PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS FORENSES

UTILIZAÇÃO DA EPIGENÉTICA NA CIÊNCIA FORENSE

Getúlio Pereira de Oliveira Júnior1

Túlio Cesar de Lima Lins2

1 Biólogo. Aluno da Pós-Graduação em Biociências Forenses pela Pontifícia

Universidade Católica de Goiás/IFAR.

2 Orientador. Bacharel em Química pela Universidade de Brasília, mestre em Ciências

Genômicas e Biotecnologia pela Universidade Católica de Brasília. E-mail:

lins.tulio@gmail.com

Resumo

Este trabalho é uma revisão sobre a possibilidade da utilização de técnicas

espigenéticas complementares as técnicas normalmente utilizadas na genética forense. Serão

abordados o sequenciamente bissulfito na determinação do padrão de metilação do DNA entre

indivíduos, assim como a imunoprecipitação da cromatina para analisar as modificações na

cromatina entre indivíduos. Essas técnicas são importantes na genética forense, pois podem

ajudar na diferenciação entre gêmeos monozigóticos e na determinação da idade celular por

meio de tecidos biológicos. Dentro de alguns anos será rotina nos laboratórios de genética

forense a análise de marcadores epigenéticos complementares aos marcadores genéticos

utilizados normalmente.

Palavras-chave: Epigenética, metilação do DNA, cromatina, gêmeos monozigóticos.

The use of Epigenetics in Forensic Science

Abstract

This paper is a review about the possibility of using complementary epigenetics

techniques commonly used in forensic genetics. Will be discussed the bisulfite sequencing to

determining the DNA methylation pattern of individuals as well as the immunoprecipitation

of chromatin to analyze the changes in chromatin between individuals. These techniques are

important in forensic genetics, and can help to distinguish between monozygotic twins and the

determination of cellular age using biological tissues. Within a few years will be routine in

forensic genetics laboratories analyzing epigenetic markers complementary to the commonly

used genetic markers.

Key words: Epigenetics, DNA methylation, chromatin, monozygotic twins

1 INTRODUÇÃO

A existência de regiões variáveis no DNA humano foi reconhecida por um longo

período de tempo como fonte de variação entre indivíduos, porém apenas no final de 1970

que o uso de polimorfismos para mapeamento em larga escala de genes humanos foi proposto.

Arlene Wyman e Ray White utilizaram loci de DNA polimórficos caracterizados por

fragmentos de restrição de tamanho variáveis ou RFLP, em seguida, David Botstein mostrou

que os RFLPs poderiam ser utilizados pra indicar diferenças genéticas entre indivíduos.

Contudo, foi o geneticista norte-americano Alec Jeffreys que primeiro descreveu a técnica

conhecida hoje como “DNA firgerprinting”, que consiste de um conjunto de marcadores

genéticos chamados minissatélites ou sequências repetitivas de número variável (VNTR), que

são altamente específicas a um indivíduo. As regiões de DNA conhecidas como VNTR são

altamente polimórficas e compostas por um conjunto de sequências repetitivas em um local

definido do genoma, que podem ser utilizadas para diferenciar membros de uma população

(THOMPSON; ZOPPIS; MCCORD, 2012).

Hoje em dia, os perfis de DNA são geralmente obtidos a partir de sequências de

repetições curtas em tandem (STRs) que apresentam entre 3 e 5 bases de comprimento

repetidas até centenas de vezes, sendo fonte de grande variação individual. Logo, a

probabilidade de dois indivíduos que partilham um conjunto idêntico de polimorfismos,

excluindo-se gêmeos monozigóticos, é pequena (HUNTER, 2010).

a identificação individual de gêmeos monozigóticos (MZS) em circunstâncias forenses

sempre foi difícil realizar. É impossível distinguir MZS utilizando marcadores genéticos

convencionais de DNA, tais como os STRs e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs). No

entanto, MZS quase sempre mostram vários graus de discordância fenotípica. Na última

década, evidências têm sido acumuladas de que modificações epigenéticas do DNA e histonas

pode ter um papel primordial nos resultados fenotípicos, incluindo em doenças humanas (LI

et al., 2011)(BELL; SPECTOR, 2011).

