VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS: uma breve revisão

RESUMO

Ozelito Possidônio de Amarante Junior*Elvis Preslei Araújo Caldas**

Natilene Mesquita Brito***Teresa Cristina Rodrigues dos Santos"''''**

Maria Luiza Barros Facure Vale*"'***

A estatística é uma ciência que provê satisfatória interpretação dosresultados obtidos na Química Analítica pelo uso da teoria daProbabilidade. Através do método indutivo, é possível elucidar osignificado de cada dado experimental. Neste artigo, foi efetuada umavisão panorâmica dos parâmetros a serem avaliados durante avalidação de um método analítico, discutido-se cada parâmetro.

Palavras-chave: validação; métodos analíticos; estatística.

ABSTRACT

The Statistics is a science, which provides suitable interpretation ofthe results obtained on the Analytical Chemistry by using ProbabilitiesTheory. Through inductive method, it is possible to elucidate themeaning of each experimental date. In this paper, an overview of theparameters that be evaluated during the validation was made, andeach parameter was discussed.

Keywords: validation; analytical methods; statistic.

1 INTRODUÇÃO

Uma etapa bastante relevante efreqüente em diversas pesquisas naárea de análise química é o desenvolvi-mento de novos métodos, baseados emadaptações mais modernas de antigosmétodos, no uso de novos equipamen-tos ou ainda de novas tecnologias. A

metodologia deve sempre incluir a vali-dação do método desenvolvido e nãoapenas sua otimização. Isto deve ocor-rer, principalmente, quando o estudo sedestina à aplicação do método a umdeterminado tipo de matriz (POLE-SELLO, 1997, p.146).

Validação recebeu várias defini-ções, sendo, por isso mesmo, um termo

* Estudante de Mestrado em Química da Universidade Federal do Maranhão** Licenciado em Matemática, Universidade Federal do Maranhão*** Estudante de Mestrado em Química da Unesp - Araraquara*.** Professora do Departamento de Tecnologia Química - UFMA*.*** Professora do Departamento de Matemática - UFMA

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não específico. Do ponto de vista prá-tico, pode-se dizer que um método, apósser desenvolvido, deve ser submetido aum processo de avaliação que estimesua eficiência e mérito. Este processode avaliação costuma ser chamado devalidação. Um método será considera-do validado se suas características es-tiverem em conformidade com ospré-requisitos exigidos. Existe, portan-to, uma diferença entre a avaliação doprocesso, que deve consistir na cole-ção dos dados experimentais, e a vali-dação propriamente dita que deveverificar a relação entre os resultadosexperimentais (FEINBERG eRAGUÉNÉS, 1999, p.240).

Os critérios de validação podemser aplicados: (i) na avaliação da capa-cidade de um laboratório obter resulta-dos em conformidade com aquelesobtidos em laboratórios certificados, (ii)na avaliação da capacidade de um mé-todo em determinar o analito em novasmatrizes, e (iii) na avaliação de instru-mentos modificados ou recém adquiri-dos (WOOD, 1999, p.625).

No estudo de validação são pro-postos "testes de aspereza" que relaci-onam os fatores que podem causarvariação no ruído do método, levando adiferenças nos resultados obtidos. Den-tre estes fatores, pode-se destacar, porexemplo, para as técnicas croma-tográficas: fluxo, pressão e temperatu-ra, entre outras (NIJHUIS et al., 1999,p.189). Estes testes se destinam a ave-riguar quais dos fatores realmente afe-tam a resposta do equipamento ouprocesso. A capacidade de permane-cer invariável, mesmo em virtude da

variação destes parâmetros, écomumente chamada de "robustez". Arobustez deve ser alcançada (ou avali-ada) antes do método se tomar rotinei-ro (FEINBERG e RAGUÉNÉS, 1999,p.240).

2 CRITÉRIOS DE VALIDAÇÃODE MÉTODOS

Para validar um método, algunsrequisitos são exigidos. Entre estes,pode-se destacar: especificidade ouseletividade, curva de calibração,linearidade, faixa de trabalho, exatidão,precisão (repetitividade e precisão in-termediária), limite de detecção, limitede quantificação e sensibilidade(HUBERT et aI., 1999, p.136). As ca-pacidades de detecção e quantificaçãosão consideradas pela IUPAC comocaracterísticas fundamentais para aeficiência do processo químico de me-dida (CURRIE, 1999, p.128).

Alguns destes critérios são exigi-dos em todos os processos de valida-ção. Entretanto, existem itens que sãoavaliados apenas se mostram algumarelevância e outros podem ser desne-cessários. Isto depende do tipo de mé-todo que se pretende avaliar(ZOONEN, 1999, p.585). O nível deexigência de cada um destes critériosé apresentado na Tabela 1.

