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MARCUS VINICIUS CARDOSO MATOS SILVA

ANÁLISE GENÉTICO-POPULACIONAL DAS MUTAÇÕES DO

GENE TCF7L2 EM DIABÉTICOS DE TRIUNFO - PERNAMBUCO

RECIFE - PE

2011

MARCUS VINICIUS CARDOSO MATOS SILVA

ANÁLISE GENÉTICO-POPULACIONAL DAS MUTAÇÕES DO

GENE TCF7L2 EM DIABÉTICOS DE TRIUNFO - PERNAMBUCO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Genética da Universidade Federal de Pernambuco,

como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título

de Mestre em Genética.

Orientadora: Profa. Dra. Rosilda dos Santos Silva Co-orientador: Prof. Dr. Luiz Maurício da Silva

RECIFE - PE

2011

Silva, Marcus Vinicius Cardoso Matos Análise genético-populacional das mutações do gene TCF7L2 em

diabéticos/ Marcus Vinicius Cardoso Matos Silva. – Recife: O Autor, 2011.

75 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Rosilda dos Santos Silva Co-Orientador: Luiz Maurício da Silva Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de

Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Genética, 2011. Inclui bibliografia

1. Genética de populações 2. Diabetes mellitus 3. Triunfo

(PE) I. Título.

576.58 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2011-106

01 03 2011

DEDICO:

Aos meus pais, meu irmão e minha família que

tanto amo pelo constante suporte.

Aos meus amigos e a minha namorada pelo

amor e apoio.

AGRADECIMENTOS

Ao meu Deus que tem me carregado nos braços em todos os momentos da minha

caminhada e pela benção de mais uma etapa da minha vida que consigo cumprir.

Aos meus pais por terem sido pilares sólidos na minha vida, pelos sábios conselhos, pelo

colo na hora da angústia, pelo incentivo, pelo sustento; à minha mãe pela sabedoria e

amor e ao meu pai pelo exemplo e força.

Ao meu irmão pela companhia e por estar sempre por perto.

A minha avó (in memorian) Maria Luzinete pela atenção, carinho, afeto e incentivo.

Ao meu tio José Ubiratan por me ensinar com a sua vida a ser guerreiro, forte e fiel.

Aos meus familiares pelo carinho e amor.

A minha namorada Ana Paula pelo amor, respeito e o compartilhar da vida.

A minha orientadora Dra. Rosilda dos Santos Silva e ao meu co-orientador Dr. Luiz

Maurício da Silva pelo apoio, por terem me ensinado na pesquisa e na vida, aos quais

tenho profundo respeito e gratidão.

A todos os amigos que fiz na Universidade e fora dela, por me serem suporte, pela

amizade, pelas horas de risos, pelas incansáveis horas de ajuda e diversão.

Aos amigos dos grupos de pesquisa dos laboratórios LGMH e LABBE – doutorandos:

Carlos, Marcus e Pierre; mestrandos: César, Marco e Tiago; estagiários: Wellington e

Sebastião - pela amizade, descontração e companheirismo.

A todos os funcionários do Laboratório de Genética Molecular Humana (LGMH) pela

ajuda e serviço.

RESUMO

A diabetes é uma doença crônico-degenerativa que envolve alterações no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas. Caracteriza-se por deficiência de secreção e/ou de ação da insulina com consequente hiperglicemia. É preocupante saber que dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) prevêem um aumento no número de diabéticos de 171 milhões no ano de 2000 para 336 milhões em 2030, o que se assemelha a uma epidemia. A diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é a principal responsável pelo incremento da doença no mundo atual. Este estudo teve como objetivo analisar a ocorrência das principais mutações do gene TCF7L2 (fator de transcrição 2 semelhante ao 7) relacionadas a DM2. Usando a técnica de PCR em tempo real com sondas TaqMan, foram genotipados quatro polimorfismos de um único nucleotídeo (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) do gene TCF7L2: rs7903146 (C/T), rs7901695 (T/C), rs12255372 (G/T) e rs11196205 (G/C). A partir do resultado da genotipagem dos 340 indivíduos residentes no município de Triunfo - Pernambuco (112 diabéticos e 228 não diabéticos) foram calculadas as frequências alélicas, genotípicas e haplotípicas para o conjunto de SNPs, utilizando o programa UNPHASED. Uma associação significativa foi encontrada entre os SNPs rs7901695 e rs12255372 com DM2 (p = 0,0379 e p = 0,0119, respectivamente) na população estudada. As frequências alélicas corroboraram o que foi observado com os genótipos para o SNP rs7901695. Na análise haplotípica, os pares rs7901695 x rs11196205 e rs11196205 x rs12255372 apresentaram associação com DM2 (p = 0,007 e p = 0,015, respectivamente). Entre os haplótipos triplos, apenas um conjunto (rs7901695 x rs7903146 x rs12255372) não mostrou associação com diabetes (p = 0,2903). Portanto, no presente estudo, os SNPs do TCF7L2 encontraram-se em associação com DM2, sendo que se estes haplótipos forem estendidos, com a adição de outros do mesmo gene, podem-se ter haplótipos que, segregando nas famílias e caracterizando-as, permitam estabelecer um diagnóstico probabilístico preventivo a partir dessas mutações. Uma vez que esses dados sejam replicados, essa associação pode ser utilizada como marcador genético de risco para famílias, cujos ancestrais mais recentes tenham DM2, bem como para monitoração das mesmas. Neste estudo, foi também realizado um levantamento de dados das famílias do distrito de Canaã em Triunfo, a fim de estabelecer a prevalência de DM2 nessa população. Numa amostragem de 198 indivíduos, a prevalência de DM2 correspondeu a 13,6% da população adulta deste distrito, demonstrando que também no sertão nordestino esse é um quadro preocupante.

Palavras-chave: Diabetes mellitus tipo 2, TCF7L2, SNPs, Prevalência, Triunfo.

ABSTRACT

Diabetes is a chronic degenerative disease that involves changes in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins. It is characterized by deficiency of secretion and/or insulin action with consequent hyperglycemia. Disturbingly, data from the World Health Organization (WHO) predict an increase in the number of diabetics from 171 million in 2000 to 336 million in 2030, which resemble to an epidemic. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is primarily responsible for the increase of the disease in world. This study aimed to analyze the occurrence of main mutations of the gene TCF7L2 (transcription factor 7-like 2) related to T2DM. Using the technique of Real-Time PCR with TaqMan probes, were genotyped four single nucleotide polymorphisms (SNPs) of TCF7L2 gene: rs7903146 (C/T), rs7901695 (T/C), rs12255372 (G/T) and rs11196205 (G/C). From the genotyping results of 340 individuals residing in the town of Triunfo - Pernambuco (112 diabetics and 228 non-diabetics) were calculated the allelic, genotypic and haplotype frequencies for all SNPs, using the UNPHASED program. A significant association was found between the SNPs rs12255372 and rs7901695 with T2DM (p = 0.0379 and p = 0.0119, respectively) in the studied population. The allelic frequencies corroborated what was observed with the genotypes for SNP rs7901695. In the haplotype analysis, the pairs rs7901695 x rs11196205 and rs11196205 x rs12255372 were associated with T2DM (p = 0.007 and p = 0.015, respectively). Among the triple haplotypes, only one set (rs7903146 x rs11196205 x rs12255372) was not associated with diabetes (p = 0.2903). Therefore, in the present study, the TCF7L2 SNPs were found in association with T2DM and if these haplotypes are extended with the addition of others of the same gene, could be found haplotypes that, segregating in families and characterizing them, would establish a preventive probabilistic diagnosis based on these mutations. Since these data are replicated, this association may be used as a genetic marker of risk for families, whose ancestors have T2DM, and for monitoring them. In this study, also was conducted a survey of data from families of the district of Canaan in Triunfo, in order to establish the prevalence of T2DM in this population. In a sample of 198 individuals, the prevalence of T2DM corresponded to 13,6% of the adult population of this district, demonstrating that also in the northeastern hinterland this is a worrying situation.

Key words: Type 2 diabetes mellitus, TCF7L2, SNPs, Prevalence, Triunfo.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Prevalência esperada da diabetes, no mundo, até 2025 ............................................... 19

Figura 2: Cronologia da descoberta dos genes associados a DM2 através do ano de publicação definitiva e tamanho aproximado do efeito .................................................................................... 29

Figura 3: A) Idiograma mostrando a localização do gene TCF7L2 na região 10q25.3 ................. 30

Figura 3: B) Posição do gene TCF7L2 no braço longo do cromossomo 10 - barras horizontais vermelhas indicam a região codificadora ...................................................................................... 30

Figura 3: C) Localização exata do gene TCF7L2 no cromossomo 10 .......................................... 30

Figura 4: Genes vizinhos ao TCF7L2, bem como suas localizações no cromossomo (pontos azul-claros) - em destaque o gene TCF7L2 (quadro vermelho). ........................................................... 30

Figura 5: Representação esquemática da via de sinalização Wnt ................................................ 31

Figura 6: Sequência onde se insere o SNP rs7903146 mostrando a posição da mutação Y em verde (código usado pela IUPAC para informar uma mutação entre pirimidinas) ......................... 37

Figura 7: Sequência onde se insere o SNP rs12255372 mostrando a posição da mutação K em verde (código usado pela IUPAC para informar uma mutação entre uma purina e uma pirimidina). ..................................................................................................................................................... 38

Figura 8: Sequência onde se insere o SNP rs7901695 mostrando a posição da mutação Y em verde (código usado pela IUPAC para informar uma mutação entre pirimidinas) .......................... 39

Figura 9: Sequência onde se insere o SNP rs11196205 mostrando a posição da mutação S central (código usado pela IUPAC para informar uma mutação forte entre pirimidina). ................. 40

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificação da diabetes mellitus. ............................................................................... 20

Tabela 2: Genes associados à diabetes mellitus e sua respectiva função no metabolismo. ......... 28

Tabela 3: Uma análise resumida da associação entre diabetes mellitus tipo 2 e o gene TCF7L2. 33

Tabela 4: Diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em azul o alelo T (selvagem) e em laranja o alelo C (mutante). . 37

Tabela 5: A diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em laranja o alelo G (selvagem) e em azul o alelo T (mutante). . 38

Tabela 6: Diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em laranja o alelo C (selvagem) e em azul o alelo T (mutante). . 39

Tabela 7: Diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em laranja o alelo C (selvagem) e em azul o alelo G (mutante). 40

Tabela 8: SNPs do gene TCF7L2 analisados na população de Triunfo - PE. ............................... 45

Tabela 9: Composição por sexo e faixa etária da amostra estudada em Triunfo – PE. ................ 46

Tabela 10: Número de pessoas estudadas, prevalência (%) de diabetes mellitus tipo 2 e intervalo de confiança (IC) de 95%, por faixa etária e total em Triunfo - PE. ............................................... 47

Tabela 11: Prevalência de diabetes mellitus tipo 2 e intervalo de confiança (IC) de 95% em cada uma das situações em 198 indivíduos residentes em Triunfo - PE. .............................................. 48

Tabela 12: Avaliação das frequências genotípicas dos SNPs do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 na população de Triunfo - PE. .......................................................... 49

Tabela 13: Avaliação das frequências alélicas de quatro SNPs do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 na população de Triunfo - PE. .......................................................... 49

Tabela 14: Avaliação das frequências haplotípicas dos SNPs, 2 x 2, do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 na população de Triunfo - PE. ....................................... 50

Tabela 15: Avaliação das frequências haplotípicas dos SNPs, 3 x 3, do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 na população de Triunfo - PE. ....................................... 51

Tabela 16: Avaliação das frequências haplotípicas dos SNPs, 4 x 4, do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 na população de Triunfo - PE. ....................................... 52

LISTA DE ABREVIATURAS

AKT Proteína quinase B

DCDs Doenças crônico-degenerativas

DM Diabetes mellitus

DM1 Diabetes mellitus tipo 1

DM2 Diabetes mellitus tipo 2

DNA Ácido desoxirribonucléico

GJA

GLP-1

Glicemia em Jejum Alterada

Glucagon like peptide-1

Glu Gene do pró-glucagon

GWS Genome Wide Screen

HDL Lipoproteína de alta densidade

HNF Fator nuclear hepático

HW Lei de Hardy-Weinberg

IMC Índice de Massa Corpórea

LDL Lipoproteína de baixa densidade

NCBI National Center for Biotechnology Information

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man

OMS Organização Mundial da Saúde

PCR Polymerase Chain Reaction

(Reação em Cadeia da Polimerase)

PDX1 Pancreatic and duodenal homeobox 1

PKA Proteína kinase A

RNA Ácido ribonucléico

SBD Sociedade Brasileira de Diabetes

SNP Single Nucleotide Polymorphism

(Polimorfismo de um único nucleotídeo)

TCF T-cell Factor (Fator da célula-T)

TCF7L2 Transcription Factor 7-like 2

(Fator de Transcrição 2 semelhante ao 7)

TDG Tolerância diminuída à glicose

TOTG Teste oral de tolerância á glicose

X² Teste do Qui-Quadrado

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................13

2. REVISÃO DA LITERATURA.................................................................................15

2.1 Doenças crônico-degenerativas...................................................................15

2.2 Diabetes Mellitus.............................................................................................16

2.3 Histórico da Diabetes.....................................................................................17

2.4 Prevalência da Diabetes................................................................................19

2.5 Tipos de Diabetes Mellitus............................................................................20

2.5.1 Diabetes Mellitus tipo 1.........................................................................21

2.5.2 Diabetes Mellitus tipo 2.........................................................................21

2.6 Monitoramento dos diabéticos......................................................................22

2.7 Genética da Diabetes......................................................................................23

2.7.1 Bases genéticas da DM1.......................................................................23

2.7.2 Bases genéticas da DM2.......................................................................24

2.8 Genes associados a DM2...............................................................................27

2.9 Gene TCF7L2...................................................................................................29

2.10 Mutações relacionadas ao gene TCF7L2....................................................36

3. OBJETIVOS...........................................................................................................41

3.1 Objetivo geral ................................................................................................ 41

3.2 Objetivos específicos ................................................................................... 41

4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 42

4.1 População e Local do Estudo ...................................................................... 42

4.2 Exames Laboratoriais....................................................................................44

4.3 Extração de DNA............................................................................................44

4.4 Genotipagem das mutações do gene TCF7L2............................................45

4.5 Análise Estatística..........................................................................................45

5. RESULTADOS......................................................................................................46

6. DISCUSSÃO..........................................................................................................53

7. CONCLUSÕES......................................................................................................57

8. REFERÊNCIAS......................................................................................................58

9. ANEXOS................................................................................................................68

10. MEMORIAL.......................................................................................................... 75

13

1. INTRODUÇÃO

Este estudo foi desenvolvido no município de Triunfo – Pernambuco, que está

situado a 449 km de Recife, na mesorregião do sertão pernambucano, microrregião do

Pageú, sendo limítrofe com a Paraíba e os municípios de: Calumbi, Flores e Santa Cruz

da Baixa Verde. Com uma altitude de mil metros e área de 182,2 km2 com temperatura

média anual de 22 ºC, onde vivem cerca de quinze mil pessoas, se apresenta

peculiarmente estável no cenário histórico do nordeste brasileiro. Nesse município é

registrada a ocorrência de diversas doenças crônico-degenerativas (DCDs), dentre elas

Diabetes Mellitus (DM) e outras mal diagnosticadas (Beltrão et al., 2005).