No início de 1940 o termo Epigenética foi introduzido pelo biólogo do

desenvolvimento Conrad Waddington, como o ramo da biologia que estuda as interações

entre genes e seus produtos que fazem o fenótipo visível. No sentido original da sua definição,

epigenética se referia a todas as vias moleculares que modulam a expressão de um genótipo

em um fenótipo particular (DUPONT; ARMANT; BRENNER, 2009). A história da

epigenética é ligada ao estudo da evolução e do desenvolvimento, mas durante os últimos 50

anos, o significado do termo “epigenética” tem se submetido a uma evolução que aumentou

significativamente o conhecimento científico dos mecanismos moleculares envolvidos na

regulação da expressão gênica em eucariotos. Atualmente a epigenética pode ser definida

como o estudo das mudanças nas funções gênicas herdáveis meióticas e/ou mitóticas que não

podem ser explicadas pelas mudanças nas sequências de DNA (ALLIS; JENUWEIN;

REINBERG, 2007). Grande parte da pesquisa epigenética está convergindo para o estudo de

modificações covalentes e não covalentes de DNA e de proteínas histonas e os mecanismos

pelos quais essas modificações influenciam na estrutura geral da cromatina (GOLDBERG;

ALLIS; BERNSTEIN, 2007).

A metilação do DNA está envolvida no controle celular normal de expressão gênica,

enquanto a hipermetilação aberrante pode levar ao silenciamento de genes. A metilação do

DNA ocorre quase exclusivamente em uma citosina de um dinucleotídeo CpG, e é conseguida

pela adição de um grupo metil na posição 5 do anel de citosina mediada pela enzima DNA

metil transferase (DNMTs) (CHUANG; JONES, 2007a).

O estado da cromatina, e consequentemente o acesso ao código genético, é

principalmente regulada por modificações pós-traducionais reversíveis (PTMs) no DNA ou

nas proteínas histonas que levam a uma estrutura de empacotamento da cromatina mais aberta

ou fechada influenciando no reconhecimento das marcas por fatores de transcrição e

complexos protéicos (SCHNEIDER et al., 2011; YOST et al., 2011). Histonas estão sujeitas a

vários tipos de PTMs incluindo acetilação, metilação, fosforilação, sumoilação, ubiquitinação,

glicosilação. As metilações em caudas de histonas, que ocorrem principalmente na lisina e em

resíduos de arginina localizados nas caudas N-terminais do núcleo das histonas, e são uma das

PTM mais estudadas (YOST et al., 2011).

Ao longo do desenvolvimento, as células e tecidos se diferenciam e mudam com o

avanço da idade do organismo. Isso inclui alterações teloméricas, acúmulo de mutações no

DNA, a senescência de estruturas celulares e de órgãos, e mudanças na expressão genética.

Tanto a diferenciação de tecidos quando os efeitos do envelhecimento são pelo menos

parcialmente causadas por modificações químicas no genoma, tais como a metilação do DNA

(BOCKLANDT et al., 2011) (KOCH; WAGNER, 2011).

Alterações epigenéticas restritas ao indivíduo pode ser uma ferramenta complementar

em casos em que a genética forense não consegue resolver utilizando somente ferramentas de

identificação de rotina, como os STR ou SNP, ou no caso de diferenciar gêmeos

monozigóticos (MZS), além de estimar características fenotípicas de um suspeito, como a

idade. Portanto, este trabalho busca revisar a literatura científica internacional a respeito da

utilização da epigenética como mecanismo complementar à ciência forense.

2 METODOLOGIA

Para a elaboração deste trabalho de revisão foram utilizados artigos científicos

publicados em revistas internacionais nos últimos 10 anos, acessados através do periódico

CAPES, base de dados PubMed e da plataforma do centro nacional de informação

biotecnológica (NCBI) disponível em: www.ncbi.nlm.nih.gov. As principais palavras-chaves

utilizadas foram: epigenetic; forensic genetic; forensic epigenetic.

3 DISCUSSÃO

3.1 BREVE HISTÓRICO DA GENÉTICA FORENSE

A identificação humana através de técnicas de análise de DNA transformou a ciência

forense. Provavelmente, o desenvolvimento mais importante tem sido o enorme sucesso da

utilização das sequencias de repetições curtas em tandem (STR). Além de processos

criminais, este método tem agora uma vasta gama de aplicações, por exemplo, em teste de

paternidade, identificação militar, investigações históricas sobre a população humana e outras

espécies (GOEDECKE et al., 2004). Além disso, o teste de DNA foi importante na

identificação das vítimas do atentado terrorista que ocorreu em 11 de setembro de 2001 no

World Trade Center em New York (BIESECKER et al., 2005).

O primeiro banco de dados criminal bem-sucedido foi criado na Europa em 1995. O

banco de dados dos Estados Unidos, chamado de combined DNA index system (CODIS), foi

criado em 1998 seguindo o sucesso do sistema Europeu. Nos últimos anos, a genotipagem dos

STRs usando eletroforese capilar tornou-se um método cuidadosamente validado para

identificação humana. Até mesmo algumas poucas cópias de moléculas de DNA, extraídos de

cenas de crimes ou áreas de desastres, podem ser analisadas e caracterizadas (GOEDECKE et

al., 2004).

