valdir avelino rocha semedo -...

Universidade de Lisboa

Faculdade de Cincias

Departamento de Qumica e Bioqumica

Estudo Calorimtrico do efeito do H2O2 no metabolismo da

Saccharomyces cerevisiae

Valdir Avelino Rocha Semedo

Dissertao de mestrado

Mestrado em Bioqumica

rea de especializao Bioqumica Mdica

2014

Universidade de Lisboa

Faculdade de Cincias

Departamento de Qumica e Bioqumica

Estudo Calorimtrico do efeito do H2O2 no metabolismo da


Valdir Avelino Rocha Semedo

Dissertao de mestrado

Mestrado em Bioqumica

rea de especializao Bioqumica Mdica

Orientadores: Fernando Antunes e Manuel E. Minas da Piedade

2014

Estudo Calorimtrico do efeito do H2O2 no metabolismo da Saccharomyces cerevisiae

i

I. Abstract

The work carried out on this thesis is part of a project whose long-term aim is

to investigate the application of hydrogen peroxide (H202), the main oxidant of the cell,

as a pharmacological agent. In this thesis, for the first time a calorimetric method was

applied in order to study metabolic modifications induced by the addition of H2O2 to

Saccharomyces cerevisiae cells. Two calorimetric techniques were used: flux and batch

microcalorimetry performed in LKB 10700-1 and LKB TAM 2277 models, respectively.

The work implied the development of reaction vessels for both calorimeters and the

optimization of experimental conditions in order to succeed in detecting the energy

modifications associated to the cellular metabolism and its response to H2O2.

Main results were: (1) calibration constant, the volume of the calorimetric cell

and the time of residence in the cell were determined for the LKB 10700-1 model; (2)

growth curve of Saccharomyces cerevisiae for the wild-type strain (wt), for the strain

deleted in the cytosolic catalase gene (ctt1), and deleted in five peroxiredoxin genes

(5) obtained by calorimetry compared well with that observed by optical density; (3)

calorimetric analysis showed the existence of oscillations in the metabolism of

Saccharmyces cerevisiae during his normal growth and alterations in the metabolic

rate after exposure to H2O2; (4) a similar power is dissipated by cells from the three

strains studied during their exponential phase of growth; (5) the calorimetric response

to the addition of a sub-lethal dose (150 M) of H2O2 is similar in the wt and ctt1

strains, but in the 5 strain approximately half of the response was observed and a

longer period was needed to recover the metabolic response observed before H2O2

addition.

In conclusion, in this work calorimetry was successfully applied to investigate

the real-time response of living cells to non-lethal H2O2 doses.

Keywords: Hydrogen Peroxide, Metabolism, Microcalorimetry, Saccharmyces

cerevisiae


ii

II. Resumo

O trabalho desenvolvido nesta tese encontra-se inserido num projecto que

tem como objectivo a longo prazo investigar a aplicao do perxido de hidrognio

(H202), o principal oxidante da clula, como frmaco. Nesta tese, aplicou-se pela

primeira vez um mtodo calorimtrico para estudar alteraes metablicas induzidas

pela adio de H2O2 em clulas de Saccharomyces cerevisiae. Utilizaram-se dois

calormetros: um microcalorimetro de fluxo LkB 10700-1 e um microcalormetro de

batch TAM LKB 2277. O trabalho implicou o desenvolvimento de vasos reaccionais

para ambos os calormetros e a optimizao das condies experimentais de modo a

conseguir detectar as variaes de energia associadas ao metabolismo celular e suas

alteraes.

Os principais resultados obtidos foram: (1) determinou-se a constante de

calibrao, o volume efectivo e o tempo de residncia na clula calorimtrica do

microcalormetro de fluxo LKB 10700-1; (2) as curvas de crescimento da

Saccharomyces cerevisiae obtidas por calorimetria para a estirpe selvagem (wt), para

as estirpes com deleo do gene do catalase citoslico (ctt1) e com deleo de cinco

genes de peroxirredoxinas (5) foram semelhantes s obtidas por densidade ptica;

(3) a anlise calorimtrica mostrou a existncia de oscilaes do metabolismo da

Saccharomyces cerevisiae no seu crescimento normal e em alteraes na taxa

metablica aps exposio ao H2O2; (4) a potncia dissipada pelas clulas das

diferentes estirpes em fase exponencial do crescimento foi semelhante; (5) a resposta

calorimtrica adio de uma dose sub-letal (150 M) de H2O2 foi semelhante nas

estirpes wt e ctt1, mas na estirpe 5 foi cerca de metade e foi necessrio um perodo

superior para que o metabolismo anterior adio de H2O2 fosse recuperado.

Em concluso, neste trabalho a calorimetria foi aplicada com sucesso ao

estudo em tempo real dos efeitos biolgicos do H2O2 em clulas vivas.

Palavras-chaves: Perxido de Hidrognio, Metabolismo, Microcalorimetria,



iii

III. ndice Geral

I. Abstract .................................................................................................................. i

II. Resumo .................................................................................................................. ii

III. ndice Geral .......................................................................................................... iii

ndice de Figuras ............................................................................................................ v

ndice de Quadros .......................................................................................................... ix

IV. Agradecimentos .................................................................................................... x

V. Lista de Abreviaturas ............................................................................................ xii

1. INTRODUO ............................................................................................................. 1

1.1 mbito do trabalho ....................................................................................... 1

1.2 Microcalorimetria .......................................................................................... 3

1.3 Saccharomyces Cerevisiae como modelo Biolgico ...................................... 7

1.4 Metabolismo Celular ................................................................................... 10

1.5 Resposta celular ao stresse oxidativo ......................................................... 13

1.6 Mecanismos de defesa antioxidante em S.cerevisiae ................................. 17

2 OBJECTIVOS ......................................................................................................... 20

3 MATERIAIS E MTODOS ...................................................................................... 21

3.1 Descrio e optimizao dos calormetros utilizados ................................. 21

3.1.1 Microcalormetro de fluxo LKB 10700-1 .................................................. 21

3.1.2 Microcalormetro Thermal analysis monitor LKB 2277 (TAM) ................ 28

3.1.3 Microcalorimetro de soluo reaco ..................................................... 32

3.2 Equipamentos de apoio............................................................................... 33

3.3 Reagentes .................................................................................................... 33

3.3.1 Reagentes qumicos ................................................................................. 33

3.3.2 Preparao do meio liquido de cultura sinttico completo .................... 34


iv

3.3.3 Preparao do meio slido de cultura ..................................................... 34

3.3.4 Material Biolgico .................................................................................... 34

3.4 Determinao da constante de calibrao do microcalormetro de fluxo LKB

10700-1, e do volume efectivo da clula calorimtrica e tempo de residncia com hidrlise

do 4-hydroxibenzoato de metilo. ............................................................................................ 35

3.5 Preparao da cultura de Saccharomyces cerevisiae .................................. 36

3.5.1 Curvas de crescimento ............................................................................. 36

3.5.2 Efeito do H2O2 na cultura de leveduras ................................................... 37

3.6 Anlise da cultura de leveduras no microcalormetro Thermal Activity

Monitor (TAM) ..................................................................................................................... 38

4 RESULTADOS ....................................................................................................... 39

4.1 Determinao da constante de calibrao do microcalormetro de fluxo LKB

10700-1, e do volume efectivo da clula calorimtrica e tempo de residncia com hidrlise

do 4-hydroxibenzoato de metilo. ............................................................................................ 39

4.2 Calibrao elctrica no meio de cultura sinttico completo (sc). ............... 43

4.3 Comparao das curvas de crescimento da Saccharomyces cerevisiae

seguidas por densidade ptica e calorimetria ........................................................................ 45

4.4 Potencia dissipada pela Saccharomyces cerevisiae na fase exponencial .... 52

4.5 Estudo do efeito do perxido de hidrognio no metabolismo da

Saccharomyces cerevisiae nas diferentes estirpes ................................................................. 57

4.6 Estudos de calorimetria em batch............................................................... 63

5 DISCUSSO .......................................................................................................... 68

6 BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 73


v

ndice de Figuras

Figura 1.1: Primeiro calormetro de reaco isotrmico desenvolvido por Lavoisier e

Laplace (Acadmie des sciences, 1780). ....................................................................................... 5

Figura 1.2: Diagrama de blocos simplificado de um microcalormetro de fluxo de

calor. Adaptado de (Simes and Piedade, 2008). ......................................................................... 7

Figura 1.3: Representao esquemtica do ciclo de vida de S. cerevisiae: Duas clulas

haplides de diferentes tipos de mating, a e , podem unir-se originando uma clula diploide

a/ que se multiplica por gemulao. Em condies adversas, como escassez de nutrientes, as

clulas diplides entram em meiose formando ascsporos. A ruptura de ascos liberta quatro

esporos que germinam como clulas haplides. A cada nova gerao, uma clula haplide

pode trocar de tipo. Imagem adaptado de (wikipdia 2014). ...................................................... 9

Figura 1.4: Vias metablicas. Imagem extrada (Tymoczko and Stryer, 2006)............ 11

Figura 1.5: Curva tpica de crescimento celular; (A) fase lag; (B) fase exponencial;

(C) fase estacionria; (D) fase de morte. ..................................................................................... 12

Figura 3.1 : Ilustrao esquemtica do sistema LKB 10700-1, microcalormetro de

fluxo modificado utilizado neste trabalho. (1) Unidade calorimtrica, (2) clula de mistura, (3)

clula de reaco, (4) cmara de ar termostatizada, (5) termostato do ar, (6) ventilador, (7)

banho pr-termostatizado, (8) serpentina de arrefecimento, (9) termopilhas, (10)

nanovoltmetro utilizado para monitorar a sada das termopilhas, (11) bomba peristltica

multicanal, (12, 13) tubos que ligam o vaso reaccional com a cultura de clulas clula de

mistura, (14) tubo que liga clula de reaco, (15) a resistncia elctrica utilizado para

calibrao, (16) multmetro do circuito de calibragem, (17) fonte de alimentao do circuito de

calibragem, (18) o termstor de preciso utilizado para medir a temperatura precisa do

calormetro, (19) computador para controle das experincias e aquisio de dados, (20)

incubadora termostatizada onde est alojado o reactor com a cultura de clulas. ................... 22

Figura 3.2: Ilustrao esquemtica do sistema LKB 10700-1, microcalormetro de

fluxo modificado utilizado neste trabalho. (A) clula de reaco utilizada neste trabalho e (B)

clula de mistura, apenas utilizada como referncia; (1) tubo de sada da clula de mistura

(referncia), (2 e 3) os tubos de entrada na clula de mistura e (4 e 5) so respectivamente os

tubos de entrada e sada da clula de reaco. .......................................................................... 23

Figura 3.3: Montagem experimental inicial do sistema LKB 10700-1 de fluxo.

