) com um ciclo de

50

extensão final de 72 °C por 7 minutos (VINJE; KOOPMANS, 1996; KOJIMA et al.,

2002; SDIRI-LOULIZI et al., 2008).

4.6.4 Detecção de Aichi vírus

A pesquisa para Aichi vírus foi feita com o par de primers 6261 e 6779

descrita pelo Yamashita et al. (2000). Após as etapas de transcrição reversa e

desnaturação inicial do DNAc, seguiu-se os 40 ciclos de amplificação com desnaturação

a 95 °C por 30 s, anelamento a 55 °C por 30 s, e extensão a 72 °C por 60 s, com um

ciclo final de incubação a 72° C por 5 minutos. O produto de amplificação obtido foi de

519 pb de comprimento, na junção entre o terminal C do 3C e N-terminal de 3D

(AMBERT-BALAY et al., 2008).

4.6.5 Análise da Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR)

Os produtos obtidos foram visualizados em gel de agarose a 1,5% em

tampão de corrida TBE 0,5X, usando cuba de eletroforese horizontal, com corrida

eletroforética de 80 minutos sob tensão de 80 volts. O DNAc foi impregnado com

brometo de etídeo na concentração de 10 mg/mL de água para visualização sob ação de

luz ultravioleta e o gel foi foto documentado com câmera digital. Em cada corrida

eletroforética, foi utilizado o DNA ladder de 100 pb ou 50 pb ( Promega) como padrão

de peso molecular.

4.7 Genotipagem de Rotavírus

Após a realização da RT-PCR, procedeu-se a reação de semi-nested-PCR.

Foi utilizado 1 μL do produto da primeira amplificação para detecção de rotavírus como

molde para identificação dos genótipos P (VP4) e G (VP7), o qual foi adicionado a

mistura de reação para um volume final de 22 µL, utilizando primers específicos para os

diferentes genótipos P (Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1, 5T-1) e para os genótipos G

(End9, aAT8, aBT1, aCT2, aDT4, aET3 e aFT9) de acordo com a Tabela 2 (GOUVEA

et al., 1990; GENTSCH et al., 1992).

Foram adicionados 21 μL da seguinte mistura: 4,4 μL de tampão de reação

5x, 4,4 μL da mistura de dNTPs (0,4 mM), 2,2 μL de MgCl2 (2,5 mM), 0,8 µL de

51

primers específicos para cada genótipo (0,8 µM de cada) e 0,26 µL de Taq DNA

polimerase (5u/µL), completando o volume com água MiliQ. A seguir, os tubos foram

colocados no termociclador (Mycycler Thermal Cycler-BioRad) programado para 25

ciclos de PCR (94 ºC por 1 minuto, 50 ºC por 2 minutos e 72 ºC por mais um minuto) e

a uma incubação de extensão final de 72 ºC por 7 minutos.

Após a realização da segunda etapa de amplificação do DNA, 8 µL do

produto amplificado de cada amostra, misturado com 2 µL do azul de bromofenol foi

aplicado em gel de agarose a 2%, submetida a uma eletroforese de 80 volts durante

aproximadamente 80 minutos em tampão de corrida TBE 0,5X, em seguida, corado com

brometo de etídio na concentração de 10 mg/mL de água. Para cada gel foram aplicados

5μL do marcador de peso molecular com 100 pares de base (100 pb DNA Ladder-

Promega). O gel foi examinado e foto documentado com câmara digital para observação

do amplicon correspondente a cada genótipo de rotavírus pesquisado (Tabela 2).

Tabela 2- Sequência dos primers utilizados para a detecção do genótipo G e P do rotavírus.

Fonte: GOUVEA et al., 1990; GENTSCH et al.,1992.

Primers Posição Sequencia 5’-3’ Genótipo Tamanho

Beg9 1-28 GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG Consenso -

End9 1062-

1036 GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG Consenso 1062pb

aAT8 178-198 GTCACACCATTTGTAAATTCG G8 885pb

aBT1 314-335 CAAGTACTCAAATCAATGATGG G1 749pb

aCT2 411-435 CAATGATATTAACACATTTTCTGTG G2 652pb

aET3 689-709 CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG G3 374pb

aDT4 480-498 CGTTTCTGGTGAGGAGTTG G4 583pb

aFT9 757-776 ATC GAT GAT ACT ACA ACT AC G9 306pb

Con-2 868-887 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC Consenso -

Con-3 11-32 TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A Consenso 876pb

1T-1 339-356 TCTACTTGG ATA ACG TGC P[8] 345pb

2T-1 474-494 CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC P[4] 483pb

3T-1 259-278 TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA P[6] 267pb

4T-1 385-402 TGA GAC ATG CAAT TGG AC P[9] 391pb

5T-1 575-594 ATC ATA GTT AGT AGT CGC P[10] 583pb

52

4.8 Análise de dados

Os dados coletados foram agrupados e tabelados. Utilizou-se o programa

Excel for Windows® para a confecção de Figuras. Com o auxílio do programa

estatístico Bioestat 5.0 (2007), avaliou-se os dados através do teste de Qui-quadrado

(2) de Independência no cruzamento das variáveis classificatórias e a correlação de

Pearson no cruzamento das variáveis numéricas, índice pluviométrico e nº de vírus

detectados nas amostras. Em todos os testes o nível de significância aplicado foi de 5%,

ou seja, considerou-se significativo quando p < 0,05.

53

5 RESULTADOS

5.1 Detecção e distribuição dos vírus entéricos

Foram testadas para os vírus entéricos (rotavírus, adenovírus, astrovírus,

norovírus e Aichi vírus), 131 amostras fecais de crianças menores de cinco anos

atendidas entre maio de 2009 a maio de 2011. Setenta e seis pertenciam ao grupo caso

(37 do sexo feminino e 39 do sexo masculino) e 55 ao grupo controle (24 do sexo

feminino e 31 do sexo masculino).

Entre as 131 crianças testadas, 20 (26,3%) e 6 (10,9%) tiveram positividade

para um dos vírus entéricos pesquisados entre o grupo caso e controle respectivamente,

sendo mais frequente no grupo caso, conforme mostrado na Figura 7 mas sem

apresentar uma relação significante.

Figura 7- Percentual de crianças menores de 05 anos com positividade para um dos vírus

entéricos em São Luís - MA, entre maio de 2009 a maio de 2011.

2 = 3,84; p = 0,0500

A RT-PCR resultou em fragmentos de 1062 pb e 876 pb (rotavírus), 413 pb

(astrovírus), 519 pb (Aichi vírus). Já todas as 7 amostras detectadas para norovírus,

mostraram ser norovírus do genogrupo II com um fragmento de 344 pb. A PCR resultou

em um fragmento de 301 pb para adenovírus. Todos os fragmentos foram visualizados

em gel de agarose, apresentados na Figura 8.

0

5

10

15

20

25

30

CASO CONTROLE

Pe

rce

ntu

al d

e C

rian

ças

Grupos

Vírus Entéricos

54

Figura 8 - Gel de agarose 1,5% mostrando o perfil de detecção por RT-PCR e PCR específico

dos vírus entéricos causadores de gastroenterite em crianças < 05 anos em São Luís

– MA, entre maio de 2009 a maio de 2011. PM1: peso molecular (100pb), RV

1:

rotavírus (End9 / Beg9), RV2: rotavírus (Con2 e Con3), AdV : adenovírus 40/41,

HAst: astrovírus, Aich: Aichi vírus, NoV: norovírus (Genogrupo II) .

