validação e revalidação de métodos para a análise de ... · método e ao grande volume de...

Validação e revalidação de métodos para a análise de micotoxinas: Aflatoxina B1, B2, G1, G2, Desoxinivalenol, Zearalenona e Ocratoxina

Jefferson Vieira Santos

Mestrado em Tecnologia e Ciência Alimentar Departamento de Química e Bioquímica 2018

Orientador Luis F. Guido, Professor Auxiliar, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri,

Porto, ______/______/_________

i

“A falta de conhecimento de ontem é o preconceito de hoje

gerando um amanhã de pura ignorância.”

(Txblacklionzion)

ii

Agradecimentos

Os meus mais sinceros e sentidos agradecimentos vão para os meus familiares, em especial

aos meus pais, que mesmo distantes sempre me encorajaram a lutar pelos meus objetivos, a

enfrentar os obstáculos. Conseguiram transmitir conhecimentos que julgo serem de grande

importância e que levarei sempre comigo: ter princípios e manter-se sempre humilde.

Aos meus irmãos, que acreditaram e acreditam no meu potencial e constantemente torcem

por mim.

As minhas cunhadas, que as considero irmãs, muito obrigado por todo o apoio e pelas

palavras de conforto.

Ao meu companheiro, o qual foi o principal motivador para eu ingressar no mestrado. Obrigado

pelos momentos felizes e também por todas as dificuldades que passamos, porém, sempre

nos apoiamos um ao outro, és uma das razões pelo qual luto todos os dias.

Aos meus poucos, mas bons amigos, por todas as boas vibrações. À “Francisquinha” a qual

de colega, transformou-se em amiga, muito obrigado pelas palavras de apoio, pelo

companheirismo, e por sermos parceiros de profissão e ajudar um ao outro mutuamente. À

“Magg” por toda a solidariedade, preocupação, ajuda e por mostrar-se uma grande pessoa

sempre disposta a ajudar.

Às técnicas de laboratório Joana Rangel e Olga Delgado, por todo o conhecimento

transmitido, pela ajuda, pelas chamadas de atenção, pelas palavras de conforto e

encorajamento.

Aos técnicos do laboratório de “MIA” por acreditarem no meu trabalho. E ao grupo Mérieux

NutriScience Portugal, pela oportunidade em fazer parte desta equipa.

Ao meu professor orientador Luís Guido, pelo apoio, paciênca e por auxiliar a concretizar mais

uma etapa na minha vida prossional/acadêmica.

A Portugal, este país maravilhoso, o qual considero minha segunda casa, e que no qual,

trouxe tantas coisas boas para a minha vida.

A todos que diretamente ou indiretamente puderam fazer parte de mais este ciclo que se

encerra, o meu muito obrigado.

iv

Resumo

O presente projeto de dissertação foi desenvolvido no âmbito do Mestrado em Tecnologia e

Ciência Alimentar, como componente da unidade de estágio curricular em parceria com a

empresa Mérieux NutriScience Portugal.

Com o objetivo de avaliar os níveis de contaminações de Aflatoxina B1, B2, G1, G2,

Desoxinivalenol, Zearalenona e Ocratoxina, este trabalho teve como finalidade, validar e

revalidar as metodologias analíticas utilizadas para a deteção e quantificação por HPLC

(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e adequação dos métodos utilizados no laboratório

da Mérieux NutriSciences Portugal com a Mérieux NutriSciences Espanha. De forma a

garantir a fiabilidade dos resultados, foram estudados parâmetros como: a repetibilidade do

método, a precisão intermédia, os limiares analíticos, a gama de trabalho e a realização de

testes de recuperação. Devido ao número extenso de matrizes a serem validadas para cada

método e ao grande volume de trabalho nas instalações da empresa, consequentemente a

indisponibilidade do equipamento (HPLC), não foi possível realizar todas as validações.

Sendo assim, o principal foco deste projeto será nas Aflatoxinas.

O método para a análise das Aflatoxinas apresentou-se específico e seletivo ao cumprir os

critérios de ensaios de recuperação estabelelecidos pelo Regulamento (EU) N° 519/2014 (50

a 120%), tendo os resultados obtidos ficado entre 76 e 119%. A exatidão foi constatada ao

comparar os resultados obtidos com o das matrizes FAPAS, onde os resultados se

enquadraram nos limites de concentrações descritos nos boletins. A linearidade fora

comprovada com o teste de RIKILT e o modelo foi considerado linear. O limite de quantificação

da reta obtido foi maior que a concentração do padrão de menor concentração, isto surge

como um fator de segurança, pois, caso este não cumpra com os critérios de repetibilidade,

é possível eleger o padrão subsequente, de modo a garantir resultados consistentes e

coerentes. Parâmetros como a repetibilidade e precisão intermédia, também foram estudados,

o coeficiente de variação manteve-se entre 11% e 6,4% respectivamente. Resultados estes

considerados satisfatórios.

Palavras-chave: micotoxinas, Aflatoxina, Desoxinivalenol, Zearalenona, Ocratoxina, HPLC,

validação.

v

Abstract

The following dissertation was developed under the Technology and Food Science Master’s

Degree, as a component of a curricular unit internship done in partnership with Mérieux

NutriScience Portugal.

With the objective of evaluating the contamination levels of Aflatoxin B1, B2, G1, G2,

Deoxynivalenol, Zearalenone and Ochratoxin, this project aimed to validate and revalidate the

analytical methodology used for detection and quantification through HPLC (High-

Performance Liquid Chromatography) and the adequacy of the methodology used in the

Mérieux NutriSciences Portugal - Mérieux NutriSciences Spain laboratory. In order to

guarantee the reliability of the results, parameters such as the following were studied:

methodological repeatability, intermediate precision, analytical thresholds, the array of work

and the realization of recovery tests. Due to the substantial number of evaluated matrices for

each method, to the great amount of work done in company facilities, and to the consequent

unavailability of equipment (HPLC), it wasn’t possible to execute every validation. Therefore,

the main focus of this project will be aflatoxins.

The method used for aflatoxin analysis was specific and selective, complying with the recovery

testing criteria established by rule No. 519/2014 of the Commission Regulation (EU) (50 to

120%), with results obtained lying between 76 and 119%. Accuracy was assured by comparing

the obtained results with those of the FAPAS matrices, where the results fit the concentration

ranges described in the data sheets. Linearity was validated with the RIKILT test and the model

was considered linear. The quantification limit for the curve was greater than the concentration

of the standard of lowest concentration. This arises as a safety factor, seeing as, if it doesn’t

comply with the repeatability criteria, it’s possible to elect the subsequent pattern, so as to

guarantee consistent and coherent results. Parameters such as repeatability and intermediate

precision were also studied. The variation coefficient remained between 11% and 6.4%,

respectively, yielding satisfactory results.

Keywords: mycotoxins, Aflatoxin, Deoxynivalenol, Zearalenone, Ochratoxin, HPLC,

validation.

vi

Índice

Agradecimentos ............................................................................................................................... ii

Resumo ............................................................................................................................................ iv

Abstract ............................................................................................................................................. v

Índice ................................................................................................................................................ vi

Índice de figuras .............................................................................................................................. ix

Índice de tabelas .............................................................................................................................. x

Abreviaturas e símbolos ................................................................................................................. xi

Apresentação da empresa ............................................................................................................. 1

Parte I -Teórica ................................................................................................................................ 3

1. Micotoxinas .............................................................................................................................. 4

1.1. Importância ........................................................................................................................... 4

1.2. Aflatoxina .............................................................................................................................. 5

1.3. Desoxinivalenol .................................................................................................................... 6

1.5. Zearalenona ......................................................................................................................... 7

1.6. Distribuição geográfica, principais alimentos, efeitos toxicológicos e patológicos. ....... 8

1.7. Teores máximos permitidos conforme o decreto CE N.1881 2016 ...............................10

1.8. Parâmetros para a deteção das micotoxinas ...................................................................11

1.8.1. Amostragem ....................................................................................................................11

1.8.2. Matrizes complexas ........................................................................................................11

1.8.3. Limites de deteção baixos ..............................................................................................11

1.9. A técnica ..............................................................................................................................12

1.9.1. Preparação da amostra ..................................................................................................12

1.9.2. Extração com solventes .................................................................................................12

1.9.2.1. Extração sólido-líquido ...............................................................................................12

1.9.2.2. Extração líquido-líquido ..............................................................................................13

1.9.2.3. Separação/purificação da micotoxina por Colunas de Imunoafinidade (IAC) .......13

1.9.3. Cromatografia ..................................................................................................................15

1.9.3.1. Histórico .......................................................................................................................15

1.9.3.2. Conceito .......................................................................................................................16

1.9.4. Componentes de um HPLC ...........................................................................................17

1.9.4.1. Injetor ...........................................................................................................................17

1.9.4.2. Bomba ..........................................................................................................................17

1.9.4.3. Coluna cromatográfica................................................................................................18

vii

1.9.4.4. Detetor .........................................................................................................................19

1.9.4.5. Sistema de processamento de dados .......................................................................22

1.9.5. Os mecanismos de separação cromatográfica ............................................................22

Parte II - Validação de métodos....................................................................................................25

2. Validação de métodos analíticos ..........................................................................................26

2.1. Seletividade/Especificidade ...............................................................................................26

2.2. Sensibilidade .......................................................................................................................27

2.3. Limiares analíticos ..............................................................................................................27

2.3.1. Limite de deteção (LD) ...................................................................................................27

2.3.2. Limite de Quantificação (LQ) .........................................................................................28

2.4. Linearidade..........................................................................................................................28

2.5. Gama analítica ....................................................................................................................29

2.6. Precisão ...............................................................................................................................29

2.6.1. Repetibilidade ..................................................................................................................30

2.6.2. Reprodutibilidade ............................................................................................................32

2.6.3. Precisão intermédia ........................................................................................................32

2.7. Exatidão ...............................................................................................................................33

Parte III – Experimental .................................................................................................................35

3. Plano de validação .................................................................................................................36

4.1. Reagentes ...........................................................................................................................37

4.2. Materiais ..............................................................................................................................37

4.3. Equipamentos .....................................................................................................................37

4.4. Soluções ..............................................................................................................................39

4.4.1. Procedimento ..................................................................................................................39

4.5. Extração ..............................................................................................................................41

4.5.1. Caso geral .......................................................................................................................41

4.5.2. Outros casos ...................................................................................................................42

4.6. As principais adaptações realizadas para o ensaio ........................................................45

5. Discussão dos resultados ......................................................................................................47

5.1. Matrizes analisadas ............................................................................................................47

5.2. Sensibilidade .......................................................................................................................51

5.3. Limite de deteção - LD .......................................................................................................51

5.4. Limite de Quantificação - LQ .............................................................................................51

5.5. Linearidade..........................................................................................................................52

5.6. Gama de Trabalho ..............................................................................................................54

5.7. Precisão ...............................................................................................................................54

viii

5.7.1. Repetibilidade ..................................................................................................................54

5.7.2. Precisão intermédia ........................................................................................................56

5.8. Exatidão ...............................................................................................................................58

7. Conclusão ...............................................................................................................................61

8. Referências .............................................................................................................................62

Anexo 1 – Matrizes a serem validadas para Aflatoxinas ............................................................65

Anexo 2 – Folha de cálculo para a repetibilidade .......................................................................66

Anexo 3 – Folha de cálculo para precisão intermédia ................................................................66

Anexo 4 – Cromatogramas para Aflatoxinas, método atual e método a ser validado .............68

ix

Índice de figuras

Figura 1 - Instalações da Silliker Portugal .............................................................................. 2

Figura 2 - Funcionamento de uma coluna de imunoafinidade (Adaptado de Kos 2015) ....... 14

Figura 3 - Cálculo para a resolução do pico (Silva, 2016)..................................................... 16

Figura 4 - Características químicas de uma amostra (Adaptado de Chust, 1990) ................ 18

Figura 5 - Componentes de um HPLC (Adaptado de Keliri, 2017) ........................................ 22

Figura 8 - Bomba ................................................................................................................. 38

Figura 6 - Banho a 70°C ....................................................................................................... 38

Figura 7 - Peça T ................................................................................................................. 38

Figura 9 - Misturador de aço inox ......................................................................................... 41

Figura 10 - Sistema de imunoafinidade montado ................................................................. 42

Figura 11 – Colunas de imunoafinidade ............................................................................... 42

Figura 12 - Fluxograma representativo da análise das Áflatoxinas ....................................... 45

Figura 13 - Reta de calibração Afla G2................................................................................. 50

Figura 14 - Reta de calibração Afla G1................................................................................. 50

Figura 15 - Reta de calibração Afla B2 ................................................................................. 50

Figura 16 - Reta de calibração Afla B1 ................................................................................. 50

Figura 17- Linearidade Afla G2 ............................................................................................ 53

Figura 18 - Linearidade Afla G1........................................................................................... 53

Figura 19 - Linearidade Afla B2 ........................................................................................... 53

Figura 20- Linearidade Afla B1 ............................................................................................. 53

x

Índice de tabelas

Tabela 1 - Principais micotoxinas de acordo com a região, principais alimentos e efeitos para

a saúde ............................................................................................................................................ 9

Tabela 2 - Teores máximos permitidos para Aflas, DON, OCRA e ZEA em alimentos conforme

o decreto CE N.1881 2016 ............................................................................................................10

Tabela 3 – Massa molecular e absortividade molar para as Aflatoxinas G2, G1, B2 e B1. ....40

Tabela 4 – Volumes para a reta de calibração dos padrões para as Aflatoxinas. ...................40

Tabela 5 – Procedimento para a extração das Aflatoxinas nas matrizes que diferem do caso

geral. ...............................................................................................................................................43

Tabela 6 – Purificação por coluna de imunoafinidade para a análise das Aflatoxinas das

matrizes que diferem do caso geral .............................................................................................44

Tabela 8 - Principais alterações nas condições do HPLC para a análise das Aflatoxinas......46

Tabela 9 – Matrizes de referência utilizadas para a análise das Aflatoxinas ...........................47

Tabela 10 – Contaminação das amostras que não possuem Aflatoxinas. ...............................48

Tabela 11 - Padrões e áreas da reta de calibração para análise das Aflatoxinas ...................49

Tabela 12 - Sensibilidade do método para cada Aflatoxina analisada. ....................................51

Tabela 13 - Avaliação da linearidade da reta de calibração das Aflatoxinas através do teste de

RIKILT .............................................................................................................................................52

Tabela 14 – Matrizes analisadas para a determinação da repetibilidade, desvio padrão,

coeficiente de variação e limite de repetibilidade relativo. .........................................................55

Tabela 15 – Matrizes analisadas para a determinação da precisão intermédia, desvio padrão,

coeficiente de variação e limite da precisão intermédia. ............................................................57

Tabela 16 - Média, desvio padrão e coeficiente de variação para o ensaio de recuperação .59

Tabela 18 - Intervalos de aceitação para os ensaios de recuperação conforme o Regulamento

(UE) N° 519/2014 ...........................................................................................................................60

Tabela 19 - Matrizes para aflatoxinas ..........................................................................................65

xi

Abreviaturas e símbolos

A. Aspergillus

ACN Acetonitrilo

ADN Ácido Desoxirribonucleico

AFLA Aflatoxina

aw Atividade da água

C.V Coeficiente de variação

CE Comissão Europeia

DON Desoxinivalenol

ECD Electron Capture Detector

EGI Engenharia e Gestão de Qualidade Industrial

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

F Distribuição de Fisher

F. Fusarium

FAO Food and Agriculture Administration

FID Flame Ionization Detector

FLD Fluorescence Detector

G Grubbs

GC Gas Chromatography

GFC Gel Filtration Chromatography

GPC Gel Permeation Chromatography

HPLC High Performance Liquid Chromatography

IAC Immunoaffinity Columns

IARC International Agency for Research on Cancer

L.P.I Limite da Precisão Intermédia

L.R Limite de Repetibilidade

L.R (%) Limite de Repetibilidade Relativo

LC Liquid Chromatography

LD Limite de Deteção

LQ Limite de Quantificação

MeOH Metanol

MS Mass Spectrometry

OA Ocratoxina A

OCRA Ocratoxina

P. Penicilluim

xii

PBS Phosphate Buffered Saline

S.A Sociedade Anonima

TLC Thin Layer Chromatography

UV Ultravioleta

ZEA Zearalenona

1 FCUP

Validação e revalidação de métodos para análises de Micotoxinas

Apresentação da empresa

✓ Histórico

Em Julho de 1992 em Vila Nova de Gaia, é fundada a Sociedade de Engenharia e Gestão da

Qualidade Industrial, Lda. (EGI), com o intuito de atender a demanda do mercado como uma

empresa prestadora de serviços para o ramo agro-alimentar. Surge em um momento onde a

prevenção da qualidade e segurança alimentar são fundamentais para a indústria. É neste

contexto e a falta de prestações de serviços de análises, que a EGI torna-se líder nacional no

setor.

