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UNIVERSIDАDE ESTАDUАL DE CАMPINАS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
FLÁVIA GIACOMETTI CAVALHEIRO
Iogurte de alto teor proteico adicionado de Lactobacillus helveticus: fabricação, perfil de
peptídeos e aspectos sensoriais
CAMPINAS
2018
FLÁVIA GIACOMETTI CAVALHEIRO
Iogurte de alto teor proteico adicionado de Lactobacillus helveticus: fabricação, perfil de
peptídeos e aspectos sensoriais
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia
de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas
como parte dos requisitos exigidos para obtenção do
título de Mestra em Tecnologia de Alimentos.
Orientаdora: Profa Dra Mirna Lúcia Gigante
Este exemplar corresponde à versão final
da dissertação de mestrado defendida pela
aluna Flávia Giacometti Cavalheiro, e orientada
pela Profa. Dra. Mirna Lúcia Gigante.
CАMPINАS
2018
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Mirna Lúcia Gigante (Orientadora)
Universidade Estadual de Campinas
Dra. Maria Teresa Bertoldo Pacheco (Membro Titular)
Instituto de Tecnologia de Alimentos
Prof. Dr. Jorge Herman Behrens (Membro Titular)
Universidade Estadual de Campinas
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica da aluna Flávia Giacometti Cavalheiro.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Marcos e Maria Marta, pelo amor, confiança e apoio incondicionais
durante toda minha formação acadêmica e vida.
“Aos outros, dou o direito de ser como são. A mim, dou o dever de ser cada dia melhor”
Chico Xavier
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Maria Marta Giacometti e Marcos Cavalheiro, e meus
irmãos, Luciana Giacometti Cavalheiro e João Marcos Giacometti Cavalheiro, pelo o apoio e
motivação durante toda minha vida. Não seria quem sou hoje sem vocês.
Ao grupo de pesquisa de proteínas o qual tive a honra de fazer parte. Não foi por
acaso que fomos unidos durante essa etapa da minha vida, e sem dúvida ela não seria
finalizada sem a ajuda e apoio que pude contar com vocês nos momentos difíceis. À Débora
Parra Baptista, por todos os ensinamentos transmitidos, mas sobretudo pelo carinho, pelas
palavras de ânimo e paciência comigo nesses últimos dois anos. Sou muito grata pela sua
ajuda e sei que não teria conseguido sem você! Ao Bruno Domingues Galli, pela ajuda em
todas as etapas do meu trabalho, pelas risadas, momentos divertidos e principalmente pela
sincera amizade.
À minha orientadora, Profa. Dra. Mirna Lúcia Gigante, pela orientação,
compreensão e confiança em mim depositada desde a gradução até o término do mestrado.
Aos membros da banca examinadora pelas correções e sugestões para a redação
desse trabalho.
Ao Laboratorio ThoMson de Espectrometria de Massas, em especial à Fernanda
Negrão e ao Prof. Dr. Marcos Eberlin, pela parceria essencial.
Às técnicas do DTA, Ana Koon, Juliana Hashimoto, Aline, Leila, Bete e Diana,
que muito me ajudaram durante os experimentos.
A Fonterra, em especial ao Nilson Cremonese, pela doação de caseinato de cálcio
que viabilizou a fabricação dos iogurtes de alto teor proteico.
Às amigas de mestrado Mariana Barreto Carvalhal Pinto, Laura Suemitsu,
Fernanda Ramalho Procópio, Maria Isabel Landim Neves e Carol Maloper, por todas as
conversas, cafés e companheirismo, tornando meu dia a dia mais agradável e feliz durante o
mestrado.
À todas as amizades que ganhei durante a minha vida, incluindo as da graduação,
intercâmbio, as de Campo Grande e ao pessoal da salinha de pós-graduação, Ana Paula Barth,
Carolina Karaziack, Ana Tsuchiya, Mayara Queiros e Rodolfo Viriato. Todos sempre me
motivaram a dar meu melhor e seguir em frente.
Ao CNPq pela bolsa de estudos concedida.
Por fim, agradeço a Deus pela vida e por todas as experiências concedidas.
Muito obrigada!
RESUMO
Alimentos saudáveis e práticos despertam o interesse dos consumidores que têm cada vez
mais consciência da relação entre o consumo de alimentos saudáveis e seu impacto na
qualidade de vida. Alimentos com maior teor proteico e que ofereçam benefícios às condições
corpóreas, além da nutrição básica, são de interesse científico e industrial, destacando-se os
produtos lácteos fermentados com potencial para a produção de peptídeos bioativos através da
adição de cultura lácticas específicas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do teor
proteico e da adição de cultura adjunta sobre as características físico-químicas, com ênfase no
perfil peptídico, e sensoriais de iogurtes. As misturas lácteas utilizadas para a fabricação dos
iogurtes foram leite desnatado padronizado (iogurte controle) e adicionado de caseinato de
cálcio (iogurte de alto teor proteico). As misturas foram fermentadas utilizando-se
Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, adicionadas ou não
da cultura adjunta de Lactobacillus helveticus, resultando em quatro iogurtes em cada
processo. Durante a fabricação, avaliou-se o tempo de fermentação e após os processos os
iogurtes foram avaliados quanto à composição centesimal e contagem total de bactérias ácido
lácticas. Após 1, 10, 20, 30 e 40 dias de armazenamento a 4 ± 1 ºC, avaliou-se o pH,
proteólise por eletroforese capilar e perfil de peptídeos solúveis na fase aquosa e etanol 70 %
por MALDI-ToF MS. Os tratamentos afetaram significativamente o tempo de fermentação.
No entanto, este tempo foi o mesmo para o iogurte controle e com alto teor proteico
adicionado de Lactobacillus helveticus (180 minutos). A adição de Lactobacillus helveticus
resultou em maior pós-acidificação do iogurte, no entanto, após 40 dias de armazenamento
refrigerado todos os iogurtes apresentaram contagem de bactérias lácticas totais maior do que
o mínimo estabelecido pela legislação (107 UFC/g). O teor de proteínas não afetou o perfil de
peptídeos dos iogurtes. Entretanto, com a adição de Lactobacillus helveticus, observou-se
uma maior prevalência de peptídeos identificados como bioativos com potencial anti-
hipertensivo. Alguns peptídeos bioativos [m/z 1053 αS1-CN f(24-32), m/z 1151 β-CN f(199-
209), m/z 1881 β-CN f(193-209)] foram comuns a todos os tratamentos e significantes para a
separação das amostras. Outros, foram identificados apenas nos iogurtes adicionados de
Lactobacillus helveticus [m/z 748 β-CN f(108-113), m/z 1110 αS2-CN (81–89) e m/z 1718 β-
CN f(194-209)]. A avaliação sensorial indicou que o iogurte de alto teor proteico, não
adicionado de cultura adjunta e adoçado com açúcar foi considerado o mais próximo do ideal
pelos provadores. A adição de Lactobacillus helveticus promoveu a formação de peptídeos
considerados bioativos e anti-hipertensivos ao longo do tempo, enquanto o aumento do teor
proteico pela adição de caseinato de cálcio não influenciou a formação dos mesmos.
Palavras-chave: iogurte, peptídeos bioativos, espectrometria de massas.
ABSTRACT
Healthy and practical foods arouse consumers’ interest, who are aware of the relationship
between healthy food consumption and its impact on quality of life. In this context, foods
with higher protein content and that also offer health benefits that go beyond basic nutrition
are scientific and industrial interest, as the case of bioactive peptides. The aim of this study
was to evaluate the effect of the protein content and the addition of the adjunct culture on the
physico-chemical characteristics of yoghurts, with emphasis on the peptide profile and
sensory evaluation. Milk mixtures used to make the yogurts were standardized skim milk
(control yogurt) and added calcium caseinate (high-protein yogurt). The mixtures were
fermented using Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
with addition or not of the culture Lactobacillus helveticus, resulting in four yogurts in each
process. Fermentation time, composition and lactic acid bacteria counting of yogurts were
evaluated after manufacturing. After 1, 10, 20, 30 and 40 storage days at 4 ± 1 ºC, yogurts
were appraised for pH, proteolysis by capillary electrophoresis and soluble peptide profile in
the aqueous phase and 70 % ethanol by MALDI- ToF MS. Treatments were significantly
affected by fermentation time, which was the same for control yogurt and high protein content
with Lactobacillus helveticus (180 minutes). The addition of Lactobacillus helveticus resulted
in higher post-acidification, but even after 40 days of storage all treatments presented the
minimum total lactic acid count established by the legislation (107 CFU/g). Protein content
did not affect yogurt peptide profile. On the other hand, a higher prevalence of bioactive
peptides potentially antihypertensive was observed in Lactobacillus helveticus yogurts. Some
bioactive peptides [m/z 1053 αS1-CN f(24-32), m/z 1151 β-CN f(199-209), m/z 1881 β-CN
f(193-209)] were common to all treatments and important to samples separation. Others
bioactive peptides were identified only in yogurts with addition of Lactobacillus helveticus
[m/z 748 β-CN f(108-113), m/z 1110 αS2-CN f(81-89), m/z 1718 β-CN f(194-209)]. Tasters
considered high-protein yogurt added with sugar and with no addition of adjunct culture as
the closest to ideal. Briefly, increasing protein content and using Lactobacillus helveticus
resulted in yogurts of greater nutritional value, with the benefit of bioactive peptides presence.
Key words: yogurt, bioactive peptides, mass spectrometry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma de fabricação de iogurte...................................................................... 33
Figura 2 – Comportamento do pH durante a fermentação das misturas lácteas na fabricação
dos iogurtes ............................................................................................................................ 40
Figura 3 - Curvas de acidez titulável (% ácido láctico) durante a fermentação das misturas
lácteas na fabricação dos iogurtes ........................................................................................... 41
Figura 4 - Efeito do teor de proteína sobre a média do pH dos iogurtes não adicionados de
caseinato de cálcio (iogurte controle; iogurte controle com Lb. helveticus) e adicionados de
caseinato de cálcio (iogurte com alto teor proteico; iogurte com alto teor proteico e Lb.
helveticus ) .............................................................................................................................. 45
Figura 5 - Efeito da interação entre o tipo de cultura e o tempo de armazenamento refrigerado
sobre os valores de pH ............................................................................................................ 45
Figura 6 - Correlação entre os valores de pH para as diferentes culturas lácticas .................. 46
Figura 7 - Eletroferograma capilar das frações solúveis dos iogurtes controle adicionados ou
não com Lb. helveticus (a) e iogurtes com alto teor proteico adicionados ou não com Lb.
helveticus (b), após 1 e 40 dias de estocagem refrigerada ...................................................... 47
Figura 8 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte controle solúveis na fase aquosa e
diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF .............................................................................. 49
Figura 9 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte controle com Lb. helveticus solúveis
na fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF .................................................. 50
Figura 10 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte com alto teor proteico solúveis na
fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF........................................................ 51
Figura 11 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte com alto teor proteico e Lb.
helveticus solúveis na fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF ................... 52
Figura 12 - Análise discriminante pelo método de quadrados mínimos parciais (PLS-DA).
Gráficos de escores dos iogurtes controle (a), iogurtes controle e Lb. helveticus (c), iogurtes
com alto teor proteico (e), iogurtes com alto teor proteico e Lb. helveticus (g); gráficos de
pesos dos iogurtes controle (b), iogurtes controle e Lb. helveticus (d), iogurtes com alto teor
proteico (f), iogurtes com alto teor proteico e Lb. helveticus (h). (•) 1 dia; (•) 10 dias; (•) 20
dias; (•) 30 dias; (•) 40 dias ..................................................................................................... 64
Figura 13 – Peptídeos importantes identificados por PLS-DA para os iogurtes controle (a),
iogurtes controle com Lb. helveticus (b), iogurtes com alto teor proteico (c), iogurtes com alto
teor proteico e Lb. helveticus (d). As caixas coloridas à direita indicam as concentrações
relativas dos correspondentes metabólitos em cada grupo em estudo. VIP score > 1 é
considerado estatisticamente significante. .............................................................................. 66
Figura 14 – Intensidades relativas (%) dos peptídeos bioativos m/z 1053 [αS1-CN f(24-32)],
1151 [β-CN f(199-209)] e 1881 [β-CN f(193-209)] ao longo dos 40 dias de armazenamento.
(a) iogurte controle; (b) iogurte controle com Lb. helveticus; (c) iogurte com alto teor
proteico; (d) iogurte com alto teor proteico e Lb. helveticus .................................................. 67
Figura 15 - Intensidades relativas (%) dos peptídeos bioativos m/z 748 [β-CN f(108-113)],
1110 [αS2-CN (81–89)] e 1718 [β-CN f(194-209)] ao longo dos 40 dias de armazenamento.
(a) iogurte controle com Lb. helveticus; (b) iogurte com alto teor proteico e Lb.
helveticus.................................................................................................................................. 68
Figura 16 - Análise discriminante pelo método de quadrados mínimos parciais). Gráficos de
escores dos iogurtes com 1 dia (a), 20 dias (c) e 40 dias de estocagem refrigerada (e); gráficos
dos pesos dos iogurtes com 1 dia (b), 20 dias (d) e 40 dias de estocagem refrigerada (f) (•)
iogurte controle (C); (•) iogurte controle com Lb. helveticus (CLh); (•) iogurte com alto teor
proteico (Ca); (•) iogurte com alto teor proteico e Lb. helveticus (CaLh)............................... 71
Figura 17 - Peptídeos importantes identificados por PLS-DA para os iogurtes com 1 dia (a),
com 20 dias (b) e com 40 dias de estocagem (c). As caixas coloridas à direita indicam as
concentrações relativas dos correspondentes metabólitos em cada grupo em estudo. VIP score
> 1 é considerado estatisticamente significante. Iogurte controle (C); iogurte controle e Lb.
helveticus (CLh); iogurte com alto teor proteico (Ca); iogurte com alto teor proteico e Lb.
helveticus (CaLh) .................................................................................................................... 72
Figura 18 - Frequência de citação de cada atributo pelos avaliadores .....................................74
Figura 19 - Agrupamento e dispersão dos dados obtidos através da técnica de perfil Flash para
as 6 amostras de iogurte de alto teor proteico. A: iogurte não adoçado e sem Lb. helveticus; B:
iogurte com açúcar e sem Lb. helveticus; C: iogurte com sucralose e sem Lb. helveticus; D:
iogurte não adoçado e com Lb. helveticus; E: iogurte com açúcar e Lb. helveticus; F: iogurte
com sucralose e Lb. helveticus ............................................................................................... 75
Figura 20 – Gráfico com os atributos descritos pelos avaliadores (n=10) na avaliação dos
iogurtes com alto teor proteico no Perfil Flash ....................................................................... 75
Figura 21 - Configuração do consenso das amostras dimensões D1 e D2. A: iogurte não
adoçado e sem Lb. helveticus; B: iogurte com açúcar e sem Lb. helveticus; C: iogurte com
sucralose e sem Lb. helveticus; D: iogurte não adoçado e com Lb. helveticus; E: iogurte com
açúcar e Lb. helveticus; F: iogurte com sucralose e Lb. helveticus ......................................... 77
Figura 22 - Distribuição da variância residual dos provadores na solução bidimensional...... 77
Figura 23 - Representação das amostras de iogurte de alto teor proteico, do produto ideal e
dos termos significativos, na solução bidimensional na análise CATA. A: iogurte não adoçado
e sem Lb. helveticus; B: iogurte com açúcar e sem Lb. helveticus; C: iogurte com sucralose e
sem Lb. helveticus; D: iogurte não adoçado e com Lb. helveticus; E: iogurte com açúcar e Lb.
helveticus; F: iogurte com sucralose e Lb. helveticus ............................................................. 80
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características das proteínas mais utilizadas como suplementos proteicos ........... 23
Tabela 2 - Peptídeos com atividade bioativa em leites fermentados ...................................... 26
Tabela 3 - Formulação dos iogurtes considerados para análise sensorial ............................... 37
Tabela 4 - Composição físico-química das misturas utilizadas na fabricação dos iogurtes e
valores de p ............................................................................................................................. 39
Tabela 5 - Parâmetros de fermentação obtidos durante a produção dos iogurtes ................... 40
Tabela 6 - Composição físico-química, contagem microbiológica, desvio padrão e valor de p
dos iogurtes após 24 horas de fabricação ................................................................................ 42
Tabela 7 - Efeito do teor de proteína, tipo de cultura, tempo e da interação desses fatores sobre
pH dos iogurtes (ANOVA) ..................................................................................................... 44
Tabela 8 – Peptídeos (m/z) do iogurte controle solúveis na fase aquosa e etanol 70 %
detectados por MALDI-ToF MS e reportados em intensidade relativa (intensidade relativa
média ± desvio padrão) ao longo da estocagem ...................................................................... 53
Tabela 9 - Peptídeos (m/z) do iogurte controle com Lb. helveticus solúveis na fase aquosa e
etanol 70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados em intensidade relativa
(intensidade relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem .................................... 55
Tabela 10 - Peptídeos (m/z) do iogurte com alto teor proteico solúveis na fase aquosa e etanol
70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados em intensidade relativa (intensidade
relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem ......................................................... 57
Tabela 11 - Peptídeos (m/z) do iogurte com alto teor proteico e Lb. helveticus solúveis na fase
aquosa e etanol 70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados em intensidade relativa
(intensidade relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem .................................... 59
Tabela 12 - Explicação (%) da solução multidimensional para o Perfil Flash ....................... 76
Tabela 13 - Explicação (%) da solução multidimensional para o CATA ............................... 78
ANEXO 1
Tabela 1 - Atributos melhor correlacionados (|r|) com as duas primeiras dimensões (D1, D2)
para cada provador no Perfil Flash ......................................................................................... 93
Tabela 2 - Porcentagem dos provadores que selecionaram cada um dos termos em CATA.. 94
SUMÁRIO
1. Introdução .......................................................................................................... 15
2. Revisão Bibliográfica ........................................................................................ 17
2.1 Leites fermentados e iogurte ............................................................................... 17
2.2 Leites fermentados e iogurte com alto teor proteico ........................................... 19
2.3 Importância tecnológica e nutricional das proteínas do leite .............................. 22
2.4 Peptídeos bioativos e proteínas do leite .............................................................. 24
2.5 Avaliação da atividade bioativa ........................................................................... 28
2.6 Análise Sensorial ................................................................................................. 29
3. Material e métodos ............................................................................................ 31
3.1 Material ............................................................................................................... 31
3.2 Fabricação do iogurte .......................................................................................... 31
3.2.1 Preparo das culturas lácticas ............................................................................... 31
3.2.2 Processo de fabricação do iogurte ....................................................................... 32
3.3 Caracterização das matérias-primas e misturas padronizadas ............................ 33
3.4 Caracterização do iogurte .................................................................................... 34
3.4.1 Análises físico-químicas ..................................................................................... 34
3.4.2 Análises microbiológicas ................................................................................... 34
3.5 Proteólise avaliada por Eletroforese Capilar ..................................................... 35
3.6 Fracionamento dos peptídeos pela solubilidade em água e etanol 70 % e análise
por MALDI-ToF MS .......................................................................................... 35
3.7 Delineamento experimental e análise dos resultados ......................................... 36
3.8 Análise sensorial ................................................................................................ 37
4. Resultados e discussão ..................................................................................... 39
4.1 Caracterização físico-química da matéria-prima e misturas lácteas controle e com
alto teor proteico ................................................................................................. 39
4.2 Caracterização da fermentação dos iogurtes controle e com alto teor proteico
adicionados ou não de Lb. helveticus .............................................................. 40
4.3 Caracterização dos iogurtes ................................................................................ 42
4.4 Efeito do tempo de armazenamento refrigerado, do teor de proteína e do tipo de
cultura na pós-acidificação dos iogurtes ............................................................ 44
4.5 Efeito dos tratamentos e do tempo de armazenamento sobre a proteólise dos
iogurtes ............................................................................................................... 47
4.6 Análise sensorial .................................................................................................. 75
4.6.1 Perfil Flash .......................................................................................................... 75
4.6.2 CATA (Check-all-that-apply) ............................................................................. 77
5. Conclusão ........................................................................................................... 80
6. Referênciаs ......................................................................................................... 81
ANEXO 1 - Tabelas utilizadas nas análises sensoriais Perfil Flash e CATA ....................... 93
ANEXO 2 - Parecer consubstanciado do comitê de ética em pesquisa .................................. 96
ANEXO 3 - Laudo das análise microbiológica dos lotes submetidos á análises sensoriais. 101
15
1. Introdução
A produção de alimentos altamente nutritivos que favoreçam a saúde e o bem-
estar dos consumidores é uma das principais tendências observadas pela indústria de
alimentos. Neste contexto de saudabilidade, o leite e os produtos lácteos fermentados,
especialmente o iogurte, ocupam um lugar de destaque no mercado. Além de ser naturalmente
associado a produtos saudáveis, o iogurte é relacionado à conveniência e praticidade de
consumo. É disponibilizado em porções individuais, embalagens de fácil abertura e descarte,
podendo também ser consumido em trânsito (ITAL, 2010).
Assim, produtos com apelo saudável, como iogurtes probióticos, prebióticos e
simbióticos, vêm sendo disponibilizados no mercado há alguns anos. Mais recentemente, o
interesse por alimentos de grande aporte nutricional levou ao desenvolvimento de iogurte com
alto teor proteico, destinados àqueles que buscam ganho de massa muscular, diminuição de
apetite e/ou prevenção da atrofia muscular, como no caso de idosos (DOUGLAS et al., 2013;
VANDEWATER & VICKERS, 1996; MARQUESAN, 2012).
Pode-se alegar alto teor proteico quando um produto alimentício fornece no
mínimo 12 g de proteína por porção do produto em uma dieta genérica de 2000 kcal/dia
(BRASIL, 2012). Neste caso, mais uma vez os produtos lácteos encontram-se em destaque.
Através do uso de tecnologias de membranas, em especial a ultrafiltração, viabilizou-se a
produção em larga escala de caseinatos, concentrados e isolados proteicos de soro, atualmente
utilizados no enriquecimento de produtos lácteos em geral (BORGES et al., 2001).
Além da importância nutricional, as proteínas do leite podem ser degradadas e dar
origem a novos compostos biologicamente ativos. É o caso dos peptídeos bioativos, os quais
se apresentam geralmente inativos na molécula de proteína, mas quando liberados em
sequências menores apresentam atividade similar a uma droga ou hormônio, capazes de
modular funções fisiológicas. Estes peptídeos exercem diferentes atividades, destacando-se as
atividades antioxidante, antimicrobiana, hipocolesterolêmica, ação anti-hipertensiva, anti-
carcinogênica e efeitos imunomoduladores (TAVERNITI & GUGLIELMETTI, 2012).