Os rotavírus, adenovírus e norovírus foram detectados em ambos os grupos

estudados, mas os rotavírus foram os únicos associados significativamente com

gastroenterites (p = 0,0465). A frequência de cada virus no grupo caso e no controle foi

respectivamente: rotavirus, 13,1% versus 1,8%; adenovirus, 5,3% versus 1,8%; and

norovirus, 4,0% versus 7,3%. Aichi virus (2,6%) e astrovirus (1,3%) foram detectados

somente em pacientes do grupo caso (Tabela 3).

55

Tabela 3 - Frequência de vírus entéricos em crianças menores de 05 anos com e sem

gastroenterite em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011.

As crianças com gastroenterite foram agrupadas nas seguintes faixas etárias:

0-6 meses (n = 11), 7-12 meses (n = 8), 13-24 meses (n = 21), 25-36 meses (n = 22) e de

37-59 meses (n = 14) e estes agrupamentos foram correlacionados com a freqüência de

amostras positivas para os enterovírus pesquisados (Tabela 4).

Vírus entéricos

Grupos

2 p

Caso

N = 76

Controle

N = 55

n (%) n (%)

Rotavirus 10 (13,1) 1 (1,8) 3,96 0,0465

Adenovirus 4 (5,3) 1 (1,8) 0,30 0,5798

Norovirus 3 (4,0) 4 (7,3) 0,19 0,6587

Aichi virus 2 (2,6) 0 (0,0) 0,24 0,6238

Astrovirus 1 (1,3) 0 (0,0) 0,02 0,8705

Total 20 (26,3) 6 (10,9) 3,84 0,0500

56

Tabela 4 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças com gastroenterite menores de 05 anos em São Luís – MA,

entre maio de 2009 a maio de 2011, distribuídos por faixa etária.

Faixa

etária*

(meses)

N.

N. (%) de infecções Total

n (%)

Rotavirus

Adenovirus

Norovirus

Aichi virus

Astrovirus

0-6 11 1 (9,1) - - - - - - - - 1 (9,1)

7-12 8 2 (25,0) 1 (12,5) 1 (12,5) - - - - 4 (50,0)

13-24 21 2 (9,5) 1 (4,7) 2 (9,5) 1 (4,7) - - 6 (28,5)

25-36 22 4 (18,2) 1 (4,5) - - 1 (4,5) 1 (4,5) 7 (31,8)

37-59 14 1 (7,1) 1 (7,1) - - - - - - 2 (14,3)

Total 76 10 (13,1) 4 (5,3) 3 (4,0) 2 (2,6) 1 (1,3) 20 (26,3)

* Teste de 2

de Independência, p > 0,05

Quanto à análise estatística das cinco faixas etárias, o estudo não revelou

correlação significativa entre os vírus entéricos estudados e a idade das crianças (p <

0,05) (Tabela 4). No entanto, os rotavírus foram detectados em todas as faixas etárias,

estando presentes em 9,1% das amostras fecais de crianças de 0-6 meses, 25% das

crianças de 7-12 meses, 9,5% das crianças de 13-24 meses, 18,2% das crianças de 25-36

meses e 7,1% das crianças de 37-59 meses.

A Tabela 5 apresenta a frequência dos vírus entéricos em relação ao sexo.

Também não se observou uma correlação significativa entre a detecção dos cinco vírus

pesquisados com o sexo.

57

Tabela 5 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças menores de 05 anos com gastroenterite

em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011, distribuídos por sexo.

Ao se investigar a ocorrência de sazonalidade dos vírus entéricos em relação

à pluviosidade, observou-se que não houve uma correlação (r = -0,021; p > 0,05) entre a

presença desses enterovírus detectados ao longo dos dois anos estudados, tanto para o

período chuvoso quanto o seco nas crianças com gastroenterite menores de 05 anos de

idade (Figura 9).

Vírus entéricos

Sexo

2 p

Feminino

N = 37

Masculino

N = 39

n (%) n (%)

Rotavirus 8 (21,6) 2 (5,1) 4,52 0,074

Adenovirus 3 (8,1) 1 (2,6) 1,17 0,5701

Norovirus 0 (0,0) 3 (7,7) 2,96 0,2576

Aichi virus 1 (2,8) 1 (2,6) 0,001 0,4971

Astrovirus 1 (2,8) 0 (0,0) 1,068 0,9789

Total 13 (35,1) 7 (18,0) 2,89 0,1498

58

Figura 9 - Variação sazonal na freqüência dos vírus entéricos detectados em 76 crianças

menores de 05 anos com gastroenterite em relação à pluviosidade em São Luís-

MA, entre maio de 2009 a maio de 2011.

Na Tabela 6 mostra a positividade de rotavírus nos grupos pesquisados em

relação ao estado vacinal. Das 131 crianças incluídas neste estudo, 44 (33,5%), foram

vacinadas, 61 (46,5%) não foram vacinadas e em 26 (20%) crianças os pais não sabiam

ou não informaram a situação vacinal. Das 11 (8,4%) crianças que foram positivas para

rotavírus, 7 delas (11,5%) não foram vacinadas, 2 (4,5%) foram vacinadas e 2 (7,7%) os

pais não sabiam ou não informaram o estado vacinal. Entretanto, não houve diferença

significativa entre os grupos caso e controle, em relação à positividade para rotavírus e

o estado vacinal (p = 0,2472, p = 0,7429, respectivamente).

0

1

2

3

4

5

6

0 100 200 300 400 500 600

Nu

mé

ro d

e v

íru

s

Índice pluviométrico (mm)

Sazonalidade

59

Tabela 6 – Detecção de rotavírus em crianças menores de 05 anos em São Luís – MA, entre

maio de 2009 a maio de 2011, distribuídas de acordo com o estado vacinal.

Grupo

Estado vacinal

Positivo/vacinado

No. (%)

Positivo/não vacinado

No. (%)

Não sabe

No. (%)

Total

No. (%)

*Caso 2/25 (8) 6/25(24) 2/26 (7,7) 10/76 (13,1)

**Controle 0/19 (0) 1/36 (2.8) - 1/55 (1,8)

Total 2/44 (4,5) 7/61 (11,5) 2/26 (7,7) 11/131 (8,4)

* Teste de 2

de Independência, p = 0, 2472 **p = 0,7429

5.2 Perfil eletroforético do genoma de Rotavírus

Através da EGPA foi possível se fazer a análise do genoma do rotavírus de

amostras positivas detectadas e confirmadas pelas técnicas de ELISA e RT-PCR. Das

11 amostras positivas, 4 amostras não apresentaram perfil de migração eletroforética,

portanto não foi possível se fazer a análise fenotípica dessas amostras, porém 7 amostras

revelaram um perfil de migração compatível com o fenótipo de rotavírus do grupo A do

tipo longo (4, 2, 3, 2). A Figura 10 mostra a EGPA de algumas amostras do presente

estudo.