As DCDs são caracterizadas por uma evolução lenta e progressiva, apresentando

um longo período de latência assintomática. Essas doenças são relacionadas com idade,

sexo e genética, mas também sofrem grande influência dos fatores de risco, tais como

obesidade, hipertensão arterial, alto nível de colesterol, consumo de álcool e de tabaco.

As doenças neoplásicas, doenças cerebrovasculares, síndromes neurológicas e DM são

exemplos de DCDs.

A DM é uma condição grave e debilitante, que requer tratamento contínuo. É

preocupante saber que dados da OMS (Organização Mundial de Saúde) prevejam um

aumento no número de diabéticos de 171 milhões no ano de 2000 para 336 milhões em

2030, assemelhando-se a uma epidemia (Galindo et al., 2006). Embora a observação da

diabetes remonte aos primórdios da história no antigo Egito, o real entendimento da

doença veio com o avanço tecnológico e científico do século XX (Cruz, 2006). Devido à

alta freqüência e ao impacto da diabetes, a detecção precoce tem se tornado uma

importante meta de saúde pública. Concomitantemente ao desenvolvimento de

tecnologias para diagnosticar essa doença, recentes e contínuos avanços no campo da

genética molecular estão proporcionando a identificação de genes responsáveis pelas

formas hereditárias, permitindo a detecção precoce. Hoje é possível uma compreensão

ampla da diabetes do ponto de vista citológico, histológico e sistêmico, e se estar partindo

para descrever e predizer como a informação genética influencia a manifestação desta

doença.

O delineamento é dado em torno da Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2), por ser a maior

responsável pelo incremento da diabetes no mundo atual. Ambos os fatores genéticos e

14

ambientais estão envolvidos na patogênese desta doença. O gene fator de transcrição 2

semelhante ao 7 (TCF7L2) é aceito em todo o mundo como um fator genético para DM2.

Este gene mostrou associação com a probabilidade aumentada 30 - 50% para cada alelo

herdado de desenvolver DM2, aproximadamente o dobro do observado com a maioria dos

outros genes de susceptibilidade a esta doença (Hattersley, 2007). O gene TCF7L2 tem

como nome oficial transcription factor 7-like 2 (T-cell specific) e também é chamado TCF4.

Está localizado no braço longo do cromossomo 10 na região 10q25.3 (Duval et al., 2000).

Este estudo teve como objetivo a investigação da diabetes mellitus tipo 2 por

análise genético-populacional com a utilização de técnicas como PCR (Polymerase Chain

Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) em tempo real, sendo esta, uma

importante ferramenta diagnóstica na triagem e prevenção dessa doença crônico-

degenerativa. A parte mais importante do diagnóstico é sua capacidade preventiva, por

identificar primariamente o indivíduo que tem susceptibilidade à doença pode-se prover

um trabalho de atenção a este paciente em potencial antes que os sintomas comecem a

aparecer e desta forma retardar ao máximo o estabelecimento da moléstia.

15

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Doenças crônico-degenerativas

As doenças crônico-degenerativas (DCDs) são condições que conduzem a

progressiva deterioração em um ou mais dos aspectos clínicos, metabólicos ou

fisiológicos, que possa ser medida em uma escala contínua (Crews e James, 1991).

Clinicamente, o diagnóstico das DCDs é geralmente feito quando um parâmetro em

particular (exemplos: glicose sangüínea, colesterol sérico, densidade óssea, pressão

sanguínea) cresce acima ou cai abaixo de um determinado ponto de corte. A maioria das

DCDs não infecciosas resulta de uma série complexa de passos – ainda não muito bem

compreendida – que se iniciam em algum ponto desconhecido na vida do individuo e a

partir daí progridem por todo o restante de sua vida (Sing et al., 1985).

As DCDs comumente reconhecidas incluem as causas que conduzem à morte de

adultos que vivem em sociedades cosmopolitas do século XXI: doenças neoplásicas,

doenças cerebrovasculares, síndromes neurológicas (doença de Alzheimer e de

Huntington) e diabetes mellitus. Numerosas condições podem ser incluídas como DCDs,

sendo que as de maior importância atualmente são aquelas que conduzem à morbidade e

mortalidade, sendo também importantes os fatores de risco associados a estas

condições: hiperlipidemia, hipertensão, hiperinsulinemia e obesidade (Crews e James,

1991).

A epidemiologia das DCDs constitui uma grande promessa de investigações

colaborativas entre profissionais de saúde e pesquisadores biomédico-evolutivos. Os

fatores de risco para as DCDs não devem possuir a mesma influência em todos os grupos

étnicos e culturais. Neste contexto, os aconselhamentos médico e genético são de grande

importância. As fragilidades genético-evolutivas relacionadas a certas DCDs segregam

em famílias e indivíduos aparentados. O conhecimento de tal background familiar é uma

ferramenta muito importante para o aconselhamento baseado no estilo de vida e para a

prevenção. Deve-se acrescentar às análises clínicas o estilo de vida familiar, como parte

da avaliação inicial do paciente e integrar este conhecimento com protocolos preventivos

e de intervenção. A prevenção fará mais para reduzir os prejuízos das doenças e perda

de produtividade do que todas as intervenções secundárias atualmente disponíveis. Uma

16

melhor compreensão das bases genético-evolutivas das DCDs fornecerá a informação

adicional que os clínicos necessitam para avaliar, tratar e aconselhar seus pacientes

(Molnar, 1998).

Nos últimos anos a perspectiva evolutiva das doenças degenerativas tornou-se um

aspecto importante da biologia populacional (Armelagos, 1991; Crews e Gerber, 1994) e

os biologistas humanos examinaram e demonstraram a variação dos aspectos físicos e

da saúde dos grupos étnicos e das populações (Molnar, 1998). A revolução molecular

muito contribuiu para uma melhor compreensão de como a variação genética é

organizada e modificada, geração após geração, fornecendo novas ferramentas para a

compreensão da afinidade entre as populações e dos padrões das doenças. Esse avanço

também contribuiu para uma melhor compreensão da base genético-evolutiva das DCDs

específicas. Isto é muito útil para informar aos praticantes que as diferentes populações,

grupos étnicos ou sexos, podem responder diferentemente a um mesmo estilo de vida ou

a uma mesma intervenção farmacêutica. Uma perspectiva evolutiva pode ainda ajudar

aos profissionais de saúde a aconselhar seus pacientes, explicando como o estilo de vida

e o comportamento podem influenciar a longevidade e a saúde. Consequentemente, uma

perspectiva evolutiva fornece a base genética para explicar aos pacientes e suas famílias

os aspectos das doenças herdadas.

2.2 Diabetes Mellitus

Diabetes Mellitus (DM) é uma doença sistêmica que envolve alterações no

metabolismo de carboidratos, lipídios, proteínas e eletrólitos, possuindo caráter crônico e

degenerativo. Caracteriza-se por deficiência de secreção e/ou de ação da insulina com

conseqüente hiperglicemia (Aquino et al., 2003). Também é um termo diagnóstico para

um grupo de doenças caracterizadas pela homeostase anormal da glicose, resultando em

sua elevação na corrente sanguínea. Não se trata, nesse caso, de uma única doença,

mas de um grupo heterogêneo de doenças, cujos indivíduos afetados possuem em

comum a intolerância a glicose (Aguiar e Silva, 2006). Trata-se então de uma doença - ou

grupo de doenças metabólicas - caracterizada pelo início lento dos sintomas e pelo difícil

controle glicêmico. A modernização da dieta, com aumento dos teores de gordura e

açúcar, é responsável pelo aumento da prevalência e avanço desta doença a cada ano

(Aquino et al., 2003).

17

A DM acarreta um grande impacto econômico para as nações. Só nos Estados

Unidos, os custos diretos e indiretos com a doença em 2002 foram estimados em 132

bilhões de dólares (American Diabetes Association, 2003) e cresceram de forma

significativa, atingindo no ano de 2007 gastos equivalentes a 174 bilhões de dólares ao

ano (American Diabetes Association, 2008). A importância da diabetes se encontra,

sobretudo, na perspectiva do desenvolvimento das complicações. Por sua freqüência e

gravidade, destacam-se as complicações crônicas. A prevalência de complicações

diabéticas varia, podendo esse fato ter como razões tanto a variabilidade na

susceptibilidade genética entre as populações, como as diferenças metodológicas no

diagnóstico das mesmas. As complicações crônicas, tanto as microvasculares (nefropatia,

retinopatia e neuropatia) como as macrovasculares (eventos cardio e cerebrovasculares),

proporcionam altas morbimortalidade e ônus sócio-econômico (Gross et al., 2005).

2.3 Histórico da Diabetes

Segundo Cruz (2006), a maneira mais didática para se entender a história da

diabetes é dividindo-a em cinco períodos: descritivo, diagnóstico, experimental,

terapêutico e das complicações crônicas.

O Período Descritivo foi o mais longo, foi de 1500 a.C a 1675 d.C e começou com a

descrição contida no papiro de Hesy-Ra. Neste se encontravam descritos sintomas que

pareciam corresponder à diabetes, tais como uma grande excreção de urina (poliúria). O

escrito propôs ainda tratar a poliúria com grãos de trigo, frutas e cerveja doce. Apenas

com Thomas Will na Inglaterra houve um reconhecimento da diabetes como doença do

sangue, e não dos rins. Além disso, Will diferenciou com a descoberta do sabor doce da

urina, o que se chama diabetes mellitus, do que se conhece como diabetes insipidus.

Esse pesquisador costumava prescrever dieta hipoglicídica, limonada, antimônio e ópio.

Suas descrições encerraram o período antigo da história da diabetes.

O Período Diagnóstico estendeu-se de 1675 até o início do século XIX e começou

com Brünner, realizando pancreatectomias em animais de experimentação, causando

poliúria e polidipsia, embora não tenha feito relação com a diabetes. Em 1796, John Rollo

propôs restrição de carboidratos no tratamento da diabetes mellitus e reforçou a descrição

do hálito cetonêmico como um caráter diagnóstico específico, além de sugerir que a

doença tinha origem no estômago e não no rim.

18

O Período Experimental, também chamado de Empírico (século XIX), foi marcado

pelo avanço científico, com o surgimento de disciplinas modernas como a bioquímica e a

fisiologia, que facilitaram o entendimento da DM, fornecendo também fundamentos mais

sólidos para o conhecimento atual a respeito da mesma. De uma lista grande de

descobertas e avanços, precisa-se destacar: a identificação da glicosúria (por Peligot em

1838) e os métodos para determiná-la; a separação mais detalhada dos tipos principais

de DM, atualmente chamadas 1 e 2; a função glicogênica do fígado e sua alteração na

DM; a caracterização da cetoacidose e as suas anormalidades bioquímicas; a descoberta

das ilhotas pancreáticas (por Paul Langerhans em 1869) e de sua função endócrina, o

estímulo experimental de DM pela pancreatectomia em animais. O tratamento, até então

empírico, girou em torno da restrição glicídica com dias de jejum forçado e a oferta

exagerada de açúcar como compensação das perdas urinárias.

O Período Terapêutico, também chamado Período de Tratamento Eficiente,

estendeu-se pelo século XX e foi marcado por importantes descobertas bioquímicas,

fisiológicas, farmacológicas e terapêuticas, dando nome ao período. Embora ainda

experimental esta etapa foi eficiente quanto ao tratamento da afecção.

O Período das Complicações Crônicas vem merecendo cuidados especiais e

perdura até os dias atuais. Grandes ensaios clínicos têm demonstrado o efeito benéfico

do tratamento intensivo da diabetes mellitus, tanto no tipo 1 quanto no tipo 2, e a

necessidade de enfrentar as co-morbidades da DM2 para melhorar o prognóstico. Esse

tem sido o período da junção das disciplinas científicas, tais como citologia, histologia,

fisiologia, patologia e genética, em busca da prevenção, diagnóstico, monitoramento e

possíveis meios de cura da DM.

O grande marco desta época foi o desenvolvimento da genética, com a síntese da

insulina in vitro, tornando o meio terapêutico mais eficiente, somado a educação

direcionada (Notelovitz, 1970; American Diabetes Association, 1986; Von Engelgart, 1989;

Medvei, 1993; Krall et al., 1994; Cruz, 2006).

19

2.4 Prevalência da Diabetes

Espera-se que, entre os anos de 1995 e 2025, a prevalência da diabetes mellitus

apresente um aumento de 35% em todo o mundo e que o número de pessoas atingidas

por esta doença seja superior a 300 milhões (Galindo et al., 2006). Dados da OMS

prevêem que a prevalência da DM, para todas as idades no mundo inteiro, passará de

2,8% em 2000 para 4,4% em 2025, o que representará um aumento do número de

diabéticos de 171 milhões no ano de 2000 para 336 milhões em 2025 (Wild et al., 2004),

assemelhando-se a uma epidemia, como pode ser observado na Figura 1. A prevalência

desta doença nos países com estilo de vida ocidental é estimada em 6 a 7,6%. Estudos

realizados em 2002 mostraram que aproximadamente 50% das pessoas com diabetes

desconheciam o seu diagnóstico, portanto não se cuidavam e estavam sujeitas a todas as

complicações por estarem expostas a todos os fatores de risco (Reinauer et al., 2002).

