Gabarito

4.Ahidrólisedepirofosfatoaortofosfatoéumareaçãoacopladaimportanteparadeslocaroequilíbriodereaçõesbiossintéticas,porexemploasíntesedeDNA.Estareaçãodehidróliseécatalisadaporumapirofosfatasequepossuimassade120kDaeconsistedeseissubunidadesidênticas.Paraestaenzima,aunidadedeatividadeenzimáticaédefinidacomoaquantidadedeenzimanecessáriaparahidrolisar10µmoldepirofosfatoem15minutosa37°C.AenzimapurificadapossuiVmax=2800unidadespormiligramadeenzima.

a) QuantosmolsdesubstratosãohidrolisadosporsegundopormiligramadeenzimaquandoaconcentraçãodosubstratoformuitomaiordoqueoKm?

SendoaconcentraçãodesubstratomuitomaiorquedoqueoKm,temosque:v0→Vmax,ecomojásabemosqueVmax=2800U.mg-1,pararespondermosaquestãoprecisamosconverteraunidadeemqueVmaxfoiexpressaparamols.s-1,logopodemosafirmar:

Vmax=2800 𝑈.𝑚𝑔-1=!"##×(!"!! !"#)

!"×!" !×!"= 31.11 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑠×𝑚𝑔=

b) Quantosmols de sítios ativos existemem1mg de enzima?Assumaque cada subunidadepossuiumsítioativo.

Sabendo-sequeamassadaenzimaéde120kDa,eassumindo-sequecadasubunidadedaenzimapossui um sítio catalítico ativo, basta calcularmos quantos moles de enzimas existem em 1mg, edepois multiplicarmos pelo número de subunidades, vejamos. Primeiramente convertermos 120KDa,para12000g/mol,ecalculamos:

𝑛° 𝑑𝑒 𝑠í𝑡𝑖𝑜 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙í𝑡𝑖𝑐𝑜𝑠 = 𝑛°𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑥 𝑛° 𝑑𝑒 𝑠𝑢𝑏𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠

= 1𝑚𝑔

120000𝑔/𝑚𝑜𝑙 𝑥 6 = 𝟓𝟎𝜼𝑴𝒐𝒍/𝒎𝒈

c) Qualéoturnoverdaenzima?

kcatou turnover,éonúmerodemoléculasdosubstrato transformadoporumaúnicamoléculadeenzimaouúnico sítioem funçãodo tempo.Nosexercíciosacimacalculamosavelocidademáximapormiligramadeenzimaem(a)ecalculamosonúmerodesítiosativosemummiligramadeenzima.Dessaforma,okcatéarazãoentreestesdoisnúmeros:

𝑉!"# = 𝑘!"# [E]t

𝒌𝒄𝒂𝒕 =𝑽𝒎𝒂𝒙𝑬 𝒕

(equação1)

Substituindo-seosvaloresdeVmax(ítema)e[E]t(ítemb),temos:

𝑘!"# =𝑉!"#[𝐸]!

=31.11 𝜇𝑚𝑜𝑙𝑠×𝑚𝑔0.05 𝜇𝑚𝑜𝑙

= 622.2𝑠!!𝑚𝑔!!

5. Suponhaqueumaenzimamutantese liguecomosubstratocomumaafinidade100xmaiordoqueaenzimaselvagem.Qualéoefeitodestamutaçãosobreoturnover(kcat)considerando-sequeainteraçãocomoestadodetransiçãonãofoiafetada?Umaabordagemparacompreenderoaumentodavelocidadedereaçãoobtidopelasenzimasconsisteemsuporqueoestadodetransição(X‡)eosubstrato(S)estejamemequilíbrio,

k‡S↔X‡→P

emqueK‡ é a constante de equilíbrio para a formaçãode X‡, ev é a velocidadede formaçãodoprodutoapartirdoestadodetransição(X‡).AvelocidadedareaçãovéproporcionalàconcentraçãodeX‡;sendoqueavelocidadeglobaldareaçãoVdependedeΔG‡daseguinteforma:

𝑉 = v 𝑋‡𝑘𝑇ℎ [𝑆]𝑒!∆!‡/!"

Nesteexercíciotratamosdahipótesedeintroduzirumamutaçãoqueaumenteem100xaafinidadeda enzima pelo substrato, consequentemente o complexo Enzima*-Substrato (E*S) terá menorenergiadoqueocomplexoESselvageme,finalmente,aenergiadeativaçãodareaçãoserámaior.Portanto,qualquermutaçãoqueestabilizeocomplexoEStornaráacinéticadecatálisemaislenta.

Caminhodereaçãodaenzimaselvagem(wt)emcomparaçãocomaenzimamutante(E*).AbarreiradaenergiadeativaçãoéexpressaporΔG‡

6.ParaumaenzimaquesegueaequaçãodeMichaelis-Menten,qualéovalordeVmaxconsiderando-sequev0=1µM/mina1/10KM?CombasenaequaçãodeMichaelis-Mentenpodemosfazer:

𝑣! = 𝑉!"# !

