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UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU – FURB CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS – CCEN
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA – PPGQ
RESOLUÇÃO DO (±)-CITRONELOL E ÁCIDO (±)-CITRONÉLICO VIA
ESTERIFICAÇÃO ENANTIOSSELETIVA CATALISADA PELA LIPASE DE
CANDIDA ANTARCTICA
VIVIANE QUINTINO MARTINI
BLUMENAU – SC 2007
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VIVIANE QUINTINO MARTINI
RESOLUÇÃO DO (±)-CITRONELOL E ÁCIDO (±)-CITRONÉLICO VIA
ESTERIFICAÇÃO ENANTIOSSELETIVA CATALISADA PELA LIPASE DE
CANDIDA ANTARCTICA
Dissertação submetida à Universidade Regional de Blumenau como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química. Orientador: Prof. Dr. Paulo César de Jesus
BLUMENAU – SC 2007
3
4
“A DEUS, QUE FOI O MEU SUPORTE PARA CHEGAR ATÉ AQUI,
A TODA MINHA FAMILIA PELA FORÇA E CONFORTO,
A TODOS QUE ME PROPORCIONARAM A EMOÇÃO EM
SENTIR A DESCOBERTA DO MEU CRESCIMENTO PESSOAL,
PROFISSIONAL E INTELECTUAL”
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, que tudo dirige e determina.
A meu esposo Alexandro pelo incentivo e compreensão nos momentos difíceis. A minha filha Maitê por entender que a mamãe teria que ficar tanto tempo ausente, e a mais nova integrante da família, Gabriela. Enfim a toda minha família que sempre me apoiou nesta caminhada. Aos meus amigos, colegas de mestrado, pela amizade, motivação, acredito que essa etapa não seria a mesma sem a presença de vocês. Ao Prof. Dr. Paulo César pela orientação, confiança, “paciência” e apoio oferecidos durante todas as etapas desse trabalho. E aos demais professores pelo incentivo, e amizade em todas as etapas do curso de mestrado. A Prof. Dra. Maria da Graça Nascimento da Universidade Federal de Santa Catarina, pela contribuição nas analises polarimetricas e espectroscópicas. Ao Alberto Wisniewski Junior do Instituto de Pesquisas Tecnológicas de Blumenau – IPTB / Laboratório de Ensaios de Cromatografia, pela realização das análises cromatográficas e espectrométrica de massas.
6
SUMÁRIO
RESUMO ...........................................................................................................................14
ABSTRACT…....................................................................................................................16
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................9
LISTA DE TABELAS .......................................................................................................12
LISTA DE ABREVIAÇÕES.............................................................................................13
1.1 HISTÓRICO DA BIOCATÁLISE ..............................................................................18 1.2 A BIOCATÁLISE .........................................................................................................20 1.3 ENZIMAS COMO BIOCATALISADORES .............................................................21
1.3.1 Classificação das Enzimas .....................................................................................23
1.3.2 Seletividade das Enzimas........................................................................................24
1.3.3 Especificidade .........................................................................................................24
1.4 FATORES QUE INFLUENCIAM NA BIOCATÁLISE ...........................................27 1.4.1 Imobilização de Enzimas........................................................................................27
1.4.2 Influência da Temperatura ....................................................................................29
1.4.3 Influência do pH.....................................................................................................30
1.4.4 Influência do Solvente............................................................................................30
1.5 LIPASES........................................................................................................................31 1.6 APLICAÇÃO DE LIPASES NA SÍNTESE ASSIMÉTRICA ...................................36 1.7 FEROMÔNIOS.............................................................................................................42
2. JUSTIFICATIVA ..........................................................................................................46
3. OBJETIVOS...................................................................................................................48
3.1 OBJETIVO GERAL.....................................................................................................48 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................48
4. PARTE EXPERIMENTAL ..........................................................................................49
4.1. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................49 4.2 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPOSTOS ..............................................................49 4.3 PREPARAÇÃO DO MEIO REACIONAL ................................................................50
4.3.1 Resolução do Ácido Racêmico (±)-Citronélico catalisado pela lipase de Candida
antarctica (CAL-B). .........................................................................................................50
4.3.2 Resolução do Álcool Racêmico (±)-Citronelol catalisado pela lipase de Candida
antarctica (CAL-B) ..........................................................................................................51
7
4.3.3 Estudo do efeito de solvente na resolução do Ácido (±)-Citronélico e do (±)-
Citronelol .........................................................................................................................51
4.3.4 Estudo da Razão Molar para o Ácido (±)-Citronélico ..........................................52
4.3.5 Estudo da razão molar para o (±)-citronelol .........................................................52
4.3.6 Estudo da variação da massa de enzima na esterificação do ácido (±)-citronélico
..........................................................................................................................................52
4.3.7 Estudo da variação da massa de enzima na esterificação do (±)-citronelol ........53
4.3.8 Determinação da atividade ótica dos produtos e excessos enantioméricos..........53
4.3.9 Preparação dos Ésteres Racêmicos do Ácido (±)-Citronélico Via Catálise Ácida
..........................................................................................................................................54
4.3.10 Preparação dos Ésteres Racêmicos do Álcool (±)-Citronelol Via Catalise Ácida
..........................................................................................................................................55
4.3.11 Análise em Cromatografia Gasosa com coluna Quiral ......................................55
4.3.12 Análise em Espectrômetro de Massas..................................................................55
4.3.13 Reações de Hidrólise dos ésteres catalisados pelas lipases .................................55
4.3.14 Reutilização do Biocatalisador.............................................................................56
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................57
5.1 RESOLUÇÃO DO ÁCIDO (±)-CITRONÉLICO CATALISADO PELA LIPASE
CANDIDA ANTARCTICA (CAL-B) ..................................................................................58 5.1.1 Caracterização dos citronelatos de n-alquila obtidos............................................60
5.1.2 Avaliação da enantiosseletividade da CAL-B para a preparação dos citronelatos
de n-alquila ......................................................................................................................63
5.1.3 Efeito de solvente na preparação dos citronelatos de n-alquila catalisada pela
CAL-B ..............................................................................................................................68
5.1.4 Avaliação da razão molar na preparação do (-)-citronelato de n-octila ..............69
5.1.5 Efeito da massa da enzima CAL-B na preparação do (-)-citronelato de n-octila 70
5.2 RESOLUÇÃO DO ÁLCOOL (±)-CITRONELOL CATALISADO PELA LIPASE CANDIDA ANTARCTICA (CAL-B).................................................................................71
5.2.1 Caracterização dos ésteres obtidos a partir do (±)-citronelol ...............................72
5.2.2 Avaliação da enantiosseletividade da CAL-B para a preparação dos alcanoatos
de citronila .......................................................................................................................75
5.2.3 Efeito de solvente na preparação dos alcanoatos de citronila catalisada pela
CAL-B ..............................................................................................................................78
8
5.2.4 Efeito da massa da enzima CAL-B na preparação dos alcanoatos de n-citronila
..........................................................................................................................................79
5.2.5 Avaliação da razão molar na preparação do (-)-butirato de citronila..................80
5.2.6 Avaliação da reutilização do biocatalisador ..........................................................81
5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS..................................................................82
6. CONCLUSÃO................................................................................................................85
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Representação geral da ligação enzima-substrato.................................
25
Figura 2
Mecanismo da enzima e substrato segundo a teoria de Fischer............ 25
Figura 3
Mecanismo da ligação entre enzima e substrato segundo a teoria de Koshland...............................................................................................
26
Figura 4 Diagrama de energia de reação catalisada versus não catalisada enzimaticamente...................................................................................
26
Figura 5 Formas de imobilização de biocatalisadores.........................................
28
Figura 6 Reações de hidrolise e síntese de éster a partir de glicerol e ácidos graxos....................................................................................................
32
Figura 7 Mecanismos de reação enzimática de Hidrolise, Esterificação, Transesterificação, e Interesterificação.................................................
33
Figura 8 Estrutura Tridimensional das Lipases...................................................
35
Figura 9 Mecanismo de reação que ocorre com as enzimas Lipases..................
36
Figura 10 Resolução enzimática para o (R,S)-Ibuprofen......................................
37
Figura 11 Exemplos de drogas resolvidas via catálise enzimática........................
37
Figura 12 Resolução enzimática do Naproxen .....................................................
38
Figura 13 Resolução enzimática do (S)-Atenolol.................................................
39
Figura 14
Esquema de reação para a obtenção do (S)-lavandulol via biocatálise.............................................................................................
40
Figura 15 Catálise enantiosseletiva da transesterificação do 2-silyloxy-1-propanol................................................................................................
41
Figura 16 Esquema do sitio ativo para as lipases derivado do Modelo de Kazlauskas............................................................................................
41
Figura 17 Feromônios sintetizados a partir do ácido (R)-(+)-citronélico.............
42
Figura 18 Substâncias químicas emitidas por organismos vivos..........................
43
Figura 19 Algumas estruturas de Feromônios.......................................................
44
Figura 20 Estrutura da molécula de Talidomida...................................................
46
10
Figura 21 Gráfico da Influência do efeito do tamanho da cadeia carbônica do álcool na formação dos citronelatos de n-alquila..................................
59
Figura 22 Espectro de Infravermelho do citronelato de octila..............................
60
Figura 23 Espectro de massa do citronelato de n-octila........................................
61
Figura 24 Rota de fragmentação do citronelato de n-octila associada ao espectro de massas................................................................................
62
Figura 25 Espectro de RMN H1 para citronelato de n-octila.................................
63
Figura 26
Espectro de Infravermelho da amostra do produto de hidrolise de citronelato de n-pentila em filme..........................................................
66
Figura 27 Separação Cromatográfica dos enantiômeros do citronelato de n-octila......................................................................................................
66
Figura 28
Espectro de Infravermelho da amostra de via catalise ácida do citronelato de n-octila em filme............................................................
67
Figura 29 Gráfico com os valores de conversão e Log P dos solventes utilizados em reação para ácido citronélico..........................................
69
Figura 30 Gráfico que representa valor de conversão devido ao aumento da concentração do álcool..........................................................................
69
Figura 31 Gráfico com o valor de Rendimento versus variação da massa da enzima...................................................................................................
70
Figura 32 Influência do efeito do tamanho da cadeia carbônica do álcool na conversão dos materiais de partida aos ésteres.....................................
72
Figura 33 Espectro de Infravermelho do octanoato de citronila em filme............
73
Figura 34 Espectroscopia de massa do butirato de citroneila...............................................................................................
74
Figura 35 Rota de fragmentação do butirato de citronila associada ao espectro de massas..............................................................................................
74
Figura 36 Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) para o Octanoato de citronila em TMS como padrão interno................................................
75
Figura 37 Espectro de Infravermelho da amostra do produto de hidrolise de octanoato de n-citronila em filme.........................................................
76
Figura 38 Espectro via catálise ácida do dodecanoato de citronila.................................................................................................
78
11
Figura 39 Efeito do solvente no rendimento da reação de esterificação entre o
álcool citronelol e ácido butírico catalisada pela CAL-B a 37 ºC........ 79
Figura 40 Comportamento da variação do rendimento de éster pela variação da massa de enzima adicionada.................................................................
80
Figura 41 Efeito da razão molar do ácido/álcool na preparação do (-)-butirato de citronila............................................................................................
80
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Estruturas dos substratos utilizados nas reações de resolução do ácido
citronélico................................................................................................
50
Tabela 2 Estruturas utilizadas nas reações de resolução do álcool (±)-citronelol..................................................................................................
51
Tabela 3 Efeito de cadeia á partir do ácido citronélico com diferentes álcoois......................................................................................................
58
Tabela 4 Valores de deformações Axial e Angular das amostras de citronelatos de n-alquila..............................................................................................
61
Tabela 5
Avaliação da rotação ótica e excesso enantiomérico dos citronelatos de n- alquila................................................................................................
64
Tabela 6 Avaliação dos excessos enantioméricos das reações de hidrolise dos citronelatos de n-alquila...........................................................................
65
Tabela 7 Efeito do solvente na obtenção do (-)citronelato de n-octila catalisado pela CAL-B..............................................................................................
68
Tabela 8 Rendimento dos ésteres formados a partir do (±)-citronelol com diferentes ácidos catalisados pela CAL-B...............................................
71
Tabela 9 Valores de deformações axial e angular das amostras de alcanoatos de citronila....................................................................................................
73
Tabela 10 Avaliação da rotação ótica e excesso enantiomérico para os alcanoatos de citronila...............................................................................................
77
Tabela 11 Efeito do solvente na obtenção do (-)-butirato de citronila catalisado pela CAL-B..............................................................................................
79
Tabela 12 Avaliação da reutilização do biocatalisador na obtenção do (-)-butirato de citronila catalisado pela CAL-B recuperada.......................................
81
13
LISTA DE ABREVIAÇÕES
CG-EM - Cromatografia gasosa associada à espectrometria de massas
CDCl3 - Clorofórmio deuterado
IV - Infravermelho
m/z - Razão massa/carga
RMN 1H - Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
TMS - Tetrametilsilano
CAL-B - Lipase de Candida antarctica
PSD-Amano I - Lipase Pseudomonas cepacia
SEP - Substâncias Enantioméricamente Puras
SER-HIS-ASP - Tríade catalítica Serina, Histidina e Ácido Aspártico
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RESUMO
Neste trabalho foi utilizado a lipase de Candida antarctica (CAL-B) na resolução do (±)-
citronelol e do ácido (±)-citronélico, via esterificação enantiosseletiva. Ácidos e álcoois
terpênicos quirais são excelentes materiais de partida para a preparação de moléculas mais
complexas com possíveis atividades biológicas. O ácido (±)-citronélico tem sido utilizado
como material de partida na preparação de diferentes feromônios, que são moléculas
responsáveis pela comunicação química efetuada entre organismos da mesma espécie. O
álcool (±)-citronelol, por oxidação química é facilmente convertido ao ácido citronélico.