Em 1993 a empresa tem o seu laboratório acreditado, conforme a sua política de qualidade e

sustentabilidade.

No ano 2000 implementa o laboratório de Análise Sensorial, visto a necessidade da avaliação

organoléptica na análise dos alimentos.

Com o forte crescimento e desenvolvimento, em Março de 2005 a EGI adquire novas

instalações, visando perspectivas futuras de modo a ampliar e acomodar todos os seus

laboratórios e serviços desenvolvidos.

Fruto de todo o desenvolvimento e liderança do setor, em Março de 2008 a empresa

multinacional norte-americana Silliker, adquire a empresa, tornando-se então o grupo Silliker

Portugal S.A. e integrante de um dos maiores grupos mundiais na prestação de serviços na

área da qualidade e segurança alimentar.

Desde 2014 que a Silliker aparesenta-se como Mérieux NutriSciences, pois foi a sociedade

da família Mérieux que em 1990 adquiriu a Silliker.

Atualmente o grupo Mérieux possui cerca de 100 laboratórios acreditados a operar em 21

países e a empregar 6500 funcionários.

✓ Missão

Proteger a saúde dos consumidores de todo o mundo disponibilizando uma vasta oferta de

serviços analíticos e de consultoria para as indústrias do setor alimentar e nutrição.

Adicionalmente presta serviços a empresas de diferentes setores, nomeadamente nas áreas

da água e ambiente, agroquímicos, bens de consumo, farmacêutica e cosméticos.

2 FCUP


✓ Setores

As mediações da Merieux Portugal, estão divididas em: análises físico-químicas e

microbiológicas, análise sensorial, rotulagem, auditorias, consultorias de gestão da qualidade

e segurança alimentar e apoio ao cliente.

Figura 1 - Instalações da Silliker Portugal

3 FCUP


Parte I -Teórica

4 FCUP


1. Micotoxinas

Os primeiros relatos decorrem no século X, quando uma doença, até então desconhecida,

afetou grande parte da população Europeia em 943. Entre os principais sintomas estavam:

crises epiléticas, espuma pela boca, vómitos, crises de loucura e dores insuportáveis.Tratava-

se de um “fogo invisível” que desprendia a carne dos ossos e a consumia. Doença essa,

popularmente nomeada de “Fogo de Santo António”, uma vez que os enfermos recorriam ao

santuário de Santo António, localizado em França com o intuito de obter a cura (FAO, 2003).

Atualmente sabe-se que o “Fogo de Santo António” ou ergotismo, é uma intoxicação

proveniente da ingestão de alimentos contaminados por um produto tóxico produzido pelo

fungo Claviceps purpurea ou “Esporão do Centeio” (FAO, 2003). Este produto tóxico é

originário do metabolismo secundário produzido por alguns fungos filamentosos e fazem parte

da flora natural de alguns produtos alimentares (Soares et al., 2013). Os metabolitos

produzidos por esses fungos são denominados “Micotoxinas” e as doenças causadas são

chamadas “Micotoxicose”.

1.1. Importância

O ano de 1962 na Inglaterra ficou marcado pela morte de mais de 100.000 perús, que

apresentaram um quadro clínico de hemorragias internas e necrose hepática (Rocha et al.,

2014; Soares et al., 2013). Após investigações, descobriu-se que os perús morreram após a

ingestão da ração à base de amendoim originário do Brasil e África. A substância presente

nesses amendoins foi proveniente do fungo Aspergillus flavus. Surgia a primeira micotoxina a

ser estudada: a Aflatoxina, derivada da palavra Aspergillus flavous toxins (Food Ingredients

Brasil, 2009).

A partir do estudo da Aflatoxina, investigadores descobriram outros fungos responsáveis por

outras toxinas distintas. Atualmente estão documentadas no mundo todo mais de 400

micotoxinas, no entanto, apenas será relatado nesta dissertação as quatro principais:

Aflatoxina, Desoxinivalenol, Ocratoxina e Zearalenona.

Quando inaladas ou ingeridas, as micotoxinas no organismo humano são altamente tóxicas e

possuem efeitos diversos, sendo sempre prejudicial. Os efeitos irão depender do tipo de

micotoxina, da concentração, do tempo de exposição, do modo de ação da micotoxina, do

sexo, da idade e da massa corpórea (Tattibayeva, 2017).

5 FCUP


Entre os principais problemas estão: o aparecimento de tumores, a debilitação do sistema

imunológico, lesão renal, doenças crónicas, estrogénica, hemorrágica, mutagénica,

teratogénica, nefrotóxica e hepatotóxica (Pereira et al., 2014).

As micotoxinas são termoestáveis, portanto, durante o ciclo de processamento do alimento

e/ou pasteurização, as mesmas não são destruídas. Sendo um contaminante natural,

principalmente nos vegetais, é praticamente impossível a sua eliminação. Entretanto, torna-

se indispensável minimizar a contaminação por fungos para que estes não representem um

risco para a saúde da população.

1.2. Aflatoxina

Estão descritas 18 tipos de Aflatoxinas, sendo as principais: B1, B2, G1, G2, M1 e M2 (Coll et

al., 2015). A Aflatoxina B1 é a micotoxina mais tóxica e mais abundante. É um dos compostos

naturais mais carcinogénico em todas as espécies de animais pesquisadas. Classificada no

“Grupo I” pela IARC (International Agency for Research on Cancer) como composto altamente

carcinogénico para os seres humanos. Ligam-se ao ADN e interferem na síntese da proteína

(Tattibayeva, 2017).

As Aflatoxinas apresentam tropismo pelos órgãos como o fígado, cérebro e rins. Os principais

fungos produtores desta micotoxina são: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Porém,

também são fungos produtores de micotoxinas: Aspergillus nomius, Aspergillus bombycis,

Aspergillus pseudotamari e Aspergillus ochraceoroseus (Rocha, 2014). A micotoxina

produzida pelo género A. flavus está adaptada a uma grande variedade de climas, substratos

e habitats. Os principais alimentos onde são encontrados maioritariamente são: amendoim,

milho e sementes de algodão. Produz unicamente as Aflatoxina Bs. O género Aspergillus

parasiticus, é sobretudo encontrado em amendoins. Entretanto, todas as estirpes produzem

Aflatoxinas Bs e Gs. Plantas aéreas como no caso do milho, geralmente são suscetíveis a

infeção por Aspergillus flavus, no entanto, plantas rasteiras como os frutos secos em contato

com o solo podem ser infetadas por Aspergillus flavus e parasiticus (Soares, 2013).

Para o desenvolvimento de A. Flavus e consequentemente das Aflatoxinas, a atividade da

água ótima é elevada (aw 0,99) e o valor mínimo é aproximadamente 0,82. O fungo prolifera-

se a uma temperatura entre 10 a 43°C, ocorrendo uma maior produção das micotoxinas a

uma temperatura entre 20 e 30°C.

6 FCUP


Para o fungo A. Parasiticus, as condições são semelhantes, com aw 0,83 para o crescimento

e 0,87 para a produção de micotoxinas. A temperatura ótima para o crescimento do fungo é

de 30°C e para produção de micotoxinas é de 28°C (FAO, 2003).

A intoxicação com Alfatoxina B1 é chamada de “Aflatoxicosis”, e apresenta-se como aguda

ou crónica. A aguda poderá ocorrer a nefrotoxicidade, cardiotoxicidade e hepatotoxicidade,

resultando em um quadro clínico de icterícia, vómitos, dores abdominais e insuficiência

hepática, provocando até mesmo a morte. A crónica relaciona-se com quadros de

desnutrição, carcinogénese e imunossupressão. Afeta o número e a função dos linfócitos e

inibem a fagocitose. Em pacientes que apresentam o vírus da hepatite B, o risco de

desenvolver cancro no fígado aumenta 60 vezes, pois a Aflatoxina B1 é 30 vezes mais potente

nestes indivíduos (Coll, 2015).

1.3. Desoxinivalenol

O Desoxinivalenol (DON) é o tricoteceno originário do género Fusarium graminearum e F.

culmorum. DON é o mais comum e não é classificado como carcinogénico em humanos. Os

tricotecenos são um grupo de aproximadamente 150 metabolitos produzidos pelo fungo do

género Fusarium, Myrothecium, Phomopsis, Stachybotrys, Trichoderma, Trichotecium,

Verticimonosporium entre outros. Os tricotecenos são conhecidos pela capacidade de inibir a

síntese de proteínas eucarióticas, interferindo na iniciação, alongamento e terminação da

síntese proteica (Rocha, 2014).

É encontrado principalmente em cereais, cevada, centeio, trigo e milho. O género F.

graminearum possui temperatura ótima de crescimento de 25°C, aw mínima para o

crescimento de 0,90, o limite máximo é superior a 0,99. É predominante em climas

temperados. Já o F. culmorum possui uma temperatura ótima de 21°C, comum em climas

frios. Outra peculiaridade é que tanto um fungo como o outro têm a capacidade de produzir

outros tricotecenos tóxicos: 15-acetildesoxinivalenol, 3-acetildesoxinivalenol, nivalenol, 4-

acetilnivalenol e fusarenona-X.

Também conhecida como vomitoxina, a ingestão aguda, a curto e longo prazo poderá causar

a inibição do apetite, redução de peso, gastrointerites, vómitos, cardiotoxicidade,

teratogenicidade e imunotoxicidade. Um caso de micotoxicose aguda com a população da

Índia, China e zonas rurais do Japão, ocorreu após a ingestão de milho e trigo mofado. Num

período de cinco a trinta minutos, surgiram os sintomas de náuseas, vómitos, dores

abdominais, diarreia, tontura e dor de cabeça (FAO, 2003; Soares 2013).

7 FCUP


1.4. Ocratoxina

Descoberta em 1965 como um metabolito secundário do fungo Aspergillus ochraceus, durante

estudos para a descoberta de novas moléculas de micotoxinas. Existem cinco tipos de

Ocratoxinas: A, B, C, alfa e beta, entretanto, a A é a mais tóxica. A Ocratoxina A é produzida

por diversos fungos provenientes da armazenagem, são eles: A. ochraceus, A alliaceus, A.

ostianus, A. mellus, Penicilluim viridicatum, P. cyclopium e P. variable (Food Ingredients Brasil,

2009; Rocha 2014; Coll, 2015).

A OA tem sido encontrada em milho, feijão seco, cacau, soja, cevada, frutas cítricas,

castanhas do Brasil, tabaco mofado, presunto curado, amendoim, grãos de café, uvas e

derivados, frutos secos e arroz. Está principalmente presente nos países da Europa e Canadá,

pois são países onde o consumo de alimentos à base de cevada e trigo são maiores. São

nestes alimentos onde melhor se desenvolve o fungo P. verrucosam. Também é possível

encontrar OA na carne de animais que foram alimentados com cereais contaminados (Food

Ingredients Brasil, 2009; Tattibayeva, 2017)

A temperatura de máxima produção para a OA é de 30°C e aw 0,95. Para a A.ochraceus a

produção mínima ocorre a 30°C e aw 0,85. Quando se trata da espécie P. verrucosam, o fungo

desenvolve e produz OA de 0°C a 31°C. Poderá produzir quantidades consideráveis de toxina

a 4°C com aw 0,86. Ao ser ingerida, é absorvida pelo trato gastrointestinal ligando-se às

proteínas plasmáticas, como a albumina, alastrando-se pelo rim e com concentrações

menores no fígado, músculo e tecido adiposo. Os efeitos sobre a saúde não estão claramente

definidos. Efeitos carcinogénicos apenas foram comprovados em estudos com animais, já em

humanos, está apenas limitado a estudos descritivos. Nos animais estudados foi observado

um comportamento hepatóxico, imunossupressor e teratogénico. Com base nestas

evidências a IARC classificou como “grupo 2B”, ou seja, possível carcinogénico para humanos

(FAO, 2003; Food Ingredients Brasil, 2009; Cardona, 2014; Tattibayeva, 2017).

1.5. Zearalenona

Esta micotoxina é produzida pelo género Fusarium, sendo: F. graminearum, F.culmorum, F.

cerealis, F. esquiseti, F crookwellense, F. semitectum. São encontradas maioritariamente nas

culturas de milho, aveia, centeio, cevada e trigo em continentes como a América, Europa e

Ásia. A Zearalenona geralmente ocorre em simultâneo com a DON, pois são produzidas pelo

mesmo género de fungo, mas é encontrada em concentrações menores, quando comparada

com o DON. O fungo coloniza a planta no estágio de floração, em períodos de chuva. Mesmo

8 FCUP


após a colheita, se o nível de humidade for elevado o fungo crescerá e produzirá a micotoxina

(Food Ingredientes Brasil, 2009; Soares et al., 2013).

A exposição a ZEA está relacionada com hiperestrogenismo em porcos, foi observado que

em altas concentrações os porcos também apresentaram alguns distúrbios como o aborto.

Foram relatados problemas reprodutivos em vacas e espécies de ovinos. Os estudos

experimentais realizados em animais não demonstraram quaisquer relações com o

desenvolvimento de cancro (Rocha et al., 2014). Já em humanos, segundo Cardona (2014) a

exposição a esta toxina tem sido responsável por alguns casos de puberdade precoce em

raparigas.