Incubadora (A), o calormetro (B), Canais de comunicao que contm os tubos de ligao


vi

entre o reactor (dentro da incubadora) e as clulas calorimtricas (seta) e ainda o computador

(c) onde os dados so recolhidos pelo programa CBCAL ............................................................ 24

Figura 3.4: Sistema de calibrao e de recolha de sinal do microcalorimetro de fluxo

LKB. De cima para baixo tem a fonte de tenso DC (Aligent 6611C), multmetro (Aligent

34401A) e nanovoltmetro (Aligent 3442OA). ............................................................................ 25

Figura 3.5: Exemplo de uma resposta calorimtrica tpica de uma experincia em que

no eixo Y est representado o sinal calorimtrico (V) e no eixo X o tempo (s). Linha de base

(A), adio da cultura de clulas ou outro reagente (seta vertical), chegada da cultura ou

reaco exotrmica clula calorimtrica (seta horizontal); o intervalo entre a seta e a queda

do sinal represente o tempo de que demora a cultura de clulas a chegar clula flow-

through. ....................................................................................................................................... 25

Figura 3.6: Balo de erlenmeyer utlizado nas experincias. ....................................... 26

Figura 3.7: Novo reactor construdo com um agitador magntico. ............................ 27

Figura 3.8: Interior da incubadora com o novo reactor (A) dentro do copo de vidro de

paredes duplas (B) com passagem de gua termostatizada por um banho externo; suporte do

reactor (seta). .............................................................................................................................. 27

Figura 3.9: Exterior da incubadora (A) utilizada na realizao das experincias no

microcalorimetro de fluxo LKB 10700-1 com temperatura controlada por um controlador de ar

e por um banho (B). .................................................................................................................... 28

Figura 3.10: (A) Calormetro LKB 2277 TAM, Thermal Activity Monitor e uma clula de

plstico (B); Os quatro canais deste calormetro encontram-se identificados nas quatro rodas

laranjas (setas); V-se tambm o nanovoltmetro que faz a recolha de dados. A clula de

plstico (B) utilizado para colocar a amostra a ser monitorada calorimetricamente. O tubo

enrolado sobre o eixo que contm a clula de plstico utilizado para fazer adies de H2O2

cultura. ........................................................................................................................................ 30

Figura 3.11: Esquema do interior do microcalorimetro TAM. (1) Suporte da clula

calorimtrica, (2) clula calorimtrica na posio de pr-equilbrio, (3) copo de medida onde

entra a clula, (4) Elemento de Peltier, termopilha e (5) metal dissipador de calor. ................. 31

Figura 3.12: Calormetro de soluo reaco Isoperibol Thermometric Precision

solution calorimeter. O copo de vidro Pirex (1), termstor (2), resistncia (3), agitador/suporte

(4), ampola (5), quebra ampolas (6), termostato Termal Activity Monitor (7). .......................... 33

Figura 3.13: Bureta automtica (CRISON 1S) utilizada para fazer adies de H2O2. ... 37

Figura 4.1: Calibrao elctrica e reaco de hidrlise do 4-hidroxibenzoato de metilo

numa soluo de NaOH 0,5 M em funo do tempo. So mostradas duas calibraes elctricas

realizadas com 100 e 130 V, respectivamente, indicadas pelas setas duplas. mostrada ainda


vii

uma reaco de hidrlise do 4-hidroxibenzoato iniciada pela adio deste reagente (seta

simples). ...................................................................................................................................... 40

Figura 4.2: Calor libertado (J.s-1) em funo do tempo da reaco de hidrlise do 4-

hidroxibenzoato de metilo. ......................................................................................................... 41

Figura 4.3: Linearizao da energia trmica dissipada (J.s-1) durante a reaco de

hidrlise do 4-hidroxibenzoato de metilo em funo do tempo (s). .......................................... 42

Figura 4.4: Calibraes elctricas no meio de cultura sc variando a intensidade

aplicado resistncia. Trs calibraes sequenciais esto indicadas pelas setas e foram feitas

com 145, 50 e 80 V, respectivamente. ..................................................................................... 44

Figura 4.5: Curva de crescimento da Saccharomyces cerevisiae, estirpe wt (),

estirpe Ctt1 () e estirpe 5 ().A OD600 inicial foi de 0,05, mostrando-se em B os resultados

obtidos em escala logartmica..................................................................................................... 46

Figura 4.6: (A) Curva de crescimento da Saccharomyces cerevisiae, estirpe selvagem

(wt) By4741 acompanhado por microcalorimetria. A adio da cultura de clulas ocorreu aos

103 minutos, isto , a volta de 1,72 horas (indicada pela seta pequena). Nota-se as 3 principais

fases de crescimento caracterstico da cultura. As fases a, b e c correspondem as fases lag,

exponencial e estacionaria respectivamente. (B) Ampliao da Figura A para evidenciar

oscilaes metablicas na fase ps-diauxica e estacionria (setas). .......................................... 48

Figura 4.7: (Superior) Curva de crescimento da Saccharomyces cerevisia, estirpe com

deleo da catalase (ctt1) By4741 acompanhado por microcalorimetria. (Inferior) Ampliao da

Figura superior onde evidencia oscilaes metablicas na fase ps-diauxica e estacionria

(setas). ......................................................................................................................................... 50

Figura 4.8: (Superior) Curva de crescimento da Saccharomyces cerevisiae, estirpe

com deleo das cinco peroxirredoxinas (5) By4741 acompanhado por microcalorimetria.

(Inferior) Ampliao da Figura A onde evidencia oscilaes metablicas na fase ps-diauxica e

estacionria (setas). .................................................................................................................... 51

Figura 4.9: Resposta calorimtrica adio da cultura de Saccharomyces cerevisiae

na fase exponencial de crescimento. A seta indica a adio de clulas da estirpe selvagem

(0,264 OD600) ao calormetro. ................................................................................................... 52

Figura 4.10: Perfil caracterstico da adio de H2O2 cultura de Saccharomyces

cerevisiae (estirpe selvagem,wt). (A) A Figura mostra 3 adies bolus de H2O2 150 M (crculos)

e a seta o tempo da adio da cultura (OD600=0,25); (B e C) mostram uma ampliao da

primeira e segunda adio de H2O2 respectivamente. As setas indicam a adio do H2O2 na

cultura. O intervalo de tempo entre a adio de H2O2 e a alterao do sinal calorimtrico


viii

reflecte o tempo que a cultura demora a chegar clula calorimtrica. Este tempo de atraso

aproximadamente 2 minutos quando o fluxo de 1.0 mL/min. ................................................ 58

Figura 4.11: Perfil caracterstico da adio de H2O2 a cultura de saccharomyces

cerevisiae (BY4741-ctt1) analisada calorimetricamente no microcalormetro de fluxo LKB-10-

700. (A). A Figura mostra as 4 adies de H2O2, nos crculos, (B e C) mostram uma ampliao da

primeira e segunda adio de H2O2 respectivamente. ............................................................... 59

Figura 4.12: Perfil caracterstico da adio de H2O2 cultura de Saccharomyces

cerevisiae, a estirpe com delees das cinco peroxirredoxinas (BY4741-5) analisada

calorimetricamente no microcalormetro de fluxo LKB-10-700. (A). A Figura mostra 3 adies

bolus de H2O2 150 M, indicadas pelos crculos. (B e C) mostram uma ampliao da primeira e

segunda adio de H2O2 respectivamente. ................................................................................. 60

Figura 4.13: Variao da densidade ptica a 600 nm em funo do tempo de uma

cultura da Saccharomyces cerevisiae, estirpe selvagem, para estimar valores de OD600 por

adio de H2O2 na cultura em questo. ...................................................................................... 61

Figura 4.14: Adio de H2O2 cultura Saccharomyces cerevisiae (estirpe selvagem) no

TAM. O grfico representa a tenso elctrica em funo do tempo (min). Os trs picos so a

primeira, a segunda e a terceira adio de H2O2 150 M, respectivamente. ............................. 64

Figura 4.15: Adio de H2O2 ao meio de cultura sc no TAM. O grfico representa a

tenso elctrica em funo do tempo (min). Os trs picos so a primeira, a segunda e a terceira

adio de H2O2, respectivamente. .............................................................................................. 64

Figura 4.16: Curva da dissoluo de H2O2 no meio sc por calorimetria de soluo a

298K. A Figura mostra a variao de temperatura em funo do tempo: (a) linha de base, (b1 e

b2) calibrao elctrica, (c) quebra da ampola com H2O2. ......................................................... 65

Figura 4.17: Adio de H2O2 a uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (estirpe

selvagem) no TAM numa clula de plstico. Representa-se a tenso elctrica em funo do

tempo (s). Os trs picos so a primeira, a segunda e a terceira adio de H2O2 (150 M),

respectivamente. ........................................................................................................................ 66


ix

ndice de Quadros

Quadro 1.1: Identificao de protenas reprimidas e estimuladas aps exposio ao

H2O2. Resumo do quadro (Godon et al., 1998) .................................................................. 14

Quadro 3.1: Estirpes de Saccharomyces cerevisiae usados no trabalho ........................... 36

Quadro 4.1: Resultados das duas calibraes elctrica relativa a experiencia

representada na Figura 4.1.................................................................................................. 41

Quadro 4.2 Resultados obtidos para a constante de calibrao (), o volume efectivo

(Vc) e o tempo de residncia () para vrias experincias independentes ........................ 43

Quadro 4.3 Constantes de calibrao obtida em cinco experiencias independentes com

meio sc. ...................................................................................................................... 44

Quadro 4.4: Valores experimentais da potncia dissipada por clulas da estirpe

selvagem da S. cerevisiae .................................................................................................... 54

Quadro 4.5: Valores experimentais da potncia dissipada por clulas da estirpe com

deleo do gene da catlase da S. cerevisiae ...................................................................... 55

Quadro 4.6: Valores experimentais da potncia dissipada por clulas da estirpe com

delees das cinco peroxirredoxinas da S cerevisiae .......................................................... 56

Quadro 4.7: Potncia dissipada por clula em cada uma das adies de H2O2 nas

diferentes estirpes em estudo ............................................................................................ 62


x

IV. Agradecimentos

O espao limitado desta seco de agradecimentos, seguramente, no me

permite agradecer, como devia, a todas as pessoas que, ao longo deste meu

mestrado em Bioqumica me ajudaram, directa ou indirectamente, a cumprir os

meus objectivos e a realizar mais esta etapa da minha formao acadmica. Desta

forma, deixo apenas algumas palavras, poucas, mas com um sentido e profundo

Sentimento de gratido.