Figura 1: Prevalência da diabetes esperada, no mundo, até 2025. Fonte: International Diabetes Federation, 2007. http://www.news.med.br/fmfiles/index.asp/::XPRM::/news/diabetes2025.jpg

No Brasil, a prevalência de diabetes na população com mais de 18 anos de idade

foi estimada pela Vigilância de Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (VIGITEL),

realizada em 2008, indicando que 5,2% (IC 95%: 4,8 - 5,5) dos adultos apresentam

20

diabetes (Brasil. Ministério da Saúde, 2009). Isto corresponde a mais de 6,8 milhões de

brasileiros. Os procedimentos de amostragem empregados pela VIGITEL visaram obter,

em cada uma das capitais dos 26 estados brasileiros e no Distrito Federal, amostras

probabilísticas da população de adultos residentes em domicílios servidos por pelo menos

uma linha telefônica fixa. Ainda que a frequência estimada na VIGITEL pelo relato de

diagnóstico médico prévio de diabetes possa subestimar a prevalência real dessa doença

na população, a magnitude observada aponta a necessidade de investigação e ações em

saúde pública para a prevenção da diabetes.

2.5 Tipos de Diabetes Mellitus

Segundo Halpern et al. (2000), a classificação da diabetes mellitus foi modificada e

não possui mais os termos insulinodependente e não-insulinodependente, e sim diabetes

do tipo 1 e tipo 2. As diversas sociedades de diabetes incorporam para classificação o

conceito de estágios clínicos, desde a normoglicemia, passando pela tolerância diminuída

à glicose e glicemia de jejum alterada, até a instalação da diabetes em si (Tabela 1),

baseando-se na etiologia dessa doença.

Tabela 1: Classificação da diabetes mellitus.

Tipo 1: Destruição da célula beta, geralmente ocasionando deficiência absoluta de insulina, de

natureza auto-imune.

Tipo 2: Varia de uma predominância de resistência insulínica com relativa deficiência de

insulina a um defeito essencialmente secretório, com ou sem resistência insulínica.

Outros tipos:

- Defeitos genéticos funcionais da célula beta;

- Defeitos genéticos na ação da insulina;

- Doenças do pâncreas exócrino;

- Endocrinopatias;

- Induzidos por fármacos e agentes químicos;

- Infecções;

- Formas incomuns de diabetes imunomediadas.

Pré-diabetes: Ocorre quando uma pessoa tem níveis de glicemia acima do normal, mas não

suficientes para o diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2.

Fonte: Sociedade Brasileira de Diabetes (2002); American Diabetes Association (2005).

21

2.5.1 Diabetes Mellitus tipo 1

A Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) corresponde a 5 – 10% dos casos de diabetes e

resulta primariamente da destruição das células pancreáticas possuindo como

complicação aguda a cetoacidose diabética. A causa mais comum deste tipo é a

destruição auto-imune das células beta do pâncreas, entretanto podem-se encontrar

casos em que o quadro auto-imune não é detectado e a destruição pancreática não é

conhecida. A susceptibilidade a esta doença pode ser verificada através de exames

sorológicos que sinalizam o processo auto-imune nas células beta, bem como através de

marcadores genéticos (Libman et al., 1998).

A DM1 é caracterizada pela deficiência da secreção de insulina podendo ter

diagnóstico imediato após sua instalação, sendo frequentemente observada em crianças

e adolescentes. Embora também possa se iniciar na idade adulta, isso vai depender da

velocidade da destruição das células beta pancreáticas (Galindo et al., 2006).

Denomina-se diabetes 1A, quando há destruição auto-imune das células beta e

insuficiência completa de insulina, sendo geralmente crônica. Entretanto, existem

pacientes que apresentam um quadro clínico de diabetes decorrente de destruição das

células beta sem evidência de agressão imune, sendo classificada como diabetes tipo 1B

ou idiopática (Libman et al., 1998).

2.5.2 Diabetes Mellitus tipo 2

A diabetes mellitus tipo 2 (DM2) pode ser entendida como a resistência, herdada

ou adquirida, à insulina. A incidência é alta em indivíduos obesos com vida sedentária,

pois a obesidade e o sedentarismo em si levam a resistência à insulina. Se existir uma

disfunção herdada das células beta com redução na secreção de insulina, ocorrerá a DM2

(Aquino et al., 2003).

Mais de 85% dos casos de diabetes são do tipo 2 e essa forma é a principal

responsável pelo aumento epidêmico do número de diabéticos no mundo atual, em

especial por estar intimamente relacionada à obesidade e ao sedentarismo, fatores

comuns aos dias de hoje (American Diabetes Association, 2008).

22

No início da doença, a maior parte dos pacientes apresenta redução do efeito da

insulina em seus alvos (tecidos adiposo e muscular), ainda existe a produção de insulina,

mas em quantidades insuficientes para a demanda diária. Mesmo assim, a maioria não

precisa ser tratada com insulina. Os níveis normais de glicemia podem ser mantidos com

atividade física regular, controle do peso e medicação oral (Aita et al., 2004).

2.6 Monitoramento dos diabéticos

O monitoramento dos diabéticos é feito através do exame de quantificação da

hemoglobina glicosilada, também conhecida como HbA1c, a qual indica o controle do nível

de açúcar no sangue de um paciente nos últimos 2-3 meses. HbA1c é um complexo

estável formado quando a glicose no sangue se liga irreversivelmente à hemoglobina.

Como o tempo normal de vida das células vermelhas no sangue é de 90 - 120 dias, a

HbA1c somente será eliminada quando as células vermelhas forem substituídas

(Sociedade Brasileira de Diabetes, 2002).

Os valores da hemoglobina glicosilada são diretamente proporcionais à

concentração de glicose no sangue durante a vida das células vermelhas no sangue. Os

valores da HbA1c não estão sujeitos às flutuações observadas no monitoramento diário da

glicose no sangue. O valor é um índice da glicose no sangue nos últimos 2 - 3 meses,

embora seja mais influenciada pelos valores mais recentes da glicose. Estes valores

mostram os últimos 30 dias com um peso de 50% da HbA1c, os 60 dias precedentes com

um peso de 25% do valor e os 90 dias precedentes com 25% do valor (Sociedade

Brasileira de Diabetes, 2002). Esta propensão deve-se à natural destruição e reposição

das células vermelhas do sangue pelo corpo. Como as células vermelhas são

constantemente destruídas e substituídas, não duram 120 dias para gerar uma alteração

clinicamente significativa na HbA1c, seguindo uma mudança expressiva na média da

glicose no sangue.

A Associação Americana de Diabetes (ADA) recomenda a hemoglobina glicosilada

como melhor teste para saber se o açúcar no sangue de um paciente está sob controle

todo o tempo. O teste deve ser executado a cada três meses em pacientes

insulinodependentes, durante mudanças de tratamento, ou quando a glicose do sangue

23

está elevada. Para pacientes tratados com drogas orais, a frequência recomendada é de

pelo menos duas vezes ao ano (American Diabetes Association, 2005).

Estudos realizados pelo DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) e pelo

UKPDS (United Kingdom Prospective Diabetes Study) mostraram que quanto mais baixos

os níveis da hemoglobina glicosilada, maiores as chances de desacelerar ou evitar o

desenvolvimento de graves complicações diabéticas, tais como: doenças oculares, renais

e neurais. Os estudos também mostraram que qualquer melhora nos níveis da HbA1c

pode reduzir essas complicações (American Diabetes Association, 2005).

2.7 Genética da Diabetes

A diabetes mellitus é uma doença heterogênea, sabendo-se que aqueles três

grupos principais e outros subtipos (Tabela 1) possuem diferenças clínicas e quanto à

herança genética. Além desses três tipos, a diabetes pode ser secundária a diversas

doenças ou ser componente de mais de 80 síndromes já descritas (Possum, 1994).

Denomina-se heterogênea, uma doença que possui mais de uma etiologia, genética ou

ambiental. Quando uma doença pode ser determinada por genes diferentes, classifica-se

a heterogeneidade lócica. Quando é resultado de mutações diferentes num mesmo gene

classifica-se a heterogeneidade alélica (Nussbaum et al., 2001).

Quando a doença resulta da interação entre fatores genéticos e ambientais, ela é

dita multifatorial. Geralmente o componente genético é poligênico, ou seja, dependente de

vários genes. A combinação de fatores genéticos e ambientais determina, para cada

indivíduo, um grau de susceptibilidade, quando este ultrapassa um limiar a doença se

expressa (Aguiar e Silva, 2006).

2.7.1 Bases genéticas da DM1

Na maior parte dos relatos de DM1, encontrou-se um histórico familiar positivo para

diabetes em 25-50% dos afetados, contra um histórico familiar de menos de 15% em não-

diabéticos. A concordância chega a 50% entre gêmeos monozigóticos e de 3-37% entre

dizigóticos. Sugere-se que haja influência de um componente genético, porque a

24

incidência da doença é diferente nas diversas populações ou etnias (Karvonen et al.,

1994). Por outro lado, o risco de recorrência em parentes de primeiro grau (pais, filhos e

irmãos) é de aproximadamente 5%, muito inferior aos índices de 25 a 50% das doenças

monogênicas. Assim, um modelo de doença multifatorial é sugerido porque existem

componentes genéticos e ambientais envolvidos com um alto risco de recorrência, porém

menor que o observado em doenças monogênicas (Eisenbarth, 1986).

Na procura por evidências de fatores que conferem susceptibilidade ou resistência

a diabetes mellitus, estudos de associação e de ligação reconheceram vários locos

identificados pela abreviatura IDDM (Diabetes mellitus dependente de insulina) seguida

de um número cardinal oriundo da ordem em que esses locos foram relatados. O fator de

susceptibilidade mais importante associado à diabetes situa-se no complexo maior de

histocompatibilidade humana (HLA). Este foi chamado de IDDM1 e contribui com

aproximadamente 50% dos casos nas famílias. Mais de 90% dos indivíduos que

desenvolvem diabetes têm os haplótipos DR3(17)-DQA1*0501-DQB1*02 ou DR4*0401/4-

DQA1*0301-DQB1*0302, contra 40% dos controles normais, sendo que o risco de

diabetes nos heterozigotos compostos com DR3 e DR4 é significativamente maior que

nos homozigotos para os haplótipos (Told e Bain, 1992).

2.7.2 Bases genéticas da DM2

Fatores genéticos e ambientais estão envolvidos na patogênese da DM2, sendo

que a importância da hereditariedade na DM2 se apóia em vários fatos descritos: a) a

concordância entre gêmeos monozigóticos para a DM2 é de 50-80%, sendo muito

superior à observada entre gêmeos dizigóticos (menos de 20%); b) estudos

epidemiológicos demonstram haver uma grande variação na prevalência da DM2 em

diferentes grupos étnicos, desde valores baixos como 1% em populações orientais até

cerca de 50% em grupos isolados como os índios Pima do Arizona; c) resultados positivos

de numerosos estudos genéticos (McCarthy et al., 1994; Defronzo, 1997; Ferrannini,

1998; Lowe, 2001).

A DM2 possui inúmeros subtipos. Nas formas tardias existe uma clara interação

dos fatores ambientais e genéticos, isso fica evidente quando se observa os estudos

feitos entre japoneses, população com baixa prevalência da doença onde foi demonstrado

25

um aumento significativo do número de indivíduos afetados nas famílias que adotaram o

estilo de vida ocidental após a migração para países do ocidente (Ferreira et al, 1996).

Em outros subtipos mais raros de DM2, observa-se um efeito quase que

exclusivamente genético, com pouca interferência dos fatores ambientais (formas

monogênicas). Recentemente foram elucidados alguns genes causadores das formas

monogênicas da DM2. No entanto, na grande maioria dos casos de DM2 a hiperglicemia

é secundária a defeitos em um grupo de genes (formas poligênicas), no entanto ainda não

se conhece quantos e quais os genes envolvidos. Nas formas monogênicas, que

representam entre 5-10% dos casos de diabetes, uma mutação em um só gene

transmitido de forma autossômica dominante é suficiente para promover a hiperglicemia

(Reis e Velho, 2002).

O início da doença é frequentemente precoce e com forte penetrância. Exemplos

de formas monogênicas de diabetes são bem representados pela MODY (Maturity Onset

Diabetes of the Young), por mutações no gene do receptor da insulina e no gene da

insulina (síndromes raras), diabetes de origem mitocondrial e também pela chamada

síndrome de Wolfram (diabetes, atrofia óptica, surdez neurossensorial), cujo gene

responsável é chamado de WFS1, localizado no braço curto do cromossomo 4. A função

da proteína codificada por este gene ainda não foi identificada (Reis e Velho, 2002).

A MODY é a forma monogênica mais frequente representando 3-5% de todos os

casos diagnosticados como DM2. O fenótipo dos pacientes MODY é caracterizado por

uma hiperglicemia crônica de origem não auto-imune, sendo que nas formas mais graves

acarreta o desenvolvimento das complicações crônico-degenerativas da mesma forma

que no DM2 clássico de início mais tardio. Do ponto de vista fisiológico, os pacientes

portadores de MODY apresentam concentrações normais ou baixas de insulina,

demonstrando uma anomalia primária na secreção da mesma (Reis e Velho, 2002).

A MODY é clínica e geneticamente heterogênea. Até o momento são conhecidos

seis genes relacionados com seu desenvolvimento. A MODY2 é causada por mutações

no gene codificador para a enzima glicoquinase, enquanto as demais formas de MODY

são secundárias a mutações em fatores de transcrição expressos nas células beta

pancreáticas: HNF-1α (MODY3), IPF-1 (MODY4), HNF-1β (MODY5) E NEUROD1

(MODY6). Porém, há famílias com características clínicas de MODY nas quais não se

encontraram mutações em qualquer dos genes acima, indicando haver outros genes

ainda por serem identificados – MODY-X (Reis e Velho, 2002).