!"!!!!!

!!"!!

(equação1)

Resolvendo-seestaequaçãoparaVmax,chegamosa:

𝑉!"# = 11×𝑣! = 11×1𝜇𝑚𝑜𝑙𝑚𝑖𝑛

= 11𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑚𝑖𝑛

7.Apenicilinaéhidrolisadaporumaenzimabeta-lactamasequeestápresenteemalgumascepasdebactérias resistentes a antibióticos. A massa desta enzima é 29.6 kDa. A quantidade de enzima

hidrolisada em 1 minuto em uma solução de 10 ml contendo 10-9 gramas de beta-lactamasepurificada foi medida em função da concentração de penicilina (tabela abaixo). Assuma que aconcentraçãodepenicilinanãosealteraapreciavelmenteduranteoensaio.

a) Faça um gráfico de V0 em função de [S] e de 1/V0 em função de 1/[S]. Responda: a beta-lactamasepareceseguiracinéticadeMichaelis-Menten?Nestecaso,qualéovalordoKM?

Inicialmente,vamoscalcularasvelocidadesiniciaisemcadaconcentraçãodesubstrato:

[S] [P] v=[P]/60segundos1 0.11 0.00183 0.25 0.00425 0.34 0.005710 0.45 0.007530 0.58 0.009750 0.61 0.0102

EagorapodemosfazerumgráficoparaverificarqueaenzimasegueacinéticadeMichaelis-Menten:

ParacalcularmosovalordeKMeVmaxémelhorlinearizarestegráficoconvertendo-oemumgráficodeLineweaver-Burkeobteraequaçãodaretaporumasimplesregressãolinear:

[S](M) v(mol/s) 1/[S] 1/v(s/mol)1.0e-06 1.83e-12 1000000 545454545454.5453.0e-06 4.17e-12 333333.333333333 240000000000.0005.0e-06 5.67e-12 200000.000000000 176470588235.2941.0e-05 7.50e-12 100000.000000000 133333333333.3333.0e-05 9.67e-12 33333.3333333333 103448275862.0695.0e-05 1.017e-11 20000 98360655737.7049

0

0.002

0.004

0.006

0.008

0.01

0.012

0 10 20 30 40 50 60

v(nM/s)

[S](µM)

MichaelisMenten

Ográficodeduplo-recíprocoresultanteestámostradoabaixo:

UmasimplesregressãolinearnosforneceaequaçãodaretaapartirdaqualpodemosobteroVmaxeoKMcomfacilidade:

1𝑣= 4,6×10!.

1[𝑠]

+ 8.8×10!"

𝒚 = 𝟒,𝟔×𝟏𝟎𝟓. 𝒙 + 𝟖.𝟖×𝟏𝟎𝟏𝟎

OKMédadopelainterceçãonoeixodasabiscissas:

0 = 4,6×10!. 𝑥 + 8.8×10!"

𝒙 = − 𝟏,𝟗𝟔𝟕×𝟏𝟎𝟓 (𝐄𝐪𝐮𝐚çã𝐨 𝟐)

PelográficodeLineweaver-Burktemosaseguinterelaçãoparaumenzima:

Quando𝑦 = 0; 𝒙 = − 𝟏𝑲𝒎

(𝐄𝐪𝐮𝐚çã𝐨 𝟑)

Logo,

− 1,967. 10! = −1𝐾!

𝑲𝒎 = 𝟓,𝟎𝟖 .𝟏𝟎!𝟔𝑴

PelográficodeLineweaver-BurktambémpodemosobterovalordeVmaxapartirdainterceçãonoeixodasordenadas:

𝑥 = 0; 𝑦 =1

𝑉!"# (Equação 4)

y=457351x+9E+10R²=0.99993

0.00E+00

1.00E+11

2.00E+11

3.00E+11

4.00E+11

5.00E+11

6.00E+11

0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 1.20E+06

1/v(m

ol-1s)

1/[S](M-1)

DuploRecíproco

Logo:

𝑦 =1

𝑉!"# → 9. 10!" =

1𝑉!"#

→ 𝑽𝒎𝒂𝒙 = 𝟏,𝟏𝟑 .𝟏𝟎!𝟏𝟏𝒎𝒐𝒍. 𝒔!𝟏

b) Qualéoturnoverdaenzimanestascondiçõesexperimentais?Assumaapresençadeumsítioativopormoléculadeenzima.

Comojáfoivistonoitemcdoexercício4,temosque𝑉!"# = 𝑘!"# [E]te𝒌𝒄𝒂𝒕 =𝑽𝒎𝒂𝒙𝑬 𝒕

Logodeterminadoonúmerodemolsdeenzimadisponíveispodemosdeterminaroturnover:

𝑚𝑜𝑙𝑠 𝑑𝑒 𝐸 = !"!! !!",! !"#

= 3,3784×10!!"𝑚𝑜𝑙𝑠𝑘!"# =!,!"!!"!!!!"#.!!!

!,!"#$.!"!!"!"#= 334.5 𝒔!𝟏