Foram realizadas reações de esterificação do ácido (±)-citronélico com diferentes álcoois
alifáticos (butan-1-ol, pentan-1-ol, hexan-1-ol, octan-1-ol e dodecan-1-ol), e a esterificação do
álcool (±)-citronelol com diferentes ácidos alifáticos butírico, pentanóico, hexanóico,
octanóico e dodecanóico utilizando como catalisador a lipase de Candida antarctica (CAL-
B). O acompanhamento das reações e o isolamento dos produtos foram realizados por
cromatografia em coluna utilizando como eluente hexano:acetato de etila (15:1). Os produtos
foram caracterizados por espectroscopia de infravermelho, RMN de 1H e CG-MS. Para os
citronelatos de n-alquila observou-se um aumento no rendimento de éster para álcoois
alifáticos lineares com cadeia carbônica contendo de 4 a 8 carbonos indo de 11 a 60% em 7
dias de reação. Acima de 8 carbonos na cadeia observa-se um decréscimo no rendimento da
reação. Na determinação da rotação ótica, a enzima mostrou preferência pelo isômero com
rotação ótica negativa, obtendo-se excessos enantioméricos menores de 50% (eep de 3 a 27%
e ees de 18 a 47%). Estudos de efeito de solvente, razão molar e variação da quantidade de
enzima no meio foram avaliados para a preparação do (-)-citronelato de n-octila. Solventes
com log P>3,0 como hexano e cicloexano mostraram melhores rendimentos. Um aumento na
concentração de álcool favoreceu a reação de esterificação do citronelato de n-octila com
15
rendimentos maiores que 60%. A variação da quantidade de enzima de 100 a 300 mg não
afetou o rendimento da reação permanecendo entre 60-65%.
Para os alcanoatos de citronila observou-se um aumento no rendimento com ácidos de cadeia
alifática de 4 a 12 carbonos, e as porcentagens de conversão variaram de 31 a 75%. A CAL-B
mostrou preferência pelo isômero com rotação óptica negativa, porém com valores baixos de
excessos enantioméricos (eep de 0,4 a 3% e ees de 1,3 a 26%). Estudos de efeito de solvente,
razão molar e variação da massa de enzima no meio foram avaliados para a preparação do
butirato de (-)-citronila. Na avaliação do efeito do solvente, também obteve-se resultados
relevantes com o hexano. Na avaliação da razão molar houve um aumento no rendimento com
o aumento da quantidade de ácido no meio reacional. Um aumento de 45 a 70% de
rendimento foi observado quando a massa de enzima foi aumentada de 100 a 300 mg.
Os estudos realizados mostraram que a lipase de Candida antarctica é mais seletiva
para o ácido (±)-citronélico do que para o (±)-citronelol.
PALAVRAS-CHAVE: CAL; esterificação; ácido (±)-citronélico; (±)-citronelol.
16
ABSTRACT
In this work Candida antarctica lipase (CAL-B) was used in the resolution of the (±)-
citronellol and (±)-citronellic acid, by enantioselective esterification. Chiral terpenic acids and
alcohols are excellent building blocks for the preparation of more complex molecules with
possible biological activities. The (±)-citronellic acid has been used as the base material in the
preparation of different pheromones, which are the molecules responsible for the chemical
communication made among organisms of the same species. The (±)-citronellol alcohol, by
chemical oxidation is easily converted into the citronellic acid. (±)-Citronellic acid
esterification reactions were accomplished with different aliphatic alcohols (1-butanol, 1-
pentanol, 1-hexanol, 1-octanol and 1-dodecanol), and esterification of the (±)-citronellol
alcohol with different aliphatic acids (butyric, pentanoic, hexanoic, octanoic and dodecanoic)
using as catalyst the lipase of Candida antarctica (CAL-B). The follow-up of the reactions
and the isolation of the products were done by chromatography in columns using hexane:ethyl
acetate (15:1) as an eluent. The products were characterized by infrared spectroscopic, RMN
of ¹H and GC-MS. For n-alkyl citronellates it was observed an increase in the yield of ester
using linear aliphatic alcohols from 4 to 8 carbon chains going from 11 to 60% after 7 day
reaction. Over an 8 carbon chain a decrease in the reaction yield was observed. At the
determination of the optical rotation, the enzyme showed a preference to the isomer with
negative optical rotation, obtain enantiomeric excess smaller than 50% (eep from 3.0 to 27.0%
and ees from 18.0 to 47.0%). Studies of solvent effect, molar ratio, and enzyme amount
variation in the medium were evaluated for the preparation of the n-octyl (±)-citronellate.
Solvents with log P>3.0 like hexane and cicloexane showed better yields. An increase in the
alcohol concentration favored the esterification of the n-octyl (-)-citronellate reaction with
yields higher than 60%. The variation in the amount of enzyme from 100 to 300mg did not
17
affect the yields of the reaction staying between 60-65%.
For the citronellyl alkanoates it was observed an increase in the yield with aliphatic acids
from 4 to 12 carbon chains, and the percentages of conversion varied from 31 to 75%. The
CAL-B showed preference for the isomer with negative optical rotation, however with low
values of enantiomeric excess (eep from 0.4 to 3.0% and ees from 1.3 to 26.0%). Studies of
solvent effect, molar ratio, and enzyme amount variation in the medium were evaluated for
the (-)-citronellyl butyrate preparation. In the evaluation of the effect of the solvent, relevant
results were also obtained with the hexane. In the evaluation of the molar ratio there was an
increase in the yields with the increase in the amount of acid in the medium. A yield increase
from 45 to 70% was observed when the amount of enzyme was also increased from 100 to
300mg.
The experiment showed that the lipase of Candida antarctica is more selective to the
(±)-citronellic acid than to the (±)-citronellol.
Key words: CAL, esterification; (±)-citronellic acid; (±)-citronellol.
18
1. INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO DA BIOCATÁLISE
A literatura destaca alguns pontos históricos, que marcaram o conhecimento e o
controle da atividade enzimática que hoje se emprega rotineiramente. A atividade catalítica de
enzimas tem sido utilizada pelo homem, há milhares de anos, em processos tais como
fermentação do suco de uva para a obtenção do vinho, fabricação de queijo e de pão. Isto foi
demonstrado em um papiro egípcio antigo em que mostra os métodos usados para
preservarem bebidas e alimentos (GHANEM, 2007). No entanto, estas eram apenas
aplicações práticas, uma vez que o conhecimento do modo de ação dos catalisadores
biológicos só recentemente foi elucidado, precedido por uma série de fatos que culminaram
nos conhecimentos para utilização de enzimas em diferentes ramos da atividade humana
(KIELING, 2002).
Com o desenvolvimento das ciências, estimulado pela ânsia do conhecimento, na
década de 1830, um preparado extraído através do malte de cevada, denominado diastase, foi
isolado por cientistas franceses. Este preparado, na realidade um complexo enzimático
possuía a capacidade de hidrolisar o amido, e constitui o que conhecemos como malte amilase
amplamente utilizada até hoje pela indústria do amido. Foi nesta época que um cientista
alemão descobriu e isolou do extrato de tecido estomacal, a enzima responsável pela digestão
da albumina, a qual foi denominada pepsina. Assim, tornou-se conhecido à presença de
substâncias em tecidos animais e vegetais com capacidade de digestão. Porém, a extração,
isolamento e purificação de enzimas de tecidos animais e vegetais era um processo que além
de árduo, apresentava baixo rendimento (SAID, 2004).
Todas as aplicações desde o início usavam culturas de microrganismos mistos, e
dirigidos para operações biotecnológicas em áreas da agricultura e nutrição humana. Foi L.
Pasteur em 1862, quem estabeleceu a base científica destas antigas aplicações, principalmente
a oxidação do álcool a ácido acético usando uma cultura pura de Bacterium xylinum
(CARVALHO, 2006).
Nas cinco décadas seguintes (1840-1897) com o aprimoramento do sistema de lentes
dos microscópios, a atenção foi voltada para os microrganismos, onde nasceram as hipóteses
de Louis Pasteur e do alemão Justus Von Liebig, pois o primeiro defendia a idéia de que o
19
processo fermentativo era dependente intrinsecamente da presença de microrganismos,
enquanto o segundo acreditava tratar-se de um processo estritamente químico (SAID, 2002).
Enquanto buscava-se uma explicação para fermentação, em 1876, William Kuhne
denominou as substâncias contidas nos extratos de leveduras de “enzime”, que em grego
significa dentro da levedura. Como Kuhne não demonstrou cientificamente a capacidade
catalisadora do extrato de leveduras, o termo foi amplamente aplicado, após a descoberta de
Büchner, para designar substâncias intracelulares capazes de executar a fermentação (SAID,
2004).
Por volta de 1900, avanços significativos na Enzimologia foram feitos através de
estudos bioquímicos que estabeleceram a relação enzima-substrato como um complexo
temporário do qual resultava o substrato transformado em produto e enzima livre (CHENG et
al., 2004).
Muito da história da bioquímica refere-se a pesquisa em enzimas. Em 1926, James
Sumner`s isolou e cristalizou a primeira enzima, a uréase, que catalisa a hidrólise da uréia. As
enzimas desempenham a função de catalisar as reações nos organismos. Com exceção de
alguns RNAs que são catalisadores durante seu próprio processamento, todas as enzimas são
proteínas, as quais aumentam a velocidade de uma reação por um fator de 1014 vezes mais
rápida do que uma reação não catalisada (VOET, 2000).
A evolução no estudo das enzimas (por volta de 1960), acompanhada por avanços
tecnológicos, possibilitou o isolamento e a identificação de propriedades das enzimas. Desde
então, vem sendo feito a caracterização e o estudo cinético de várias enzimas de diferentes
fontes: animais, vegetais e de microrganismos (WENDHAUSEN, 1998).
Na década de 60, indústrias européias passaram a incorporar proteases bacterianas em
sabões em pó e principalmente amilases começaram a ser empregadas na indústria de
alimentos. Foi em 1972 que imobilizou-se pela primeira vez uma enzima para fins comerciais.
A glicose isomerase de Actinoplanes missouriensis foi purificada e imobilizada em DEAE-
celulase. Atualmente estão sendo desenvolvidos muitos estudos para a obtenção de enzimas
estruturalmente delineadas, através de técnicas que envolvem a bioinformática e modelagem
molecular (GOMES, 2006).
Está presente na literatura da última década, que biocatalisadores (microrganismos e
enzimas isoladas), tiveram ampla aplicação como reagentes “seletivos” para a solução de
problemas sintéticos da química orgânica. Apesar da extraordinária especificidade da catálise
enzimática ter sido reconhecida há muito tempo, apenas recentemente tem sido aplicada na
20
transformação seletiva de substratos não naturais, principalmente na produção de compostos
quirais enantiomericamente puros (RODRIGUES, 2001).
1.2 A BIOCATÁLISE
A biocatálise está relacionada às transformações (síntese) de compostos através do
metabolismo dos seres vivos. Como os delicados materiais biológicos são extremamente
sensíveis, é necessária a intervenção de catalisadores para tornar as reações possíveis. Estes
catalisadores são as enzimas, proteínas de alto peso molecular capazes de sintetizar moléculas
extremamente exóticas e sofisticadas o que se constitui na base de modernas indústrias de
biotransformação (GOTOR, 2005).
Os termos biocatálise ou biotransformação abrangem os processos em que um
catalisador biológico é utilizado para converter um substrato em um número limitado de
etapas enzimáticas. Para estabelecer um processo de biotransformação eficaz, é necessária a
análise detalhada dos fatores que condicionam o desenvolvimento e otimização integrados de
um processo biotecnológico. A estratégia de desenvolvimento e otimização de um
Bioprocesso depende de quatro contribuições: Biocatalisador, Bioconversão, Isolamento e
Purificação do Produto (AIRES-BARROS, 2004).
O isolamento e purificação do biocatalisador (enzimas), consiste em geral numa etapa
de concentração, seguida da purificação propriamente dita, por processos cromatográficos. A
obtenção de novos biocatalisadores, baseados na Engenharia do Biocatalisador permite
modificar e melhorar as características do biocatalisador de forma a que o bioprocesso não
seja condicionado pelo biocatalisador (HUANG, 2005).
As proteínas são fundamentais para os seres vivos e podem desempenhar diversas
funções, desde a organização estrutural de uma célula até as organizações anatômicas de um
organismo vivo, além de atuarem como enzimas, que catalisam as mais diversas reações
metabólicas indispensáveis à vida (FONSECA, 2006).
Uma vez identificada a matéria prima mais adequada para substrato da bioconversão
pretendida, deve-se selecionar o biocatalisador que apresente níveis adequados de atividade
catalítica, seletividade e estabilidade para operar nas condições selecionadas de temperatura,
força iônica, pH e natureza da solução tampão, concentração de substrato e produto e ainda na
eventual presença de solventes orgânicos (AIRES-BARROS, 2004, MASON, 2000).
A habilidade de conduzir transformações químicas que são impossíveis ou
21
impraticáveis de outra forma, especialmente na área de obtenção de compostos
enantiomericamente puros; aliada a necessidade de mudar os catalisadores hoje existentes
(geralmente constituídos de metais pesados ou de transição, altamente nocivos ao ambiente)
por catálises “ambientalmente corretas”, torna o uso de biocatalisadores um dos maiores
desafios da síntese orgânica na atualidade (FABER, 1997, MONTEIRO, 2003).
Nesse contexto, o enfoque biotecnológico, vem se apresentando como uma opção
interessante para sua exploração em síntese orgânica, principalmente quando são consideradas
algumas das vantagens dessa rota, tais como: i) maior rendimento do processo; ii) obtenção de
produtos biodegradáveis; iii) menor consumo de energia; iv) redução da quantidade de
resíduos; v) introdução de rotas mais acessíveis de síntese (MOURA, 2007).
1.3 ENZIMAS COMO BIOCATALISADORES
Enzimas podem ser encontradas em células de animais ou de plantas, bem como em
microrganismos. Entretanto quando a permeabilidade da membrana celular é insuficiente para
a passagem do substrato ou quando ocorrem reações laterais indesejáveis, é necessário
conduzir a biotransformação com enzimas isoladas ou purificadas (SAID, 2004).
As enzimas são tão eficazes como catalisadores biológicos que a maioria das reações
que catalisam não ocorreria em sua ausência em um tempo razoável sem extremos de
temperatura, pressão ou pH. Reações enzimáticas, ou catalisadas por enzimas, são 1012 a 1017
vezes mais rápidas do que as reações correspondentes não catalisadas (SUAN, 2004).
Um catalisador é uma substância que acelera uma reação química, até torná-la
instantânea ou quase instantânea, ao diminuir a energia de ativação. Como catalisadores as
enzimas atuam em pequena quantidade e se recuperam indefinidamente (NASCIMENTO,
2002).