Dentre os peptídeos bioativos, os peptídeos anti-hipertensivos são os mais
estudados e bem caracterizados na literatura (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2004;
ROBERT et al., 2004; OTTE et al., 201; NIELSEN et al., 2009). Tanto a hidrólise das
caseínas como das proteínas do soro são fontes importantes de peptídeos bioativos. Porém, os
peptídeos liberados pela hidrólise de proteínas do soro apresentam níveis relativamente baixos
16
de atividade anti-hipertensiva quando comparados às sequências derivadas da caseína. Assim,
a escolha do tipo de proteína a ser adicionada dependerá das características a serem
desenvolvidas no produto de alto teor proteico. Enquanto as proteínas do soro são muito
utilizadas na área de nutrição esportiva devido sua rápida digestibilidade e composição de
aminoácidos, as caseínas têm se mostrado uma fonte mais adequada para produção de
peptídeos bioativos com potencial anti-hipertensivo (FITZGERALD & MURRAY, 2006;
FOX et al., 2017).
A liberação desses peptídeos a partir do leite ocorre pela ação de enzimas
proteolíticas, seja durante a digestão no organismo humano ou durante processos
fermentativos e/ou de maturação em produtos lácteos. Essas enzimas podem estar
naturalmente presentes no leite, no trato digestivo humano ou ainda associadas à presença de
coagulantes ou de bactérias ácido lácticas (PHELAN et al., 2009).
Do ponto de vista tecnológico, a fabricação de produtos lácteos fermentados ricos
em peptídeos bioativos requer o controle do processo de fermentação. Este controle inclui os
parâmetros de processo, o substrato disponível e a escolha do microrganismo capaz de liberar
os peptídeos de interesse no produto. Diversos microrganismos são estudados com este
propósito, sendo que culturas de Lactobacillus helveticus vêm se mostrando as mais capazes
em produzir peptídeos bioativos devido à atividade acentuada de suas proteases associadas à
membrana celular (FUGLSANG et al., 2003; TAVERNITI & GUGLIELMETTI, 2012).
Ao se considerar que os parâmetros de processo (temperatura de fermentação,
porcentagem de inóculo e pH final) são usualmente padronizados para fabricação do iogurte
através da fermentação do leite com Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus, a hipótese para este trabalho foi que o aumento do substrato disponível e o
uso de cultura adjunta que favorecesse a formação de peptídeos bioativos pudessem viabilizar
a fabricação de um iogurte com alto teor proteico e significativo potencial bioativo
Neste contexto, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito do teor proteico e da
adição da cultura adjunta na fabricação, perfil de peptídeos e características sensoriais de
iogurtes. O aumento do teor proteico foi obtido através da adição de caseinato de cálcio e a
cultura adjunta selecionado foi Lactobacillus helveticus LH-B02. Os iogurtes controles e de
alto teor proteico, adicionados ou não de Lactobacillus helveticus foram armazenados sob
refrigeração e avaliados até 40 dias após a fabricação.
17
2. Revisão Bibliográfica
2.1 Leites fermentados e iogurte
A fermentação é um dos métodos de preservação do leite mais antigos, sendo as
primeiras evidências desta prática relatadas há mais de 10.000 anos no Oriente Médio. O
processo fermentativo é resultante do desenvolvimento do conjunto de micro-organismos
contendo bactérias ácido lácticas que, por sua vez, metabolizam lactose em ácido láctico e
diminuem o pH do leite até o ponto isoelétrico das caseínas que precipitam formando um gel
firme e fino (FOX et al., 2015). Entende-se por leites fermentados os produtos que passaram
por fermentação láctica, adicionados ou não de outros ingredientes lácteos, como por exemplo
iogurte, kefir e coalhada (BRASIL, 2007). Sem dúvida, o iogurte compõe a categoria mais
importante dentre os leites fermentados, apresentando um crescente consumo pela população
(NIELSEN, 2017).
Iogurte é definido pela legislação brasileira como produto resultante da
fermentação do leite pela protocooperação das bactérias ácido lácticas Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus e Streptococcus thermophilus, ou ainda acompanhadas de
outras bactérias ácido lácticas. A contagem mínima das bactérias lácticas totais no iogurte
deve ser de 107 UFC/g ao longo do seu prazo de validade e o produto deve apresentar um
valor de acidez entre 0,6 a 1,5 g de ácido láctico/100 g do produto (BRASIL, 2007). Em
relação à quantidade de iogurte por unidade de embalagem, a ANVISA sugere 200 g ou mL
(BRASIL, 2003), porém esta pode variar de acordo com a marca ou tipo do produto.
Iogurtes podem ser classificados em firme ou batido, sendo o líquido considerado
um tipo de iogurte batido de baixa viscosidade, de acordo com seu método de produção e
estrutura física do coágulo. O processo de fabricação de iogurte pode ser resumido pela
recepção e pré-tratamento do leite, homogeneização, tratamento térmico, fermentação,
resfriamento, adição ou não de outros ingredientes, envase e armazenamento (TAMIME &
ROBINSON, 1999).
O pré-tratamento do leite inicia-se com a padronização do teor de gordura e
sólidos totais do leite, estando estes diretamente ligados à consistência final do produto. O
teor de sólidos totais ideal para a fabricação do iogurte varia de 15 a 20 g em 100 g de leite, e
o seu aumento pode ser conseguido removendo-se a água do leite pela evaporação ou
ultrafiltração, ou pela adição de pós como leite desnatado, leitelho, caseinatos e concentrados
proteicos de soro (BONG et MORARU, 2014). Podem ser adicionados ainda adoçantes,
18
conservantes, aromas e estabilizantes, tais como gomas naturais e sintéticas, melhorando a
capacidade de retenção de água do produto e diminuindo os efeitos de perda de firmeza do
coágulo devido às etapas de processo (BULDO et al., 2016).
Em seguida, realiza-se a homogeneização com o principal objetivo de se prevenir
a separação da gordura durante a fermentação. Na sequência, procede-se o tratamento
térmico, sendo utilizado normalmente o binômio tempo x temperatura 85°C/30 min. Esta
etapa tem por finalidade a destruição de patógenos e micro-organismos indesejáveis,
produção de fatores estimulantes para o desenvolvimento das culturas lácticas e mudanças nas
propriedades físico-químicas do produto. Tais mudanças são descritas como a desnaturação
das proteínas do soro pela aplicação do tratamento térmico e sua posterior interação com as
caseínas presentes na superfície da micela, diminuindo a sinérese e melhorando a firmeza do
coágulo (HARTE et al., 2003).
Após o tratamento térmico, efetua-se a fermentação da mistura na temperatura
ótima da cultura láctica (40 - 45 °C). O processo fermentativo do iogurte decorre da ação
conjunta entre as bactérias Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus. No início da fermentação, a ação proteolítica dos lactobacilos origina pequenos
peptídeos e aminoácidos, especialmente a valina, promovendo o desenvolvimento dos
estreptococos. Estes, por sua vez, produzem ácido fórmico e CO2 que favorecem o
desenvolvimento dos lactobacilos. Com esta associação de bactérias lácticas, ocorre uma
produção mais rápida de ácido láctico por ambas as culturas, como também a formação de
compostos característicos do iogurte como acetaldeído, ácido acético e diacetil. Por fim,
realiza-se um resfriamento para se controlar a atividade metabólica das bactérias e enzimas e
obter-se a acidez final desejada ao produto (WALSTRA et al., 2006).
Além da cultura tradicional de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus podem ser adicionadas outras bactérias com o objetivo de se
criar produtos com diferentes características ou com propriedades terapêuticas desejáveis,
como no caso dos iogurtes probióticos (STANTON et al., 2001). Muitas vezes, a cultura
adjunta poderá alterar características físico-químicas, sensoriais e microbiológicas durante o
processo e armazenamento do produto, sendo necessário considerar sua influência sobre as
propriedades finais do alimento. Um exemplo dessa influência é a utilização de Lactobacillus
acidophilus LA-5 na elaboração de iogurte firme probiótico (RIBEIRO et al., 2014). A
presença do micro-organismo probiótico favoreceu a pós-acidificação do iogurte refrigerado.
No caso da utilização de culturas lácticas produtoras de exopolissacarídeos, fatores como a
19
acidez do meio utilizado, temperatura de incubação e variação da cepa influenciam o
rendimento e o tipo de carboidrato originado no produto final (BULDO et al., 2016;
GROBBEN et al., 1998). Por outro lado, iogurtes e leites fermentados adicionados de
Bifidobacterium spp. apresentaram diferente perfil sensorial de sabor devido a produção de
ácido acético por este gênero (YERLIKAYA, 2014). Logo, torna-se necessário o
conhecimento e estudos prévios de como será afetada a fermentação ou pós-acidificação dos
iogurtes para cada tipo de cultura adjunta utilizada.
Devido à flexibilidade do uso de diferentes ingredientes na fabricação do iogurte,
como por exemplo a adição de diversas polpas de frutas, aromas, adoçantes ou adição de
fibras e micro-organismos probióticos, criou-se uma grande variedade de tipos de produtos no
mercado que acabou impulsionando o seu consumo. Atualmente, há uma crescente busca por
alimentos relacionados com a saúde, categoria em que o iogurte é o maior representante com
crescimento de 136% na demanda (NIELSEN, 2017).
A crescente procura por produtos relacionados à conveniência e praticidade de
consumo aumentou a demanda por alimentos de embalagens de fácil abertura, descarte,
porções individuais e que possam ser consumidos em trânsito, categoria na qual o iogurte está
inserido. Considerado um alimento prático, o iogurte também é visto pelos consumidores
como saudável. É indicado como um dos produtos de maior crescimento relativo de vendas
entre os anos 2000 e 2008, além de ser o que mais desperta interesse e desejo do consumidor
quando lançado no mercado (ITAL, 2010).
Dessa forma, o potencial de crescimento do mercado de iogurte é elevado no país,
uma vez que ainda há espaço para ampliação de produção. Nesta linha estão inseridos os
iogurtes probióticos e de alto teor proteico, sendo esta última categoria a de maior expectativa
de crescimento. Espera-se que o mercado global de alimentos com alto teor de proteínas atinja
91,07 bilhões de dólares até 2021 (TECHNAVIO, 2017), evidenciando a oportunidade de
mercado para este tipo de produto.
2.2 Leites fermentados e iogurte com alto teor proteico
A formulação e consumo de um iogurte contendo alto teor proteico pode ser um
aliado de pessoas ativas que buscam opções de alimentos saudáveis e que auxiliem no ganho
de massa muscular. Pessoas de maior faixa etária, como os idosos, representam um
importante mercado consumidor de produtos com alto teor de proteínas, uma vez que perdem
massa magra em maiores proporções quando comparadas às pessoas mais jovens, condição
20
chamada sarcopenia (FIB, 2016). Além disso, o consumo de leites e derivados quando
integrados a uma dieta de alto teor proteico aumenta a absorção intestinal de cálcio e melhora
a integridade dos ossos, sendo indicado para pacientes acima do peso, obesos e idosos
(PASIAKOS, 2015). Pesquisas também indicam que o consumo de produtos proteicos, entre
eles o iogurte, diminuem o apetite e aumentam a saciedade nos consumidores, tornando-se um
aliado daqueles que buscam a perda de peso (DOUGLAS et al., 2013; VANDEWATER &
VICKERS, 1996).
De acordo com o Regulamento Técnico sobre Informação Nutricional
Complementar, resolução nº 54 da ANVISA de 12 de novembro de 2012 (BRASIL, 2012),
um iogurte só poderá ser considerado de alto teor proteico caso apresente no mínimo 12 g de
proteína por porção.
O teor proteico alcançado pelo iogurte quando se faz a adição de sólidos visando a
padronização das características do produto depende da concentração de proteínas dos sólidos
adicionados. No geral, um iogurte comercial tradicional fornece, em média, 3,6 g de
proteína/100 g do produto. Já o iogurte grego oferece em média 6,2 g proteína/100 g do
produto (TAMIME & ROBINSON, 1999). Shakes e bebidas proteicas comerciais apresentam
um conteúdo de proteínas de 6 a 10 g/100 g do produto (RITTMANIC, 2006).
A padronização do teor de sólidos do iogurte com a finalidade de obter-se um
produto de melhor consistência e viscosidade é uma prática comum realizada pela indústria.
Diversos estudos utilizaram diferentes fontes proteicas para este fim. Entre eles, os
concentrados e isolados proteicos de soro (ANTUNES et al. 2015), caseinato de cálcio e sódio
(REMEUF et al, 2003; GURSEL et al., 2016; DAMIN et al., 2009) e leitelho em pó
(ROMEIH et al., 2014; SAFFON et al., 2013).
Porém, o aumento dos consumidores à procura de alimentos que apresentem
maiores teores de proteína impulsionou o desenvolvimento e pesquisa de iogurtes e leites
fermentados com maior teor proteico, pela adição principalmente de caseinatos e isolados
proteicos de soro (BONG & MORARU, 2014; CHO et al., 2015; JORGENSEN et al., 2015).
Vale ressaltar que estes dois últimos ingredientes são os mais indicados para a produção de
bebidas lácteas/iogurtes com alto teor proteico, uma vez que apresentam concentração de
proteína em torno de 90 %. Em relação aos caseinatos, os mais utilizados são os de cálcio e de
sódio. O caseinato de cálcio, apesar de ser de mais difícil dissolução, apresenta a vantagem
tecnológica de melhorar a estrutura do iogurte, devido ao maior número de pontes de cálcio
realizadas (REMEUF et al., 2003), além de aumentar a ingestão de cálcio, possivelmente
21
melhorando a saúde dos ossos (THORPE, 2008). O caseinato de sódio, por outro lado,
aumenta o teor de sódio do produto de alto teor proteico, o que não é recomendado uma vez
que o consumo excessivo de sódio está associado às doenças cardiovasculares (WHO, 2012).
Em um estudo recente, realizado por Gursel et al. (2016), os autores avaliaram o
efeito da adição de caseinato de sódio, concentrado proteico de soro 80 % e isolado proteico
de soro 90 % em iogurtes de cabra. Os ingredientes foram adicionados em 2 % (v/v), e
caracterizados quanto à composição físico-química, microbiológica, perfil de textura,
compostos voláteis e perfil sensorial. Os autores observaram que os iogurtes adicionados de
caseinato de sódio e concentrado proteico de soro apresentaram melhores características
físicas, sendo o iogurte com caseinato de sódio o melhor avaliado sensorialmente.
Já Damin et al. (2009) estudaram os efeitos da adição de caseinato de sódio 80 %,
concentrado proteico de soro 70 % e leite desnatado em pó na cinética de acidificação,
propriedades reológicas e microestrutura de iogurtes desnatados. Os autores observaram
diminuição no tempo de fermentação e aumento na firmeza com o aumento de concentração
do caseinato de sódio, enquanto os iogurtes suplementados com concentrado proteico de soro
não apresentaram diferenças quando comparados ao controle (leite em pó desnatado
reconstituído).
Um estudo realizado por Bong e Moraru (2014) analisou os efeitos do uso de
concentrados de caseína micelar, um ingrediente proteico obtido por meio de microfiltração
do leite, na produção de iogurtes gregos. Foram utilizados dois concentrados micelares
diferentes, com 58 % e 88 % de proteínas, os quais foram adicionados na formulação até
proporcionarem 9,8 % de proteína final do produto. Os iogurtes fortificados apresentaram
taxa de acidificação mais rápida que o controle, porém apresentaram menor capacidade de
retenção de água.
Os efeitos da desnaturação das proteínas do soro na estrutura e reologia de
iogurtes de alto teor proteico e baixo teor de gordura foram estudadas por Jorgensen et al.
(2015), através da adição de diferentes razões entre proteínas do soro nativas e concentrados
de caseína. Os autores observaram que os iogurtes adicionados de proteínas do soro
alcançaram o pH 4,6 mais rapidamente que os adicionados de concentrados de caseína, bem
como apresentaram maior firmeza.
22
2.3 Importância tecnológica e nutricional das proteínas do leite
As principais proteínas do leite são as caseínas e as proteínas do soro. As caseínas
compõem 80 % do total de proteínas, existindo na forma de estruturas coloidais chamadas de
micelas de caseína. De outra maneira, as principais proteínas do soro são a β-lactoglobulina,
α-lactalbumina, soro albumina bovina, imunoglobulinas e lactoferrina, apresentando-se
tipicamente em estruturas globulares (FOX et al., 2015).
Durante as últimas décadas, vários modelos da estrutura das micelas de caseína
vêm sendo propostos (WALSTRA, 2006; HORNE, 2000; DALGLEISH, 2004), porém existe
a concordância dos pesquisadores da área com relação às propriedades gerais da micela. Entre
elas está o fato das micelas serem estruturas complexas formadas por frações αS1, αS2, β e κ-
caseínas, cada uma apresentando funcionalidades e características diferentes. Uma delas, por
exemplo, é a quantidade de resíduos fosfato-serina por mol, responsáveis pela carga negativa
e pelas regiões hidrofílicas presentes na superfície da micela. Estes resíduos, concentrados em
clusters, estão mais presentes nas caseínas α e β e estas frações precipitariam ao se ligarem ao
Ca+2 se não fossem estabilizadas pela κ-caseína, que é solúvel mesmo em altas concentrações
de Ca+2 e tem capacidade de ligar-se hidrofobicamente às frações α e β.
A formação do gel através da acidificação do leite, ocasionada pela conversão da
lactose em ácido láctico pela ação da cultura láctica, é acompanhada de alterações físico-
químicas no leite. A acidificação governa um sistema físico-químico composto por forças de
desagregação e agregação das micelas de caseína. A desagregação é ocasionada
principalmente pela solubilização do fosfato de cálcio coloidal presente na micela, levando à
desagregação intermicelar. Por outro lado, as forças de agregação decorrem majoritariamente
pela redução da carga negativa superficial da micela de caseína. Em valores de pH mais
baixos, as forças de agregação prevalecem e desestabilizam o sistema, promovendo a
formação do gel (FOX et al., 2000).
As proteínas apresentam diferentes funções fisiológicas de acordo com a
composição e sequência de aminoácidos, características estruturais, dimensões e configuração
das cadeias polipeptídicas. A β-lactoglobulina e a α-lactalbumina, consideradas as principais
proteínas do soro, apresentam ligações –S-S– e grupos sulfidril livre. Ao ocorrer mudanças no
pH ou temperatura, as proteínas podem sofrer diversas mudanças em suas estruturas terciária
e quaternária, desnaturando-se e expondo grupos reativos. Dessa forma, as proteínas do soro
podem formar ligações dissulfídicas entre si ou com outras proteínas, como a κ-caseína e αS2-
caseína (FOX et al., 2015). Tais pontes são muito importantes para o melhoramento da matriz
23
proteica formada durante a fabricação de iogurtes com leites pré-aquecidos, uma vez que as
ligações dissulfeto ajudam na formação de coágulos mais firmes e menos susceptíveis à
sinérese (TAMIME & ROBINSON, 1999).
Nos últimos anos, as proteínas do leite vêm recebendo muita atenção nas áreas de
nutrição esportiva e clínica pelo seu importante benefício fisiológico (MCSWEENEY et al.,
2013). O sistema muscular é o tecido humano capaz de desenvolver força, tornando possíveis
atividades básicas como manter a postura, deglutir e se movimentar, constituindo uma reserva
de proteínas e aminoácidos degradados e regenerados constantemente conforme as
necessidades do metabolismo. Em certas situações essa necessidade é elevada, tal como
durante atividade física intensa, exigindo uma maior ingestão de proteínas. Em pessoas
idosas, a correta ingestão de aminoácidos e a prática de exercícios físicos são importantes na
manutenção da massa muscular, diminuindo as consequências da atrofia dos músculos e
melhorando a qualidade de vida dos indivíduos (MARQUESAN, 2012).
Dangin et al. (2003) destacam as diferenças entre o tipo de proteína e as
quantidades ingeridas após a atividade física, e como esses fatores influenciam na síntese
proteica. As proteínas do soro, assim como as da soja e do colágeno hidrolisado, são
absorvidas de forma mais rápida quando comparadas à caseína, ou seja, apresentam maior
digestibilidade e são classificadas dessa forma como fast protein. A Tabela 1 apresenta as
características de aminoácidos e a digestibilidade das proteínas mais utilizadas como
suplementos proteicos.
Tabela 1 - Características das proteínas mais utilizadas como suplementos proteicos.
Proteínas do soro Caseína Soja
Colágeno
hidrolisado
Contém todos os AAE1 Sim Sim Sim Não
Digestibilidade Rápida Lenta Rápida Rápida
Conteúdo de aminoácidos
(g/25 g proteína)
Leucina 3,0 2,3 1,5 0,8
Σ AAE1 12,4 11,0 9,0 3,8
Σ AACR2 5,6 4,9 3,4 1,4
Fonte: DEVRIES & PHILLIPS, 2015. 1Aminoácidos essenciais; 2Aminoácidos de cadeia ramificada.
24
A absorção proteica mais rápida aumenta as concentrações plasmáticas de
aminoácidos essenciais, como a leucina, e também os níveis de insulina plasmática. A leucina
mostra-se como um ativador chave na síntese das proteínas do músculo (PHILLIPS et al.,
2011), enquanto maiores níveis de insulina promovem maior absorção de glicose e favorecem
a captação de aminoácidos para o interior da célula muscular. O estudo realizado por
Reitelseder et al. (2011) demonstrou, entretanto, taxas iguais de síntese proteica para as
proteínas do soro e para o caseinato de cálcio quando ingeridos após exercícios de resistência,
evidenciando a importância de suplementos esportivos a base de caseinato de cálcio.
Produtos formulados com caseinato podem ser utilizados também como
suplementos para idosos ajudando na manutenção da massa muscular esquelética, uma vez
que esta se perde de acordo com o envelhecimento ou inatividade física da pessoa. Esse
processo é resultado da menor taxa metabólica em pessoas com idade mais avançada, dada a
diminuição da síntese, aumento da degradação proteica e menor capacidade de conversão de
gordura em energia (INELMEN, 2003). O leite bovino apresenta uma proporção
relativamente alta de leucina em comparação a outros tipos de proteína comumente utilizadas
como suplemento proteico (Tabela 1). A combinação de diferentes proteínas presente no leite
auxilia na síntese muscular rápida (proteínas do soro) e sustentada (caseínas), juntamente com
reduções na degradação de proteínas musculares. A partir dessa perspectiva, as proteínas do
leite fornecem benefícios às pessoas ativas, durante a prática de atividades físicas intensas, e
também às pessoas idosas, com menor frequência de atividade física (FORBES et al., 2012).
Além das funções nutricionais básicas das proteínas no corpo humano, as
proteínas do leite podem também originar componentes biologicamente ativos, que impactam
positivamente na saúde. São os chamados peptídeos bioativos, que são frações proteicas
liberadas durante hidrólise pelas enzimas digestivas, por enzimas proteolíticas de vegetais ou
micro-organismos e pela fermentação do leite por culturas lácticas proteolíticas
(KORHONEN et PIHLANTO, 2003).
2.4 Peptídeos bioativos e proteínas do leite
Peptídeos bioativos são formados por fragmentos específicos de proteínas que
induzem respostas fisiológicas positivas no corpo humano. Ao se ligarem a receptores
específicos de suas células alvo, podem gerar atividades reguladoras nos sistemas imune,
cardiovascular, endócrino, digestivo e nervoso (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2011).