26

Cada subtipo de MODY possui características particulares no que se refere à idade

do diagnóstico, tendência às complicações crônicas, déficit secretório de insulina,

fisiopatologia e magnitude da hiperglicemia. Do ponto de vista clínico, podem-se dividir os

subtipos de MODY em dois grupos principais: aquele secundário às mutações nos fatores

de transcrição com hiperglicemia mais grave, início pós-puberal e piora progressiva da

secreção de insulina; e o outro com hiperglicemia leve ou intolerância à glicose, iniciando

nos primeiros anos de vida sem piora da secreção de insulina (Reis e Velho, 2002).

Outra forma monogênica bem estudada é a chamada diabetes mitocondrial. Várias

síndromes causadas por mutações pontuais, deleções ou duplicações no DNA

mitocondrial (mtDNA) são conhecidas. Nestas doenças ocorre uma redução da

fosforilação oxidativa celular, sendo frequente a presença de diabetes nos indivíduos

afetados. De transmissão exclusivamente materna, esta forma de diabetes cursa também

com perda auditiva (Reis e Velho, 2002).

Identificou-se perto de 40 mutações pontuais no mtDNA em indivíduos

apresentando diabetes de transmissão materna, mas apenas uma dentre elas foi

sistematicamente analisada. Esta mutação na posição 3243 do tRNA da leucina

[tRNALeu(UUR)] representa a causa de cerca de 1% dos casos de diabetes em algumas

populações. A hiperglicemia na diabetes mitocondrial, que frequentemente evolui para

necessidade de administração de insulina, é secundária aos mecanismos complexos e

multifatoriais. Os defeitos incluem redução da produção de insulina, glicotoxicidade e

mesmo resistência à insulina. Entretanto, um defeito na secreção de insulina estimulada

pela glicose parece ser, nestes casos, a anormalidade primária (Reis e Velho, 2002).

Nas formas poligênicas de DM2, é importante notar que a manutenção da glicemia

é secundária à interação de genes expressos em diferentes células, como por exemplo:

hepatócitos, adipócitos, células beta pancreáticas e da musculatura esquelética. Os

poligenes relacionados à DM2 estão presentes em todos estes tecidos. Estes genes

desfavoráveis atuam gerando fenótipos intermediários da diabetes que irão influenciar a

homeostase glicídica ante a massa gordurosa, sensibilidade à insulina e padrão secretório

da insulina. Nestas formas mais comuns de DM2 cada um dos genes menores gera

individualmente um efeito muito limitado para o risco do desenvolvimento da doença.

Porém, quando transmitidos simultaneamente a um mesmo indivíduo estes efeitos

genéticos, potencialmente deletérios, serão expressos clinicamente se houver a presença

de fatores ambientais desfavoráveis. Postula-se também que, junto com os genes

27

menores possa haver alguns genes defeituosos com efeito fenotípico mais acentuado.

Desta mesma forma, uma grande parcela dos indivíduos pode ser susceptível à diabetes

mellitus por adotarem hábitos de vida favoráveis ao desenvolvimento desta doença. Esta

observação é de grande importância epidemiológica e poderia justificar o aumento

surpreendente dos casos de obesidade e diabetes em algumas populações que alteraram

dramaticamente seu estilo de vida nas últimas décadas (Lowe, 2001).

2.8 Genes associados a DM2

A identificação de genes de susceptibilidade pode ser realizada, de modo geral, por

dois métodos: Genome Wide Screen (GWS) e pesquisa de genes candidatos. O método

GWS permite a identificação de qualquer gene ou sequência reguladora sem que haja um

conhecimento prévio de sua função, ou seja, o genoma é analisado sem que haja uma

hipótese inicial referente aos genes envolvidos na doença. Enquanto que na estratégia

dos genes candidatos, os genes que serão estudados são selecionados se sua função

biológica sugerir que este possa estar envolvido com a doença (candidatos biológicos) ou

caso pertençam a uma região previamente identificada por clonagem posicional

(candidatos posicionais), depois são avaliadas nesses genes as associações entre um ou

mais polimorfismos e o fenótipo da doença (Videira et al., 2006).

Segundo Zeggini et al. (2007), com o advento do método GWS houve um aumento

no número dos locos mais importantes relacionados a DM2, passando de três (PPARG,

KCNJ11, TCF7L2) para nove (com a adição dos locos CDKAL1, IGF2BP2, CDKN2A/B,

HHEX/IDE, FTO e SLC30A8). Este estudo aumentou o entendimento da etiologia

genética e tem fornecido um modelo através do qual outros estudos podem ser

conduzidos.

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) é um banco de dados que se propõe

a disponibilizar informações sobre todas as descobertas de genes relacionados a

doenças. Segundo OMIM2, foram catalogados, até novembro de 2010, 62 genes

relacionados com a diabetes mellitus (Tabela 2).

2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=OMIM

28

Tabela 2: Genes associados à diabetes mellitus e sua respectiva denominação.

GENE DENOMINAÇÃO

GPD2 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 (mitocondrial)

NEUROD1, NIDDM Neurogenic differentiation 1

IRS1 Insulin receptor substrate-1

IGF2BP2, IMP2 Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 2

WFS1, WFRS, WFS, DFNA6 Wolframin

NIDDM4 Noninsulin-dependent diabetes mellitus 4

CDKAL1, CDK5 Regulatory subunit-associated protein 1-like 1

VEGF Vascular endothelial growth factor

ENPP1, PDNP1, NPPS, M6S1,

PCA1 Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (antígeno Ly-41)

GCK, HHF3 Glucokinase (hexokinase-4)

TCF7L2, TCF4 Transcription factor 7-like 2

ABCC8, SUR, PHHI, SUR1, HHF1,

TNDM2 ATP-binding cassette, subfamília C, membro 8 (sulfonylurea receptor)

KCNJ11, BIR, PHHI, HHF2,

TNDM3 Potassium inwardly-rectifying channel, subfamília J, membro 11

MAPK8IP1, IB1 Mitogen-activated protein kinase 8-interacting protein 1

TCF1, HNF1A, MODY3 Interferon production regulator factor (HNF1), albumin proximal factor

IPF1 Insulin promoter factor 1, homeodomain transcription factor

IRS2 Insulin receptor substrate 2

TCF7L2, HNF2, MODY5, FJHN Transcription factor-2; LF-B3; variant hepatic nuclear factor

GCGR Glucagon receptor

RETN, RSTN, FIZZ3 Resistin

AKT2 Murine thymoma viral (v-akt) homolog-2

HNF4A, TCF14, MODY1 Hepatocyte nuclear factor 4, alpha (transcription factor-14)

NIDDM3 Noninsulin-dependent diabetes mellitus 3

Destes genes representados na tabela 2, o TCF7L2 tem sido o mais relacionado

com essa doença, mostrando associação com a probabilidade de desenvolver DM2

aumentada de 30 a 50% para cada alelo herdado, aproximadamente o dobro do

observado com a maioria dos outros genes de susceptibilidade (Hattersley, 2007), tais

como: PPARG, FTO, CAPN10, HNF1A (Figura 2).

29

Figura 2: Cronologia da descoberta dos genes associados a DM2 através do ano de publicação definitiva e tamanho aproximado do efeito. Fonte: Florez (2008).

2.9 Gene TCF7L2

Diante do vasto manancial de descobertas na genética, um dos genes de maior

associação com DM2 é o fator de transcrição 2 semelhante ao 7 (TCF7L2). Esse gene foi

identificado através de estudos de ligação e foram confirmados através do método do

gene candidato (Cox e Freeman, 2006).

O gene TCF7L2 tem como nome oficial transcription factor 7 - like 2 (T-cell specific,

HMG-box) e também é chamado TCF4. Este gene abrange uma região de 215.863 bases

no braço longo do cromossomo 10 na posição q25.3 (Figuras 3 e 4), consistindo de 14

éxons e 13 íntrons (Duval et al., 2000; Damcott et al., 2006).

30

Figura 3: A) Idiograma mostrando a localização do gene TCF7L2 na região 10q25.3. B) Posição do gene TCF7L2 no braço longo do cromossomo 10 - barras horizontais vermelhas indicam a região codificadora. C) Localização exata do gene TCF7L2 no cromossomo 10.

Figura 4: Genes vizinhos ao TCF7L2, bem como suas localizações no cromossomo (pontos azul-claros) - em destaque o gene TCF7L2 (quadro vermelho).

31

O gene TCF7L2 é membro da família do fator de célula T (TCF), que desempenha

papel na ativação de muitos genes a partir da via de sinalização Wnt (Figura 5), tendo

importante influência no aumento da susceptibilidade a DM2 (Nelson e Nusse, 2004;

Prunier et al., 2004; Papadopoulou e Edlund, 2005; Yi et al., 2005; Damcott et al., 2006;

Helgason et al., 2007).

Figura 5: Representação esquemática da via de sinalização Wnt, que é fundamental para o crescimento e o desenvolvimento. A família TCF desempenha papel na ativação de muitos genes envolvidos na regulação do crescimento e diferenciação, bem como a expressão e secreção do hormônio GLP-1 nas células endócrinas do intestino. Fonte: Adaptado de Smith (2007).

Estudos propõem que a via de sinalização Wnt tem um papel na regulação da

função secretora das células β pancreáticas maduras. O primeiro relato surgiu a partir da

deleção do co-receptor Wnt, o LRP5, em ratos, levando a alterações no metabolismo da

glicose e do colesterol, ocorrendo intolerância à glicose frente a uma dieta padrão normal

(Fujino et al., 2003). Experimentos in vitro utilizando ilhotas pancreáticas isoladas desses

animais indicaram uma reduzida secreção de insulina estimulada pela glicose, que se

correlaciona com uma diminuição na expressão de vários genes específicos das células β

pancreáticas, incluindo o gene da glicoquinase, membros da família dos fatores de

transcrição do fator nuclear hepático (HNF) e genes envolvidos na sinalização insulínica.

Ainda evidenciado em ilhotas isoladas de ratos e humanos, nas quais a redução do gene

32

TCF7L2 diminui a expressão do gene da insulina, a secreção de insulina estimulada pela

glicose e o nível da proteína PDX1 - Pancreatic and Duodenal Homeobox 1, necessária

para o desenvolvimento e maturidade das células β pancreáticas (Shu et al., 2008).

O gene TCF7L2 está envolvido na manutenção da expressão de genes das células

β que regulam a fusão de grânulos de secreção. A exocitose defeituosa da insulina pode,

assim, acentuar a incidência de diabetes nos portadores dos alelos de risco do gene

TCF7L2. Estudos em humanos com polimorfismos do gene TCF7L2 e predispostos ao

DM2 evidenciaram intolerância à glicose em resposta ao teste oral de tolerância à glicose,

mas não ao teste intravenoso. Isso sugere um defeito na rede de comunicação neural e

endócrina entre o intestino e as ilhotas pancreáticas que provoca a elevação da secreção

de insulina em resposta à alimentação (Lyssenko et al., 2007; Schafer et al., 2007). O

hormônio Glucagon Like Peptide-1 (GLP-1) é um componente central deste eixo.

O GLP-1 é liberado pelas células endócrinas do intestino em resposta à ingestão

de alimentos e atua sobre as células β pancreáticas potencializando a secreção de

insulina estimulada pela glicose (Baggio e Drucker, 2007). Foi proposto que o defeito na

tolerância à glicose oral em pacientes com variantes TCF7L2 é resultado da deterioração

da secreção do GLP-1 pelas células intestinais. Isto é baseado em um estudo implicando

a via Wnt na regulação célula-específica do gene do pró-glucagon (glu), precursor do

GLP-1 (Prunier et al., 2004; Yi et al., 2005). Como um fator de transcrição, o gene

TCF7L2 foi considerado essencial para a expressão de glu, portanto, para a síntese do

GLP-1, em uma linhagem de células endócrinas do intestino (Yi et al., 2005).

Além do seu potencial papel na regulação da secreção de insulina estimulada pela

glicose, evidências indicam que a via Wnt está envolvida na sobrevivência das células β

pancreáticas. Ativação da sinalização Wnt em linhagens de células β de ratos resultam

em aumento na sua proliferação (Cozar-Castellano et al., 2006; Rulifson et al., 2007;

Schinner et al., 2008). Além disso, o aumento da expressão de β-catenina em ilhotas in

vivo provoca uma expansão da massa de células β funcionantes (Rulifson et al., 2007). A

depleção do gene TCF7L2 em ilhotas humanas provocou diminuição na proliferação das

células β pancreáticas, aumento nos níveis de apoptose e diminuição drástica nos níveis

de AKT (proteína quinase B), um importante fator de sobrevivência das células β e a

super expressão do gene TCF7L2 tanto em ilhotas de ratos como em humanos, protegem

as células contra toxidade induzida pela glicose e citoquinas, com uma redução na

atividade de caspase 3 e níveis de apoptose (Shu et al., 2008).

33

A primeira publicação sobre a relação entre TCF7L2 e DM2 foi produzida por Grant

et al. (2006). Desde esta publicação, uma série de pesquisas em todo o mundo tem sido

feita para elucidar a importância do gene TCF7L2 na patogênese do DM2. Os estudos

que analisaram a associação do TCF7L2 no desenvolvimento de DM2, entre os anos de

2006 e 2010, estão resumidos na Tabela 3.

Tabela 3: Uma análise resumida da associação entre diabetes mellitus tipo 2 e o gene TCF7L2.