Os marcadores de STR são alvos de iniciadores direto e reverso em uma reação em

cadeia da polimerase (PCR), que hibridizam em ambos os lados da região de repetição. Um

dos iniciadores é marcado na extremidade 5’ com um corante fluorescente que permite a

detecção do produto de PCR resultante da amplificação seguinte (Figura 1). A posição dos

iniciadores define o tamanho geral dos produtos de PCR assim como o número de repetições

presentes na região STR. Os produtos de PCR são separados por tamanho e cor do corante

usando eletroforese seguida por indução a laser de fluorescência com detecção de múltiplos

comprimentos de onda. Um padrão interno, contendo fragmentos de DNA de tamanho

conhecido e marcados com um corante de cor diferente, é tipicamente analisado por

eletroforese correndo juntamente com as amostras para calibrar os tamanhos de corrida a

corrida. Os dados coletados na forma de eletroferogramas multicoloridos são analisados por

software que automaticamente determina o tamanho dos alelos de STR baseado em uma curva

padrão produzida a partir dos padrões internos de tamanhos conhecidos. A genotipagem de

STR é feita por comparação dos tamanhos de alelos em cada amostra para os tamanhos de

alelos presentes em uma escada alélica, que contém alelos comuns que tenham sido

previamente sequenciados (BUTLER et al., 2004).

Figura 1. Representação esquemática das posições dos iniciadores em uma PCR para

amplificação de marcadores de DNA STRs. As setas únicas representam as posições dos iniciadores, a

seta dupla ilustra o tamanho total do produtor de PCR usando um conjunto particular de iniciadores

(BUTLER et al., 2004) com adaptações.

A finalidade de um banco de dados de DNA é coletar e armazenar perfis de DNA (por

exemplo, a partir de cenas de crime, de criminosos, ou casos de pessoas desaparecidas) e

permitir a comparação dos perfis. Em casos de reincidência, os bancos de dados de DNA, são

projetados para ajudar a resolver crimes futuros (GE; EISENBERG; BUDOWLE, 2012). Em

novembro de 1997, o Federal Bureau of Investigation (FBI) selecionou 13 marcadores STR

para servir como o núcleo do CODIS. Estes marcadores são CSF1PO, FGA, TH01, TPOX,

VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 e D21S11

(Tabela 1) (BUTLER et al., 2004).

Em junho de 2011, pesquisas sobre o CODIS já produziu mais de 147,200 pistas que

ajudaram em mais de 141,300 investigações. Atualmente, o banco de dados CODIS contém

mais de 10 milhões de perfis forenses e o número de perfis continua a aumentar (GE et al.,

2012)

Tabela 1. Informações sobre os 13 marcadores STR utilizados pelo FBI no banco de dados

CODIS e outros marcadores STR contidos em kits comerciais (BUTLER et al., 2004).

Embora a utilização de marcadores nos 13 loci de STR do CODIS seja suficiente na

maioria dos casos, abordagens de ampliação vem sendo estudadas, entre elas, a inclusão de

mais loci à base de dados, Y-STRs para determinação da linhagem paterna, a utilização do

DNA mitocondrial, já que mais mulheres e associações maternas podem vir a preencher o

banco de dados no futuro, a utilização de nucleotídeos de polimorfismo único (SNP) (GE et

al., 2012) e estratégias baseadas na utilização de mecanismos epigenéticos, que incluem as

modificações pós-traducionais em caudas de histonas e a metilação do DNA, já que esta

fornece informações que podem servir para a diferenciação de gêmeos monozigóticos, na

determinação da idade biológica e nos recentes crimes onde o indivíduo tem seus alelos de

STR dos loci do CODIS desvendados, em seguida sintetizados em laboratório e implantados

na cena do crime para uma falsa acusação.

3.2 METILAÇÃO DO DNA

Uma das primeiras marcas epigenéticas estudadas em eucariotos é a metilação em

citosinas do DNA, que atua como uma modificação de forma herdável estável afetando a

atividade do gene e a biologia celular (FERNANDEZ et al., 2012).

A metilação do DNA é uma modificação covalente na qual a posição 5’ da citosina é

metilada em uma reação catalisada pelas enzimas DNA metil transferases (DNMTs) com a S-

adenosil-metionina como doador do grupo metil (Figura 2). Nos mamíferos, esta modificação

ocorre nos dinucleótidos CpG e pode ser catalisada por três diferentes enzimas, DNMT1 e

DMNT3a, e DNMT3b. A metilação do DNA desempenha um papel no silenciamento da

transcrição e na formação da heterocromatina, que é a forma condensada da cromatina. Como

uma modificação epigenética, a metilação do DNA permite que esses estados de

silenciamento gênicos sejam herdados ao longo das divisões celulares (MIRANDA; JONES,

2007).