Quando presentes nas cadeias polipeptídicas das moléculas de proteína, tais sequências
25
bioativas encontram-se inativas, porém, quando liberados, esses peptídeos exercem diferentes
atividades, destacando-se as atividades antioxidante, antimicrobiana, hipocolesterolêmica,
ação anti-hipertensiva, anti-carcinogênica, e efeitos imunomoduladores (TAVERNITI &
GUGLIELMETTI, 2012).
As proteínas do leite bovino, caseínas e proteínas do soro, são consideradas as
melhores fontes de peptídeos bioativos quando comparadas a proteínas de outros alimentos.
Na fabricação de produtos lácteos fermentados, tais proteínas são hidrolisadas por proteases e
peptidases naturais do leite, em especial às resistentes ao tratamento térmico, ou originárias de
bactérias ácido lácticas da cultura utilizada no processo de fermentação. Estas enzimas
utilizam o substrato proteico naturalmente presente no leite como fonte de nitrogênio
necessária ao seu desenvolvimento (MCCARTHY, 2014).
A fermentação do leite é um importante recurso na produção de peptídeos
bioativos, que é objeto de grande interesse de estudo nos últimos anos. Inúmeros autores
relataram a identificação de peptídeos que apresentam atividades anti-hipertensivas (QUIRÓS
et al., 2006; AHTESH et al., 2016; NIELSEN et al., 2009; FUGLSANG et al., 2003),
antioxidantes (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2005; VIRTANEN et al. 2007; CHO et al.,
2015; ALOGLU & ÖNER, 2011), hipocolesterolêmica, antitrombóticas e imunomodeladoras
(TAVERNITI & GUGLIELMETTI, 2012; PARK, 2009) em leites fermentados e iogurtes.
Algumas das atividades fisiológicas são descritas na Tabela 2.
Atualmente, a atividade bio-funcional mais estudada e comprovada em produtos
lácteos fermentados é a ação anti-hipertensiva. Peptídeos com atividade anti-hipertensiva
atuam na redução da pressão arterial através da inibição da ação da enzima conversora de
angiotensina (ECA), reguladora da pressão arterial (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2011;
AKUZAWA et al., 2009). A ECA faz parte do sistema renina-angiotensina, responsável pela
regulação da pressão arterial periférica. Ela atua como catalizador da conversão de
angiotensina I a angiotensina II, um potente vasoconstritor e, simultaneamente, catalisa a
degradação de bradicinina, um peptídeo vasodilatador (SIEBER et al., 2010). Essas duas
reações resultam em contração dos vasos sanguíneos e no consequente aumento da pressão
arterial. Desta forma, através da ação inibidora da ECA, peptídeos bioativos podem apresentar
importante papel na redução da pressão arterial (SIEBER et al., 2010; HERNÁNDEZ-
LEDESMA et al., 2011).
26
Tabela 2 - Peptídeos com atividade bioativa em leites fermentados.
Proteína precursora Peptídeo Classificação fisiológica
αS1-caseína
αS1-casecidina Antimicrobiana
Isracidina Antimicrobiana
αS1-casoquinina-5 ECA inibidor
Caseinafosfopeptídeo Ligações de Cálcio e transportador
αS1-caseína exorphina Agonista opioide
Casoxina D Agonista opioide
αS1-caseína exorphina Agonista opioide
αS2-caseína Casocidina-1 Antimicrobiana
Caseinafosfopeptideo Ligação de minerais
β-caseína
β-casoquinina-7 ECA inibidor
β-casoquinina-10 Imunomodulador e ECA inibidor
- Antihipertensivo
- Imunoestimulador
β-casomorfina-4, 5, 6, 7 e 11 Agonista opioide
Morficeptina Agonista opioide
Caseinofosfopeptideo Ligação de minerais
κ-caseína
κ-casecidina Antimicrobiana
Casoplatelina Antitrombótica
- Antitrombótica
Casoxina A Antagonista opioide
Casoxina B Antagonista opioide
Casoxina C Antagonista opioide
Caseinofosfopeptideo Ligação de minerais
α-lactalbumina α-lactorfina ECA inibidor e agonista opioide
β-lactoglobulina β-lactorfina ECA inibidor e agonista opioide
Lactoferrina Lactoferricina A Imunomodulador e antimicrobiana
Lactoferricina B Agonista opioide
Lactotransferrina - Antitrombótica
Albumina do soro bovina Serorfina Agonista opioide
Fonte: Adaptado de Ibeagha-Awemu, 2009.
27
A avaliação da atividade inibidora de ECA in vitro tem sido a ferramenta mais
utilizada para avaliar o potencial bioativo de leites fermentados e iogurtes (HERNÁNDEZ-
LEDESMA et al., 2004; ROBERT et al., 2004; OTTE et al., 201; NIELSEN et al., 2009).
Essa escolha baseia-se, possivelmente, na boa correlação entre os resultados obtidos in vitro e
a real atividade anti-hipertensiva do produto, demostrada através de testes in vivo com
animais (NAKAMURA et al., 1996; WU & DING, 2001;) e humanos (SEPPO et al., 2003;
MIZUSHIMA et al., 2004).
De acordo com Fitzgerald e Murray (2006), tanto a hidrólise das caseínas como
das proteínas do soro são fontes importantes de peptídeos hipotensores. Porém, os peptídeos
liberados pela hidrólise de proteínas do soro apresentaram níveis relativamente baixos de
atividade anti-hipertensiva quando comparados às sequências derivadas da caseína durante o
processo de fabricação de leites fermentados.
A escolha do tipo de bactérias ácido lácticas é um dos fatores que mais
influenciam a liberação de peptídeos bioativos em produtos lácteos fermentados. Bactérias
comumente relacionadas à liberação de biopeptídeos são Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactococcus lactis subsp. diacetylactis,
Lactococcus lactis subsp. cremoris e Streptococcus thermophilus (HERNÁNDEZ-
LEDESMA, 2011). De forma geral, culturas de Lactobacillus helveticus têm se mostrado
mais capazes de produzir peptídeos anti-hipertensivos do que culturas de Lactococcus lactis,
devido à atividade acentuada de suas proteases associadas à membrana celular (FUGLSANG
et al., 2003; TAVERNITI & GUGLIELMETTI, 2012).
As cepas de Lactobacillus helveticus apresentam diferentes capacidades de
acidificação e proteólise. Dessa forma, devem ser corretamente selecionadas de acordo com o
interesse biotecnológico (FORTINA et al. 1998; BROADBENT et al., 2011). Na literatura,
encontram-se diversos estudos sobre o uso de Lactobacillus helveticus e suas consequências
durante a fermentação de leites fermentados e iogurtes.
Nielsen et al. (2009) estudaram os efeitos de 13 cepas diferentes de bactérias
ácido lácticas no pH de fermentação, tempo de estocagem no perfil de peptídeos e na
atividade inibidora da enzima conversora de angiotensina. Foram avaliadas 4 cepas de
Lactococcus lactis, 8 cepas de Lactobacillus helveticus e 1 cepa de Lactobacillus acidophilus.
Os autores observaram que as maiores atividades inibidoras de ECA foram obtidas com as
duas cepas mais proteolíticas de Lactobacillus helveticus, MI 1198 (Chr. Hansen) e MI 1263
28
(National Collection of Dairy Organisms), após 7 dias de estocagem refrigerada e valores de
pH entre 4,3 - 4,6.
Para a identificação de peptídeos em leites fermentados e iogurtes, diferentes
técnicas de espectrometria de massas são utilizadas. As principais são a espectrometria de
massas por bombardeamento rápido (FAB-MS) (GOBBETI et al., 2000), espectrometria de
massas por ionização por eletrospray (ESI-MS) (ROBERT et al., 2004), espectrometria de
massas sequencial (MS/MS) (HERNÁNDEZ-LEDESMA et al., 2005), espectrometria de
massas por cromatografia líquida (LC-MS) (OTTE et al., 2011; JIN et al., 2016) e
espectrometria de massas por ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-ToF
MS) (Croxatto et al. ,2012). Segundo Croxatto et al. (2012), a técnica MALDI-ToF MS permite
a identificação e análise de frações proteicas que, por não apresentarem caráter volátil, não eram
possíveis anteriormente. Desde então, o MALDI-ToF MS tem sido utilizado com sucesso em
várias áreas da ciência, como por exemplo na genotipagem de DNA, reavaliação de taxonomia de
micro-organismos e aplicações na área de alimentos, apresentando alta precisão e sensibilidade.
2.5 Avaliação da atividade bioativa
O termo biodisponibilidade foi inicialmente proposto pela Food and Drug
Administration (FDA), como sendo a proporção do nutriente digerido capaz de ser absorvido,
metabolizado e disponível para ser usado ou armazenado pelo organismo. Porém, tornou-se
claro que este conceito era equivocado, uma vez que nem todas as substâncias digeridas são
absorvidas, e nem todos os nutrientes absorvidos são metabolizados, podendo ser diretamente
excretados pelo organismo. Inúmeras definições foram propostas posteriormente, gerando
ainda motivo de discussão pela comunidade científica. Entretanto, há o consenso de existirem
dois tipos de biodisponibilidade: a quantitativa, relativa ao teor do nutriente proveniente da
dieta, e a qualitativa, relacionada ao quanto esta substância consegue ser utilizada pelo
organismo em função de suas características bioquímicas e funcionais (COZZOLINO, 2016).
Dessa forma, os efeitos fisiológicos dos peptídeos bioativos dependem de sua
habilidade de alcançar, em sua forma ativa, seus tecidos e organismos-alvo. Devem ser,
portanto, resistentes às enzimas do trato gastrointestinal, serem absorvidas pelo epitélio do
intestino e posteriormente alcançar e atuar em seu órgão-alvo. Tal resistência é geralmente
avaliada em estudos in vitro que simulam condições digestórias. Os peptídeos IPP [β-CN
f(74-76)], VPP [β-CN f(84-86)] e LHLPLP [β-CN f(133–138)], por exemplo, demonstraram
ser resistentes à ação dessas enzimas. Já em outros casos, a forma ativa do peptídeo é liberada
29
durante o próprio processo digestório, como no caso da formação da forma ativa do peptídeo
KVLPVPQ [β-CN f(169–175)], gerado após hidrólise durante digestão pancreática
(HERNANDEZ-LEDESMA et al., 2011). Porém, certos peptídeos que demonstravam
atividade inibidora da ECA em estudos in vitro não apresentaram a mesma ação em ensaios in
vivo (MAENO et al., 1996), o que evidencia a importância da confirmação dos estudos por
meio de ensaios in vivo realizados com animais e humanos.
2.6 Análise Sensorial
Testes sensoriais são utilizados pela indústria de alimentos para investigar o perfil
sensorial de um produto, com o objetivo de avaliar a preferência de determinado atributo ou
de testar o impacto de uma nova formulação, a estabilidade de armazenamento, a mudança no
processamento ou na forma de embalagem. Assim, busca-se explicar e antecipar as
preferências do consumidor (DELARUE & SIEFFERMANN, 2004).
O Perfil Flash (Flash Profile) desenvolvido por Sieffermann (2000) faz parte dos
métodos descritivos, que utilizam equipes que descrevem de forma qualitativa e quantitativa
as amostras avaliadas. Porém, diferentemente dos métodos descritivos tradicionais como a
Análise Descritiva Quantitativa (ADQ), que necessita de um longo treinamento dos
avaliadores, inúmeras repetições e o desenvolvimento de uma linguagem comum para a
descrição de atributos, o Perfil Flash surge como uma alternativa mais rápida e simples ao se
descrever sensorialmente um produto.
O método Perfil Flash é uma técnica mais flexível e rápida, uma vez que as fases
de familiarização com o produto, geração de atributos e ordenação foram integradas em uma
única etapa. Os avaliadores classificam atributo por atributo, forçando-os a se concentrar nas
diferenças percebidas e a utilizar apenas atributos discriminantes. Por ser um método baseado
no Perfil Livre (WILLIAMS & LANGRON, 1984), os consumidores são livres para criar sua
própria lista de atributos, eliminando a etapa de consenso entre os participantes e a
necessidade de treinamento. Por fim, não há necessidade de avaliadores especialistas no
produto a ser analisado, mas sim pessoas com boa capacidade descritiva e dispostas a seguir
as instruções do líder da equipe, gerando atributos discriminantes e não hedônicos (DAIROU
& SIEFFERMANN, 2002).
O estudo realizado por Delarue et Sieffermann (2004) avaliou as percepções de
sabor em iogurtes de morango batidos e cremes de queijo fresco sabor pêssego. Foram
comparadas a técnica Perfil Flash e métodos descritivos convencionais, como ADQ, sendo
30
ambas as amostras melhor descritas pelo método Perfil Flash. Em outro estudo, realizado por
Alvarado et al. (2012), a melhor descrição de queijos Manchego também foi obtida com o
método Perfil Flash, reafirmando assim as vantagens do uso desta técnica na avaliação de
produtos lácteos.
Em relação a outras técnicas sensoriais descritivas, o método CATA (Check All
That Apply) está entre as metodologias mais rápidas atualmente utilizadas na avaliação
sensorial pelos consumidores. Uma lista de atributos previamente levantados para o tipo de
produto compõe os questionários de avaliação. Antes da avaliação das amostras, uma ficha é
entregue aos participantes para que estes preencham com o que consideram ser a amostra
ideal do produto em questão. O estudo realizado por Ares et al. (2014) avaliou sensorialmente
pelo método CATA oito formulações de iogurtes adoçados com açúcar, variando a
concentração de gordura, amido e gelatina. A técnica mostrou-se útil na identificação das
principais preferências pelos consumidores, e os avaliadores descreveram este método como
simples, intuitivo e não tedioso para a realização (ARES et al., 2014).
Para a avaliação sensorial de iogurtes desnatados probióticos, Cadena et al.
(2014) compararam o método ADQ com outras três técnicas sensoriais rápidas: mapa
projetivo, posicionamento sensorial polarizado e CATA. O método CATA foi o que
apresentou as configurações mais similares àquelas obtidas pela ADQ.
Independente da técnica utilizada para descrever/avaliar os produtos lácteos
fermentados em geral, e o iogurte em especial, a percepção sensorial é influenciada pela
presença ou não de açúcar e/ou tipo de adoçante. Em substituição à sacarose, a legislação
brasileira permite vários tipos de adoçantes em alimentos, como aspartame, sucralose,
clicamato e estévia (BRASIL, 1995). Contudo, a sucralose têm sido a mais utilizada na
formulação de iogurtes, bem como a mais bem avaliada sensorialmente (REIS et al., 2009).
31
3. Material e métodos
3.1 Material
Foram utilizadas as seguintes matérias primas: leite desnatado UHT (Piracanjuba,
Bela Vista de Goiás, GO, Brasil), leite em pó desnatado instantâneo (Itambé, Belo Horizonte,
MG, Brasil), cultura láctica mista de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus YF-L812 (Christian Hansen, Valinhos, SP, Brasil), cultura comercial de
Lactobacillus helveticus LH-B02 (Christian Hansen Valinhos, SP, Brasil) e caseinato de
cálcio (Fonterra, Auckland, Nova Zelândia). Os reagentes utilizados foram: acetonitrila grau
HPLC (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, Estados Unidos), ácido α-ciano-4-hidroxi-
cinâmico (CHCA, 99 %) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, Estados Unidos), ácido
trifluoracético (99 %) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, Estados Unidos), padrão α-CN, β-
CN, κ-CN (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, Estados Unidos) e padrão de calibração de
peptídeos II (Bruker Daltonics, Brémen, Alemanha).
As matérias primas foram adquiridas do mesmo lote de produção em quantidades
suficientes para a realização de todos os experimentos, evitando variação entre elas.
3.2 Fabricação do iogurte
3.2.1 Preparo das culturas lácticas
Utilizaram-se as culturas lácticas liofilizadas de Lactobacillus helveticus LH-B02
e a cultura mista YF-L812 contendo Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus na fabricação dos iogurtes. As culturas foram inoculadas separadamente em
leite em pó desnatado reconstituído e esterilizado em câmara de fluxo laminar. O leite
inoculado foi distribuído em porções menores que foram congeladas a -18 °C e mantidas
como cultura estoque. Para cada processamento uma porção de cada cultura láctica foi
descongelada e posteriormente ativada em leite em pó reconstituído e esterilizado. A cultura
láctica tradicional (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)
foi ativada a 45 °C por 4 h, enquanto a ativação do Lactobacillus helveticus foi realizada na
temperatura de 40 °C durante 18 h. O período de incubação necessário para a ativação da cepa
LH-B02 de Lactobacillus helveticus foi determinado através da curva de crescimento do
micro-organismo durante 24 h.
32
3.2.2 Processo de fabricação do iogurte
Os iogurtes foram fabricados conforme descrito na Figura 1. Inicialmente, o leite
UHT foi padronizado através da adição de leite em pó desnatado para a obtenção de 16 litros
de leite com 10 % de sólidos totais. O leite padronizado foi dividido em duas porções de 8
litros, sendo uma delas utilizada para fabricação dos iogurtes controle e a outra adicionada de
caseinato de cálcio para padronização do teor de proteínas no mínimo em 6 %,
correspondendo a 12 g de proteína/200 mL de leite, mínimo exigido para um produto de alto
proteico. A adição do caseinato de cálcio foi efetuada a aproximadamente 60 °C, sob agitação
mecânica contínua para sua dispersão. Em seguida, as misturas foram tratadas termicamente
(85 °C/30 min), resfriadas em banho de gelo e mantidas a 4 °C durante a noite para ocorrer a
completa hidratação das proteínas antes da preparação do iogurte (BULDO et al., 2016;
ZHANG et al., 2015; NEEDS et al., 2000).
Para a fermentação, as misturas foram aquecidas a 45 °C, distribuídas em quatro
recipientes de aço inoxidável e adicionadas das culturas lácticas previamente ativadas. As
misturas controle (10 % de sólidos totais) e de alto teor proteico (6 % de proteínas) foram
inoculadas com cultura láctica tradicional constituída de Streptococcus thermophilus e
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (2,5 % v/v), e adicionadas ou não com a cultura
de Lactobacillus helveticus (1 % v/v). Assim, para cada repetição de processo, quatro
iogurtes foram fabricados com a seguinte denominação: iogurte controle (10 % de sólidos
totais e cultura láctica tradicional); iogurte controle adicionado de Lactobacillus helveticus
(10% de sólidos totais adicionado de cultura láctica tradicional e de Lactobacillus helveticus);
iogurte com alto teor proteico (6 % de proteína e adicionado de cultura láctica tradicional) e
iogurte com alto teor proteico adicionado de Lactobacillus helveticus (6 % de proteína
adicionado de cultura tradicional e de Lactobacillus helveticus).
Os recipientes foram levados à estufa a 45 °C para a fermentação. Previamente,
uma porção de cada tratamento foi separada, distribuída em tubos de rosca (50 mL) e
colocada em banho-maria (45 °C) para acompanhamento do pH e da acidez titulável durante a
fermentação em intervalos de 30 minutos. O tempo de fermentação foi considerado o
necessário para que o pH atingisse 4,9 ± 0,05. Ao final da fermentação, os iogurtes foram
resfriados em banho de gelo e armazenados sob refrigeração (4 ± 1 ºC) por 24 horas. No dia
seguinte os iogurtes foram batidos em batedeira da marca Arno, distribuídos em copos
plásticos de 200 mL, selados com tampas de alumínio termosoldável e armazenados em
33
câmara fria (4 ± 1 ºC). Amostras foram avaliadas após 1, 10, 20, 30 e 40 dias de
armazenamento refrigerado.
Figura 1 - Fluxograma de fabricação de iogurte.
3.3 Caracterização das matérias-primas e misturas padronizadas
Todos os experimentos foram realizados utilizando-se o mesmo lote de leite UHT
desnatado, leite em pó desnatado e caseinato de cálcio. O leite UHT e as misturas foram
avaliados quanto ao pH utilizando-se potenciômetro devidamente calibrado, acidez titulável,
gordura determinada gravimetricamente após extração em frascos de Mojonnier, extrato seco
total pelo método de secagem em estufa a 105 °C, cinzas por incineração em forno mufla a
34
550 °C e nitrogênio total pelo método de micro-Kjeldahl, de acordo com metodologias
oficiais (AOAC, 2012). O teor de proteína foi calculado multiplicando-se o teor de nitrogênio
total por 6,38. O leite em pó desnatado foi avaliado quanto ao extrato seco total pelo método
de secagem em estufa a 105 °C (AOAC, 2012).
3.4 Caracterização do iogurte
Um dia posterior a estocagem em câmara fria, os iogurtes foram caracterizados
quanto a composição centesimal e após 1, 10, 20, 30 e 40 dias avaliados quanto à pós-
acidificação (pH e acidez). O perfil de proteólise foi avaliado por eletroforese capilar após 1 e
40 dias e os peptídeos formados avaliados por espectrometria de massa após 1, 10, 20, 30 e 40
dias de armazenamento. A contagem de bactérias ácido lácticas totais foi avaliada após 1 e 40
dias de estocagem.
Os iogurtes utilizados para a avaliação sensorial foram avaliados quanto a
contagem de bactérias ácido lácticas totais e, adicionalmente, quanto aos parâmetros
microbiológicos exigidos pela ANVISA (RDC nº 12) para a comercialização do produto
(BRASIL, 2001).
3.4.1 Análises físico-químicas
Os iogurtes foram analisados quanto ao extrato seco total pelo método de secagem
em estufa a 105 °C; gordura determinada gravimetricamente após extração em frascos de
Mojonnier; nitrogênio total pelo método de micro-Kjeldahl e a proteína total multiplicando-se
o teor de nitrogênio total pelo fator 6,38; cinzas por incineração em forno mufla a 550 °C
(AOAC, 2012) e lactose pela diferença entre os demais constituintes do produto.
A avaliação da pós-acidificação foi realizada por medidas de pH com a utilização
de potenciômetro e acidez titulável (AOAC, 2012).
3.4.2 Análises microbiológicas
A viabilidade das culturas lácticas foi avaliada através do plaqueamento em
profundidade e sobrecamada em meio MRS ágar segundo Silva (2010). Todo o material
utilizado nas análises microbiológicas foi previamente esterilizado em autoclave, e as análises
realizadas em câmara de fluxo laminar.
No preparo das amostras, 10 g de iogurte foram pesados em saco para
homogeneizador de amostras juntamente com 90 mL de água peptonada 0,1 % (p/v). A
35
mistura foi homogeneizada (Stomacher 400, Seward Laboratory, UK) durante 1 minuto, em
velocidade normal pré-definida pelo equipamento, e logo em seguida utilizada para a
realização das análises. Diluições seriadas em água peptonada foram realizadas e 1 mL das
amostras plaqueadas em profundidade em meio MRS. As placas foram incubadas invertidas,
em atmosfera normal, por 48 h à 37 °C e a leitura do número de colônias realizada.
