XII Salão de Iniciação Científica – PUCRS, 03 a 07 de outubro de 2011

XII Salão de

Iniciação Científica PUCRS

Validação de Método para Determinação de Cotinina em

Líquido Amniótico

Karine Rodrigues1, José Miguel Chatkin2, 3, Julia de Barros Machado2, 3, Carolina Mohr2, 3, Ana Paula

Goulart Szezepaniak2, 3, Flavia Valladão Thiesen1 (Orientadora)

1 Faculdade de Farmácia, PUCRS,

2 Faculdade de Medicina, PUCRS,

3 Hospital São Lucas da PUCRS

Resumo

Introdução

O tabagismo é atualmente um dos principais problemas de saúde pública. É

considerado fator de risco para diversas doenças como cânceres, doenças cardiovasculares e

respiratórias (Nakajima et al., 2000). A nicotina é o maior constituinte do tabaco, sendo que

um cigarro contém, em média 8,4 mg desse composto, que é o responsável por causar

dependência. Quimicamente, é uma amina terciária composta de anéis piridina e pirrolidina.

Apenas de 10 a 20% de toda nicotina inalada é excretada sob a forma inalterada e o principal

metabólito de biotransformação da nicotina é a cotinina, um marcador biológico útil para essa

exposição e é usado em larga escala para validar a auto-relatados de tabagismo. A cotinina

tem uma meia vida de 15-40 horas em adultos e 37-160 horas em crianças. A partir disso a

determinação de cotinina em líquido amniótico é relevante para medir a exposição do feto ao

tabaco durante a gravidez (Sant’Anna, 2010). Até a vigésima semana de gestação, as

secreções maternas são as principais contribuintes para a formação de líquido amniótico, com

alguns componentes provenientes das secreções do feto. Após este período, a urina, as

secreções de fluidos fetais e do pulmão tornam-se as principais fontes de líquido amniótico,

como um meio de proteção do feto. Mais do que qualquer outro compartimento, o líquido

amniótico acumula substâncias solúveis em água, mas também pode conter compostos

parentais e seus metabólitos, o que expõe o feto durante toda gravidez a diversas substâncias

tóxicas (Malafatti e Martins, 2009).

A presença de cotinina no líquido amniótico indica que o feto tem exposição ao

tabaco. Outras amostras, como sangue e urina, são invasivas ou de difícil coleta em recém-

nascidos.

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Esse trabalho tem como objetivo validar um método para detecção de cotinina em

líquido amniótico, a fim de verificar a exposição de recém-nascidos ao tabaco durante o

período fetal.

Metodologia

A partir de um método para determinação de cotinina já validado para amostras de

soro, adaptamos o mesmo para a quantificação em líquido amniótico. O procedimento

analítico envolve extração líquido-líquido com 1,0 mL de líquido amniótico, utilizando como

padrão interno 2-fenilimidazol 0,25 ug/mL. A extração foi feita com diclorometano, onde se

retira a fase aquosa depois de homogeneização e centrifugação. A fase aquosa foi extraída

novamente para maior reprodutibilidade, e logo após a fase orgânica foi evaporada sob ar

comprimido a 37°C e o extrato foi reconstituído com 200 uL da fase móvel (Água MilliQ,

Metanol, Acetato de sódio 0,1M e Acetonitrila - 50:15:25:10 v/v em pH 4,4) para injeção em

Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência Agilent 1100® series, com separação em coluna de

fase reversa (Zorbax Eclipse XDB-C8 4,6x150mm e 5u), sob fluxo isocrático de 0,5 mL/min

e detecção ultravioleta em 261 nm. O tempo total da corrida foi de 10 minutos, sendo que o

tempo de retenção para cotinina foi aproximadamente de 6,8 minutos e para o padrão interno

foi de 5,6 minutos.

Considerando que o método foi previamente validado para amostras de soro (Petersen

et al., 2010), foi realizada validação parcial. Validação parcial é empregada sempre que

ocorrem modificações no método bioanalítico já validado, como mudança de matriz, no

procedimento de preparação da amostra, na metodologia ou na substituição do sistema de

detecção. Foram determinados os parâmetros limite inferior de quantificação (LIQ),

linearidade, exatidão, precisão interdia e intradia, segundo as exigências da ANVISA (2003).

Resultados

O coeficiente de correlação foi superior a 0,998 no intervalo de 2,0 a 200,0 ng/mL,

sendo o limite inferior de quantificação de 2,0 ng/mL. Os valores de precisão intra e inter-

ensaio (Tabela 1) apresentaram coeficiente de variabilidade (CV) de 3,89 a 13,99% e exatidão de

82,23 a 91,47%.

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Tabela 1. Precisão e exatidão intra e interdia de cotinina em líquido amniótico por HPLC

Adicionado

(ng/mL) Intradia (n=6) Interdia (n=6)

Cotinina 5.0 4.56 ± 0.61 13.46 91.12 4.40 ± 0.62 13.99 87.92

50.0 41.12 ± 1.81 4.41 82.23 41.89 ± 3.57 8.52 83.77

200.0 182.94 ± 9.65 5.28 91.47 177.40 ± 6.91 3.89 88.70

CV: Coeficiente de variação; DP: Desvio Padrão

Precisão

CV (%)

Exatidão

(%)

Detectado

(média±DP)

(ng/mL)

Precisão

CV (%)

Exatidão

(%)

Detectado

(média±DP)

(ng/mL)

Conclusão

O método apresentou linearidade, LIQ, precisão e exatidão dentro dos limites

aceitáveis pela ANVISA. No entanto, empregá-lo para avaliar exposição intra-uterina ao

tabaco, testes para determinação de estabilidade, especificidade, recuperação e limite de

detecção devem ser concluídos.

Referências

BENTLEY, M.C.; ABRAR, M.; KELK, M.; COOK, J.; PHILLIPS, J.K. Validation of assay for the

determination of cotinine and 3-hydroxycotinine in human saliva using automated solid-phase extraction and

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194.

MALAFATTI, L.; MARTINS, I. Aspectos analíticos da determinação de cotinina em matrizes biológicas.

Revista Brasileira de Toxicologia Vol. 22, n. 1-2 (2009), pp. 9-20.

NAKAJIMA M.; YAMAMOTO T.; KUROIWA Y.; YOKOI T. Improved highly sensitive method for

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PETERSEN, G.O.; LEITE, C.E.; CHATKIN, J.M.; THIESEN, F.V. Cotinine as a biomarker of tobacco

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33, (2010), pp. 516-521.

PICHINI S.; ALTIERI I.; PACIFICI R.; ROSA M. Simultaneous determination of cotinine and trans-3’-

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358-361.

RE nº 899, de 29 de maio de 2003 – Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. D.O.U.

02/06/2003.

SANT’ANNA, G.S. Avaliação da exposição fetal à nicotina através da análise toxicológica em mecônio. São

Paulo: USP, 2010. Tese Mestrado em Toxicologia e Análises Toxicológicas, Faculdade de Ciências

Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 2010.

WATTS, R.R.; LANGONE, J.J.; KNIGHT, G.J.; LEWTAS, J. Cotinine analytical workshop report:

consideration of analytical methods for determining cotinine in human body fluids as a measure of passive

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Apoio: FAPERGS