Referências SNP Alelo Associação TCF7L2/DM2

Valor p População Amostral

Damcott et al. 2006

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205

T T C G

Presente Presente Presente Ausente

8×10-3

4×10

-2

1×10-2

7×10

-2

Amish (n=618)

Grant et al. 2006

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205 rs7895340

T T C C A

Presente Presente Presente Presente Presente

1.6×10-9

4.8×10-8

3.5×10

-9

9.7×10-5

9.7×10

-5

Islândia (n=2116)

Grant et al. 2006

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205 rs7895340

T T C C A

Presente Presente Presente Presente Presente

1.8×10-3

4.1×10

-3

7.2×10-3

3.9×10

-3

2.6×10-3

Dinamarca (n=767)

Grant et al. 2006

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205 rs7895340

T T C C A

Presente Presente Presente Presente Presente

1.6×10-7

9.4×10-9

5.9×10

-6

9.5×10-3

9.8×10

-3

EUA (n=891)

Groves et al. 2006

rs7903146 rs12255372 rs4506565 rs12243326

T T T C

Presente Presente Presente Presente

1.3×10-11

2.2×10

-8

1.6×10-11

4.3×10

-9

Reino Unido

(n=4732)

Humphries et al. 2006 rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

3×10-3

8×10

-3

Reino Unido

(n=2676)

Melzer et al. 2006 rs7903146 T Presente 2.3×10-2

Itália

(n=1155)

Scott et al. 2006

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205 rs7895340 rs7079711 rs11196192 rs11196213 rs11196175 rs11196181 rs17747324 rs7896811 rs11196199 rs17685538 rs11196228 rs290494 rs1555485

T T C C A G G T C G C C A C T G G

Presente Presente Presente Presente Presente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente

4.2×10-4

2.6×10

-4

4.2×10-3

3×10

-2

2.9×10-2

3×10

-1

8×10-2

4.9×10

-2

7×10-2

9.4×10

-1

5.4×10-3

9.3×10

-1

6.5×10-1

1.4×10

-1

1.5×10-2

1.8×10

-1

8.2×10-1

Finlândia (n=2104)

34

Zhang et al. 2006 rs12255372 T Presente <1×10-4

EUA

(n=3520)

Bodhini et al. 2007 rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

1×10-4

1×10

-3

Índia (n=2069)

Chang et al. 2007

rs7903146 rs12255372 rs7895340 rs7079711 rs4506565 rs11196192 rs12243326 rs11196213 rs7919409 rs11196219 rs4918792 rs10749127 rs11196224 rs7085532 rs17130188 rs10787475 rs12775879 rs290489 rs290487 rs290481

C G G G A T T C T G A C C G T T T G T A

Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Presente Presente

3.6×10-1

4.3×10

-1

3.5×10-1

8.6×10

-1

4.2×10-1

3.1×10

-1

5.8×10-1

1.6×10

-1

4.7×10-1

5.5×10

-2

6.9×10-1

2.2×10

-1

8×10-1

6.3×10

-1

1.5×10-1

1×10

-1

1.6×10-2

4.4×10

-1

2.1×10-3

2.1×10

-2

China (n=1520)

Chandak et al. 2007 rs7903146 rs12255372 rs4506565

T T T

Presente Presente Presente

3×10-5

4×10

-5

2×10-5

Índia (n=1354)

De Silva et al. 2007 rs7903146 T Presente 2×10-4

Reino Unido

(n=3167)

Hayashi et al. 2007

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205

T T C C

Presente Presente Presente Presente

5.1×10-2

2.4×10

-3

4.39×10-2

8.5×10

-3

Japão (n=2694)

Helgason et al. 2007 rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

6.5×10-13

3.37×10

-8

Dinamarca (n=3549)

Helgason et al. 2007 rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

5.2×10-15

8.9×10

-12

Islândia (n=11135)

Helgason et al. 2007 rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

2.1×10-4

4.4×10

-2

Oeste da África

(n=1069)

Horikoshi et al. 2007

rs7903146 rs12255372 rs11196205 rs7895340

T T C A

Presente Ausente Ausente Ausente

2×10-3

2.1×10

-1

1.3×10-1

1.6×10

-1

Japão (n=1997)

Lehman et al. 2007

rs7903146 rs12255372 rs11196213 rs3814573 rs10885390 rs12573128 rs7895307 rs10885405 rs3750804 rs911768 rs290483

T T T T A G A T T C G

Presente Presente Ausente Presente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente Ausente

3×10-2

3.3×10

-2

5.12×10-1

1.2×10

-2

2×10-3

5.5×10

-2

5.25×10-1

2.75×10

-1

7.44×10-1

4.1×10

-2

8.47×10-1

Americano Mexicano (n=545)

Lyssenko et al. 2007 rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

1.4×10-11

2.7×10

-7

Suécia (n=7061)

Lyssenko et al. 2007 rs7903146 T Presente 1×10-2

Finlândia (n=2651)

35

Ng et al. 2007

rs7903146 rs11196205 rs7079711 rs7919409 rs11196224 rs17130188 rs12775879 rs290489

rs11196218 rs6585194 rs6585195 rs7917983 rs6585196 rs11196209 rs4918789 rs4917644 rs290474

rs10787476 rs1028629 rs10509970 rs11196251

T C A C T C G A A G G T C A G T A C T G T

Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente Presente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente

4.24×10-1

3.8×10

-2

1.68×10-1

6.87×10

-1

4.54×10-1

1.1×10

-2

3.36×10-1

3.12×10

-1

2×10-3

5.36×10

-1

4.1×10-1

6×10

-2

2.64×10-1

4.7×10

-1

6×10-2

1.57×10

-1

9.5×10-2

9.5×10

-2

4.67×10-1

2.7×10

-1

4.06×10-1

China (n=852)

Parra et al. 2007 rs7903146 rs12255372

T T

Ausente Presente

1.52×10-1

1.7×10

-2

México (n=561)

Sale et al. 2007

rs7903146 rs12255372 rs7901695 rs11196205 rs7895340

T T C C A

Presente Presente Presente Ausente Ausente

1.79×10-8

2×10-2

4×10

-3

9.1×10-2

1×10

-1

Americano Africano (n=1173)

Scott et al. 2007 rs7903146 T Presente 3.5×10-4

Finlândia (n=2473)

Sladek et al. 2007 rs7903146 T Presente 3.2×10-17

França

(n=1363)

van Vliet-Ostaptchouk et al. 2007

rs7903146 rs12255372

T T

Presente Presente

4.4×10-5

3×10

-3

Alemanha (n=1422)

Marquezine et al. 2008 rs7903146 T Presente 3.2×10-3

Brasil

São Paulo (n=560)

Miyake et al. 2008

rs7903146 rs12255372 rs11196205 rs290487

rs11196218

T T C C A

Presente Presente Presente Ausente Ausente

2.7×10-4

9.8×10

-5

4.6×10-4

4.5×10-1

2.6×10

-1

Japão (n=4087)

Saadi et al. 2008 rs7903146 rs12255372

T T

Ausente Presente

4×10-1

3×10

-2

Emirados Árabes (n=368)

Wegner et al. 2008 rs7903146 T Presente 4×10-2

Dinamarca

(n=783)

Ezzidi et al. 2009 rs7903146 T Presente 6×10-3

Tunísia

(n=1397)

Tabara et al. 2009 rs7903146 rs12255372

T T

Ausente Presente

6.1×10-2

2.2×10

-2

Japão (n=908)

Takeuchi et al. 2009 rs7903146 T Presente 7.3×10-3

Japão

(n=1022)

Yan et al. 2009 rs7903146 T Presente 3×10-2

Americano Africano (n=2727)

Yan et al. 2009 rs7903146 T Presente <1×10-2

Americano Caucasiano

(n=9302)

36

Chauhan et al. 2010 rs7903146 T Presente 4.6×10-34

Índia

(n=5164)

Webster et al. 2010 rs7903146 T Presente 3.9×10-2

Austrália (n=4554)

2.10 Mutações relacionadas ao gene TCF7L2

O gene TCF7L2 humano tem pelo menos quatro marcadores polimórficos de

ligação com DM2 (Tong et al., 2009). São estes:

(1) substituição TC (posição genômica: 114748339) no SNP rs7903146 do

íntron 3 (Grant et al., 2006; Helgason et al., 2007; Sale et al., 2007);

(2) substituição GT (posição genômica: 14798892) no SNP rs12255372 do

íntron 4 (Grant et al., 2006; Zhang et al., 2006);

(3) substituição TC (posição genômica: 114744078) no SNP rs7901695 do

íntron 3 (Grant et al., 2006; Sale et al., 2007);

(4) substituição CG (posição genômica: 114797037) no SNP rs11196205 do

íntron 4 (Scott et al., 2006; Ng et al., 2007).

Além desses marcadores, Groves et al. (2006), Scott et al. (2006), Chandak et al.

(2007), Chang et al. (2007), Lehman et al. (2007) e Ng et al. (2007) identificaram nove

polimorfismos de um único nucleotídeo – SNPs (rs4506565, rs12243326, rs17130188,

rs290487, rs3814573, rs10885390, rs911768, rs17747324 e rs11196228) do TCF7L2 que

exerceram influência sobre o risco de DM2 e sugerem que as variações do gene TCF7L2

podem agir como fatores de risco para DM2 através da influência sobre a via de

sinalização Wnt, sendo necessário mais estudos com diferentes populações.

Os SNPs estão distribuídos de forma não aleatória por todo genoma e ocorrem a

uma frequência de aproximadamente um em cada 1200 pares de bases, representando

assim as variáveis mais comuns no genoma humano (Sachidanandam et al., 2001; Sherry

et al., 2001; Venter, 2001). Um SNP se origina quando uma mutação pontual ocorre no

genoma, convertendo um determinado nucleotídeo em outro qualquer, e forças evolutivas

como: seleção, deriva e migração modulam a fixação ou desaparecimento dessa mutação

ao longo de gerações em uma população (Brown, 2002).

37

SNP rs7903146

Este SNP está representado em uma sequência que possui 635 bases, conteúdo

de CG = 38,2%; na posição 299 do gene TCF7L2 ocorre a troca de uma T por uma C

(caracterizando a mutação do tipo transição). A sequência é mostrada na figura 6 ou pode

ser mostrada da seguinte forma simplificada:

TTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGATA[C/T]TATATAATTTAATTGCCGTATGAGG

.

Figura 6: Sequência onde se insere o SNP rs7903146 mostrando a posição da mutação Y em verde (código usado pela IUPAC para informar uma mutação entre pirimidinas).

A diversidade do SNP rs7903146 nas populações está apresentada na tabela 4.

Tabela 4: Diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em azul o alelo T (selvagem) e em laranja o alelo C (mutante).

38

SNP rs12255372

Este SNP está representado em uma sequência que possui 700 bases, conteúdo

de CG = 47,6%; na posição 201 do gene TCF7L2 ocorre a troca de um G por um T

(caracterizando a mutação do tipo transversão). A sequência é mostrada na figura 7 ou na

seguinte forma simplificada:

CTGCCCAGGAATATCCAGGCAAGAAT[G/T]ACCATATTCTGATAATTACTCAGGC

Figura 7: Sequência onde se insere o SNP rs12255372 mostrando a posição da mutação K em verde (código usado pela IUPAC para informar uma mutação entre uma purina e uma pirimidina).

A diversidade do SNP rs12255372 nas populações está apresentada na tabela 5.

Tabela 5: A diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em laranja o alelo G (selvagem) e em azul o alelo T (mutante).

39

SNP rs7901695

Este SNP está representado em uma sequência que possui 1642 bases, conteúdo

de CG = 46,3%; na posição 754 do gene TCF7L2 ocorre a troca de um T por um C

(caracterizando a mutação do tipo transição). A sequência é mostrada na figura 8 ou na

seguinte forma simplificada:

TCATATAAATGGTATCATAAAATCTA[C/T]GGGCTTTTGTGTCTGTCTGCTTTCA.

Figura 8: Sequência onde se insere o SNP rs7901695 mostrando a posição da mutação Y em verde (código usado pela IUPAC para informar uma mutação entre pirimidinas).

A tabela 6 mostra a diversidade do SNP rs7901695 nas populações.

Tabela 6: Diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em laranja o alelo C (selvagem) e em azul o alelo T (mutante).

40

SNP rs11196205

Este SNP está representado em uma sequência que possui 815 bases, conteúdo de CG =

34,8%; na posição 615 do gene TCF7L2 ocorre a troca de um C por um G (caracterizando

a mutação do tipo transversão). A sequência é mostrada na figura 9 ou na seguinte forma

simplificada:

TGAAAGTTCTCAACATTTATAACTAC[C/G]AGCAGTATGTAAGAGAGTTATGGTT

.

Figura 9: Sequência onde se insere o SNP rs11196205 mostrando a posição da mutação S central (código usado pela IUPAC para informar uma mutação forte entre pirimidinas).

A diversidade do SNP rs11196205 nas populações está apresentada na tabela 7.

Tabela 7: Diversidade de genótipos e freqüência dos alelos nas populações de acordo com o banco de dados SNP do NCBI - em laranja o alelo C (selvagem) e em azul o alelo G (mutante).

41

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Determinar a prevalência das mutações do gene TCF7L2, relacionado à diabetes

mellitus tipo 2, na população de Triunfo - Pernambuco.

3.2 Objetivos específicos

Avaliar epidemiologicamente a distribuição da DM2, segundo as características

sociais e econômicas da população local para subsidiar o planejamento de futuros

projetos de saúde pública;

Descrever os polimorfismos do gene TCF7L2 na população em estudo;

Criar um banco de dados como referência para estudos futuros;

Comparar as frequências alélicas, genotípicas e haplotípicas observadas, assim

como a possível relação destas e a DM2, com as informações descritas na

literatura, visando analisar a estrutura genética da população em estudo.

42

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 População e Local do Estudo

O tamanho da amostra para o estudo da prevalência de diabetes mellitus tipo 2 foi

baseado no número de famílias residentes no distrito de Canaã em Triunfo - PE, sendo

encontradas 234 famílias. Dos questionários distribuídos e respondidos nesse distrito, foi

realizado um sorteio dos participantes da amostra, sendo escolhido apenas um indivíduo

por cada família. Das 234 famílias, 198 preencheram todas as etapas de estudo. A

composição dessa amostra foi feita por faixa etária e por sexo.

Embora possivelmente não representativa da população de Triunfo, a amostra do

distrito de Canaã foi escolhida por representar adequadamente aquela do sertão

pernambucano. Esse distrito, que está situado na parte mais baixa do município e

apresenta temperaturas bem mais elevadas que a média municipal, se assemelha as

características climáticas e socioeconômicas encontradas no restante do sertão

pernambucano. Assim, os dados deste estudo são provavelmente representativos de

populações urbanas de pequenos municípios, de origem miscigenada e

predominantemente de baixa renda e escolaridade, do sertão nordestino.