Os iogurtes utilizados na análise sensorial foram avaliados quanto à contagem de
coliformes totais, coliformes termotolerantes, bolores e leveduras, exigidas para
comercialização dos produtos segundo a legislação (BRASIL, 2007). As análises foram
realizadas em laboratório externo, conforme a metodologia descrita por Vanderzant &
Splittstoesser (1992). O laudo emitido pelo laboratório é apresentado no Anexo 3.
3.5 Proteólise avaliada por Eletroforese Capilar
As análises foram realizadas de acordo com as condições descritas por Ortega et
al. (2002) e Otte et al. (1997) com modificação propostas por Alves et al. (2013). Uma
alíquota de 0,1 mL de iogurte foi diluída em 0,9 mL de tampão fosfato de sódio, contendo 8
M uréia e 10 mM de ditiotreitol (DTT) em pH 8,0. Para avaliação da proteólise por
eletroforese capilar utilizou-se um capilar de sílica fundida de 57 cm (50 cm de comprimento
efetivo até o detector x 75 μm de diâmetro), usando o sistema P/ACE MDQ (Beckman
Coulter, Santana de Parnaíba, SP, Brasil) e analisada com o auxílio do software Karat
(Beckman Coulter), sendo as análises realizadas em duplicata.
3.6 Fracionamento dos peptídeos pela solubilidade em água e etanol 70 % e análise por
MALDI-ToF MS
Para a obtenção da fração aquosa, os iogurtes foram centrifugados por 30 minutos
a 4 °C e 3000 g utilizando centrífuga Allegra R64 (Beckman Coulter, Indianápolis, IN, USA).
A fração aquosa (sobrenadante) foi então filtrada em lã de vidro e papel de filtro Whatman
No. 113, congelada a -80 °C e liofilizada. As amostras liofilizadas foram pesadas (10 mg) em
duplicatas e dissolvidas em 0,5 mL de etanol 70 %, mantendo-as em temperatura ambiente
por 30 minutos e centrifugadas 13000 g por 10 minutos. O sobrenadante obtido foi utilizado
na análise por MALDI-ToF.
O instrumento MALDI-TOF/TOF Autoflex III (Bruker Daltonics, Alemanha),
equipado com um laser SmartBeam, foi usado para obtenção dos espectros de massa dos
peptídeos solúveis presentes nos iogurtes. Inicialmente, o equipamento foi calibrado com o
36
padrão de peptídeos II (Peptide Calibration Standard II, Bruker Daltonics). Sobre uma placa
de aço (MSP 96 polished steel target, Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) foram aplicadas
alíquotas das amostras (1 μL), secas à temperatura ambiente, e sobrepostas com a solução
matriz (1 μL), na concentração de 20 mg/mL composta a partir de ácido α-ciano-
hidroxicinâmico (CHCA) dissolvido em 50 % de acetonitrila e ácido trifluoroacético 2,5 %.
Após a secagem completa das gotículas, a placa foi introduzida no equipamento. Operou-se o
espectrômetro de massas ajustando-se a potência do laser a 60 - 70 % e as voltagens da fonte
de íons 1, fonte de íons 2, lentes, reflector e o reflector 2 foram de 20,00, 17,77, 7,90, 21,95 e
10,03 kV, respectivamente. O modo escolhido foi reflector de íons positivos na faixa de
massa de m/z 600 - 3500, controlado pelo software FlexControl 3.3 (Bruker Daltonics), e o
limite de supressão de massa ajustado a m/z 600 e o tempo de extração dos íons pulsados foi
de 30 ns.
3.6.1 Processamento de dados e análise quimiométrica
Os dados brutos foram pré-processados pelo software FlexAnalysis 3.4 (Bruker
Daltonics) para a remoção de linha de base e alinhamento dos espectros com calibração
externa. Os dados foram salvos em arquivos com a extensão CSV e realizado o upload no
MetaboAnalyst, um servidor online para análise estatística dos dados. Os dados foram
normalizados pela soma e escalados pelo método de Pareto. Para a comparação entre os
tratamentos, efetuou-se análise multivariada dos dados utilizando a ferramenta de PLS-DA
(Partial Least Square-Discriminant Analysis). PLS-DA fornece as principais variáveis
responsáveis pela classificação das amostras de acordo com os escores VIP (importância das
variáveis em projeção).
3.7 Delineamento experimental e análise dos resultados
O experimento completo foi repetido três vezes e utilizado o delineamento
experimental de esquema fatorial 2 x 2 x 5, em blocos inteiramente casualisados. O efeito do
teor proteico (dois níveis de variação: controle a alto teor proteico), do tipo de cultura (dois
níveis de variação: tradicional ou tradicional adicionada de Lactobacillus helveticus), do
tempo de armazenamento refrigerado (cinco níveis de variação: 1, 10, 20, 30 e 40 dias), bem
como o efeito da interação desses fatores, foi avaliado por análise de Variância (ANOVA).
Em caso de diferença, comparou-se as médias pelo teste de Tukey a 5 % o nível de
significância, e os resultados analisados utilizando-se o programa Statistica 7.0.
37
3.8 Análise sensorial
Foram realizados os métodos Perfil Flash e CATA (Check-all-that-apply)
devidamente aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNICAMP (Anexo 2).
Avaliaram-se apenas os iogurtes de alto teor proteico, adicionados ou não de Lactobacillus
helveticus. Foram preparadas seis amostras para análise: duas do iogurte com alto teor
proteico natural (não adoçados), duas com adição de açúcar, duas com adição de adoçante
sucralose (Tabela 3). A concentração de açúcar foi baseada em estudos prévios com iogurtes
realizados por Ares et al. (2007), enquanto a de sucralose definida conforme consenso da
equipe de pesquisa. Foram recrutados 10 avaliadores para o teste de Perfil Flash e 64
consumidores para o CATA.
Tabela 3 - Formulação dos iogurtes considerados para análise sensorial
Açúcar (%) Adoçante (%) Sigla
Iogurte com alto teor proteico
na* na A
8 na B
na 0.65 C
Iogurte com alto teor proteico
adicionado de Lactobacillus
helveticus
na na D
8 na E
na 0.65 F
*na: não adicionado
O Perfil Flash foi realizado em duas sessões, sendo a primeira com o objetivo de
levantar os atributos percebidos por cada um dos avaliadores. Na segunda sessão, apresentou-
se uma ficha personalizada para cada participante, com os termos que o próprio participante
levantou para avaliação das amostras. Foi solicitado aos consumidores que provassem
novamente cada amostra e as ordenassem de acordo com a intensidade de cada atributo.
Na realização do CATA, as fichas de avaliação continham os atributos levantados
anteriormente no método de Perfil Flash, como por exemplo, “gosto doce”, “aparência
líquida”. Foi solicitado aos participantes que assinalassem os atributos percebidos em cada
uma das amostras e também os atributos característicos do iogurte considerado “ideal” em
uma ficha separada.
Os testes foram realizados em cabines individuais, sob luz branca. Uma amostra
de 25 g de cada iogurte foi servida em recipiente plástico adequado, devidamente codificado
38
com números aleatórios de três dígitos, sendo a ordem de apresentação das amostras sorteada
entre os julgadores seguindo delineamento de Macfie et al. (1989). As porções foram servidas
juntamente com biscoito cream cracker e água mineral à temperatura ambiente, para remoção
do sabor residual entre as amostras. Os resultados foram avaliados através do software XLStat
versão 2016.03.31939 (Addinsoft, New York, NY, EUA) e submetidos à Análise de
Procrustes Generalizada e Teste Q de Cochran/Análise de Correspondência para os métodos
de Perfil Flash e CATA, respectivamente.
39
4. Resultados e discussão
4.1 Caracterização físico-química da matéria-prima e misturas lácteas controle e com
alto teor proteico
O leite UHT utilizado em todos os processamentos para preparar as misturas
apresentou pH 6,7, acidez titulável de 0,17 ± 0,02 g ácido láctico/100 mL, teores de 9,02 ±
0,1 % de sólidos totais, dos quais 0,48 ± 0,04 % de gordura, 8,54 ± 0,02 % extrato seco
desengordurado, 2,8 ± 0,2 % de proteína, 0,79 % de cinzas, e 4,95 ± 0,05 % de lactose. Dessa
maneira, o leite UHT utilizado para a fabricação dos iogurtes atendeu aos requisitos mínimos
de qualidade exigidos Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Leite UHT
(BRASIL, 1997), o qual estabelece como requisitos o teor de gordura máximo de 0,5 %
(m/v), acidez titulável entre 0,14 - 0,18 g ácido láctico/100 mL e extrato seco desengordurado
mínimo de 8,4 % (m/m).
A Tabela 4 apresenta a composição físico-química média das misturas de leite
padronizadas utilizadas na fabricação dos iogurtes controle e com alto teor proteico.
Tabela 4 - Composição físico-química das misturas utilizadas na fabricação dos iogurtes e valores de p (n = 3)
Misturas lácteas
Mistura
controle
Mistura com alto
teor proteico p-valor
pH 6,71 ± 0,06 6,66 ± 0,04 0,2628
Acidez Titulável (% ácido láctico) 0,18 ± 0,003b 0,26 ±0,01a <0,0001
Sólidos totais (%) 10,13 ± 0,11b 12,97 ± 0,18a <0,0001
Proteína (%) 4,31 ± 0,30b 6,58 ± 0,54a 0,0030
Cinzas (%) 0,87 ± 0,02b 0,97 ±0,02a 0,0064
Gordura (%) 0,36 ± 0,06 0,36 ± 0,05 0,8553
Lactose (%)* 4,59 ± 0,37 5,05 ± 0,46 0,2446
*Calculada por diferença
Observa-se que o pH e os teores de gordura e lactose não diferiram
significativamente entre si (p ≥ 0,05). Entretanto, como esperado, os teores de sólidos totais,
proteína e cinzas e a acidez titulável foram significativamente maiores para a mistura com alto
teor proteico. O teor de proteína contribuiu com aproximadamente 2,84 % no aumento dos
sólidos totais.
40
4.2 Caracterização da fermentação dos iogurtes controle e com alto teor proteico
adicionados ou não de Lactobacillus helveticus
Observa-se na Tabela 5 que o teor de proteína e o tipo de cultura láctica afetaram
significativamente o tempo de fermentação. Os comportamentos do processo de fermentação
dos diferentes tratamentos de iogurte são apresentados nas Figuras 2 e 3.
Tabela 5 - Parâmetros de fermentação obtidos durante a produção dos iogurtes (n = 3)
p-valor
Fator de variação GL Tempo de fermentação*
Teor de proteína 1 0,0010
Tipo de cultura 1 0,0010
Teor de proteína x tipo de cultura 1 0,3465
*Tempo médio necessário para os iogurtes atingirem pH 4,9 ± 0,05
Figura 2 – Comportamento do pH durante a fermentação das misturas lácteas na fabricação dos iogurtes.
41
Figura 3 - Curvas de acidez titulável (% ácido láctico) durante a fermentação das misturas lácteas na fabricação
dos iogurtes.
Comparado ao iogurte controle, a adição de Lactobacillus helveticus diminuiu em
30 minutos o tempo de fermentação, passando de 180 para 150 minutos o tempo médio
necessário para os iogurtes atingirem pH 4,9 ± 0,05. Por outro lado, ainda comparado ao
iogurte controle, misturas com maior teor proteico apresentaram um aumento no tempo
fermentação (180 para 210 minutos), evento já descrito por outros autores como efeito da
suplementação de proteínas em iogurtes (MARAFON et al., 2011; SODINI et al.; 2004;
OLIVEIRA et al., 2001). A diminuição mais lenta do pH nas misturas contendo caseinato de
cálcio deve-se ao efeito tamponante das caseínas presentes no leite e no caseinato. Durante a
fermentação, as micelas de caseína são capazes de absorver íons H+ provenientes do ácido
láctico produzido pela cultura láctica, liberando fosfato de cálcio.
Dessa forma, misturas contendo maior quantidade de caseína (e fosfatos de cálcio)
possuem maior capacidade tamponante quando comparadas às misturas com baixos teores de
caseína (KINDSTEDT et al., 2005). Por outro lado, a queda acelerada de pH nos iogurtes
contendo apenas Lactobacillus helveticus deve-se à ação acidificante desta cultura durante a
42
produção de leites fermentados (KULOZIK et WILDE, 1999; OTTE et al., 2011). A
fermentação de iogurte com alto teor proteico, associado à adição de Lactobacillus helveticus,
resultou na manutenção do tempo de fermentação da mistura quando comparado ao controle.
4.3 Caracterização dos iogurtes
A Tabela 6 apresenta a composição físico-química e a contagem total de bactérias
ácido-lácticas dos iogurtes controle e com alto teor proteico adicionados ou não de
Lactobacillus helveticus, após armazenamento refrigerado por 24 horas.
Tabela 6 - Composição físico-química, contagem microbiológica, desvio padrão e valor de p dos iogurtes após
24 horas de fabricação (n = 3)
Tratamentos
Determinações
analíticas
Iogurte
controle
Iogurte
controle com
Lb. helveticus
Iogurte com
alto teor
proteico
Iogurte com
alto teor
proteico e
Lb. helveticus
p-valor
Físico-químicas
pH 4,60 ± 0,1ab 4,34 ± 0,05c 4,71 ± 0,1a 4,44 ± 0,09bc 0,0033
Acidez Titulável
(% ácido láctico) 0,84 ±0,08b 1,00 ± 0,09ab 1,00 ± 0,06ab 1,22 ± 0,04a 0,0063
Sólidos totais
(%) 9,95 ± 0,07b 9,70 ± 0,13b 12,78 ± 0,26a 12,49 ± 0,35a < 0,0001
Proteína (%) 4,53 ± 0,47b 4,44 ± 0,38b 7,24 ± 0,52a 7,16 ± 0,25a < 0,0001
Cinzas (%) 0,88 ± 0,02b 0,88 ± 0,03b 1,01 ± 0,04a 1,00 ± 0,03a 0,0004
Gordura (%) 0,26 ± 0,03 0,29 ± 0,04 0,23 ± 0,09 0,29 ± 0,03 0,4428
Lactose (%)* 4,27 ± 0,38 4,09 ± 0,42 4,31 ± 0,39 4,03 ± 0,58 0,8074
Microbiológicas
Contagem total
bactérias ácido-
lácticas (UFC/g)
1,83 x 109 3,87 x 109 3,43 x 109 2,87 x 109 0,5880
*Calculada por diferença
a, b Médias com a mesma letra na linha não diferem significativamente entre si (p ≥ 0,05)
43
Após a fabricação, os iogurtes apresentaram contagem de bactérias lácticas totais
em torno de 109 UFC/g, dois ciclos logarítmicos maiores do que o mínimo estabelecido para o
iogurte (107 UFC/g) de acordo com a legislação (BRASIL, 2007). Além disso, a contagem
total de bactérias não foi significativamente afetada pelos tratamentos.
Em relação à composição, observa-se na Tabela 6 que as variáveis teor de
proteína e o tipo de cultura láctica utilizada não afetaram significativamente os teores de
gordura e lactose. Em contrapartida, como esperado, as variáveis afetaram significativamente
os teores de sólidos totais, proteína e cinzas. Cabe ressaltar que os iogurtes adicionados de
caseinato de cálcio, com aproximadamente 7,0 % de proteína, alcançaram o mínimo de 12 g
de proteína por porção, ou seja, mínimo de 6 % na porção de 200 g ou mL, que é a porção
sugerida como padrão pela ANVISA (BRASIL, 2003). Com essas características o produto
enquadra-se na categoria de iogurte alto teor proteico.
No tocante aos parâmetros pH e acidez titulável, os resultados foram
significativamente afetados pelos tratamentos. Menores valores de pH eram esperados para os
iogurtes com Lactobacillus helveticus, resultantes da ação acidificante desta cultura. Porém,
observa-se que o pH do iogurte com alto teor proteico e adicionado de Lactobacillus
helveticus não diferiu significativamente do controle, tornando evidente a influência da adição
de proteínas na manutenção do pH para este tipo de iogurte. Também eram esperados maiores
valores de acidez titulável para os tratamentos adicionados de caseinato de cálcio e
adicionados de Lactobacillus helveticus, o que se confirmou pela análise dos resultados.
O pH é a medida da concentração dos grupos H+ livres, enquanto a acidez
titulável engloba todos os componentes do leite que por meio da titulação liberam grupos H+
no meio (caseínas, compostos minerais e ácidos orgânicos formados pelo desenvolvimento
microbiano) (ALAIS, 1985). Desse modo, é visível que o efeito tamponante da adição de
proteína e o efeito acidificante da cultura adjunta se confundem.
4.4 Efeito do tempo de armazenamento refrigerado, do teor de proteína e do tipo de
cultura na pós-acidificação dos iogurtes
A Tabela 7 apresenta o efeito do teor de proteína, do tipo de cultura e do tempo de
armazenamento, bem como da interação desses fatores sobre o pH dos iogurtes. Observa-se
que cada um dos fatores, bem como a interação entre o tipo de cultura e o tempo, afetou
significativamente o pH durante o armazenamento refrigerado.
44
Tabela 7 - Efeito do teor de proteína, tipo de cultura, tempo e da interação desses fatores sobre pH dos iogurtes
(ANOVA) (n = 3)
p-valor
Fator de variação GL pH
Teor de proteína* 1 0,0001
Tipo de cultura** 1 <0,0001
Tempo*** 4 <0,0001
Teor de proteína x Tempo 4 0,9648
Tipo de cultura x Tempo 4 0,0054
Teor de proteína x Tipo de cultura x Tempo 4 0,8768
* Teor de proteína representado pela adição ou não de caseinato de cálcio à mistura-controle
** Tipo de cultura representada pela adição ou não de Lactobacillus helveticus
*** Tempo representa os dias 1, 10, 20, 30 e 40 de armazenamento refrigerado
GL (Graus de Liberdade); p (probabilidade de significância ≤ 0,05)
No que diz respeito ao teor de proteína dos iogurtes, observa-se na Figura 4 que a
adição de caseinato de cálcio resultou em valores de pH significativamente mais elevados
quando comparado ao iogurte controle. Estudos apresentaram resultados similares ao
avaliarem a pós-acidificação em iogurtes adicionados de caseinato e concentrados de caseína
(UNAL et al. 2013; BONG et MORARU, 2014; AKALIN et al., 2012).
Figura 4 - Efeito do teor de proteína sobre a média do pH dos iogurtes não adicionados de caseinato de cálcio
(iogurte controle; iogurte controle com Lactobacillus helveticus) e adicionados de caseinato de cálcio (iogurte
com alto teor proteico; iogurte com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus ) (n = 3)
a, b Letras minúsculas diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey (p < 0,05).
45
A Figura 5 apresenta o efeito da interação entre o tipo de cultura e o tempo de
armazenamento no pH dos iogurtes:
Figura 5 - Efeito da interação entre o tipo de cultura e o tempo de armazenamento refrigerado sobre os valores de
pH (n = 3)
A,B Letras maiúsculas diferentes entre os tipos de cultura apresentam diferença significativa pelo teste de Tukey
para o mesmo período de armazenamento (p < 0,05).
a,b Letras minúsculas diferentes ao longo do tempo de armazenamento apresentam diferença significativa pelo
teste de Tukey (p < 0,05).
Observa-se que a adição de Lactobacillus helveticus resultou em maior pós-
acidificação dos iogurtes. Estudos que avaliaram a pós-acidificação em iogurtes adicionados
de Lactobacillus helveticus apresentaram resultados similares durante a estocagem refrigerada
dos produtos (NIELSEN et al., 2009; OTTE et al., 2011), devido a maior capacidade
acidificante deste microrganismo como já descrita anteriormente (GRIFFITHS & TELLEZ,
2013; TAVERNITI & GUGLIELMETTI, 2012; SHARPE & WHEATER, 1957). Ao final
dos 40 dias de armazenamento, verificou-se a redução de 0,4 unidades de pH para os iogurtes
adicionados de Lactobacillus helveticus, e de apenas 0,14 unidades de pH para os iogurtes
controle. Observa-se na Figura 6, que apresenta a correlação entre os valores de pH dos
iogurtes com apenas cultura láctica tradicional e dos iogurtes adicionados de Lactobacillus
helveticus, que a velocidade de pós-acidificação dos iogurtes com Lactobacillus helveticus foi
duas vezes maior comparado aos iogurtes contendo apenas a cultura láctica tradicional.
46
Figura 6 - Correlação entre os valores de pH para as diferentes culturas lácticas
4.5 Efeito dos tratamentos e do tempo de armazenamento sobre a proteólise dos
iogurtes
A identificação dos perfis de degradação das diferentes caseínas foi realizada
comparando-se as eletroforeses das amostras de iogurte com dados da literatura referentes à
produtos lácteos fermentados (ORTEGA et al., 2002; OTTE et al., 1997) e com os padrões
Sigma-Aldrich Co., referentes à α, β e κ caseína.
Observa-se na Figura 7 um aumento na área dos picos nos tratamentos com alto
teor proteico quando comparados ao não adicionados de proteína para o mesmo volume de
amostra (100 μL). Assim, iogurtes com alto teor proteico, independentemente do tipo de
cultura láctica utilizada, apresentaram picos maiores no eletroferograma decorrentes da maior
quantidade de caseínas presentes nessas amostras devido a adição de caseinato de cálcio.
Nota-se também um perfil de hidrólise semelhante das amostras no início e no final do
período de armazenamento. Dessa forma, pode-se concluir que não há diferenças
consideráveis na proteólise durante a estocagem refrigerada de iogurtes.
47
Figura 7 - Eletroferograma capilar das frações solúveis dos iogurtes controle adicionados ou não com
Lactobacillus helveticus (a) e iogurtes com alto teor proteico adicionados ou não com Lactobacillus helveticus
(b), após 1 e 40 dias de estocagem refrigerada.
Os resultados obtidos na análise das frações peptídicas solúveis dos iogurtes na
fase aquosa e etanol 70 % por MALDI-ToF são apresentados nas Figuras 8, 9, 10 e 11. A
partir do espectro total gerado, foram obtidas as intensidades relativas das frações peptídicas
nos dias 1, 10, 20, 30 e 40 de armazenamento (Tabelas 8, 9, 10 e 11). A identificação dos
peptídeos foi realizada por meio de comparações das razões massa/carga (m/z) com as razões
previamente identificadas na literatura em produtos lácteos fermentados (JIN et al., 2016;
48
ONG et al., 2008; ADDEO et al., 1992; EBNER et al., 2015; GAGNAIRE et al., 2001;
BROADBENT et al., 1998; KUNDA et al., 2012).
49
Figura 8 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte controle solúveis na fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF
50
Figura 9 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte controle com Lactobacillus helveticus solúveis na fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF
51
Figura 10 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte com alto teor proteico solúveis na fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-ToF..
52
Figura 11 - Espectros de massas dos peptídeos do iogurte com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus solúveis na fase aquosa e diluídas em etanol 70 % por MALDI-
ToF.
53
Tabela 8 – Peptídeos (m/z) do iogurte controle solúveis na fase aquosa e etanol 70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados em intensidade relativa (intensidade
relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem.