60

Figura 10 – Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando o perfil eletroforético de amostras fecais de

crianças menores de 05 anos positivas para rotavírus em São Luís-MA. A canaleta

A contém controle negativo. As canaletas B, E, F, H, I e J apresentam amostras

com perfil eletroforético padrão longo. As canaleta C, D e G representam amostras

negativas na EGPA. Os números de 1 a 11 representam os segmentos do dsRNA.

5.3 Genotipagem dos Rotavírus

As 11 amostras positivas para rotavírus foram genotipadas por meio do

método de PCR para os genótipos P (VP4) e G (VP7). Na análise dos resultados da

genotipagem, observou-se que todas as amostras eram P[4] em relação à genotipagem P

(Figura 11A). No entanto para a genotipagem G, somente 9 amostras foram

genotipáveis, sendo todas classificadas como G2 (Figura 11B). Duas amostras que não

apresentaram características de nenhum dos genótipos G pesquisados, também não

apresentaram o produto da primeira amplificação (determinação de VP7). Observando

nessas 9 amostras a combinação G2P[4].

61

Figura 11 – Genotipagem de rotavírus visualizada em gel de agarose a 2%. A- genotipagem P

(VP4) de rotavírus usando produtos da 1ªamplificação e um cocktail de primers

(Con3,1T-1 a 5T-1). PM: peso molecular (100 pb), Cp: controle positivo, 1 a 11:

amostras positivas mostrando fragmentos amplificados de 483 pb (P[4]). B-

genotipagem G (VP7) de rotavírus usando produtos da 1ª amplificação e um

cocktail de primers (End9, aAT8, aBT1, aCT2, aDT4, aET3 e aFT9). PM: peso

molecular (100 pb), Cp: controle positivo, 1 a 6: amostras positivas mostrando

fragmentos amplificados de 652 pb (G2).

1062pb

500pb

1000pb

1000pb

500pb

A

B

62

6 DISCUSSÃO

A importância dos vírus na gastroenterite infantil tem sido descrita em

diversos estudos em todo o mundo com taxas de incidência variáveis. Por exemplo,

Svraka et al. (2007), mostraram em seu estudo na Holanda que a etiologia viral

correspondia a mais de 80% dos casos de diarreia diagnosticados. Meqdam e Thwiny

(2007) encontraram uma positividade de 50% em crianças com gastroenterite aguda na

Arábia Saudita.

No Brasil dados da literatura apontam para a ocorrência desses vírus em

percentuais que variam entre 12 a 47% de crianças com gastroenterite, atendidas em

ambulatório ou hospitais (LINHARES, 2000; CARDOSO et al., 2003; BARLETTA et

al., 2009), compatíveis com nosso estudo que encontrou uma incidência de 26,3% em

crianças do grupo caso, mostrando que todos esses vírus estão circulando em crianças

da nossa região, principalmente o rotavírus. As condições dos estudos tais como a

amostragem, o nível socioeconômico da população, e métodos de diagnóstico, podem

explicar essas diferenças entre os estudos nas taxas de detecção (SDIRI-LOULIZI et al.,

2008).

No presente estudo os rotavírus, norovírus e adenovírus foram claramente os

três principais agentes virais detectados nas amostras analisadas, sendo detectados em

ambos os grupos caso e controle estudados (13,1% e 1,8%; 4,0% e 7,3%; 5,3% e 1,8%,

respectivamente), confirmando a importância destes vírus como causadores de doença

diarreica.

Os resultados aqui apresentados são similares aos achados de outros países

(MEQDAM; THWINY, 2007; NGUYEN et al., 2007; SVRAKA et al., 2007; SDIRI-

LOULIZI et al., 2008) e também de outras regiões do Brasil (ANDREASI et al., 2007;

MAGALHÃES et al., 2007; BARLETTA et al., 2009; MUNFORD et al., 2009; DE

MOURA et al., 2012) que descrevem os rotavírus como o principal agente etiológico da

gastroenterite infantil.

Além disso, os resultados aqui obtidos (Tabela 3) são comparáveis aos

dados anteriores, em São Luís, que mostraram a ocorrência dos rotavírus com

frequência elevada (21,2%) entre as crianças hospitalizadas por diarréia aguda (LUZ et

al., 2005). No entanto, curiosamente, nossos dados também mostram uma proporção de

1,8% de crianças sem diarreia que excretaram rotavírus, porém com uma taxa que não

ultrapassou os estudos anteriores realizados na mesma cidade (STEWIEN et al., 1991)

63

Uma explicação para esse fato pode ser a introdução da imunização contra o rotavírus

no Brasil, em 2006, reduzindo a circulação do vírus entre as crianças.

Apesar de estudos recentes afirmarem que a idade mais comum da presença

de gastroenterite viral esporádica é de 6-24 meses (LUZ et al., 2005; SDIRI-LOULIZI

et al., 2008; BARLETTA et al., 2009; LEVIDIOTOU et al., 2009), Santos et al (2008)

observaram uma maior frequência de casos positivos em crianças de 2 a 5 anos de

idade. No entanto, neste estudo, não foi observada, uma correlação significativa entre os

vírus pesquisados e as faixas etárias estudadas (p > 0,05). A literatura mostra que apesar

das infecções ocorrerem preferencialmente em lactentes, à faixa etária acometida pode

variar, de acordo com a região, nível sócio econômico e período de realização do estudo

(COSTA et al., 2004).

No presente estudo, foi observado que a infecção por rotavírus ocorreu em

todas as faixas etárias, incluindo crianças com menos de 6 meses de idade (9,1%),

apesar dessa faixa etária de 0-6 meses ser considerada de ocorrência assintomática

(WILHELMI; ROMAN; SÁNCHEZ-FAUQUIER, 2003). Andreasi et al. (2007)

também encontraram importante índice de infecção sintomática nessa faixa etária

(15,7%), o que pode refletir as condições sócio-econômico-sanitárias da população.

Neste estudo não foi observada diferença estatística significante entre os

resultados obtidos para os cinco vírus pesquisados em relação ao sexo (Tabela 5), mas

se observou uma maior positividade desses vírus no sexo feminino para rotavírus

(21,6%). Este dado é semelhante ao verificado por Carneiro et al. (2005), quando este

estudava as características clínicas e epidemiológicas de crianças internadas por

rotavírus na cidade de Salvador-BA, Brasil. Entretanto, divergiu de Cardoso et al.

(2003) que encontrou maior índice de positividade para o gênero masculino.

No Brasil, a distribuição sazonal das infecções virais assume duas

configurações bem definidas. As regiões centro-oeste, sudeste e sul apresentam um

perfil sazonal marcante, principalmente em relação às rotaviroses, com maior incidência

de casos nos meses mais secos ou frios do ano (CARDOSO et al., 2002; CAMPOS et

al., 2003; ANDREASI et al., 2007; BARLETTA et al., 2009). Porém o mesmo não

acontece nas regiões norte e nordeste, onde as infecções ocorrem durante o ano todo

(LUZ et al., 2005; GABBAY et al., 2005; GABBAY et al., 2007).