Observa-se que a exatidão e arepetitividade são exigidas em todos osestudos de validação de métodos, inde-pendente do seu tipo e aplicação, ex-cetuando-se os métodos qualitativos,que são destinados apenas a observara presença de um analito. A repro-dutibilidade é obrigatória apenas para

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Tabela 1 -Exigências para validação deacordo com o tipo do método.

o

c o 1iJ..'" " oc -e"" "" o ~ " -e

o-g ;g " -o '" N." -e II g " -o ~-o :~ ~

-e "O ·üTipo de método .~ " " ·C '" "-e C" " ·ü .D

X 'g -c s " " " g" Q. g -e :É c.e Q. °E s ~e :J E

:JNovo : ./ : ./ : ./ : 0 : 0 : ./ : ./ : ./

:~~r~~~~~~~~~~~~~~~~!~+~!;+~!;+~!~]lg~~~~~~? l~_L?.l l_-=-l~J_~l':_l_-:"_Quanlitativ.o (nível de !./!./!./! ® ! 1./ ! ./ ! ../_~'!~~~l~C(~~_eJ~_v_~c!~t_..LL__.!.. l ..L ! ..L l _Quantitativ.o (ní~ejde !./! ../! ./ ! ./ 1 ./ 1 ~' ! ../ 1 ./concentraçao baIXO) ! .L__.L L__J.. L__.L L-

./ obrigatório; 0" se relevante; 0 não necessário.

Fonte: Zoonen (1999, p.585).

métodos novos, onde se conhece pou-co sobre a influência de fatores ambi-entais sobre o método analítico, sendoexigido, também, em métodos quanti-tativos. O Limites de detecção (LD) éobrigatório para métodos qualitativos ouquantitativos para análise de traços, umavez que é necessário conhecer o alcan-ce do método nestes casos. O Limitede quantificação (LQ) é obrigatóriopara métodos quantitativos para análi-ses de traços. A linearidade é obriga-tória para métodos novos ou paraaqueles destinados à análise de analitosmajoritários. A especificidade erobustez devem ser avaliadas quandose propõe método novo. Para entendermelhor a tabela, deve-se observar aobrigatoriedade de um critério no pri-meiro campo, realizando-se sua avalia-ção sempre que este for obrigatório. Emcaso de critério facultativo, observa-sese este é obrigatório no segundo cam-po. Por exemplo: A reprodutibilidade éfacultativa para métodos modificados,

entretanto, se o método modificado forpara análise quantitativa este critériopassa a ser obrigatório.

2.1 Precisão

A precisão de um método é defi-nida como sua capacidade de fornecerresultados com baixa dispersão. Ouseja, um método é dito preciso quando,ao analisar a mesma amostra váriasvezes, os resultados obtidos são bas-tante próximos entre si (BACCAN etal., 1979, p.183). A precisão é estima-da por medidas de dispersão, como des-vio-padrão, variância e coeficiente devariação, entre outras (POLESELLO,1997, p.146).

A repetitividade expressa a pre-cisão, sob condições de análise iguais,em um pequeno intervalo de tempo. Istoé, repetitividade é a precisão de um pro-cedimento analítico considerando-se osmesmos equipamentos, o mesmo ana-lista, as mesmas condições ambientaise os mesmos reagentes. Chama-se deprecisão intermediária a precisão ex-pressa dentro do mesmo laboratório emdias diferentes de análise, com diferen-tes analistas, equipamentos diferentes,entre outras variações. Entretanto, estetermo é menos utilizado.Reprodutibilidade, por outro lado, ex-pressa a precisão entre laboratórios.Isto é, expressa quão preciso é o méto-do, independentemente do lugar onde érealizado. Geralmente são realizadosestudos colaborativos para determinara reprodutibilidade de um método, coma finalidade de padronizar metodologias(THE EUROPEAN AGENCY. .., 1994,p.4).

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A Repetitividade, precisão inter-na do laboratório, pode ser asseguradaanalisando-se um mínimo de nove de-terminações dentro da faixa decalibração utilizada, isto é, analisando-se três amostras em três replicatas,desde a etapa de extração até aquantificação (INTERNATIONALCONFERENCE ON ..., 1996, p.7). Ométodo é considerado preciso quandoapresenta variações de sinais analíticosaceitáveis. Estes valores aceitáveis sãomais rígidos quando o nível de concen-tração é mais elevado. Deste modo,para análise de resíduos de pesticidas,por exemplo, aceita-se um Coeficientede Variação (CV) de até 20%, valorrelativamente elevado, mas dentro doque se pode assegurar, se considera-das as pequenas concentrações obti-das nestes estudos.

2.2 Exatidão

A exatidão expressa a capacida-de de um método analítico obter resul-tados próximos ao valor real(BACCAN et al., 1979, p.183).

Segundo Polesello (1997, p.146)a exatidão é estimada pelo cálculo doerro absoluto ou do erro relativo, sendoconsiderada a chave para a validaçãode um método. A exatidão de um mé-todo novo pode ser avaliada por quatrotipos de estudos: (i) estudo comparati-vo com Materiais de Referência Certi-ficados (MRC); (ii) comparação dométodo proposto com um método con-siderado padrão, já bem estabelecidona literatura; (iii) estudos de recupera-ção em amostras; e (iv) estudoscolaborativos ou interlaboratoriais

(GUSTAVO-GONZÁLEZ et al., 1999,p.730).