São macromoléculas, com peso molecular variando entre cerca de 5.000 a até mais de
1.000.000 Daltons. O Dalton é uma unidade de massa, equivalente a 1/12 da massa de um
átomo de carbono 12 (LIMA, 1999).
São constituídas basicamente de L-amino ácidos ligados covalentemente numa
seqüência definida, com uma estrutura denominada de sítio ativo formada de uns poucos
aminoácidos, o qual tem o papel de se ligar diretamente ao substrato (reagente) e catalisar a
reação específica de uma determinada enzima (CABRAL, 2001).
22
Quimicamente as enzimas são proteínas com uma estrutura química especial, contendo
um centro ativo, denominado apoenzima, e algumas vezes um grupo não protéico
denominado, coenzima. À molécula toda (apoenzima e coenzima) é dado o nome de
haloenzima. Dependendo do tipo de ligação, o grupo prostético pode ser separado da proteína
por métodos brandos, como por exemplo, diálise (KIELING, 2002).
Existe para cada enzima uma temperatura ótima na qual a reação é mais rápida. Acima
dessa temperatura a velocidade da reação cai de maneira aguda devido, geralmente, à
desnaturação da enzima pelo calor. O aumento na velocidade da reação com o aquecimento,
na região abaixo da temperatura ótima, resulta do aumento da energia cinética das moléculas
em reação. Todavia, se a temperatura for elevada ainda mais, a energia cinética das interações
intramoleculares ultrapassa a barreira energética para romper as ligações secundárias que
mantém no seu estado nativo cataliticamente ativo. Há conseqüentemente, uma perda das
estruturas secundária e terciária com o desaparecimento paralelo da atividade catalítica. Para a
maioria das enzimas, as temperaturas ótimas são iguais ou superiores à temperatura do
ambiente celular em que estas existem (WON et al., 2006).
Idealmente os sistemas catalisados por enzimas devem ser tratados caso a caso e as
generalizações devem ser praticadas com cautela. Portanto, a seleção das condições
adequadas na catálise enzimática em meios não convencionais ou orgânicos deve seguir uma
cuidadosa manipulação do meio-ambiente do biocatalisador, de tal forma que a produtividade
do sistema seja maximizada por meio da potencialidade total da atividade enzimática. Isto
pode ser alcançado pela utilização de solventes apropriados, controle do teor de água no meio
reacional e imobilização da enzima em suportes sólidos. A imobilização tem efeito benéfico
na estabilidade da enzima, em função das interações físicas e químicas entre o suporte e as
moléculas da enzima. A imobilização também auxilia na dispersão homogênea da enzima no
meio, o que é essencial para a condução de reações enzimáticas (GOMES, 2006).
Quando enzimas são isoladas ou purificadas possuem um número de propriedades que
tornam seu uso atrativo como catalisador em biotransformação. São extremamente ativas,
versáteis e realizam uma variedade de transformações sob condições brandas e de maneira
seletiva (WENDHAUSEN, 2005). No entanto, a aplicação de enzimas em síntese orgânica é
ainda restrita a um grupo reduzido, particularmente aos grupos que não requerem presença de
cofatores, como por exemplo as hidrolases (YU et al., 2004).
Desenvolvimentos recentes em enzimologia, principalmente engenharia de proteínas e
reações enzimáticas em meios não aquosos, aumentaram consideravelmente o potencial de
23
aplicação das enzimas como catalisador em processos industriais (FABER, 1997).
1.3.1 Classificação das Enzimas
Uma comissão de enzimologia foi nomeada pela União Internacional de Bioquímica,
em 1956, com o objetivo de sistematizar a classificação das enzimas. Para cada enzima foram
indicados: a reação catalisada; seu nome sistemático em nomenclatura normalizada e seu
número de classificação (SAID, 2002). O tipo de reação que catalisam, classifica as enzimas
em seis grupos:
a) Oxirredutases: catalisam reações de oxido-redução envolvendo oxigenação, tais como
C - H --- C - OH, e remoção ou adição de átomos de hidrogênio equivalentes, por exemplo,
CH(OH) - C = O.
b) Transferases: intermediam a transferência de vários grupos, tais como aldeídos, cetonas,
acil, fosforil, de uma molécula para outra.
c) Hidrolases: catalisam a hidrólise de ésteres, amidas, glicosídeos, etc.
d) Liases: catalisam a adição de HX (X diferente de OH) a alcenos imidas e grupos
carboxílicos.
e) Isomerases: catalisam processos de isomerização, tais como racemização e epimerização.
f) Ligases: catalisam a conexão de duas moléculas, mediando a formação de ligações como
C-O, C-N e C-C, juntamente com uma unidade de pirofosfato da molécula de adenosina
trifosfato.
Atualmente, mais de 3000 diferentes enzimas tem sido identificadas e muitas isoladas
em sua forma pura. Várias têm sido obtidas na forma cristalina e as seqüências de
aminoácidos, bem como a estrutura tridimensional determinada através de cristalografia de
raios-X e RMN-2D (Pasteur acesso em: 10/11/2006).
As enzimas hidrolíticas (proteases, celulases, amilases e lipases) são as mais
freqüentemente usadas na química orgânica. Entre as várias razões que as tornam uma opção
particularmente atrativa, pode-se citar ampla disponibilidade, baixo custo, condições suaves
de síntese, facilidade de uso por não necessitarem de cofatores e ampla especificidade para
substratos (PAQUES, 2006).
24
1.3.2 Seletividade das Enzimas
A extraordinária seletividade das enzimas passou a ser explorada de forma cada vez
mais intensa, onde as características mais importantes são:
a) Quimiosseletividade - atuam sobre um determinado grupamento químico.
b) Regiosseletividade ou Diastereosseletividade - devido a sua estrutura tridimensional
complexa, as enzimas podem distinguir entre grupos funcionais que estão situados em
diferentes regiões da mesma molécula do substrato.
c) Enantiosseletividade - as enzimas são feitas de L-aminoácidos e, portanto, são catalisadores
quirais. Como conseqüência, qualquer tipo de quiralidade presente na molécula do substrato é
reconhecida na formação do complexo enzima-substrato (CARLI, 2006).
1.3.3 Especificidade
Existe uma correlação entre a estrutura das proteínas e dos peptídeos que fazem da
molécula enzimática e suas propriedades biológicas, e esta propriedade leva a uma
especificidade extraordinariamente alta e reproduzível (KIELING, 2002).
O composto sobre o qual a enzima atua chama-se substrato. O substrato se une a uma
região concreta da enzima, chamada sítio ativo. Uma vez formados os produtos, a enzima
pode iniciar um novo ciclo de reação.
Muitos modelos foram propostos para explicar o tipo de ligação estabelecida entre
enzima e substrato. A Figura 1 mostra um esquema geral da ligação estabelecida entre enzima
e substrato em uma reação enzimática, com a liberação dos produtos formados no final da
reação.
As enzimas reagem via a formação de um complexo enzima-substrato para
posteriormente formar produtos (Equação 1).
E + S [ES] E + P (eq. 1)
k1 k2
k-1
25
Figura 1: Representação geral da ligação enzima-substrato.
Fonte: (MACHADO, 2007).
Entre as teorias e racionalizações que têm sido desenvolvidas para entender catálise
enzimática, os modelos mais ilustrativos são os mecanismos da chave e fechadura
desenvolvida por Emil Fischer em 1884 e o mecanismo do encaixe induzido de Koshland Jr.
desenvolvido no final da década de sessenta. A regra de três pontos foi outra teoria criada por
A. G. Ogston para explicar a enantiosseletividade das enzimas (JESUS, 1998).
Emil Fischer desenvolveu em 1884, a teoria na qual a especificidade enzimática é
comparada a um conjunto de chave e fechadura (KIELING, 2002) esta teoria está apresentada
através da Figura 2. A enzima é rígida na região do sítio ativo. O sítio ativo é formado por
uma região da enzima, em uma disposição própria para a fixação do substrato. Somente
moléculas de substrato cujas estruturas cabem exatamente no sítio de fixação podem se ligar à
enzima (ZANIN, 2006).
Figura 2: Mecanismo da enzima e substrato segundo a teoria de Fischer.
Fonte: http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas.htm visitado em 20/07/2007.
26
Este mecanismo não explica por que muitas enzimas atuam sobre grandes moléculas,
enquanto são inativas sobre moléculas similares menores. Da mesma forma, não explicam por
que muitas enzimas atuam sobre substratos não naturais (NASCIMENTO, 2001).
Entre 1950 e 1960 um número de observações feitas sugeriu que as enzimas
apresentavam considerável flexibilidade. Em 1958 Koshland propôs o modelo do ajuste
induzido para explicar o poder catalítico e especificidade apresentada por enzimas,
representado pela Figura 3. Segundo essa teoria, em alguns casos, sítio ativo adota a
conformação idônea só em presença do substrato e a união do substrato ao sítio ativo da
enzima, desencadeia uma troca conformacional (arranjo espacial dos grupamentos R dos
aminoácidos) que dá lugar a formação do produto (WENDHAUSEN, 1998).
Figura 3: Mecanismo da ligação entre enzima e substrato seguno a teoria de Koshland.
Fonte: www.ciagri.usp.br/~luagallo/enzimas.html, visitado em 20/07/2007.
Como toda reação catalítica, uma enzima acelera a velocidade de reação diminuindo a
barreira energética entre reagentes e produtos (Figura 4). Grande parte de seu poder catalítico
ocorre por elas aproximarem os substratos em orientações favoráveis no complexo enzima -
substrato (ES).
Figura 4 - Diagrama de energia de reação catalisada versus não catalisada enzimaticamente.
S= substrato, P = produto, E = enzima, [ES] = complexo enzima-substrato, # denota estado de transição, Ea =
energia de ativação. Fonte: (JESUS, 1998).
27
1.4 FATORES QUE INFLUENCIAM NA BIOCATÁLISE
1.4.1 Imobilização de Enzimas
Nos últimos anos, diferentes técnicas foram aperfeiçoadas ou desenvolvidas para o
estudo e otimização de biotransformações em meio orgânico, como por exemplo,
imobilização, modificação enzimática por engenharia genética ou via interação covalente
(BORA, 2003).
A imobilização é um método de fixação ou encerramento de uma enzima em suportes
sólidos, que possibilita diversas aplicações destes catalisadores, tais como, reutilização da
enzima, separação de inibidores de enzimas, facilidade de separação do produto do
catalisador, em processos analíticos e em reatores de fluxo contínuo (MARCONCINI, 2000 e
ZADA, 2006).
Estas técnicas envolvem ou ligação em suporte sólido insolúvel em água (ligação em
suporte) ou ligações cruzadas intermoleculares de enzimas por reagentes bifuncionais ou
multifuncionais. Alternativamente, o biocatalisador pode ser confinado em uma área da qual
ele não pode sair, mas onde permanece cataliticamente ativo (confinamento em matriz sólida
ou membrana de comportamento restrito). Apesar de não apresentar ligações e nem de
confinar as enzimas fisicamente, os sistemas bifásicos também são considerados métodos de
imobilização de enzimas, pois estas ficam retidas na água somente entrando em contato com o
solvente orgânico através de agitação mecânica (MOREIRA, 2003).
Para ser efetivo na imobilização o suporte deve deixar a enzima acessível ao substrato,
manter sua atividade por um longo período e permitir que o sistema (suporte/enzima) seja
regenerado ao final do processo, sem que ocorram perdas na atividade enzimática (DALLA-
VECCHIA, 2004).
A imobilização de enzimas em diferentes suportes é uma das técnicas mais
importantes que vêm sendo utilizadas na aplicação de catálise enzimática para reações
sintéticas em solventes orgânicos. Os suportes que têm sido utilizados para a aplicação de
biocatalisadores em meio orgânico são: Eupergit C, celite, quitosana, quitina, organo-gel e
cristotila entre outros (NASCIMENTO, 2002; SILVA, 2003).
Muitos estudos vêm sendo realizados em cima de vários materiais, a fim de
desenvolver novas técnicas que forneçam estabilidade para as enzimas e também facilitem a
28
sua recuperação e reutilização e, principalmente, que possam ser aplicados na indústria (QUN,
2002, MOURA, 2007).
A imobilização de enzimas em suportes pode ser sub-classificada em adsorção
física, ligação iônica e ligação covalente. A imobilização de enzimas baseada na adsorção
física de moléculas enzimáticas sobre a superfície de matrizes sólidas, é o método mais
barato, simples, eficiente e antigo de imobilização. O método preferido para propósitos
comerciais é o processo de carregamento do reator enzimático com o suporte e a enzima a ser
imobilizada (SAID, 2002). A Figura 5 representa alguns métodos de imobilização
enzimática.
Figura 5: Formas de imobilização de biocatalisadores. Fonte: Said e Pietro (2002).
Estudos da influência de determinados fatores na imobilização de enzimas são de
extrema importância de forma a se otimizar um dado protocolo. Dentre os fatores que
influenciam no processo de imobilização, ressaltam-se: pH do meio, temperatura,
concentração de enzima, presença de aditivos. O pH do meio de imobilização modifica as
interações entre grupos de carga elétrica, ou dipolo, da enzima e do suporte, o que influencia
na afinidade entre os mesmos. Sabe-se também que quanto maior a temperatura, maior a
agitação das moléculas e maior a tendência das mesmas de se desorverem. Quanto à
concentração de enzimas na solução, pequenas concentrações podem acarretar maior
intensidade das forças de interação enzima-suporte sobre as poucas moléculas de enzima e o
excesso de enzima pode acarretar em adsorção em multicamada. Finalmente, os aditivos são
substâncias utilizadas com o intuito de melhorar a eficiência da imobilização e podem atuar
IMOBILI-ZAÇÃO
LIGAÇÃO AO
SUPORTE SÓLIDO
RETICU-LAÇÃO
ADSOR-ÇÃO
LIGAÇÃO COVA-LENTE
INCLU-
SÃO
LIGAÇÃO IÔNICA
LIGAÇÃO COVA-LENTE
EM GEL EM MICRO-CÁPSU-
LAS 3
EM FIBRA
29
mudando a conformação da enzima imobilizada, reforçando a ligação utilizada na
imobilização ou mesmo protegendo o sítio catalítico desta (PINHEIRO, 2005).
