UTILIZAÇÃO DE POLPA DENTÁRIA COMO UTILIZAÇÃO DE POLPA DENTÁRIA COMO AMOSTRAAMOSTRA--REFERÊNCIA PARA ANÁLISE DE REFERÊNCIA PARA ANÁLISE DE

PERFIS GENÉTICOS DE DNAPERFIS GENÉTICOS DE DNA

Use of dental pulp as reference sampling for analysis of Use of dental pulp as reference sampling for analysis of

genetic profiles of DNAgenetic profiles of DNA

Talita Lima de Castro

Universidade Estadual de CampinasFaculdade de Odontologia de Piracicaba

Piracicaba2009

Introdução

• As técnicas da biologia e genética molecular têm mostrado um marcável desenvolvimento científico

• A identificação pelo DNA tem provado seu valor, principalmente quando o uso dos métodos de identificação tradicionais como as impressões digitais e as radiografias dentárias são ineficazes

• Os testes de DNA podem ser realizados com qualquer tecido ou líquido orgânicoSangue, saliva, sêmen, urina, fluidos, pêlos, músculo, ossos, células descamativas, pele e tecidos de todos os órgãos

Remualdo et al., 2005

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• Porém, quando fatores exógenos destrutivos estão presentes, tais como alta temperatura e pressão, o emprego dos tecidos fica limitado

Explosão do depósito de combustíveis de Buncefield, 2005

http://zonaderisco.blogspot.com

Boljun�i� J, 2007; Primorac et al., 2000; De

Leo et al., 2000; Remualdo, 2004.

• Nessas situações, porém, a polpa dentária goza de proteção única

• Está envolta por dentina, cemento e esmalte, e protegida por tecido ósseo, muscular, conjuntivo e epitelial

Silva et al., 2007

Remualdo et al., 2005

• Representa excelente fonte de DNA genômico

SCHWARTZ, T.R. et al. Characterization of deoxyribonucleic acid (DNA) obteined from teeth subjected to various environmental conditions. J Forensic Sci, v.36, n.4, p.979-90, 1991.

• Schwartz et al. (1991) avaliaram fatores como:PH (3.7 e 10.0),Temperatura (4°C, 25°C, 37°C e incineração)Umidade (20, 66 e 98%)Tipo de solo em que foi enterrado (areia, barro, grama, submersão em água, ao ar livre)Períodos de inumação (uma semana a seis meses)

• Concluíram que as condições ambientais examinadas não afetam a habilidade de obter DNA humano da polpa dentária

HANAOKA, Y. et al. Fundamental and pratical study for DNA analysisusing tooth as a source of DNA. Nihon Hoigaku Zasshi, v. 49, n.1, p.1-10, 1995

• Hanaoka et al. (1995) avaliaram a extração de DNA a partir dos tecidos mineralizados do dente e da polpa de 50 dentes estocados em temperatura ambiente por no mínimo 336 dias

• Não houve correlação entre o período de armazenamento e a quantidade de DNA amplificado

• Os resultados obtidos a partir do sangue e da polpa dentária foram melhores que os dos tecidos duros dentais, pela análise de DNA genômico (VNTR)

• Conclusão: Foi possível encontrar DNA nas amostras

SMITH, B. C. et al. A systematic approach to the sampling of dental DNA. J Forensic Sci. v.38, n.5, p.194-209, 1993.

• Smith et al. (1993) estocaram 20 terceiros molares (10 direitos e 10 esquerdos) em umidade e temperaturaambiente por 18 semanas

• Os molares direitos foram triturados, enquanto que os da esquerda foram seccionados a fim de fornecerem amostra para a análise gênica

• Concluíram que quando o dente é triturado, os resultados são maximizados

• Porém, a secção conservadora do dente provê amostras suficientes para a análise gênica, com a vantagem de preservar a estrutura dentária, possibilitando seu uso para outras finalidades posteriores (estudos radiográficos, comparativos e bioquímicos)

Justificativa• Atualmente não há uma uniformização dos

protocolos a serem empregados na extração do DNA a partir da polpa dentária

• Não se tem claro se a utilização desse tecido como fonte de material genético produz resultados satisfatórios para o propósito da identificação humana

Objetivos

Objetivo principal: Avaliar a viabilidade da utilização de amostras biológicas provenientes da polpa dentária para obtenção de perfis genéticos de DNA de corpos não-identificados.Objetivos secundários: - Analisar a capacidade da polpa de prover amostras com número de alelos suficientes para permitir uma identificação segura;- Comparar os resultados desse trabalho com resultados provenientes de extração de DNA em ossos constantes dos processos de análise realizados pelo Laboratório de DNA Criminal da PC-ES nos anos de 2006 a 2008.