O uso de MRC, quando disponí-veis, é o método preferível, uma vezque podem ser aceitos como padrõesinternacionais e por apresentarem ca-racterísticas semelhantes às das amos-tras. O processo consiste na análise deum número suficiente de replicatas doMRC e a comparação estatística dosresultados com os valores do certifica-do. O teste estatístico geralmente em-pregado é o teste de hipóteses, onde seestabelece como hipótese nula (rio) quea média amostral é igual à médiapopulacional. Para isto, utiliza-se o tes-te "t" de Student, com "n-I" graus deliberdade. (PEREIRA et al., 1999,p.730), conforme equação:

X-flt = ocal S

[Eq. 1]

Onde: ~ é a média amostral, sen-do H o : ~ = flo (hipótese nula onde a

média amostral é igual a populacional)

é verdadeira se t :::;tlabelado; tlabeladoé ovalor crítico (Tabela 2) acima do qualconsidera-se a hipótese nula falsa; ffio éo valor certificado; s é o desvio-pa-drão, e n é o número de amostras.

O método, entretanto, tem comodesvantagens o fato de que materiaiscertificados são geralmente caros, difí-ceis de serem encontrados e, em al-guns casos, completamente inexistentes(GUSTAVO-GONZÁLEZ et al., 1999,p.730). Isto é, para análise de diversosanalitos em amostras ambientais, ali-

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mentares, medicamentos entre outrasmatrizes biológicas e minerais, dificil-mente serão encontrados MRC comcaracterísticas similares às da referidamatriz e com as quantidades de analitospróximas aos valores que serão encon-trados na amostra em estudo.

A eficiência do método desenvol-vido pode, todavia, ser assegurada pelacomparação dos valores obtidos nométodo proposto com valores obtidos,para as mesmas amostras com ummétodo validado, isto é, um método quetenha sua precisão e exatidão conheci-das (GUSTAVO-GONZÁLEZ et al.,1999, p.730). Neste caso, realiza-se aanálise de diferentes amostras por am-bos os métodos, emparelham-se os da-dos e, a diferença obtida para cadaamostra analisada por cada um dosmétodos é comparada com o valor de-sejado, neste caso, zero (PEREIRA etal., 1999, p.730). Utiliza-se a equação:

-(d-l1)t = --'-----'-

Sd

Fn[Eq.2]

-Onde: d é a média das diferen-

ças entre os valores observados porcada método, para cada amostra, sen-

do a hipótese H o : d = 11 verdadeira

se t ~ ttabelado ; D é a diferença deseja-da (neste caso D = O); n é o número dedeterminações; Sd é o desvio-padrãodas diferenças.

Por exemplo, analisa-se as amos-tras A, B e C pelos métodos X e Y. Amédia das diferenças: Ax - Ay, Bx -By, C; - Cç, é comparada estatistica-mente com o valor desejado (zero).Entretanto, muitas vezes, ao se desen-volver um método, não existem méto-dos pré-existentes para o analito ou paraa amostra em estudo (GUSTAVO-GONZÁLEZ et al., 1999, p.730).

Estudos colaborativos são bastan-te eficazes no que diz respeito a valida-ção de métodos, uma vez que consistemem teste de exatidão e precisão(COWELL et al, 1986, p.958). Contu-do, estudos deste tipo são bastantelaboriosos e necessitam da disponi-bilização de vários laboratórios em di-ferentes lugares do mundo para suarealização. Pode-se realizar, neste caso,análise de variância, para determinarse existe diferença entre os valoresobtidos nos laboratórios em que se apli-cou o método proposto (GUSTAVO-GONZÁLEZ et al., 1999, p.730). Nestecaso classifica-se os elementos daamostra (concentração obtida) em fun-ção do tratamento (cada laboratório),como mostrado na Tabela 2.

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Tabela 2 - Distribuição t de Student.

ti·1 o 1

>ZJ 0,5°1 0,251 0,101 0,051 0,031 0,011 0,01

1 1,00000 2,41420 6,31380 12,7060 25,5420 63,6570 127,3202 0,81650 1,60360 2,92000 4,31270 6,20530 9,92480 14,08903 0,76489 1,42260 2,35340 3,18250 4,17650 5,84090 7,453304 0,74070 1,34440 2,13180 2,77640 3,49540 4,60410 5,59760

5 0,72669 1,30090 2,01500 2,57060 3,16340 4,03210 4,773306 0,71756 1,27330 1,94320 2,44690 2,96870 3,70740 4,316807 0,71114 1,25430 1,89460 2,36460 2,84120 3,49950 4,029308 0,70639 1,24030 1,85950 2,30600 2,75150 3,35540 3,832509 0,70272 1,22970 1,83310 2,26220 2,68500 3,24980 3,68970

10 0,69981 1,22130 1,81250 2,22810 2,63380 3,16930 3,5814011 0,69745 1,21450 1,79590 2,20100 2,59310 3,10580 3,4966012 0,69548 1,20890 1,78230 2,17880 2,56000 3,95450 3,4284013 0,69384 1,20410 1,77090 2,16040 2,53260 3,01230 3,3725014 0,69200 1,20010 1,76130 2,14480 2,50960 2,97680 3,32570