1.6. Distribuição geográfica, principais alimentos, efeitos

toxicológicos e patológicos.

A Tabela 1 apresenta as principais micotoxinas presentes nas diversas regiões, assim como

os principais alimentos e os efeitos causados quando ingeridas.

9 FCUP


Tabela 1 - Principais micotoxinas de acordo com a região, principais alimentos e efeitos para a saúde

Micotoxina Estrutura Química Região Predominante Efeitos Tóxicos Efeitos Patológicos Alimentos

AFLA

América do Norte,

América do Sul, África, Ásia e Austrália.

Citotóxico, mutagénico, hepatotóxico,

carcinogénico, teratogénico,

imunossupressor.

Hiperplasia das vias biliares, hemorragias intestinais e

renais, tumores no fígado, hepatite aguda, cirrose

hepática.

Frutos secos, cereais,

café, oleaginosas e amendoins.

DON

América do Norte, América do Sul,

Europa (Leste e Oeste).

Imunossupressor, neurotóxico, genotóxico,

teratogénico.

Náuseas temporais, vómitos, diarreia, dor abdominal, dor de cabeça, tonturas, febre,

anorexia.

Cereais de grão pequeno.

OCRA

América do Norte, América do Sul e

Europa (Oeste).

Citotóxico, nefrotóxico, teratogénico,

hepatotóxico.

Nefropatia endémica, nefropatia intersticial crónica,

enterite, nefropatia suína,

tumores renais.

Uvas, uvas passas, cafés, frutos secos,

cereais e pastelaria.

ZEA

América do Norte, África, Europa (Leste e

Oeste).

Genotóxico, efeito estrogénico.

Puberdade precoce, edema

da vulva, prolapso vaginal, atrofia testicular e dos

ovários, aumento das mamas

e aborto.

Cereais de grão pequeno.

10 FCUP


1.7. Teores máximos permitidos conforme o decreto CE N.1881 2016

Os teores máximos permitidos para as micotoxinas presentes em alimentos estabelecidos pelo decreto da Comissão Europeia de 19 de

Dezembro de 2006, estão resumidamente apresentados na tabela a seguir:

Tabela 2 - Teores máximos permitidos para Aflas, DON, OCRA e ZEA em alimentos conforme o decreto CE N.1881 2016

Alimento

Micotoxina

Alimento

Micotoxina

Alimento

Micotoxina

Alimento

Micotoxina

Afla B1 (μg/kg) Afla Total Ocratoxina A

(μg/kg) Desoxinivalenol

(μg/kg) Zearalenona

(μg/kg)

Amendoins e frutos de casca rija

2,0 4,0 Cereais 3,0 Cereais 750,0 Cereais 75,0

Frutos secos 5,0 10,0 Uvas passas 10,0 Pão 500,0 Pão 50,0

Cereais 2,0 4,0 Café 5,0 Alimentos para

bebés 200,0

Alimentos para

bebés 20,0

Milho 5,0 10,0 Vinho 2,0

Especiarias 5,0 10,0 Alimentos para

bebés 0,50

Alimentos para bebés

0,10 -

11 FCUP


1.8. Parâmetros para a deteção das micotoxinas

Existem diversas metodologias para a análise e identificação de micotoxinas. No entanto, para

que uma análise seja fiável, dependerá de alguns fatores essenciais, apresentados a seguir.

1.8.1. Amostragem

Uma toma representativa do alimento, assim como sua devida homogeneização, é

fundamental para que a análise da amostra seja bem sucedida. As toxinas produzidas pelos

fungos não se distribuem uniformemente pelo alimento. Uma amostra não representativa

poderá invalidar a análise das micotoxinas.

1.8.2. Matrizes complexas

O sucesso da análise decorre da capacidade de separar a micotoxina de uma matriz

complexa. Uma matriz complexa pode ser considerada como amostras que contenham

diferentes composições como por exemplo o teor de carboidratos, proteínas e lípidos. Estes

por sua vez, podem interferir na separação e determinação das micotoxinas.

1.8.3. Limites de deteção baixos

Os limites de deteção são extremamente baixos, em alguns casos em ppb (partes por bilião),

µg/kg ou ng/kg. Um método de deteção bem sucedido deverá ser capaz de detetar estes

níveis de contaminação, com amostras aceitáveis de falsos negativos e positivos (Turner et

al., 2015).

Os métodos utilizados atualmente têm seguido uma série de etapas em comum como:

amostragem, homogeneização, extração, uma etapa de separação para eliminar ou minimizar

os componentes indesejados, purificação, concentração e finalmente a deteção confirmativa.

Entre os métodos de extração está a extração sólido-líquido, onde o analito é extraído por

intermédio de um ou vários solventes de uma matriz sólida. Na sequência é incluída uma

etapa de purificação do extrato obtido, de modo a eliminar os possíveis interferentes. Esta

purificação é realizada com colunas de imunoafinidade, pois permite um limite de deteção

extremamente baixo. Para a deteção confirmativa, utilizam-se técnicas cromatográficas

acopladas a uma variedade de detetores ou métodos imunoquímicos. Estas técnicas são

12 FCUP


conhecidas como: Cromatografia Líquida (LC), Cromatografia Gasosa (GC) e Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (HPLC), combinadas com detetores como a Espectrometria de

Massa (MS), Fluorescência (FLD), Ultravioleta (UV), Ionização de Chama (FID) ou Captura

Eletrónica (ECD). Já as técnicas de rastreio de amostras são realizadas por Cromatografia

em Camada Fina (TLC) ou Imunoensaio, como o Ensaio de Imunoabsorção Enzimática

(ELISA). Porém, estas duas últimas técnicas apenas permitem resultados qualitativos ou

semi-qualitativos (Pereira et al., 2014; Tattibayeva, 2017).

Na sequência estão descritas as técnicas utilizadas para a determinação das micotoxinas,

assim como o funcionamento do HPLC.

1.9. A técnica

1.9.1. Preparação da amostra

Assim como citado nos itens 1.8.1 e 1.8.2, os alimentos geralmente apresentam grande

complexidade na sua composição, logo, a etapa de amostragem é fundamental para a

obtenção de resultados fidedignos e a amostra deverá ser representativa de todo o produto a

analisar. Para alimentos como cereais, por exemplo, são utilizados moinhos que possam

reduzir os grãos inteiros a pó. Alimentos fluídos como vinhos, bebidas, papas e polpas de

frutas destinadas a alimentação infantil, são homogeneizados muitas vezes na própria

embalagem. Quando os alimentos a serem analisados são pastelarias, frutos secos etc, estes

necessitam de ser processados, de modo a obter um produto homogéneo.

1.9.2. Extração com solventes

1.9.2.1. Extração sólido-líquido

É a técnica utilizada para extrair a micotoxina de uma matriz sólida por intermédio de um

solvente. Normalmente é utilizada para extração de grãos, cereais e outras matrizes sólidas.

O solvente a ser utilizado varia de acordo com o analito a ser extraído. A grande maioria das

micotoxinas são solúveis em solventes polares e ligeiramente polares, entretanto, são

insolúveis em solventes apolares. Assim, são utilizadas misturas de solventes orgânicos como

a acetona, acetonitrilo, clorofórmio, diclorometano, acetato de etilo ou metanol com uma

pequena porção de ácidos diluídos ou água. A utilização de água ou sua acidificação promove

13 FCUP


a eficiência da extração, uma vez que a água aumenta a penetração do solvente dentro do

alimento. Já a acidificação auxilia na quebra de interações moleculares entre a toxina e outros

constituintes como proteínas e açúcares. Muitas vezes solventes apolares são utilizados antes

de realizar a extração sólido-líquido, de modo a remover componentes lipofílicos. A relação

amostra e solvente, assim como o tempo de extração e temperatura devem ser

cuidadosamente controlados para que ocorra uma correta quantificação da toxina. (Pereira et

al., 2014; Fernandes, 2016).

Conforme citado por Pereira et al. (2014), estudos realizados com misturas de solventes

mostraram que a mistura de metanol com acetonitrilo, permite uma co-extração reduzida de

componentes indesejados da matriz sólida. Quando preparado na proporção acetonitrilo/água

(84:16) produziu menos compostos interferentes do que em outras misturas.

1.9.2.2. Extração líquido-líquido

É a técnica utilizada para extrair a micotoxina de uma matriz líquida por intermédio de um

solvente. Na extração líquido-líquido o solvente que apresenta uma baixa constante dielétrica

(tendem a ser imiscíveis com água) possuem baixa capacidade de extração de compostos

polares como as micotoxinas. Os solventes mais adequados são o metanol ou acetonitrilo e

devem ser misturados com a água na presença de sais para que estes reduzam a

miscibilidade mútua. Os analitos polares movem-se seletivamente da fase aquosa para a fase

orgânica polar (Turner et al., 2015).

1.9.2.3. Separação/purificação da micotoxina por Colunas de

Imunoafinidade (IAC)

Após a etapa de extração, a micotoxina presente no líquido é isolada por intermédio de

colunas de extração de fase sólida. Nesta etapa serão reduzidos os possíveis interferentes

presentes na matriz. A utilização de colunas de imunoafinidade (IAC) é uma das técnicas com

maior utilização, pois aumentam a seletividade do método. Essas colunas são compostas por

uma fase sólida constituída por anticorpos específicos para cada tipo de micotoxina. Quando

o líquido passa pelo interior da coluna, o analito (micotoxina) de interesse liga-se

seletivamente ao anticorpo, enquanto as impurezas são lixiviadas. Na sequência, o analito é

14 FCUP


eluído por intermédio de um solvente ou uma mistura de solventes, de acordo com a

micotoxina a ser estudada (Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).

Figura 2 - Funcionamento de uma coluna de imunoafinidade (Adaptado de Kos 2015)

As colunas de imunoafinidade são destacadas pela simplicidade, alta especificidade,

recuperação, melhor limite de deteção, reduzida percentagem do coeficiente de variação e

análise de múltiplos compostos em uma gama variada de matrizes. Os anticorpos utilizados

na fase sólida poderão ser monoclonais ou policlonais. Monoclonais apresentam um grau de

pureza elevado e são mais sensíveis às condições de ligação dos que os policlonais. É

necessário ter em conta que na presença de solventes orgânicos poderá ocorrer a

desnaturação do anticorpo, sendo assim, é de relevante importância que o extrato a ser

passado pela coluna, seja uma solução aquosa contendo muito pouco ou nenhum solvente

orgânico. A coluna só poderá ser utilizada uma única vez, pois, quando a micotoxina é eluída,

o anticorpo desnatura (Amado, 2002; Pereira et al., 2014; Fernandes, 2016).

Adição da matriz

contendo a

micotoxina

A micotoxina liga-se

ao anticorpo sendo

isolada da matriz

Eluição com o solvente

adequado, desnatura o

anticorpo, libertando a

toxina

Anticorpo

imobilizado

15 FCUP


1.9.3. Cromatografia

1.9.3.1. Histórico

Originária do grego “chroma” (cor) e “graphein” (escrever) a cromatografia é datada do ano

de 1903, quando o botânico russo Mikhail Semenovich Tswett, ministou uma palestra e

publicou um artigo com as aplicações da adsorção em análises bioquímicas. Em 1906 mais

dois artigos foram publicados e Tswett descreveu um método físico-químico testado por ele,

onde realizou a separação de pigmentos das plantas. O método possibilitou a separação de

pigmentos de cloroplastos presentes nas folhas verdes das plantas. O botânico utilizou uma

coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (fase estacionária) e o éter de petróleo

(fase móvel), obtendo assim a completa separação dos componentes em faixas coloridas

(Pacheco et al., 2017; Fernandes, 2016; Torre 2013).

Até a década de 30, a cromatografia não tinha muita importância, entretanto o químico alemão

Richard Kuhn em conjunto com o seu pós-doutorando o bioquímico francês Edgar Lederer,

aprimoraram a técnica e conseguiram separar e identificar xantofilas da gema do ovo. Já na

década de 40, os químicos britânicos Archer Martin e Richard Synge, surgiram com o modelo

e a explicação dos pratos teóricos, que está relacionado com a eficiência da separação,

trouxeram conceitos essenciais sobre o GC e o HPLC.

A partir da década de 70, foi possível fabricar colunas com partículas de tamanho reduzido,

importantes para uma boa resolução, também houve o surgimento de equipamentos capazes

de trabalharem sobre altas pressões o que possibilitou um aumento da velocidade na eluição

da fase móvel e consequemente reduzir o tempo de análise. Com o passar dos anos a técnica

sofreu avanços, até surgir a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. É a técnica de

separação mais usual, pois apresenta uma grande sensibilidade e é aplicável a uma vasta

gama de substâncias de elevado significado para as indústrias, ciência e população em geral

(Fernades, 2016; Torre, 2013; Collins, 1997).

Na análise através do HPLC, a utilização de detetores como UV, espalhamento de luz,

fluorescência aliados a softwares específicos, possibilitam a identificação e a análise

quantitativa dos componentes de uma mistura em concentrações muito reduzidas (Lanças,

2009).

16 FCUP


1.9.3.2. Conceito

Quando ocorre uma separação via HPLC, a análise qualitativa dá-se através de uma

representação gráfica com picos (cromatogramas) equivalentes a cada composto da amostra

analisada. A separação dos picos através do sistema cromatográfico é definida de acordo

com a resolução, a retenção e a seletividade. A resolução, definida como a capacidade da

separação. É obtida através da razão da diferença entre a distância de dois picos pela média

da largura do pico, conform a expressão a seguir. (Chust, 1990).

Figura 3 - Cálculo para a resolução do pico (Silva, 2016)

Em que:

R = 0 (não há separação)

R = 1,0 (separação parcial)

R = 1,5 (separação na linha de base)

A retenção mede a capacidade do sistema cromatgráfico em reter os componentes de uma

amostra. Já a seletividade é a capacidade do método de detetar um componente de uma

mistura de outros compostos dentro de uma matriz complexa (Aragão et al., 2009). O volume

de retenção/eluição é definido como o volume de fase móvel essencial para arrastar o soluto

através da coluna cromatográfica. O tempo é obtido de acordo com o tempo demorado após

a injeção da amostra na coluna até o soluto atingir o detetor. Maior será a capacidade da

separação quando maior for o tempo que o soluto é retido pela coluna (Fernandes 2016;

Kupiec 2004; Chust, 1990).

A dispersão dos picos cromatográficos comparado ao seu centro é descrito com base nos

pratos teóricos. Caso os picos não saiam simétricos e apresentem apenas uma proximidade

17 FCUP


a forma Gaussiana, a quantidade de pratos teóricos é reduzida. É um fator que facilita o

controlo da eficiência do sistema e o desgaste da coluna cromatográfica. (Chust, 1990).

O processo de eluição (passagem do eluente pela coluna) poderá ser por dois tipos:

✓ Eluição isocrática: a composição da fase móvel não se altera durante a separação.

É a técnica mais simples;

✓ Eluição por gradiente: ocorre a mudança na composição da fase móvel durante a

separação, é indicado para a análise de matrizes complexas.