Figura 2. Mecanismo de metilação do DNA. A metilação do DNA envolve a adição de um

grupo metil na posição 5 de um resíduo de citosina, mediada pelas enzimas DNMTs. A metilação do

DNA acontece quase exclusivamente em citosinas anteriores a uma guanina em um dinucleótido CpG

(CHUANG; JONES, 2007a) com adaptações.

As ilhas CpG normalmente permanecem não metiladas, emquanto sítios esporádicos

CpG no restante do genoma são normalmente metilados. Existe uma inversão gradual deste

padrão durante o envelhecimento o que leva a uma metilação esporádica nas ilhas CpG e uma

perda global de metilação, mas esta mudança ocorre particularmente durante a carcinogênese.

A metilação de ilhas CpG em regiões promotoras é muitas vezes associada com o

silenciamento de genes, e metilação anormal no DNA ocorre na maioria dos cânceres,

levando ao silenciamento de alguns genes supressores de tumor (Figura 3) (CHUANG;

JONES, 2007b).

Figura 3. As regiões CpG no genoma são distribuídos desigualmente. As ilhas CpG podem

ser encontradas nas regiões promotoras de cerca de metade dos genes e normalmente permanecem

desmetiladas. Quando elas se tornam anormalmente hipermetiladas, como pode acontecer em muitos

cânceres, elas levam ao silenciamento de genes (CHUANG; JONES, 2007a) com adaptações.

A técnica considerada padrão-ouro na análise do estado de metilação de citosinas

individuais é o sequenciamento bissulfito, nas quais as citosinas não metiladas são

convertidas em uracilas e lidas como timinas, enquanto citosinas metiladas são protegidas da

conversão. O rendimento do sequenciamento bissulfito mostra resolução ótima de dados, mas

este método tem sido limitado na cobertura de genomas relativamente pequenos

(FERNANDEZ et al., 2012). Uma vez que a conversão das citosinas não metiladas tenham

ocorrido, as diferenças entre citosinas metiladas e não metiladas (convertidas em uracilas)

podem ser analisadas por vários métodos, entre eles, sequenciamento, digestão usando

enzimas de restrição, ensaios de extensão de nucleotídeos (MS-SnuPE), PCR com iniciadores

específicos (MSP), ou pirossequenciamento. Estes métodos são valiosos já que não são

laboriosos e requerem quantidades pequenas de DNA. No entanto, estes métodos são

geralmente limitados uma vez que só se pode estudar um único gene ou locus por rodada. Os

métodos anteriores que consistiam na utilização de enzimas de restrição sensíveis a metilação

e Southen blotting para a determinação de metilação em genes específicos foram substituídos

para aqueles métodos mais convenientes (YANG et al., 2004)

3.3 MODIFICAÇÃO NA CROMATINA.

A cromatina é uma estrutura altamente dinâmica de nucleossomos que são compostos

por DNA e estão envolvidos em torno do núcleo das proteínas histonas (H2A, H2B, H3 e H4)

(TOTH et al., 2010). Esta estrutura é crucial para a regulação da expressão gênica, que é feita

através do recrutamento de complexos proteicos e pelo remodelamento da cromatina. As

modificações covalentes no núcleo das histonas tem um papel crítico na regulação da

expressão gênia por meio da acetilação, metilação (GOLBABAPOUR; ABDULLA;

HAJREZAEI, 2011), fosforilação, ubiquitinação, sumoilação e essas modificações em

histonas são mais dinâmicas do que a metilação do DNA uma vez que podem ser colocadas e

removidas por uma ampla variedade de enzimas (VAN MONTFOORT et al., 2012).

Figura 4. Representação das caudas de histona na formação da fibra de DNA de 30-nm. (A)

Os pontos de saída aproximadas das oito caudas de histonas, quatro de cada subunidade, que se

estendem a partir de cada nucleossomo. (B) Um modelo especulativo mostrando como as caudas de

histona podem ajudar a embalar nucleossomas juntos na fibra de 30-nm. Este modelo baseia-se em (1)

Evidência experimental de que as caudas de histonas ajudam na formação da fibra 30-nm, (2) A

estrutura cristalina do nucleossomo vista por raio-x, e (3) evidência de que as caudas histona

interagem com o DNA (ALBERTS et al., 2002) com adaptações.