15 0,69120 1,19670 1,75300 2,13150 2,48990 2,94670 3,2860016 0,69013 1,19370 1,74590 2,11990 2,47290 2,92080 3,2520017 0,68919 1,19100 1,73960 2,10980 2,45810 2,89820 3,2225018 0,68837 1,18870 1,73410 2,10090 2,44500 2,87840 3,1966019 0,68763 1,18660 1,72910 2,09300 2,43340 2,86090 3,17370

20 0,68696 1,18480 1,72470 2,08600 2,42310 2,84530 3,1534021 0,68635 1,18310 1,72070 2,07960 2,41380 2,83140 3,1352022 0,68580 1,18160 1,71710 2,07390 2,40550 2,81880 3,1188023 0,68531 1,18020 1,71390 2,06870 2,39790 2,80730 3,1040024 0,68485 1,17890 1,71090 2,06390 2,39100 2,79690 3,09050

25 0,68443 1,17770 1,70810 2,05950 2,38460 2,78740 3,0782026 0,68405 1,17660 1,70560 2,05550 2,37880 2,77870 3,0669027 0,68370 1,17570 1,70330 2,05180 2,37340 2,77070 3,0565028 0,68335 1,17480 1,70110 2,04840 2,36850 2,76330 3,0469029 0,68304 1,17390 1,69910 2,04520 2,36380 2,75640 3,03800

30 0,68276 1,17310 1,69730 2,04230 2,35960 2,75000 3,0298040 0,68066 1,16730 1,68390 2,02110 2,32890 2,70450 2,9712060 0,67862 1,16160 1,67070 2,00030 2,29910 2,66030 2,91460120 0,67656 1,15590 1,65770 1,97990 2,26990 2,61740 2,8599000 0,67449 1,15030 1,64490 1,96000 2,24140 2,57580 2,80700

Fonte: Fooseca et al. (1985, p.2265)

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Tabela 3 -Organização dos dados paraanálise de variância.

Laboratório~Amostra

1 XII x21 x31 xKI

2 xI2 x22 x32 xK2

3 xI3 X23 X33 XK3

n; X1nl x2n x3n3 XiKoK

Somas TotalMédias -Xi -'2 X:J Xi = 1.2.3 •...• Kj = 1. 2. 3•...• n;

A média de cada laboratório é amédia aritmética dos valores observa-dos neste laboratório, enguanto a mé-dia geral é dada por:

_ I K n;X=-LLxijn i=1 j=1

[Eg.3]

ou

[Eg.4]

K

onde " = Lnin::::::l

Neste caso, a hipótese nula é guetodos os laboratórios tenham médiasiguais, isto é:

Ho: ffil = ~ = l1l:J = ... = ffiK·

E gue todas as populações dos la-boratórios tem a mesma variância: 82.

A hipótese alternativa é gue pelomenos duas médias sejam diferentes:

HI: TI\ 1 ffig'

Onde: p 1 g.A aceitação de H, significa gue a

diferença de laboratório não acarretadiferença significativa na análise. Poroutro lado, a rejeição de H, indicará,com risco a, gue o laboratório exerce

influência sobre o resultado da análise(FONSECA e MARTINS, 1996,p.2S4).

Admitindo-se H, como verdadei-ra, pode-se estimar a variância comumde três maneiras:

i) No primeiro caso, consideram-se os K laboratórios como umaúnica amostra de tamanho n e

a média geral X . Se Ho forverdadeira, tem-se:

2S,

Qtn -1

[Eg.S]

Onde s; é a estimativa davariância total, e Qt é dada por:

K "iQt= LLxi~-C

i=1 j=1[Eg.6]

Onde: Qt é a variação total e Cé dada por:

[Eg.7]c = -'-----=--_---.L-n

ii) A segunda forma de estimar avariância comum 82 é conside-rar as médias dos K laboratóri-

os e a média geral X .Se Hofor verdadeira, tem-se:

2 Qes =--e K-1 [Eg.8]

Onde: S2 é a estimativa dae

variância entre laboratórios, eQe é dada por:

[Eg.9][cl" x ..K L... IJ

Qe= L j -ci=l ni

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Onde: Qe é a variação entre la- Onde: Qr é a variação residual.boratórios. Pode-se demonstrar que:

iii) A terceira forma de se esti- Qt = Qe + Qr [Eq. 12]mara a variância comum s2 é As variações Qt, Qe e Qr têm dis-por meio de cada uma dos K tribuição x2 com, respectivamente, (nlaboratórios. Se Ho for verda- - 1), (K - 1) e (n - K) graus de liber-deira, tem-se: dade. Assim, temos:

2 Qr[Eq. 10] 2 QeSr ---

XK-1n-K --- --- 2

2 'F_K-l_K-l_se

Onde S e a estimativa da -T-~-2 [Eq.13]r ----'!.::!...- ___ S';

variância residual, e Qr é dada n-l n-Kpor:

A distribuição F terá (K - 1) graus

~

de liberdade no numerador e (n - K)K li •. graus de liberdade no denominador. O

Qr= I~>j~-I quociente F -Tabela 4 - será utilizado;=1 j=l nj [Eq. 11]

para testar Ho. Para facilitar a Análisede Variância, pode-se construir um qua-dro como o mostrado na Tabela 5.