Com a imobilização em resina iônica é conseguido estabilidade elevada para a enzima
e a possibilidade para reciclagem que são altamente desejáveis para as indústrias. Em
experimentos de epoxidação em tolueno a enzima CAL-B foi altamente estável, com 75% da
atividade após 15 ciclos de reação (TÖRNVALL, 2007).
1.4.2 Influência da Temperatura
A maioria das reações químicas se processa em uma velocidade maior à medida que a
temperatura aumenta. Um aumento na temperatura imprime maior energia cinética às
moléculas dos reagentes, ocasionando um maior número de colisões produtivas por unidade
de tempo. As reações catalisadas por enzimas apresentam um comportamento semelhante às
reações catalisadas quimicamente. Porém, as enzimas são moléculas protéicas complexas e
sua atividade catalítica provém da necessidade de que sua estrutura terciária seja mantida,
principalmente por um grande número de ligações não covalentes, como ligações de
hidrogênio, ligações dissulfeto e interações hidrofóbicas (YAHYA, 1998, TÖRNVALL et al.,
2007).
Em geral, os aumentos de temperatura aceleram reações químicas: a cada 10 ºC de
aumento, a velocidade de reação se duplica. As reações catalisadas por enzimas seguem esta
lei geral. Entretanto, sendo proteínas, a partir de certa temperatura, começam a desnaturar-se
pelo calor. A temperatura na qual a atividade catalítica é máxima é chamada de temperatura
ótima (KIELING, 2002).
Se a molécula absorve excesso de energia, a estrutura terciária se rompe e a enzima
ficará desnaturada, perdendo sua atividade catalítica. À medida que a temperatura se eleva o
aumento esperado na velocidade, resultante do aumento das colisões entre E + S, é
contraposto pelo aumento da velocidade de desnaturação (SAID, 2004).
TÖRNVALL et al. (2007), em seus experimentos de epoxidação de ácidos graxos
realizaram vários testes de estabilidade da enzima em diferentes temperaturas, com resultados
relevantes.
30
1.4.3 Influência do pH
Ao comprovar experimentalmente a influência do pH na velocidade das reações se
obtém curvas que indicam que as enzimas apresentam um pH ótimo de atividade. O pH pode
afetar de várias maneiras:
- O sítio ativo pode conter aminoácidos com grupos ionizados que podem
variar com o pH.
- A ionização de aminoácidos que não estão no sítio ativo pode provocar
modificações na conformação da enzima.
- O substrato pode ver-se afetado pelas variações do pH.
As enzimas possuem grupos químicos ionizáveis (carboxilas –COOH; amino –NH2;
tiol –SH; imidazol, etc) nas cadeias laterais de seus aminoácidos. Segundo o pH do meio,
estes grupos podem ter cargas elétricas positivas, negativas ou neutras. Como a conformação
das proteínas depende, em parte, de suas cargas elétricas, haverá um pH no qual a
conformação será a mais adequada para a atividade catalítica. Este é o chamado pH ótimo.
Ligeiras mudanças de pH podem provocar a desnaturação da proteína. Algumas enzimas
apresentam variações peculiares. A pepsina do estômago apresenta um ótimo de atividade em
pH=2, e a fosfatase alcalina do intestino a pH=12 (PAQUES, 2006).
1.4.4 Influência do Solvente
Segundo Dalla-Vecchia (2004), quando um biocatalisador ou uma preparação
enzimática é selecionado para determinada reação, o tipo de solvente, a quantidade de água e
a solubilidade dos substratos e produtos devem ser avaliadas e otimizadas. A simples relação
entre dois componentes pode levar a uma interpretação errônea. A água é, talvez, o
componente mais importante quando o biocatalisador é utilizado em meio orgânico. Está bem
documentado na literatura que uma quantidade mínima de água, que é dependente do tipo de
solvente e das características do suporte utilizado, é absolutamente necessária para a
solvatação da enzima ou dos substratos e produtos. Entretanto, o excesso de água pode
favorecer a reação de hidrólise e não de síntese.
As enzimas necessitam de uma pequena quantidade de água para reter a sua
conformação tridimensional ativa, mesmo quando estão ligadas covalentemente a um suporte.
A água contribui ainda para a integridade estrutural, polaridade do sítio ativo e estabilidade da
31
proteína, e pode também limitar a solubilidade de substratos hidrofóbicos em torno da enzima
(LIU, 2006).
O efeito da atividade da água, em reações biocatalisadas por lipases tem sido mostrado
em vários trabalhos (GERVAIS, 2003, MARIA, 2006).
Na literatura, não existe uma idéia clara com referência à escolha do parâmetro para
descrever quantitativamente o efeito do solvente, em reações catalisadas por enzimas. Porém,
o parâmetro mais freqüentemente utilizado é o log Poct, definido como o logaritmo do
coeficiente de partição do solvente no sistema octanol/água (LAANE, 1987).
Segundo Laane (1987), os solventes que possuem log Poct ≤ 2 são hidrofílicos e não
são adequados para a biocatálise, por que perturbam fortemente a interação água-
biocatalisador, inativando-o ou desnaturando-o. Os solventes com log Poct entre 2 e 4 são
menos hidrofílicos, perturbam fracamente a interação água-biocatalisador e afetam sua
estrutura de maneira imprevisível. Os solventes que possuem log Poct superior a 4 são
hidrofóbicos e não perturbam a camada de água, deixando o biocatalisador no seu estado
ativo. O material usado como suporte para a imobilização afeta a quantidade de água total nas
proximidades da enzima, e a participação dos reagentes e/ou produtos na mistura reacional.
Gray et al (1990), verificaram que a atividade da lipase de Candida cilindracea, ligada
ou não covalentemente em um suporte, diminuiu quando a quantidade de água era reduzida no
sistema.
Do ponto de vista físico-químico, os aspectos mais importantes são a capacidade de
extração (coeficiente de partição) e solubilização de substratos e/ou produtos pelo solvente
orgânico, e as suas propriedades que vão determinar a facilidade de separação das fases e a
transferência de massa. O solvente orgânico deve ser químico termicamente estável, não deve
formar emulsões em meio aquoso, de forma a facilitar a separação de fases, a sua viscosidade
deve ser reduzida, de forma a facilitar a transferência de massas, e não ser degradado pelo
biocatalisador (KIELING, 2002).
1.5 LIPASES
Entre os processos químicos de maior interesses industriais estão as reações
catalisadas pelas lipases, as quais representam aproximadamente 20% das biotransformações
realizadas atualmente. As lipases (triacilglicerol hidrolases EC 3.1.1.3) catalisam ambas as
32
reações de hidrólise e síntese de éster a partir de glicerol e ácidos graxos de cadeias longas,
essas reações são mostradas na Figura 6 (MOURA, 2007).
Figura 6: Reações de hidrólise e síntese de éster a partir de glicerol e ácidos graxos.
Fonte: (CROSS, 2006).
Essas reações usualmente são processadas com alta régio e/ou enantiosseletividade,
tornando as lipases um importante grupo de biocatalisadores. As razões desse enorme
potencial biotecnológico incluem a quebra das ligações de éster de triacilgliceróis na presença
de moléculas de água (hidrólise), as lipases são também capazes de catalisar a reação inversa
sob condições microaquosas, como por exemplo, a formação de ésteres a partir de álcoois e
ácidos carboxílicos. Estes processos básicos podem ser combinados numa seqüência lógica
para efetuar reações de interesterificação (acidólise, alcoólise e transesterificação), as quais
estão representadas na Figura 7 (CROSS, 2004, FUGLSETH, 2006).
As lipases são encontradas em tecidos de vários animais e vegetais, e podem ser
produzidas por fermentação usando várias espécies de microrganismos, tais como os fungos
Aspergillus mucor, Rhizopus penicillium, Geotrichum sp, por leveduras de Tulopis sp e
Candida sp e bactérias como Pseudomonas sp, Achromobacter sp e Staphylococcus sp. Do
ponto de vista econômico e industrial, os microrganismos são preferíveis do que as lipases de
fontes animais e vegetais, devido ao custo do isolamento das lipases (LUTZ, 2004).
33
Figura 7: Esquema geral de reação enzimática de Hidrólise, Esterificação, Transesterificação,
e Interesterificação. Fonte: (GHANEM, 2007).
Por terem natureza protéica, podem sofrer ao longo de uma reação um processo de
desnaturação com perda progressiva da atividade funcional. Por meio da imobilização em
suportes sólidos, pode ocorrer um aumento na estabilidade do catalisador, prolongando sua
vida útil. A imobilização facilita a recuperação da enzima do meio reacional, possibilitando
sua posterior reutilização. Há uma vasta quantidade de trabalhos na literatura que tratam das
diferentes técnicas de imobilização de lipases, caracterização dos complexos ativados e
aplicações em reações que se processam em meios aquosos e não aquosos. (ZANIN, 2004).
O uso das enzimas, especialmente hidrolases, oxidorredutases e liases, na preparação
de drogas quirais já está estabelecido na literatura (GOTOR-FERNANDEZ, 2006, LUTZ,
2004).
34
As lipases são muito utilizadas em síntese orgânica porque não requerem cofatores,
atuam em uma faixa de pH relativamente grande, são muito estáveis nesse meio, apresentam
especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e enantiosseletividade (TORRES,
2006). O deslocamento do equilíbrio na reação, no sentido direto (hidrólise) ou inverso
(síntese), é controlado pela quantidade de água presente na mistura reacional. As lipases têm
sido extensivamente investigadas com relação as suas propriedades bioquímicas e fisiológicas
e, mais recentemente, para aplicações industriais (WON, 2006, TORRES-GAVILAN, 2006).
Dentre os processos bioquímicos reportados na literatura, as lipases representam cerca
de 35% dentre as enzimas empregadas. No entanto, mesmo com uma vasta variedade de
lipases microbianas, o uso dessas enzimas em escala industrial ainda é escasso, devido aos
elevados custos de produção. Com o objetivo de intensificar a utilização de lipases em escala
piloto e industrial, estudos de fontes vegetais, como sementes, látex, folhas e caule, têm
crescido nos últimos anos. Dentre as lipases vegetais, as mais estudadas são as extraídas de
cereais e óleos de sementes, localizadas em diferentes tecidos e normalmente ativadas durante
a germinação (PAQUES, 2006).
No entanto, as enzimas disponíveis comercialmente apresentam ainda custo elevado,
uma vez que a maioria dos processos de produção é baseada em fermentação submersa, o que
muitas vezes pode tornar a sua utilização pouco atrativa economicamente. Assim, as buscas
por processos de produção de lipases que possam diminuir os custos finais da enzima são de
grande interesse, pois pode viabilizar algumas aplicações pouco exploradas, como por
exemplo, o tratamento de efluentes gordurosos (NASCIMENTO, 2004).
Segundo FURIGO 2001, na maior parte das preparações a concentração real da
enzima é desconhecida. Consequentemente, a quantidade de enzima presente só pode ser
expressa em termos de sua atividade. A determinação da atividade da enzima envolve a
medida da velocidade da reação, portanto, a Comissão de Enzima da União Internacional de
Bioquímica, recomenda a seguinte definição:
“Uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação
de 1 micromol de substrato, ou a formação de 1 micromol de produto por minuto”, nas
condições de ensaio (temperatura, pH, concentração de substrato, etc). A concentração da
enzima de uma preparação impura é expressa em termos de unidade/mL. A atividade
específica é expressa em termos de atividade por miligrama de proteína (U/mg).
A partir da estrutura protéica pode-se entender melhor as propriedades catalíticas das enzimas
(Figura 8). Há uma grande diferença de tamanho entre a enzima e seus substratos. O
35
investimento energético para a síntese de uma molécula tão grande justifica-se pela obtenção
de uma estrutura muito precisa, com reentrâncias de forma apropriada e com grupos químicos
localizados em posições exatas para servir à catálise. Para que esta seja exercida, os reagentes
(substratos) devem ligar-se à molécula da enzima em uma região específica de sua superfície,
chamada sítio ativo ou catalítico. O sítio ativo é uma cavidade com forma definida, aberta na
superfície da molécula globular da enzima, constituída por grupos R de aminoácidos que
podem estar distanciados na estrutura primária da proteína, mas que os dobramentos da
estrutura terciária trouxeram à proximidade uns dos outros. É essa forma definida do sítio
ativo que confere a especificidade à catálise enzimática. Para ser reconhecida como substrato,
uma molécula deve ter a forma adequada para acomodar-se no sítio ativo e os grupos
químicos capazes de estabelecer ligações com os grupos R ali presentes (WISEMAN, 2001).
Figura 8: Estrutura Tridimensional das Lipases.
Fonte: www.biotec.rwthaachen.de/biokat/Grafikvorlag, site visitado em 20/02/2007.
Nas lipases o sítio catalítico é formado pela tríade catalítica Ser-His-Asp/Glu (Figura
9), que se repetem em todas as estruturas e é freqüentemente protegido na molécula por uma
“tampa” hidrofóbica ou “lid” que ao interagir com a interface lipídeo/água sofre uma
mudança conformacional, expondo o sítio ativo. A presença da “tampa” na estrutura da
enzima e a propriedade de ativação interfacial passaram a ser fatores determinantes para a
caracterização de lipases. Estudos de raios-X realizados por Uppenberg e colaboradores, com
a lipase da Candida antarctica revelou a existência de uma “tampa” similar recobrindo a
36
tríade catalítica Ser-His-Asp. Mais recentemente, entretanto, observou-se que a presença da
“tampa” não esta necessariamente correlacionada com a ativação interfacial, sendo que as
lipases de Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e Candida antarctica B, que
apresentam a “tampa” em suas estruturas, não sofrem ativação interfacial. Por outro lado, as
cutinases, enzimas consideradas lipases “verdadeiras”, não apresentam a “tampa” e não
precisam da interface para exceder a atividade hidrolítica (DALLA-VECCHIA, 2004).
Figura 9: Mecanismo de reação que ocorre com as Lipases. Fonte: (SAID, 2004).
1.6 APLICAÇÃO DE LIPASES NA SÍNTESE ASSIMÉTRICA
Muitos dos estudos para a utilização de enzimas em síntese orgânica têm envolvido
conversão assimétrica. A indústria farmacêutica tem demonstrado grande interesse nesta área,
visto que a atividade biológica de muitas drogas racêmicas, às vezes, reside em um único
enantiômero. As atividades biológicas exibidas por um par de enantiômeros são
completamente diferentes, na Figura 10 tem-se a visualização do mecanismo de reação para o
Ibuprofen, fármaco de grande interesse industrial. (SUAN E SARMIDI, 2004, CEYNOWA E
RAUCHFLEISZ, 2003, GOTOR-FERNANDEZ, 2006).