Ao contrário da metilação do DNA, que é geralmente envolvido na repressão da

transcrição, modificações em caudas de histonas exibem grande variedade de funções (VAN

MONTFOORT et al., 2012). A hiperacetilação das histonas H3 e H4 ocorrem principalmente

em promotores e correlacionam com a ativação gênica, enquanto a hipoacetilação é

caracterizada pela repressão gênica. A metilação de histonas está associada tanto com a

ativação quanto repressão de genes, dependendo de quais resíduos de lisina na histona são

mono-, di- ou tri-metilados. Em geral, os genes transcricionalmente ativos estão associados

com H3K4me3 e H3K36me3, enquanto que a trimetilação de H3K9, H3K27 e H4K20 ocorre

principalmente em genes reprimidos (TOTH et al., 2010).

Para entender como ocorre o mecanismo de interação do DNA com proteínas, como

visto no caso das modificações em histonas, é utilizada a técnica de imunoprecipitação da

cromatina (ChIP). A ChIP tem sido amplamente utilizada para mapear a localização de

modificações pós-traducionais encontradas em caudas de histonas no genoma ou em loci de

genes específicos, ou para mapear a associação de fatores de transcrição ou de enzimas

modificadoras da cromatina do genoma (COLLAS; DAHL, 2008).

A ChIP é uma técnica eficiente que permite a análise da interação entre fatores de

transcrição e de complexos reguladores da cromatina com o DNA em células vivas,

proporcionando assim uma imagem da célula viva com a estrutura nativa da cromatina e

fatores ligados a genes em diferentes estados funcionais. Tipicamente, a técnica ChIP

primeiro envolvia o crosslinking entre proteína-proteína e proteína-DNA. Resumidamente, a

cromatina isolada bruta é então sonicada para produzir pequenos fragmentos, normalmente de

300-1000 pb de tamanho médio. Em seguida, os anticorpos são usados contra proteínas que

supostamente se ligam a uma determinada parte do DNA para imunoprecipitar fragmentos da

cromatina. Para finalizar pode ser feita análise por PCR do imunoprecipitado, usando

oligonucleótidos que medem uma sequencia de DNA, revelando quando a proteína está ligada

in vivo a uma região de DNA (SANDOVAL et al., 2004).

Figura 5. Duas maneiras em que a estrutura da cromatina pode influenciar a expressão gênica.

Uma região de cromatina não embaladas, chamada eucromatina, em que os genes são acessíveis é

flanqueado por dois segmentos mais compactos, chamados heterocromatina. Na eucromatina, o

posicionamento dos nucleossomas influenciam a expressão gênica. À esquerda, os nucleossomos têm

espaçamento regular, no lado direito, o posicionamento nucleossomo mudou e uma pequena extensão

de DNA, de aproximadamente 300 pb, é exposta (BROWN, 2002) com aptações.

3.4 EPIGENÉTICA NA IDENTIFICAÇÃO DE GÊMEOS

MONOZIGÓTICOS

Gêmeos monozigóticos compartilham o mesmo genótipo. Entretanto, várias

discordâncias fenotípicas podem ser observadas entre a maioria dos gêmeos monozigóticos,

como as diferenças na susceptibilidade a doenças e em várias características antropomórficas.

Existem algumas possíveis explicações para essas observações, desde variações

submicroscópicas no DNA após ciclo celular meiótico, até a existência de diferenças

epigenéticas (FRAGA et al., 2005). Essa variação entre os organismos com sequências de

DNA virtualmente idênticas tem sido largamente atribuída para os efeitos do ambiente.

Fatores ambientais podem ter um forte efeito sobre alguns fenótipos, mas evidências de

experiências em animais e humanos sugerem que o impacto do ambiente tem sido exagerado.

Portanto, os pontos de vista sobre as causas das diferenças fenotípicas em organismos

geneticamente idênticos requerem uma revisão (WONG, A. H.; GOTTESMAN; PETRONIS,

2005).

Duas áreas que podem se beneficiar das diferenças epigenéticas observadas em

gêmeos monozigóticos são a ciência forense e a medicina de transplante de órgãos. Embora os

gêmeos não tenham maior probabilidade de serem criminosos comparados com a população

em geral, um em cada 250 pessoas são gêmeos MZ e os processos judiciais envolvendo

gêmeos MZ são de alto perfil. Por exemplo, a identidade genética compartilhada de gêmeos

MZ pode permitir que os gêmeos forneçam uns álibis entre si em casos criminais. Diferenças

nos perfis epigenéticos entre gêmeos MZ, se consistentemente comprovado, poderia conduzir,

no futuro, um preenchimento dessa lacuna (BELL; SPECTOR, 2011).