Cada indivíduo incluído na pesquisa recebeu as devidas informações sobre a sua

participação no projeto, respondeu previamente a um questionário socioeconômico-

epidemiológico (Anexos) e assinou o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(TCLE), submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da

Universidade Federal de Pernambuco (registro n° 190/2006). O estudo envolveu

indivíduos com diabetes (casos) e sem diabetes (controles), devidamente informados

sobre a pesquisa, assim como dos aspectos legais do estudo. Permaneceu claro ao

entrevistado, como ratificado pela 2ª via do documento que lhe foi entregue, que a sua

não aceitação ou desistência de participação, não implicaria em nenhuma alteração do

serviço prestado.

Algumas características da população estudada também foram analisadas, tais

como o nível socioeconômico e a escolaridade, bem como alguns fatores de risco. Em

relação à classificação dos níveis socioeconômicos foi adotado como critério o número de

salários mínimos recebidos mensalmente, sendo subdivididos em: menos de 1 salário

43

mínimo, 1 a 2 salários mínimos e mais de 2 salários mínimos. Quanto à escolaridade, o

critério baseou-se na lei de Diretrizes e Bases da Educação Nacional - Lei nº 9394-96

(Brasil, 2006), que utiliza os seguintes termos: ensino fundamental (equivalente ao

primeiro grau), ensino médio (equivalente ao segundo grau) e ensino superior. Aqueles

participantes sem qualquer escolaridade foram nominados de analfabetos. Quanto à co-

morbidades e fatores de risco foram coletadas informações quanto ao tabagismo,

atividade física e peso corporal. Para hábito de fumar, foram considerados tabagistas

aqueles indivíduos fumando qualquer quantidade de cigarros, excetuando-se os que

nunca fumaram ou pararam de fumar há pelo menos 30 dias. Para avaliação da atividade

física foram considerados praticantes aqueles que faziam algum exercício pelo menos 3

horas semanais de uma ou mais das seguintes atividades no lazer: caminhar, dançar,

nadar, pedalar, correr ou outra atividade física esportiva, inclusive treinamento para

competições. Para o diagnóstico de sobrepeso ou obesidade foi usado o cálculo de índice

de massa corpórea - IMC (peso/altura em metros ao quadrado). Aqueles voluntários que

apresentaram IMC < 18,5 kg/m² foram considerados abaixo do peso, aqueles com IMC

entre 18,5 e 24,9 kg/m² foram considerados de peso normal, IMC entre 25,0 e 29,9 kg/m²

foram considerados com sobrepeso e aqueles com IMC > 30 kg/m² foram considerados

obesos (World Health Organization, 2004).

A coleta do material biológico (sangue) foi realizada no município de Triunfo em

112 indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 e 228 não diabéticos, totalizando 340

amostras. Os participantes do estudo de análise genética foram identificados como

portadores ou não de DM2, inicialmente pelos agentes de saúde de Triunfo, e em seguida

confirmado ou não seu diagnóstico através da avaliação laboratorial (glicemia em jejum

plasmática e/ou hemoglobina glicosilada). A seleção dos participantes dessa amostra,

portanto, foi independente daquela para a amostragem do estudo de prevalência de DM2.

Para se submeter aos exames laboratoriais, os indivíduos precisaram permanecer

em estado de jejum de 12h. Sendo que esses testes foram realizados no período

matutino.

44

4.2 Exames Laboratoriais

Os indivíduos que conheciam a sua condição de diabético foram avaliados através

da hemoglobina glicosilada e os indivíduos que não conheciam a sua condição de

diabético foram analisados primeiramente através da glicemia em jejum plasmática, que é

o exame mais comum para medir o nível de glicose no sangue. O resultado foi

considerado normal quando a taxa de glicose variava de 70 até 100 mg/dL. Se o resultado

ficava em torno de 100 a 125 mg/dL, o indivíduo era portador de glicemia em jejum

alterada (GJA). Assim, tornava-se necessário à realização do exame conhecido como

Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG). Ocorrendo um resultado igual ou acima de

126 mg/dL, ficava então confirmado o diagnóstico de diabetes. Enquanto com uma

glicemia superior a 140 mg/dL, mesmo sendo colhida a qualquer hora do dia, se

confirmava o diagnóstico de diabetes.

Para se realizar o TOTG, o paciente ingeria 75g de glicose diluída em 300 mL de

água. Após duas horas de espera, era feita a coleta de sangue para medir a taxa de

glicose. No resultado que apresentava uma glicemia igual ou superior a 200 mg/dL,

considerava que o indivíduo tinha diabetes mellitus. No entanto, se a glicemia estava

entre 140 e 199 mg/dL, então o diagnóstico era de tolerância diminuída à glicose (TDG).

Todos os testes requereram abstinência de pelo menos 12 horas de bebidas

alcoólicas e fumo, isso porque as substâncias tóxicas do tabaco e do álcool circulam pela

corrente sangüínea e interferem no diagnóstico final.

4.3 Extração de DNA

O DNA (ácido desoxirribonucléico) foi extraído de 3mL de sangue venoso através

da técnica de Mini Salting Out (Anexos - Miller et al., 1988), utilizando-se o anticoagulante

ACD (ácido cítrico 0,0038M; citrato de sódio tribásico 0,075M; dextrose 0,133M), diluído e

quantificado através do espectrofotômetro para utilização nos procedimentos moleculares

seguintes.

45

4.4 Genotipagem das mutações do gene TCF7L2

A genotipagem foi feita pela técnica de PCR em tempo real. Para cada reação

foram utilizados os seguintes reagentes: 5µL de Master Mix, composto de Taq DNA

polimerase, dNTPs e tampão de reação; 0,2µL de sonda de hidrólise TaqMan, juntamente

com os primers; 3,8µL de água Milli-q autoclavada e 1µL de DNA genômico.

Quatro polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) do gene TCF7L2 foram

genotipados: rs7903146 (C/T) e rs7901695 (T/C) presentes no íntron 3; rs12255372 (G/T)

e rs11196205 (G/C) presentes no íntron 4. A tabela 8 mostra os SNPs utilizados, as

sequências analisadas com os fluorocromos VIC e FAM, a codificação dos alelos, sua

referência e posição. Pode-se verificar que a maior distância entre estes polimorfismos é

menor que 5000 pares de bases, configurando os haplótipos.

Tabela 8: SNPs do gene TCF7L2 analisados na população de Triunfo - PE.

# SNP Posição Codificação dos alelos Sequência [VIC/FAM]

1 rs7901695 114744078 1=C; 2=T

T > C CATATAAATGGTATCATAAAATCTA[C/T]G

GGCTTTTGTGTCTGTCTGCTTTCA

2 rs7903146 114748339 1=C; 2=T

C > T TAGAGAGCTAAGCACTTTTTAGATA[C/T]

TATATAATTTAATTGCCGTATGAGG

3 rs11196205 114797037 1=C; 2=G

G > C GAAAGTTCTCAACATTTATAACTAC[C/G]A

GCAGTATGTAAGAGTTATGGTT

4 rs12255372 114798892 1=G; 2=T

G > T CCAGGAATATCCAGGCAAGAAT[G/T]ACC

ATATTCTGATAATTACTCAGGC

4.5 Análise Estatística

A prevalência de diabetes mellitus tipo 2 foi calculada por contagem direta e

expressa em porcentagem. Analisou-se a conveniência da proporção e verificou-se a

homogeneidade dos grupos, quanto ao sexo, idade, grau de escolaridade, renda mensal,

atividade física, tabagismo e IMC. Os dados foram submetidos à análise estatística pelo

método do Qui-Quadrado (χ²) para comparar as proporções, com intervalo de confiança

de 95%, considerando-se um nível de significância de 5% (p < 0,05).

O Equilíbrio de Hardy–Weinberg (EHW) foi verificado também pelo teste do Qui-

Quadrado para as distribuições genotípicas dos polimorfismos estudados. As associações

alélicas, genotípicas e haplotípicas foram realizadas com o programa UNPHASED -

versão 3.1.3 (Dudbridge, 2008).

46

5. RESULTADOS

Dos 198 indivíduos analisados, 34,4% (n=68) eram homens e 65,6% (n=130)

mulheres, com idade média de 57,4 anos (31-90 anos), sendo 56,7 anos entre os homens

e 57,7 anos entre as mulheres. A distribuição por faixa etária da amostra estudada de

acordo com o gênero está apresentada na tabela 9.

Tabela 9: Composição por sexo e faixa etária da amostra estudada em Triunfo – PE.

Faixa etária (anos) Amostra (%)

30-39

Masculino

3,0

Feminino

5,6

40-49 7,1 11,6

50-59 11,1 18,7

60-69 7,1 14,6

≥ 70 6,1 15,1

Total 34,4 65,6

Quanto à composição dessa amostra segundo as características sociais e

econômicas, para o grau de escolaridade: 13,1% eram analfabetos, 80,0% tinham ensino

fundamental incompleto, 6,9% possuíam ensino médio incompleto e não existiam

indivíduos com ensino superior. Para a renda mensal individual: 81,3% dos voluntários

ganhavam menos de 1 salário mínimo, 16,7% ganhavam entre 1 e 2 salários mínimos e

2,0% tinham renda de mais de 2 salários mínimos. Quanto aos hábitos, 28,2% dos

indivíduos eram fumantes e somente 27,8% praticavam atividade física.

Do total de indivíduos avaliados, 13,6% (n=27) apresentaram níveis glicêmicos

compatíveis com a diabetes mellitus, 6,6% (n=13) eram portadores de GJA e 1,0% (n=2)

de TDG, portanto, totalizando 7,6% de casos de disglicemia ou pré-diabetes. Quanto ao

diagnóstico prévio dessa doença, de todos os diabéticos da amostra, 24,0% (IC 95%: 7,2

- 40,7%) não tinham ainda diagnóstico e dos que já eram previamente diagnosticados,

8,0% (IC 95%: 0,0 - 18,6%) se encontravam controlados do ponto de vista glicêmico.

A prevalência por sexo mostrou-se significativamente mais elevada (p = 0,01) em

mulheres (16,2%) do que em homens (7,5%), como pode ser observada na tabela 10. Em

relação à idade, houve associação significativa entre o aumento da faixa etária e a

prevalência de DM2 (p < 0,05).

47

Tabela 10: Número de pessoas estudadas, prevalência (%) de diabetes mellitus tipo 2 e intervalo de confiança (IC) de 95%, por faixa etária em Triunfo - PE.

Masculino Feminino p value

Idade (anos) < 0,05

n % IC (95%) n % IC (95%)

30-39 6 0,0 11 0,0

40-49 14 0,0 23 9,1 (0,00 - 20,8)

50-59 22 4,5 (4,10 - 13,1) 37 20,6 (7,50 - 33,6)

60-69 14 21,4 (0,00 - 42,8) 29 28,0 (11,6 - 44,3)

>70 12 18,2 (0,00 - 40,0) 30 11,5 (0,08 - 22,9)

Total na amostra 68 7,5 (1,23 - 13,7) 130 16,2 (9,80 - 22,5) 0,01

Prevalência global 13,6 (8,60 - 18,5)

Na tabela 11, a prevalência de DM2 é apresentada de acordo com o grau de

escolaridade, renda mensal, atividade física, IMC, bem como a presença de tabagismo.

Verificando a distribuição desses diabéticos encontrados quanto à escolaridade,

observou-se que todos os casos estavam entre analfabetos ou indivíduos com apenas o

ensino fundamental. Em relação à renda, não foi encontrada associação significativa entre

baixa renda e a ocorrência de DM2. Na avaliação da relação dessa doença com outros

fatores de risco cardiovascular estudados, não houve diferença significativa na

prevalência de DM2 entre sedentários e praticantes de atividade física, assim como entre

fumantes e não fumantes. No entanto, encontrou-se associação positiva entre DM2 e

IMC, com prevalência variando de 13,2% naqueles com IMC < 25 kg/m2 a 17,9% nos

indivíduos com IMC ≥ 30 kg/m2.

48

Tabela 11: Prevalência de diabetes mellitus tipo 2 e intervalo de confiança (IC) de 95% em cada uma das situações nos indivíduos analisados em Triunfo - PE.

Características Categorias Número de indivíduos

% na amostra Prevalência de DM2 (IC 95%)

p value

Escolaridade

Analfabetos

Fundamental incompleto

Médio incompleto

26

158

14

13,1

80,0

6,9

4,3 (0,0 – 12,5)

17,1 (10,8 – 23,3)

0,0

0,189

Renda mensal

< 1 salário mínimo

1-2 salários mínimos

> 2 salários mínimos

183

10

5

92,5

5,1

2,4

13,3 (8,1 – 18,4)

10,0 (0,0 – 28,5)

50,0 (1,0 – 99,0)

0,077

Tabagismo Sim

Não

53

145

26,8

73,2

12,2 (3,0 – 21,3)

15,2 (8,9 – 21,4) 0,594

Atividade física Sim

Não

55

143

27,8

72,2

17,8 (6,6 – 93,3)

14,5 (8,1 – 20,8) 0,564

Índice de Massa Corpórea (kg/m²)

< 25

25-29,9

> 30

96

71

31

48,6

35,8

15,6

13,2 (12,5 – 13,9)

12,5 (4,3 – 20,6)

17,9 (3,7 – 32,0)

< 0,05

Das 340 amostras coletadas em Triunfo para a análise dos polimorfismos do gene

TCF7L2, apenas 324 apresentaram resultados viáveis para rs7901695, 325 para

rs7903146, 297 para rs11196205, e 303 para rs12255372, durante a genotipagem. A

partir dos resultados foram calculadas as freqüências alélicas, genotípicas e haplotípicas

para cada SNP, como mostrado nas tabelas 12, 13, 14, 15 e 16.

A analise genotípica demonstrou uma associação significativa dos SNPs

rs7901695 e rs12255372 com DM2 (p = 0,0379 e p = 0,0119, respectivamente) (Tabela

12). Vale ressaltar que os genótipos desses SNPs mais freqüentes nos diabéticos foram

os heterozigotos, demonstrando uma baixa relação para qualquer alelo. As freqüências

alélicas verificadas na tabela 13 corroboram o observado com os genótipos para o SNP

rs7901695, sendo o alelo C o mais freqüente nos diabéticos.