A redução da viscosidade da fase móvel proporciona um melhor desempenho da coluna

cromatográfica. Essa redução é influenciada pelo aumento da temperatura, entretanto, a

temperatura deve ser sempre controlada, caso contrário originará uma diminuição na

reprodutibilidade e cromatogramas com resolução reduzida (Fernandes, 2016).

1.9.4. Componentes de um HPLC

1.9.4.1. Injetor

Atualmente há muitos sistemas de injeção, entretanto, os mais usuais são as válvulas

manuais ou injetores automáticos. Na injeção manual, há uma válvula com seis vias e duas

posições permitindo que com o auxílio de uma seringa o loop (alça de amostragem) seja

preenchido pela amostra a ser analisada. Em sequência a válvula é rodada, de modo a inserir

o loop na linha cromatográfica em direção ao sistema de bombeamento e a coluna. Os

injetores automáticos apresentam as mesmas funções que um operador executaria na

operação manual: preenche o loop através da inserção da amostra por intermédio de uma

seringa. Outro modelo de injeção automática preenche o loop por meio de sucção da amostra.

Já outra vertente, possui a agulha de amostragem integrada ao loop de amostragem (Neto,

2009).

1.9.4.2. Bomba

As bombas utilizadas são de alta pressão e devem possibilitar o controle da pressão máxima.

Como a fase móvel é um líquido e apresenta alguma viscosidade, é essencial que seja

exercida uma pressão sobre a respetiva, de modo a permitir ultrapassar a resistência exercida

pelas partículas da coluna. Essas partículas apresentam caminhos de difusão relativamente

18 FCUP


curtos, logo, produzem um elevado número de pratos teóricos. A bomba é considerada o

“coração do HPLC” e dela dependem uma variedade de fatores (Fernandes, 2016; Chust,

1990).

Caso o fluxo varie ocorrerá a modificação dos tempos de retenção e das áreas dos picos

cromatográficos, sendo assim, é essencial que o fluxo da fase móvel seja constante, não

apresente pulsações e tenha a possibilidade de ser regulado de acordo com o método a ser

realizado para a análise de uma amostra, é necessário utilizar fluxos baixos, para que assim

permita uma boa precisão e repetibilidade. O fluxo ideal poderá variar de 0,1 ml/min a 5,0

ml/min (Degani et al., 1998; Chust, 1990).

1.9.4.3. Coluna cromatográfica

É na coluna (fase estacionária) que ocorre a separação dos componentes da mistura/amostra.

É um dos componentes mais importantes e crítico no sistema cromatográfico. Geralmente as

colunas são compostas por aço inoxidável o que favorece a resistência à corrosão, são

resistentes a altas pressões e são reaproveitáveis, pois, não há a necessidade de efetuar a

regeneração após a sua utilização. Ao definir o tipo de coluna, é necessário definir as

características da amostra a ser separada conforme o diagrama apresentado por Chust

(1990):

Os diversos componentes presentes na amostra apresentam propriedades distintas, logo

diferentes graus de afinidade com a fase móvel e a coluna, sendo a velocidade de migração

distinta, o que irá permitir a separação cromatográfica. Assim, os componentes que possuem

Amostra Carga iónica

Estrutura

Química

Polaridade

Hidrossolúvel

Lipossolúvel

Positiva

Negativa

Grupo

Funcional

Estereoquímica

Figura 4 - Características químicas de uma amostra (Adaptado de Chust, 1990)

19 FCUP


maior interação/ligação com a coluna serão aqueles que irão eluir por último, já os que

apresentam menor interação serão eluídos primeiro.

As colunas cromatográficas apresentam geralmente um diâmetro interno de 3 a 5 mm e o

comprimento varia de 10 a 50 cm. A capacidade da coluna é estabelecida pelo seu

comprimento e o material ao qual é contida internamente. Nas extremidades da coluna sem

provocar um aumento da pressão, há um disco de metal poroso ou teflon, de modo a previnir

a perda do recheio da coluna ou possíveis mudanças na compactação. O tamanho dos poros

está relacionado com a superfície que a amostra irá interagir. Uma coluna que funcione

adequadamente, as micropartículas devem ser esféricas e o seu tamanho reduzido, o que

proporcionará em uma elevada eficiência e área superficial proporcionando uma maior

retenção (Collins, 1997)

A fase estacionária poderá ser:

✓ Fase normal: a fase móvel é apolar e a fase estacionária é polar, os componentes

apolares serão eluídos primeiro, enquanto os polares ficarão retidos na coluna e serão

eluídos posteriormente;

✓ Fase reversa: quando a fase móvel é polar e a estacionária é apolar, logo os

componentes polares serão os primeiros a serem eluídos e os apolares os últimos.

Nas análises por HPLC, geralmente é utilizado a fase reversa em colunas C18

octadecilsílica (Silva, 2012; Degani et al., 1998)

É necessário que o solvente utilizado na fase móvel, apresente um elevado teor de pureza,

para evitar que este contamine a coluna. A fase móvel deverá ser filtrada, para a remoção de

partículas sólidas, oxigénio ou outros gases dissolvidos. Um outro modo de proteger a coluna

principal, é a inserção de uma pré-coluna (2-5 cm de comprimento) com as mesmas

características, é situada entre o injetor e a coluna principal (Degani, 1998; Collins, 1997).

1.9.4.4. Detetor

O detetor identifica a presença do sinal do analito de interesse que está a ser eluído na coluna,

gerando um sinal eletrónico em forma de pico cromatográfico. A sensibilidade é estimada de

acordo com a relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que faz com que

gere este sinal (Peres, 2002).

Um bom detetor deverá apresentar uma elevada sensibilidade, baixo limite de detecção, uma

alargada faixa de linearidade, confiabilidade e reprodutibilidade, ser facilmente operável, não

destruir o soluto, apresentar insensibilidade a possíveis mudanças na fase móvel e à

20 FCUP


temperatura e baixo nível de ruído. Há uma grande variedade de detetores, a escolha

dependerá das características químicas/estruturais do analito a detetar (Collins, 1997; Chust,

1990).

Entre os detetores estão:

✓ Ultravioleta – Visível (UV-Vis) e de díodos: também conhecidos como detetores

fotométricos, medem a absorvância do UV-Vis. O funcionamento é com base na

absorvância da luz por parte da amostra. A resposta deste detetor é seletiva, pois

apenas deteta as substâncias que absorvem em um determinado comprimento de

onda. São insensíveis a variações de temperatura e vazão. São constituídos por uma

lâmpada de excitação, um filtro ou rede de difração e um divisor do feixe de luz que

dirige cada um dos feixes resultantes e de mesma intensidade a cada uma das duas

células de detecção (amostra e referência), incidindo posteriormente em um

fotodetetor. O fotodetetor medirá a diferença de intensidade de luz entre as células (a

luz que não é absorvida) e gerará um sinal elétrico que será amplificado e convertido

em unidades de absorção. A única desvantagem apresentada provém de sua

seletividade, uma vez que não podem ser utilizados nas análises de deteção de

lípidos, hidratos de carbono, ácidos gordos, hidrocarbonetos e grande parte dos

polímeros. O deteror de díodos utiliza os mesmos princípios do UV, entretanto, permite

a aquisição simultânea em vários comprimentos de onda . O detetor de díodo identifica

o espectro do composto e deteta o comprimento de onda, originando uma

quantificação precisa do composto (Collins, 1997; Chust, 1990).

✓ Fluorescência: é um detetor específico e um dos mais sensíveis para compostos

fluorescentes. Com condições adequadas é possível detetar quantidades na ordem

dos ppb. Entre os detetores de HPLC é o que apresenta maior sensibilidade, sendo

1000 vezes superior à do detetor de UV. Engloba todas as características do detetor

de UV-Vis e permite distinguir os componentes de interesse de uma amostra complexa

de substâncias não fluorescentes. Uma lâmpada de excitação seguida de um filtro de

excitação ou uma rede de difração incide um feixe luminoso sobre a célula de amostra

e excita os átomos da respetiva, o que origina a emissão de um feixe de luz ao voltar

ao estado fundamental. Esse feixe é dirigido a um segundo filtro ou monocromador

que distingui o comprimento de onda emitido, incidindo-o no fotodetetor. Apresenta um

elevado custo, porém, possibilita a análise de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos,

esteroides, vitaminas e corantes alimentares (Collins, 1997; Chust 1990).

21 FCUP


✓ Condutividade: a principal aplicação é na cromatografia iónica (análise de aniões e

catiões) e metais de transição. É considerado um detetor de alta sensibilidade e

seletividade. O detetor mede a condutividade total da solução (eluente + amostra)

através de uma célula tubular com dois, quatro ou mesmo seis elétrodos de prata,

platina ou aço inoxidável. Geram um sinal analítico que será tratado e quantificado.

Apresenta grande sensibilidade na deteção (até10-8 M) e mudanças de temperatura.

Devido a este fator e a condutividade do eluente, é preciso recorrer a processos de

compensação e supressão química (reduz os interferentes da fase móvel na medição)

ou eletrónica (Inkemia Brasil, 2016; Chust, 1990).

✓ Índice de refração: é um detetor universal, pois apresenta resposta a qualquer

espécie de amostra, entretanto, a sua sensibilidade é moderada, sendo o UV 1000

vezes mais sensível. O funcionamento é baseado na mudança do índice de refração

do eluente devido os componentes da amostra, quanto maior for a diferença de

refração do componente e da fase móvel, maior será a intensidade do sinal. É sensível

às alterações de temperatura o que ocasiona a alteração da resposta do detetor. Não

é recomendado para análises de gradiente. Geralmente são utilizados quando os

demais detetores não correspondem aos compostos de interesse, e a sensibilidade

não seja relevante em separações preparativas e análises de macromoléculas em

cromatografia por exclusão de tamanho (Inkemia Brasil, 2016).

✓ Eletroquímico: também conhecido como amperométrico, possui uma grande

sensibilidade para detetar aminas biogénicas e alguns iões que não são detetados por

condutimetria, por exemplo, os cianetos, sulfuretos, sulfitos, halogenetos e arsenatos.

O seu funcionamento provém da oxidação ou redução do composto a analisar na

superfície do elétrodo. O ganho ou perda de eletrões proveniente da redução ou

oxidação gera uma corrente proporcional à concentração do composto ao passar na

célula de deteção. Apresenta uma grande sensibilidade (10-7 M) e permite uma boa

especificidade na identificação dos compostos obtidos através da seleção do potencial

redox da reação (Chust, 1990).

✓ Espectrometria de massas (MS): permite a informação estrutural de compostos e a

identificação de componentes desconhecidos presentes em amostras, através da

determinação da massa, carga e estrutura proveniente da forma ionizada dos

componentes. Apresenta elevada sensibilidade. As moléculas de uma amostra são

transformadas em iões em fase gasosa, em sequência são separados no

22 FCUP


espectrómetro de acordo com a sua razão massa sobre a carga (Ikemia Brasil, 2016;

Wilson & Walker, 2010).

1.9.4.5. Sistema de processamento de dados

É neste componente onde ocorrerá o processamento de dados, o sinal obtido pelo detetor é

convertido em cromatograma. Os dados obtidos são processados e armazenados no

computador. Com a análise do cromatograma é possível identificar o tempo de retenção, a

altura do pico, a área e controlar a linha de base. O sistema de processamento de dados,

também trará informações a cerca da bomba, fluxo, em resumo comandará todos os

componentes do HPLC.

Figura 5 - Componentes de um HPLC (Adaptado de Keliri, 2017)

1.9.5. Os mecanismos de separação cromatográfica

A cromatografia líquida é classificada em cinco mecanismos distintos no processo de

separação. São eles:

✓ Adsorção: a separação é baseada nas diferenças de afinidade entre os componentes

da amostra e a fase estacionária. As moléculas são reversivelmente retidas na fase

estacionária. Dá-se então a separação dos componentes da amostra em bandas ou

zonas discretas, as quais poderão ser analisadas qualitativamente e

quantitativamente. Este mecanismo poderá ser de fase normal ou reversa, entretanto

23 FCUP


a fase estacionária deverá possuir uma área superficial específica elevada, pois a

retenção é diretamente proporcional à área superficial (Fernandes, 2016).

✓ Partição: é composta por uma fase estacionária líquida e através da adsorção fica

retida na superfície da coluna e uma fase móvel líquida, que entra em contacto com a

fase estacionária que poderá ser polar ou apolar. A separação dos componentes

levará em conta a solubilidade da matriz em comparação com a fase móvel e

estacionária. Os componentes com maior solubilidade na fase móvel, serão eluídos

primeiramente e os componentes com maior solubilidade com a fase estacionária

serão retidos (Silva, 2012).

✓ Permuta iónica: a fase estacionária é carregada com catião ou anião, os

componentes das amostra com cargas contrários a fase estacionária são adsorvidos

seletivamente da fase móvel. Todos estes compostos adsorvidos são posteriormente

eluídos por deslocamento com outros íons com a mesma carga, entretanto, com maior

força de interação com a fase estacionária (Collins, 1997).

✓ Exclusão de tamanho: também conhecida como Permeação em Gel (GPC) e

Filtração em Gel (GFC). É utilizada para compostos de elevado peso molecular. Os

componentes da amostra são separados consoantes o tamanho da molécula.

Empacotada com um material inerte e com porosidade controlada, quando o

componente da amostra entra em contacto com a fase estacionária as micromoléculas

são retidas nos poros. Isto acarretará em uma maior retenção, logo, serão eluídas

mais tardamente, quando comparado com as moléculas maiores (Silva, 2012).

✓ Afinidade: as macromoléculas biológicas unem-se reversivelmente a ligantes

específicos. É necessário preparar uma fase estacionária seletiva, através da

imobilização covalente de ligantes específicos. A macromolécula de interesse ao

entrar em contacto com a coluna é retida, enquanto as moléculas que não possuem

afinidade com o ligante são eluídas (Collins, 1997).

24 FCUP


25 FCUP


Parte II - Validação de métodos

26 FCUP


2. Validação de métodos analíticos

A validação de métodos de ensaios tem a finalidade de verificar os requisitos específicos que

são adequados para a finalidade pretendida, logo, é necessário a validação de métodos não

normalizados, métodos criados ou desenvolvidos pelo próprio laboratório ou métodos

normalizados utilizados fora do âmbito para os quais foram concebidos e em ampliações de

métodos normalizados. A descrição do método de ensaio interno deve ser realizada em

documentos, de maneira detalhada e de modo a que qualquer pessoa com formação

adequada o possa executar (Pereira, 2016; Guia RELACRE, 2000).

O principal foco da validação é a confirmação das características do método, se atendem ou

não as especificações requeridas para os resultados analíticos, de modo a estabelecer limites

de controle a serem empregues no trabalho diário. É um aspeto fundamental para demonstrar

a fiabilidade do método nas condições praticadas, permitindo a obtenção de resultados muito

próximos ao valor verdadeiro do teor de um dado analito presente em uma amostra.