Os resultados do presente estudo mostraram um padrão semelhante ao que

geralmente é relatado para regiões tropicais, com os vírus entéricos sendo detectados ao

longo do ano em crianças menores de 5 anos, sem uma correlação entre a freqüência dos

64

enterovírus e a pluviosidade (Figura 9). Entretanto, a falta da ocorrência de sazonalidade

das infecções virais em relação à pluviosidade, talvez não reflita a realidade, devido à

irregularidade na obtenção das amostras durante o período de estudo. Porém, pesquisas

anteriores realizadas na mesma cidade mostraram que a freqüência de vírus entéricos,

pode variar de um ano para o outro em regiões de clima tropical e que não está

necessariamente relacionada ao índice pluviométrico (STEWIEN et al., 1991;

GABBAY et al., 2005; LUZ et al., 2005).

Em relação ao estado vacinal das crianças pesquisadas contra rotávírus, 44

(33,5%) foram vacinadas e 61 (46,5%) não foram vacinadas (Tabela 6).

Atualmente, dois tipos de vacinas estão disponíveis, uma monovalente

atenuada de especificidade G1P[8] (Rotarix ®, GlaxoSmithKline Biologicals,

Rixensart, Bélgica) e uma pentavalente recombinante contendo os sorotipos G1, G2,

G3, G4 e P[8] (RotaTeq ®, vacinas da Merck, Whitehouse Station, NJ, EUA) (RUIZ-

PALACIOS et al., 2006; VESIKARI et al., 2006; GURGEL et al., 2009; CHANDRAN

et al., 2010). Estas vacinas fazem parte dos programas de imunização em muitos países

da América Latina. Uma revisão recente da literatura de estudos caso-controle que

avaliaram o impacto da vacina utilizada no Brasil, México, Nicarágua, Panamá,

concluíram que a imunização contra o rotavírus tem um impacto significativo na

redução tanto da internação hospitalar quanto na mortalidade entre as crianças por

diarreia (DESAI et al., 2011).

No Brasil, o Ministério da Saúde introduziu a vacina Rotarix ® contra o

rotavírus no calendário básico de vacinação em março de 2006, oferecendo

gratuitamente a todas as crianças menores de seis meses (BRASIL, 2006). No entanto,

das 131 crianças incluídas neste estudo, 44 (33,5%) tomaram a vacina o que poderia ter

reduzido ainda mais o número de acesso dessas crianças aos hospitais ou postos de

saúde com sintomas de diarréia se um maior número de crianças tivesse sido vacinado.

Neste estudo, ao se analisar apenas o rotavírus em crianças vacinadas, observou-se uma

freqüência de 4,5% (Tabela 6), sugerindo que a imunização contra o rotavírus teve um

impacto importante na redução da morbidade por este vírus, mesmo com uma pequena

amostra de crianças incluídas, o que é uma limitação do presente estudo.

Os genótipos G, encontrados com maior prevalência no mundo todo, são os

genótipos G1 e G4, porém outros genótipos G, como G2, G5, G6, G8, G9 e G10 têm

apresentado significativa importância, principalmente em paises em desenvolvimento

como o Brasil. Esses dados apontam para a possibilidade de mudanças na prevalência

65

de diferentes genótipos por região (MASCARENHAS et al., 2002; ANDREASI et al.,

2007).

Neste estudo, foi observado o predomínio total do genótipo G2. Porém, em

um estudo realizado em São Luís, entre 1997 a 1999, foi mostrado o predomínio do

sorotipo G1 que respondeu por aproximadamente 70% dos isolado tipados, sendo o

sorotipo G2 o segundo mais prevalente durante todo o período estudado (LUZ et al.,

2005). Via de regra, as investigações indicam que um determinado genótipo predomina

durante um ou dois anos, emergindo, a partir de então, uma nova variedade antigênica

dominante (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001).

Por outro lado, considerando a genotipagem P, todas as amostras

genotipáveis foram P[4] e como resultado da associação G e P, a combinação observada

foi G2P[4] que não está incluída na vacina utilizada rotineiramente no Brasil. Fato

semelhante a este foi observado por Gurgel et al. (2007), quando estudavam crianças

vacinadas e não vacinadas contra o rotavírus em Aracajú-SE, onde mesmo após terem

recebido a vacina contra rotavírus algumas crianças desenvolveram a doença diarreica

por rotavírus com a combinação G2P[4]. Munford et al. (2009) ao estudar crianças de 4

regiões do Brasil, observaram também com maior frequência o genótipo G2P [4].

Estudos realizados em diversos estados brasileiros (SANTOS et al., 2003;

ANDREASI et al., 2007; MONTENEGRO et al., 2007), bem como em outros países

(BON et al., 2000; UCHIDA et al., 2006), consideraram a combinação G1P[8] de maior

importância epidemiológica nas causas da doença diarreica por rotavírus. Fato que

levou o desenvolvimento da vacina Rotarix® que confere imunidade para esta

combinação. Porém atualmente no período pós-vacinal, o genótipo G2P[4] é

predominante em todo o Brasil (GURGEL et al., 2009; CORREIA et al., 2010;

JUSTINO et al., 2011).

Variações devem sempre ser apuradas por causa das flutuações genéticas, já

que pode levar a redução da eficácia da vacina ou até mesmo a falha da vacina ao longo

do tempo. Portanto, o acompanhamento contínuo das cepas circulantes em todo mundo,

é necessário para avaliar e atualizar os métodos de análise da vacina. (ROSE;

MIAGOSTOVICH; LEITE, 2010)

Neste estudo, a análise do RNA dos rotavírus detectados em sete amostras

positivas (Figura 10) através da EGPA demonstrou um perfil eletroferótipo compatível

com o grupo A de perfil longo. Esse resultado está de acordo com a literatura que relata

que os rotavírus do grupo A são de maior incidência e responsáveis por mais de 98%

66

das infecções entre humanos, com uma nítida preponderância do padrão longo em

relação ao curto (COLUCHI et al., 2002; CAMPOS et al., 2003; GENTSCH et al.,


Entretanto, é perceptível a partir dos resultados obtidos neste estudo que

houve uma certa variação de eletroferótipos em comparação ao estudo realizado em São

Luís onde eletroferótipos longos e curtos circularam com taxas semelhantes ao longo do

período pesquisado (LUZ et al., 2005). Este fato reforça a opinião de que o padrão de

bandeamento dos 11 diferentes segmentos de dsRNA de Rotavírus A fornecem

importantes informações em termos de variação de amostras em determinado tempo e

localidade (LINHARES; BRESEE, 2000).

Com relação à ocorrência de quatro amostras positivas para rotavírus

detectadas por ELISA e RT-PCR, mas que foram negativas por EGPA (Figura 10).

Supõe-se que provavelmente a concentração de RNA era insuficiente, ou seja, abaixo do

limite de coloração da prata de 3-4 ng, já que a EGPA é uma técnica que precisa de uma

carga viral maior para a detecção do RNA viral, ou devido à degradação do RNA pela

ação enzimática das fezes (HERRING et al., 1982; CAMPOS et al., 2002).

Os adenovírus entéricos têm sido alvo de estudos por ser um importante

patógeno humano, estando entre os quatro vírus mais relacionados à gastroenterite

infantil (WILHELMI; ROMAN; SÁNCHEZ-FAUQUIER, 2003). No presente estudo

os adenovírus foram encontrados em segundo lugar, em crianças com gastroenterite

(5,3%), mas também ocorreram em crianças sem sintomas de diarreica aguda (1,8%).