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
789 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 1,75 ± 9,57 0,20 ± 0,82
91 αS1-CN f(18–23) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 10,52 ± 16,12 5,09 ± 9,66 1,78 ± 4,69 2,28 ± 5,94
792 não-identificado - 20,60 ± 17,55 16,61 ± 21,09 13,93 ± 15,57 11,76 ± 11,40 9,31 ± 9,45
810 αS2-CN f(202–207) Jing et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,70 ± 1,43 1,13 ± 1,94 1,84 ± 2,38
853 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 1,10 ± 1,90
870 não-identificado - 0,00 ± 0,00 3,72 ± 4,31 3,95 ± 3,98 4,07 ± 3,74 5,08 ± 4,28
906 αS1-cn (f17-23) Alli et al. (1998) 0,00 ± 0,00 0,55 ± 1,69 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
939 β-CN f(199-207) Liu (2017) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,25 ± 0,79 0,37 ± 0,96 0,67 ± 1,37
1053* αS1-CN f(24-32) Ong et al. (2008) 2,36 ± 4,75 13,96 ± 4,80 14,96 ± 5,35 20,26 ± 6,33 15,32 ± 7,39
1091 αS1-CN f(191-199) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,25 ± 0,77 0,56 ± 1,28 1,45 ± 1,97
1110* αS2-CN (81–89) Kunda et al. (2012) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,08 ± 0,45
1118 αS1-CN f(15-23) Soeryapranata (2004) 0,00 ± 0,00 2,72 ± 4,30 3,17 ± 4,15 1,97 ± 3,06 1,69 ± 2,38
1151* β-CN f(199-209) Addeo et al. (1992) 50,50 ± 25,33 82,87 ± 7,48 80,61 ± 11,16 81,70 ± 8,48 77,17 ± 16,88
1183 não-identificado - 0,00 ± 0,00 2,10 ± 3,08 4,05 ± 5,93 5,65 ± 6,93 8,33 ± 9,32
1189 não-identificado - 0,00 ± 0,00 2,16 ± 5,38 2,35 ± 4,00 2,48 ± 3,32 2,70 ± 2,91
1198 αS1-CN f(23–32) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,05 ± 0,27 0,00 ± 0,00 0,17 ± 0,67
1252 κ-CN f(44-54) Ebner et al. (2015) 72,31 ± 30,11 100,00 ± 0,00 98,21 ± 9,79 100,00 ± 0,00 97,97 ± 8,54
1279 αS2-CN f(141–150) Ebner et al. (2015) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,95 ± 1,75 1,20 ± 2,10 1,70 ± 2,48
1290 κ-CN f(125–137) Ebner et al. (2015) 0,00 ± 0,00 2,85 ± 5,64 2,66 ± 4,20 3,12 ± 3,66 3,15 ± 3,01
1311 β-CN f(46–56) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,26 ± 0,78 0,61 ± 1,39 1,36 ± 2,15
1330 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,06 ± 0,31 0,00 ± 0,00 0,19 ± 0,71
1394 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,65 ± 1,53 0,66 ± 1,51 2,14 ± 3,43 1,64 ± 2,12
54
(continuação)
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
1536 αS1-CN f(1-13) Gouldsworthy et al. (1996) 0,30 ± 1,61 2,36 ± 2,79 3,30 ± 3,80 2,68 ± 2,82 4,47 ± 3,65
1614 α-La f(36–50) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
1764 não-identificado - 14,42 ± 15,63 6,93 ± 8,81 1,90 ± 4,11 0,00 ± 0,00 0,57 ± 2,25
1877 αS1-CN f(1-16) Gagnaire et al. (2001) 35,97 ± 19,24 15,88 ± 8,21 11,96 ± 6,84 7,88 ± 5,10 7,56 ± 5,33
1881* β-CN f(193-209) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 2,40 ± 7,93
1991 αS1-CN f(1-17) Broadbent et al. (1998) 48,67 ± 24,85 20,31 ± 11,02 12,84 ± 9,39 12,00 ± 7,43 10,27 ± 8,00
1994 β-CN f(192–209) Ebner et al. (2015) 0,00 ± 0,00 1,32 ± 4,38 11,01 ± 15,75 13,36 ± 14,42 23,26 ± 29,76
2331 não-identificado - 20,69 ± 41,23 14,52 ± 25,23 10,53 ± 19,32 6,80 ± 14,12 12,06 ± 22,08
2332 não-identificado - 53,14 ± 44,24 11,35 ± 15,34 9,09 ± 18,59 7,82 ± 11,16 3,68 ± 4,85
2460 não-identificado - 3,60 ± 10,94 5,53 ± 10,51 4,40 ± 8,71 0,35 ± 1,92 4,21 ± 9,87
2461 β-CN f(168-189) Jin et al. (2016) 36,10 ± 24,60 6,61 ± 7,70 5,62 ± 7,97 5,11 ± 6,72 2,51 ± 3,68
(*) Peptídeos potencialmente bioativos identificados nos iogurtes e similares (m/z) aos reportados na literatura.
55
Tabela 9 - Peptídeos (m/z) do iogurte controle com Lactobacillus helveticus solúveis na fase aquosa e etanol 70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados em
intensidade relativa (intensidade relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem.
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
748* β-CN f(108-113) Pihlanto-Leppala (2000) 3,61 ± 5,30 3,50 ± 5,51 2,21 ± 4,38 1,91 ± 3,37 0,32 ± 1,32
789 não-identificado - 17,37 ± 13,93 7,36 ± 8,23 3,29 ± 5,49 0,93 ± 2,15 0,10 ± 0,56
791 αS1-CN f(18–23) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,09 ± 0,50 0,00 ± 0,00 0,23 ± 0,89
792 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,12 ± 0,64 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
810 αS2-CN f(202–207) Jing et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,10 ± 0,57 0,45 ± 1,03 0,35 ± 1,06 0,11 ± 0,58
906 αS1-cn (f17-23) Alli et al. (1998) 1,86 ± 3,44 3,16 ± 3,75 2,42 ± 3,28 2,45 ± 3,31 1,40 ± 2,60
939 β-CN f(199-207) Liu (2017) 2,95 ± 3,98 10,27 ± 4,56 9,23 ± 6,77 8,64 ± 6,33 9,08 ± 5,86
955 αS1-CN f(27-151) Ahtesh (2016) 0,00 ± 0,00 2,40 ± 3,79 1,80 ± 3,06 3,12 ± 4,30 2,87 ± 3,79
978 αS2-CN f(174–181) Jing et al. (2016) 0,00 ± 0,00 11,04 ± 11,36 10,00 ± 11,39 19,60 ± 20,22 26,23 ± 29,86
1053* αS1-CN f(24-32) Ong et al. (2008) 75,65 ± 20,19 93,05 ± 25,32 86,67 ± 34,57 73,02 ± 44,80 88,62 ± 24,62
1091 αS1-CN f(191-199) Jin et al. (2016) 1,31 ± 2,99 3,89 ± 3,56 3,00 ± 3,11 4,41 ± 4,37 6,40 ± 4,67
1110* αS2-CN f(81–89) Kunda et al. (2012) 0,00 ± 0,00 8,17 ± 5,19 6,38 ± 6,22 10,93 ± 11,28 18,24 ± 15,36
1127 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,16 ± 0,87 0,35 ± 1,32 1,38 ± 2,89 1,59 ± 2,92
1135 κ-CN f(24-32) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 1,94 ± 2,92 1,46 ± 2,40 2,02 ± 3,15 1,40 ± 2,69
1165 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,12 ± 0,65 0,00 ± 0,00 0,57 ± 1,73 0,30 ± 1,14
1183 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,63 ± 1,66 0,85 ± 1,81 0,15 ± 0,83 0,29 ± 1,09
1198 αS1-CN f(23–32) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,11 ± 0,58 0,00 ± 0,00 0,12 ± 0,63
1252 κ-CN f(44-54) Ebner et al. (2015) 35,22 ± 16,94 16,38 ± 8,10 14,00 ± 7,24 14,47 ± 6,46 13,10 ± 8,45
1259 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,15 ± 0,80 0,40 ± 1,55
1269 κ-CN f(51-60) Alli et al. (1998) 0,00 ± 0,00 2,78 ± 4,17 2,61 ± 3,57 6,57 ± 8,51 9,61 ± 8,66
1330 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,11 ± 0,60 0,16 ± 0,85 0,16 ± 0,86
1394 não-identificado - 3,35 ± 4,24 3,14 ± 2,63 2,46 ± 2,75 0,65 ± 1,72 0,36 ± 1,11
56
(continuação)
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
1485 αS1-CN f(180–193) Jin et al. (2016) 2,20 ± 4,07 3,45 ± 3,78 2,40 ± 3,33 2,23 ± 3,03 1,22 ± 2,65
1536 αS1-CN f(1-13) Gouldsworthy et al. (1996) 9,10 ± 5,78 5,06 ± 3,78 4,08 ± 3,70 6,73 ± 4,64 4,72 ± 4,55
1586 β-CN f(127-140) Liu (2017) 25,79 ± 4,74 34,41 ± 7,01 34,54 ± 7,20 43,74 ± 7,20 44,27 ± 13,48
1614 α-La f(36–50) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 1,37 ± 2,59 1,30 ± 2,10 2,63 ± 3,61 4,64 ± 4,38
1700 αS1-CN f(151–164) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,92 ± 2,11 1,22 ± 2,35 2,52 ± 3,49 2,52 ± 3,67
1718* β-CN f(194-209) Soeryapranata (2004) 0,00 ± 0,00 2,03 ± 2,99 1,44 ± 2,26 2,76 ± 4,07 5,09 ± 5,95
1761 não-identificado - 0,00 ± 0,00 1,83 ± 2,75 1,89 ± 2,48 3,28 ± 3,69 5,30 ± 5,08
1863 αS1-CN f(151–165) Jin et al. (2016) 0,55 ± 2,11 0,84 ± 1,93 0,61 ± 1,72 0,52 ± 1,61 0,47 ± 1,49
1877 αS1-CN f(1-16) Gagnaire et al. (2001) 99,97 ± 0,10 60,98 ± 23,60 56,70 ± 16,81 71,03 ± 21,85 66,04 ± 23,87
1881* β-CN f(193-209) Ong et al. (2008); Jin et al. (2016) 1,81 ± 4,77 8,48 ± 5,89 14,46 ± 12,53 31,33 ± 26,15 50,87 ± 35,65
1882 não-identificado - 5,67 ± 5,81 1,33 ± 3,68 0,60 ± 2,39 0,23 ± 1,28 0,00 ± 0,00
1915 αS1-CN f(180-196) Ahtesh (2016) 3,98 ± 5,01 2,39 ± 2,85 0,73 ± 1,96 4,26 ± 4,87 2,02 ± 4,16
1991 αS1-CN f(1-17) Broadbent et al. (1998) 12,56 ± 2,68 5,85 ± 5,24 6,63 ± 4,92 9,38 ± 4,00 10,25 ± 4,36
1994 β-CN f(192–209) Ebner et al. (2015) 2,36 ± 4,01 2,06 ± 2,83 4,03 ± 4,51 8,04 ± 5,97 14,25 ± 6,58
2107 β-CN f(191–209) Ebner et al. (2015) 5,07 ± 5,91 7,94 ± 8,39 15,82 ± 15,03 23,93 ± 18,80 38,91 ± 27,45
2120 αS1-CN f(1–18) Ebner et al. (2015) 0,00 ± 0,00 0,98 ± 2,24 1,15 ± 2,45 1,77 ± 3,02 1,78 ± 2,75
2201 β-CN f(125–143) Jin et al. (2016) 7,30 ± 5,31 3,48 ± 4,00 2,29 ± 3,25 4,65 ± 3,56 3,33 ± 3,40
2460 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,09 ± 0,50 0,00 ± 0,00 0,29 ± 1,11
2461 β-CN f(168-189) Jin et al. (2016) 0,46 ± 1,77 0,27 ± 1,02 0,00 ± 0,00 0,13 ± 0,72 0,09 ± 0,48
2481 não-identificado - 8,89 ± 5,99 0,25 ± 0,97 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
2588 não-identificado - 8,76 ± 5,31 4,04 ± 3,07 1,88 ± 2,27 1,29 ± 2,28 0,94 ± 1,97
(*) Peptídeos potencialmente bioativos identificados nos iogurtes e similares (m/z) aos reportados na literatura.
57
Tabela 10 - Peptídeos (m/z) do iogurte com alto teor proteico solúveis na fase aquosa e etanol 70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados em intensidade relativa
(intensidade relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem.
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
789 não-identificado - 2,07 ± 11,36 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,17 ± 0,95
791 αS1-CN f(18–23) Jin et al. (2016) 6,45 ± 11,33 10,68 ± 13,73 6,28 ± 9,64 6,92 ± 10,30 8,96 ± 8,79
792 não-identificado - 5,72 ± 7,65 8,95 ± 9,38 7,99 ± 8,64 7,60 ± 6,59 4,57 ± 5,78
810 αS2-CN f(202–207) Jing et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,07 ± 0,36 1,04 ± 1,40 2,33 ± 2,14 2,48 ± 3,34
853 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,53 ± 1,11 2,27 ± 2,10 2,75 ± 3,46
870 não-identificado - 2,74 ± 4,45 8,88 ± 6,20 12,33 ± 7,39 17,57 ± 5,88 12,07 ± 10,81
939 β-CN f(199-207) Liu (2017) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,05 ± 0,29 0,20 ± 0,77 0,64 ± 1,31
955 αS1-CN f(27-151) Ahtesh (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,56 ± 1,29
1053* αS1-CN f(24-32) Ong et al. (2008) 2,44 ± 3,63 12,37 ± 3,58 14,47 ± 3,57 16,02 ± 4,57 18,03 ± 7,89
1091 αS1-CN f(191-199) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,62 ± 1,28 2,10 ± 1,90 3,27 ± 3,88
1118 αS1-CN f(15-23) Soeryapranata (2004) 0,00 ± 0,00 5,66 ± 5,25 3,27 ± 3,25 3,01 ± 2,88 4,49 ± 2,29
1151* β-CN f(199-209) Addeo et al. (1992) 36,45 ± 26,93 77,15 ± 8,33 83,04 ± 6,54 83,45 ± 6,18 84,75 ± 7,61
1183 não-identificado - 0,53 ± 1,61 7,17 ± 8,80 11,34 ± 11,35 19,85 ± 16,85 27,64 ± 25,62
1189 não-identificado - 0,42 ± 2,30 2,90 ± 3,19 2,83 ± 3,59 3,33 ± 2,65 5,32 ± 5,20
1198 αS1-CN f(23–32) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,72 ± 1,34 1,36 ± 1,71 2,09 ± 1,99
1252 κ-CN f(44-54) Ebner et al. (2015) 90,39 ± 15,78 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 99,72 ± 1,36
1279 αS2-CN f(141–150) Ebner et al. (2015) 0,00 ± 0,00 1,56 ± 2,43 3,37 ± 3,61 4,40 ± 4,07 5,43 ± 4,69
1290 κ-CN f(125–137) Ebner et al. (2015) 1,38 ± 3,68 3,97 ± 3,49 3,34 ± 3,20 3,70 ± 2,74 5,94 ± 4,77
1311 β-CN f(46–56) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,32 ± 0,97 0,90 ± 1,87 3,10 ± 3,87 5,11 ± 7,43
1330 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,29 ± 0,90 1,06 ± 1,71 2,93 ± 2,74 5,59 ± 5,50
1394 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,44 ± 1,15 1,35 ± 2,46 1,60 ± 1,86 1,78 ± 2,43
58
(continuação)
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
1536 αS1-CN f(1-13) Gouldsworthy et al. (1996) 3,51 ± 5,16 4,65 ± 3,98 7,86 ± 3,17 10,88 ± 4,05 12,28 ± 3,18
1764 não-identificado - 0,91 ± 2,08 0,27 ± 0,83 0,51 ± 1,27 1,07 ± 2,16 0,92 ± 1,90
1877 αS1-CN f(1-16) Gagnaire et al. (2001) 24,17 ± 17,44 13,36 ± 5,63 9,77 ± 4,91 10,13 ± 5,74 8,38 ± 4,08
1881* β-CN f(193-209) Ong et al. (2008); Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 1,11 ± 1,94
1882 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,06 ± 0,35 0,00 ± 0,00
1991 αS1-CN f(1-17) Broadbent et al. (1998) 44,21 ± 19,57 19,99 ± 7,49 16,96 ± 6,27 16,12 ± 9,38 16,74 ± 5,62
1994 β-CN f(192–209) Ebner et al. (2015) 0,00 ± 0,00 2,46 ± 4,31 4,19 ± 3,83 3,85 ± 3,57 6,42 ± 3,34
2331 não-identificado - 40,06 ± 44,25 17,15 ± 20,13 6,45 ± 8,96 5,58 ± 7,24 4,95 ± 6,49
2332 não-identificado - 2,43 ± 4,50 2,21 ± 4,04 2,76 ± 4,43 1,68 ± 1,89 1,18 ± 2,14
2460 não-identificado - 17,05 ± 20,69 5,73 ± 7,36 2,26 ± 3,72 3,07 ± 5,07 2,20 ± 3,28
2461 β-CN f(168-189) Jin et al. (2016) 3,48 ± 5,33 2,29 ± 3,26 2,13 ± 3,53 1,38 ± 2,08 1,02 ± 1,80
(*) Peptídeos potencialmente bioativos identificados nos iogurtes e similares (m/z) aos reportados na literatura.
59
Tabela 11 - Peptídeos (m/z) do iogurte com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus solúveis na fase aquosa e etanol 70 % detectados por MALDI-ToF MS e reportados
em intensidade relativa (intensidade relativa média ± desvio padrão) ao longo da estocagem.
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
748* β-CN f(108-113) Pihlanto-Leppala (2000) 12,01 ± 10,13 11,51 ± 11,34 7,35 ± 6,89 8,39 ± 7,30 8,33 ± 7,95
789 não-identificado - 4,93 ± 6,16 3,84 ± 5,04 0,64 ± 1,97 0,27 ± 1,46 1,52 ± 2,62
791 αS1-CN f(18–23) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,12 ± 0,63 0,00 ± 0,00 0,25 ± 0,97
792 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,33 ± 1,28
810 αS2-CN f(202–207) Jing et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,09 ± 0,47 0,00 ± 0,00 0,14 ± 0,77
906 αS1-cn (f17-23) Alli et al. (1998) 0,89 ± 2,09 2,25 ± 2,69 3,61 ± 3,54 4,39 ± 3,51 5,36 ± 4,44
939 β-CN f(199-207) Liu (2017) 3,31 ± 5,06 7,98 ± 2,68 9,53 ± 3,52 10,34 ± 2,51 9,48 ± 2,82
955 αS1-CN f(27-151) Ahtesh (2016) 2,02 ± 4,03 1,35 ± 2,30 8,54 ± 7,86 10,80 ± 9,40 13,09 ± 8,46
978 αS2-CN f(174–181) Jing et al. (2016) 3,35 ± 6,65 3,85 ± 2,95 18,72 ± 16,74 28,52 ± 22,32 33,67 ± 28,29
1053* αS1-CN f(24-32) Ong et al. (2008) 48,92 ± 25,99 79,43 ± 17,73 88,84 ± 13,14 86,14 ± 12,18 87,23 ± 15,27
1091 αS1-CN f(191-199) Jin et al. (2016) 1,63 ± 2,86 3,77 ± 4,02 6,42 ± 3,33 8,55 ± 3,57 8,90 ± 2,74
1110* αS2-CN (81–89) Kunda et al. (2012) 4,49 ± 6,99 9,44 ± 2,01 16,64 ± 8,15 18,76 ± 11,41 17,72 ± 13,21
1127 não-identificado - 0,32 ± 1,23 0,00 ± 0,00 2,66 ± 4,14 4,67 ± 5,64 6,36 ± 6,88
1135 κ-CN f(24-32) Jin et al. (2016) 1,43 ± 2,70 0,60 ± 1,55 3,17 ± 3,91 4,12 ± 4,11 4,47 ± 3,88
1151 β-CN f(199-209) Addeo (1992) 0,00 ± 0,00 0,32 ± 1,24 0,34 ± 1,30 0,16 ± 0,88 0,74 ± 1,93
1165 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,52 ± 1,97 2,99 ± 4,52 4,39 ± 4,44
1183 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,30 ± 1,13 0,64 ± 1,68 0,74 ± 1,79 0,57 ± 1,75
1252 κ-CN f(44-54) Ebner et al. (2015) 20,93 ± 7,27 25,03 ± 7,78 20,39 ± 5,94 20,45 ± 4,67 19,60 ± 5,23
1259 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 1,70 ± 3,15 8,35 ± 4,44
1269 κ-CN f(51-60) Alli et al. (1998) 1,97 ± 4,52 0,12 ± 0,67 11,53 ± 12,48 18,51 ± 16,54 22,80 ± 17,43
1330 não-identificado - 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,99 ± 2,29 3,39 ± 3,79 5,48 ± 3,91
1394 não-identificado - 1,23 ± 2,27 1,30 ± 2,25 0,46 ± 1,49 0,36 ± 1,11 0,00 ± 0,00
60
(continuação)
m/z Peptídeo Referência Dia 1 Dia 10 Dia 20 Dia 30 Dia 40
1485 αS1-CN f(180–193) Jin et al. (2016) 1,10 ± 2,30 2,07 ± 3,15 1,48 ± 2,85 2,61 ± 3,63 1,32 ± 2,49
1536 αS1-CN f(1-13) Gouldsworthy et al. (1996) 16,33 ± 3,87 13,66 ± 4,21 14,69 ± 4,93 15,58 ± 4,50 15,02 ± 4,57
1586 β-CN f(127-140) Liu (2017) 15,77 ± 6,67 29,87 ± 11,49 47,61 ± 7,81 43,80 ± 13,52 49,35 ± 15,40
1614 α-La f(36–50) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 2,56 ± 3,73 3,73 ± 4,18 5,11 ± 4,19
1700 αS1-CN f(151–164) Jin et al. (2016) 0,00 ± 0,00 1,61 ± 2,51 3,81 ± 3,24 3,54 ± 3,74 4,26 ± 3,73
1718* β-CN f(194-209) Soeryapranata (2004) 2,08 ± 3,05 0,74 ± 1,93 3,26 ± 4,56 4,67 ± 5,47 4,38 ± 5,50
1761 não-identificado - 0,82 ± 2,15 0,00 ± 0,00 3,01 ± 3,74 4,52 ± 4,07 4,88 ± 4,17
1863 αS1-CN f(151–165) Jin et al. (2016) 2,12 ± 2,90 3,12 ± 3,02 3,29 ± 3,25 3,05 ± 3,23 3,32 ± 3,59
1877 αS1-CN f(1-16) Gagnaire et al. (2001) 97,07 ± 7,02 99,30 ± 2,23 93,96 ± 18,23 98,36 ± 4,08 90,97 ± 25,04
1881* β-CN f(193-209) Ong et al. (2008); Jin et al. (2016) 4,14 ± 7,78 2,51 ± 5,26 13,83 ± 11,44 24,79 ± 15,26 36,19 ± 20,52
1882 não-identificado - 0,52 ± 2,05 3,31 ± 3,89 1,50 ± 3,49 0,31 ± 1,70 1,70 ± 6,86
1915 αS1-CN f(180-196) Ahtesh (2016) 6,06 ± 3,82 6,80 ± 4,76 6,48 ± 6,50 9,49 ± 5,61 6,68 ± 4,21
1991 αS1-CN f(1-17) Broadbent et al. (1998) 11,23 ± 3,27 12,33 ± 2,86 12,64 ± 4,64 14,59 ± 3,22 12,75 ± 6,79
1994 β-CN f(192–209) Ebner et al. (2015) 1,12 ± 2,62 0,97 ± 3,02 5,06 ± 5,75 8,09 ± 8,11 11,30 ± 6,57
2107 β-CN f(191–209) Ebner et al. (2015) 5,47 ± 9,69 5,90 ± 6,44 10,51 ± 12,06 14,54 ± 20,49 18,37 ± 21,40
2120 αS1-CN f(1–18) Ebner et al. (2015) 0,47 ± 1,44 2,14 ± 2,67 2,97 ± 3,06 3,88 ± 3,25 3,76 ± 3,16
2201 β-CN f(125–143) Jin et al. (2016) 5,40 ± 3,92 4,22 ± 4,04 3,74 ± 3,60 3,75 ± 3,85 3,80 ± 3,67
2460 não-identificado - 0,14 ± 0,77 0,10 ± 0,56 0,24 ± 0,90 0,10 ± 0,54 0,21 ± 0,79
2461 β-CN f(168-189) Jin et al. (2016) 0,57 ± 1,49 0,11 ± 0,58 0,08 ± 0,41 0,08 ± 0,46 0,00 ± 0,00
2481 não-identificado - 0,34 ± 1,33 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
2588 não-identificado - 4,59 ± 2,91 5,48 ± 3,26 4,40 ± 2,46 3,14 ± 2,51 2,14 ± 2,35
(*) Peptídeos potencialmente bioativos identificados nos iogurtes e similares (m/z) aos reportados na literatura.