37
Figura 10: Resolução enzimática para o (R,S)-Ibuprofeno. Fonte: (CARVALHO, 2006).
Normalmente, um dos isômeros (R ou S) é provido da atividade desejada e o
enantiômero oposto é menos ativo ou até mesmo tóxico. Sintetizar tais drogas em sua forma
enantiomericamente pura, está se tornando um caminho importante na química da
biotransformação. A Figura 11 mostra alguns exemplos de drogas que foram resolvidas via
catálise enzimática (TAUCHI, 2006).
OH
OH
O2N NHCOCHCl2
CH 2CONH 2
OOH
NH
Cloranfenicol (agente anti-microbial) Atenolol (tratamento da hipertensão e angina)
OOCOCH3
OHO
HOC6H6COO
H3CO
Ph NH
Ph
O
O
OH
CH3OCO
Taxol (combate ao câncer)
Figura 11 – Exemplos de fármacos resolvidas via catálise enzimática.
Fonte: (JESUS, 1998).
38
Atualmente, a importância na produção de substâncias opticamente puras é um
capítulo de destaque nos setores acadêmicos e industriais. Quando os químicos sintetizam
produtos naturais e desenham novos alvos, a pureza enantiomérica dos produtos, e sua relação
com as propriedades biológicas, é um tema de permanente discussão (NASCIMENTO, 2002).
As lipases têm sido utilizadas na preparação de álcoois quirais, ácidos carboxílicos,
ésteres, amidas e lactonas, através das reações de síntese, de hidrólise, de alcoolise, de
acidólise ou de transesterificação (TORRES-GAVILAN, 2006).
Engel (1991) tem dado ênfase à importância da esterificação enantiosseletiva,
catalisada por lipases, dos ácidos 2-metil-alcanóicos nos últimos anos, devido à sua utilidade
na síntese de compostos biologicamente ativos. Segundo Engel, a necessidade para obtenção
de ácidos 2-metil-alcanóicos com alta pureza enatiomérica é refletida pelas várias tentativas
de suas síntese assimétricas.
Chen e col., em 2005, estudaram a hidrólise enantiosseletiva do éster (R,S)-naproxen
2,2,2-trifluoretila em solvente orgânico saturado com água, pela lipase de Carica pentagona e
Carica papaya. Comparações do desempenho das lipases indicaram que ambas mostram
baixa tolerância em solvente hidrofílico e foram inibidas pelo (S)-naproxen e 2,2,2-
trifluoretanol. Como demonstra a Figura 12 a reação biocatalisada do (R,S)-naproxen, onde o
isômero S (+) mostrou ser 28 vezes mais reativo que o R (-)..
Figura 12: Resolução enzimática do Naproxen.
Fonte: (Gu, 1986).
39
A lipase de Candida rugosa é uma enzima comercial relativamente barata e foi
investigada extensivamente como um biocatalalisador em solventes orgânicos (YU, 2004).
Nguyen e col., em 1999, aplicaram a lipase de Candida rugosa na resolução
enantiosseletiva via esterificação de ácidos carboxílicos ramificados com grupo metila; entre
eles o ácido citronélico. Eles observaram que para ácido 3-metil substituído o enantiômero R
é mais reativo, enquanto que para o ácido 2-metil substituído a preferência é pelo enantiômero
S. A enantiosseletividade (E) variou de 17 a 51 (ZANIN, 2004).
Ácidos 2-metil-alcanóicos e seus derivados têm sido utilizados como intermediários
sintéticos na presença de, entre outros compostos, um grande número de feromônios
estereoquimicamente puros. A presença de uma pequena quantidade do outro enantiômero,
em alguns feromônios, pode causar um efeito inibitório pronunciado. Ácidos 2-metil-
alcanóicos de cadeia curta e seus ésteres também ocorrem naturalmente em vários alimentos
contribuindo significantemente para o seu aroma (ENGEL, 1991, PAQUES, 2006).
As enzimas tornaram-se importantes ferramentas práticas, não apenas na medicina,
mas também na indústria química, no processamento de alimentos e agricultura, e na obtenção
de compostos opticamente ativos, álcoois e ácidos têm sido muito empregados na indústria (
KISS, 2006). O atenolol, um dos cinco fármacos mais vendidos no mundo, utilizado no
tratamento de hipertensão e angina do peito também foi resolvido via catálise enzimática, e o
isômero (S) mostrou ser mais ativo que o (R) (Figura 13).
Figura 13: Resolução enzimática do (S)-Atenolol.
Fonte: (BARREIRO, 1997).
40
Huang e col. estudaram, em 2005, a preparação de ácidos (S)-mandélicos pela
degradação de racematos com a bactéria Pseudomonas putida ECU1009 isolada do solo,
obtendo ácido (S)-mandélico com rendimento de 46,5% em 48 horas de bioconversão, e
excessos enantioméricos (ee) de 99%.
É freqüentemente necessário conduzir estas reações enzimáticas em solventes
orgânicos com objetivo de melhorar a solubilidade da estrutura e de deslocar o equilíbrio
químico (CHEN, 2005, YUAN, 2006).
ZADA et al. 2006, utilizaram em seus experimentos a lipase de pâncreas do porco, na
acetilação do lavandulol (Figura 14) com acetato de vinila como o doador do grupo acil, em
meio orgânico com excessos enantioméricos na escala de 70-84%.
Figura 14: Esquema de reação para a obtenção do (S)-lavandulol via biocatálise.
Fonte: (ZADA, 2004).
Cheng e colaboradores, em 2004, aplicaram a lipase de Carica papaya em meio
orgânico, na resolução enantiosseletiva do ácido (R,S)-2-(-4–clorofenoxi) propiônico. As
análises cinéticas ocorreram entre 20 e 60 ºC, indicando que a lipase é termoestável, obtendo
valor de E de 113 a 200. Solventes hidrofóbicos mostraram favorecer a catálise enzimática.
Ghanem et al., em 2007, realizaram a resolução do 2-sililoxi-propan-1-ol com
excessos enantiomérico acima de 95% (Figura 15).
41
Figura 15: Catálise enantiosseletiva da transesterificação do 2-sililoxi-1-propanol Fonte: (GHANEM, 2007).
Uma teoria mais recente para explicar a preferência enantiosseletiva de enzimas é a
regra de Kazlauskas. Ela prevê uma diferença na estrutura do sítio ativo das lipases, que
consiste em duas cavidades de tamanhos diferentes, uma grande e uma pequena. A
enantiosseletividade para as estruturas que contêm um substituinte pequeno e grande (por
exemplo, um álcool secundário, como mostrado na Figura 16) é explicada pela forma com
que os substituintes laterais são encaixados nas cavidades. Na Figura 16a observa-se um
melhor encaixe o que resulta em uma maior enantiosseletividade do biocatalisador. Quando o
outro enantiômero que é catalisado pela lipase, entretanto, acaba forçando para acomodar seu
substituinte grande na cavidade menor (Figura 16b). Assim, as repulsões estéreas entre este
substituinte e a cavidade do sítio ativo causam uma ruptura na tríade catalítica resultando em
uma baixa seletividade na reação para este enantiômero (GHANEM, 2007).
Figura 16: Esquema do sítio ativo para as lipases segundo o Modelo de Kazlauskas. (a) o
enantiômero reage rapidamente e (b) o enantiômero reage lentamente.
Fonte: (GHANEM, 2007).
Ácidos terpênicos quirais são materiais de partida comuns para a síntese de
42
feromônios com substituintes tais como metil, isopropil e isopropenil. A Figura 17 mostra
alguns feromônios que podem ser obtidos a partir do ácido (R)-(+)-citronélico. A resolução
cinética dos ácidos racêmicos, por método de reações enantiosseletivas catalisadas por lipases,
pode ser uma alternativa útil para a sua preparação (JESUS, 1998, CHAAR, 2000).
Figura 17: Alguns feromônios sintetizados a partir do ácido (R)-(+)-citronélico. [a]
componente do feromônio de Adoxophyes sp, [b] componente do feromônio de Eldana
saccharina, [c] feromona sexual da mosca Glossina palladipes, [d] feromônio de agregação
produzido pelo besouro, Tribolium castaneum, [e] componente do feromônio de Megoura
viciae, [f] feromônio sexual da Aonidiella citrina. Fonte: (JESUS, 1998).
1.7 FEROMÔNIOS
Feromônios são substâncias químicas emitidas por organismos vivos, responsáveis
pela comunicação química efetuada entre organismos da mesma espécie. Dependendo da
ação, os feromônios podem ser classificados em feromônios sexuais, de alarme, de marcação
de trilha, de alerta, de agregação, etc. A estereoquímica está muito presente na química dos
feromônios, e a presença de um outro enantiômero pode causar um efeito inibitório
pronunciado. Isto nos leva a deduzir que o uso do enantiômero correto é muito importante
quando se trata de sistemas biológicos. Álcoois e Ácidos terpênicos quirais têm sido
utilizados como intermediários sintéticos na produção de feromônios (FERREIRA et al.,
2001). Como exemplos, podem ser citados os feromônios sexuais (provocam a atração entre
43
macho e fêmea), os feromônios de alarme (produzem estado de alerta pela aproximação de
algum predador natural) e os feromônios de trilha e oviposição (demarcam, respectivamente,
o caminho até uma fonte de alimentos e o local onde os ovos foram depositados). Já as
substâncias químicas empregadas na comunicação entre espécies diferentes (interespecíficas)
são chamadas de aleloquímicos e são divididos em alomônios (favorecem a espécie emissora),
cairomônios (favorecem a espécie receptora) e sinomônios (ambas são favorecidas). Os
alomônios geralmente são compostos utilizados para a defesa da espécie, enquanto os
cairomônios são as substâncias produzidas por uma presa e que são percebidas pelo predador.
Estas substâncias químicas utilizadas para a comunicação (feromônios, alomônios,
cairomônios, etc.) são denominadas genericamente por semioquímicos [do grego semion (=
marca ou sinal) (Figura 18).
Figura 18: Substâncias químicas emitidas por organismos vivos.
Fonte: www.tecsol.achetudoeregiao.com.br/ANIMAIS/insetosfalam.htm, visitado em 25/09/2006.
O comportamento sexual dos animais e insetos, em especial a atração exercida pelas
fêmeas sobre os machos de uma mesma espécie, sempre despertou a curiosidade de
pesquisadores das mais diversas áreas do conhecimento. O interesse científico pela
comunicação olfativa evidenciou-se na década de 50, através do isolamento e identificação
química do primeiro feromônio sexual de inseto. Em um trabalho realizado ao longo de vinte
anos e utilizando milhares de insetos para este fim, os pesquisadores extraíram cerca de 12 mg
de um feromônio da mariposa do bicho-da-seda Bombyx mori. A substância foi identificada
SEMIOQUÍMICOS
ALELOQUÍMICOS FEROMÔNIOS ALOMÔNIOS CAIRMÔNIOS SINOMÔNIOS COMPORTAMENTO: - SEXUAL - AGREGAÇÃO - DISPERSÃO - ALARME - TERRITORIALIDADE - TRILHA - OVIPOSIÇÃO - OUTROS
44
como sendo o (10E,12Z)-hexadeca-10,12-dien-1-ol (bombicol), e é produzida pela mariposa-
fêmea para atrair os machos para o acasalamento.
No final da década de 60
foram isolados e identificados os primeiros feromônios quirais, como por exemplo o
acetal cíclico exo-brevicomina, feromônio de agregação do besouro Dendroctonus
brevicomis. Desde então, centenas de feromônios têm sido isolados e caracterizados, com
estruturas que vão desde álcoois e hidrocarbonetos de estrutura simples, até compostos
polifuncionais mais complexos, como a periplanona-B, feromônio sexual da barata
Periplaneta americana (Figura 19).
Figura 19: Algumas estruturas de Feromônios.
Fonte:www.tecsol.achetudoeregiao.com.br/ANIMAIS/insetosfalam.htm, visitado em
25/09/2006.
A sensibilidade apresentada por alguns insetos frente a atividade de determinados
feromônios é algo impressionante. Quantidades ínfimas de feromônio (picogramas) são
suficientes para atrair insetos localizados a centenas de metros de distância. De modo
semelhante, uns poucos miligramas de periplanona-B podem atrair milhões de baratas. Além
de promover uma melhor compreensão dos mecanismos de comunicação entre os insetos, o
interesse crescente pelo estudo dos feromônios possibilita outras aplicações interessantes. A
classificação taxonômica de várias espécies (família, gênero, etc.) tem sido revisada,
tomando-se por base a produção de semioquímicos da espécie. Além disso, a aplicação de
feromônios na agricultura, seja como forma de monitoramento populacional ou em
armadilhas de captura de insetos é hoje uma realidade cada vez maior na busca por formas
racionais de controle de pragas.
Entretanto, a grande dificuldade no estudo de feromônios (isolamento, identificação e
aplicações específicas) reside no fato dessas substâncias naturais serem produzidas pelos
45
organismos em quantidades extremamente baixas e junto com vários outros compostos
inativos, mas quimicamente semelhantes. Além disso, na maioria dos casos os feromônios são
substâncias voláteis e/ou instáveis e de difícil manipulação. Técnicas analíticas sofisticadas
têm sido empregadas para a determinação da estrutura de vários feromônios, destacando-se a
cromatografia a gás acoplada a outros instrumentos (espectrômetro de massas, infravermelho,
ultravioleta e ressonância magnética nuclear). Em alguns casos, uma amostra de alguns
nanogramas, obtida a partir de um único inseto, pode ser suficiente para uma análise eficiente.
A síntese de feromônios em laboratório é hoje uma área em expansão na química
orgânica, permitindo não só a caracterização total dos feromônios naturais isolados (através
da comparação de propriedades físicas e químicas conhecidas), mas também fornecendo
material em quantidades suficientes para estudos na área de entomologia e na agricultura
(Tecsol, visitado em: 10/11/ 2006). Muitos feromônios são moléculas opticamente ativas. Nos
últimos anos, catalisadores quirais têm sido chaves na preparação destes compostos por
métodos sintéticos, sendo que métodos enzimáticos vêm sendo explorados em síntese
denominada quimio-enzimáticas.