Taxas de detecção um pouco maiores do que estas foram encontradas nas cidades do

Rio de Janeiro (6%), Juiz de Fora - MG (5,4%) e na Amazônia Ocidental (6,4%) em

crianças internadas ou não devido à gastroenterite (CAMPOS et al., 2003;

MAGALHÃES et al., 2007; BARLETTA et al., 2009).

Os norovírus são considerados os principais causadores de surtos de

gastroenterite que afetam todos os grupos etários nos países ocidentais

(FANKHAUSER et al., 2002; LOPMAN et al., 2003). No entanto, a positividade

observada neste estudo em fezes diarreicas (4,0%) foi menor do que a encontrada em

São Paulo (15,7%) e Espírito Santo (39,7%) em crianças que foram hospitalizadas com

sintomas de gastroenterite (MORILLO et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008). Apesar da

frequência encontrada neste trabalho, os norovírus não podem ser responsabilizados

como agentes causais de diarreia, pois estão presentes também em fezes normais

(7,3%).

67

Neste estudo, todas as amostras positivas para norovírus foram do

genogrupo II, consistente com os resultados recentes do norte e sul do Brasil

(ARAGÃO et al., 2010; GEORGIADIS et al., 2010) que demonstraram a prevalência

deste genogrupo. Outros trabalhos relataram um aumento significativo neste genogrupo,

com uma grande variabilidade genética tanto em surtos longos como a casos

esporádicos (BULL et al., 2006; OKADA et al., 2007). Embora no Japão tenha sido

observada prevalência semelhante para ambos os grupos (NAKATA et al., 2000).

Os astrovírus de humanos são considerados importantes patógenos virais em

crianças com gastroenterite aguda na maioria dos países onde foram investigados,

porém a prevalência da doença varia bastante de acordo com os grupos estudados e há

relatos em crianças assintomáticas (MÉNDEZ-TOSS et al., 2004; GABBAY et al.,

2007; SDIRI-LOULIZI et al., 2008).

No presente estudo, das 131 amostras pesquisadas, somente uma criança

(0,76%) com sintomas de diarreia apresentou positividade para astrovírus, estando

abaixo das incidências já descritas por diversos pesquisadores como Gabbay et al.

(2007) que encontraram uma taxa de 6,1% nos casos de doença infantil diarreica em

Belém e de Santos et al. (2007) que observaram uma incidência de 4,3% nas crianças

hospitalizadas com gastroenterite aguda em Brasília e Goiânia. Taxas bem mais

elevadas já foram registradas em São Luís (11%) e Rio de Janeiro (14%) em crianças

com até 24 meses de idade (GABBAY et al., 2005; VICTORIA et al., 2007A).

Vale ressaltar, que os autores acima citados utilizaram uma amostragem

muito maior que a utilizada neste estudo. No entanto, os resultados obtidos permanecem

em conformidade com os da literatura que mostram que estes vírus causam infecções

assintomáticas ou formas leves de gastroenterite que são tratados em casa, não

requerendo hospitalizações (BUESA et al., 2002; OH; GAEDICKE; SCHREIER, 2003;

NGUYEN et al., 2007).

Além da confirmação da circulação de todos esses vírus entéricos em

crianças de São Luís, o presente estudo é o segundo a relatar a presença de Aichi vírus

no Brasil, uma vez que foi detectada em 2 (2,6%) crianças do grupo caso. Este vírus foi

descrito pela primeira vez no Brasil por Oh et al. (2006), em crianças com gastroenterite

esporádica na região Centro-Oeste, porém sua participação na gastroenterite infantil,

ainda continua a ser um evento raro (OH; GAEDICKE; SCHREIER, 2003; AMBERT-

BALAY et al., 2008), pois é conhecido como um agente causador de gastroenterite

associado ao consumo de ostras (YAMASHITA et al., 2000).

68

Os dados recentes da literatura somados aos resultados obtidos no presente

trabalho reforçam a idéia do papel do Aichi vírus, em casos de gastroenterite e sugerem

que as ostras não podem ser o único vetor de transmissão do vírus. Entretanto mais

estudos devem ser realizados a fim de elucidar o papel do Aichi vírus na etiologia da

gastroenterite infantil.

69

7 CONCLUSÃO

Os rotavírus, adenovírus e norovírus são os três principais agentes virais mais

presentes na gastroenterite infantil em nosso meio. Enquanto que os astrovírus e

Aichi vírus raramente estão envolvidos.

Não foi observada correlação significativa entre a detecção de vírus entéricos

com o sexo e a idade das crianças pesquisadas. Da mesma forma, não foi

verificada variação sazonal da incidência das infecções pelos vírus entéricos nos

períodos chuvosos e secos do ano.

Todos esses vírus estão circulando entre as crianças de São Luís e o rotavírus é

ainda um agente mais prevalente na gastroenterite, mesmo após a introdução da

vacina devido ao envolvimento de outros genótipos não incluídos rotineiramente

na vacina usada no Brasil.

Os rotavírus circulantes apresentaram um perfil eletroforético compatível com o

grupo A de perfil longo e são do genótipo G2P[4], enquanto os norovírus são do

genogrupo II.

Uma vez que G2P[4] é o novo genótipo predominante, existe uma necessidade

de reavaliação da introdução de vacinas que proporcionem protecção contra os

sorotipos múltiplos.

Embora os outros vírus entéricos tenham sido detectados em taxas de baixa

freqüência, podemos sugerir que, além de rotavírus e adenovírus, norovírus

também sejam incluídos no teste de rotina no Brasil.

70

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82

APÊNDICES

83

APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

84

APÊNDICE B - SOLUÇÕES E REAGENTES

1-Solução utilizada para o preparo das suspensões fecais

1.1-Tampão fosfato salina (PBS) 10X - pH 7,4

NaCl 80 g

Na2HPO4 14,4 g

KH2PO4 2,4 g

KCl 2 g

Água destilada estéril q.s.p 1000 mL

1.2 Tampão fosfato salina (PBS) 1X – pH 7,4

PBS 10X 100 mL


2-Soluções utilizadas para a eletroforese em gel de agarose

2.1-EDTA 0,5 M pH 8,0

EDTA 186,1 g

NaOH 20 g

Água destilida estéril q.s.p 1000 mL

2.2-Solução de brometo de etídeo 10 mg/mL

Brometo de etídeo 1 g


2.3-Tampão Tris/Borato/EDTA (TBE) 10X – pH 8,4

Tris base 108 g

Ácido bórico 55 g

EDTA 0,5 M pH 8,0 40 mL


2.4-Tampão Tris/Borato/EDTA (TBE) 0,5X – pH8,4

TBE 10X 50 mL


2.5-Tampão corante para amostras

85

Azul de bromofenol 25 mg

Xileno cianol 25 mL

Ácido bórico 55 g

Glicerol 3 mL


2.6- Agarose 1,5%

Agarose 3 g

TBE 0,5X q.s.p 200 mL

2.7-Agarose 2,0%

Agarose 5 g

TBE 0,5X q.s.p 250 mL

3-Soluções utilizadas para eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA)