Resumidamente, a validação será um comprovativo, partindo de evidências diretas, de que o

método satisfez todos os requisitos para uma dada aplicação ou uso específico, garantindo a

qualidade analítica. Quando ocorrerem mudanças nas características de um método já

implementado e validado no laboratório, este deverá ser revalidado (Martins, 2016; Costa,

2015).

Os requisitos mínimos para uma validação irão depender do tipo de método em causa,

entretanto, compreendem a investigação e o conhecimento da gama de trabalho/linearidade,

limiares analíticos (deteção e quantificação), sensibilidade, precisão e exatidão para análises

quantitativas. Em análises qualitativas os parâmetros mais importantes a serem estudados

são o limite de deteção, a seletividade/especificidade e a robustez (Guia RELACRE, 2000).

2.1. Seletividade/Especificidade

A seletividade é a capacidade de um método identificar e distinguir um analito específico em

uma matriz complexa sem a interferência dos outros componentes. A matriz poderá conter

compostos que interferem na medição. Esses interferentes poderão aumentar ou diminuir o

sinal, a magnitude do efeito também dependerá da concentração do analito (Pereira, 2016;

Guia RELACRE, 2000).

A especificidade de um método é quando este consegue separar o analito dos outros

compostos presentes na amostra. Em resumo, é quando o sinal medido é proveniente

27 FCUP


unicamente do analito em estudo. É possível avaliar as interferências, através de um teste de

recuperação com uma série de amostras, com a mesma matriz, apenas variando a

concentração do analito, em duplicado e em condições de repetibilidade. O método será

específico e seletivo quando obter taxas de recuperação próximas a 100%, ou de acordo com

os critérios de aceitação pré-determinados pelo laboratório. (Guia RELACRE, 2000).

2.2. Sensibilidade

Irá avaliar a capacidade de um método ou equipamento distinguir as diferenças mínimas na

concentração do analito. É definida como o quociente entre o acréscimo do valor lido (∆L) e

variação da concentração (∆C) correspondente a esse acréscimo. A sensibilidade

corresponde a derivada de primeira ordem da curva de calibração nessa zona de

concentração, se a curva de calibração for um modelo linear, a sensibilidade será constante

ao longo de toda a gama de trabalho, e equivalente ao declive da reta de calibração (Guia

RELACRE, 2000).

Sensibilidade = ∆L

∆C

(1)

2.3. Limiares analíticos

2.3.1. Limite de deteção (LD)

É o teor mínimo medido, no qual é detetado a presença do analito, entretanto, não

necessariamente quantificada como valor exato, com uma certeza estatística razoável

(usualmente 95%). Uma leitura inferior ao LD, não significa que o analito esteja ausente na

amostra, apenas é afirmado que com a probabilidade definida, a concentração do analito será

inferior a um certo valor (Pereira, 2016). É também denominado como a concentração mínima

distinguível de uma amostra com a mesma matriz, mas sem o analito (branco).

(2)

28 FCUP


Onde:

Sy/x: desvio padrão residual da curva de calibração

b: declive da reta.

2.3.2. Limite de Quantificação (LQ)

Corresponde à menor concentração medida, na qual é possível quantificar o analito com uma

determinada exatidão e precisão. Após a determinação de LQ, é necessário recorrer a uma

série de padrões internos, em condições de precisão intermédia cuja concentração se

encontre próxima ou igual à do limiar de quantificação, de modo a testar e verificar se a

exatidão e precisão obtida é satisfatória.

(3)

2.4. Linearidade

Corresponde a capacidade do método analítico produzir um sinal diretamente proporcional à

concentração do analito dentro do intervalo da gama de trabalho. Para traçar a curva de

calibração são necessários definir no mínimo cinco pontos, excluindo o ponto zero para não

proporcionar possíveis erros associados. Este parâmetro pode ser verificado através da

visualização da reta de calibração do gráfico e do valor do coeficiente de correlação linear

obtido que deve ser maior que 0,995 e por avaliação estatística através do teste RIKILT, o

qual analisa a linearidade de cada ponto da curva de calibração (Fernandes, 2016).

y = ax + b

(4)

Em que:

y: sinal instrumental

a: declive da reta

x: concentração do analito

b: interseção da reta com o eixo y (ordenada de origem)

29 FCUP


Para avaliar é necessário determinar a razão entre o sinal instrumental (yi) e a concentração

do padrão (xi) para cada ponto da reta e a média das razões obtidas (y i/xi)m. Na sequência é

calculada a percentagem da linearidade para cada ponto. E para que o método seja

considerado linear, é considerado o valor da média como 100% o que indica uma linearidade

perfeita, e cada ponto da reta deverá estar situado entre os 90% e 110%. Se houver algum

valor fora deste intervalo, este deverá ser descartado e o teste RIKILT deverá ser novamente

aplicado à gama reduzida, até se verificar os requisitos estabelecidos (Fernandes, 2016).

A equação a ser utilizada está representada a seguir:

(5)

2.5. Gama analítica

A gama de trabalho corresponde ao intervalo de concentrações no qual o analito pode ser

determinado com boa linearidade, precisão e exatidão. A escolha da gama, deve ter em

consideração a abrangência de toda a gama de concentração das amostras, sendo

recomendado que a concentração mais frequente das amostras incida sobre o centro da gama

(Martins, 2016; Pereira, 2016).

2.6. Precisão

A precisão avalia a dispersão dos resultados obtidos em ensaios independentes, repetidos

sobre a mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões em condições definidas. Permite

constatar que o método tem a capacidade de repetir e reproduzir os resultados obtidos em

análises sobre a mesma amostra ou padrão. É recomendável a utilização de amostras reais,

para que o efeito matriz, que pode influenciar os resultados obtidos bem como a avaliação da

precisão, seja considerado.

A dispersão é avaliada através de duas medidas extremas: repetibilidade e reprodutibilidade.

Entre ambas existe uma situação intermédia designada por precisão intermédia ou

variabilidade interlaboratorial (Guia RELACRE, 2000).

30 FCUP


A precisão pode ser expressa sob a forma de desvio-padrão:

(6)

Ou pelo coeficiente de variação:

(7)

Em que s corresponde ao desvio padrão da precisão intermédia e �̅� a média dos resultados

obtidos.

2.6.1. Repetibilidade

Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições idênticas (ensaios

realizados sobre a mesma amostra, mesmo laboratório, mesmo analista, mesmo

equipamento, mesmo tipo de reagentes e a curtos intervalos de tempo). Para determinar a

repetibilidade de um método no próprio laboratório, é realizado uma série de medições (n ≥

10) sobre uma mesma amostra ou padrões em condições de repetibilidade. O limite de

repetibilidade é o valor máximo admissível para a diferença absoluta ente dois ensaios em

condições de repetibilidade, determinada para o nível de confiança de 95%.

∆𝒓 = 𝒕u𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) × √𝟐 × �̅�𝒓i

(8)

Onde o n é o número de réplicas que servem de base para determinar o desvio-padrão S̅𝒓i ,

referente à repetibilidade estimada 𝒕u𝟎,𝟎𝟓(n−𝟏) o valor crítico da distribuição t-student, com um

nível de significância de 0,05 e com n-1 graus de liberdade.

É necessário também considerar o coeficiente de variação de repetibilidade, CVr que é

numericamente igual à razão entre o desvio-padrão da repetibilidade (Sri) e a média dos

resultados obtidos, �̅�:

31 FCUP


%𝑪𝑽𝒓 = 𝟏𝟎𝟎 × 𝑺𝒓𝒊

�̅�̅

(9)

Para verificar o afastamento ou resultados discrepantes das medições, é necessário aplicar o

teste de Grubbs:

G calculado = |𝒙̅𝒔−�̅�̅|

𝒔

(10)

xs é o valor suspeito

�̅� é o valor médio

s é o desvio padrão

Para n graus de liberdade para um nível de confiança de 99%:

Se Gcalculado < Gtabelado o valor suspeito não é aberrante face ao conjunto de dados

considerados;

Se Gcalculado > Gtabelado o valor suspeito é aberrante face ao conjunto de dados considerados,

logo deve ser rejeitado.

A homogeneidade das variâncias dos diferentes resultados para a análise da repetibilidade

são avaliadas de acordo com o teste de Cochran. De modo a verificar se há diferenças

significativas entre as variâncias ou não:

(11)

Sri2máx é a variância máxima do conjunto de dados considerados

∑ Sri2 é o somatório de todas as variâncias consideradas

Para um nível de confiança de 95% com n-1 graus de liberdade, em que n é o conjunto dos

dados considerados, temos:

Se Ccalculado < Ctabelado os conjuntos de dados considerados apresentam variâncias que não são

significativamente diferentes;

Se Ccalculado > Ctabelado os conjuntos de dados considerados apresentam variâncias que são

significativamente diferentes

32 FCUP


2.6.2. Reprodutibilidade

Exprime a precisão de um método de ensaio efetuado em condições experimentais distintas,

realizando o mesmo método de ensaio numa mesma amostra, variando apenas algumas

condições como: operador, laboratório, equipamento e intervalo temporal.

A reprodutibilidade definirá a amplitude de erros aleatórios de quantificação a uma escala

transnacional e só pode ser estimada através de ensaios interlaboratoriais. Assim é efetuado

o envio de uma série de amostras aos laboratórios participantes, e estes realizam ensaios

sobre a mesma amostra. A variância associada é calculada de acordo com a seguinte

expressão:

𝑺2𝑹𝒊 = 𝑺2

𝑳𝒊 + 𝑺2𝒓𝒊

(12)

Onde:

𝑺2𝑹𝒊 : é a variância da reprodutibilidade

𝑺2𝑳𝒊 : é a variância interlaboral

𝑺2𝒓𝒊 : é a variância da repetibilidade

Se o principal foco é implementar um novo método de análise, o estudo da reprodutibilidade

de um método é indispensável, pois verifica a precisão do método sobre diferentes condições

de trabalho. Já quando o objetivo é a validação, o estudo da reprodutibilidade não possui a

mesma importância, uma vez que o método será executado pelo mesmo laboratório, será

utilizado o mesmo equipamento e as condições experimentais variam pouco ao longo do

tempo.

2.6.3. Precisão intermédia

Exprime a precisão estimada sobre a mesma amostra ou padrão ao utilizar a mesma

metodologia, o mesmo laboratório, estabelecendo exatamente as condições que sofrem

alterações como operadores distintos, equipamentos distintos e intervalo temporal distinto.

Para quantificar a precisão intermédia é necessário realizar várias medições sobre a mesma

amostra, variando os parâmetros experimentais em cada análise. É realizada com base nas

cartas de controlo de amplitudes, uma vez que, ao realizar as análises em dias diferentes há

33 FCUP


uma variação aleatória considerável dos parâmetros experimentais não controlados, que

afetam o desempenho do método. A precisão intermédia é calculada consoante a seguinte

expressão:

(13)

Em que:

S precisão : é o desvio padrão relativo da precisão intermédia

n: o número de réplicas

t: número de amostras ensaiadas

yjk :o resultado replicado

k: (variando k entre 1 e n) do padrão j (variando j entre 1 e t)

�̅� j : a média aritmética dos resultados de n ensaios realizados sobre o padrão j (t – n) deve

ser superior a 15.

Quando n= 2 temos:

14)

Yj1 – primeiro resultado obtido para a amostra j;

Yj2 – segundo resultado obtido para a amostra j.

2.7. Exatidão

É a concordância do resultado obtido em um ensaio com um valor de referência tido como

verdadeiro. Ao ser inserida em uma série de resultados é acompanhada de possíveis erros

aleatórios e sistemáticos. Sendo assim, para avaliar a exatidão geralmente é utilizado

materiais de referência certificados, ensaios interlaboratoriais e testes comparativos (Guia

RELACRE, 2000).

34 FCUP


2.8. Material de referência – FAPAS

A FAPAS é uma empresa de renome mundial e fornecedora de matrizes alimentares

certificadas, utilizadas no controle de qualidade desde 1990. Estes materiais de controle são

uma ferramenta de controlo interno dos resultados de um laboratório, assim como são úteis

no treino do analista. As matrizes FAPAS são elaboradas com um rigoroso controlo da

qualidade. A reprodutibilidade dos seus resultados é obtida mediante um consenso dos

laboratórios do grupo, utilizando diferentes métodos analíticos. Geralmente o material de

referência apresenta um relatório técnico, com a informação da matriz, gama de concentração

e o valor médio medido.

35 FCUP


Parte III – Experimental

36 FCUP


3. Plano de validação

3.1. Objetivo

O objetivo é validar e revalidar as metodologias analíticas utilizadas para a deteção e

quantificação das micotoxinas (Aflatoxina G2, G1, B2 e B1; Desoxinivalenol, Ocratoxina e

Zearalenona) por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) e adequação dos métodos

utilizados no laboratório da Mérieux NutriSciences Portugal com a Mérieux NutriSciences

Espanha. A metodologia portuguesa será adaptada de modo a se assemelhar com a

metodologia espanhola. A fiabilidade dos resultados será garantida com base no estudo de

parâmetros tais como a repetibilidade do método, a precisão intermédia, os limiares analíticos,

a gama de trabalho e a realização de testes de recuperação.

3.2. Observação

Devido ao número extenso de matrizes a serem validadas para cada método, e ao grande

volume de trabalho nas dependências da empresa e consequente indisponibilidade do

equipamento (HPLC), não foi possível realizar todas as validações, sendo as Aflatoxinas a

única família de compostos estudada. Entretanto, não houve tempo hábil para concluir a

validação da respetiva, pelo que apenas uma pequena parte das matrizes foram analisadas.

Os resultados apresentados no decorrer deste trabalho, serviram unicamente como base de

inicialização do estudo de validação. Para que esta seja concluída, é necessário que

futuramente o estudo seja retomado.

As matrizes a serem estudadas para o método das aflatoxinas, estão representadas no anexo

1.

37 FCUP


4. Materiais e método

4.1. Reagentes

✓ Acetonitrilo – Honeywell (99,9%)

✓ Cloreto de sódio – VWR Chemicals (99,9%)

✓ Iodo cristalino – Sigma Aldrich (99,8%)

✓ Metanol para HPLC – VWR Chemicals (100%)

✓ Padrão para aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 – Sigma Aldrich (G2 98,5%; G1 99,7%; B2

99,0% e B1 99,0%)

✓ Tolueno – Carlo Erba Reagents (99,8%)

4.2. Materiais

✓ Células de quartzo com trajeto ótico de 1 cm - Hellma

✓ Colunas IAC para Aflatoxinas - Ambifood

✓ Espátula

✓ Filtro de plástico

✓ Papel filtro de membrana de porosidade 0,45 µm - VWR

✓ Matraz

✓ Unidade de filtração à vacuo

✓ Micropipeta - Eppendorf

✓ Papel filtro – VWR (5 – 13 µm)

✓ Papel filtro de microfibra de vidro – VWR (1,6 µm)

✓ Proveta de vidro – Linex (250 ml)

✓ Reservatório de vidro para colunas de imunoafinidade (10 ml) – Poulten & Graf

✓ Seringa de plástico

✓ Tubo Falcon – Sarstedt AG & Co (15 ml)

✓ Vial âmbar – VWR (1,5 ml)

4.3. Equipamentos

✓ Misturador equipado com copo de aço inox – Waring Laboratory

✓ Espectofotómetro (comprimento de onda entre 200 nm e 400 nm) – Pharma Spec UV

1700 Shimadzu

✓ HPLC (Agilent Technologies Série 1200) constituído por:

38 FCUP


✓ Bomba de HPLC – HITACHI

✓ Sistema de injeção automático

✓ Sistema de derivatização pós-coluna constituído por uma segunda bomba não

peristáltica, uma peça T, um tubo em PTGE ou aço inox com comprimento de 3000

mm a 5000 mm e um diâmetro interno de 0,5 mm, e um banho de água regulado a

70ºC.