Em primeiro lugar agradeo a Deus, pelo dom da Vida, pelas graas e

maravilhas que realizou e realiza em mim todos os dias, por um dia ter tido a

oportunidade de aventurar-me por este mundo fora, longe daqueles que

significam tudo para mim a fim de aumentar, desenvolver e enriquecer a minha

formao acadmica e crescer como pessoa.

Um obrigado aos meus dois orientadores, Fernando Antunes e Manuel E.

Minas da Piedade que me acompanharam e me orientaram no trabalho

desenvolvido nesta tese. Para alm do grande respeito que tenho pelos dois h em

mim uma grande admirao pelos professores que so, pelo conhecimento que

possuem e pela vontade de ensinar.

minha princesa preferida, a Susana, por estar sempre ao meu lado e

por fazer com que a minha vida fosse e seja mais alegre. MEDNB!

Felcia Gomes e Regina Alves por se disponibilizarem sempre a ajudar-

me e pelo carinho grande que tm para comigo. Sem vocs seria ainda mais difcil

concluir esta etapa, agradeo vos do fundo do meu corao.

s minhas tias Anita, Neftaly, Isabel, Antnia pelo apoio, carinho e

amizade que me foram dando ao longo destes dois anos. A todas vs e aos meus

primos, um obrigado pelos bons momentos de convvio. Aproveito para agradecer

a Jocilene Santos!

professora Lusa Cyrne por estar sempre presente e disponvel a ajudar-

me no Laboratrio.


xi

No podia deixar de agradecer a Cinthia Nakamura que comeou esta

maratona comigo e a Tatiana Nobre, pela ajuda nas tarefas do laboratrio, pelo

convvio e pelos bolos da me.

Agradeo a grande contribuio do professor Muftah Basheer, pela boa

disposio, pela amizade, pelo convvio no laboratrio, pelos conselhos e pela

grande ajuda na alterao do sistema calorimtrico e desenho do novo reactor

utilizado. Um grande abrao.

Agradeo ao Carlos Bernardes pela disponibilidade e apoio ao longo do

ano no laboratrio.

Agradeo aos meus colegas de laboratrio Abhinav Josepf, Joana Vitorino,

Ricardo Simes, Rafael Bento, e aos meus colegas de curso pelo contributo que

tiveram, de uma ou de outra forma, na realizao deste trabalho e de outros

anteriores.

Um obrigado ao povo cantina velha pelos bons momentos de convvio

durante os almoos ao longo do ano lectivo.

Agradeo tambm Fundao Millennium BCP e aos SASUL pela ajuda no

ltimo ano do mestrado. Obrigado pelo vosso imprescindvel apoio.

Aproveito para agradecer ao professor Dong-Yan Jin da Universidade de

Hong Kong pela oferta generosa da estirpe 5.

Queria terminar esta parte de agradecimento, agradecendo as primeiras

pessoas que me ajudaram e motivaram a chegar at aqui. Um Obrigado do

tamanho do Mundo aos meus pais, Ceclia Rocha e Arlindo Semedo e claro aos

meus irmos, Patrick, Ivan, Indira, Chrisney, Rubem, Eder, Melany e Fabio. Embora

no vos veja h mais de seis anos, desde que me aventurei em Portugal para a

licenciatura, seguindo-se o mestrado, vocs continuam sendo a minha fora todos

os dias. Muito em breve estarei convosco, com esta etapa da minha vida concluda.

A vs, famlia, dedico este trabalho!


xii

V. Lista de Abreviaturas

ATP Trifosfato de adenosina

CAT Catalase

Ctt1 Estirpe de S. cerevisiae com deleo do gene do catalase

5 Estirpe de S.cerevisiae com deleo das 5 peroxirredoxinas

DNA cido desoxirribonucleico

ERO Espcies reactivas de oxignio

GAPDH 3-fosfato de gliceraldedo desidrogenase

GPx Glutationo peroxidase

GSH Forma reduzida do glutationo (-glutamilcisteinilglicina)

GSSG Forma oxidada do glutationo

H2O2 Perxido de hidrognio

HO Radical hidrxilo

mRNA RNA mensageiro

NADPH Fosfato de dinucleotido de adenina e nicotinamida no estado

reduzido

O2- Radical anio superxido

OD600 Densidade ptica a 600 nm

PTP1B Fosfatase de tirosina 1B

S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

TAM Thermal activity monitor

TPx Tiorredoxina peroxidase

YNB Yeast nitrogen base

Yap Yeast activator protein

Wt Estirpe selvagem de S. cerevisiae

Estudo Calorimtrico do efeito do H2O2 no metabolismo da Saccharomyces cerevisiae Introduo

1

1. INTRODUO

1.1 mbito do trabalho

O trabalho desenvolvido nesta tese encontra-se inserido num projecto que

tem como objectivo a longo prazo investigar a aplicao do perxido de hidrognio

(H202), o principal oxidante da clula, como frmaco. A medicina oxidativa, ou seja, a

utilizao de oxidantes na terapia de patologias, um campo inovador, emergente, e

ainda altamente controverso, uma vez que surge aps dcadas em que danos txicos

so atribudos aos oxidantes.

O H2O2 produzido na clula de forma natural, resultando do metabolismo

aerbico (Chance et al., 1979). H evidncia de que a administrao de H2O2 em doses

controladas pode constituir uma terapia em vrias patologias humanas, abrindo assim

o campo da medicina oxidativa (Bjrkman et al., 2008; Le Bourg, 2007; Mesquita et al.,

2010; Schroder et al., 2012; Yokoo et al., 2004; Yoo et al., 2011). Isto representa uma

viso contrria de muitos investigadores que consideram a suplementao com

antioxidantes como sendo benfica para a sade. Se por um lado h evidncia

epidemiolgicas sobre os efeitos benficos dos antioxidantes, os ensaios clnicos

realizados at data no confirmam esses efeitos benficos, e por vezes at

evidenciam um efeito prejudicial para a sade causado pela suplementao de

antioxidantes (Bjelakovic et al., 2007; Goodman et al., 2011). Este paradoxo pode ser

compreendido se se considerar o no estabelecimento de relaes causa-efeito nos

estudos epidemiolgicos. Por outro lado, hoje associa-se ao comportamento dos

oxidantes curvas dose-resposta no clssicas com hormese (Forman et al., 2014).

O termo hormese descreve relaes dose-resposta, caracterizadas por uma

inverso de resposta de algum ponto final biolgico relevante (por exemplo, a

proliferao ou a longevidade) entre baixas e altas doses de produtos qumicos,

molculas biolgicas ou factores de stress fsicos.(Kendig et al., 2010). Este fenmeno

tem suscitado grande interesse na comunidade cientfica sendo amplamente discutido


2

na literatura biomdica, principalmente nas reas da toxicologia, e de proteco a

radiaes (Calabrese and Baldwin, 2003).

Foram estudadas as respostas de adaptao ao stress oxidativo do perxido

de hidrognio (H2O2) na levedura Saccharomyces cerevisiae BYRZ53. Os resultados

mostraram que o crescimento de clulas naive facilmente preso ao desafio do H2O2.

Em contraste, as clulas que foram pr-expostas a doses relativamente baixas de H2O2

so capazes de sobreviver a uma dose subsequente e continuam a dividir-se a taxas

normais. O aumento da resistncia de H2O2 nas clulas pr-tratadas foi transitrio,

sendo prontamente revertido durante 60-90 min de crescimento na ausncia de H2O2

(Davies et al., 1995).

A nvel molecular existe evidncia do H2O2 ser benfico para vrias patologias.

Talvez os exemplos mais claros sejam os da diabetes e obesidade. O H2O2 mimetiza a

aco da insulina por um mecanismo molecular que envolve a inibio do fosfatase de

tirosina PTP1B (Mahadev, 2001). Esta via molecular altamente relevante para a

diabetes tipo II, a forma mais comum de diabetes, caracterizada pela resistncia das

clulas aco da insulina. O PTP1B inibe o receptor de insulina, e assim, a inibio do

PTP1B pode evitar a resistncia das clulas aco da insulina. De facto quando o

PTP1B suprimido, os ratinhos aumentam a sensibilidade aos efeitos benficos da

insulina e no desenvolvem diabetes (Elchebly, 1999). Alm disso, os animais tornam-

se resistentes obesidade induzida por dietas ricas em glcidos e lpidos (Kaszubska et

al., 2002), facto provavelmente explicado pelas funes semelhantes do PTP1B

exercidas na via da transduo do sinal da insulina e da leptina, uma importante

hormona regulatria do apetite a nvel do hipotlamo. Infelizmente, o

desenvolvimento de frmacos contra o PTP1B no tem tido sucesso (Haque et al.,

2011), Mas, sendo o H2O2 o inibidor endgeno deste fosfatase, coloca-se a hiptese de

aplicar farmacologicamente H2O2 para estimular as vias de transduo da insulina e da

leptina.