61
A análise dos peptídeos dos iogurtes solúveis na fase aquosa e etanol 70 %
resultou na detecção de 54 picos nos quatro tratamentos ao longo de 40 dias de
armazenamento. No iogurte controle e controle com Lactobacillus helveticus foram
detectados 33 e 43 peptídeos, dos quais 21 e 30 foram identificados, respectivamente (Tabelas
8 e 9). Similarmente, nos iogurtes com alto teor proteico e alto teor proteico com
Lactobacillus helveticus foram detectados 32 e 44 peptídeos, dos quais 19 e 30 foram
identificados (Tabelas 10 e 11).
O peptídeo de m/z 1252 [κ-CN f(44-54)] apresentou maior intensidade relativa em
todos os tempos analisados para os iogurtes controle e de alto teor proteico (Tabelas 8 e 10),
sendo então utilizado como referência para o cálculo da intensidade relativa dos outros
peptídeos. Por outro lado, os peptídeos de m/z 1053 [αS1-CN f(24-32)] e 1877 [αS1-CN f(1-
16)] foram tomados como referência para o iogurte controle com Lactobacillus helveticus e
para o iogurte com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus, respectivamente (Tabelas 9 e
11).
O perfil proteolítico do iogurte controle foi semelhante ao de alto teor proteico,
sendo que estes foram os únicos a apresentar os peptídeos de m/z 1118 [αS1-CN f(15-23)],
1279 [αS2-CN f(141–150)] e 1311 [β-CN f(46–56)] e os peptídeos não identificados de m/z
853, 870, 1189, 1764, 2331 e 2332. Por outro lado, a adição do Lactobacillus helveticus
favoreceu a formação dos peptídeos de m/z 748 [β-CN f(108-113)], 978 [αS2-CN f(174–181)],
1135 [κ-CN f(24-32)], 1269 [κ-CN f(51-60)], 1485 [αS1-CN f(180–193)], 1586 [β-CN f(127-
140)], 1700 [αS1-CN f(151–164)], 1718 [β-CN f(194-209)], 1863 [αS1-CN f(151–165)], 1915
[αS1-CN f(180-196)], 2107 [β-CN f(191–209), 2120 [αS1-CN f(1–18)], 2201 [β-CN f(125–
143)]. Não foram identificados os peptídeos de m/z 1127, 1165, 1259, 1761, 2481 e 2588,
presentes unicamente nos iogurtes adicionados de Lactobacillus helveticus.
A análise discriminante pelo método de quadrados mínimos parciais (PLS-DA)
para cada tratamento ao longo do período de estocagem foi realizada com o intuito de avaliar
a separação entre as amostras de iogurte. Além disso, o método evidencia a segregação dos
peptídeos mais importantes através dos gráficos de escores VIP. A análise entre os diferentes
tipos de iogurte durante o tempo de armazenamento refrigerado foi baseada nas duas
primeiras PCs, explicadas por uma variância total de dados de 57,6 %, 43,8 %, 61 % e 46,9
%, como exposto na Figura 12 abaixo.
62
63
Figura 12 - Análise discriminante pelo método de quadrados mínimos parciais (PLS-DA). Gráficos de escores
dos iogurtes controle (a), iogurtes controle e Lactobacillus helveticus (c), iogurtes com alto teor proteico (e),
iogurtes com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus (g); gráficos de pesos dos iogurtes controle (b),
iogurtes controle e Lactobacillus helveticus (d), iogurtes com alto teor proteico (f), iogurtes com alto teor
proteico e Lactobacillus helveticus (h). (•) 1 dia; (•) 10 dias; (•) 20 dias; (•) 30 dias; (•) 40 dias.
64
Segundo os gráficos de pesos da Figura 12, as variáveis de maior peso negativo
foram iguais para os iogurtes adicionados de Lactobacillus helveticus, enquanto as variáveis
de maior peso positivo foram as mesmas para os iogurtes controle e alto teor proteico (não
adicionadas de Lactobacillus helveticus) ao longo do tempo. Para o iogurte controle, controle
com Lactobacillus helveticus, alto teor proteico e alto teor proteico com Lactobacillus
helveticus, as variáveis de maior peso negativo (à esquerda) em PC 1 e relacionadas ao
primeiro dia de estocagem foram os peptídeos de m/z 1991 [αS1-CN f(1-17)], 1877 [αS1-CN
f(1-16)], 2331 (não identificado) e 1877 [αS1-CN f(1-16)], respectivamente. Por outro lado, as
variáveis de maior peso positivo (à direita) em PC1 e mais correlacionadas ao dia 40 foram os
peptídeos de m/z 1151 [β-CN f(199-209)] para os iogurtes controle e alto teor proteico,
enquanto para o iogurte controle com Lactobacillus helveticus foi o de m/z 1881 [β-CN f(193-
209)] e para o alto teor proteico com Lactobacillus helveticus foi o de m/z 978 [αS2-CN f(174–
181)].
As frações peptídicas mais importantes para a separação dos diferentes
tratamentos foram selecionadas de acordo com o critério de seleção dos valores de escore VIP
(>1), apresentados na Figura 13. De forma geral, pode-se observar em todos os tratamentos a
alta intensidade relativa das frações derivadas da αS1-CN f(1-23) nos primeiros dias de
armazenamento, como por exemplo os peptídeos de m/z 1536 [αS1-CN f(1-13)], 1877 [αS1-CN
f(1-16)] e 1991 [αS1-CN f(1-17)]. Esse evento decorre possivelmente da ação inicial das
proteinases nativas presentes no leite (catepsinas D e G), que podem apresentar atividade após
sofrer tratamento térmico (HAYES et al., 2001), e clivam as ligações Phe23-Phe24 da αS1-
caseína originando a fração αS1-CN f(1-23) (CONSIDINE et al., 2002). Esta fração, por sua
vez, servirá posteriormente como substrato para proteinases associadas à membrana celular e
peptidases da cultura ácido láctica e da cultura adjunta e, originando os peptídeos de tamanho
intermediário derivados da fração αS1-CN f(1-23) (CHRISTENSEN et al., 1999).
Observa-se na Figura 13 (b e d) que o peptídeo de m/z 1881 [β-CN f(193-209)],
mostrou-se importante na separação das amostras dos iogurtes adicionados de Lactobacillus
helveticus ao longo do tempo. Este peptídeo se forma em maior quantidade, possivelmente
pela ação de aminopeptidases desta cultura adjunta que utilizam como substrato resíduos com
aminoácidos hidrofóbicos, neste caso clivando o sítio Leu192-Leu193 da sequência da primária
da β-caseína (FENSTER, et al. 1997).
As cepas de Lactobacillus helveticus apresentam um complexo sistema
proteolítico composto por proteinases e peptidases. Durante a fermentação do leite apenas
65
1 - 2 % das proteínas do leite, principalmente as caseínas, são proteolisadas (KHALID et al,
1991). A hidrólise da caseína é iniciada pelas proteinases da membrana celular das bactérias
ácido lácticas, originando oligopeptídeos. A maioria das bactérias ácido lácticas apresentam
apenas uma proteinase da membrana celular, enquanto foi reportado que Lactobacillus
helveticus apresenta ao mínimo duas destas proteinases, evidenciando assim a ação
proteolítica dessa cultura (GILBERT et al., 1997).
66
Figura 13 – Peptídeos importantes identificados por PLS-DA para os iogurtes controle (a), iogurtes controle com
Lactobacillus helveticus (b), iogurtes com alto teor proteico (c), iogurtes com alto teor proteico e Lactobacillus
helveticus (d). As caixas coloridas à direita indicam as concentrações relativas dos correspondentes metabólitos
em cada grupo em estudo. VIP score > 1 é considerado estatisticamente significante.
(*) Peptídeos potencialmente bioativos identificados nos iogurtes e similares (m/z) aos reportados na literatura
67
Dentre os peptídeos identificados, seis frações apresentam atividade inibidora de
ECA relatada anteriormente na literatura: os de m/z 748 [β-CN f(108-113)] (PIHLANTO-
LEPPALA, 1998); m/z 1053 [αS1-CN f(24-32)] (ONG et al., 2008); m/z 1110 [αS2-CN (81–
89)] (MURRAY & FITZGERALD, 2007); m/z 1151 [β-CN f(199-209)] (HA et al., 2015); m/z
1718 [β-CN f(194-209)] (STEPANIAK et al., 2001); m/z 1881 [β-CN f(193-209)]
(BIRKEMO et al., 2009). Entretanto, somente três deles foram significativos para a
separação, ou seja, apresentaram valores de escore VIP >1. São os de m/z 1053 [αS1-CN f(24-
32)], 1151 [β-CN f(199-209)] e 1881 [β-CN f(193-209)], cujas intensidades relativas ao longo
do tempo para os diferentes tratamentos são apresentadas na Figura 14.
Figura 14 – Intensidades relativas (%) dos peptídeos bioativos m/z 1053 [αS1-CN f(24-32)], 1151 [β-CN f(199-
209)] e 1881 [β-CN f(193-209)] ao longo dos 40 dias de armazenamento. (a) iogurte controle; (b) iogurte
controle com Lactobacillus helveticus; (c) iogurte com alto teor proteico; (d) iogurte com alto teor proteico e
Lactobacillus helveticus.
68
Nota-se que os peptídeos com potencial anti-hipertensivo de m/z 1053 [αS1-CN
f(24-32)] e 1881 [β-CN f(193-209)] estão presentes com maiores intensidades relativas nos
iogurtes contendo Lactobacillus helveticus e aumentaram relativamente ao longo do tempo de
armazenamento. De outra forma, o peptídeo de m/z 1151 [β-CN f(199-209)] mostrou-se
presente com maior intensidade relativa nos iogurtes controle e alto teor proteico, aumentando
após o primeiro dia de fabricação.
É importante ressaltar que os peptídeos reconhecidos como bioativos por sua
atividade inibidora de ECA e não significativamente importantes na separação do perfil de
peptídeos (valores de escore VIP <1), ou seja, os de m/z 748 [β-CN f(108-113)], m/z 1110
[αS2-CN (81–89)] e m/z 1718 [β-CN f(194-209)], estão presentes exclusivamente nos iogurtes
adicionados de Lactobacillus helveticus, independente do teor proteico. Suas intensidades
relativas ao longo dos 40 dias de armazenamento são apresentadas na Figura 15. Embora
esses peptídeos não sejam importantes na separação do perfil de peptídeos, não é possível
afirmar que não apresentem bioatividade quando avaliados em estudos in vivo. Estes
resultados indicam que a adição do Lactobacillus helveticus favoreceu, no geral, a formação
dos peptídeos bioativos em iogurtes e justificam a continuação de estudos que avaliem o
potencial bioativo in vitro e a bioatividade in vivo.
Figura 15 - Intensidades relativas (%) dos peptídeos bioativos m/z 748 [β-CN f(108-113)], 1110 [αS2-CN (81–
89)] e 1718 [β-CN f(194-209)] ao longo dos 40 dias de armazenamento. (a) iogurte controle com Lactobacillus
helveticus; (b) iogurte com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus.
As especificidades dos sítios de clivagem das proteinases da membrana celular e
das peptidases podem diferir muito de uma cepa para outra de Lactobacillus helveticus. No
entanto, de forma geral, podem clivar de maneira mais eficiente as caseínas β e αS1, e em
menor extensão as caseínas αS2 e κ (SADAT-MEKMENE, 2011). Nota-se, por exemplo, que
69
cinco dos seis peptídeos identificados anteriormente como bioativos (Figuras 14 e 15) são
provenientes da β e αS1 caseína, provavelmente pela preferência das proteinases do
Lactobacillus helveticus por tais frações proteicas do leite. Além disso, peptidases não
mutantes, presentes em cepas de Lactobacillus helveticus, estão relacionadas à maior
produção de peptídeos com atividade inibitória de ECA (KILPI et al., 2007).
É válido ressaltar também a importância da sequência específica de aminoácidos
dos peptídeos na inibição da ECA. Frações peptídicas que apresentem em sua sequência um
resíduo aromático na posição C-terminal são indicadas como melhores inibidores de ECA
comparadas aquelas que não o possuam (PIHLANTO-LEPPALA et al., 2000). A inibição da
enzima seria seletiva à posição COOH-terminal em relação aos dois últimos aminácidos
presentes nas sequências dos substratos inibidores, sendo preferidos os resíduos alifáticos,
básicos e aromáticos na penúltima posição e resíduos prolina, aromáticos e alifáticos na
última posição. O peptídeo de m/z 1110 [αS2-CN (81–89)] representado pela sequência
ALNEINQFY e presente nos iogurtes adicionados de Lactobacillus helveticus, possui ao final
de sua sequência dois aminoácidos aromáticos (fenilalanina e tirosina), o que possivelmente
resultaria em sua ação inibidora da ECA (TAUZIN et al., 2002). O mesmo pode ser
considerado em relação ao peptídeo de m/z 1881 [β-CN f(193-209)], representado pela
sequência YQEPVLGPVRGPFPIIV e também presente em maior intensidade relativa nos
iogurtes adicionados de Lactobacillus helveticus, cujos dois últimos aminoácidos da
sequência são alifáticos (isoleucina e valina) (ONG & SHAH, 2008).
Nos gráficos de escores da Figura 12 que apresenta a análise PLS-DA, observa-se
uma clara separação do perfil de peptídeos das amostras presentes após 1 e 40 dias de
armazenamento sob refrigeração. Porém, não se observou separação para os tempos
intermediários, ou seja, após 10, 20 e 30 dias de armazenamento. Assim, na tentativa de tornar
mais clara a avaliação do perfil de peptídeos frente aos diferentes tratamentos, optou-se por
avaliar o perfil de peptídeos ao longo do tempo utilizando novamente a PLS-DA nos dias 1,
20 e 40. A avaliação foi baseada nas duas primeiras PCs, explicadas por uma variância total
de dados de 62,1 %, 66,4 % e 63,5 %, representadas na Figura 16.
Durante o período de estocagem, nota-se clara separação entre os grupos de
peptídeos dos iogurtes adicionados ou não de Lactobacillus helveticus, e a pouca influência
do teor proteico na separação das amostras. Observa-se que as variáveis de maior peso
positivo para a separação das amostras a direita do gráfico de escores (Figura 16) foram os
peptídeos de m/z 1877 [αS1-CN f(1-16)] e 1053 [αS1-CN f(24-32)], considerado bioativo, e
70
relacionados às amostras adicionadas de Lactobacillus helveticus. Por outro lado, as variáveis
de maior peso negativo relacionadas às amostras sem adição de Lactobacillus helveticus
foram os peptídeos de m/z 1252 [κ-CN f(44-54)] e 1151 [β-CN f(199-209], este também
considerado bioativo. Este perfil foi mantido ao longo do tempo de estocagem. Os gráficos de
escores VIP apresentados pela Figura 17 evidenciam os peptídeos mais importantes para a
separação das amostras nos dias 1, 20 e 40.
71
Figura 16 - Análise discriminante pelo método de quadrados mínimos parciais (PLS-DA). Gráficos de escores
dos iogurtes com 1 dia (a), 20 dias (c) e 40 dias de estocagem refrigerada (e); gráficos dos pesos dos iogurtes
com 1 dia (b), 20 dias (d) e 40 dias de estocagem refrigerada (f) (•) iogurte controle (C); (•) iogurte controle com
Lactobacillus helveticus (CLh); (•) iogurte com alto teor proteico (Ca); (•) iogurte com alto teor proteico e
Lactobacillus helveticus (CaLh).
72
Figura 17 - Peptídeos importantes identificados por PLS-DA para os iogurtes com 1 dia (a), com 20 dias (b) e
com 40 dias de estocagem (c). As caixas coloridas à direita indicam as concentrações relativas dos
correspondentes metabólitos em cada grupo em estudo. VIP score > 1 é considerado estatisticamente
significante. Iogurte controle (C); iogurte controle e Lactobacillus helveticus (CLh); iogurte com alto teor
proteico (Ca); iogurte com alto teor proteico e Lactobacillus helveticus (CaLh).
(*) Peptídeos potencialmente bioativos identificados nos iogurtes e similares (m/z) aos reportados na literatura
73
Ao longo de todo o período de armazenamento, os peptídeo de m/z 1536 [αS1-CN
f(1-13)] e 1877 [αS1-CN f(1-16)] estiveram presentes com maior intensidade relativa nos
iogurtes adicionados de Lactobacillus helveticus. A maior presença desses peptídeos em tais
tratamentos decorre possivelmente do fato do Lactobacillus helveticus apresentar proteinases
associadas à membrana celular e endopeptidases que clivam a fração αS1-CN f(1-23),
originando a partir desta fração outras sequências menores de peptídeos em maior quantidade
(SOERYAPRANATA et al., 2008).
Por outro lado, os peptídeos de m/z 1151 [β-CN f(199-209)], 1252 [κ-CN f(44-
54)] e 2461 [β-CN f(168-189)] mostraram-se mais presentes nos iogurtes controle e de alto
teor proteico, tornando-se importantes na separação das amostras entre os tratamentos. As
proteinases e peptidases do Lactobacillus helveticus, além de hidrolisar as caseínas β e αS1,
são também capazes de hidrolisar frações de αS2 e κ caseína, como anteriormente discutido.
Assim, o peptídeo 1252 [κ-CN f(44-54)] está em menor intensidade relativa nos iogurtes
adicionados de Lactobacillus helveticus possivelmente por ser hidrolisado pelo sistema
proteolítico desta cultura adjunta. Os peptídeos de m/z 1053 [αS1-CN f(24-32)] e 1151 [β-CN
f(199-209)], identificados como bioativos, foram importantes na separação das amostras em
todos os dias avaliados nos gráficos escores VIP (Figura 17).
4.6 Análise sensorial
4.6.1 Perfil Flash
Na primeira sessão da análise sensorial de Perfil Flash com a finalidade de
levantar atributos, os 10 provadores utilizaram diferentes termos segundo aparência, textura,
aroma e sabor. Para a descrição das amostras de iogurte de alto teor proteico sem
Lactobacillus helveticus (A), sem Lactobacillus helveticus e com açúcar (B), sem
Lactobacillus helveticus e com adoçante (C), com Lactobacillus helveticus (D), com
Lactobacillus helveticus e com açúcar (E) e com Lactobacillus helveticus e com adoçante (F),
o número de atributos descritos pelos participantes variou entre quatro e nove, com uma
média de seis termos para cada avaliador e um total de 27 atributos (Figura 18).
74
Figura 18 - Frequência de citação de cada atributo pelos avaliadores (n = 10)
Na Figura 19, observa-se o agrupamento dos dados coletados na análise sensorial
de Perfil Flash. Houve pouca dispersão dos resultados e boa repetibilidade dos provadores,
existindo uma clara diferenciação entre os iogurtes A e D (não adoçados) do restante dos
grupos. Nota-se também que os iogurtes C e F (ambos com adoçante), assim como B e E
(ambos com açúcar), estão embaralhados e deixam claro a influência do tipo de dulçor
utilizado na separação dos grupos.
A lista dos atributos levantados aproximou-se da linguagem do consumidor, bem
como as correlações dos termos com as dimensões 1 e 2 (Tabela 1 do Anexo 1). Como
critério de escolha dos termos mais relevantes para descrição da amostra, optou-se por utilizar
atributos coincidentes entre vários provadores e com correlação, em módulo, para cada
provador superior ou igual a 0,5 (TERHAAG & BENASSI, 2011). Os termos mais citados
foram gosto doce (correlação negativa em D1), gosto ácido/azedo (correlação positiva em
D1), textura arenosa (correlação negativa em D1 e correlação positiva em D2) e aroma
característico correlação negativa em D1 e correlação positiva em D2). As correlações dos
termos com as dimensões podem ser observadas na Figura 20.
75
Figura 19 - Agrupamento e dispersão dos dados obtidos através da técnica de perfil Flash para as 6 amostras de
iogurte de alto teor proteico. A: iogurte não adoçado e sem Lactobacillus helveticus; B: iogurte com açúcar e
sem Lactobacillus helveticus; C: iogurte com sucralose e sem Lactobacillus helveticus; D: iogurte não adoçado e
com Lactobacillus helveticus; E: iogurte com açúcar e Lactobacillus helveticus; F: iogurte com sucralose e
Lactobacillus helveticus
Figura 20 – Gráfico com os atributos descritos pelos avaliadores (n=10) na avaliação dos iogurtes com alto teor
proteico no Perfil Flash
76
O iogurte com alto teor proteico com adoçante e sem Lactobacillus helveticus (C)
foi caracterizado como sendo o de maior intensidade de doçura, residual doce, sabor e aroma
característicos. Por outro lado, os iogurtes sem Lactobacillus helveticus (A) e com
Lactobacillus helveticus (D) foram melhor descritos pelos atributos gosto ácido/azedo, brilho,
sem sabor, aroma ácido/azedo e gosto amargo (Tabela 1 do Anexo 1). Este último atributo
correlacionou-se mais com o iogurte D, possivelmente pela maior concentração do peptídeo
de m/z 1881 [β-CN f(193-209)] nos produtos adicionados de Lactobacillus helveticus
(Tabelas 9 e 11). Este peptídeo, composto por 17 aminoácidos dos quais 13 são hidrofóbicos,
seria responsável por atribuir gosto amargo quando presente (SOERYAPRANATA et al.,
2002).