3.1- Acrilamida 30%

Acrilamida 29 g

Bisacrilamida 1 g


Armazenar a 4 ºC ao abrigo da luz

3.2-Tris-HCL 1,5M, pH 8,8

Tris base 27,23 g


Ajustar com HCL 6N e armazenar a 4 ºC

3.3-Tris-HCL 0,5M, pH 6,8

Tris base 6,1 g


Ajustar com HCL 6N e armazenar a 4 ºC

3.4-Solução de HCL 6N

HCl 50,4 mL

86


3.5-Solução de Dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%

SDS 1 g


3.6-Azul de bromofenol 1%

Azul de bromofenol 0,1 g

Água estéril 10 mL

3.7-Tampão de tratamento das amostras

Tris-HCL 0,5M, pH 6,8 1 mL

Glicerol 0,8 mL

SDS 10% 1,6 mL

2-β Mercaptoetanol 0,4 mL

Azul de bromofenol 1% 0,4 mL

Água estéril 3,8 mL

3.8-Tampão de corrida Tris/Glicina 5X, pH 8,3

Tris base 15 g

Glicina 72 g

SDS 5 g


3.9-Tampão de corrida Tris/Glicina 1X

Tris/Glicina 5X 200 mL


3.10- Solução de Persulfato de Amônia (PA) 10%

Persulfato de amônia 1 g


3.11-Solução Fixadora (Álcool etílico 10% - Ácido acético 0,5%)

Álcool etílico PA 50 mL

Ácido acético PA 2,5 mL

87

Água estéril q.s.p 500 mL

3.12-Solução de Nitrato de Prata 0,01 M

AgNO3 0,85 g


3.13-Solução Reveladora (NaOH 0,75 M – Formaldeído 0,95%)

NaOH 15 g

Formaldeído 12, 8 mL

Água estéril q.s.p 500 mL

88

ANEXOS

89

ANEXO A - PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM

PESQUISA DO UNICEUMA

90

ANEXO B - CERTIFICADO DO PRÊMIO DE MELHOR PAINEL DO V SIMPÓSIO

DE MICROBIOLOGIA APLICADA

91

ANEXO C - PUBLICAÇÃO DO RESUMO: DETECTION OF ROTAVÍRUS AND

ADENOVÍRUS IN FECAL SAMPLES FROM CHILDREN HOSPITALIZED IN SÃO

LUÍS, MARANHÃO, BRAZIL. NA REVISTA HOLOS ENVIRONMENTAL

92

ANEXO D - PROTOCOLO DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA PEDIATRIC

RESEARCH

93

ANEXO E – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA

PEDIATRIC RESEARCH

94

ANEXO F – ARTIGO SUBMETIDO CONFORME AS NORMAS DA REVISTA

PEDIATRIC RESEARCH

ENTERIC VIRUSES ASSOCIATED TO INFANTILE GASTROENTERITIS IN

NORTHEAST BRAZIL

Running title: Enteric viruses in northeast Brazil

Roxana de C. Veras1,2

; Patrícia de M. S. Figueiredo1; Cristina Andrade-Monteiro

1,3; Jessika S.

M. Farias1; Márcia B. Alves

1,3; Leandro A. Soares

1; Nyla T. M. Lobão

1; Valério Monteiro-

Neto1,4

1Research Group of Endemic and Parasitic Diseases, CEUMA University,

2University Hospital,

Federal University of Maranhão; 3Federal Institute of Maranhão;

4Center of Health and

Biological Sciences, Federal University of Maranhão, São Luís, Maranhão, Brazil.

Corresponding author: Valério Monteiro-Neto, Universidade do CEUMA, Rua Josué Montello

No. 1, CEP: 65.075-120, São Luís-MA, Brazil. E-mail: [email protected]. Telephone:

+55 98 3214 4252. Fax: +55 98 3235 8600.

Financial support: This study received a grant from FAPEMA (Foundation of Support for

Research and Technological Development of Maranhão) No.2918/10.

Category of study: translational study

Word count of abstract: 196

Word count of manuscript: 4,484

ABSTRACT

INTRODUCTION: Viral gastroenteritis is a major cause of morbidity and mortality

throughout the world, affecting mainly children under 5 years of age.

METHODS: This study, conducted from May 2009 to May 2011, investigated the presence of

several viral pathogens in children with (76) and without (55) acute diarrhea in the city São

Luís, Maranhão, northeast Brazil.

RESULTS: Of the children studied, 26.3% (20/76) in the case group and 10.9% (6/55) in the

control group were positive for at least one of the enteric viruses studied. The viruses most

frequently detected in children with gastroenteritis were: rotavirus (13.1%) and adenovirus

(5.3%), followed by norovirus (4.0%), Aichi virus (2.6%), and astrovirus (1.3%). In the control

group, norovirus was detected more often than in cases (7.3%), followed by rotavirus (1.8%),

and adenovirus (1.8%). Rotavirus was the only one significantly associated with gastroenteritis,

of which 9 out of 11 strains were genotyped as G2P[4].

DISCUSSION: This study demonstrated that all these viruses are circulating in children in

northeast Brazil and that rotavirus is still a significant agent of gastroenteritis even after

introduction of vaccination, due to the involvement of other genotype not included in the

vaccine routinely used in Brazil.

INTRODUCTION

Diarrhea is one of the major public health problem worldwide, since it is an important cause of

morbidity and mortality among children, particularly in developing countries (1). It is estimated

that the global mortality due to diarrhea in the population up to 5 years old is almost 2 million,

which corresponds approximately to 19% of total child mortality (2). Their etiology is

associated to many microorganisms, but viruses are the major agents responsible for endemic

and epidemic gastroenteritis (3). A variety of viruses have been frequently reported in

association to infantile gastroenteritis, principally: rotavirus, adenoviruses, noroviruses,

astroviruses, and Aichi virus (4-9).

mailto:[email protected]

95

Rotavirus is considered the most prevalent viral enteropathogen all over the world.

Groups A, B, and C are those that produce infections in humans, but group A rotavirus causes

infection in almost every children in the first 5 years of life (10-12) and is responsible for more

than 60% of all hospital admissions of children with diarrhea in some countries (13). However,

data from case-control studies carried in Latin America countries have demonstrated a

substantial reduction in morbidity and mortality after introduction of routine vaccination for

group A rotavirus (14).

Enteric adenoviruses have a DNA genome that displays a great variability, which allows

its classification in different species and serotypes, including more than 51 human serotypes

classified in six species, from A to F. The enteric serotypes 40 and 41 (species F) are the most

frequently associated to infantile gastroenteritis (5, 15). They present variable incidences in

developing countries ranging from 2% to 31% (10).

Norovirus belongs to the Caliciviridae family and is involved in gastroenteritis in both

children and adults (16, 17). It is a small single-stranded RNA virus, which is classified in three

genogroups: genogroup I is composed by five genetic groups; genogroup II has nine genetic

groups and genogroup III has a single genetic group (18). Norovirus is considered the main

agent responsible for outbreaks of non-bacterial diarrhea and the second cause of viral

gastroenteritis after rotavirus, in many countries (10, 9). The intestinal infection is soft and self-

limited, lasting for up to 48 hours and related to the consumption of contaminated food and

water (19, 20).

The astroviruses are spherical non-enveloped viruses, with well-defined borders,

presenting an stellar configuration whose genome is composed of a molecule of single-stranded

RNA, classified in the Astroviridae family. The infection caused by astroviruses in humans is

characterized by an acute gastroenteritis that lasts for two or three days and affects mainly

children under five years of age (21).