Para alm do exemplo anterior ainda existem outros que ilustram potenciais

efeitos benficos do H2O2 como: (a) doenas vasculares - recentemente, observou-se a

induo da proteco da vasculatura durante a isqumia e a inflamao pelo H2O2

produzido na reaco catalisada pelo enzima NADPH oxidase, Nox4 (Schroder et al.,


3

2012); (b) cicatrizao em trabalhos com elevado impacto observou-se, um papel

importante para este processo exercido pelo H2O2 (Yoo et al., 2011); (c) doena

granulomatosa crnica esta doena caracteriza-se pela deficincia em NADPH

oxidase (enzima catalisador da produo de H2O2) da qual resulta um estado de

inflamao crnica, apoiando a hiptese de um papel anti-inflamatrio para o H2O2

(Bjrkman et al., 2008); (d) vrios investigadores observaram efeitos no

prolongamento do tempo de vida exercidos pela adio de H2O2, quando a teoria mais

comum os oxidantes promoverem o envelhecimento (Yokoo et al., 2004).

Para estudar se h potencialmente efeitos benficos da exposio celular a

H2O2 necessrio, em primeiro lugar, desenvolver e optimizar uma metodologia que

permita observar as alteraes que eventualmente ocorrem aquando da exposio das

clulas a doses sub-letais de H202.

A microcalorimetria uma tcnica com grande potencial para este tipo de

estudos devido sua elevada sensibilidade e ao facto de, ao contrrio das tcnicas

espectrofotomtricas, no necessitar de transparncia ptica. Permite, para alm

disso, monitorizar o calor associado ao metabolismo celular em tempo real e de forma

no invasiva. Tem como principal desvantagem o facto de no ser especfica, ou seja

detecta o calor produzido pelo metabolismo celular, mas a resposta global. No

fornece, assim, informao sobre qual a(s) via(s) metablica(s) mais directamente

relacionada(s) com alteraes do sinal calorimtrico associadas adio de H2O2. por

isso, importante desenvolver estratgias que permitam interpretar os resultados a

nvel molecular.

O presente projecto centrou-se no desenvolvimento de metodologias

experimentais para estudar a hormese do H2O2 usando microcalorimetria de fluxo de

calor.

1.2 Microcalorimetria

H mais de 200 anos que calorimetria tem sido aplicada no estudo de

sistemas biolgicos (Kleiber, 1961). Crawford na Esccia e Lavoisier e Laplace na Frana

mediram produo de calor na respirao de animais. Durante as primeiras dcadas do


4

seculo XX a calorimetria da respirao calorimetria do corpo inteiro foi mais

extensivamente utilizada na medio do calor produzido por animais e pessoas quando

em repouso ou realizando trabalho mecnico (Silva, 1984).

A actividade biolgica o resultado da ligao entre as reaces de

abastecimento (catabolismo), que so reaces exotrmicas e biossintticas

(anabolismo), que so endotrmicas. A fora motriz destas reaces medida pela

respectiva variao de energia de Gibbs, rG. Embora rG seja a varivel

termodinmica fundamental que sustenta o crescimento, apenas variao de

entalpia de reaco (rH) que mensurvel por calorimetria (mudana de temperatura

ou fluxo de calor). Por outras palavras H igual ao calor libertado ou absorvido, isto

, pode ser positivo ou negativo nos processos exotrmicos e endotrmicos

respectivamente A relao fundamental entre estes dois parmetros dada pela

equao 1.1

onde T a temperatura do sistema e rS a variao de entropia. O calor que liberado

por quase todos os processos biolgicos consequncia da dissipao de energia de

Gibbs para sustentar reaces termodinamicamente desfavorveis. Dissipao o

custo para executar reaces no espontneas.(Brown, 1998)

Historicamente, Lavoisier foi o primeiro que relacionou a respirao com

combusto, numa famosa experincia em que colocou um pssaro sob uma

campnula de vidro. Da mesma forma, ele relatou a relao entre a gerao de calor e

actividade metablica. De facto, a taxa de fluxo de calor proporciona uma medida da

actividade biolgica.(Brown, 1998).

A primeira aplicao de calorimetria de organismos vivos certamente a

medida do calor gerado por uma cobaia, relatada em 1780 por Lavoisier e Laplace. Eles

colocaram o animal numa cmara rodeada por gelo e uma camada de isolamento

(Acadmie des sciences, 1780). Admitindo que o gelo o nico dissipador de calor e


5

que a actividade metablica do animal a nica fonte de calor, a quantidade de gua

recolhida deve ser proporcional ao calor produzido pela cobaia.

Figura 1.1: Primeiro calormetro de reaco isotrmico desenvolvido por Lavoisier e

Laplace (Acadmie des sciences, 1780).

A maioria das transformaes qumicas e fsicas, incluindo as que ocorrem nos

sistemas biolgicos, ocorre em condies de presso constante. Para quantificar o

fluxo de calor para dentro e para fora do sistema num processo a presso constante,

usa-se a grandeza entalpia (H). Contudo, o que se mede normalmente a variao de

entalpia, H.


6

Calormetro de conduo de calor

Na calorimetria de conduo de calor, a taxa de fluxo de calor produzido no

interior do reactor transferido para a parede circundante, termopilha (contendo

grande quantidade de junes idnticas de termopares dispostas em torno da clula

reaccional) que gera e conduz a uma tenso (V) proporcional taxa de fluxo de calor

(dQ / dt). Ver equao1.3.

A constante de proporcionalidade k pode ser determinada

experimentalmente por calibrao. Calormetro de conduo de calor tem um baixo

limite de deteco, mas a identificao de qualquer alterao na taxa de fluxo de calor

lenta. Por conseguinte, este tipo de calormetro adequado para retardar os

processos de produo de pequenas quantidades de calor.

Os calormetros de fluxo de calor modernos tm clulas individuais; assim,

eles operam em modo diferencial. Isto significa que as termopilhas elctricas das

clulas da amostra e da referncia esto ligadas em oposio, de modo que a medida

sada seja a diferena entre as respectivas foras termoelctricas. Os sistemas

electrnicos auxiliares de um instrumento de fluxo de calor so relativamente simples,

como se mostra no diagrama de blocos da Figura 1.2. O dispositivo principal uma

interface entre o nanovoltmetro e um computador para controle do instrumento,

aquisio e manipulao de dados. Os restantes sistemas electrnicos de um

microcalormetro (no mostrado na Figura 1.2) esto relacionadas com o controlo

preciso da temperatura do termostato e, em alguns casos, com a calibrao do

instrumento elctrico. (Simes and Piedade, 2008)


7

Figura 1.2: Diagrama de blocos simplificado de um microcalormetro de fluxo de calor.

Adaptado de (Simes and Piedade, 2008).

1.3 Saccharomyces Cerevisiae como modelo Biolgico

Para estudar a capacidade hormtica do H2O2, e os seus efeitos benficos na

sade importante encontrar um modelo biolgico que tenha caractersticas muito

prximas das clulas humanas. Muitos genes de leveduras tm mostrado ser ortlogos

no genoma humano, incluindo alguns genes causadores de doenas. Vrias protenas

humanas podem ser funcionalmente substitudas para os seus anlogos de levedura

aps a transfeco de genes humanos em levedura (Gershon and Gershon, 2000).

S. cerevisiae um eucariota, fungo unicelular, pertencente ao filo de

Ascomycete. Apresenta uma organizao intracelular complexa que

consequentemente leva a mecanismos complexos de regulao da expresso gentica

tal como nos organismos multicelulares.

A utilizao das leveduras como modelo experimental apresenta inmeras

vantagens, genticas, bioqumicas e fisiolgicas. A S. cerevisiae de fcil manipulao,

e tem um tempo de duplicao relativamente curto. A sua gentica bem conhecida e

isso permite que a construo de mutantes definidos seja relativamente simples.

Microcalormetro

Regulador de Temperatura

Nanovoltmetro


8

Destaca-se ainda um custo de manuteno e crescimento, comparativamente a outros

sistemas biolgicos bastante mais reduzido; o facto de no ser patognico, no

havendo factor de risco para o manipulador; como j mencionado um tempo de

duplicao relativamente curto, cerca de 90 minutos; apresenta vrias semelhanas

com os eucariotas superiores a nvel dos organitos, macromolculas, mecanismos

bsicos de replicao, diviso celular e metabolismo. A facilidade de manipulaes

genticas associadas ao conhecimento completo da sequncia de DNA permite que a

construo de mutantes definidos seja relativamente simples, obtendo assim estirpes

diferentes resultantes de deleco de genes. A levedura S. cerevisiae provavelmente

o eucariota mais estudado e, por conseguinte, amplamente utilizado na investigao

biolgica nas mais diversas reas desde de processos especficos ao envelhecimento.

S. cerevisiae pode ser plaqueada em placas de gar como clulas individuais e

observa-se um crescimento clonal. Reproduz-se quer por gemulao (reproduo

assexuada) quer por conjugao (reproduo sexuada). Ao contrrio de muitos outros

microrganismos, a S. cerevisiae tem o genoma estvel tanto na forma haplide como

diplide e pode proliferar se em ambos os estados (Figura 1.3). O crescimento

vegetativo destas clulas eucariotas unicelulares ocorre habitualmente por gemulao.

Uma clula-filha cresce a partir de uma gmula da clula-me. Segue-se a diviso

nuclear, formao da parede celular e finalmente a separao das clulas.


9

Figura 1.3: Representao esquemtica do ciclo de vida de S. cerevisiae: Duas clulas

haplides de diferentes tipos de mating, a e , podem unir-se originando uma clula

diploide a/ que se multiplica por gemulao. Em condies adversas, como escassez

de nutrientes, as clulas diplides entram em meiose formando ascsporos. A ruptura

de ascos liberta quatro esporos que germinam como clulas haplides. A cada nova

gerao, uma clula haplide pode trocar de tipo. Imagem adaptado de (wikipdia

2014).

A capacidade de duas clulas haplides a e se conjugarem, fundirem e

originarem uma clula diplide a/ denominada de mating ou reproduo sexuada.