Os iogurtes com açúcar e Lactobacillus helveticus (E) e com adoçante e
Lactobacillus helveticus (F) foram melhor representados no eixo D2, sendo caracterizados por
apresentarem sinérese e textura arenosa (F) e aroma característico e aparência cerosa (E). O
iogurte com açúcar e sem Lactobacillus helveticus (B), por não estar representado nessas
dimensões (Figura 19), não foi relacionado especificamente com algum atributo de maior
peso na avaliação sensorial.
Os dados obtidos geraram um total de cinco dimensões, das quais as três primeiras
explicavam 89,57 % do total de dados (Tabela 12). O comportamento da equipe foi analisado
empregando-se as duas primeiras dimensões, uma vez que a terceira dimensão não alterou o
perfil de diferenciação entre as amostras nem auxiliou na explanação e discussão dos dados.
Tabela 12 - Explicação (%) da solução multidimensional para o Perfil Flash
D1 D2
Autovalor 8,08 1,93
Variabilidade (%) 62,39 14,89
% Acumulada 62,39 77,29
A Figura 21 representa a diferenciação dos diferentes tipos de iogurtes no espaço
bidimensional. Com exceção da amostra de iogurte de alto teor proteico sem Lactobacillus
helveticus e com açúcar (B), as amostras mostraram-se bem discriminadas nos eixos 1 e 2. A
variância residual dos julgadores na solução bidimensional variou de 14 % a 27 %, conforme
a Figura 22. Valores similares de variância residual dos provadores foram relatados por
Lachinit et al. (2003) para bebidas carbonatadas à base de suco de laranja.
77
Figura 21 - Configuração do consenso das amostras de iogurte de alto teor proteico nas dimensões D1 e D2. A:
iogurte não adoçado e sem Lactobacillus helveticus; B: iogurte com açúcar e sem Lactobacillus helveticus; C:
iogurte com sucralose e sem Lactobacillus helveticus; D: iogurte não adoçado e com Lactobacillus helveticus; E:
iogurte com açúcar e Lactobacillus helveticus; F: iogurte com sucralose e Lactobacillus helveticus
Figura 22 - Distribuição da variância residual dos provadores na solução bidimensional.
4.6.2 CATA (Check-all-that-apply)
As mesmas amostras e atributos levantados no Perfil Flash foram utilizados na
técnica CATA. Diferenças significativas nas frequências dos termos descritos foram
verificadas para 13 termos (p > 0,05) de acordo com Teste Q de Cochran, sugerindo que os
78
consumidores foram capazes de discriminar as amostras (Tabela 2 do Anexo 1). Os atributos
significativamente diferentes foram: aroma doce, cor branca, aparência cremosa, gosto
adstringente, gosto amargo, gosto ácido, gosto azedo, gosto doce, sabor lácteo, sabor de papel,
sabor residual doce, textura grumosa e textura característica (Figura 23). O iogurte ideal foi
descrito como apresentando sabor e aroma característicos, cremosidade, aroma e sabor lácteo,
cor branca, brilho, firmeza e aparência lisa, em concordância com o estudo de Ares et al.
(2014).
A análise de correspondência pode ser aplicada aos coeficientes de correlação e os
resultados visualizados em um mapa bidimensional (Figura 23). As primeiras duas dimensões
explicam 92,8 % da variância total dos dados (Tabela 13). As outras quatro dimensões
forneceram 7,2 % de explicação dos dados, mas não apresentaram informações relevantes na
caracterização das amostras. Os atributos relacionados ao gosto (como doçura, sabor de papel
e gosto azedo) foram melhor representados na dimensão 2, enquanto as descrições
relacionadas à aparência, aroma e textura foram melhor descritas pela dimensão 1. Os iogurtes
A e D (não adoçados) se localizaram em valores positivos da dimensão 2 e negativos na
dimensão 1, sendo mais relacionados aos termos “gosto ácido”, “sem sabor”, “aroma
fermentado” e “gosto adstringente”. Por outro lado, os iogurtes C, E, F e B se localizaram no
centro do espaço amostral e próximos entre si, sendo melhor descritos pelos termos “textura
com grumos”, “aroma lácteo”, “sabor amanteigado” e mais próximos ao “gosto doce”. Nota-
se que o iogurte B foi descrito como o mais próximo ao ideal (Figura 23).
Tabela 13 - Explicação (%) da solução multidimensional para o CATA
D1 D2
Autovalores 0,10 0,05
Variabilidade (%) 58,66 34,12
% Acumulada 58,66 92,79
79
Figura 23 - Representação das amostras de iogurte de alto teor proteico, do produto ideal e dos termos
significativos (p < 0,05) de acordo com Teste Q de Cochran e análise de correspondência, na solução
bidimensional na análise CATA. A: iogurte não adoçado e sem Lactobacillus helveticus; B: iogurte com açúcar e
sem Lactobacillus helveticus; C: iogurte com sucralose e sem Lactobacillus helveticus; D: iogurte não adoçado e
com Lactobacillus helveticus; E: iogurte com açúcar e Lactobacillus helveticus; F: iogurte com sucralose e
Lactobacillus helveticus
80
5. Conclusão
O teor de proteína e o tipo de cultura afetaram significativamente (p < 0,05) o
tempo de fermentação dos iogurtes. No entanto, o tempo de fermentação do iogurte com alto
teor proteico, associado ao uso de Lactobacillus helveticus, foi o mesmo do iogurte controle
(180 minutos), configurando uma vantagem do ponto de vista tecnológico. A adição de
Lactobacillus helveticus promoveu a formação de peptídeos considerados bioativos e anti-
hipertensivos ao longo do tempo, enquanto o aumento do teor proteico pela adição de
caseinato de cálcio não influenciou a formação dos mesmos. Em relação à análise sensorial, o
iogurte com alto teor proteico adoçado com açúcar foi considerado pelos avaliadores como o
mais próximo ao iogurte ideal.
81
6. Referênciаs
ADDEO, F.; CHIANESE, L.; SALZANO, A.; SACCHI, R.; CAPPUCIO, U.; FERRANTI,
P.; MALORNI, A. Characterization of the 12 % trichloroacetic acid-insoluble oligopeptides
of Parmegiano-Reggiano cheese. Journal of Dairy Research, v. 59, p. 401-411, 1992.
AHTESH, F. Anti-hypertensive (Angiotensin converting enzyme-inhibitory) peptides
released from milk proteins by proteolytic microorganisms and enzymes. 2016. 306 f. Tese
(Doutorado) - College of Health and Biomedicine, Victoria University, Melbourne, Australia.
2016.
AHTESH, F.; STOJANOVSKA, L.; SHAH, N.; MISHRA, V. K. Effect of flavourzyme on
angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides formed in skim milk and whey protein
concentrate during fermentation by Lactobacillus helveticus. Journal of Food Science, vol.
81, n. 1, 2016.
AKALIN, A. S; UNAL, G., DINKCI, N.; HAYALOGLU, A. A. Microstructural, textural,
and sensory characteristics of probiotic yogurts fortified with sodium calcium caseinate or
whey protein concentrate. Journal of Dairy Science, v. 95, p.3617–3628, 2012.
ALAIS, C. Ciencia de la leche. Reverté, 1985, p. 873.
ALLIA, I.; OKONIEWSKAA, M.; GIBBSA, B. F.; KONISHIB, Y. Identification of Peptides
in Cheddar Cheese by Electrospray Ionization Mass Spectrometry. International Dairy
Journal, v. 8, p. 643-649, 1998.
ALOĞLU, H. S.; ÖNER, Z.; Determination of antioxidant activity of bioactive peptide
fractions obtained from yogurt. Journal of Dairy Science, vol. 94, p. 5305–5314, 2011.
ALVARADO, J. G. G.; ALMARAZ, D. R.; RIVERA, E. J. R. Physicochemical and sensory
quality of Manchego cheese type during ripening. Revista Científica UDO Agrícola, v. 12, p.
929-938, 2012.
ALVES, L. S.; MERHEB-DINI, C.; GOMES, E.; DA SILVA, R.; GIGANTE, M. L. Yield,
changes in proteolysis, and sensory quality of Prato cheese produced with different
coagulants. Journal of Dairy Science, v. 96, p. 7490-7499, 2013.
ANTUNES, A. R.; FARINÃ, L. O.; KOTTWITZ, M. K.; PASSOTTO, J. A.
Desenvolvimento e caracterização química e sensorial de iogurtes semidesnatado adicionado
de concentrado proteico de soro. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes, Juiz de
Fora, v. 70, n. 1, p. 44-54, 2015.
ARES, G.; DAUBER, C; FERNÁNDEZ, E; GIMÉNEZ, A; VARELA, P. Penalty analysis
based on CATA questions to identify drivers of liking and directions for product
reformulation. Food Quality and Preference, v. 32, p.65–76, 2014.
ARES, G.; GONÇALVEZ, D.; PÉREZ, C.; REOLÓN, G.; SEGURA, N.; LEMA, P.;
GÁMBARO, A. Influence of gelatin and starch on the instrumental and sensory texture of
stirred yogurt. International Journal of Dairy Technology, vol. 60, n. 4, 2007.
82
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of
AOAC International. Washington, 2012.
BIRKEMO, G. A.; O’SULLIVAN, O.; R.P. ROSS, R. P.; HILL, C.; Antimicrobial activity of
two peptides casecidin 15 and 17, found naturally in bovine colostrum. Journal of Applied
Microbiology, v. 106, p. 233-240, 2009.
BONG, D. D.; MORARU, C. I. Use of micellar casein concentrate for Greek-style yogurt
manufacturing: effects on processing and product properties. Journal of Dairy Science, v. 97,
p. 1259–1269, 2014.
BORGES, P. F. Z. ET AL. Pilot scale production of protein concentrates from cow’s milk:
composition and nutritive value. Brazilian Jounal of Food Technology, v. 4, p. 1-8, 2001.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Portaria nº 318 de 24 de novembro de
1995. Aprova o uso de sucralose com a função de edulcorante em alimentos e bebidas
dietéticas. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Brasília, n. 227, 25 de
novembro. 1995.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 12, 2 de janeiro de
2001, que aprova o Regulamento Técnico sobre padrões microbiológicos para alimentos.
Diário Oficial da União: Brasília, Distrito Federal, 10 de janeiro. 2001.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 359, 23 de dezembro
de 2003. Regulamento Técnico de Porções de Alimentos Embalados para Fins de Rotulagem
Nutricional. Diário Oficial da União, 26 de dezembro. 2003.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução - RDC nº 54, 12 de novembro
de 2012, que aprova o Regulamento Técnico sobre Informação Nutricional Complementar.
Diário Oficial da União: Brasília, Distrito Federal, seção 1, p. 122, 13 de novembro. 2012.
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Portaria Nº 370, 4 de setembro de
1997, que aprova o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Leite UHT (UAT).
Diário Oficial da União: Brasília, 8 de setembro. 1997.
BRASIL. Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n° 46, de
23 de outubro de 2007, que ado a o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leites
Fermentados. Diário Oficial da União: Brasília, seção 1, p. 524 de outubro. 2007.
BROADBENT, J. R.; CAI, J.; LARSEN, L.; HUGHES, J.; WELKER, D. L.; DE
CARVALHO, V. G.; TOMPKINS, T. A.; ARDÖ, Y.; VOGENSEN, F.; LORENTIIS, A.;
GATTI, M; E.; STEELE, J. L. Genetic diversity in proteolytic enzymes and amino acid
metabolism among Lactobacillus helveticus strains. Journal of Dairy Science, v. 94, p. 4313–
4328, 2011.
BROADBENT, J. R.; STRICKLAND, M. WEIMER, B. C.; JOHNSON, M. E.; STEELE, J.
L. Peptide accumulation and bitterness in cheddar cheese made using single-strain
Lactococcus lactis starters with distinct proteinase specificities. Journal of Dairy Science,
v.81, p. 327-337, 1998.
83
BULDO, P.; BENFELDT, C.; FOLKENBERG, D. M.; JENSEN, H. B.; B, AMIGO, J. M.;
SIEUWERTS, S.; THYGESEN, K.; BERG, F.; IPSEN, R. The role of exopolysaccharide-
producing cultures and whey protein ingredients in yoghurt. Food Science and Technology, v.
72, p.189-198, 2016.
CHO, Y. C.; SHIN, S.; HONG, S.; KIM, C.; Production of functional high-protein beverage
fermented with lactic acid bacteria isolated from korean traditional fermented food korean.
Journal of Food Science, v. 35, n. 2, p. 189-196, 2015.
CHRISTENSEN, J. E.; DUDLEY, E. G.; PEDERSON, J. A.; STEELE, J.L. Peptidases and
amino acid catabolism in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek, v. 76, p. 217-246,
1999.
CONSIDINE, T.; GEARY, S.; KELLY, A.L; MCSWEENEY, P. L. H. Proteolytic specificity
of cathepsin G on bovine and 3-caseins. Food Chemistry, v. 76, p. 59-67, 2002.
COZZOLINO, S. M. F. Biodisponibilidade de nutrientes. 5. ed. São Paulo, Manole, 2016, p.
4-9.
CROXATTO, A.; PROD’HOM, G.; GREUB, G. Applications of MALDI-TOF mass
spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Review, v. 36, p. 380-
407, 2012.
DAIROU, V.; SIEFFERMANN, J. M. A Comparison of 14 jams characterized by
conventional profile and a quick original method, the Flash Profile. Journal of Food Science,
v. 67, p. 826-834, 2002.
DAIRY REPORTER, 2015. Disponível em: http://www.dairyreporter.com/Manufacturers/
Irish-made-high-protein-Powerful-Yogurt-launching-in-UK-and-Ireland. Acesso em: 2 de
julho de 2016.
DALGLEISH, D. G.; SPAGNUOLO, P. A.; GOFF, H. D. A possible structure of the casein
micelle based on high-resolution field-emission scanning electron microscopy. International
Dairy Journal, v. 14, p. 1025-1031, 2004.
DAMIN, M.R.; ALCÂNTARA, M.R.; NUNES, A.P.; OLIVEIRA, M. N. Effects of milk
supplementation with skim milk powder, whey protein concentrate and sodium caseinate on
acidification kinetics, rheological properties and structure of nonfat stirred yogurt. Food
Science and Technology, v. 42, p. 1744–1750, 2009.
DANGIN, M.; GUILLET, C.; GARCIA-RODENAS, C.; GACHON, P.; BOUTELOUP-
DEMANGE, C.; REIFFERS-MAGNANI, K.; FAUQUANT, J.; BALLÈVRE, O.;
BEAUFRÈRE, B. The rate of protein digestion affects protein gain differently during aging in
humans. The Journal of Physiology, v. 549, p. 635-644, 2003.
DELARUE, J.; SIEFFERMAN, J. M. Sensory mapping using Flash profile. Comparison with
a conventional descriptive method for the evaluation of the flavour of fruit dairy products.
Food quality and preference, Massy, vol. 15, n. 4, p. 383 -392, 2004.
84
DEVRIES, M. C.; PHILLIPS, S. M. Supplemental protein in support of muscle mass and
health: advantage whey. Journal of Food Science, v. 80, S1, 2015.
DOUGLAS, S. M.; ORTINAU, L.C; HOERTEL, H. A.; LEIDY, H. J. Low, moderate, or
high protein yogurt snacks on appetite control and subsequent eating in healthy women.
Appetite, v. 60 p. 117–12, 2013.
EBNER, J.; ARSLAN, A. A.; FEDOROVA, M.; C, HOFFMANN, R.; KÜÇÜKÇETIN, A.;
PISCHETSRIEDER, M. Peptide profiling of bovine kefir reveals 236 unique peptides
released from caseins during its production by starter culture or kefir grains. Journal of
Proteomics, v. 117, p. 41-57, 2015.
FENSTER, K. M.; PARKIN, K. L.; STEELE, J. Characterization of a thiol-dependent
endopeptidase from Lactobacillus helveticus CNRZ32. Journal of Bacteriology. v. 179, p.
2529-2533, 1997.
FITZGERALD, R. J.; MURRAY, B. A. Bioactive peptides and lactic fermentations.
International Journal of Dairy Technology, v. 59, p. 118 – 125, 2006.
FOOD INGREDIENTS BRASIL. Concentrado proteico de soro de leite 60% e 80%:
Benefícios em nutrição esportiva e suplemento para maior idade. Ed. 37 Março/Abril/Maio
2016, p. 26-28. Disponível em http://www.revista fi.com/edicoes/79/#p=7. Acesso em: 23 de
setembro de 2016.
FORBES, S. C.; LITTLE, J. P.; CANDOW, D. G.; Exercise and nutritional interventions for
improving aging muscle. Endocrine, v. 42, p. 29-38, 2012.
FORTINA, M. G.; NICASTRO, G.; CARMINATI, D.; NEVIANI, E.; MANACHINI, P. L.;
Lactobacillus helveticus heterogeneity in natural cheese starters: the diversity in phenotypic
characteristics. Journal of Applied Microbiology, v. 84, n. 1, p. 72-80, 1998.
FOX, P.F.; GUINEE, T.P.; COGAN, T.M.; MCSWEENEY, P.L.H. Fundamentals of cheese
science. Gaithersburg, AN Aspen Publication, 2000, p. 364.
FOX, P. F.; T. UNIACKE-LOWE, MCSWEENEY, P. L. H.; O’MAHONY, J.A. Dairy
chemistry and biochemistry. 2th. ed. Springer, 2015, p. 547.
FUGLSANG, A.; RATTRAY, A. F. P.; NILSSON, D.; NYBORG, N. C. B. Lactic acid
bacteria: inhibition of angiotensin converting enzyme in vitro and in vivo. Antonie van
Leeuwenhoek, v. 83, p. 27–34, 2003.
GAGNAIRE, V.; MOLLÉ, D.; HERROUIN, M.; LÉONIL, J. Peptides identified during
emmental cheese ripening: origin and proteolytic systems involved. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, v. 49, p. 4402-4413, 2001.
GILBERT, C.; BLANC, B.; FROT-COUTAZ, J.; PORTALIER, R. Comparison of cell
surface proteinase activities within the Lactobacillus genus. Journal of Dairy Research, v. 64,
p. 561-57, 1997.
85
GOBBETTI, M.; FERRANTI, P.; SMACCHI, E.; GOFFREDI, F.; ADDEO, F. Production of
angiotensin-I-converting-enzyme-inhibitory peptides in fermented milks atarted by
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus SS1 and Lactococcus lactis subsp. cremoris FT4.
Applied and Environmental Microbiology, p. 3898-3904, 2000.
GOULDSWORTHY, A. M.; LEAVER, J.; & BANKS, J. M. Application of a mass
spectrometry sequencing technique for identifying peptides present in cheddar cheese.
International Dairy Journal, v. 6, p. 781-790, 1996.
GRIFFITHS, M. W.; TELLEZ, A. M. Lactobacillus helveticus: the proteolytic system.
Frontiers in microbiology, v. 4, 2013.
GROBBEN, G. J.; CHIN-JOE, I.; KITZEN, V.A.; BOELS, I.C; SIKKEMA, J.; SMITH,
M.R.; DE BONT, J.A.M. Enhancement of exopolysaccharide production by Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 with a simplified defined medium. Applied and
Environmental Microbiology, v. 64, p. 1333, 1998.
GURSEL, A.; GURSOY, A.; ANLI, E. A. K. ; BUDAK, S. O. ; AYDEMIR, S.; DURLU-
OZKAYA, F. Role of milk protein–based products in some quality attributes of goat milk
yogurt. Journal of Dairy Science, v. 99, p. 2694–2703, 2016.
HA, G. E.; CHANG, O. K.; JO, S-M. Identification of antihypertensive peptides derived from
low molecular weight casein hydrolysates generated during fermentation by Bifidobacterium
longum KACC 91563. Korean Journal for Food Science of Animal Resources, v. 35, p. 738-
747, 2015.
HARTE, F.; LUEDECKE, L.; SWANSON, B.; BARBOSA-CANOVAS, G. V. Low-fat set
yogurt made from milk subjected to combinations of high hydrostatic pressure and thermal
processing. Journal of Dairy Science, v. 86, p. 1074, 2003.
HAYES, M. G.; HURLEY, M. J.; LARSEN, L. B.; HEEGAARD, C. W.; ABDALLAH A. A.
MAGBOUL, A. A. A.; OLIVEIRA, J. C.; PAUL L. H.; McSWEENEY, P. L. H.; KELLY, A.
L. Thermal inactivation kinetics of bovine cathepsin D. Journal of Dairy Research, v. 68, p.
267-276, 2001.
HERNÁNDEZ-LEDESMA, B.; CONTRERAS, M. M.; RECIO, I. Antihypertensive peptides:
production, bioavailability and incorporation into foods. Advances in Colloid and Interface
Science, v. 165, p. 23-25, 2011.
HERNÁNDEZ-LEDESMA, B.; MIRALLES, B.; AMIGO, L.; RAMOS, M.; RECIO, I.
Identification of antioxidant and ACE-inhibitory peptides in fermented milk. Journal of the
Science Food and Agriculture, v. 85, p. 1041–1048, 2005.
HORNE, D. S. Purification and properties of a milk-clotting enzymes produced by
Penicillium oxalicum. Bioresource Technology, v. 75, p. 219-222, 2000.
IBEAGHA–AWEMU, E. M.; LIU, J. R.; ZHAO, X. Bioactive components in yogurt
products. Wiley-Blackwell, 2009. p. 243.
86
INELMEN, E. M; SERGI, G.; COIN, A.; MIOTTO, F.; PERUZZA, S.; ENZI, G. Can obesity
be a risk factor in elderly people? Obesity Reviews, v. 4, p. 147-155, 2003.
INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS – ITAL. Brasil Food Trends 2020. São
Paulo: ITAL/FIESP, 2010. 173 p. Disponível em: http://www.brasilfoodtrends.com.br/Brasil_
Food_Trends/files/publication.pdf. Acesso em: 20 de agosto de 2016.
JIN, Y.; YU, Y.; QI, Y.; B, FANGJUNWANG; YAN, J.; ZOU, H. Peptide profiling and the
bioactivity character of yogurt in the simulated gastrointestinal digestion. Journal of
Proteomics, v. 141, p. 24–46, 2016.
JORGENSEN, C. E.; ABRAHAMSEN, R. K.; RUKKE, E. O.; JOHANSEN, A. G.;
SCHÜLLER, R. B.; SKEIE, S. B. Improving the structure and rheology of high protein, low
fat yoghurt with undenatured whey proteins. International Dairy Journal, v. 47, p. 6-18,
2015.