Tabela 4 - ''F'' tabelado de Snedecor, a = 5%.

~v,v, 1 161,4 199,5 215,7 224,6 230,2 234,0 236,8 238,9 240,5 241,9 248,0 250,1 253,3 254,3

2 18,51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40 19,45 19,46 19,49 19,503 10,13 9,55 9,28 9,12 9.01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79 8,66 8,62 8,55 8,534 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6.16 6,09 6,04 6,00 5,96 5,80 5,75 5,66 5,635 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74 4,56 4,50 4,40 4,366 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06 3, 7 3,81 3,70 3,677 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64 3,44 3,38 3,27 2,238 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35 3,15 3,08 2,97 2,929 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14 2,94 2,86 2,75 2,7110 4,96 4,10 3,71 0,48 3.33 3,22 3,14 4,07 3,02 2,98 2,77 2,70 2,58 2,5411 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85 2,65 2,57 2,45 2,4012 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,90 2,85 2.80 2,75 2,54 2,47 2,34 2,3013 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67 2,46 2,38 2,25 2,2114 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60 2,39 3,31 2,18 2,1315 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54 2,33 2,25 2,1\ 2,0716 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,84 2,49 2,28 2,19 2,06 2,0117 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45 2,23 2,15 2,01 1,9618 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41 2,19 2,11 1,97 1,9219 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38 2,16 2,07 1,93 1,8820 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35 2,12 2,Ó4 1,90 1,8421 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 3,37 2,32 2,10 2,01 1,87 1,8122 4,30 3,44 4,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,30 2,07 1,98 1,84 1,7823 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,27 2,05 1,96 1,81 1,7624 4,28 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25 2,03 1,94 1,79 1,7330 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,16 1,93 1,84 1,68 1,6240 4,06 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,21 2,18 2,12 2,08 1,84 1.74 1,58 1,5160 4,00 3,15 2,76 2,53 2,37 2,25 2,17 2,10 2,04 1,99 1,75 1,65 1,47 1,39120 3,92 3,07 2,68 2,45 2,29 2,17 2,09 2.02 1,96 1,91 1,66 1,55 1,35 1,25

I co 3,84 3,00 2,60 2,37 2,21 2,10 2,01 1,94 1,88 1,83 1,57 1,46 1,22 1,00

Fonte: Fonseca et aI. (1985, p.264).

Cad, Pesq. São Luís, v. 12, n. 1/2, p. 116-131, jan.rdez, 2001. 123

Tabela 5 - Quadro da análise de variância.

Fonte de Soma deTeste F

variação quadrados

EntreQe K-l

2tratamentosSe

Dentro dos 2 Qr r: =2laboratórios Qr= Qt- Qe n-K s =-- Sr

e K-1(residual)

Total Qt n=-I

Estudos interlaboratoriais podemainda ser desenvolvidos para testes deproficiência, em que se avalia se umlaboratório pode ser certificado para aanálise de determinado analito em va-riadas matrizes, ou para estabelecimen-to de valores de referência, isto é, paracertificar um dado material (CURRIE,1995, p.1700).

Pelas razões já expostas, os estu-dos de recuperação têm sido mais am-plamente difundidos para análisesambientais, toxicológicas ~u farmacêu-ticas (GUSTAVO-GONZALEZ et al.,1999, p.730). Este estudo consiste na"fortificação" de amostras, ou seja, naadição de quantidades conhecidas, emdiferentes níveis, seguida da determi-nação da concentração do compostoadicionado, calculando-se a da quanti-dade percentual que foi recuperada(POLESE, 2000, p. 51). Neste caso,testes de significância podem ser reali-zados utilizando-se o teste "t" deStude~t (GUSTAVO-GONZÁLEZ etal., 1999, p.730), de acordo com a equa-ção:

(Rec-lOO)t=-----«:

fn[Eq. 14]

Onde: Rec é a média das recupe-rações obtida para n repetições, sendo a

hipótese Ho : Rec = 100% verdadei-

ra se t < t b I d ; 100 é a recuperação- ta ea o

percentual desejada; n é o número dedeterminações (geralmente trabalha-secom n = 5, no núnimo); SRecé o desvio-padrão das recuperações. '

Segundo Gustavo-González et al(1999, p.230), para a análise de com-postos em nível de traços, costuma-seconsiderar como aceitável recupera-ções que estejam no intervalo de 75 e125% do valor esperado, mesmo queno teste "t" se rejeite a hipótese nula(Ro: Rec. = 100%). Chama-se, ainda,de recuperação absoluta o estudo daeficiência de extração, ou seja, a recu-peração obtida considerando-se apenasas perdas relacionadas ao processo deextracão (HUBERT et al, 1999, p.136).Neste caso, fortifica-se uma amostratestemunha, isto é, que não possua oanalito em sua composição, realizando-se a extração e análise. Este resultadoé comparado com o obtido para umaamostra testemunha que sofreu o pro-cesso de extração e que seu extrato foifortificado, considerando-se este últimoresultado como 100%.