O tipo de mating de cada clula determinado pelo locus MAT (MATing type). Clulas

com o alelo MAT so do tipo , secretam pequenos pptidos (feromonas) deste tipo

e expressam na superfcie celular receptores de pptidos de tipo complementar.

Similarmente, clulas com o alelo MATa so do tipo a, secretam feromonas a e

reconhecem feromonas sua superfcie. O reconhecimento de feromonas de tipo

complementar leva aproximao das clulas haplides em questo, fuso celular e

nuclear numa nica clula diplide heterozigtica a/. Estas clulas podem, mediante

as condies ambientais, dividir-se mitoticamente ou, se sob dfice nutricional, dividir-

se meioticamente. Quando as condies externas so desfavorveis para as clulas

diplides, a meiose ocorre, causando o aparecimento de quatro esporos haplides


10

Neste caso originaro 4 clulas haplides, duas de cada tipo, a e . Se as condies o

proporcionarem, os esporos germinaro e dividir-se-o mioticamente.

1.4 Metabolismo Celular

Para estudarmos os efeitos do H2O2 nas clulas pretendemos observar as

alteraes no metabolismo induzido pelo H2O2 em doses no letais. A

microcalorimetria permite-nos determinar o calor libertado e consequentemente a

taxa metablica. O metabolismo celular constitudo por uma rede grande e complexa

de reaces qumicas (Figura 1.4) (Tymoczko and Stryer, 2006) catalisadas

enzimaticamente. Estas ocorrem sequencialmente e de forma coordenada, com o

principal objectivo de gerar um ou mais produtos especficos (metabolitos e ATP), que

sero utilizados subsequentemente nas etapas de biossntese. O processo metablico

tradicionalmente dividido em duas etapas conhecidas como catabolismo e

anabolismo. O catabolismo ou metabolismo oxidativo a via pela qual as

macromolculas, constituintes celulares (glcidos, protenas, lpidos, etc.) so

oxidativamente degradados com o objectivo de produzir energia qumica (na forma de

ATP) e intermedirios metablicos para processos biossintticos. So exemplos a via

da -oxidao de cidos gordos e a gliclise. O anabolismo ou metabolismo redutivo,

tambm conhecido como via biossinttica, o processo pelo qual as biomolculas so

sintetizadas a partir de molculas mais simples e energia (ATP), que so em grande

parte oriundas das vias catablicas.


11

Figura 1.4: Vias metablicas. Imagem extrada (Tymoczko and Stryer, 2006).

Na maioria das espcies de levedura o catabolismo ocorre por duas vias

principais, fermentao e/ou respirao. Em algumas espcies de leveduras estes dois

processos podem ocorrer concomitantemente, como no caso da S. cerevisiae. Esse

fenmeno depende das condies do meio, principalmente da concentrao da glicose

e da limitao de oxignio do meio.

Por um lado, em condies nas quais existem elevadas concentraes de

glucose, frutose ou maltose, a tendncia utilizar fermentao alcolica, ou seja, o

piruvato resultante da gliclise oxidado a etanol. Quando h escassez destas fontes

no meio a levedura consome o etanol. A S. cerevisiae tem um crescimento divido em

trs fases (Figura 1.5) (Rettori and Volpe, 2000), (A) a chamada fase lag, corresponde

a uma fase de adaptao fisiolgica das clulas ao novo meio de cultura no qual elas

foram introduzidas. Nesta fase o metabolismo das clulas est activo (sintetizando

enzimas e coenzimas) de modo a criar as condies para que elas se possam dividir.

Portanto, na fase lag as clulas no se dividem. A fase (B) conhecida como a fase

exponencial de crescimento porque o nmero de clulas aumenta exponencialmente

com o tempo. E a fase (C) denomina-se de estacionria, onde o nmero de clulas


12

viveis se mantm constante, isto , so iguais os nmeros correspondentes as clulas

que nascem e as que morrem. Aps esta ltima fase as clulas entram na chamada

fase da morte pois as condies do meio vo se tornando cada vez mais imprprias

para as clulas sobreviverem.

Figura 1.5: Curva tpica de crescimento celular; (A) fase lag; (B) fase exponencial; (C) fase estacionria; (D) fase de morte.

A fase B, exponencial caracterizada pela intensa actividade metablica

celular pois para o crescimento exponencialmente, preciso muita energia, isto , a

clula necessita produzir grandes quantidades de ATP custa de um grande consumo

de uma fonte de carbono. Este processo catablico (produo de ATP a partir de uma

fonte de carbono) exotrmico (Jr et al., 2013) e o balano deste com os demais

processos catablicos e anablicos que ocorrem no interior da clula tambm

exotrmico. Uma clula liberta calor quando est activa metabolicamente portanto a

microcalorimetria uma tcnica que pode ser utilizada no estudo do metabolismo

celular.


13

1.5 Resposta celular ao stresse oxidativo

O oxignio molecular o aceitador final de electres ideal porque a sua

elevada afinidade por electres fornece grande fora impulsora termodinmica. Todos

os organismos de crescimento aerbico esto continuamente expostos a espcies

reactivas de oxignio (ERO). A exposio contnua aos EROs gera stresse oxidativo

quando a concentrao de oxidantes excede a capacidade tampo antioxidante da

clula levando a danos celulares (Sies, 1997).

As principais espcies reactivas de oxignio formadas em ambiente celular

so: o perxido de hidrognio (H2O2), o radical hidrxilo (HO.), e o radical superxido

(O2 -), mas outras espcies reactivas txicas podem ser produzidos a partir da reaco

entre as ERO e outros compostos (Temple et al., 2005). O radical superxido O2-, pode

ser formado na cadeia transportadora de electres situada na membrana interna

mitocondrial, sendo tambm formado durante o metabolismo microssomal. Este

radical no muito reactivo mas pode reagir directamente com algumas protenas

(Gardner and Fridovich, 1991). O H2O2 produzido pela dismutao do O2.- catalisada

pelo superxido dismutase, assim como na oxidao de cidos gordos nos peroxisomas

(Aruoma et al., 2006). Contrariamente ao O2.-, que devido sua carga no atravessa

membranas celulares, o H2O2 pode difundir-se atravs de membranas.

O H2O2 considerado um oxidante fraco. Surge associado oxidao de

grupos sulfidrilo (-SH) levando diminuio da razo GSH/GSSG, inactivao de

alguns enzimas e determinadas protenas, associadas produo e transporte de

energia cujo centro activo seja rico em resduos de cistena ou que possuam resduos

de cistena importantes para a sua funo devido oxidao dos grupos sulfdrico

(Grant, 2001). No entanto, pode levar formao in vivo do radical hidrxilo via

reaco de Fenton (equao 1.4):


14

O radical HO. formado altamente reactivo, e reage de forma rpida e

indiscriminadamente com metabolitos e macromolculas, levando formao de

outros radicais.

O estudo do efeito do H2O2 em doses sub letais e as respostas ao mesmo

crucial para a compreenso de como organismos unicelulares e multicelulares se

adaptam a diversas mudanas do meio ambiente. Tais respostas requerem um sistema

complexo de reconhecimento e transduo de sinal, permitindo o crescimento e

proliferao da clula bem como a expresso de genes, actividades metablicas e

outras caractersticas da clula.

As alteraes na expresso de genes subjacentes resposta da levedura ao

stresse oxidativo e sua adaptao ao H2O2 foram analisados por electroforese

comparativa em gel bidimensional das protenas totais celulares em S.cerevisiae. O

Tratamento das clulas com H2O2 resultou na sntese de pelo menos 115 protenas

enquanto 52 outras protenas foram reprimidas (Godon et al., 1998). A exposio ao

H2O2 tambm resulta numa diminuio das protenas responsveis por processos

biossintticos e estimulao das vias de degradao de protenas. Podemos ver no

quadro 1 (Godon et al., 1998) a expresso de diversas protenas envolvidas

directamente na resposta ao choque trmico, associadas ao scavenging de ERO,

proteases e protenas ligados na reparao de danos moleculares.

Quadro 1.1: Identificao de protenas reprimidas e estimuladas aps exposio ao

H2O2. Resumo do quadro (Godon et al., 1998).

Genes Nome Represso Induo

1. Protenas com propriedades antioxidantes

CCP1 Citocromo c peroxidase +

CTT1 Catalase T +

GLR1 Glutationo Redutase +

SOD1 Cu/Zn-SOD +

SOD2 Mn-SOD +

TRR1 Tiorredoxina Redutase +

TRX (1/2) Tiorredoxina 1 ou 2 +


15

TSA1 Tiorredoxina peroxidase +

GRX1 Glutarredoxina 1 +

TSA2 Tiorredoxina peroxidase +

AHP1 Tiorredoxina peroxidase +

2. Protenas de choque trmico e chaperoninas

DDR48 Resposta ao dano no DNA +

HSC82 Protena de choque trmico +

HSP104 Protena de choque trmico +




PDI1 Protena persulfureto isomerase +

3. Protases

CIM5 Subunidade do Proteossoma +

PRE3 Subunidade do Proteossoma +



HSP78 Protease mitocondrial +

UBA1 Enzima activadora de ubiquitina +

4. Protenas envolvidas na traduo proteica

EFB1 Factor de elongao EF-1 -

EFT1 Factor de elongao EF-2 -

YEF3 Factor de elongao EF-3 -

IF4B Factor de iniciao elF4B +

RPA2 Protena ribossomal acdica L44 -

5. Enzimas do metabolismo dos glcidos

A. Via dos fosfatos de pentose


16

TAL1 Transaldolase +

TKL1 Transcetolase +

TKL2 Transcetolase +

ZWF1 Glucose 6-fosfato desidrogenase +

B. Gliclise

ADH1 Alcol desidrogenase -

ALD5 Aldeido desidrogenase +

ALD6 Alcol desidrogenase -

ENO1 Enolase +

GLK1 Glucocinase +

GLK1 Gliceraldedo 3-fosfato desidrogenase -

C. Ciclo do cido ctrico

LPD1 Di-hidrolipoamida desidrogenase -

MDH1 Malato desidrogenase -

PDB1 Piruvato desidrogenase -

D. Metabolismo glicerol

DAK1 Di-hidroxiacetona cinase -

GPD1 Fosfato glicerol

desidrogenase

-

GPP1 Fosfato glicerol fosfatase +

GPP2 Fosfato glicerol fosfatase -

E. Metabolismo aminocidos

ARG1 Arginosuccinato sintase +

ARO4 DAHP sintase +

GDH1 Glutamato desidrogenase -

HIS4 AMP ciclo-hidrolase +

ILV2 Acetolactato sintase -

MET6 Metionina sintase -

LYS20 Homocitrato sintase +

F. Sntese purinas e pirimidinas


17

GUA1 GMP sintetase -

ADE3 C1- tetra-hidrofolato sintase -

ADE6 5'-fosforibosilformilglicinamidina sintase -

ADE57 Fosforibosilamina-glicina ligase -

URA1 Di-hidrourotato desidrogenase -

Estes resultados foram obtidos num estudo envolvendo a utilizao de uma

dose bolus de H2O2 e, a resposta obtida envolve muitos mais genes devido quer

prpria resposta ao stresse oxidativo quer elevada alterao do estado redox da

clula.