Um dos primeiros estudos envolvendo mecanismos epigenéticos em gêmeos MZ

examinou diferenças globais e locus-específica na metilação do DNA e na acetilação das

histonas de um grande grupo de gêmeos monozigóticos (FRAGA et al., 2005). Eles

descobriram que, embora os gêmeos sejam epigeneticamente indistinguíveis durante os

primeiros anos de vida, gêmeos MZ mais velhos apresentaram diferenças marcantes em seu

conteúdo geral e na distribuição genômica de 5-metilcitosina no DNA e na acetilação de

histonas, afetando os seus perfis de expressão gênica (Figura 5). Estes achados indicam uma

lacuna com relação aos conceitos da epigenética sobre a nossa compreensão de como

diferentes fenótipos podem ser originados a partir do mesmo genótipo. Essas diferenças nos

perfis epigenéticos podem ser explicadas pela influência de fatores externos e internos. O

hábito de fumar, atividade física, dieta, são fatores externos que podem influenciar nas

modificações epigenéticas (FRAGA et al., 2005).

Figura 6. (Acima) Quantificação do conteúdo total de 5mC do DNA (esquerda), acetilação

das histonas H4 (Centro), e acetilação da histona H3 (Direita) por HPLC e eletroforese capilar de alta

performance. (C Baixa) Comparação dos valores epigenéticos entre os irmãos de cada par de gêmeos

com 3 e 50 anos de idade (FRAGA et al., 2005).

Em 2010 foi investigada quantitativamente a metilação do DNA em regiões

promotoras do gene receptor de dopamina 4 (DRD4), o gene transportador de serotonina

(SLC6A4/SERT) e o gene ligado ao X da monoamina oxidase A (MAOA) utilizando

amostras de DNA em 46 pares de MZ e 45 pares de gêmeos dizigóticos (DZ) (total n = 182)

nas idades de 5 e 10 anos. Os dados sugeriram que as diferenças na metilação do DNA são

visíveis já na infância, até mesmo entre indivíduos geneticamente idênticos, e que as

diferenças individuais na metilação não são estáveis ao longo do tempo (Figura 6). O estudo

do autor sugere ainda que as influências ambientais são fatores importantes na contabilização

das diferenças de metilação interindividuais de DNA, e que essas influências diferem do

genoma (WONG, C. C. et al., 2010).

Figura 7. Nível médio de metilação no DNA em DRD4, SERT e MAOA em idades de 5 e 10

anos. MZ, gêmeos monozigóticos, DZ, dizigóticos; MZM, gêmeos monozigóticos do sexo masculino;

MZF, gêmeos monozigóticos femininos; DZM, dizigóticos do sexo masculino; feminino, DzF

dizigóticos (WONG, C. C. et al., 2010).

Outro estudo analisou 22 pares de gêmeos MZ adultos. O DNA genômico foi

modificado com bissulfito e em seguida foram analisadas 27,000 ilhas CpG. Os resultados

indicaram que gêmeos MZ apresentaram diferenças notáveis nas suas 5-metilcitosina entre

seus genomas (LI et al., 2011). De acordo com um conjunto de critérios de seleção, 377 sítios

CpG com diferenças significativas de metilação foram escolhidos. Embora a metilação do

DNA mostre apenas estabilidade parcial, os resultados primário deste estudo sugerem

fortemente que a metilação em ilhas CpG pode ser um biomarcador para distinguir gêmeos

MZ uns dos outros (LI et al., 2011).

Para explorar a variação e herdabilidade da metilação do DNA, outro estudo

(GERVIN et al., 2011) realizou sequenciamento bissulfito de 1,760 ilhas CpG em 186 regiões

do complexo de histocompatibilidade humana (MHC) em linfócitos CD4+ de 49 pares de

gêmeos monozigóticos (MZ) e 40 dizigóticos (DZ). Os resultados mostraram que indivíduos

apresentam grandes variações na metilação do DNA, tanto entre genes e dentro das regiões do

complexo MHC. Além disso, muitas regiões também têm um padrão complexo de variação

(GERVIN et al., 2011). Globalmente, parece ser uma distribuição bimodal de metilação de

DNA nas regiões, mas uma fração significativa das ilhas CpG são também heterogeneamente

metiladas. A classificação das regiões em ilhas CpG (intragênica e intergênica), final 5’ de

genes não associado a uma ilha CpG definida, regiões não-codificadoras conservadas, e sítios

aleatórios CpG, mostraram diferenças em variação e hereditariedade de acordo com a região

analisada. As análises revelaram menores diferenças intra-par entre MZ do que entre os pares

DZ, sugerindo algumas influências genéticas sobre a variação da metilação do DNA, com a

maior parte da variância atribuída a não genéticos fatores. Em geral, as estimativas de

herdabilidade de metilação do DNA foram baixas (GERVIN et al., 2011).