46
2. JUSTIFICATIVA
Após o desastre ocorrido com o uso da talidomida racêmica, onde 12.000 crianças
nasceram deformadas (fora os natimortos) (Barreiro, 1997), a preparação de substâncias
enantiomericamente puras (SEP) transformou-se em uma necessidade industrial (Figura 20).
(S)-talidomida (R)-talidomida
teratogênico sedativo
Figura 20: Estrutura da molécula de Talidomida.
Fonte: (BARREIRO, 1997).
Porém, somente a partir dos anos 90, a Administração de Drogas e Alimentos dos
Estados Unidos (FDA) e agências de saúde começaram a exigir estudos farmacêuticos e
toxicológicos com os dois enantiômeros puros e com sua respectiva mistura, antes de liberar
um fármaco quiral para ser usado como racemato (Maier, 2001). Esta exigência causou um
grande aumento nas vendas mundiais de SEP (Stinson, 2001; Rouhi, 2003). No ano de 2000,
por exemplo, a venda de enantiômeros puros alcançou US$ 133 bilhões (Yadav E Sivakumar,
2003), já no ano de 2002, superou os US$ 159 bilhões (Rouhi, 2003), um crescimento numa
razão anual de mais de 13% e a estimativa é alcançar US$ 200 bilhões no ano de 2008 (Yadav
E Sivakumar, 2004). Mais ou menos 40% de toda droga vendida em 2000 foi de um único
enantiômero (Yadav E Sivakumar, 2003). Estes valores confirmam que a separação de
misturas racêmicas para produção de enantiômeros puros é de grande relevância comercial e
diferentes abordagens são empregadas incluindo o uso de enzimas (FURLAN, 2007).
Entre os processos químicos de maior interesses industriais estão as reações
catalisadas pelas lipases, as quais representam aproximadamente 20% das biotransformações
realizadas atualmente.
Um grande número de trabalhos nesta área pode ser encontrado na literatura
especializada, tendo em vista o interesse científico demonstrado por diversos grupos de
47
pesquisa, no sentido de elucidar as propriedades e o comportamento de enzimas em meios não
aquosos. Conseqüentemente, o número de rotas de síntese que incorporam um passo
enzimático torna-se cada vez maior.
Álcoois e ácidos carboxílicos quirais são excelentes compostos para serem utilizados
em síntese orgânica por causa de suas versatilidades químicas e facilidade de conversão para
outras classes de compostos. Além do mais, álcoois secundários quirais, ácidos carboxílicos,
ésteres e lactonas ocorrem amplamente na natureza como flavorizantes de alimentos. O ácido
citronélico e o álcool citronelol opticamente ativos são excelentes intermediários utilizados na
síntese de feromônios.
As enzimas, em especial as lipases têm sido utilizadas como catalisadores quirais na
preparação de uma série de compostos com propriedades biológicas interessantes, o potencial
destes biocatalisadores vem crescendo devido às exigências do mercado de se produzir
compostos enantiomericamente puros. A indústria química atualmente vem aplicando
enzimas para biotransformação de moléculas que exibem quiralidade como, por exemplo, a
indústria farmacêutica. Embora quimicamente idênticas, e muitas vezes difíceis de separar por
métodos químicos, as duas formas espaciais diferentes dos isômeros ópticos de uma molécula
quiral, podem ser considerados diferentes nos organismos vivos. Por isso a importância de
obtermos as formas puras dos isômeros. Outra contribuição do uso de biocatalisadores está na
demanda crescente de produtos naturais. Processos que utilizam enzimas mostram que elas
podem ser usadas com eficiência no desenvolvimento destes tipos de produtos. Portanto, fica
clara a relevante contribuição desta proposta para o desenvolvimento científico e tecnológico.
O princípio da síntese assimétrica faz uso de reagentes auxiliares enantiomericamente
puros que são utilizados como catalisadores ou às vezes em quantidades estequiométricas.
Eles são muitas vezes caros e não podem ser recuperados em muitos casos.
A produção biotecnologica de produtos químicos é geralmente um processo limpo,
sem formação de subprodutos, e com isso diminui o impacto ambiental de muitos poluentes
que podem ser gerados em processos químicos comuns.
48
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a aplicação de lipases na esterificação enantiosseletiva de álcoois e ácidos
racêmicos utilizados como precursores na preparação de moléculas mais complexas com
possíveis atividades biológicas.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Estudar a resolução do ácido racêmico (±)-citronélico via esterificação enantiosseletiva com
diferentes álcoois alifáticos catalisada pela lipase de Candida antarctica (CAL-B).
- Estudar a resolução do álcool racêmico (±)-citronelol via esterificação enantiosseletiva com
diferentes ácidos alifáticos catalisada pela lipase de Candida antarctica (CAL-B).
- Fazer estudos da razão molar, efeito do solvente e reutilização do biocatalisador nas reações
de esterificação enantiosseletivas em estudo.
- Determinar os excessos enantioméricos dos substratos oticamente ativos via polarimetria e
por cromatografia quiral.
- Avaliar a enantiosseletividade da lipase na obtenção do álcool e do ácido oticamente ativo.
49
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1. MATERIAIS E MÉTODOS
As enzimas utilizadas no desenvolvimento deste trabalho foram: lipase de Candida
antarctica (CAL-B) com atividade (10 U/mg de sólido) adquirida previamente imobilizada
de procedência Novozyme Latin América. O (±)-citronelol e o (±)-ácido citronélico foram de
procedência da Acros Organics. O ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido butanóico, ácido
hexanóico, ácido dodecanóico, pentan-1-ol, butan-1-ol, hexan-1-ol, clorofórmio, heptano,
acetonitrila, éter de petróleo, ciclohexano, hexano, éter etílico foram de procedência da Vetec
Química Fina Ltda. O acetato de etila, octan-1-ol, álcool etílico foram de procedência de
J.T.Baker Analized ACS Reagents. O dodecan-1-ol e ácido octanóico foram de procedência
da Fluka Chemie Company. A sílica gel 60 (70-230 mesh) para cromatografia em coluna foi
de procedência da Merck. Para a cromatografia em camada delgada foi utilizada sílica gel 60
G de procedência da Vetec. Para realizar as reações foi utilizada uma incubadora TE 420 com
agitação orbital da Tecnal.
4.2 CARACTERIZAÇÃO DOS COMPOSTOS
Os compostos foram caracterizados por técnicas de espectroscopia no infravermelho,
RMN de 1H e Espectrometria de Massas. Para a realização dos espectros IV utilizou-se um
espectrofotômetro Shimadzu modelo FT-IR Prestigie 21. Equipamento este do Departamento
de Química da FURB. Os espectros de RMN de 1H foram feitos em um espectrômetro Bruker
400 MHz, utilizando tetrametilsílano (TMS) como padrão interno, equipamento este da
Central de análises do Departamento de Química da UFSC.
Para realizar a espectrometria de massas utilizou-se um cromatógrafo Varian CP-3800
acoplado ao Espectrômetro de Massas Saturn 2000. Os testes foram realizados no Instituto de
Pesquisa Tecnológico de Blumenau da FURB.
As medidas de rotação óptica foram determinadas em um polarímetro modelo
Polartronic E da Schmidt e Haensch equipamento do Laboratório de Biocatálise da UFSC.
Utilizou-se também o cromatógrafo a gás modelo Shimadzu GC - 14B e Coluna capilar quiral
BETA DEX 120 da SUPELCO.
50
4.3 PREPARAÇÃO DO MEIO REACIONAL
4.3.1 Resolução do Ácido Racêmico (±)-Citronélico catalisado pela lipase de Candida
antarctica (CAL-B).
Em um erlenmeyer de 125 mL foi adicionado 0,02 mol de ácido (±)-citronélico, 0,02
mol de álcool alifático (Tabela 1), 100 mg de lipase (CAL-B) e 25 mL de hexano. O meio
reacional foi colocado em uma incubadora termostatizada TE 420 com agitação orbital 120
rpm a 37 ºC e ao final de 7 dias foi interrompida. As reações foram acompanhadas por
cromatografia em camada delgada (ccd) utilizando como eluente hexano:acetato de etila
(15:1). Os produtos foram isolados por cromatografia em coluna utilizando-se sílica gel 60
(70 a 230 mesh), e como eluente uma mistura de hexano:acetato de etila (15:1). Os produtos
foram caracterizados por técnicas espectrométricas no infravermelho, CG-Quiral, Massas, e
RMN de 1H.
Tabela 1: Estruturas dos substratos utilizados nas reações de resolução do Ácido Citronélico
Estrutura dos Substratos Nomes
COOH
Ácido (±)-Citronélico
CH2CH3 CH2 OHCH2 Butan-1-ol
CH3CH2CH2C OHH2CH2 Pentan-1-ol
CH2CH3 CH2CH2C OHH2CH2 Hexan-1-ol
CH2CH2C OHH2CH2CH3CH2CH2CH2 Octan-1-ol
CH2CH2C OHCH3CH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2H2 Dodecan-1-ol
51
4.3.2 Resolução do Álcool Racêmico (±)-Citronelol catalisado pela lipase de Candida
antarctica (CAL-B)
Em um erlenmeyer de 125 mL foi adicionado 0,02 mol de álcool (±)-citronelol, 0,02
mol de ácido alifático (Tabela 2), 100 mg de lipase (CAL-B) e 25 mL de hexano. O meio
reacional foi colocado em uma incubadora termostatizada com agitação orbital de 120 rpm a
37 ºC. As reações foram acompanhadas por cromatografia em camada delgada (ccd)
utilizando como eluente hexano:acetato de etila (15:1) durante 7 dias. Os produtos foram
isolados por cromatografia em coluna utilizando-se sílica gel 60 (70 a 230 mesh), e como
eluente uma mistura de hexano:acetato de etila (15:1). Os produtos foram caracterizados por
técnicas espectrométricas no infravermelho, CG-Quiral, Massa, e RMN de 1H.
Tabela 2: Estruturas dos substratos utilizados nas reações de resolução do (±)-Citronelol.
Estrutura dos Substratos Nomes
OH
CH3CH3
CH3
Álcool (±)-Citronelol
CH2CH2COOHCH3 Ácido Butírico
CH2CH2C OOHCH3 H2C Ácido Pentanóico
CH2CH3 CH2CH2C OOHH2C Ácido Hexanóico
CH2CH3 CH2CH2C OOHH2CH2CH2C Ácido Octanóico
CH2CH3 CH2CH2C OOHH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2C Ácido Dodecanóico
4.3.3 Estudo do efeito de solvente na resolução do Ácido (±)-Citronélico e do (±)-
Citronelol
Em um erlenmeyer de 125 mL foi adicionado 0,01 mol de ácido (±)-citronélico, 0,01
mol de álcool alifático presentes na Tabela 1, 100 mg da lipase CAL-B e 25 mL dos
diferentes solventes (hexano, heptano, ciclohexano, éter de petróleo e acetonitrila) em cada
reação. O meio reacional foi colocado em uma incubadora termostatizada a 37 ºC com
52
agitação orbital a 120 rpm. As reações foram acompanhadas por cromatografia em camada
delgada (ccd) utilizando como eluente hexano:acetato de etila (15:1) durante 7 dias. Os
produtos foram isolados por cromatografia em coluna utilizando-se sílica gel 60 (70 a 230
mesh), e como eluente foi empregada uma mistura de hexano:acetato de etila (15:1).
O procedimento para o (±)-citronelol foi o mesmo descrito para o ácido (±)-
citronélico, apenas utilizando os ácidos alifáticos descritos na Tabela 2 no lugar do álcool.
4.3.4 Estudo da Razão Molar para o Ácido (±)-Citronélico
Para este estudo foi escolhida a reação entre o ácido (±)-citronélico e o álcool octan-
1-ol, cujo éster formado forneceu o melhor rendimento. A concentração do ácido foi fixada
em 0,02 mol, e a concentração do álcool foi variada em 0,005; 0,01; 0,02 e 0,03 mol. Em um
erlenmeyer de 125 mL foi adicionado o ácido (±)-citronélico, o álcool, 100 mg de CAL-B e
25 mL de hexano, em cada reação. O meio reacional foi colocado em uma incubadora
termostatizada com agitação orbital a 120 rpm a 37 ºC. As reações foram acompanhadas por
cromatografia em camada delgada (ccd) utilizando como eluente hexano:acetato de etila
(15:1) durante 7 dias. Os produtos foram isolados por cromatografia em coluna utilizando-se
sílica gel 60 (70 a 230 mesh), e como eluente uma mistura de hexano:acetato de etila (15:1).
4.3.5 Estudo da razão molar para o (±)-citronelol
Para este estudo foi escolhida a reação entre (±)-citronelol e o ácido cujo éster
formado forneceu o melhor rendimento. A concentração do álcool foi fixada em 0,02 mol, e a
concentração do ácido foi variada em 0,005; 0,01; 0,02 e 0,03 mol. Em um erlenmeyer de 125
mL foi adicionado (±)-citronelol, o ácido, 100 mg de CAL-B e 25 mL de hexano, em cada
reação. As condições das reações foram às mesmas descritas para o estudo da razão molar do
ácido (±)-citronélico (item 4.3.4).
4.3.6 Estudo da variação da massa de enzima na esterificação do ácido (±)-citronélico
No estudo da variação da massa de enzima foi escolhida a reação do ácido (±)-
citronélico com o álcool que se obteve o melhor resultado e realizado a reação, onde a
53
concentração do ácido e do álcool foi fixada em 0,01 mol, e a quantidade da lipase CAL-B foi
variada de 100, 200 e 300 mg. As reações foram realizadas em um erlenmeyer de 125 mL
com 25 mL de hexano, em uma incubadora termostatizada com agitação orbital a 120 rpm a
37 ºC e deixou-se reagir por 7 dias. As reações foram acompanhadas por cromatografia em
camada delgada (ccd) utilizando como eluente hexano: acetato de etila (15:1). Os produtos
foram isolados por cromatografia em coluna utilizando-se sílica gel 60 (70 a 230 mesh), e
como eluente uma mistura de hexano: acetato de etila (15:1).