124 Cad. Pesq., São Luís, v. 12, n. 112, p. 116-131, jan.rdez. 2001.

2.3 Linearidade, intervalo detrabalho e curva de calibração

Os métodos desenvolvidos na quí-mica analítica buscam obter um sinalanalítico y proporcional a quantidade ouconcentração x de um analito em umamatriz. Busca-se, geralmente, uma re-lação linear entre a concentração ouquantidade e o sinal analítico, emborarelações não-lineares sejam aceitas. Alinearidade de um método é sua habili-dade em obter sinais analíticos que se-jam diretamente proporcionais àconcentração ou quantidade do analitona amostra. O alcance de um procedi-mento analítico pode ser definido comoo intervalo entre a maior e a menorconcentração ou quantidade de analitona amostra para o qual o procedimentofornece boa precisão, exatidão elinearidade (THE EUROPEANAGENCY. .., 1994, p.4). O estudo dalinearidade pode ser efetuado pela re-lação entre o resultado e não pela cur-va de calibração (concentraçãocalculada versus concentraçãointroduzida), ou seja, pela relação line-ar entre a recuperação e o valor real,estimando-se a capacidade do métodode se desviar linearmente da recupera-ção ideal (100%), em função do nívelde fortificação (HUBERT et al, 1999,p.136). Isto é, estes autores recomen-dam que se considere um método line-ar quando a relação entre aconcentração recuperada e a de forti-ficação for linear.

Linearidade do método, desta for-ma, diz respeito à capacidade do méto-do em produzir resultados linearmenteproporcionais à concentração do analito.

Neste parâmetro, analisa-se sucessivasamostras com concentrações crescen-tes até que seja encontrada uma con-centração acima da qual a relação deixade apresentar a proporcionalidade.

Conforme Huger faz-se isto, re-lacionando-se o logaritrno da concen-tração do analito versus a razão daresposta pela concentração do analito,de modo que se considera fora dalinearidade o valor que estiver fora do

intervalo: x ± O,05x geralmente esteprocedimento não é realizado.

A linearidade é muitas vezes apre-sentada como estando relacionada àcurva de calibração, podendo se refe-rir à linearidade da curva de calibração(CHASIN et al, 1994, p.SO).

O intervalo de trabalho expressaa faixa entre a menor e a maior con-centração dos padrões usados na cons-trução do gráfico de calibração. Umavez definida a linearidade de um méto-do, pode-se escolher uma faixa de tra-balho que se deseja estudar. Entretanto,na prática, é comum seguir o caminhocontrário, selecionando um intervalo detrabalho e estudando a linearidade ape-nas neste intervalo.

A função da calibração é a ex-pressão matemática que relaciona amedida observada (sinal analítico).Emfunção da concentração ou quantidadedo analito na amostra (CURRIE, 1999,p.ll0). Finalmente expressa ~o gráficode calibração. Geralmente, busca-seobter uma relação linear entre a pro-priedade a ser medida e a concentra-ção ou quantidade do analito.Entretanto, em alguns casos é possíveladmitir uma relação não-linear. Um

Cad. Pesq., São Luís, v. 12, n. 1/2, p. 116-131,jan.ldez. 2001. 125

gráfico contendo todas as possíveis con-centrações de um analito em umaamostra e sua resposta corresponden-te seria, na realidade, uma relaçãoexponencial. Entretanto, constrói-seeste gráfico com uma faixa de concen-tração tão pequena que este apresenteuma característica linear (HUBERT etal, 1999, p.136). Para uma relação li-near, tem-se:

y = F(x)+ey [Eq. 15]

Onde: ey é o erro randômico ouerro indeterminado (que segue a distri-buição normal); y é o sinal analítico (oumedido) que corresponde proporcional-mente à quantidade ou concentraçãodo analito. Geralmente, o errorandômico é desprezado na relação,igualando-se y à F(x). O errorandômico é avaliado através dos des-vios-padrão de cada ponto. F(x) é dadapor:

F(x) =B+Sx [Eq. 16]

Onde: B é a média das medidasdo branco (branco instrumental); S é asensibilidade do método; e x é a quanti-dade ou concentração do analito naamostra (CURRIE, 1999, p.110).

A linearidade da curva decalibração e, portanto, o intervalo detrabalho, é determinado pelo coeficien-te de correlação (índices de correlaçãode Pearson) da reta obtida (RIEDERet al, 2000, p.88). No caso, consider

a) R = 1 - correlação perfeita;b) 0,91 < R < 0,99 - correlação

fortíssima;c) 0,61 < R < 0,91 - correlação

forte;

d) 0,31 < R < 0,60 - correlaçãomédia;

e) 0,01 <R <0,30 - correlação fra-ca;

f) R = zero - correlação nula.Os dados do branco instrumental

e sensibilidade podem, ainda, ser usa-dos para estimar os limites de detecçãoe quantificação do analito pelo métodoavaliado (FEINBERG e RAGUÉNÉS,1999, p.240).

2.4 Sensibilidade

A sensibilidade expressa a capa-cidade do procedimento analítico geraruma variação na medida da proprieda-de monitorada, causada por um peque-no incremento na concentração ouquantidade do analito. Em geral, a sen-sibilidade de um método é definidacomo a inclinação da curva decalibração (CURRIE, 1999, p.110).Deste modo, pode-se expressar a sen-sibilidade como:

S= dydx [Eq. 17]

Assim sendo, um método é sensí-vel quando uma pequena diferença deconcentração do analito causa umagrande diferença no valor do sinal ana-lítico medido (CURRIE, 1999, p.110).