3.5 PREVENDO A IDADE POR MEIO DA EPIGENÉTICA

O envelhecimento afeta as funções fisiológicas e pode ser definido como a

acumulação de danos nas moléculas, células e tecidos durante toda a vida. Muitas vezes esse

processo diminui a capacidade de um organismo para manter a homeostase em condições de

estresse, e implica um maior risco para muitas doenças (câncer, doenças cardiovasculares e

doenças neurodegenerativas). A identificação de fatores que regulam o envelhecimento é

limitada pela complexidade do processo e pela considerável heterogeneidade entre indivíduos

e mesmo entre tecidos dentro de um corpo. Ao nível celular, o evento mais proeminente em

um tecido de envelhecimento é a senescência celular, uma consequência da exposição

intrínsecas e extrínsecas à fatores de envelhecimento. É caracterizada pela acumulação

gradual de danos no DNA e alterações epigenéticas na estrutura do DNA que afetam a

expressão gênica correta e levam a uma alteração da função celular (RODRIGUEZ-RODERO

et al., 2011).

No contexto de determinar a idade celular por meio de mecanismos epigenéticos, os

gêmeos monozigóticos (MZ) são um modelo atraente para estudar mudanças de metilação

com a idade. No momento da separação dos embriões, ambos têm padrões de metilação quase

idênticos. Enquanto certas mudanças de metilação são geneticamente controladas, a exposição

ambiental e processos estocásticos podem conduzir a alterações no padrão de metilação.

Dessa forma, gêmeos idênticos podem ser considerados replicatas do mesmo experimento de

desenvolvimento e envelhecimento. Vários estudos têm investigado o estado epigenético de

um pequeno número de genes selecionados e ilhas CpG em indivíduos de diferentes idades ou

mediram as mudanças globais na metilação do DNA com o aumento da idade. Recentemente,

estudos imparciais do genoma têm documentados os efeitos da idade sobre a metilação do

DNA em cultivo de células, camundongos, e os seres humanos (BOCKLANDT et al., 2011).

O primeiro estudo que buscou analisar padrões de metilação relacionados à idade foi

publicado em 2009 e utilizou modelo de camundongos da linhagem C57BL/6J (n = 12 por

grupo) de duas idades diferentes, 2 meses (jovens) e 10 meses (adulto), e mães com idade

entre 2 meses (n = 6 casais reprodutores por grupo). Os comportamentos sociais e

exploratórios foram examinados na prole. As conclusões dos autores foram que os filhotes de

pais mais velhos tinham comportamento social menor (p = 0,02) e exploratória (p = 0,02)

comparados com a prole de pais mais jovens. Não houve diferenças significativas na medição

de atividade motora. A conclusão do trabalho diz que evidência de efeitos deletérios do

avanço da idade paterna no comportamento social e exploratório. Alterações cromossômicas

de-novo e/ou mudanças epigenéticas são os fatores mais aceitáveis para explicar essas

mudanças (SMITH et al., 2009).

Dois importantes artigos foram publicados em 2011 e utilizaram humanos para

determinar a idade celular. O primeiro artigo, mostrou que os padrões da metilação do DNA

mudam com o aumento da idade e contribuem nas doenças relacionadas à idade

(BOCKLANDT et al., 2011). Os autores identificaram 88 regiões dentro ou próximas de 80

genes nos os quais o grau de metilação de citosina foi significativamente correlacionado com

a idade. Para a realização deste estudo, os autores utilizaram saliva de 34 pares de gêmeos MZ

homens entre 21 e 55 anos de idade. Além disso, eles validaram regiões nos promotores de

três genes e replicaram os resultados usando amostras da população geral de 31 homens e 29

mulheres entre 18 e 70 anos de idade. A metilação em três regiões, nos promotores dos genes

EDARADD, TOM1L1, e NPTX2 foram consideradas lineares com a idade ao longo de um

intervalo de cinco décadas (Figura 7). Usando apenas duas citosinas encontradas neste loci, os

autores construíram um modelo de regressão que explicou 73% da variação na idade, e foram

capazes de prever a idade de um indivíduo com uma precisão média de 5,2 anos

(BOCKLANDT et al., 2011).

Os dados mostrados podem ser utilizados na ciência forense, tornando possível estimar

a idade de uma pessoa, baseada em uma amostra biológica isolada (BOCKLANDT et al.,

2011).

Figura 8. Porcentagem de metilação versus a idade para os três marcadores validados em três

conjuntos de amostras. Amostras originais de gêmeos foram marcadas em azul, amostras controles de

homens estão marcadas em vermelho e as amostras de controle do sexo feminino em verde. As linhas

de tendência linear são mostradas nas cores das amostras individuais. A) Edaradd r = -0.81 (gêmeos), r

= -0.73 (controles do sexo masculino), r = -0,75 (controles do sexo feminino) B) NPTX2 r = 0,52

(gêmeos), r = 0,79 (controles do sexo masculino), r = 0,03 (controles do sexo feminino) C) Tom1L1 r

= -0,70 (gêmeos), r = -0.49 (controles do sexo masculino), r = -0,24 (controles do sexo feminino)

(BOCKLANDT et al., 2011).