O frasco a conter a solução de iodo é inserido na bomba, em sequência na peça T os

capilares devem estar inseridos no banho, uma das extremidades do capilar de

coloração verde é ligado na saída na coluna e a extremidade do capilar de cor marrom

é conectado na saída da bomba (capilar metálico) e por último a extremindade do

capilar bege é conectado no detetor. O iodo entra em contato com a fase móvel

proveniente da coluna, que por sua vez é encaminhado para o detetor.

✓ Coluna analítica tipo C18 (4,6 mm x 150 mm e 5,0 µm de porosidade) - Waters

✓ Detetor de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 365 nm e um

comprimento de onda de emissão de 435 nm

✓ Forno de colunas a 40 °C – Shimadzu CTO 6A

✓ Balança eletrónica de precisão, capaz de pesar com a aproximação de 1mg – Metller

Toledo

✓ Banho de ultrassom – VWR

✓ Bomba peristáltica – ISMATEC

Figura 8 - Peça T Figura 7 - Banho a 70°C Figura 6 - Bomba

39 FCUP


4.4. Soluções

✓ Solução de extração Metanol/Água (80:20)

✓ Solução de extração Metanol/Água (60:40)

✓ Solução de Tween 20 a 10%

✓ Solução Metanol/Água (50:50)

✓ Solução tampão fosfato pH 7,4 (PBS)

✓ Solução de tween 20 a 10% de PBS

✓ Solução tolueno/acetonitrilo (98:2)

4.4.1. Procedimento

Foi preparado previamente a fase móvel, constituída de uma mistura de água, acetonitrilo e

metanol na proporção 3:1:1. Em sequência foi preparado o reagente de derivatização

contendo metanol, iodo e água. O reagente de derivatização foi agitado por aproximademente

duas horas e em sequência foi deixado em repouso por 15 minutos. Finalmente foi filtrado por

filtração a vácuo. Foi preparada uma solução padrão das Aflatoxinas (100 µg/l para G1 e B1,

e 30 µg/l para G2 e B2) com metanol. Para realizar o enriquecimento das amostras que não

apresentam a toxina, foi preparada uma solução das Aflatoxinas (20 µg/l B1 e G1; 5 µg/l B2 e

G2) utilizando tolueno/acetonitrilo. A confirmação da concentração foi efetuada através da

curva de absorção, pela leitura em espectrofotómetro com comprimento de onda de 330 nm

a 370 nm. Sendo a solução de referência a mistura de tolueno/acetonitrilo.

A concentração foi calculada com base na seguinte equação:

ρ = �̅� 𝒙̅ 𝑴 𝒙̅ 𝟏𝟎𝟎

𝜺 𝒙̅ 𝒅

(15)

Em que:

�̅� = absorção média determinada a partir dos valores de absorção máxima de 3 curvas de

absorção. A diferença não deve exceder 5%.

M = massa molecular relativa de cada aflatoxina em g/mol

40 FCUP


𝜀 = absortividade molar de cada aflatoxina em tolueno/acetonitrilo em m2/mol

d = trajeto ótico da célula em cm.

Tabela 3 – Massa molecular e absortividade molar para as Aflatoxinas G2, G1, B2 e B1.

Afla M (g/mol) 𝜺 (m2/mol)

B1 312 1930 B2 314 2040

G1 328 1660 G2 330 1790

Para elaborar a reta de calibração foi retirada uma alíquota da solução (100 µg/l B1 e G1; 30

µg/l B2 e G2) os seguintes volumes:

Tabela 4 – Volumes para a reta de calibração dos padrões para as Aflatoxinas.

Padrão Volume µl B1 (µg/l) B2 (µg/l) G1 (µg/l) G2 (µg/l)

1 500 5,00 1,50 5,00 1,50

2 250 2,50 0,75 2,50 0,75

3 100 1,00 0,30 1,00 0,30

4 1000 (padrão 1) 0,50 0,15 0,50 0,15

5 500 (padrão 1) 0,25 0,07 0,25 0,07

6 200 (padrão 1) 0,10 0,03 0,10 0,03

7 100 (padrão 1) 0,05 0,015 0,05 0,015

O volume dos balões volumétricos foram completados com a solução de água/metanol

(50:50).

41 FCUP


4.5. Extração

4.5.1. Caso geral

Foi pesado aproximadamente 25g de amostra homogeneizada mais 5g de cloreto de sódio.

Juntou para o copo misturador de aço inox, 125 ml da solução de extração metanol/água

(60:40). A mistura foi homogeneizada por 3 minutos em velocidade alta.

A mistura foi filtrada através de um filtro de papel. Foram pipetados 10 ml do filtrado para um

matraz de 100 ml. Foram adicionados 10 ml de água e procedeu-se a homogeneização. A

mistura foi filtrada com a utilização do filtro de fibra de vidro. A coluna de imunoafinidade foi

prendida ao reservatório de vidro e este na bomba peristáltica. Foram vertidos 10 ml do

filtrado para o reservatório. Após passar os 10 ml, lavou-se a coluna com 2 porções de 10 ml

de água desionizada. As Aflatoxinas contidas na coluna foram eluídas para um tubo Falcon,

com 1 ml de metanol, seguido de 1 ml de água. A solução contendo a micotoxina foi

homogeneizada e transferida para um vial de 1,5 ml.

Figura 9 - Misturador de aço inox

42 FCUP


4.5.2. Outros casos

Para as outras matrizes que diferem do caso geral, o procedimento seguido foi conforme o

especificado na Tabela a seguir.

Figura 10 - Sistema de imunoafinidade montado

Figura 11 – Colunas de imunoafinidade

43 FCUP


Tabela 5 – Procedimento para a extração das Aflatoxinas nas matrizes que diferem do caso geral.

1 2 3 4 5 6 7

Matriz

Frutos secos (com ou sem casca)

cereais e outros

tipos de amostras não identificadas

nos itens

posteriores

Especiarias Pistacho com ou

sem casca

Alimentos a base de cereais

para lactantes e crianças de curta

idade

Azeite, manteiga,

margarina ou óleos

Oleorresina Cerveja

Peso amostra (g) 25 25 45 25 5 5 20

Volume de solução extratora

125 ml (Metanol/água

60:40)

100 ml (Metanol/Água 80:20)

125 ml (Metanol/Água

60:40)

100 ml (Metanol/Água

80:20) -

20 ml (Metanol/Água 80:20)

-

5 g (NaCl) 5 g (NaCl) 5 g (NaCl) 5 g (NaCl) 20 ml de metanol 1 g (NaCl) Ajustar o pH 7,9 ± 0,1 c/ NaOH 2M ou baixar com

HCl 1M

Dispersão 2 min. Máx veloc. 2 min. Máx veloc. 2 min. Máx veloc. 2 min. Máx. veloc. Agitar vigorosamente

1 min.

Agitar em vortex 1

min

Adicionar 20 ml de água, agitar e deixar repousar

Filtrar

Filtro de papel. Pipetar da solução

filtrada

10 ml + 10 ml de água


filtrada

6 ml + 60 ml de Tween 20 a 10% de PBS


filtrada

10 ml + 10 ml de PBS


filtrada

11 ml + 99 ml de PBS

Transferir 3 ml da fase metanólica

(superior) em um

matraz, adicionar 27 ml de água


filtrada

2 ml + 20 ml de Tween a 10% de

PBS

Centrifugar Caso apareçam precipitados, centrifugar a 3500 rpm por 10 min. Filtrar com filtros de pregas

44 FCUP


A purificação por coluna de imunoafinidade para os casos acima citados, seguem os seguintes

procedimentos:

Tabela 6 – Purificação por coluna de imunoafinidade para a análise das Aflatoxinas das matrizes que diferem do caso geral

Extração por coluna de imunoafinidade 1 2 3 4 5 6 7

Volume de amostra

na coluna 10 ml 55 ml 10 ml 100 ml 20 ml 11 ml 10 ml

Volume de água

para lavar a coluna 2 x 10 ml 2 x 10 ml 2 x 10 ml 3 x 5 ml 20 ml de

PBS 20 ml

Volume de eluente

1 ml de metanol +

1 ml de água

1 ml de metanol +

1 ml de água

1 ml de metanol +

1 ml de água

1 ml de metanol +

1 ml de água

2 ml de metanol +

2 ml de água

1 ml de metanol +

1 ml de água

1 ml de metanol +

1 ml de água

Fator de diluição 50 40 50 20 40 40 8

45 FCUP


4.6. As principais adaptações realizadas para o ensaio

_______________________________________________________

* Para os demais casos o procedimento a ser seguido é conforme o indicado na Tabela 5.

Método atual: válido para

todas as matrizes Método a ser validado:

Caso Geral*

Figura 12 - Fluxograma representativo da análise das Áflatoxinas

Pesar 25,0 g de amostra homogeneizada + 5,0 g de NaCl

+125 ml de MeOH/H2O (70:30)

Homogeneizar por 3 min, em velocidade alta

Filtrar e pipetar 15 ml do filtrado para um matraz de 100 ml

Adicionar 30 ml de água e agitar.

Filtrar com filtro de fibra de vidro

Pipetar 10 ml do filtrado para o

reservatório contendo a coluna

IAC

Lavar a coluna com 2 porções

de 10 ml de água desionizada

Eluir com 1 ml de MeOH seguido

de 1 ml de água destilada

Injeção em HPLC com sistema

de derivatização pós-coluna

com detetor FLD (excitação

365; emissão 435 nm)

Pesar 25,0 g de amostra homogeneizada + 5,0 g de NaCl

+125 ml de MeOH/H2O (60:40)

Homogeneizar por 3 min, em velocidade alta

Filtrar e pipetar 10 ml do filtrado para um matraz de 100 ml

Adicionar 10 ml de água e agitar.

Filtrar com filtro de fibra de vidro

Pipetar 10 ml do filtrado para o

reservatório contendo a coluna

IAC

Lavar a coluna com 2 porções

de 10 ml de água desionizada

Eluir com 1 ml de MeOH seguido

de 1 ml de água destilada

Injeção em HPLC com sistema

de derivatização pós-coluna

com detetor FLD (excitação

365; emissão 450 nm)

46 FCUP


Tabela 7 - Principais alterações nas condições do HPLC para a análise das Aflatoxinas

Conforme apresentado na tabela 8, as alterações foram adaptadas a realidade e as condições

do laboratório nas instalações da Mérieux Portugal. No método utilizado em Espanha, o

equipamento utilizado é diferente do utilizado em Portugal, logo, na fase móvel não foi

adicionado KBr e HNO3 . A coluna utilizada para a validação foi de 150 mm o que justifica a

redução do fluxo para 0,7 ml. O volume de injeção passou de 300 µl para 100 µl. A emissão

do detetor FLD foi reajustada para 450 nm. E por fim a sensibilidade do equipamento foi

elevada de 12 para 18.

Condições HPLC

Método Atual Método a ser validado Alterações

Equipamento Agilent Technologies Série

1200 KOBRA CELL

Agilent Technologies Série 1200

Fase móvel Água/ACN/Metanol (3:1:1) Água/ACN/Metanol (3:1:1)

com KBr e HNO3 Água/ACN/Metanol (3:1:1)

Temperatura do banho

70 °C - 70 °C

Fluxo da fase móvel

1,2 ml/min 1,0 ml/min 0,7 ml/min

Reagente de

derivatização

100 mg de Iodo, 2 ml de

metanol e 200 ml de água -

100 mg de Iodo, 2 ml de

metanol e 200 ml de água

Fluxo do reagente

de derivatização 0,4 ml/min - 0,4 ml/min

Volume injeção amostra

300 µl 100 µl 100 µ

Coluna Coluna analítica tipo C18

por ex. 150x4,6mm e 5 µm Waters Spherisorb ODS2 5µ

250x4.6 mm Coluna analítica tipo C18 por

ex. 150x4mm e 5 µm

Detetor FLD Excitação 365 nm e

emissão 435 nm Excitação 365 nm e emissão

450 nm Excitação 365 nm e emissão

450 nm

Temperatura da coluna

40 °C 40 °C 40 °C

Sensibilidade 12 18 18

47 FCUP


5. Discussão dos resultados

5.1. Matrizes analisadas

Algumas das matrizes estudadas, foram matrizes de referência, ou seja, amostras com a

concentração conhecida de Aflatoxinas. Para essas amostras a quantidade a ser pesada foi

reduzida entre 5 e 14 g. As informações pertinentes às matrizes de referências estão descritas

na Tabela 9. As demais matrizes a serem validadas, foram contaminadas com um volume e

concentração conhecidos, assim como apresentado na Tabela 10.

Tabela 8 – Matrizes de referência utilizadas para a análise das Aflatoxinas

Amostra Massa pesada (g) Afla Intervalo de conc. (μg/kg)

Pistacho 10

G2 0,423 – 1,089

G1 0,92 – 2,35

B2 0,82 – 2,11

B1 4,26 – 10,95

Total 6,423 – 16,499

Ração 7

G2 0,90 – 2,31

G1 1,06 – 2,72

B2 2,57 – 6,62

B1 7,9 – 20,2

Total 12,1 – 31,1

Farinha de milho 14

G2 0,530 – 1,363

G1 0,535 -1,376

B2 0,89 – 2,30

B1 0,96 – 2,47

Total 2,89 – 7,44

Amendoim 7

G2 0,85 – 2,19

G1 1,36 – 3,50

B2 0,83 – 2,13

B1 2,89 – 7,44

Total 5,8 – 15,0

G2 1,59 – 4,09

G1 1,69 – 4,36

Pimenta preta 5 B2 3,13 – 8,04

B1 3,66 – 9,42 Total 10,07 – 25,91

48 FCUP


Tabela 9 – Contaminação das amostras que não possuem Aflatoxinas.

Amostra Massa pesada

(g) Volume de contaminação

(ml) Afla

Conc. Teórica (μg/kg)

Arroz 25 4,0

G2 1,024

G1 3,264

B2 0,896

B1 3,616

Total 8,800

Farinha láctea 25 1,0

G2 0,256

G1 0,816

B2 0,224

B1 0,904

Total 2,200

Cárnico 25 2,0

G2 0,512

G1 1,632

B2 0,448

B1 1,808

Total 4,400

A concentração teórica para as amostras contaminadas foi calculada consoante a seguinte

expressão:

Valor teórico = 𝐶𝑜𝑛𝑐.𝑑𝑜 𝑝𝑎𝑑𝑟ã𝑜 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑑𝑖𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑑𝑜

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎

(16)

Com o objetivo de quantificar a concentração de aflatoxinas presente nas matrizes em µg/kg,

foram primeiramente injetados no HPLC os padrões para se obter a curva de calibração. Esta

reta foi construída sempre que se iniciou a análise no decorrer de seis dias. A média das áreas

dos picos obtidos correspondente a cada concentração encontram-se na Tabela 11, e os picos

cromatográficos representativos das Aflatoxinas encontram-se no anexo 4.