É comum, entretanto, erronea-mente se utilizar o termo "sensível'tparadesignar um método que possui um bai-xo limite de detecção.

2.5 Limite de detecção

O limite de detecção de um mé-todo é definido pelo Comitê de Méto-dos Analíticos (Analytical Methods

126 Cad. Pesq., São Luís, v. 12, n. 1/2, p. 116-131,jan./dez. 2001.

Committee) da Sociedade Real de Quí-mica (Royal Society of Chemistry)como sendo a menor concentração doanalito que pode ser distingui da, comrazoável confiança, da região de res-posta do branco. O branco, por sua vez,é definido como uma amostra que, hi-poteticamente, não possui qualquerquantidade do analito (ANALYTICALMETHODS ..., 1987, p.2000). O comi-tê afirma que o limite de detecção (LD)é estimado pelo domínio da resposta(sinal analítico), embora seja reportadoem termos de concentração.

Talvez a maior armadilha no pro-cesso de validação seja o uso da ex-pressão "Limite de Detecção". Aprimeira escola ("sinal/ruído") utilizaeste termo para indicar o valor críticoda quantidade estimada ou concentra-ção acima da qual é feita a decisão "de-tectado". Explicitamente, esta escolareconhece apenas o erro chamado "fal-so positivo" (erro tipo 1 ou a), que emefeito faz a probabilidade do falso ne-gativo (erro tipo 2 ou b) igual a 50%.Isto é, quando um composto é conside-rado "detectado" a probabilidade de queele não esteja presente é muito baixa.Entretanto, quando o composto é con-siderado "não detectado" existe em tor-no de 50% de probabilidade de que eleesteja presente. Isto ocorre, principal-mente, devido à utilização apenas doruído do aparelho para a determinaçãodo LD. Neste caso, um valor numéricodo LD é encontrado pela adição de trêsvezes o desvio do sinal obtido para a

média do branco. Isto é, LD = xB

+ 3sB

(onde SB é o desvio-padrão do bran-co), expressando-se em unidades de

concentração ou quantidade (CURRIE,1999, p. 128). Assim, temos como va-lor medido para o LD:

[Eq. 18]

Onde: XL é o LD (expresso em

sinal analítico); xB

é a média do valor

obtido para o branco; SB é o desvio-pa-drão estimado para o branco; e k é umaconstante numérica, recomendada pelaIUPAC como k = 3. Deste modo, o LDtambém é dado por:

c = kSBL S [Eq. 19]

Onde: CL é o LD expresso emconcentração; k é uma constante nu-mérica; S é a sensibilidade do método;e SB é o desvio-padrão do branco(ANALYTICAL METHODSCOMMITTEE, 1987, p.200).

Outra forma utilizada para o cál-culo do LD utiliza os dados obtidos apartir da curva de calibração(FEINBERG e RAGUÉNÉS, 1999,p.240). Neste caso, a equação empre-gada é:

LD = b+3.sb

S[Eq.20]

Onde: b é o branco instrumental(coeficiente linear da cl}rva decalibração); s, é o desvio padrão parao branco instrumental; s é a sensibili-dade do método (coeficiente angular dacurva de calibração).

A segunda escola ("teste de hi-pótese") usa o termo "Limite de Detec-ção" para indicar a capacidade de

Cad. Pesq., São Luís, v. 12, n. I!2, p. 116-131,jan./dez. 2001. 127

detecção inerente do processo de me-dida em questão. Neste caso, conside-ra-se todos os efeitos que o processopossa sofrer, inclusive o efeito de ma-triz, considerando, além das variaçõesno branco, as variações apresentadaspela amostra fortificada de menor con-centração do analito. Esta escola pro-cura levar em consideração os dois tipospossíveis de erro, empregando valoresindependentes para a e b, comumentecada um igual a 0,05 ou ainda 0,01. Umexemplo deste tipo de consideração éo apresentado pelo Manual de Análi-ses de resíduos de pesticidas, que defi-ne LD da seguinte forma:

[...] o limite de detecção é carac-terizado pelo menor valor daconcentração de um compostona amostra analítica, para o qualo método analítico em particularproduza um valor de inal quedifira em 95% de probabilidadedaquele dado a concentraçãonula na amostra analítica (THIEReZEUMER,1987,p.38).

Isto significa que, conhecendo-seo valor de sinal obtido para o branco,busca-se um valor para o qual o seusinal difira, em 95% de probabilidade,do valor do branco. Ainda segundo omanual, existem vários caminhos parase determinar o LD de um método. Sãocitados:

a) estimativa a partir de valores dobranco: quando se possui vári-as medidas de branco, pode-seobter uma estimativa bruta doLD por:

2.t 95'" ,SBLD = li, 70

S[Eq.21]

128

Onde: tn,95% é o parâmetro deno-minado "t" de Student (tabelado emfunção de n, usando-se o valor unilate-ral positivo); SB é o desvio-padrão dobranco; S é a sensibilidade do método.