Outro importante artigo publicado em 2011 (KOCH; WAGNER, 2011) buscou perfis

de metilação no DNA de vários tipos de células em depósitos de dados públicos por meio da

plataforma HumanMethylation27 BeadChip que representa 27.578 regiões CpG. Cinco

conjuntos de dados englobando os tecidos da derme, epiderme, esfregaço cervical, células-T e

monócitos foram utilizados para construir o modelo Pavlidis para identificar 19 regiões CpG

que são continuamente hipermetiladas pelo envelhecimentos (R> 0,6; p-value <10-13

). Quatro

destas regiões CpG (associadas aos genes NPTX2, TRIM58 e GRIA2 e KCNQ1DN) e uma

região adicional CpG hipometilada (BIRC4BP) foram usados para prever a idade dos

doadores. Esta assinatura epigenética da idade foi testada para validação de um grupo de oito

conjuntos de dados independentes correspondentes a vários tipos de células de tecidos

diferentes. Em geral, as cinco regiões CpG revelaram mudanças na metilação do DNA

associadas à idade em todos os tecidos. A diferença média absoluta entre as idades previstas e

cronológicas reais foi cerca de 11 anos. Este método pode ser utilizado para prever a idade do

doador em várias preparações celulares – por exemplo, na utilização na ciência forense

(KOCH; WAGNER, 2011).

Tabela 2. Regiões CpG com as mudanças mais significativas associadas à idade (KOCH;

WAGNER, 2011).

O modelo Pavlidis foi usado para identificar regiões CpG que apresentassem alterações mais

significativas associadas à idade. Regiões de 19 ilhas CpG revelaram hipermetilação com um

coeficiente de correlação R de Pearson > 0,6 em todas as amostras do grupo de treinamento.

Correlações significativas associadas à idade também foram observadas na maioria dos dados

individuais. As regiões CpG da assinatura epigenética da idade estão indicados em cinza. *Uma região

CpG hipometilada adicional (cg23571857) foi incluída no preditor (KOCH; WAGNER, 2011).

4 CONCLUSÃO

Pelo exposto neste trabalho de revisão bibliográfica conclui-se que é necessário um

aprimoramento nas ferramentas utilizadas pela genética forense clássica, que utiliza

marcadores STR validados, como por exemplo, o banco de dados CODIS. Dentre as

perspectivas de melhorias incluem-se a utilização de mais loci, de marcadores para linhagens

maternas, como o DNA mitocondrial, marcadores de linhagem paterna, como as regiões Y-

STR e, principalmente, marcadores epigenéticos que possibilitem a diferenciação de gêmeos

MZ e permitam uma assinatura epigenética da idade biológica.

Estudos mostraram que uma forma de diferenciar gêmeos MZ o que pode ser

importante em casos forenses pode ser feita por meio da análise do padrão de metilação em

algumas regiões CpG e também pela análise das acetilações presentes em aminoácidos de

proteínas histonas H4 e H3. As regiões promotoras dos genes DRD4, MAOA, SLC6A4/SERT

são candidatas da assinatura epigenética da idade e podem ser analisadas pelas metilações no

DNA.

A idade biológica celular pode ser medida pelo padrão de metilação do DNA

acumulados durante o envelhecimento causados por fatores ambientais. Os principais genes

marcadores da correlação entre metilação no DNA e envelhecimento são as regiões

promotoras dos genes EDARADD, TOM1L1, NPTX2, TRIM58, GRIA2 e KCNQ1DN, que

são metilados ao longo do envelhecimento. Ao contrário disso, a região promotora do gene

BIRC4BP apresentou decréscimo na metilação ao longo do envelhecimento. Essas regiões

podem ser importantes na análise biológica de vestígios em cenas de crime.

A utilização destas técnicas na ciência forense ainda não é comum, porém podem

fornecer informações valiosas na busca e julgamento de criminosos em casos que a genética

forense clássica não pode ajudar. Futuramente, nos casos complexos no qual existir o

questionamento sobre irmãos monozigóticos ou estágio da vida do suspeito em relação ao

material biológico da evidência essas técnicas deverão ser utilizadas rotineiramente.

Laboratórios forenses em todo o mundo serão equipados para realizarem essas aferições,

conforme as técnicas sejam criteriosamente estabelecidas e menos laboriosas além dos custos

operacionais se tornarem mais acessíveis.

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