Aichi virus is a member of the Kobuvirus genus of the Picornaviridae family. It is

positive single-stranded RNA that was isolated for the first time in 1989 from a stool sample of

a patient with non-bacterial gastroenteritis associated to consumption of oysters in the province

of Aichi, in Japan. In Brazil, this virus was reported only once in sporadic gastroenteritis (22).

Despite the significant advance in the study of all these viruses as agents of epidemic and

endemic diarrhea in many countries, in Brazil, particularly in its northeast region, little is known

about their contribution to the etiology of infantile gastroenteritis. Thus, the objective of this

study was to investigate the frequency of enteric viruses in children under 5 years old with and

without diarrhea, in the city of São Luís, state of Maranhão, Brazil.

METHODS

Area of study and patients

This study was conducted from May 2009 to May 2011 in the metropolitan area of São Luís,

state capital of Maranhão, northeast Brazil. This city has a tropical climate, it is hot and humid,

with a total rainfall during the period of study of 4,060 mm. There are only a rainy (from

January to June) and a dry season (from July to December). The average temperatures vary from

24°C to 29°C with a high relative humidity of air exceeding 80% all over the year (data supplied

by the Laboratory of Meteorology, State University of Maranhão).

One hundred thirty-one stool samples of children under five years old were analyzed. Of those,

76 samples were from children with acute diarrhea (case group) and 55 did not display any

gastrointestinal symptoms (control group). Written informed consent was obtained from the

parents or legal guardians of the participants enrolled in the study. Children of both groups were

seen at two public pediatric hospitals and at a community health center. This study was

approved by the Committee on Ethics in Research of UNICEUMA (License No. 00559/09).

Laboratory Procedures

Stool samples were screened for rotavirus with the enzyme immunoassay Ridascreen® (R-

Biopharm, Darmstadt, Germany) and then by RT-PCR using the primers Beg9 and End9 (23)

and primers Con2 and Con3 (24). Positives samples for rotavirus were submitted to genotyping

by using specific primers to identify the genotypes G (G1-G4 and G8, G9), as well as the

genotypes P (P[4], P[6], P[8],P[9] and P[10]) (23, 24). PAGE was also carried out for the

completion of the characterization study (25, 26).

96

Noroviruses, astroviruses and Aichi viruses were also detected by RT-PCR (kit Qiagen

OneStep RT-PCR). To detect noroviruses, we used separately the pairs of primers G1SKF /

G1SKR and G2SKF / G2SKR, that amplified a fragment of the capsid gene of the genogroup I

(GI) and genogroup II (GII), respectively (27, 28). To detect astroviruses and Aichi viruses we

used, respectively, the specific primers Mon244 and Mon245, directed to the ORF2 of the viral

genome and the pair of primers Ai6261 and Ai6779 that target the RNA polymerase gene (29,

30). Viral nucleic acids were extracted from 20% stool suspensions in phosphate-buffered saline

with QIAamp viral kit (Qiagen, Hilden, Germany). RT-PCRs were carried out with Qiagen

OneStep RT-PCR, according to the manufacturer´s instructions (Qiagen, Hilden, Germany).

Human adenovirus were detected by conventional PCR using the set of primers

Hex1DEG and Hex2DEG (31).

Statistical analyzes. Statistical analyses were performed with Bioestat software version

5.0 (2007). Data were compared by the Chi-square (2) test of independence for the categorical

variables. Pearson’s correlation was used to compare numerical variables, rainfall rate and

number of viruses detected in the samples. In all tests, the significance level applied was 5%,

that is, it was considered significant when P < 0, 05.

RESULTS

Positive results were obtained for at least one of the studied viruses in 20 (26.3%) children of

the case group and in 6 (10.9%) controls. Rotavirus, adenovirus, and norovirus were detected in

both studied groups, but rotavirus was the only significantly associated with gastroenteritis (P =

0.0465). The frequency rates of each virus in cases and in controls were, respectively: rotavirus,

13.1% versus 1.8; adenovirus, 5.3% versus 1.8%; and norovirus, 4.0% versus 7.3% (Table 1).

Aichi virus (2.6%) and astrovirus (1.3%) were detected only in patients of the case group. All

the 7 positive samples for norovirus were shown to be of genogroup II.

Regarding age, the studied viruses, there were no significant correlations the enteric

viruses and the age groups of children (P > 0.05) (Table 2).

From the 131 children included in our study, 44 (33.5%) were vaccinated, 61 (46.5%)

were unvaccinated, and the parents of 26 (20%) children did not know or did not inform the

vaccination status. Of the 11 (8.4%) children that were positive for rotavirus, 7 of them (11.5%)

were unvaccinated, 2 (4.5%) were vaccinated and 2 (7.7%) did not know or did not inform the

vaccination status. There was no significant difference between the case and control groups in

relation to the positivity for rotavirus and the vaccination status (Table 3).

After PAGE analysis, 4 samples did not show any electrophoretic migration profile, but 7

samples showed a profile compatible to the phenotype of long type (4, 2, 3, 2), which

characterizes group A rotavirus (Figure 1). P genotyping of the 11 samples positive for rotavirus

revealed that all samples were P[4]. However, for G genotyping, 9 samples were classified as

G2, i.e., they were G2P[4] (Figure 2). Two samples did not present any of the studied G type

and did not show the product of the first amplification as well (determination of VP7).

In this study, we did not observe a significant correlation of virus detection with gender

(data not shown). The same way, we did not observed seasonality of their incidence in both

rainy and dry periods of the year (r = -0.021; p > 0.05).

DISCUSSION

The data of the present study showed that all these viruses are circulating in children in our

region, principally rotavirus. The contribution of rotavirus for infantile gastroenteritis is well

established all over the word with variable incidence rates (9, 10, 32). In Brazil, many studies

have demonstrated the prevalence of rotavirus in children with diarrhea (5, 12, 33-35), but there

are only a few studies that reported the frequency of norovirus, adenovirus, and astrovirus in

children with gastroenteritis (6, 7, 12, 36-39).

Regarding rotavirus, the results presented here corroborate findings from other countries

(9, 32, 40, 41) and also from other regions of Brazil (5, 35, 42, 43), which describe rotavirus as

an important agent of infantile gastroenteritis. However, a low detection rate (1.8%) was

observed among children in the control group. A explanation for this fact may be the

introduction of rotavirus immunization in Brazil, in 2006, reducing virus circulation among

those children.

97

According to some studies, a significant reduction in morbidity and mortality is expected

to occur after the introduction of vaccination programs. At present, two kinds of vaccines are

available, a monovalent live attenuated of G1P(8) (Rotarix®, GlaxoSmithKline Biologicals,

Rixensart, Belgium) and a pentavalent recombinant containing serotypes G1, G2, G3, G4, and

P1A(8) (RotaTeq®, Merck Vaccines, Whitehouse Station, NJ, USA) (44-48). These vaccines

are part of immunization programs in many countries of Latin America. A recent review of

published literature of case-control studies of vaccine effectiveness and population-based

studies for vaccine impact data carried out in Brazil, Mexico, Nicaragua, and Panama concluded

that rotavirus immunization have a significant impact in the reduction of both hospitalization

and mortality among children by diarrhea (14).