Conforme atrs mencionado, o mbito deste trabalho investigar o efeito do

H2O2 em doses sub-letais no metabolismo celular. A molcula de H2O2 pequena,

neutra e capaz de se difundir atravs das membranas biolgicas. Hoje em dia sabe-se

que a difuso de H2O2 nas membranas celulares no ocorre de forma livre, podendo

mesmo a sua passagem atravs da membrana ser regulada por alteraes a nvel da

composio membranar (Branco et al., 2004). Esta regulao depende de alteraes da

composio da membrana. O facto de ser mais estvel comparativamente ao radical

hidrxilo e ao anio superxido faz com que seja preferencialmente usada para

sinalizaes intra- e intercelulares. (Forman et al., 2010)

1.6 Mecanismos de defesa antioxidante em S.cerevisiae

Para proteco contra danos oxidativos, as clulas desenvolveram

mecanismos eficazes de defesa (Grant, 2001). As clulas possuem sistemas de defesa

enzimticos e no enzimticos para proteger seus constituintes celulares e manter o

estado redox fisiolgico. Sistemas de defesas no enzimticos consistem tipicamente

em molculas pequenas que so solveis num meio aquoso ou em alguns casos num

ambiente lipdico. Eles agem em geral, como scavengers de radicais formados por

ERO, removendo assim oxidantes da soluo (Jamieson DJ, 1998). Mas relevante para

o objectivo do trabalho presena de antioxidantes enzimticos responsveis pela

remoo do H2O2.


18

Os principais enzimas so catalase (CAT), citocrmio c peroxidase, a

peroxirredoxina, tiorredoxina, e tiorredoxina redutase, glutationo peroxidase e

redutase. Destaca-se ainda o sistema gerador de NADPH que fornece os equivalentes

redutores para estes enzimas.

Catalase um enzima intracelular, encontrado na maioria dos organismos,

que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) segundo a equao 1.5.

Na S. cerevisiae, existem dois catalases, o A e o T codificadas pelos genes Cta1

e Ctt1 respectivamente. O catalase A encontra-se nos peroxisomas e o principal papel

deste enzima est relacionado com a remoo de H2O2 produzido pelo enzima acilo-

CoA oxidase, durante a -oxidao de cidos gordos (Hiltunen et al., 2003). A funo

da protena citoplasmtica, catalase T menos clara. Catalisa a dismutao do H2O2

em gua e oxignio, no sendo necessrio cofactor dador de electres. Expresso do

gene CTT1 , no entanto, regulada por estresse oxidativo, osmtico e pela fome.

Estirpes mutadas nos genes codificantes dos dois catalases (CTA1 e CTT1), no

demonstram qualquer alterao ao nvel da sensibilidade ao H2O2, ou qualquer

limitao no crescimento exponencial em condies aerbias relativamente a estirpe

selvagem (wt), inferindo-se assim que os catalases no so essenciais na proteco

contra o H2O2 (Izawa et al., 1996a)

O perxido de hidrognio tem de ser rapidamente convertido numa espcie

qumica que seja incua. O catalase tem o mais alto nmero de turnover (kcat)

conhecido em enzimas: um enzima de catalase pode catalisar a decomposio de at

4107 molculas de H2O2 por segundo. (Nelson and Cox, 2008).

No entanto, o duplo mutante cta1ctt1 apresenta hipersensibilidade ao

H2O2 em fase estacionria, sugerindo deste modo uma resposta conjunta e

cooperativa entre os dois catalases na proteco contra o H2O2 externo. A actividade

enzimtica dos catalases aumenta quer na proteco ao H2O2 na fase estacionria,

quer na resposta adaptativa ao H2O2 comparativamente ao seu nvel na fase

exponencial de crescimento.(Izawa et al., 1996a).

http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Per%C3%B3xido_de_hidrog%C3%A9niohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Segundo


19

Peroxirredoxinas, constituem uma famlia de peroxidases especficos de tiol

abundantes encontradas em todos os organismos (Wood et al., 2003). Embora estes

enzimas antioxidantes sejam considerados cruciais na defesa celular e sinalizao

redox, seus papis fisiolgicos exactos so desconhecidas (Wong et al., 2004). Muitos

tipos diferentes de peroxirredoxinas so encontrados numa espcie. A S. cerevisiae

tem cinco tipos conhecidos (Park et al., 2000). Estas protenas so capazes de reduzir

hidroperxidos orgnicos e inorgnicos com electres fornecidos principalmente por

NADPH ou NADH e de diferentes protenas, tais como a tiorredoxina (Trx),

glutarredoxina (GRX), e ciclofilina A (Chae et al., 1994; Lee et al., 2001).

Glucose 6-fosfato desidrogenase, transcetolase e ribulose 5 fosfato

epimerase. Estes enzimas da via pentose de fosfato so essenciais na produo e

regenerao de poder redutor na forma de NADPH. Ambos requerem NAPH como

redutor para reduzir glutationo oxidada (GSSG) e tiorredoxina. O GSH e tiorredoxina

so importantes antioxidantes, por isso, mutaes que afectam os enzimas da via das

pentoses fosfatos tem um efeito negativo na capacidade de responder ao stresse

oxidativo, ficando as clulas hipersensveis ao H2O2 (Jamieson DJ, 1998).

Glutationo redutase. Trata-se de um antioxidante importante e o principal

agente responsvel pela reduo do GSSG em GSH, contribuindo assim para a

manuteno da elevada proporo GSH/GSSG. Este enzima codificado pelo gene

GLR1 na S. cerevisiae e apesar de mutantes nulo serem viveis apresentam um excesso

de glutationo oxidada e hipersensibilidade a oxidantes.(Grant et al., 1996)

Glutationo peroxidase. Como referido anteriormente, o GSH um

antioxidante importante que pode reagir directamente com radicais e electrfilos. GSH

tambm pode agir como uma fonte de electres de glutationo peroxidase. O enzima

glutationo peroxidase catalisa a reduo de hidroperxidos, usando GSH como

redutor. interessante notar que ambas as actividades peroxidases da levedura,

glutationo peroxidase, H202 e hidroperxidos orgnicos podem ser induzidas por uma

mudana de anaerobiose para as condies de crescimento aerbio (Galiazzo et al.,

1987).


Objectivos

20

2 OBJECTIVOS

A investigao do efeito do H2O2 feita usando a S. cerevisiae como modelo

biolgico, onde estudamos alteraes na taxa metablica por microcalorimetria.

Os principais objectivos, que constituram o trabalho desenvolvido nesta tese

so os abaixo descritos:

1. O primeiro objectivo criar e desenvolver um mtodo para

o estudo do metabolismo celular e de alteraes do mesmo em S. cerevisiae

resultante da exposio ao H2O2;

2. O segundo objectivo especfico caracterizar a curva de

crescimento no s seguindo a densidade ptica como tambm o calor

produzido pela cultura traduzida no sinal calorimtrico;

3. O terceiro objectivo especfico caracterizar resposta da

S.cerevisiae em fase exponencial adio em bolus de H2O2 numa dose sub-

letal. Para isso, sero obtidos dados metablicos em tempo real,

nomeadamente, gerao de calor;

4. O quarto objectivo ser caracterizar em tempo real a

resposta a adio em bolus de H2O2 numa dose sub-letal em leveduras em fase

exponencial das diferentes estirpes com delees de genes codificantes para

enzimas responsveis pela remoo de H2O2 nomeadamente o catalase

citoslica (Cct1), e as cinco peroxirredoxinas (Tsa1, Tsa2, Ahp1, Prx1, Dot5).

Estudo Calorimtrico do efeito do H2O2 no metabolismo da Saccharomyces cerevisiae Materiais e Mtodos

21

3 MATERIAIS E MTODOS

3.1 Descrio e optimizao dos calormetros utilizados

Neste trabalho utilizaram-se trs calormetros, o microcalorimetro de fluxo

LKB 10700-1, o calormetro TAM (Thermal Activity Monitor) LKB 2277 e o calormetro

isoperibol Thermometric Precision Solution calorimeter existentes no grupo de

Estrutura e Reactividade do centro de Qumica e Bioqumica da Faculdade de Cincias

da Universidade de Lisboa.

3.1.1 Microcalormetro de fluxo LKB 10700-1

O microcalormetro de fluxo LKB 10700-1 (Figura 3.1) utilizado encontra-se

descrito em (Leskiv et al., 2009), sendo uma modificao do calormetro original.

Este aparelho permite determinaes precisas de pequenas variaes de calor

com uma sensibilidade mxima de O,4 watt (0,1 cal / s). Trabalha no intervalo de

temperatura de 20 a 40C Os reagentes so bombeados para uma clula de reaco, e

o fluxo de calor medido. O calormetro tem uma clula do tipo flow-through e

outro tipo mixing-cell. A clula flow-through ideal para estudar culturas celulares

(exemplo processos de crescimento) e reaces enzimticas no qual h um excesso de

substrato. Porm para estudo de reaces mais rpidas mais adequado a clula de

mistura. Neste trabalho utilizou-se a clula flow-through.