Este tipo de estimativa, no entan-to, pode não ser adequada quando sepossui poucos valores de branco ouquando, por exemplo o valor do brancose apresenta como uma linha de base(como na cromatografia). Neste caso,não há um desvio-padrão do branco;

b) estimativa a partir de experi-mentos de recuperação: esti-ma-se o desvio-padrão (sA) domenor nível de fortificação,calculando-se s ,a partir de

com

SA e SB:

Scom =(m-1).s~ + (n-1)s~

m+n-2 [Eq.22]

Onde: m é o número de determi-nações do menor nível de fortificação,n é o número de determinações do bran-co; SA é o desvio-padrão da amostra demenor nível de fortificação; S8 é o des-vio-padrão do branco. A partir destevalor, pode-se calcular o LD pela equa-ção:

[Eq.23]

Este limite pode, ainda, ser deter-minado de acordo com a teoria das pro-babilidades (CURRIE, 1999, p.1lO).Neste caso, o limite de detecção é de-rivado de testes de hipóteses, onde seestuda as probabilidades de erros a oub. Nestes estudos, geralmente, se as-sume valores para ambos os parâme-tros iguais a 0,05 (CURRIE, 1999,p.128).

Cad. Pesq., São Luís, v. 12, n. 1/2, p. 116-131, jan.rdez: 2001.

2.6 Limite de quantificação

O Limite de Quantificação (LQ)é definido pelo Manual de Análise deResíduos de Pesticidas como o menornível de fortificação estudado, no quala recuperação esteja entre 80 e 120%,com coeficiente de variação menor que20% (THIERe ZEUMER, 1987, p.38).Esta determinação visa garantir quenão se cometa os erros tipo a e b.

Para a primeira escola, que tem ointento de não cometer o erro tipo a, oLQ pode ser determinado pelos dadosobtidos na curva de calibração(FEINBERG e RAGUÉNÉS, 1999,p.240). Assim, temos que:

LQ = b+lO.sb

s[Eq.24]

Onde: b é o branco instrumental(coeficiente linear da curva decalibração); Sb é o desvio padrão parao branco instrumental; S é a sensibili-dade do método (coeficiente angular dacurva de calibração).

Entretanto, este método é geral-mente utilizado com análise de soluçõespadrão e se relaciona com os ruídosinstrumentais. Para alguns métodos, ovalor do sinal e o desvio padrão podemvariar bastante para uma amostra embranco e uma amostra testemunha quecontém os componentes presentes namatriz (FEINBERG e RAGUÉNÉS,1999, p.240).

2.7 Especificidade

Um analista não pode realizar umaanálise sem antes garantir que o méto-do é específico, ou seja, que o sinal

medido é característico para o analitoem estudo. No caso da cromatografia,deve-se demonstrar que o pico obser-vado se refere apenas à presença dasubstância. Isto pode ser testado pelosmétodos de adição padrão ou pelo usode padrão interno (KRULL et al; 1998,p.1 086). A especificidade pode sertestada estatisticamente utilizando-seum experimento de adição padrão.Neste caso, adiciona-se quantidades co-nhecidas do analito, realizando-se a aná-lise. O sinal analítico é relacionado àconcentração do analito, em cadaamostra fortificada (FEINBERG eRAGUÉNÉS, 1999, p.240). Utiliza-sea equação:

[Eq.25]

Onde: r é a recuperação para cadanível de fortificação; Co e c[ são oscoeficiente linear e angular, respecti-vamente; v é o valor de concentracãoadicionada; e é o erro randômico. >

Para avaliar se o método é seleti-vo, relaciona-se estatisticamente c eoc[ com 0,0 e 1,0, respectivamente. Esteteste é realizado com n - 2 graus deliberdade, usando as equações:

[Eq.26]

Onde ScO é o desvio-padrão de co'

t = ico - 01[Eq.27]

Cad. Pesq., São Luís, v. 12, n. 1/2, p. 116-131,jan./dez. 2001. 129

Onde se}é O desvio-padrão de c}.A especificidade para métodos

cromatográficos é geralmente relacio-nada com o fator de resolução, consi-derando-se um método seletivo quandoo fator de resolução é maior que 2,5(HUBER, 1999, p.64).

3 CONCLUSÃO

Durante a metodologia, ou seja,o estudo de desenvolvimento e avalia-ção de um método, os procedimentosanalíticos devem ser submetidos à va-lidação estatística com o objetivo dese conhecer suas limitações, bemcomo definir a confiabilidade dos re-

sultados obtidos para a aplicação dométodo à amostras que se deseje ana-lisar.

A escolha do método para esti-mar a exatidão deve levar em conside-ração aspectos como custo, tempo,disponibilidade de pessoal e de materi-ais de referência, métodos padrão vali-dados, entre outros.

A precisão pode ser estimadaatravés do desvio-padrão ou do coefi-ciente de variação (ou desvio-padrãorelativo). A necessidade de se avaliaroutros parâmetros de validação, taiscomo linearidade, LD, LQ, robustez,ente outros, é determinada pelo tipo demétodo analítico que se deseja validar.

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