4.3.7 Estudo da variação da massa de enzima na esterificação do (±)-citronelol
O mesmo procedimento do item 4.3.6 foi utilizado para o estudo da variação da massa
na reação de esterificação do (±)-citronelol com o ácido alifático, que forneceu o melhor
resultado.
4.3.8 Determinação da atividade ótica dos produtos e excessos enantioméricos
Para determinar a rotação ótica dos produtos obtidos, foram preparadas soluções em
balão volumétrico de 10 mL dos respectivos ésteres utilizando clorofórmio como solvente. As
soluções foram adicionadas a uma cela de 95,05 dm e feito a leitura em um polarímetro. A
rotação ótica observada foi anotada e a rotação ótica específica calculada pela Equação 1. A
enantiosseletividade (E) foi calculada pelas Equações 2 e 3.
(eq. 1)
Onde:
[α]Dt = rotação ótica específica;
α obs = rotação ótica observada;
l = comprimento de cela polarimétrica em decímetros;
c = concentração da solução em g/mL.
(eq. 2)
E = ln [(1− c).(1− ees)] / ln [(1− c).(1+ ees)]
α D
t= α obs
l . c
54
Onde:
E = Enantiosseletividade;
c = grau de conversão da reação;
ees = excesso enantiomérico do substrato.
(eq. 3)
Onde:
c = grau de conversão da reação;
eep = excesso enantiomérico do produto;
ees = excesso enantiomérico do substrato.
4.3.9 Preparação dos Ésteres Racêmicos do Ácido (±)-Citronélico Via Catálise Ácida
Em um balão de fundo redondo de 50 mL foi adicionado 0,025 mol de ácido (±)-
citronélico e 0,025 mol dos álcool alifático presentes na Tabela 1, 0,2 mL de H2SO4 e 30 mL
de Hexano. Foi então montado um sistema de refluxo adaptado ao balão um Dean Stark e um
condensador de bolas. A mistura foi refluxada por aproximadamente 2 horas, acompanhada
pela formação de água coletada no Dean Stark. Terminada a reação, o produto bruto contido
dentro do balão foi adicionado a um funil de separação e lavado 3 a 4 vezes com solução de
NaHCO3 (saturada). Após separar as fases, foi adicionada a fase orgânica MgSO4 (anidro)
para retirar a água presente na amostra. Em seguida foi filtrada, concentrada em evaporador
rotatório e isolada por cromatografia em coluna utilizando-se sílica gel 60 (70-230 mesh), e
como eluente uma mistura de hexano: acetato de etila (15:1). Os produtos foram
caracterizados por infravermelho e utilizados como padrão de comparação na Cromatografia
Gasosa em Coluna Quiral, por que os mesmos não estão presentes na literatura.
c = ees / ees + eep
55
4.3.10 Preparação dos Ésteres Racêmicos do Álcool (±)-Citronelol Via Catalise Ácida
O mesmo procedimento do ítem 4.3.9 foi utilizado para o estudo da preparação dos
ésteres por via química a partir do (±)-citronelol com ácidos alifáticos presentes na Tabela 2.
4.3.11 Análise em Cromatografia Gasosa com coluna Quiral
Os ésteres obtidos nos experimentos foram submetidos à análise cromatográfica
utilizando coluna capilar com fase sólida quiral (30m x 0,25mm x 0,25 um), BETA DEX
120. As condições estabelecidas para a obtenção dos cromatogramas foram: Temperatura do
Injetor: 250 ºC; Temperatura do forno: 150 ºC (10 min), 2 ºC/min para 200 ºC (15 min); Gás
de arraste: N2 e pressão de 50 kPa.
4.3.12 Análise em Espectrômetro de Massas
Os ésteres obtidos nos experimentos foram submetidos à análise cromatográfica em
um Cromatógrafo Varian CP-3800 acoplado ao Espectrômetro de Massas Saturn 2000. As
condições estabelecidas para os experimentos foram: Coluna CP-SI 8CB Low Bleeh (30m x
0,25 mm; 0,25 um); Gás de arraste: He com fluxo constante 1 mL. min-1; Temperatura do
Injetor: 250 ºC; Temperatura do forno: 100 ºC (5 min) 10 ºC.min-1 até 200 ºC (15min).
4.3.13 Reações de Hidrólise dos ésteres catalisados pelas lipases
Em um balão de fundo redondo de 50 mL foi adicionado os citronelatos de n-alquila
(n-butila, n-pentila, n-hexila, n-octila, n-dodecila) e os alcanoatos (butirato, pentanoato,
hexanoato, octanoato, dodecanoato) da citronila, respectivamente. Foi adicionado também 30
mL de solução de KOH alcoólico e 2 mL de H2O. Foi então montado um sistema de refluxo
adaptado a um condensador de bolas. A mistura foi refluxada por aproximadamente 4 horas.
Após refluxo a amostra foi acidificada com HCl concentrado até pH 2. Foi então feita à
extração com éter etílico e H2O, a fase orgânica foi concentrada em evaporador rotatório e
armazenada em refrigerador, para posterior determinação da rotação óptica especifica ([α]D+).
56
4.3.14 Reutilização do Biocatalisador
Em um erlenmeyer de 125 mL foi adicionado 0,02 mol de álcool (±)-citronelol,
0,02 mol de ácido octanóico, 100 mg de lipase CAL-B e 25 mL de hexano. O meio reacional
foi colocado em uma incubadora termostatizada a 37 ºC e 120 rpm,. As reações foram
acompanhadas por cromatografia em camada delgada (ccd) utilizando como eluente
hexano:acetato de etila (15:1). Os produtos foram isolados por cromatografia em coluna
utilizando-se sílica gel 60 (70 a 230 mesh), e como eluente uma mistura de hexano:acetato de
etila (15:1). Os produtos foram caracterizados por técnicas espectroscópicas no
infravermelho.
A reação foi repetida utilizando o mesmo biocatalisador que foi lavado em hexano e
colocado novamente em uma incubadora durante 7 dias. Este procedimento foi realizado por
quatro vezes consecutivas.
57
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho consistiu na resolução do ácido (±)-citronélico e do (±)-citronelol,
via catálise enzimática. É conhecido que o ácido (±)-citronélico é utilizado na síntese de
compostos mais complexos com propriedades biológicas. Sendo que vários feromônios têm
sido sintetizados a partir deste ácido. A resolução dos dois compostos nos leva a uma
pergunta: Qual o melhor caminho na preparação do ácido citronélico oticamente ativo? Fazer
a resolução do mesmo diretamente ou fazer a resolução do álcool e depois convertê-lo por
meio químico ao ácido citronélico oticamente ativo? (Esquema I).
Esquema I
Para uma melhor compreensão os resultados foram divididos e discutidos da seguinte
forma, a saber:
- Estudo da resolução do ácido (±)-citronélico via esterificação com diferentes álcoois
alifáticos catalisada pela lipase de Candida antarctica (CAL-B).
- Estudo da resolução do (±)-citronelol via esterificação com diferentes ácidos alifáticos
catalisada pela lipase de Candida antarctica (CAL-B).
58
5.1 RESOLUÇÃO DO ÁCIDO (±)-CITRONÉLICO CATALISADO PELA LIPASE
CANDIDA ANTARCTICA (CAL-B)
Foram realizadas as reações de esterificação do ácido (±)-citronélico com os álcoois
alifáticos (butan-1-ol, pentan-1-ol, hexan-1-ol, octan-1-ol e dodecan-1-ol) catalisado pela
lipase de Candida antarctica (CAL-B). Os ésteres obtidos foram isolados por cromatografia e
os rendimentos podem ser observados na Tabela 3.
Tabela 3: Rendimento dos ésteres formados a partir do ácido (±)-citronélico com diferentes
álcoois catalisados pela CAL-B.
Álcool Éster obtido Conc. Molar dos
Álcoois (mol)
Rendimento (%) Rf.
Butan-1-ol Citronelato de n-
butila
0,01
0,02
11
14
0,55
0,73
Pentan-1-ol Citronelato de n-
pentila
0,01
0,02
16
39
0,31
0,62
Hexan-1-ol Citronelato de n-
hexila
0,01
0,02
40
43
0,51
0,60
Octan-1-ol Citronelato de n-
octila
0,01
0,02
50
60
0,49
0,50
Dodecan-1-ol Citronelato de n-
dodecila
0,01
0,02
45
40
0,58
0,54
(a) Condições da reação: tempo de 7 dias, 0,02 mol de ácido, solvente hexano, 37 °C;
Pela Tabela 3 pode-se observar que um aumento na cadeia do álcool de C4 a C12, tanto
para 0,01 mol quanto para 0,02 mol de álcool com 0,02 mol de ácido ocorreu um aumento no
rendimento da reação. Para álcool com até 8 carbonos o rendimento foi crescente, mostrando
um máximo na esterificação do ácido (±)-citronélico catalisado pela CAL-B, sendo que a
esterificação com álcoois com mais de 8 carbonos observa-se uma diminuição no rendimento
da reação. O comportamento da atividade catalítica da CAL-B na esterificação do ácido (±)-
citronélico com o aumento da cadeia do álcool, pode ser melhor observado na Figura 21.
59
4 6 8 10 12
10
20
30
40
50
60
Ren
dim
ento
%
Nº de Carbonos na Cadeia de Álcool
0,01 mol 0,02 mol
Figura 21: Influência do efeito do tamanho da cadeia carbônica do álcool na formação dos
citronelatos de n-alquila [ácido] = 0,02 mol; [álcool] = 0,01 e 0,02 mol.
Segundo Miller 1988, essa lipase tem como limitação substratos com um número
superior de 15 carbonos, sendo estabelecido como sistema reacional mais adequado o sistema
octanol e ácido heptanóico. Bruno e colaboradores em 2004, também verificaram uma
limitação na reação de síntese de ésteres catalisada pela lipase de Mucor miehei imobilizada
em matriz híbrida, constituída de polissiloxano e poli (álcool vinílico), para substratos
compostos de álcoois e ácidos carboxílicos com cadeia superior a 14 carbonos.
Considerando que primeiro é formado o complexo enzima - substrato (acil-enzima)
para depois ir a produtos, deve se levar em consideração dois aspectos na formação do
complexo, o primeiro, a orientação favorável dos orbitais para efetivar a catálise e segundo, a
janela da reação na qual o substrato alcoólico deve passar para ocorrer à formação do éster.
Pelos resultados obtidos observa-se que o álcool com oito carbonos na cadeia deve
possuir a estrutura mais adequada quanto à orientação e janela de reação. Outro fator
importante é a adequação do sítio de posicionamento na formação do complexo acil-enzima e
o quanto o substrato ajusta este sítio segundo Koshland para a melhor adaptação. Este
envolvimento é refletido no resultado obtido com os ácidos de cadeia curta como o ácido
butírico e pentanóico que apresentaram baixos rendimentos.
60
5.1.1 Caracterização dos citronelatos de n-alquila obtidos
Os citronelatos de n-alquila foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho,
RMN de 1H e massa.
A Figura 22 mostra o espectro de infravermelho do citronelato de n-octila, onde pode-
se observar a banda característica da carbonila de éster em 1735 cm-1. Na região de 2856 a
3000 cm-1 observa-se a banda de deformação axial de C-H alifático. Entre 1100 a 1300 cm-1
aparecem duas vibrações de deformação axial assimétrica acoplados, que correspondem a
C-C(=O)–C e O-C-C.
Figura 22: Espectro de Infravermelho do citronelato de n-octila em filme.
A partir da análise do citronelato de n-octila pela espectroscopia de infravermelho,
Figura 22, confirmam-se as principais freqüências de absorção dos seus grupos. Para os
demais ésteres citronelatos de n-alquila os espectros foram similares, de acordo com os
valores apresentados na Tabela 4.
61
Tabela 4: Valores de deformações axial e angular dos citronelatos de n-alquila em
Infravermelho.
Éster Def. Axial de C-H (1/cm)
Def. Axial de C=O (1/cm)
Def. Axial de C-C(=O)-C e O-C-C (1/cm)
Def. Angular C-H (1/cm)
Citronelato de n-butila
2958 1737 1153 a 1188 1456
Citronelato de n-pentila
2926 1735 1100 a 1150 1450
Citronelato de n-hexila
1926 1735 1151 a 1186 1454
Citronelato de n-octila
2856 1735 1153 a 1188 1458
Citronelato de n-dodecila
2924 1735 1150 a 1165 1460
As amostras de citronelatos de n-alquila, também foram caracterizadas por
espectroscopia de massas. A Figura 23 mostra a análise cromatográfica e o espectro de massa
para o citronelato de n-octila. O tempo de retenção para o citronelato de n-octila foi de 17min.
Figura 23: Espectroscopia de Massa para o citronelato de n-octila.(a) análise cromatográfica,
(b) espectro de massas por Impacto eletrônico EI.
(a)
(b)
62
O espectro de massa do citronelato de n-octila apresenta as fragmentações da cadeia
lateral a partir do íon molecular 283, fornecendo o íon base em 110 e os íons de maior
intensidade m/z em 152, 94, 81, 69 e 55 cuja rota de fragmentação proposta está representada
na Figura 24.
CH3
CH3CH3
O
O
CH3
CH3CH3
CH3
O+
CH3CH3
CH3
O
CH3CH3
CH3
CH
CH3CH3 CH3CH3
CH
CH
CH3CH3
m/z 283 m/z 153 m/z 152 m/z 110
m/z 95 m/z 94 m/z 69m/z 55
CH
CH3CH3
m/z 81
+.
+.+.
+.H2C
CH3CH3
.++.
.
Figura 24: Rota de fragmentação do citronelato de n-octila associada ao espectro de massas.
A Figura 25 mostra o espectro de RMN de 1H para o citronelato de n-octila, produto
de esterificação do ácido citronélico e octan-1-ol, em CDCl3. Pode-se observar na Figura 25
um singlete observado em 7,2 ppm corresponde ao solvente clorofórmio, um triplete em 4,1
ppm que corresponde aos prótons metilênicos (-COOCH2-) ligados ao oxigênio do grupo
éster, outro singleto observado em 5,1 ppm que corresponde ao próton de =CH. Os demais
prótons estão distribuídos conforme a estrutura do éster na Figura 25. A caracterização dos
demais ésteres encontra-se na seção 5.3 deste manuscrito.
63
Figura 25: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) para o citronelato de n-octila em TMS
como padrão interno.