O microcalorimetro LKB 10700-1 opera num ambiente de temperatura

constante com a unidade calorimtrica localizado numa camara de ar termostatizada

(Figura 3.1). Esta unidade consiste num dissipador de calor em que duas clulas de

reaco, termopilhas e outros elementos de controlo da temperatura esto alojados.

Durante as experincias, a cultura/soluo bombeada com um fluxo

constante com auxlio de uma bomba peristltica para a unidade calorimtrica (Figura

3.2). O calor libertado na clula calorimtrica provoca uma diferena de temperatura e

um fluxo de calor entre a clula e o dissipador de calor. O dissipador de calor, de

elevada capacidade calorfica, absorve ou liberta este fluxo de calor, enquanto as


22

pilhas termoelctricas, localizadas entre a clula e o dissipador de calor (Figura 3.1),

medem a diferena de temperatura, a qual proporcional ao fluxo de calor e tenso

elctrica gerada.

Na Figura 3.1 est representado no s o sistema do calormetro LKB 10700-1

modificado como tambm a incubadora onde so colocadas as amostras em estudo.

20

11

Figura 3.1 : Ilustrao esquemtica do sistema LKB 10700-1, microcalormetro de fluxo

modificado utilizado neste trabalho. (1) Unidade calorimtrica, (2) clula de mistura, (3)

clula de reaco, (4) cmara de ar termostatizada, (5) termostato do ar, (6) ventilador,

(7) banho pr-termostatizado, (8) serpentina de arrefecimento, (9) termopilhas, (10)

nanovoltmetro utilizado para monitorar a sada das termopilhas, (11) bomba

peristltica multicanal, (12, 13) tubos que ligam o vaso reaccional com a cultura de

clulas clula de mistura, (14) tubo que liga clula de reaco, (15) a resistncia

elctrica utilizado para calibrao, (16) multmetro do circuito de calibragem, (17) fonte

de alimentao do circuito de calibragem, (18) o termstor de preciso utilizado para

medir a temperatura precisa do calormetro, (19) computador para controle das

experincias e aquisio de dados, (20) incubadora termostatizada onde est alojado o

reactor com a cultura de clulas.


23

Figura 3.2: Ilustrao esquemtica do sistema LKB 10700-1, microcalormetro de fluxo

modificado utilizado neste trabalho. (A) clula de reaco utilizada neste trabalho e (B)

clula de mistura, apenas utilizada como referncia; (1) tubo de sada da clula de

mistura (referncia), (2 e 3) os tubos de entrada na clula de mistura e (4 e 5) so

respectivamente os tubos de entrada e sada da clula de reaco.

A temperatura ambiente adequada para a reaco escolhida e definida no

controlador de temperatura mantendo a camara de ar termostatizada a uma

temperatura constante. O controlo da temperatura do termostato feito com uma

serpentina de arrefecimento (Figura 3.1, (8)) com gua a partir de um banho de gua

externa pr-termostatizado.

Previamente ao incio da experincia calorimtrica, o calormetro deve estar

em equilbrio com a temperatura escolhida de modo a que cada parte do dissipador de

calor tenha a mesma temperatura. Este mantido a uma temperatura constante por

um controlador de temperatura e um sensor.

1 4 5 2 3

B A


24

Figura 3.3: Montagem experimental inicial do sistema LKB 10700-1 de fluxo.

Incubadora (A), o calormetro (B), Canais de comunicao que contm os tubos de

ligao entre o reactor (dentro da incubadora) e as clulas calorimtricas (seta) e ainda

o computador (c) onde os dados so recolhidos pelo programa CBCAL

3.1.1.1 Sistema LKB inicial no microcalorimetro de fluxo

As primeiras experincias foram feitas com base na montagem mostrado na

Figura 3.3. A cultura de clulas foi transferida para um balo de erlenmeyer e colocada

dentro da incubadora (A) com temperatura constante e controlada por um controlador

de temperatura (Julabo). Um tubo de teflon mergulhado na cultura leva esta para

dentro da clula de reaco calorimtrica flow-through (A, Figura 3.2) e outro traz de

volta para o balo. Em simultneo outros 2 tubos levam gua/meio de outro balo

erlenmeyer para a clula de mistura, utilizada como referncia enquanto o regresso ao

erlenmeyer da gua/meio ocorre por intermdio de outro tubo. Portanto quer as

clulas da cultura quer a gua utilizada como referncia encontram-se num circuito

fechado entre os bales dentro da incubadora e a unidade calorimtrica do

microcalorimetro de fluxo LKB 10700-1.

A

C

B


25

O sistema de calibrao e de

recolha de sinal do microcalorimetro

de fluxo LKB (Figura 3.4)

importante na aquisio de dados e

na calibrao do aparelho. A

calibrao elctrica permite

relacionar a potncia dissipada e o

sinal calorimtrico obtido pelo

programa CBCAL 1. necessrio

determinar a constante de calibrao

(), que multiplicado pela mudana

da linha de base (Sc) d o calor

libertado por segundo dentro da

clula calorimtrica (equao 3.1).

Figura 3.5: Exemplo de uma resposta calorimtrica tpica de uma experincia em que

no eixo Y est representado o sinal calorimtrico (V) e no eixo X o tempo (s). Linha de

base (A), adio da cultura de clulas ou outro reagente (seta vertical), chegada da

cultura ou reaco exotrmica clula calorimtrica (seta horizontal); o intervalo entre

a seta e a queda do sinal represente o tempo de que demora a cultura de clulas a

chegar clula flow-through.

A

Figura 3.4: Sistema de calibrao e de

recolha de sinal do microcalorimetro de

fluxo LKB. De cima para baixo tem a fonte

de tenso DC (Aligent 6611C), multmetro

(Aligent 34401A) e nanovoltmetro

(Aligent 3442OA).


26

Na Figura 3.5 observa-se a variao da

tenso elctrica gerada pelas termopilhas em

funo do tempo. Esta tenso como j referido

anteriormente proporcional a transferncia

de calor que ocorre na clula calorimtrica.

Quando calor libertado ou absorvido pelo

sistema ocorre variao da linha de base.

Processos exotrmicos levam a mudana da

linha de base para baixo (seta horizontal, Figura

3.5), enquanto que, processos endotrmicos

levam a variao da linha de base para cima.

3.1.1.2 Alterao do sistema inicial no LKB 10700-1

Devido a variaes casuais da linha base o sistema tal como descrito

anteriormente para as primeiras experincias, foi alvo de alteraes no sentido de

minimizar o rudo da linha base.

O sistema inicial sofreu alteraes no reactor utilizado e no controlo da

temperatura deste. Para tentar diminuir o rudo, desenhou-se um reactor diferente do

balo de erlenmeyer utilizado (Figura 3.6). No sistema anterior a cultura era colocada

num balo de erlenmeyer (Figura 3.6) que ficava dentro da incubadora termostatizada

pelo controlador de temperatura (Julabo). Desenhou-se e construi-se um novo reactor

para utilizar em vez do balo. O novo reactor (Figura 3.7) foi desenhado para estar

dentro de um copo de vidro de paredes duplas onde circula gua termostatizada de

um banho externo. Este banho externo permite que a cultura ou a soluo que estiver

dentro do novo reactor tenha uma maior inrcia trmica. Estas alteraes esto

representadas nas Figura 3.8 e 3.9.

Figura 3.6: Balo de erlenmeyer utlizado

nas experincias.


27

O novo reactor tem um

esmerilado que lhe permite encaixar

numa tampa de teflon (seta, Figura

3.8) e ficar a 1 cm do fundo do copo

de paredes dublas. Tambm

apresenta duas entradas, a maior

onde entra e saiem os tubos que

conduzem a cultura clula

calorimtrica e a mais pequena

utilizada para introduzir o tubo

oriundo da bureta automtica que faz

as adies de H2O2 a cultura em

estudo.

Este sistema revelou ter menos rudo e ser menos sensvel a variaes do

ambiente laboratorial, sendo adequado para o estudo calorimtrico das culturas de

clulas.

Figura 3.8: Interior da incubadora com o novo reactor (A) dentro do copo de vidro de

paredes duplas (B) com passagem de gua termostatizada por um banho externo;

suporte do reactor (seta).

A

B

Figura 3.7: Novo reactor construdo com um

agitador magntico.


28

Figura 3.9: Exterior da incubadora (A) utilizada na realizao das experincias no

microcalorimetro de fluxo LKB 10700-1 com temperatura controlada por um

controlador de ar e por um banho (B).

3.1.2 Microcalormetro Thermal analysis monitor LKB 2277 (TAM)

Este calormetro inicialmente chamado LKB BioActivity Monitor (Figura 3.10)

foi desenhado como indica o nome para monitorizar actividade de sistemas biolgicos.

O aparelho evidentemente adequado para monitorizar de forma directa e continua

variaes de calor numa ampla gama de processos, biolgicos, qumicos e fsicos.

Trabalha no intervalo de temperatura de 20 a 80C e tem a vantagem de ser

multicanal.

A produo ou absoro de calor dentro de um recipiente termicamente

fechado leva a uma alterao de temperatura. O microcalorimetro TAM

semelhana do microcalorimetro de fluxo um instrumento isotrmico onde os

B

A


29

processos so estudados a temperatura constante. Isto torna possvel, que a clula de

medio (com a amostra activa) troca calor livremente com os seus arredores, que

funcionam como um grande dissipador de calor. Este calor detectado e medido por

termopilhas. O instrumento mede semelhana do microcalorimetro de fluxo LKB

10700-1, descrito anteriormente, a potncia trmica (Joules por segundo ou watts) em

vez de calor total (Joules).

A potncia trmica na reaco de interesse muitas vezes extremamente

pequena, e por este motivo o TAM incorpora um sistema de deteco trmica muti-

canal capaz de detectar um fluxo de calor contnuo to baixo como 0,1 W, ou pulsos

de calor de 10 J. Este calormetro tem o sistema de controlo de temperatura externo,

assistido por uma circulao externa de gua termicamente bem controlada. O banho

externo funciona como o principal dissipador de calor.