KHALID, N. M.; EL-SODA, M.; MARTH, E. H. Peptidase hydrolases of Lactobacillus
helveticus and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Journal of Dairy Science, v. 74, p.
45, 1991.
KILPI, E. R.; KAHALAA, M. M.; STEELEB, J. L.; PIHLANTOA, A. M.;
ANDJOUTSJOKIA, V. V. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity in milk
fermented by wild type and peptidase deletion derivatives of Lactobacillus helveticus
CNRZ32E. International Dairy Journal, v. 17, p. 976–984, 2017.
KINDSTEDT, P. American Farmstead Cheese: the complete guide to making and selling
artisan cheeses. Vermont Cheese Council, 2005. p. 37-48.
KORHONEN, H.; PIHLANTO, A. Bioactive peptides: new challenges and opportunities for
the dairy industry. Australian Journal of Dairy Technology, v. 58, p. 129, 2003.
KULOZIK, U.; WILDE, J. Rapid lactic acid production at high cell concentrations in whey
ultrafiltrate by Lactobacillus helveticus. Enzyme and Microbial Technology, v. 24, p. 297-
302, 1999.
KUNDA, P. B.; BENAVENTE, F.; CATALA-CLARIANA, S.; GIMENEZ, E.; BARBOSA,
J.; SANZ-NEBOT, V.; Identification of bioactive peptides in a functional yogurt by micro
liquid chromatography time-of-flight mass spectrometry assisted by retention time prediction.
Journal of Chromatography A, v. 1229, p. 121– 128, 2012.
LACHNIT, M.; BUSCH-STOCKFISCH, M.; KUNERT, J.; KRAHL, T. Suitability of Free
Choice Profiling for assessment of orange based carbonated soft drinks. Food Quality and
Preference, v. 14, n. 4, p. 257-263, 2003.
LECLERC, P. L.; GAUTHIER, S. F.; BACHELARD, H.; SANTURE, M.; ROY, D.;
Antihypertensive activity of casein-enriched milk fermented by Lactobacillus helveticus.
International Dairy Journal, v. 12, p. 995–1004, 2002.
87
LIU, Y.; PISCHETSRIEDER, M. Identification and relative quantification of bioactive
peptides sequentially released during simulated gastrointestinal digestion of commercial kefir.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 65, p. 1865–1873, 2017.
MACFIE, H. J.; BRATCHELL, N.; GREENHOOFF, K.; VALLIS, L. Designs to balance the
effect of order of presentation and first order carry over effects in hall tests. Journal of
Sensory Studies, v. 4, p. 129-148, 1989.
MAENO, M.; YAKAMOTO, N.; TAKANO, T.; Identification of antihypertensive peptides
from casein hydrolysate produced by a proteinase from Lactobacillus helveticus CP790.
Journal of Dairy Science, v. 73, p. 1316-1321, 1996.
MARAFON, A. P.; SUMI, A.; ALCÂNTARA, M. R., TAMIME, A. Y.; OLIVEIRA, M. N.;
Optimization of the rheological properties of probiotic yoghurts supplemented with milk
proteins. Food Science and Technology, v. 44, p. 551-519, 2011.
MARAFON, A. P.; SUMI, A.; GRANATO, D.; ALCÂNTARA, M. R.; TAMIME, A. Y.;
OLIVEIRA, M. N.; Effects of partially replacing skimmed milk powder with dairy
ingredients on rheology, sensory profiling, and microstructure of probiotic stirred-type yogurt
during cold storage. Journal of Dairy Science, v. 94, p. 5330–5340, 2001.
MARQUESAN, F. M. Análise da função Muscular em idosas com e sem fibromialgia. 2012.
90 f. Tese (Doutorado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul. Instituto de
Geriatria e Gerontologia, 2012.
MCCARTHY, R.; MILLS, S.; ROSS, R. P.; FITZGERALD, G.F.; STANTON, C. Bioactive
Peptides from Casein and Whey Proteins. In: Kanekanian, A. (Ed.). Milk and Dairy Products
as Functional Foods. UK: Wiley-Blackwell, p. 23-46, 2014.
MCSWEENEY, P. L. H.; FOX, P. F. Advanced dairy chemistry: proteins basic Aspects. 4th
ed., Springer, 2013. p. 548.
MIZUSHIMA, S.; OHSHIGE, K.; WATANABE, J.; KIMURA, M.; KADOWAKI, T.;
NAKAMURA, Y.; TOCHIKUBO, O.; UESHIMA, H. Randomized controlled trial of sour
milk on blood pressure in borderline hypertensive men. American Journal of Hypertension, v.
17, p. 701-706, 2004
MURRAY, B. A.; FITZGERALD, R. J. Angiotensin converting enzyme inhibitory peptides
derived from food proteins: biochemistry, bioactivity and production. Current
Pharmaceutical Design, v. 13, p. 773, 2007.
NAKAMURA, Y.; MASUDA, O.; TAKANO, T. Decrease of tissue angiotensin I-converting
enzyme activity upon feeding sour milk in spontaneously hypertensive rats. Bioscience
biotechnology and biochemistry, v. 60, p. 448-489, 1996.
NEEDS, E. C.; CAPELLAS, M.; BLAND, A. P.; MANOJ, P.; MACDOUGAL, D.; PAUL,
G. Comparison of heat and pressure treatments of skim milk, fortified with whey protein
concentrate, for set yogurt preparation: effects on milk proteins and gel structure. Journal of
Dairy Research, v. 67, p. 329-348, 2000.
88
NIELSEN COMPANY. Para onde vai o consumidor? Disponível em: http://www.nielsen.
com/pt/pt/press-room/2017/where-does-the-consumer-go.html. Acesso em: 04 de novembro
de 2017.
NIELSEN, M. S.; MARTINUSSEN, T.; FLAMBARD, B.; I. SØRENSEN, K. I.; OTTE, J.
Peptide profiles and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk
products: effect of bacterial strain, fermentation pH, and storage time. International Dairy
Journal, v. 19 p. 155–165, 2009.
ONG, L.; SHAH, N. P. Influence of Probiotic Lactobacillus acidophilus and L. helveticus on
proteolysis, organic acid profiles, and ACE-inhibitory activity of cheddar cheeses ripened at
4, 8, and 12 ◦C. Food Microbiology and Safety, v. 73, n. 3, 2008.
OLIVEIRA, M. N., SODINI, I., REMEUF, F., & CORRIEU, G. Effect of milk
supplementation and culture composition on acidification, textural properties and
microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria. International Dairy
Journal, v. 11, p. 935-942, 2011.
ORTEGA, N.; ALBILLOS, S. M.; BUSTO, W. D. Application of factorial design and
response surface methodology to the analysis of bovine caseins by capillary zone
electrophoresis. Food Control, v. 14, p. 307–315, 2002.
OTTE, J.; LENHARD, T.; FLAMBARD, B.; I. SØRENSEN, K. I.; Influence of fermentation
temperature and autolysis on ACE-inhibitory activity and peptide profiles of milk fermented
by selected strains of Lactobacillus helveticus and Lactococcus lactis. International Dairy
Journal, v. 21, 2011.
OTTE, J., ZAKORA, M., KRISTIANSEN, K. R., QVIST, K. B. Analysis of bovine caseins
and primary hydrolysis products in cheese by capillary zone electrophoresis. Lait, v. 77, p.
241-57, 1997.
PACHECO, M. T.; ANTUNES, A. E. C.; SGARBIERI, V. C. New technologies and
physiological functional properties of milk proteins. In: Protein Research Progress. Eds:
Boscoe, A. B. & Listow, C. R. Nova Science, 2008. p. 117-168
PARK, Y. W. Bioactive Components in Milk and Dairy Products. Wiley-Blackwell, 2009. p.
235-250.
PASIAKOS, S. M. Metabolic advantages of higher protein diets and benefits of dairy foods
on weight management, glycemic regulation, and bone. Journal of Food Science, v. 80, S1,
2015.
PHELAN, M.; AHERNE, A.; FITZGERALD, R. J.; O'BRIEN, N. M. Casein-derived
bioactive peptides: biological effects, industrial uses, safety aspects and regulatory status.
International Dairy Journal, v. 19, p. 643, 2009.
PHILLIPS, S.M. Symposium 2: exercise and protein nutrition. The science of muscle
hypertrophy: making dietary protein count. Proceedings of Nutrition Society, v. 70, p. 100–
103, 2011.
89
PIHLANTO-LEPPALA, A.; KOSKINEN, P.; PIILOLA, K.; TUPASELA, T.; KORHONEN,
H. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory properties of whey protein digests:
concentration and characterization of active peptides. Journal of Dairy Science Research, v.
67, p. 53-64, 2000.
QUIRÓS, A.; RAMOS, M.; MUGUERZA, B.; DELGADO, M. A.; MARTÍN-ALVAREZ, P.
J.; ALEXANDRE, A.; RECIO, I. Determination of the antihypertensive peptide LHLPLP in
fermented milk by high performance liquid chromatography mass spectrometry. Journal of
Dairy Science, v. 89, 2006.
REIS, R. C; MINIM, V. P. R.; DIAS, B. R. P; CHAVES, J. B. P.; MINIM, L. A. Impacto da
utilização de diferentes edulcorantes na aceitabilidade de iogurte “light” sabor morango.
Alimentos e nutrição, v. 20, p. 53-60, 2009.
REITELSEDER, S.; AGERGAARD, J.; DOESSING, S.; HELMARK, I. C.; LUND, P.;
KRISTENSEN, N. B., FRYSTYK, J.; FLYVBJERG, A.; SCHJERLING , P.; VAN HALL,
G.; KJAER, M. HOLM, L. Whey and casein labeled with L-[1-13C] leucine and muscle
protein synthesis: effect of resistance exercise and protein ingestion. American Journal
Physiology Endocrinol Metablism, v. 300, p. 231-42, 2011.
REMEUF, F.; MOHAMMED, S.; SODINI, I.; TISSIER, J.P. Preliminary observations on the
effects of milk fortification and heating on microstructure and physical properties of stirred
yogurt. International Dairy Journal, v. 13, p.773–782. 2003.
RIBEIRO, M. C. E.; CHAVERS, K. S.; GEBARA, C.; INFANTE, F. N. S.; GROSSO, C. R.
F.; GIGANTE, M. L. Effect of microencapsulation of Lactobacillus acidophilus LA-5 on
physicochemical, sensory and microbiological characteristics of stirred probiotic
yoghurt. Food Research International, v. 66, p. 424-431, 2014.
RITTMANIC, S. Whey proteins in ready-to-drink beverages. U.S. Dairy Export Council,
2006. Disponível em: http://www.thinkusadairy.org/Documents/Customer%20Site/C3-
Using%20Dairy/C3.7Resources%20and%20Insights/03Application%20and%20Technical%2
0Materials/RTDBEVERAGES_ENG.pdf. Acesso em: 28 de agosto de 2016.
ROBERT, M.; RAZANAME, A.; MUTTER, M.; JUILLERAT, M. A. Identification of
angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides derived from sodium caseinate
hydrolysates produced by Lactobacillus helveticus. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v. 52, p. 6923 6931, 2004.
ROMEIH, E. A.; ABDEL-HAMID, M.; A. A, AWAD. The addition of buttermilk powder
and transglutaminase improves textural and organoleptic properties of fat-free buffalo yogurt.
Dairy Science and Technology, v. 94, p. 297–309, 2014.
SADAT-MEKMENE, L.; GENAY, M.; ATLAN, D.; LORTAL, S.; GAGNAIRE, V. Original
features of cell-envelope proteinases of Lactobacillus helveticus. International Journal of
Food Microbiology, v. 146, p. 1–13, 2011.
90
SAFFON, M.; RICHARD, V.; JIMÉNEZ-FLORES, R.; GAUTHIER, S. F.; BRITTEN, M.;
YVES POULIOT, Y. Behavior of heat-denatured whey: buttermilk protein aggregates during
the yogurt making process and their influence on set type yogurt properties. Foods, v. 2, p.
444 - 459, 2013.
SEPPO, L.; JAUHIAINEN, T.; POUSSA, T.; KORPELA, R. A fermented milk high in
bioactive peptides has a blood pressure-lowering effect in hypertensive subjects. The
American Journal of Clinical Nutrition, v. 77, p. 326-330, 2006
SHAHPEM, E.; WIIEATERD, M. Lactobacillus helveticus. Journal of General
Microbiology, v. 16, p. 676-679, 1957.
SIEFFERMANN, J. M. Le profil flash: un outil rapide et innovant d’évaluation sensorielle
descriptive. In: AGORAL, 2000, Montpellier. Anais... Paris: Lavoisier, p. 335-340.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de métodos de análise
microbiológica de alimentos. São Paulo: Varela, 2010, p. 317.
SODINI, I.; REMEUF, F.; HADDAD, S.; CORRIEU, G. The relative effect of milk base,
starter, and process on yogurt texture: a review. Critical Reviews in Food Science and
Nutrition, v. 44, p. 113-137, 2004.
SOERYAPRANATA, E.; POWERS, J. R.; FAJARRINI, F.; WELLER, K. M.; HILL, H. H.;
SIEMS, W. F. Relationship between MALDI-TOF analysis of β-CN f193-209 concentration
and sensory evaluation of bitterness intensity of aged cheddar cheese. Journal of Agriculture
and Food Chemistry, v. 50, p. 4900-4905, 2002.
SOERYAPRANATA, E.; POWERS, J. R.; ÜNLÜ, G. Degradation of αs1-CN f1-23 by
aminopeptidase N and endopeptidases E, O, O2, and O3 of Lactobacillus helveticus WSU19
under cheese ripening conditions. International Dairy Journal, v. 18, p. 178-186, 2008.
SOERYAPRANATA, E.; POWERS, J. R.; WELLER, K. M; HILL, H. H.; SIEMS, W. F.
Differentiation of intracellular peptidases of starter and adjunct cultures using matrix-assisted
laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lebensmittel-Wissenschaft +
Technologie, v. 37, p. 17-22, 2004.
STANTON, C; GARDINER, G.; MEEHAN, H.; COLLINS, K.; FITZGERALD, G.;
LYNCH, P. B.; ROSS, R. P. Market potential for probiotics. American Journal of Clinical
Nutrition, v. 73, p. 476-483, 2001.
STEPANIAK, L.; SORHAUG, T.; JEDRYCHOWSKI, L.; WROBLEWSKA, B.
Immunoreactivity and inhibition of angiotensini converting enzyme and lactococcal
oligopeptidase by peptides from cheese. Italian Journal of Food Science, v. 13, p. 373-381,
2001.
TAMIME, A. Y.; ROBINSON, R. K. Yoghurt: science and technology. 2. ed. Oxford:
Pergamon, 1999. p. 431.
TAUZIN, J.; MICLO, L.; GAILLARD, J. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory
peptides from tryptic hydrolysate of bovine αS2-casein. FEBS Letters, v. 531, p. 369-374,
2002.
91
TAVERNITI, V.; GUGLIELMETTI, S.; Health-promoting properties of Lactobacillus
helveticus. Frontiers in Microbiology, v. 3, 2012.
TECHNAVIO. Global high protein based food market 2017-2021. Inglaterra, 2017, p. 66.
Disponível em: https://www.technavio.com/talk-to us?report=Global+High+Protein+Based+
Food+Market+2017-2021&type=sample. Acesso em: dois de novembro de 2017.
TERHAAG, M. M.; BENASSI, M. T. Perfil Flash: uma opção para análise descritiva rápida.
Journal Food Technology, p. 140-151, 2010.
THORPE, M. P.; JACOBSON, E. H.; LAYMAN, D. K.; HE, X.; KRIS-ETHERTON, P. M.;
EVANS, E. M. A diet high in protein, dairy, and calcium attenuates bone loss over twelve
months of weight loss and maintenance relative to a conventional high-carbohydrate diet in
adults. Journal of Nutrition, v.138, p. 1096–100, 2008.
UNAL, U.; AKALIN, A. S. Antioxidant and angiotensin-converting enzyme inhibitory
activity of yoghurt fortified with sodium calcium caseinate or whey protein concentrate. Dairy
Science & Technology, v. 92, p. 627–639, 2012.
UNAL, U.; AKALIN, A. S. Influence of fortification with sodium–calcium caseinate and
whey protein concentrate on microbiological, textural and sensory properties of set-type
yoghurt. International Journal of Dairy Technology, v. 66, 2013.
VANDERZANT, C. & SPLITTSTOESSER, F. D. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 3. ed. American Public Health Association,
Washington, D. C. 1992. p. 1219.
VANDEWATER, K.; VICKERS, Z. Higher protein foods produce greater sensory specific
satiety. Physiology and Behavior, v. 59, p. 579–583, 1996.
VIRTANEN, T.; A. PIHLANTO, A.; AKKANEN, S.; KORHONEN, H. Development of
antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bactéria. Journal of
Applied Microbiology, v. 102, p. 106-115, 2007.
WALSTRA, P.; WOUTERS, J. T. M.; GEURTS, T. Dairy Science and Technology. 2. ed.
London, CRC Press, 2006. p. 744.
WILLIAMS, A. A.; LANGRIN, S. P. The use of free-choice profiling for the evaluation of
commercial ports. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 35, p. 558–568, 1984.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Guideline: sodium intake for adults and children.
Geneva, 2012.
WU, J.; DING, X. Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting
enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 49, p. 501-506, 2001.
YERLIKAYA, O. Starter cultures used in probiotic dairy product preparation and popular
probiotic dairy drinks. Food Science and Technology, v. 34, p. 221-229, 2014.
92
ZHANG, T.; MCCARTHY, J.; WANG, G.; LIU, Y.; GUO, M. Physiochemical properties,
microstructure and probiotic survivability of nonfat goats’ milk yogurt using heat-treated
whey protein concentrate as fat replacer. Journal of Food Science, v. 80, 2015.
93
ANEXO 1 – Tabelas utilizadas nas análises sensoriais Perfil Flash e CATA
Tabela 1 - Atributos melhor correlacionados (|r|) com as duas primeiras dimensões (D1, D2) para cada provador
no Perfil Flash.
Avaliador D1 D2
1 Gosto doce (-0,84); Gosto ácido/azedo (0,92); Aroma
característico (-0,60); Presença de soro (-0,54)
Presença de soro (0,79); Aroma
característico (-0,73); Textura
arenosa (0,83)
2
Brilho (0,87); Opacidade (-0,84); Aroma doce (-0,69); Sabor
papel (0,78); Gosto doce (-0,83); Gosto ácido/azedo (0,84);
Textura arenosa (-0,51)
Aroma característico (0,65);
3 Gosto doce (-0,92); Gosto ácido/azedo (0,80); Residual doce
(-0,92) Gosto ácido/azedo (0,58)
4 Sem sabor (0,83); Textura arenosa (0,65); Gosto doce (-0,92);
Sabor característico (-0,73) Sabor característico (-0,54)
5
Aroma lácteo (-0,76); Gosto doce (-0,94); Cremosidade (-
0,88); Gosto ácido/azedo (0,91); Sem sabor (0,94); Cor branca
(0,56)
Aroma lácteo (0,52)
6 Aroma ácido (0,96); Aroma fermentado (0,65); Gosto
ácido/azedo (0,95); Viscosidade (0,96); Gosto doce (-0,92) Baixas correlações (<0,50)
7 Gosto doce (-0,82); Gosto ácido/azedo (0,84) Textura arenosa (0,75)
8 Aroma ácido (0,73); Gosto doce (-0,91); Gosto ácido/azedo
(0,70); Sabor característico (-0,90); Baixas correlações (<0,50)
9 Gosto amargo (0,81); Sabor residual (0,75); Gosto doce (-
0,81); Aroma característica (-0,70); Textura arenosa (-0,51) Aroma característico (0,53)
10 Aroma doce (-0,91); Sabor residual (0,91); Gosto doce (-0,91)
Textura característica (0,63);
Aparência cerosa (-0,79);
Aparência característica (0,63)
94
Tabela 2 - Porcentagem dos provadores que selecionaram cada um dos termos em CATA (n = 67).
Iogurtes
Atributos Ideal A B C D E F
Aroma amanteigado ns 1 8 8 10 8 9 5
Aroma característico ns 63 40 45 35 40 43 44
Ar. característico queijo ns 0 9 4 6 8 8 6
Aroma doce *** 27 12 23 23 8 21 22
Aroma fermentado ns 18 27 22 22 23 20 27
Aroma lácteo ns 33 26 26 30 30 33 33
Sem aroma ns 0 7 2 6 4 6 4
Cor branca ** 42 53 55 57 57 52 59
Brilho ns 37 40 43 40 39 44 41
Aparência característica ns 13 6 9 5 6 10 8
Aparência cerosa ns 1 14 6 9 13 10 9
Aparência cremosa * 64 24 36 36 28 32 26
Firmeza ns 38 9 7 8 8 6 10
Granuloso ns 0 22 23 25 30 26 26
Aparência lisa ns 42 15 9 16 9 14 15
Aparência líquida ns 0 16 11 21 16 22 19
Opacidade ns 5 13 9 10 12 9 9
Soro ns 2 19 12 13 18 21 17
Gosto adstringente *** 4 26 8 11 21 9 11
Sabor amanteigado ns 3 3 10 10 6 11 11
Gosto amargo *** 1 15 0 4 20 1 1
Gosto ácido *** 29 30 15 15 27 14 10
Gosto azedo *** 24 34 14 9 41 8 10
Sabor característico ns 39 14 23 22 20 27 25
Gosto doce *** 34 2 48 57 2 55 55
Sabor lácteo *** 44 26 45 35 30 38 38
Sabor papel ** 0 5 0 1 5 1 0
Sabor residual doce ** 4 19 6 18 13 9 12
Sem sabor ns 0 3 1 1 2 1 0
Textura arenosa ns 1 37 28 39 41 34 33
95
(continuação)
Iogurtes
Atributos Ideal A B C D E F
Textura grumosa ** 1 21 18 28 32 27 34
Textura característica * 15 3 12 10 6 8 12
Textura cremosa ns 59 31 33 31 23 27 29
Textura firme ns 41 6 9 5 5 7 7
Textura lisa ns 38 15 16 12 13 16 10
Viscosidade ns 21 18 12 13 14 15 12
*** Diferença significativa a p < 0,001
** Diferença significativa a p < 0,01
* Diferença significativa a p < 0,05
ns Sem diferença significativa (p > 0.05) de acordo com o Teste Q de Cochran
A: iogurte não adoçado e sem Lactobacillus helveticus; B: iogurte com açúcar e sem Lactobacillus helveticus; C:
iogurte com sucralose e sem Lactobacillus helveticus; D: iogurte não adoçado e com Lactobacillus helveticus; E:
iogurte com açúcar e Lactobacillus helveticus; F: iogurte com sucralose e Lactobacillus helveticus.
96
ANEXO 2 - Parecer consubstanciado do comitê de ética em pesquisa
97
98
99
100
101
ANEXO 3 - Laudo das análise microbiológica dos lotes submetidos á análises sensoriais