A análise haplotípica mostra que os pares rs7901695 x rs11196205 e rs11196205 x

rs12255372 apresentam associação com DM2 (p = 0,007 e p = 0,015, respectivamente)

(Tabela 14). Entre os haplótipos triplos apenas um conjunto (rs7901695 x rs7903146 x

rs12255372) não mostrou associação com diabetes (p = 0,2903) (Tabela 15). As quadras

haplotípicas mostraram associação com DM2, sendo o haplótipo 2-1-2-1 o mais freqüente

nos diabéticos (Tabela 16).

49

Tabela 12: Avaliação das frequências genotípicas dos SNPs do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 em Triunfo - PE.

SNPs Genótipos Ca-Freq Co-Freq Associação

rs7901695

1/1 0,259 0,208 χ2= 6,544

gl = 2

p = 0,0379

1/2 0,537 0,454

2/2 0,204 0,338

rs7903146

1/1 0,422 0,477 χ2= 1,018

gl = 2

p = 0,6012

1/2 0,468 0,435

2/2 0,110 0,088

rs11196205

1/1 0,398 0,459 χ2= 1,028

gl = 2

p = 0,5981

1/2 0,379 0,335

2/2 0,223 0,206

rs12255372

1/1 0,350 0,510 χ2= 8,867

gl = 2

p = 0,0119

1/2 0,505 0,335

2/2 0,146 0,155

Ca-Freq = frequência nos diabéticos (casos); Co-Freq = frequência nos controles

Tabela 13: Avaliação das frequências alélicas de quatro SNPs do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 em Triunfo - PE.

SNPs Alelos Ca-Freq Co-Freq Associação

rs7901695

1 0,528 0,435 χ2= 4,57

gl = 1

p = 0,026 2 0,472 0,565

rs7903146

1 0,656 0,694 χ2 = 0,982

gl = 1

p = 0,322 2 0,344 0,306

rs1196205

1 0,587 0,626 χ2 = 0,856

gl = 1,

p = 0.355 2 0,413 0,374

rs1255372

1 0,602 0,678 χ2 = 3,390

gl = 1

p = 0,0656 2 0,398 0,323

Ca-Freq = frequência nos diabéticos (casos); Co-Freq = frequência nos controles

50

Tabela 14: Avaliação das frequências haplotípicas dos SNPs, 2 x 2, do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 em Triunfo - PE.

SNPs Haplótipos Ca-Freq Co-Freq Associação

rs7901695

x

rs7903146

1-1 0,181 0,137 χ

2= 5.611

gl = 3

p = 0.132

1-2 0,344 0,299

2-1 0,474 0,561

2-2 0,000 0,003

rs7901695

x

rs11196205

1-1 0,473 0,414 χ

2= 12.215

gl = 3

p = 0,007

1-2 0,054 0,025

2-1 0,114 0,210

2-2 0,359 0,352

rs7901695

x

rs12255372

1-1 0,173 0,172 χ

2= 5.78408

gl = 3

p = 0,123

1-2 0,354 0,266

2-1 0,429 0,507

2-2 0,043 0,055

rs7903146

x

rs11196205

1-1 0,246 0,332 χ

2= 5,09164

gl = 3

p = 0,165

1-2 0,410 0,362

2-1 0,338 0,295

2-2 0,006 0,011

rs7903146

x

rs12255372

1-1 0,515 0,585 χ

2= 3,389

gl = 3

p = 0,336

1-2 0,141 0,111

2-1 0,090 0,094

2-2 0,254 0,210

rs11196205

x

rs12255372

1-1 0,222 0,308 χ

2= 10,443

gl = 3

p = 0,015

1-2 0,364 0,315

2-1 0,378 0,370

2-2 0,037 0,006

Ca-Freq = frequência nos diabéticos (casos); Co-Freq = frequência nos controles

51

Tabela 15: Avaliação das frequências haplotípicas dos SNPs, 3 x 3, do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 em Triunfo - PE.

Ordem SNPs Haplótipos Caso Controle Ca-Freq Co-Freq

1 – 2 – 3

rs7901695

x

rs7903146

x

rs11196205

1-1-1 28,7 55,2 0,1315 0,1237

1-1-2 10,9 6,6 0,0499 0,0151

1-2-1 73,8 129,3 0,3387 0,2900

1-2-2 1,2 4,2 0,0054 0,0094

2-1-1 24,8 92,6 0,1140 0,2076

2-1-2 78,6 156,7 0,3606 0,3513

2-2-1 0,0 1,3 0,0000 0,0029

Associação χ2= 15,003 gl = 6, p = 0,0202

1- 2 – 4

rs7901695

x

rs7903146

x

rs12255372

1-1-1 19,1 35,9 0,0878 0,0805

1-1-2 20,4 25,8 0,0937 0,0579

1-2-1 18,7 40,7 0,0858 0,0913

1-2-2 56,3 92,5 0,2583 0,2075

2-1-1 94,0 225,8 0,4312 0,5062

2-1-2 9,4 24,1 0,0433 0,0539

2-2-1 0,0 1,2 0,0000 0,0028

Associação χ2= 6,912 gl = 6, p = 0,2903

1 – 3 – 4

rs7901695

x

rs11196205

x

rs12255372

1-1-1 28,71 66,67 0,1329 0,1515

1-1-2 73,55 115,9 0,3405 0,2634

1-2-1 8,83 9,392 0,0409 0,0213

1-2-2 2,909 1,723 0,0135 0,0039

2-1-1 18,98 69,49 0,0879 0,1579

2-1-2 5,159 22,02 0,0239 0,0500

2-2-1 73,56 153,7 0,3406 0,3492

2-2-2 4,298 1,17 0,0199 0,0027

Associação χ2= 17,683 gl = 6, p = 0,0135

2 – 3 – 4

rs7903146

x

rs11196205

x

rs12255372

1-1-1 30,26 100,9 0,1388 0,2304

1-1-2 23,21 45,35 0,1065 0,1035

1-2-1 81,5 155,5 0,3738 0,3551

1-2-2 8,028 3,084 0,03682 0,0070

2-1-1 18,52 36,15 0,08497 0,0825

2-1-2 55,16 91,9 0,253 0,2098

2-2-1 1,316 5,067 0,006035 0,0116

Associação χ2= 12,964 gl = 6, p = 0,0436

Ca-Freq = frequência nos diabéticos (casos); Co-Freq = frequência nos controles

52

Tabela 16: Avaliação das frequências haplotípicas dos SNPs, 4 x 4, do gene TCF7L2 e sua associação com diabetes mellitus tipo 2 em Triunfo – PE.

Ordem SNPs Haplótipos Casos Controles Ca-Freq Co-Freq

1 -2 -3 -4

rs7901695

x

rs7903146

x

rs11196205

x

rs12255372

1-1-1-1 10,8 31,1 0,0493 0,0696

1-1-1-2 17,9 24,8 0,0823 0,0556

1-1-2-1 7,8 4,9 0,0358 0,0109

1-1-2-2 3,1 1,7 0,0140 0,0039

1-2-1-1 17,9 35,6 0,0822 0,0799

1-2-1-2 55,9 93,1 0,2564 0,2087

1-2-2-1 1,2 4,5 0,0054 0,0101

2-1-1-1 19,5 70,6 0,0896 0,1583

2-1-1-2 5,1 21,4 0,0234 0,0479

2-1-2-1 74,5 155,6 0,3419 0,3488

2-1-2-2 4,3 1,5 0,0196 0,0034

2-2-1-1 0,0 1,3 0,0000 0,0029

Associação χ2= 20,592 gl = 11, p = 0, 0378

Ca-Freq = frequência nos diabéticos (casos); Co-Freq = frequência nos controles

53

6. DISCUSSÃO

Este trabalho compõe um projeto amplo, cuja finalidade é descrever aspectos

epidemiológicos e genéticos relacionados à diabetes mellitus tipo 2 e condições

associadas da população do município de Triunfo – PE.

Numa amostragem de 198 indivíduos residentes no distrito de Canaã em Triunfo, a

prevalência de DM2 nessa população foi de 13,6% (IC 95%: 8,6 - 18,5%). Esse resultado

foi semelhante ao encontrado por Bosi et al. (2009) em São Carlos - São Paulo (12,1%

dos indivíduos entre 30 e 69 anos) e por Torquato et al. (2003) em Ribeirão Preto - São

Paulo (13,5% dos indivíduos entre 30 e 79 anos). No entanto, esse número foi superior ao

observado por Malerbi e Franco (1992) em um estudo multicêntrico envolvendo várias

capitais brasileiras (7,6% dos indivíduos entre 30 e 69 anos), Duncan et al. (1993) em

Porto Alegre - Rio Grande do Sul (8,89% dos indivíduos entre 15 e 64 anos), Oliveira et al.

(1996) no Rio de Janeiro (7,1% dos indivíduos entre 30 e 69 anos), Gus et al. (2002) no

Rio Grande do Sul (7,0% dos indivíduos com mais de 20 anos) e Souza et al. (2003) em

Campos - Rio de Janeiro (6,0% dos indivíduos com mais de 18 anos). Embora haja

diferenças entre as características metodológicas dos diversos inquéritos populacionais

referidos que impossibilitam comparações diretas entre os valores de prevalência

encontrados, os dados observados sinalizam para um aumento na prevalência de DM2 na

população adulta do Brasil.

No presente estudo foram encontrados TDG e GJA em 1,0% e 6,6% dos indivíduos

estudados, com um total de disglicêmicos de 7,6%. Mesmo considerando as diferenças

metodológicas dos estudos, tais frequências se aproximam dos 7,8% de intolerância à

glicose encontrada no estudo multicêntrico brasileiro (Malerbi e Franco, 1992), dos 7,7%

em Ribeirão Preto (Torquato et al., 2003) e dos 5,0% em São Carlos (Bosi et al., 2009).

A prevalência de DM2 neste estudo foi significativamente maior no sexo feminino,

dado que, embora também encontrado no estudo realizado por Fidelis et al. (2009), não

foi observado nos estudos de Malerbi e Franco (1992), Souza et al. (2003), Torquato et al.

(2003), Passos et al. (2005) e Bosi et al. (2009), em que não houve diferença

estatisticamente significativa entre os gêneros.

Nesse estudo em Triunfo, a prevalência de DM2 se elevou na medida em que se

aumentava a faixa etária, sendo maior em homens (21,4%) e mulheres (28,0%) entre 60 e

54

69 anos, entretanto menor entre os com 70 anos de idade ou mais. Esse crescimento da

prevalência de DM2 com a idade também foi encontrado por outros estudos (Malerbi e

Franco, 1992; Souza et al., 2003; Torquato et al., 2003). A queda na faixa etária acima

dos 70 anos também foi observada em homens no estudo de São Carlos (Bosi et al.,

2009), e em ambos os sexos nos indivíduos com 80 anos ou mais no município de

Teixeiras – Minas Gerais (Fidelis et al., 2009). Na análise desses dados deve-se

considerar um possível viés de seleção deste estudo, em que foi obtida maior proporção

de mulheres e de indivíduos com 50 anos ou mais de idade entre os entrevistados. Uma

das prováveis explicações está no fato da coleta de dados ter sido realizada nos

domicílios dos participantes sem sensibilização prévia. Assim, se identificou a dificuldade

em encontrar homens e indivíduos mais jovens nos domicílios, por estes estarem muitas

vezes em jornada de trabalho na ocasião das visitas.

Quanto à escolaridade, observou-se no presente estudo que todos os casos de

DM2 estavam entre analfabetos ou indivíduos com apenas o ensino fundamental. Esses

dados são concordantes com os descritos em vários outros grupos populacionais urbanos

(Oliveira et al.,1996; Souza et al., 2003; Ong et al., 2008; Bosi et al., 2009) que

encontraram maior prevalência de diabetes entre as pessoas com menor grau de

escolaridade. Entretanto, é importante ressaltar que, por ser uma característica marcante

dessa população, quase a totalidade da amostra estava nessa condição de baixa

escolaridade. Por outro lado, não foi encontrada associação entre baixa renda e a

ocorrência de DM2. Tal resultado é similar ao visto em outro estudo brasileiro (Bosi et al.,

2009), porém diferente do encontrado por Passos et al. (2005), em que houve relação

inversa entre diabetes e renda familiar.

A obesidade é provavelmente o fator de risco mais importante para o

desenvolvimento de DM2 (Gigante et al., 1997; Berber et al., 2001), encontrando-se,

nesse estudo de Triunfo, uma associação significativa entre a prevalência dessa doença e

o IMC (p < 0,05), variando de 13,2% naqueles com IMC < 25 kg/m² a 17,9% nos

indivíduos com IMC > 30 kg/m². Tais dados se assemelham aos encontrados em outros

inquéritos populacionais (Torquato et al., 2003; Passos et al., 2005; Bosi et al., 2009).

O sedentarismo tem sido associado à resistência a insulina em indivíduos não

diabéticos, independentemente da obesidade (Mayer-Davis et al., 1998). A prática regular

de exercícios aumenta o numero de capilares e fibras musculares, favorecendo a

disponibilidade de glicose mediada pela insulina nessas células (Utriainen et al., 1996).

55

No presente estudo, assim como no descrito por Gimeno et al. (2002), não houve

diferença significativa na prevalência de DM2 entre sedentários e praticantes de atividade

física, diferentemente de Passos et al. (2005), que encontraram relação positiva entre

sedentarismo e diabetes.

Muitos estudos (Eliasson, 2003; Passos et al., 2005; Chiolero et al., 2008) sugerem

que o tabagismo ativo pode ser independentemente associado a DM2. Neste estudo,

entretanto, não se encontrou diferença significativa na prevalência dessa doença entre

fumantes e não fumantes.