At quatro cilindros de medio so suspensos num banho de gua, cada um

dos cilindros contendo uma clula de medida e uma de referncia. Cada par de clulas

partilha um dissipador de calor metlico comum, e incorpora elementos de peltier

para detectar e medir o fluxo de calor.

As clulas de medio operam sempre em pares, uma clula de medio

(contendo a amostra) e outra de referncia. Qualquer diferena do poder trmico

entre a clula de referncia e a da amostra resulta numa pequena diferena de sinal

que amplificada no amplificador associado ao canal.


30

Figura 3.10: (A) Calormetro LKB 2277 TAM, Thermal Activity Monitor e uma clula de

plstico (B); Os quatro canais deste calormetro encontram-se identificados nas quatro

rodas laranjas (setas); V-se tambm o nanovoltmetro que faz a recolha de dados. A

clula de plstico (B) utilizado para colocar a amostra a ser monitorada

calorimetricamente. O tubo enrolado sobre o eixo que contm a clula de plstico

utilizado para fazer adies de H2O2 cultura.

A B

a


31

Figura 3.11: Esquema do interior do microcalorimetro TAM. (1) Suporte da clula

calorimtrica, (2) clula calorimtrica na posio de pr-equilbrio, (3) copo de medida

onde entra a clula, (4) Elemento de Peltier, termopilha e (5) metal dissipador de calor.

1

2

3 4

5


32

3.1.3 Microcalorimetria de soluo reaco

A calorimetria de soluo-reaco foi utilizada para perceber se h reaco do

H2O2 com o meio de cultura, que no fosse detectado no microcalorimetro de fluxo

LKB. Estes estudos foram realizados no calormetro Isoperibol Thermometric Precision

solution calorimeter (Figura 3.12). O equipamento regularmente aferido medindo as

entalpias de dissoluo do tris(hidroximetil)aminometano (THAM), em hidrxido de

sdio 0,05 mol.dm-3 e HCl 0,1 mol.dm-3 respectivamente ((Nunes et al., 2006) e

(Marsh, 1987)). No foi pois necessrio test-los antes dos ensaios realizados no

mbito da tese.

A clula calorimtrica composta por um copo de vidro Pirex, 1 na Figura

3.12, com um volume til de 100 cm3, que suporta um termistor de 30 k (a 298.15 K),

2, para a medio da temperatura e uma resistncia de 50 , 3, para a calibrao

elctrica. O agitador 4, funciona a 400 rpm, compreende tambm o suporte para a

ampola, 5, com 1 cm3 de volume que por sua vez contm a amostra (H2O2). Na base da

clula encontra-se o quebra ampolas 6. A clula calorimtrica est inserida num

termostato Thermal Activity Monitor, 7, que possui uma estabilidade de 10-4 K.

Numa experiencia tpica, determinado volume de soluo de H2O2 com a

concentrao conhecida foi colocada numa ampola previamente pesada. A ampola

com a soluo j fechada foi rigorosamente pesada com uma preciso de 10-5 g numa

balana Mettler Toledo XS205. O conjunto foi ajustado clula calorimtrica e esta

introduzida no termostato. Aps um perodo de estabilizao iniciou-se a curva

temperatura-tempo. O processo de dissoluo ocorreu aps a quebra da ampola em

100 cm3 de meio. As calibraes elctricas foram realizadas aplicando uma diferena

de potencial de 5 v resistncia, 3, durante pequeno intervalo de tempo, antes e aps

a quebra da ampola.


33

Figura 3.12: Calormetro de soluo reaco Isoperibol Thermometric Precision solution

calorimeter. O copo de vidro Pirex (1), termstor (2), resistncia (3), agitador/suporte

(4), ampola (5), quebra ampolas (6), termostato Termal Activity Monitor (7).

3.2 Equipamentos de apoio

Ao longo do trabalho utilizaram-se o espectrofotmetro UV Visvel (Thermo

Scientific, Genesys 10S UV-Vis), o microscpio ptico (ZEISS,west) a Incubadora e

agitador orbital (HT CH-4103 Bottmingen), duas estufas (Jouan e Memmert), o

autoclave (Uniclave 88), centrfuga (Sigma-302), balanas analticas (Metller AE100 e

Mettler Toledo XS205), duas buretas automticas (CRISON 1S e CRISON 4S), um

nanovoltmetro (Aligent 3442OA), um nanovoltmetro (HP Hewlett Packard 344a0)

multmetro (Aligent 34401A), fonte de tenso (Aligent 6611C), controladores de

temperatura (Julabo), controlador de temperatura (MAAk), duas bombas peristlticas

(ISMATEC e LSTTATEC), arca (SANYO).

3.3 Reagentes

3.3.1 Reagentes qumicos

gua milipore (do sistema Milli-Q Gradient), a bacto-peptona, o yeast

nitrogen base (YNB), e o extracto de levedura provieram da Difco (Detroit, MI, EUA). A


34

glucose e o perxido de hidrognio foram obtidos da Merck (Whitehouse Station, NJ).

Os aminocidos do meio de crescimento (arginina, metionina, tirosina, isoleucina,

lisina, fenilalanina, valina, acido asprtico, cido glutmico, triptofano, histidina,

leucina, adenina, uracilo, treonina e serina) (SIGMA). O p-hidroxibenzoato de metilo

(SIGMA-ALDRICH), o hidrxido de sdio (Jos M.Vaz Pereira).

Perxido de hidrognio

Preparou-se a soluo do perxido de hidrognio a partir de uma soluo

stock de H2O2 concentrada (9M) guardada no frigorfico. Diluu-se esta soluo me

em gua destilada de modo a ter uma soluo de 9 mM aproximadamente. Sabendo

que a 240 nm a absortividade molar do H2O2 43,4 M-1cm-1, o valor exacto da

concentrao foi determinado pela medio da absorvncia aos 240 nm.

3.3.2 Preparao do meio liquido de cultura sinttico completo

O meio de cultura utilizado foi o meio lquido de cultura sinttico completo

(sc) por no levar a formao de H2O2, ao invs do meio liquido completo YPD. O meio

lquido sc tem a seguinte composio: Glucose 2% (m/v), YNB 6,85% (m/v), arginina

0,002% (m/v), metionina 0,002% (m/v), tirosina 0,003% (m/v), isoleucina 0,003%

(m/v), lisina 0,003% (m/v), fenilalanina 0,005% (m/v), valina 0,015% (m/v), acdo

asprtico 0,01% (m/v), cido glutmico 0,01% (m/v), triptofano 0,005% (m/v), histidina

0,01% (m/v), leucina 0,01% (m/v), adenina 0,0025% (m/v), uracilo 0,0025% (m/v),

treonina 0,02% (m/v) e serina 0,04% (m/v).

3.3.3 Preparao do meio slido de cultura

O meio slido tem a seguinte composio: peptona 2% (m/v), extrato de

levedura1% (m/v), agar 2%, e glucose 2% (m/v). No meio slido de glicerol a glucose

substituda pelo glicerol.

3.3.4 Material Biolgico

A estirpe selvagem (wild type, wt) de Saccharomyces cerevisiae utilizada ao

longo do trabalho experimental foi a BY4741 (MATa; his3D1; leu2D0; met15D0;

ura3D0), e foi adquirida na European Saccharomyces cerevisiae Archive For Functional

Analysis (EUROSCARF, Germany). As estirpes mutantes usadas no trabalho


35

experimental so isognicas da estirpe wt encontrando-se descritas no quadro 3.1,

tendo sido adquirida a estirpe ctt1 na EUROSCARF e a estirpe 5 foi gentilmente

oferecida pelo Professor Dong-Yan Jin da universidade de Hong Kong, China.

Quadro 3.1: Estirpes de Saccharomyces cerevisiae usadas no trabalho.

Designao Estirpe Gentipo

Wt Y000000 BY4741; MAta; his31; leu20; met150;

ura30

Ctt1 Y04718 BY4741; MAta; his31; leu20; met150;

ura30; YKRO66C::KanMx4

5 Y01402 BY4741; MAta; his31; leu20; met150

;ura30; tsa1::KanMX4; tsa2::LEU2;

prx1::URA3; ahp1::HIS3; dot 5::MET15

3.4 Determinao da constante de calibrao do microcalormetro de

fluxo LKB 10700-1, e do volume efectivo da clula calorimtrica e

tempo de residncia com hidrlise do 4-hydroxibenzoato de

metilo.

Para determinar o volume efectivo da clula calorimtrica, o tempo de

residncia e a constante de calibrao do calormetro, acompanhou-se

calorimetricamente a reaco de hidrlise do 4-hidroxibenzoato de metilo conforme

descrito em (M. A. A. O Neill, 2003). Inicialmente, foi obtida uma linha de base fazendo

passar pelo calormetro uma soluo de NaOH a 0,50 mol.dm-3. Quando se atingiu uma

linha de base relativamente estvel, fez-se uma calibrao elctrica (o potencial

elctrico imposto previamente seleccionado atravs do programa CBCAL 1.0).

Terminada a calibrao elctrica o sinal regressa linha de base. Assim aps a

estabilizao deste pde-se iniciar a reaco de hidrlise adicionando o 4-


36

hidroxibenzoato de metilo em p ao NaOH numa concentrao final de 4,9910-5

mol.cm3. Aps o trmino da reaco realiza-se uma nova calibrao elctrica.

3.5 Preparao da cultura de Saccharomyces cerevisiae

Para obteno da cultura de clulas da levedura o seguinte procedimento foi

realizado. A partir de clulas armazenadas numa arca com temperatura de - 80C fez-

se um riscado numa placa de Petri em meio slido de glicerol. A partir deste riscado

preparou-se a pr-cultura da seguinte forma: suspendeu-se uma amostra do riscado

em 10 mL de meio sc, esta suspenso denominada de pr-cultura foi incubada a 30C

num agitador orbital HT modelo CH-4103 Bottmingen a uma velocida

valdir avelino rocha semedo -...

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