Material e MétodoMaterial e Método

Local da pesquisa

• Departamento Médico-Legal• Laboratório de DNA Criminal da Polícia Civil do

Espírito Santo

Características gerais da população a estudar

• 50 corpos que derem entrada no DML - Vitória no período estipulado

• Sexo feminino e masculino• Após exame antropológico, serão incluídos

apenas os cadáveres cuja idade seja acima de 18 anos

Critérios de Inclusão

• Cadáveres em avançado estado de decomposição

• Cadáveres carbonizados• Ossadas• Que, após a realização dos procedimentos

normais (identificação datiloscópica e identificação antropológica) permanecerem na condição de corpos não-identificados.

Critérios de Exclusão

• Idade abaixo de 18 anos aproximadamente, (calculada pelo médico legista através de exame antropológico)

• Cadáveres já identificados

Coleta e acondicionamento do material

• Radiografia• Extração de um dente de cada cadáver• Armazenamento em recipientes plásticos

estéreis, na câmara fria, a -4ºC.• Identificação com número da amostra, RG/IML

do cadáver e data

Coleta do material• Retirar da superfície externa do dente, com

cureta, placa bacteriana ou cálculo• Lavar cuidadosamente com água deionizada

Coleta do material• Cortar o dente horizontalmente, perpendicular

ao seu eixo, ao nível da porção cervical• Disco de corte em baixa rotação

Coleta do material• Curetar as paredes da câmara, recolhendo o

tecido da polpa ali aderido

• O material será acondicionado in natura em eppendorf

• Identificação, catalogação e armazenamento das amostras

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Fase I: Extração• A extração seguirá o protocolo de Budowle et al.

(1995) modificado, utilizado rotineiramente pelo Laboratório de DNA Criminal da Polícia Civil do ES.

Fase I: Extração• Os STR loci a serem estudados são os comumente

utilizados pelo CODIS (combined DNA index system) do FBI, entre eles o TPOX, D3S1358, D5S818, FGA, CSF1PO, D7S820, D8S1179, THO1, VWA, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, e a amelogenina.

Fase II: Amplificação pela PCR• Fase onde o DNA é amplificado através da

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

2n° de ciclos

• Seqüenciador de DNA do Laboratório de DNA Criminal do Espírito Santo

• O software a ser utilizado para monitorar o processo de eletroforese será o Foundation Data Colection, e para a interpretação dos dados, utilizaremos o Gene Mapper.

Fase III: Eletroforese capilar

• Análise dos perfis genéticos e validação dos resultados

• Material biológico remanescente: será descartado segundo as normas de biossegurança adotadas no Laboratório de DNA Criminal. Não haverá formação de bancos de tecidos ou dados

Resultados EsperadosO presente trabalho busca:

• Demonstrar a importância da polpa dentária na identificação humana, e sua capacidade de prover número de alelos suficientes para permitir uma identificação segura.

• Apontar vantagens do uso da polpa dentária como amostra-referência em relação ao osso, ao analisar a viabilidade, a praticidade e eficácia, bem como a maior rapidez nos resultados e menores custos.

• Ampliar o campo de atuação dos odontolegistas dentro dos Laboratórios de DNA e dos Institutos Médico-Legais, visto que as atividades apresentadas exigem a capacidade técnica dos cirurgiões-dentistas.

Cronograma de Execução da Pesquisa

• Meses 1 e 2: Realização dos testes-piloto• Meses 3, 4, 5, 6, 7: Coleta, acondicionamento e

processamento das amostras• Meses 8 e 9: Análise e tabulação dos resultados• Meses 10 e 11: Conclusão do projeto e redação final• Mês 12: Apresentação

• * A execução do projeto somente terá início após a aprovação pelo CEP

• Alvarez García A, Muñoz I, Pestoni C, Lareu MV, Rodríguez-CalvoMS, Carracedo A. Effect of environmental factors on PCR-DNA analysis from dental pulp. Int J Legal Med. 1996; 109(3): 125-9.