De acordo com meta-análises (Florez, 2007; Cauchi et al., 2007), TCF7L2 é o gene

de susceptibilidade mais reproduzível para DM2 em vários grupos étnicos, mostrando

forte e consistente associação, com probabilidade de desenvolvimento de DM2

aumentada em 40-60% para cada alelo herdado (Cauchi et al., 2007). Este trabalho

confirmou a ligação de variantes do gene TCF7L2 com DM2 em Triunfo. A análise

genotípica encontrou associação significativa dos SNPs rs7901695 e rs12255372 com

DM2, diferentemente dos SNPs rs7903146 e rs11196205, que não se correlacionaram

significativamente a essa doença.

A associação do SNP rs7901695 e DM2 está comprovada através de estudos em

diferentes populações (Damcott et al., 2006; Grant et al., 2006; Scott et al., 2006; Hayashi

et al., 2007; Sale et al., 2007). Zeggini et al. (2007) realizaram um estudo genômico de

associação em grande número de diabéticos e quanto à correlação com o rs7901695 foi

encontrado um odds ratio de 1,37 (p < 0,05). No estudo de Triunfo, em concordância com

dados encontrados nessas diferentes populações, houve associação significativa com

DM2 (p = 0,03).

A associação do SNP rs7903146 e DM2 está comprovada através de vários

estudos em diferentes países (Damcott et al., 2006; Grant et al., 2006; Groves et al.,

2006; Melzer et al., 2006; Scott et al., 2006; Bodhini et al., 2007; Chandak et al., 2007; De

Silva et al., 2007; Hayashi et al., 2007; Helgason et al., 2007; Horikoshi et al., 2007;

Lehman et al., 2007; Lyssenko et al., 2007; Sale et al., 2007; Sladek et al., 2007; van

Vliet-Ostaptchouk et al., 2007; Marquezine et al., 2008; Miyake et al., 2008; Ezzidi et al.,

2009; Takeuchi et al., 2009; Chauhan et al., 2010; Webster et al., 2010) e ratificada

através de meta-análises (Scott et al., 2007; Luo et al., 2009; Tong et al., 2009). Por outro

lado, estudos não têm evidenciado essa ligação (Chang et al., 2007; Parra et al., 2007;

56

Saadi et al., 2008; Tabara et al., 2009). Os resultados da amostra estudada em Triunfo

não encontraram associação significativa desse SNP com DM2.

Uma significativa associação do rs12255372 com DM2 foi encontrada nesse estudo

no sertão pernambucano (p = 0,001), sendo que dados similares foram observados por

muitas outras populações (Damcott et al., 2006; Grant et al., 2006; Groves et al., 2006;

Scott et al., 2006; Zhang et al., 2006; Bodhini et al., 2007; Chandak et al., 2007; Hayashi

et al., 2007; Helgason et al., 2007; Lehman et al., 2007; Lyssenko et al., 2007; Parra et al.,

2007; Sale et al., 2007; van Vliet-Ostaptchouk et al., 2007; Miyake et al., 2008; Saadi et

al., 2008; Tabara et al., 2009), confirmada por meta-análise (Tong et al., 2009) e diferente

de alguns estudos que não encontraram essa associação (Chang et al., 2007; Horikoshi

et al., 2007).

Vários estudos avaliaram a associação do SNP rs11196205 e DM2, tendo sido

comprovada em diversos grupos populacionais (Grant et al., 2006; Scott et al., 2006;

Hayashi et al. 2007; Ng et al., 2007; Miyake et al., 2008; Luo et al. 2009; Tong et al. 2009).

Em vista dos resultados contraditórios anteriormente relatados sobre a ligação entre os

polimorfismos do gene TCF7L2 e DM2, é possível que as razões para esses resultados

controversos seriam causadas pela variabilidade étnica em diferentes populações, pelas

diferenças metodológicas, ou ambas.

Alguns haplótipos mostraram boas associações com diabetes mellitus tipo 2, sendo

a melhor com os haplótipos duplos de rs7901695 e rs11196205 (p = 0,007) (Tabela 11),

todos os haplótipos triplos, exceto os de rs7903146 x rs11196205 x rs12255372 (p =

0,2903) (Tabela 12), bem como os haplótipos quádruplos (p = 0, 0378) (Tabela 13).

Todas as associações são suficientes para garantir sucesso numa procura maior

de um marcador clinicamente adequado para acompanhamento de indivíduos em

diferentes gerações familiares. Sabe-se que estes haplótipos segregam em famílias e

podem ser utilizados como marcadores justamente naqueles casos em que as

complicações são evidentes. O haplótipo duplo de rs7901695 e rs11196205 deve ser

avaliado em novos estudos de associação do gene TCF7L2 com DM2, pois é possível

que este aponte para famílias onde pode aparecer maior quantidade de diabéticos.

57

7. CONCLUSÕES

Em vista do exposto, conclui-se que a prevalência de diabetes mellitus tipo 2

mostrou-se significativamente elevada entre os residentes do distrito de Canaã, região

urbana do município de Triunfo, no sertão de Pernambuco. Sendo que os resultados

obtidos neste estudo corroboram os dados de alta e possivelmente crescente prevalência

em vários municípios brasileiros, e indicam a necessidade de intervenções para detecção

precoce, controle adequado da DM2 e maior atenção quanto a esta doença e suas co-

morbidades nessa população nordestina. Portanto, ações promotoras de saúde efetivas

são necessárias com o intuito de reduzir os riscos associados de desfechos desfavoráveis

e seu impacto social.

Em conclusão, este estudo revelou que os SNPs do gene TCF7L2 estão

associados com o risco aumentado de DM2 na população de Triunfo. Sendo que se os

haplótipos relacionados a estes SNPs forem estendidos, com a adição de outros do

mesmo gene, podem-se ter novos haplótipos que, segregando nas famílias e

caracterizando-as, permitam estabelecer um diagnóstico probabilístico preventivo a partir

dessas mutações. Essa associação pode ser usada em futuras pesquisas como

fundamento de saúde pública, não só na população nordestina, mas também em outras

regiões do país ou mesmo em outros países. Uma vez que esses dados sejam replicados,

essa associação pode ser utilizada como marcador genético de risco para famílias, cujos

ancestrais mais recentes tenham DM2, bem como para monitoração das mesmas. Fora

deste contexto familiar, a DM2 apresenta complicações de manejo com custos elevados e

grande sofrimento.

Como o nordeste do Brasil é composto por comunidades municipais que podem ser

abordadas pela aplicação da genética de populações à saúde pública, essas ferramentas

ajudarão a compor um programa de verificação do estado de saúde destas populações

em relação à diabetes mellitus. Estamos iniciando assim um projeto de genômica

populacional em pequenas comunidades como um tipo de “projeto alfa” para o controle

genético-epidemiológico dessa doença no estado de Pernambuco.

58

8. REFERÊNCIAS

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68

9. ANEXOS

9.1 Questionário socioeconômico-epidemiológico

69

70

71

72

9.2 Técnica de extração Mini Salting Out

Check List

Numeração das amostras nos cadernos de Concentração

Diluição (100 ng/L); Eppendofs (3X).

Soluções utilizadas: RCBL 5X; Proteinase K; SDS 20%; H2O Milli Q; H2O Milli Q autoclavada; Tampão de proteinase K 5X; NaCl 6M; Etanol PA; Etanol 70%.

Temperatura do banho-maria: 55 C. Pedacinhos de pára-filme. Outros materiais: Cotonetes;

Água sanitária; Álcool comercial; Pipetadores; Ponteiras amarelas / azuis.

Protocolo

Separação dos Leucócitos:

1. Transferir 500L de sangue total, coletado em ACD ou EDTA, para um tubo de 1,5mL e adicionar 1mL de RCBL 5X (tampão de lise de hemácias);

2. Homogeneizar por inversão, durante 30 segundos; 3. Centrifugar a 13.000rpm, durante 3 minutos (separação dos núcleos dos leucócitos); 4. Descartar o sobrenadante por decantação; 5. Lavagem: adicionar 1mL de H2O Milli Q; 6. Homogeneizar, gentilmente, por inversão, durante 30 segundos; 7. Centrifugar a 13.000rpm, durante 3 minutos; 8. Descartar o sobrenadante por decantação e drenar o excesso de líquido emborcando os

tubos sobre papel absorvente (cuidado: às vezes o pellet se desprende).

Preparação da SPK (solução de proteinase K):

Tampão de proteinase K 5X 80L

Proteinase K (20mg/mL) 30L

H2O Milli Q 240L

SDS 20% 20L

TOTAL 370L

73

Digestão e Eliminação das Proteínas:

1. Ressuspender o pellet em 370L de SPK; 2. Homogeneizar em vortex até a dissolução completa do pellet;

3. Incubar em banho-maria a 55 C com suave agitação, durante 30 minutos; 4. Deixar esfriar a temperatura ambiente, durante 10 minutos;

5. Adicionar 100L de NaCl 6M; 6. Agitar vigorosamente por 20 segundos; 7. Centrifugar a 13.000rpm, durante 6 minutos (retirada do precipitado de proteínas); 8. Verter o sobrenadante em outro tubo de 1,5mL e desprezar o tubo contendo o pellet; 9. Centrifugar a 13.000rpm, durante 4 minutos; 10. Verter novamente o sobrenadante em outro tubo de 1,5mL e desprezar o tubo contendo o

pellet.

Precipitação e Lavagem do DNA:

1. Adicionar, lentamente, pelas paredes do tubo, 1mL de etanol PA (99,5%) (precipitação do DNA);

2. Centrifugar a 13.000rpm, durante 3 minutos; 3. Balançar, vagarosamente, o tubo para que ocorra a precipitação do DNA (formação de

enovelado esbranquiçado); 4. Centrifugar a 13.000rpm, durante 3 minutos; 5. Descartar o sobrenadante por decantação, cuidadosamente para evitar que o pellet se

desprenda do fundo do tubo (enquanto descarta, ficar observando atentamente o pellet); 6. Lavagem: adicionar 1mL de etanol 70%; 7. Centrifugar a 13.000rpm, durante 3 minutos; 8. Descartar o sobrenadante e drenar o etanol restante com cotonetes com cuidado para não

remover o pellet ( até a marcação 0,5 do tubo);

9. Incubar em estufa a 55 C, durante 15 minutos;

10. Adicionar 35L de H2O Milli Q autoclavada; 11. Agitar em vortex, durante 30 segundos e dar um pulso de centrifugação; 12. Medir a leitura no espectrofotômetro (2X) e anotar no caderno de concentração, tanto as

leituras quanto as relações (R);

13. Ajustar a concentração encontrada para 100ng/L, adicionado H2O Milli Q autoclavada.

74

9.3 Lista de trabalhos apresentados em congressos, artigos científicos publicados

em periódicos e outras atividades relevantes durante o mestrado

Cardoso, MV; Lyra, R; Herculano, SCA; Mauricio-da-Silva, L; Silva, RS. Análise Genético-Populacional das Mutações do Gene TCF7L2 em Diabéticos de Triunfo – Pernambuco. XII Congresso Brasileiro de Biomedicina em Recife/PE (Outubro/2010).

Cardoso, MV; Lyra, R; Cezar, NJB; Silva, RS; Mauricio-da-Silva, L. Análise da Prevalência de Diabetes em Triunfo – Pernambuco. XII Congresso Brasileiro de Biomedicina em Recife/PE (Outubro/2010).

Cardoso, MV; Lyra, R; Silva, RS; Mauricio-da-Silva, L. Análise da Prevalência de Hipertensão Arterial em Triunfo – Pernambuco. XII Congresso Brasileiro de Biomedicina em Recife/PE (Outubro/2010).

Herculano, SCA; Cardoso, MV; Lyra, R; Mauricio-da-Silva, L; Silva, RS. Preventive diagnosis of type 2 diabetes mellitus by genetic markers. 3º Congresso Brasileiro de Biotecnologia em Fortaleza/CE (Outubro/2010).

Lyra, R; Silva, RS; Montenegro, RM; Cardoso, MV; Cézar, NJB; Mauricio-da-Silva, L. Prevalence of diabetes and associated factors in an urban adult population of low educational level and income from the Brazilian Northeast wilderness. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia (Impresso), v.54, p.560 - 566, 2010.

Mini-curso: Diagnóstico e Epidemiologia Molecular de Infecções. XII Congresso Brasileiro de Biomedicina (Outubro/2010). Carga Horária: 15 horas.

Professor Substituto de Citologia, Anatomia Humana Básica e Fisiologia Humana Básica. Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). Período: 05/2010 a 11/2010.

75

10. Memorial

Eu, Marcus Vinicius Cardoso Matos Silva, nasci em Feira de Santana – BA no dia 9

de agosto de 1987 e meu endereço de e-mail é marcuscardoso.fsa@gmail.com. Ingressei

na graduação em 2005 no curso de Bacharelado em Biomedicina na Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC) em Ilhéus – BA e colei grau em 21 de janeiro de 2009.

Durante o curso de graduação, a partir do terceiro período fui trabalhar no Laboratório de

Farmacogenética e Epidemiologia Molecular (LAFEM), onde fui bolsista de iniciação

científica por um ano, atuando na investigação da relevância e distribuição de

polimorfismos genéticos de enzimas, como a arilamina N-acetiltransferase 2 (NAT2),

segundo sua contribuição para a biotransformação de drogas e como fator de risco para

disfunções orgânicas. Assim, terminei o curso com experiência na área de Genética, com

ênfase em Farmacogenética, tendo como produto alguns resumos publicados em

congressos e ainda a experiência de organizar alguns eventos científicos. Ao final do

curso, conheci a área da Genética Humana e Médica, que me despertou muito interesse,

o que me levou a fazer Mestrado nessa área no Programa de Pós-Graduação em

Genética da Universidade Federal de Pernambuco. Durante o Mestrado obtive

experiência em muitas áreas da Genética Humana e Médica, tais como: Genotipagem;

Genética de Populações; Bioinformática. As áreas da Biomedicina que tenho mais

interesse são aquelas que utilizam as diversas aplicações da Genética Humana e da

Genética Molecular no estudo das doenças crônico-degenerativas, principalmente a

diabetes. Também durante o Mestrado tive a oportunidade de ir a vários eventos

científicos; realizar um estágio em um laboratório fora do estado de Pernambuco;

ministrar aulas e palestras. Tudo isso foi bastante importante para a minha formação

acadêmica.