49 FCUP


Tabela 10 - Padrões e áreas da reta de calibração para análise das Aflatoxinas

Afla Conc. ng/ml Área Afla Conc. ng/ml Área

G2

0,016 37,704

G1

0,051 104,091

0,032 69,987 0,102 194,507

0,08 175,484 0,26 488,052

0,16 350,649 0,51 970,051

0,32 706,344 1,02 1961,016

0,8 1812,955 2,55 5045,817

1,6 3518,659 5,1 9686,999

Afla Conc. ng/ml Área Afla Conc. ng/ml Área

B2

0,014 56,520

B1

0,07 156,039

0,028 101,660 0,13 289,615

0,07 248,557 0,29 727,684

0,14 504,695 0,57 1460,476

0,28 1002,440 1,13 2953,528

0,7 2581,680 2,83 7579,568

1,4 5047,424 5,65 14695,200

As retas de calibração, estão apresentadas nas figuras de 13 a 16:

50 FCUP


Figura 14 - Reta de calibração Afla G1 Figura 13 - Reta de calibração Afla G2

Figura 15 - Reta de calibração Afla B2 Figura 16 - Reta de calibração Afla B1

51 FCUP


O cálculo da concentração das Aflatoxinas, recorrendo a curva de calibração é dado por:

Afla (µg/kg) = 𝑅𝑒𝑠𝑢𝑙𝑡𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑎 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑝𝑜𝑙𝑎çã𝑜 𝑥 𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑚 𝑔

(17)

5.2. Sensibilidade

A sensibilidade é proveniente da capacidade do método analítico distinguir pequenas

diferenças de concentração do analito. Para este método em causa, como a reta de calibração

é um modelo linear, a sensibilidade é constante ao longo de toda a gama de trabalho e

equivale ao declive da reta. Sendo assim, a sensibilidade para cada Aflatoxina, está

representada na Tabela 12:

Tabela 11 - Sensibilidade do método para cada Aflatoxina analisada.

Micotoxina Equação da reta Coeficiente de Correlação

Linear (R2) Sensibilidade

Afla G2 y = 2208,5x + 4,0688 0,9998 2208,5

Afla G1 y = 1910,3x + 17,9110 0,9996 1910,3

Afla B2 y = 3616,9x + 3,3136 0,9999 3616,9

Afla B1 y = 2618,2x – 10,647 0,9998 2618,2

y é correspondente ao sinal analítico medido para cada um dos padrões da reta de calibração

em termos de área, e x a concentração dos respetivos.

5.3. Limite de deteção - LD

O limite de deteção, foi calculado com base na Tabela 11, com o auxílio da equação (2). O

limite de deteção encontrado para Aflatoxina G2 foi de 0,032 ng/ml, G1 0,137 ng/ml, B2 0,022

ng/ml e B1 0,117 ng/ml.

5.4. Limite de Quantificação - LQ

O limite de quantificação foi calculado com base na reta de calibração da Tabela 11, com o

auxílio da equação (3). O limite de quantificação para a Aflatoxina G2 foi de 0,096 ng/ml, G1

0,416 ng/ml, B2 0,066 ng/ml e B1 0,354 ng/ml.

52 FCUP


5.5. Linearidade

Para estimar a linearidade da reta de calibração, recorreu-se ao teste de RIKILT com o auxílio

da equação (5). Os dados obtidos estão representados na Tabela 13:

Tabela 12 - Avaliação da linearidade da reta de calibração das Aflatoxinas através do teste de RIKILT

Micotoxina Pontos Xi (conc ng/ml) Yi (sinal analítico) Yi/Xi Yi/Xi (%)

Afla G2

1 0,016 37,704 2356,488 106

2 0,032 69,987 2187,096 98

3 0,08 175,484 2193,547 98

4 0,16 350,649 2191,555 98

5 0,32 706,344 2207,324 99

6 0,8 1812,955 2266,194 101

7 1,6 3518,659 2199,162 99

Média 2228,766

Afla G1

1 0,051 104,091 2041,007 105

2 0,102 194,507 1906,930 98

3 0,26 488,052 1877,124 97

4 0,51 970,051 1902,060 98

5 1,02 1961,016 1922,565 99

6 2,55 5045,817 1978,752 102

7 5,1 9686,999 1899,412 98

Média 1938,073

Afla B2

1 0,014 56,520 4037,127 110

2 0,028 101,660 3630,727 99

3 0,07 248,557 3550,819 97

4 0,14 504,695 3604,964 98

5 0,28 1002,440 3580,142 98

6 0,7 2581,679 3688,113 101

7 1,4 5047,424 3605,303 98

Média 3671,028

Afla B1

1 0,07 156,0387 2229,125 90

2 0,13 289,6147 2227,806 90

3 0,29 727,6843 2509,256 101

4 0,57 1460,476 2562,238 103

5 1,13 2953,528 2613,741 105

6 2,83 7579,568 2678,293 108

7 5,65 14695,2 2600,92 105

Média 2488,768

Para uma melhor visualização foram elaborados quatro gráficos, representados nas figuras

(17 a 20) para cada Aflatoxina, os quais representam as respetivas concentrações e as

percentagens calculadas, de modo a verificar a linearidade da reta.

53 FCUP


Figura 19 - Linearidade Afla B2

Figura 18 - Linearidade Afla G1

Figura 20- Linearidade Afla B1

Figura 17- Linearidade Afla G2

54 FCUP


Conforme os dados analisados, é possível verificar que cada ponto da reta de calibração para

as 4 micotoxinas, se enquadra no intervalo entre 90% a 110%, o que condiz com os

parâmetros estabelecidos pelo teste de RIKILT. Logo é constatado que as funções são

lineares.

5.6. Gama de Trabalho

A gama de trabalho foi estabelecida conforme a avaliação de todos os valores medidos para

as Aflatoxinas. Para as Aflatoxinas G2 e G1 a gama de trabalho é 0,5 – 5,0 μg/kg; para B2

0,5 – 10 μg/kg. para B1 0,5 – 15,0 μg/kg e para Totais 0,5 – 25,0 μg/kg.

5.7. Precisão

Para avaliar a precisão, foram realizados ensaios de repetibilidade e precisão intermédia.

5.7.1. Repetibilidade

Efetuaram-se 10 determinações para as amostras de amendoim, arroz, pimenta, farinha

láctea, farinha de milho, pistachio, cárnico e ração. Foram calculados, de acordo com a folha

de Excel do Anexo 2, a concentração do analito, o valor médio, o desvio padrão, o limite de

repetibilidade e o coeficiente de variação. Para as amostras de arroz, farinha láctea e cárnico,

foi necessário realizar um enriquecimento da amostra com (G2 - 6,4 μg/l G1 - 20,4 μg/l; B2 -

5,6 μg/l e B1 - 22,6 μg/l).

Para verificar se haviam resultados com valores muito afastados em relação ao conjunto dos

mesmos, foi aplicado o teste de Grubbs conforme Anexo 2. Para constatar a homogeneidade

de variâncias foi aplicado o teste de Cochran, que se encontra no mesmo anexo.

Os resultados obtidos estão representados na Tabela 14:

55 FCUP


Tabela 13 – Matrizes analisadas para a determinação da repetibilidade, desvio padrão, coeficiente de variação e limite de repetibilidade relativo.

Matriz Afla

Ensaio 1

Ensaio 2

Ensaio 3

Ensaio 4

Ensaio 5

Ensaio 6

Ensaio 7

Ensaio 8

Ensaio 9

Ensaio 10

Valor médio

Desvio Padrão

C.V (%) L.R L.R (%)

Teste de Grubbs

Ração

G2

1,67 1,56 1,43 1,35 1,57 1,46 1,56 1,56 1,52 1,49 1,5170 0,089 5,86 0,249 16,42 Aceitável Farinha de Milho 1,10 1,25 1,07 1,05 1,01 1,05 1,30 1,18 1,13 1,16 1,1300 0,093 8,26 0,261 23,13 Aceitável Pimenta 3,96 3,68 3,78 3,88 3,79 3,79 3,79 3,52 3,96 3,75 3,7900 0,130 3,43 0,365 9,62 Aceitável

Amendoim 1,49 1,65 1,57 1,45 1,61 1,68 1,78 1,87 1,69 1,69 1,6480 0,126 7,65 0,353 21,41 Aceitável Pistachio 0,77 0,90 0,74 0,97 0,83 0,78 0,86 0,73 0,68 0,81 0,8070 0,086 10,71 0,242 29,98 Aceitável Farinha Láctea 0,29 0,30 0,29 0,30 0,29 0,28 0,28 0,29 0,28 0,28 0,2880 0,007 2,74 0,022 7,67 Aceitável

Cárnico 0,48 0,45 0,45 0,46 0,45 0,48 0,49 0,49 0,47 0,46 0,4680 0,016 3,46 0,045 9,69 Aceitável Arroz 1,02 0,99 0,95 0,93 0,89 1,03 0,99 0,94 0,93 0,95 0,9620 0,044 4,59 0,124 12,86 Aceitável

Ração

G1

1,76 1,63 1,51 1,68 1,66 1,55 1,66 1,65 1,60 1,59 1,6290 0,070 4,33 0,198 12,14 Aceitável Farinha de Milho 1,03 0,98 1,00 0,99 0,97 0,98 1,01 1,11 1,05 1,10 1,0220 0,050 4,90 0,140 13,72 Aceitável

Pimenta 3,58 3,37 3,59 3,39 3,76 3,65 3,77 3,36 3,70 3,66 3,5830 0,157 4,39 0,441 12,30 Aceitável



Ração

B2




Ração

B1



Cárnico 1,40 1,39 1,41 1,38 1,38 1,45 1,55 1,52 1,52 1,47 1,4470 0,065 4,47 0,181 12,51 Aceitável

Arroz 3,24 3,19 3,00 2,82 2,85 3,29 3,17 2,96 2,97 3,00 3,0490 0,163 5,36 0,457 15,00 Aceitável

Ração

Totais

22,12 20,51 19,21 20,91 20,92 19,65 20,88 20,84 20,04 19,82 20,4900 0,836 4,08 2,340 11,42 Aceitável Farinha de Milho 5,83 5,76 5,88 5,67 5,61 5,68 5,95 6,31 6,11 6,23 5,9030 0,243 4,13 0,682 11,55 Aceitável

Pimenta 23,85 21,90 22,89 22,38 24,01 23,76 23,47 22,00 24,41 23,11 23,1780 0,871 3,76 2,439 10,52 Aceitável Amendoim 10,78 10,82 10,87 9,90 11,43 11,64 12,15 12,44 11,71 11,79 11,3530 0,759 6,68 2,124 18,71 Aceitável Pistachio 11,85 13,79 11,29 11,96 12,56 11,96 13,02 11,12 12,49 12,01 12,2050 0,795 6,51 2,225 18,23 Aceitável

Farinha Láctea 2,44 2,52 2,47 2,51 2,44 2,29 2,45 2,51 2,45 2,41 2,4490 0,067 2,72 0,186 7,61 Aceitável Cárnico 3,73 3,51 3,55 3,52 3,52 3,71 3,91 3,85 3,75 3,64 3,6690 0,144 3,93 0,404 11,01 Aceitável Arroz 8,20 8,02 7,62 7,29 7,18 8,30 8,01 7,52 7,51 7,62 7,7270 0,383 4,96 1,073 13,88 Aceitável

56 FCUP


Com base nos dados obtidos na Tabela 14, os resultados observados para o limite de

repetibilidade para as Aflatoxinas, a diferença entre dois ensaios realizados em condições de

repetibilidade com um grau de confiança de 95%, de modo geral, não deverão exceder

valores entre 7% e 30% para Afla G2, 8% e 20% para Afla G1, 7% e 27% para Afla B2, 7% e

19 % para Afla B1 e para Aflas totais, isto consoante cada tipo de matriz.

Um coeficiente de variação relativamente pequeno, traduz-se como uma melhor condição de

repetibilidade, o que é observado nas análises realizadas, onde o coeficiente de variação ficou

abaixo dos 11%.

5.7.2. Precisão intermédia

Foram analisadas 4 amostras em duplicado no decorrer de 5 dias. Na Tabela 15 estão

apresentadas as concentrações para cada par de duplicado correspondente a cada

Aflatoxina, assim como o desvio padrão, o limite da precisão intermédia e o coeficiente de

variação, calculados conforme a folha de Excel apresentada no Anexo 3.

57 FCUP


Tabela 14 – Matrizes analisadas para a determinação da precisão intermédia, desvio padrão, coeficiente de variação e limite da precisão intermédia.

Matriz Concentração Afla G2 Concentração Afla G1 Concentração Afla B2 Concentração Afla B1 Concentração Aflas

Totais

Ração

1,480 1,380 1,680 1,610 4,110 3,830 12,460 11,600 19,730 18,420

1,520 1,510 1,620 1,600 4,280 4,290 12,720 12,790 20,140 20,190 1,650 1,560 1,780 1,660 4,660 4,390 13,790 12,940 21,880 20,550

1,330 1,220 1,420 1,300 4,000 3,680 12,010 10,900 17,940 16,370

1,510 1,400 1,560 1,430 4,170 3,850 12,080 10,940 19,320 17,620

Pistachio

0,780 0,880 1,460 1,630 1,600 1,780 7,890 8,620 11,730 13,010 0,770 0,900 1,560 1,810 1,520 1,780 8,000 9,300 11,850 13,790

0,920 0,930 1,760 1,760 1,820 1,870 9,320 9,410 13,820 13,970

0,780 0,780 1,540 1,520 1,550 1,600 8,110 8,240 11,980 12,140

Amendoim

1,410 1,530 2,100 2,250 1,290 1,400 5,030 5,360 9,830 10,540 1,590 1,660 2,270 2,380 1,500 1,570 5,660 6,000 11,020 11,610

1,680 1,730 2,380 2,490 1,580 1,610 5,900 6,120 11,540 11,950

1,620 1,590 2,330 2,310 1,520 1,490 5,810 5,750 10,990 10,880

Farinha de Milho

1,470 1,590 2,050 2,180 1,410 1,570 5,170 5,660 10,100 11,000

0,950 0,920 0,940 0,920 1,520 1,470 1,780 1,760 5,190 5,070

1,090 1,110 1,020 1,050 1,740 1,760 2,180 2,060 6,030 5,980

1,070 1,100 1,000 1,060 1,700 1,730 1,900 1,990 5,670 5,880 1,050 1,110 0,980 1,040 1,680 1,760 1,960 2,040 5,590 5,860

Arroz

0,930 0,900 0,820 0,810 1,530 1,530 1,640 1,700 4,920 4,940

0,440 0,410 1,370 1,240 0,380 0,350 1,500 1,340 3,690 3,340 0,960 0,900 2,880 2,730 0,790 0,760 3,490 2,850 8,120 7,240

0,990 0,910 3,080 2,840 0,850 0,780 3,230 2,980 8,150 7,510

0,820 0,770 2,140 2,180 0,690 0,680 2,060 2,260 5,710 5,890

Desvio padrão da Precisão Intermédia 0,399 0,107 0,082 0,052 0,062

Coeficiente de variação (%) 6,41 5,36 4,78 4,50 5,59

Limite da Precisão Intermédia (%) 17,96 15,02 13,38 12,61 15,66

58 FCUP


Com base nos dados representados na Tabela 15, o desvio padrão das amostras analisadas

para a precisão intermédia apresentou uma dispersão relativamente baixa, demonstrando que

os valores estão próximos da concentração esperada. A ter em conta fatores como matrizes

e concentrações distintas, o coeficiente de variação para as aflatoxinas G2, G1, B2 e B1

manteve-se entre 6,4% e 4,50%. Considerando o fator tempo (dias distintos) que podem afetar

o desempenho do método, o limite da precisão intermédia manteve-se entre 12,6 e 18%.