In São Luís, a study performed in the pre-vaccine era demonstrated a positivity rate of

32% and 9.8% for rotavirus in children with and without diarrhea, respectively. The majority of

them was of G1-serotype (66.7%) and showed long (30.9%) and short (19%) RNA migration

patterns. Some G1 strains (16.7%) did not show any migration pattern. Other strains were

serotyped as G2 (14.3%) and exhibited a short electropherotype (34). This fact reinforces the

opinion that the banding pattern of the 11 different RNA segments of rotavirus A give important

information about sample variation in certain time and place (49), since our strains were typed

as G2 and displayed a long RNA migration pattern.

In our study, if one analyzes only rotavirus in vaccinated children, a frequency of 4.5%

was observed, suggesting that rotavirus immunization had an important impact in the reduction

of morbidity by this virus. Even though we had a small sample of children enrolled, which is a

limitation of our study. The predominant rotavirus strain G2P[4] detected in our study is distinct

of the predominant type previously observed among us and also it is not included in vaccine

routinely used in Brazil. This variability in prevalence of rotavirus strain has been described in

other studies in Brazil and also in other countries (50-53). In a recent study performed with

children from 4 regions of Brazil, G2P[4] was the most frequent detected genotype (42).

Although we did not observe any statistical difference regarding age and rotavirus

gastroenteritis, a higher rate of detection occurred in children with age between 6-24 months.

This data is similar to those previously described in the literature (9, 34, 54). However, elevated

rotavirus frequencies in children aged 2 – 5 years have also been reported (55).

The frequency rates observed for adenovirus, norovirus, and astrovirus in our study were

lower than those obtained in some of these studies carried out in Brazil. Detection rates of

adenovirus in children with gastroenteritis in the Western Brazilian Amazonia were reported to

be approximately 6.4% (5). Caliciviruses, including norovirus, have been observed in 8.6% of

infants in the Central-West region (56). In São Paulo city, which is located in the Southeast

region, a detection rate of 15% has been reported for norovirus (57) For astrovirus, detection

rates have varied from 3.1% to 31.1% in several Brazilian cities (7, 36, 38, 58). Recently,

Andreasi et al. found astrovirus, adenovirus, and calivirus in frequencies 3.1%, 3.6% and 7.5%

in children in the Central-West region (7).

In this study, all positive samples for norovirus were from the genogroup II, which is

consistent with recent findings from northern Brazil (59). A significant raise in this genogroup

has been reported with a great genetic variability both in outbreaks and sporadic cases in

different countries (60, 61).

In addition to the confirmation of all these viruses in children of São Luís, the present

study is the second to report the presence of Aichi virus in Brazil, since it was detected in 2

(2.6%) children of the case group. This virus was first described in Brazil, in the Central-West

region, associated to sporadic gastroenteritis in 5 children (22).

In Brazil, the seasonal distribution of the viral infections assumes two well defined

configurations. Central-west, southeast and south regions have a striking seasonal profile,

especially in relation to rotavirus, with higher incidence of cases in the driest or coldest months

of the year (33, 35, 55). However, in northern and northeast regions, rotavirus infections occur

all over the year (34, 37). In our study, a pattern similar to the one of tropical regions was

observed, with the detection of the enteric viruses all over the year and no correlation between

the viruses frequency and rainfall rates (r = -0.021; p > 0.05). However, the lack of seasonality

of viral infections in relation to rainfall rates may also be due to the irregularity in obtaining

stool samples during the study period, but previous studies in the same city showed that the

98

enteroviruses frequency may vary during the year and that it is not related to the rainfall rates

(34, 36, 62).

In sum, the data of this study demonstrate that rotavirus is still an important agent of

infantile gastroenteritis in our region. Since G2P[4] is the new predominant strain, there is a

need to re-evaluate of the introduction of vaccines that provide protection against multiple

serotypes. Although the other enteric viruses were detected in low frequency rates, we may

suggest that, besides rotavirus and adenovirus, norovirus be also included in routine testing in

Brazil.

ACKNOWLEDGEMENTS

Authors wish to thank to FAPEMA (Foundation of Support for Research and Technological

Development of Maranhão) for financial support (grant No.2918/10).

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102

Table 1. Frequency of enteric viruses in children with and without gastroenteritis in São Luís,

MA, northeast Brazil.

Enteric viruses

Groups

2 P value Case

N = 76

Control

N = 55

n (%) n (%)

Rotavirus 10 (13.1) 1 (1.8) 3.96 0.0465

Adenovirus 4 (5.3) 1 (1.8) 0.30 0.5798

Norovirus 3 (4.0) 4 (7.3) 0.19 0.6587

Aichi virus 2 (2.6) 0 (0.0) 0.24 0.6238

Astrovirus 1 (1.3) 0 (0.0) 0.02 0.8705

Total 20 (26.3) 6 (10.9) 3.84 0.0500

103

Table 2. Distribution of enteric viruses in 76 children with gastroenteritis by age in São Luís, MA, northeast Brazil.

Age group*

(months)

No. of

children

No. (%) of infections Total

n (%)

Rotavirus

Adenovirus

Norovirus

Aichi virus

Astrovirus

0-6 11 1 (9.1)

- -

- -

- -

- - 1 (9.1)

7-12 8 2 (25.0)

1 (12.5)

1 (12.5)

- -

- - 4 (50.0)

13-24 21 2 (9.5)

1 (4.7)

2 (9.5)

1 (4.7)

- - 6 (28.5)

25-36 22 4 (18.2)

1 (4.5)

- -

1 (4.5)

1 (4.5) 7 (31.8)

37-59 14 1 (7.1)

1 (7.1)

- -

- -

- - 2 (14.3)

Total 76 10 (13.1)

4 (5.3)

3 (4.0)

2 (2.6)

1 (1.3) 20 (26.3)

*P >0.05

104

Table 3. Detection of rotavirus in case and control groups according to their vaccination status.

Group

Vaccination status

Positive/vaccinated

No. (%)

Positive/unvaccinated

No. (%)

Unknown

No. (%)

Total

No. (%)

*Case 2/25 (8) 6/25 (24) 2/26 (7.7) 10/76 (13.2)

**Control 0/19 (0) 1/36 (2.8) - 1/55 (1.8)

Total 2/44 (4.5)*** 7/61 (11.5)*** 2/26 (7.7) 11/131 (8.4)

*P = 0. 2472; **P = 0.7429; ***P = 0.369

Figure. 1 Polyacrylamide gel electrophoresis stained with silver nitrate. Lane A - negative

control. Lanes B, E, F, H, I, and J - samples with long electrophoretic profile pattern. Lanes

C, D and G - negative samples in PAGE. Numbers 1 to 11 represent dsRNA segments.

105

Figure. 2 Genotyping analysis of rotavirus by agarose gel electrophoresis. a - P

genotyping using products of the first amplification and primers Con3,1T-1 to 5T-

1. MW: molecular weight (100 bp), Pc - positive control, 1 to 11 - positive

samples showing amplified fragments of 483 bp (P[4]). b – G genotyping using

products of the first amplification and primers End9, aAT8, aBT1, aCT2, aDT4,

aET3, and aFT9. MW - molecular weight (100 bp), Pc: positive control, 1 to 6:

positive samples showing amplified fragments of 652 bp (G2).

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