• Alimena LJM, Jesus-Garcia Filho R, Toledo SRC, Alves MTS, Petrilli AS, De Luca Junior G, et al. Protocolo de um banco de tecidos neoplásicos. Rev Bras Ortop. 2008; 43(3): 53-8.

• Andelinovic Š, Sutlovic D, Ivkošic IE, Škaro V, Ivkošic A, Paic F, Rezic B, Definis-Gojanoviæ M, Primorac D. Twelve-year Experience in Identification of Skeletal Remains from Mass Graves. Croat Med J. 2005; 46(4): 530-539.

• Boljun�i� J. DNA Analysis of Early Mediaeval Individuals from Zvonimirovo Burial Site in Northern Croatia: Investigation of Kinship Relationships by Using Multiplex System Amplification for Short Tandem Repeat Loci. Croat Med J. 2007; 48: 536-46.

Referências Bibliográficas

• Budowle B, Baechtel FS, Comey CT, Giusti AM, Klevan L. Simple protocols for typing forensic biological evidence: chemiluminescentdetection for human DNA quantitation and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses and manual typing of polymerase chain reaction (PCR) amplified polymorphisms. Electrophoresis 1995; 16(9): 1559-67.

• De Leo D, Turrina S, Marigo M. Effects of individual dental factors on genomic DNA analysis. Am J Forensic Med Pathol 2000; 21(4): 411-415.

• Drancourt M, Aboudharam G, Signoli M, Dutour O, Raoult D. Detection of 400 year old Yersinia pestis DNA in human dental pulp: An approach to the diagnosis of ancient septicemia. Proc Natl AcadSci. 1998; 95: 12637-40.

• Pötsch L, Meyer U, Rothschild S, Schneider PM, Rittner C. Application of DNA techniques for identification using human dental pulp as a source of DNA. Int J Legal Med. 1992; 105: 139-43.

Referências Bibliográficas

• Primorac D, Anðelinoviæ Š. Identification of human remains from mass graves found in Croatia and Bosnia and Herzegovina. In: ZabitC, editor. Proceedings of the 10th International Symposium on Human Identification; 1999 Sep 29–Oct 2; Lake Buena Vista, FL, USA. Madison, WI: Promega Corporation. In press 2000.

• Primorac D, Schanfieldi MS, Primorac D. Application of Forensic DNA Testing in the Legal System. Croatian Med J. 2000; 41: 32-46.

• Remualdo VR. Avaliação de três métodos de extração de DNA de dentes humanos submetidos ao calor [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo; 2004.

• Remualdo VR, Nunes FD, Hirata MH, Melani RFH, Oliveira RN. Análise do STR-F13A01 e MPSs do mtDNA para fins de identificação humana: comparação de três métodos de extração de DNA de dentes submetidos ao calor. RPG Rev Pós Grad. 2005; 12(4): 437-43.

• Remualdo VR, Oliveira RN. Analysis of Mitochondrial DNA From the Teeth of a Cadaver Maintained in Formaldehyde. Am J Forensic Med Pathol. 2007; 28: 145–146.

Referências Bibliográficas

• Schwartz TR, Schwartz EA, Mieszerski L, McNally L, Kobilinsky L. Characterization of deoxyribonucleic acid (DNA) obtained from teeth subjected to various environmental conditions. J Forensic Sci. 1991; 36: 979-90.

• SENASP. Padronização de Exames de DNA em Perícias Criminais. 2008.

• Silva RHA, Oliveira RN. Forensic anthropology and molecular biology: independent or complementary sciences in forensic dentistry? An overview. Braz J Oral Sci. 2008; 7(25): 1575-1579.

• Smith BC, Fisher DL, Weedn VW, Warnock GR, Holland MM. A systematic approach to the sampling of dental DNA. J Forensic Sci. 1993; 38(5): 1194-209.

• Sweet DJ, Sweet CH. DNA analysis of Dental Pulp to link Incinerated Remains of Homicide Victim to Crime Scene. J ForensicSci. 1995; 40(2): 310-4.

• Vanrell JP. Odontologia legal e antropologia forense. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2002.

Referências Bibliográficas

Obrigada pela Atenção!

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