Tanto o desvio padrão, como o coeficiente de variação assim como o limite de precisão

intermédia, apresentaram uma percentagem relativamente pequena, logo conclui-se que os

resultados obtidos apresentaram uma boa precisão.

5.8. Exatidão

Para analisar a exatidão do método, os resultados analisados foram comparados com as

matrizes de referências certificadas, estes cumprem com as concentrações especificadas nas

respetivas concentrações alvo, conforme descrito nas tabelas 9, 14 e 15.

6. Ensaio de recuperação

Foram efetuados 5 ensaios de recuperação, sendo cada um deles realizados em duplicado.

Para os ensaios de recuperação, as matrizes sem a presença das Aflatoxinas, foram

contaminadas com um determinado volume e uma concentração conhecida, descritos na

Tabela 16.

59 FCUP


Tabela 156 - Média, desvio padrão e coeficiente de variação para o ensaio de recuperação

Amostra Afla

Conc. padrão adicionado

(μg/l)

Volume adicionado

(ml)

Valor real

(µg/kg)

Valor teórico

(µg/kg)

% Recuperação Média Desvio

Padrão CV (%)

Chocolate

G2 6,4

1 0,20 0,25 80,77

93,62 14,52 15,51

Amendoim 1 0,21 0,25 82,15

Arroz 4 0,91 1,02 88,99

Whisky 2 0,63 0,63 100,81

Farinha Láctea 1 0,3 0,26 115,38

Chocolate

G1 20,4

1 0,65 0,81 80,34

89,65 12,70 14,16

Amendoim 1 0,64 0,81 78,54

Arroz 4 2,73 3,26 83,75

Whisky 2 1,95 1,99 97,64

Farinha Láctea 1 0,88 0,81 107,98

Chocolate

B2 5,6

1 0,17 0,22 76,55

92,20 17,28 18,75

Amendoim 1 0,18 0,22 80,47

Arroz 4 0,76 0,89 84,94

Whisky 2 0,55 0,55 100,58

Farinha Láctea 1 0,27 0,22 118,46

Chocolate

B1 22,6

1 0,7 0,9 77,54

89,06 16,40 18,41

Amendoim 1 0,71 0,9 78,65

Arroz 4 2,84 3,61 78,51

Whisky 2 2,11 2,21 95,39

Farinha Láctea 1 1,04 0,9 115,19

60 FCUP


Os resultados dos ensaios de recuperação são provenientes da equação (16) seguida da

expressão abaixo:

Recuperação % = 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑡𝑖𝑑𝑜

𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑇𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑜 𝑥 100

(18)

De acordo com o Regulamento (UE) N° 519/2014 da Comissão de 16 de Maio de 2014, os

intervalos de aceitação são:

Tabela 16 - Intervalos de aceitação para os ensaios de recuperação conforme o Regulamento (UE) N° 519/2014

Recuperação Gama de conc. Valor recomendado

B1, B2, G1 e G2

< 1,0 μg/kg 50 a 120 %

1-10 μg/kg 70 a 110 %

> 10 μg/kg 80 a 110 %

Logo é possível verificar que os ensaios de recuperação se encontram dentro dos parâmetros

especificados, o que permite garantir que o método apresenta seletividade e especificidade.

61 FCUP


7. Conclusão

É extremamente necessário que os laboratórios efetuem validações/revalidações nos seus

métodos laboratoriais. Estes irão definir se o método se adequa aos objetivos pretendidos, se

são capazes de demonstrar resultados fiáveis, atendam aos critérios estabelecidos pela

qualidade e se estão enquadrados nos parâmetros descritos nos regulamentos da União

Europeia.

O foco principal era validar e revalidar os métodos para Aflatoxinas, Zearalenona,

Desoxinivalenol e Ocratoxina, entretanto devido ao curto espaço de tempo apenas foi possível

iniciar o estudo das Aflatoxinas. O acompanhamento diário junto dos analistas do laboratório

foi fundamental para aprender a técnica e trabalhar com os equipamentos.

O método para análise das Aflatoxinas mostrou-se específico e seletivo ao atender os critérios

de recuperação estabelecidos pelo Regulamento (EU) N° 519/2014 (50 a 120%), tendo os

resultados obtidos enquadrarem-se entre 76 e 119%. O critério de exatidão foi alcançado com

base nas análises e nos resultados das análise das matrizes FAPAS, onde os resultados

obtidos se enquadram nos limites de concentrações descritos nos respetivos boletins. A

linearidade da curva de calibração utilizada no método, foi comprovada com o teste de RIKILT,

e esta por sua vez, enquadra-se perfeitamente nos critérios pré-estabelecidos pelo teste, logo

o modelo é considerado linear.

Como um dos parâmetros da qualidade, o fato de obter um LQ maior que o padrão de menor

concentração da reta, surge da eventualidade deste não obedecer os critérios de

repetibilidade e para que os resultados sejam consistentes e coerentes para o cliente.

Para analisar a precisão, foram estudadas a repetibilidade e a precisão intermédia. Para cada

parâmetro foi calculado um coeficiente de variação que ficou entre 11 % e 6,4%

respetivamente. Estes resultados são considerados satisfatórios para os critérios de

repetibilidade e precisão intermédia.

Apesar dos resultados atenderem os parâmetros estabelecidos, vale ressaltar, que a

validação não está concluída, sendo necessário que o estudo seja retomado e o restante das

matrizes sejam analisadas, assim como outros critérios como a incerteza associada.

Efetivamente o método não está validado, entretanto algumas melhorias foram constatadas e

atualmente encontram-se em uso no método das Aflatoxinas: o loop foi reduzido de 300

microlitros para 100 microlitros e o ganho foi aumentado de 12 para 18. Estas melhorias

resultaram em picos com uma melhor separação.

62 FCUP


8. Referências

Amado MA. 2002. Métodos imunológicos na detecção e determinação de aflatoxinas em

alimentos: vantagens e inconvenientes. Millenium 26.

Aragão NM et al. 2009. Validação de métodos cromatográficos de análise - um experimento

de fácil aplicação utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e os princípios da

"Química Verde" na determinação de metilxantinas em bebidas. Química Nova 32 (9): 2476 –

2481.

Cardona AGM, Johnson NM, Phillips TD, Hayes AW. 2014. Mycotoxins in a changing global

environment – A review. Food and Chemical Toxicology 69: 220-230.

Chust RB. 1990. Introdução à cromatografia de líquidos (HPLC). Boletim SPQ 39: 43-53.

Coll HAS, Castro NC. 2015. Micotoxicosis y micotoxinas: generalidades y aspectos básicos.

Revista CES Medicina 29 (1): 143-152

Collins CH et al. 1997.Introdução a métodos cromatográficos. 7ª edição, Unicamp. Campinas

– SP.

Costa JCD. 2015. Validação de um método de cromatografia de alta eficiência para

determinação de conservantes em géneros alimentícios. Dissertação de mestrado. Instituto

Superior de Engenharia de Lisboa – Lisboa, 105p.

Degani ALG et al. 1998. Cromatografia um breve ensaio. Química nova na escola 7: 21 – 25.

FAPAS. 2018. About us. [Consul. em 01 de Set. 2018] Disponível em:

https://fapas.com/about-us

Fernandes MS. 2016. Validação do método de quantificação de ocratoxina A por HPLC em

cereais e café no laboratório da SGS Portugal. Dissertação de mestrado. Faculdade de

Ciências e Tecnologia Universidade de Lisboa – Lisboa, 67p.

Ferreira AS. 2013. Validação da determinação de teobromina em amostras de cacau e seus

derivados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Dissertação de mestrado.

Faculdade de Ciências e Tecnologia Universidade de Lisboa – Lisboa, 71p.

Food and Agriculture Organization. 2003. Manual sobre la aplicación del sistema de Análises

de Peligros y de Puntos Críticos de Control (APPCC) en la prevención y control de las

micotoxinas. Estudio FAO alimentación Nutrición 73: 1-130.

63 FCUP


Food Ingredients Brasil. 2009. As micotoxinas. Revista FI 7: 32-40.

Guia RELACRE. 2000. Validação de métodos internos de ensaio em análise química. [Consul.

04 Mai. 2018]. Disponível em:

http://www.relacre.pt/assets/relacreassets/files/commissionsandpublications/Guia%20RELA

CRE%2013.pdf

Inkemia Brasil. 2016. Cromatografia líquida de alta eficiência – Parte 1. [Consul. 19 Agos.

2018]. Disponível em: https://inkemiabrasil.com/2016/09/20/cromatografia-liquida-de-alta-

eficiencia-parte-1/

Keliri EC. 2017. Isolation, identification and quantification of cholesterol oxidation products, in

salted and unsalted meat, by high performance liquid chromatography – HPLC. Dissertation

bachelor’s degree. Department of Chemistry at the University of Cyprus – Nicosia, 52p.

Kos G, Krska R. 2015. Internet training course on modern sample preparation techniques for

the determination of mycotoxins. [Consul. 19 Agos. 2018]. Disponível em:

https://www.researchgate.net/publication/265192271/download

Kupiec T. 2004. Quality-Control Analytical Methods: High-Performance Liquid

Chromatography. International Journal of Pharmaceutical Compounding 8 (3): 223-227.

Lanças FM. 2009. A cromatografia líquida moderna e a espectrometria de massas: finalmente

“compatíveis”? Scientia Chromatographica 1: 35-61

Martins AFS. 2016. Implementação e validação de métodos analíticos. Dissertação de

mestrado. Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra – Coimbra, 101p.

Merieux NutriSciense Portugal 2017. Quem somos. [Consul. em 05 de Nov. 2017] Disponível

em: https://www.merieuxnutrisciences.com/pt/silliker-portugal

Neto AJS. 2009. Uma visão técnica para a compreensão e resolução de problemas em

sistemas de cromatografia líquida. Scientia Chromatographica 1: 83-96.

Pacheco S et al. 2015. História da Cromatografia Líquida. Revista Virtual de Química 7 (4):

1225 – 1271.

Pereira DAS. 2016. Implementação e validação de um método analítico para determinação

de carbono orgânico total. Dissertação de mestrado. Faculdade de Ciências e Tecnologia

Universidade de Lisboa – Lisboa, 119p.

https://www.merieuxnutrisciences.com/pt/silliker-portugal

64 FCUP


Pereira VL, Fernandes JO e Cunha SC. 2014. Mycotoxins in cereals and related foodstuffs: A

review on occurrence and recent methods of analysis. Trends in Food Science & Technology

36: 96-136.

Peres TB. 2002. Noções básicas de cromatografia. Biológico 64 (2): 227 – 229.

Regulamento (UE) N° 519/2014 da Comissão de 16 de Maio de 2014

Regulamento CE N.° 1881/2006 da União Europeia de 19 de dezembro de 2006.

Rocha MEB, Freire FCO, Maia FEF, Guedes MIF e Rondina D. 2014. Mycotoxins and their

effects on human and animal health. Food Control 36: 159-165.

Setel. 2018. Venta de materiales de control de calidad y de referencia. [Consul. em 01 de Set.

2018] Disponível em: http://www.setelsl.com/materialcontrol.shtml

Silva PD. 2012. Determinação de compostos fenólicos por HPLC. Dissertação de mestrado.

Universidade da Beira Interior – Covilhã, 108p.

Silva AFA. 2016. Validação de Métodos Analíticos para controlo de Qualidade de um

Medicamento,por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Dissertação de mestrado.

Faculdade de Ciências e Tecnologia – Lisboa.

Soares C, Abrunhosa L e Venâncio A. 2013. Fungos produtores de micotoxinas. Sociedade

Portuguesa de Microbiologia. [Consult. 06 Jan. 2018]. Disponível em:

http://hdl.handle.net/1822/27316.

Tattibayeva D. 2017. Presencia de elementos tóxicos y micotoxinas en cereales de Kazajistán.

Facultade de Veterinaria da Universidade de Santiago de Compostela. Tese de Doutorado.

65 FCUP


Anexo 1 – Matrizes a serem validadas para Aflatoxinas

Tabela 17 - Matrizes para aflatoxinas

Determinação de Aflatoxinas

Grupo Matrizes a estudar Analisado?

Açúcar, produtos açucarados e derivados

Chocolate com frutos secos Não

Preparado para gelatina Não

Doce com frutos secos Não

Alimentos confecionados e pré-confecionados

Puré de batata Não

Molho soja Não

Batata frita Não

Alimentos dietéticos, suplementos alimentares, produtos de alimentação especial

Farinha láctea Não

Alimento infantil Sim

Puré Não

Alimentos para animais (simples e compostos) Alimento seco para cão Não

Ração Sim

Bebidas alcoólicas Whisky Não

Bagaço Não

Bebidas não alcoólicas Bebida de soja Não

Café, chá, infusões e derivados Café Não

Infusão Não

Carne e produtos cárneos e derivados Alheira Não

Cárnico Sim

Cereais, leguminosas, pseudo-cereais e derivados

Cereais Não

Farinha de milho Sim

Arroz Sim

Especiarias, condimentos e derivados

Pimenta Sim

Mostarda Não

Sal Não

Frutos, algas, produtos hortícolas e derivados

Milho para pipocas Não

Amendoim Sim

Pistacho Sim

Gordura, óleos, sementes oleaginosas e derivados

Azeite Não

Óleo de girassol Não

Creme vegetal Não

Leite, produtos lácteos e derivados Gelado Não

Iogurte Não

Produtos da pesca e derivados Conserva de peixe Não

66 FCUP


Anexo 2 – Folha de cálculo para a repetibilidade

Anexo 3 – Folha de cálculo para precisão intermédia

67 FCUP


68 FCUP


Anexo 4 – Cromatogramas para Aflatoxinas, método atual e método a ser validado

validação e revalidação de métodos para a análise de ... · método e ao grande volume de...

Documents