5.1.2 Avaliação da enantiosseletividade da CAL-B para a preparação dos citronelatos de
n-alquila
Foi realizada medida de rotação óptica dos citronelatos de n-alquila obtidos e
determinados os excessos enantioméricos para os isômeros reativos e não-reativos. A lipase
CAL-B mostrou preferência pelo isômero com rotação óptica negativa (-). Para a
determinação dos excessos enantioméricos (ee) e cálculos das enantiosseletividades (E) foram
realizadas as hidrólises, via catálise básica, dos ésteres formados (Esquema II). Os resultados
obtidos podem ser observados nas Tabelas 5 e 6.
(a)
(b)
(d) (e) (f, g)
CH3CH3
CH3
O
O
(CH 2)6
CH3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)
(f)(a)
(e)
(c)
(d) (d)
(g)
64
CH3
CH3CH3
COOH
CH3
CH3CH3
COOR
+ ROH CAL-B
37 °C
+
CH3
CH3CH3
COOH
+ H2O
( )- + ( )
CH3
CH3CH3
COOH
KOH alc.
H2O
-
R = C Hn 2n 1+
onde n = 4, 5, 6, 8, 12
( )
(±)
Esquema II
Tabela 5: Avaliação da rotação ótica e excesso enantiomérico dos citronelatos de n- alquila (a).
Álcool [α] D25 Éster
(c, CHCl3) (c)
[α]D25
Ácido não reativo (c, CHCl3)
(c) ees
(b) (%)
Butan-1-ol
-1,58 (5,3) ----- ----
Pentan-1-ol -1,03 (4,1)
+3,75 (2,5) 46,9
Hexan-1-ol -0,55 (19)
+3,69 (4,5) 46,1
Octan-1-ol -0,40 (13)
+2,05 (14) 25,6
Dodecan-1-ol -1,92 (2,7)
+1,35 (11) 17,5
(a) Condições da reação: tempo de 7 dias, concentração de substratos (1:1), solvente hexano, 37 °C. (b) ees é o
excesso enantiomérico do isômero ácido não reativo. O valor de [α] D25 para o ácido citronélico é 8,0 (ACROS
2004/2005); (c) c = concentração para 100 mL de solução.
Os excessos enantioméricos determinados a partir do produto da hidrólise do éster
(ácido oticamente ativo) bem como do isômero não reativo mostram que os excessos
enantioméricos não passaram de 50%.
Nguyen e colaboradores, têm realizado a esterificação do ácido (±)-citronélico
com hexadecan-1-ol em ciclohexano catalisada pela lipase de Candida rugosa resolvendo o
ácido com baixo valor de enantiosseletividade e conversão (E=24% conv. 25%) em 6 dias de
65
reação. Obtendo R-éster com 89,6 % de excesso enantiomérico e isômero não reativo 30,0%.
Isto demonstra uma certa dificuldade em obter o ácido citronélico opticamente ativo, onde as
lipases de Candida não têm se mostrado muito enantiosseletivas. A catálise realizada pela
lipase de CAL-B no substrato ácido (±)-citronélico, pelos baixos valores de E obtidos, sugere
que esteja ocorrendo uma competição cinética, sendo que uma modificação no sítio ativo para
adequar o ácido não esteja facilitando o melhor encaixe, e conseqüentemente a
enatiosseletividade não esteja sendo favorecida, conforme a regra de Kazlauskas (GHANEM,
2007). A baixa seletividade pode ser atribuída a estrutura do ácido, sendo este ramificado,
onde as repulsões estéreas entre os substituintes e a cavidade do sítio ativo causam uma
ruptura na tríade catalítica resultando em uma baixa seletividade na reação para este
enantiômero
Tabela 6: Avaliação da rotação ótica e dos excessos enantioméricos das reações de hidrólise
dos citronelatos de n-alquila.
Éster
[α]D25
Ácido derivado da hidrólise (c,CHCl3)
eep(a)
(%)
E
Citronelato de butila -2,2 (19) 27 ----
Citronelato de n-pentila -0,73 (43) 9,1 5,10
Citronelato de n-hexila -0,21 (19) 2,6 1,41
Citronelato de n-octila -0,40 (13) 5,0 1,40
Citronelato de n-dodecila -0,71 (15) 8,9 1,38
(a) Condições da reação: tempo de 4 horas, solvente hidróxido de potássio. (a) eep é o excesso enantiomérico do
isômero ácido reativo derivado da hidrólise básica do éster. O valor de [α] D25 para o ácido citronélico 8,0 puro
(Aldrich 2005-2006).
As amostras das hidrólises foram caracterizadas por espectroscopia no infravermelho,
a Figura 26 mostra o espectro do produto de hidrolise do citronelato de n-pentila, onde se
pode observar a banda característica de OH 3000 cm-1. Na região de 1700 cm-1 observa-se a
banda de carbonila de ácido.
66
Figura 26: Espectro de Infravermelho da amostra do produto de hidrolise de citronelato de n-
pentila em filme.
A partir da análise do citronelato de n-pentila pela espectroscopia no infravermelho,
Figura 26, confirmam-se as principais freqüências de absorção dos seus grupos. Para os
demais ésteres citronelatos de n-alquila os espectros foram similares, de acordo com os
valores presentes na seção 5.3.
Por ser a técnica polarimétrica uma medida que depende da concentração da amostra,
pode esta apresentar uma margem de erro. Foi utilizada então a cromatografia gasosa em
coluna quiral para determinar o excesso enantiomérico dos citronelatos de n-alquila. A
amostra de citronelato de n-octila apresentou o cromatograma conforme (Figura 27).
Figura 27: Separação cromatográfica dos enantiômeros do citronelato de n-octila.
67
O tempo de retenção para o (-)-citronelato de n-octila foi de 40 min. A Figura 27
apresenta um tempo de retenção em 39,4 e outro em 40,38 min. indicando que pode ser a
presença do outro isômero.
Para confirmação deste resultado foram preparados os ésteres racêmicos citronelatos
de n-alquila via catálise ácida. A reação está representada no Esquema III.
COOH
CH3
CH3CH3
H2SO4 / H2O
Refluxo COOR
CH3
CH3CH3
+ H2O
(±) (±)
+ ROH
Esquema III
As amostras dos ésteres obtidos via catálise ácida foram caracterizadas por
espectroscopia no infravermelho, a Figura 28 mostra o espectro do citronelato de n-octila,
onde se pode observar a banda característica de éster em 1735 cm-1.
Figura 28: Espectro de Infravermelho do citronelato de n-octila (obtido via catálise ácida) em
filme.
68
A partir da análise do citronelato de n-octila pela espectroscopia de infravermelho,
Figura 28, confirmam-se as principais freqüências de absorção dos seus grupos. Para os
demais ésteres citronelatos de n-alquila os espectros foram similares, de acordo com os
valores presentes na seção 5.3.
Nas análises de Cromatografia o éster racêmico não abriu nas condições utilizadas, o
que implicou na não confirmação do resultado obtido pelo cromatograma da Figura 28.
5.1.3 Efeito de solvente na preparação dos citronelatos de n-alquila catalisada pela CAL-
B
O desempenho catalítico da lipase de Candida antarctica (CAL-B), foi avaliado na
esterificação do ácido (±)-citronélico com o octan-1-ol na formação do (-)-citronelato de n-
octila, e os resultados podem ser observados na Tabela 7.
Tabela 7: Efeito do solvente na obtenção do (-)citronelato de n-octila catalisado pela CAL-
B(a).
Solvente
Coeficiente de partição (log P)(b)
Rendimento (%) eep (%)
Acetonitrila - 0,33
24,1 6,25
Ciclohexano 3,2
40,0 11,6
Hexano 3,5
53,2 7,90
Heptano 4,0
30,0 8,75
Éter de Petróleo -
50,5 6,00
(a) Condições da reação: tempo de 7 dias, concentração de substratos (1:1), 37 °C; (b) valores de log de P obtidos na literatura (LAANE, 1987).
Segundo os resultados obtidos nas reações do efeito de solvente, foi observado um
aumento no rendimento de éster com a utilização de solvente apolar (log P > 3,0) (Figura 29).
Silva e colaboradores têm demonstrado que algumas lipases apresentam uma baixa
atividade enzimática em solventes hidrofílicos, com log P<2, moderados em solventes com
log P entre 2 e 4 e alto em solventes com log P>4. Este mesmo efeito também tem sido
observado por Monteiro e colaboradores (SILVA, 2003; MONTEIRO, 2003).
Os resultados obtidos confirmam que independente do substrato, as lipases catalisam
69
melhor as reações na presença de solventes hidrofóbicos.
-1 0 1 2 3 40
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Heptano
Hexano
Ciclohexano
AcetonitrilaR
endi
men
to (
%)
Log P
Figura 29: Efeito de solvente no rendimento da reação de esterificação entre o ácido citronélico e octan-1-ol catalisado pela CAL-B a 37 ºC. 5.1.4 Avaliação da razão molar na preparação do (-)-citronelato de n-octila
Nos estudos da razão molar a concentração do ácido foi fixada em 0,02 mol, e a
concentração do álcool variou em 0,005; 0,01; 0,02 e 0,03 mol (Figura 30).
0,0 0,5 1,0 1,5 2,020
30
40
50
60
70
Ren
dim
ento
(%
)
[Á lcool]/[Ácido]
Figura 30: Efeito da razão molar do álcool/ácido na preparação do (-)-citronelato de n-octila.
Observa-se na Figura 30 um aumento do rendimento da reação de esterificação com o
aumento da quantidade da razão molar, ou seja, com o aumento da concentração de álcool
adicionado ao meio. Este resultado pode ser devido à enzima formar inicialmente o complexo
acil-enzima com o ácido citronélico sendo que, aumentando a quantidade de álcool no meio
70
aumenta a probabilidade da reação de esterificação ocorrer devido ao favorecimento do
ataque nucleofílico bem como pelo fato da enzima facilitar a proximidade do álcool pela sua
linearidade na cadeia hidrocarbônica.
5.1.5 Efeito da massa da enzima CAL-B na preparação do (-)-citronelato de n-octila
A preparação do (-)-citronelato n-octila, utilizando diferentes massas de lipase CAL-B,
foi avaliada. As massas da lipase variaram de 100 a 300 mg em 25 mL de hexano. Na Figura
31 a conversão molar do octan-1-ol em éster é demonstrada em função da massa de enzima e
rendimento obtido.
Sob determinadas condições, a velocidade de transformação do substrato em produto é
proporcional à quantidade de enzima. Desvios de linearidade podem acontecer devido a:
presença de inibidores na própria solução da enzima; presença de substâncias tóxicas;
presença de um ativador que dissocia a enzima; e limitações impostas pelo método de análise.
A fim de evitar o efeito causado por esses fatores recomenda-se utilizar nos ensaios cinéticos,
sempre que possível: enzimas com alto grau de pureza; substratos puros; e método de análise
confiável (FURIGO, 2001).
100 200 3000
10
20
30
40
50
60
70
Ren
dim
ento
(%
)
M assa de Enzim a (m g)
Figura 31: Comportamento da variação do rendimento do éster pela variação da massa de
enzima adicionada (mg).
Variando-se a massa da enzima adicionada no meio reacional, não foi observada
diferenças relevantes no rendimento da reação, mostrando que para o citronelato de n-octila a
quantidade de enzima estudada não apresenta grande influência.
71
5.2 RESOLUÇÃO DO ÁLCOOL (±)-CITRONELOL CATALISADO PELA LIPASE
CANDIDA ANTARCTICA (CAL-B)
Foram realizadas as reações de esterificação do álcool (±)-citronelol com os ácidos
alifáticos (butanóico, hexanóico, octanóico e dodecanóico) utilizando a lipase Candida
antarctica (CAL-B) como catalisador. Os rendimentos dos ésteres obtidos podem ser
observados na Tabela 8.
Tabela 8: Rendimento dos ésteres formados a partir do (±)-citronelol com diferentes ácidos
catalisados pela CAL-B.(a)
Ácido Éster obtido Concentração do ácido (mol) Rendimento
(%)
Rf
Butírico Butirato de citronila 0,01
0,02
50
31
0,61
0,62
Hexanóico Hexanoato de citronila 0,01
0,02
65
35
0,60
0,50
Octanóico Octanoato de citronila 0,01
0,02
66
48
0,62
0,62
Dodecanóico Dodecanoato de citronila 0,01
0,02
71
75
0,65
0,65
(a) Condições da reação: tempo de 7 dias, 0,02 mol de álcool, solvente hexano, 37 °C;
Pela Tabela 8 pode-se observar que um aumento na cadeia do ácido de C4 a C12, tanto
na concentração de 0,01 mol quanto para 0,02 mol de ácido, ocorreu um aumento no
rendimento da reação. Os resultados da Tabela 8 podem ser melhores visualizados na Figura
32.
72
4 6 8 10 1225
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
Ren
dim
ento
(%
)
Nº de Carbonos na cadeia de Ácido
0,01 mol 0,02 mol
Figura 32: Influência do efeito do tamanho da cadeia carbônica do ácido na formação dos alcanoatos de citronila [álcool] = 0,02 mol; [ácido] = 0,01 e 0,02 mol.
Para a esterificação do citronelol, primeiro é formado o complexo acil-enzima com o
ácido alifático para depois o citronelol reagir formando os alcanoatos de citronila. Diferente
da reação com o ácido citronélico que primeiro forma o complexo acil-enzima com o ácido
citronélico para depois ir a produtos. Os alcoanoatos formam o intermediário sem a presença
de ramificações, o que deve permitir pouca mudança na conformação do sítio ativo e de
posicionamento. As lipases de modo geral têm demonstrado melhor reação com ácidos de
cadeia alifática entre 10 a 18 carbonos.
Zada e colaboradores têm realizado a esterificação do lavandulol, um importante
terpeno, que possui estrutura similar a do Citronelol e têm observado também um
favorecimento no rendimento quando a cadeia do ácido é aumentada (ZADA, 2006).
Irimescu et al., utilizaram a CAL-B na resolução cinética do 2-metoxi-2-feniletanol
utilizando os ácidos pentanóico, octanóico e decanóico, entre outros e as porcentagens de
conversão para estes ficam em torno de 30%, não demonstrando grande variação com o
aumento da cadeia do ácido (IRIMESCU, 2004)
5.2.1 Caracterização dos ésteres obtidos a partir do (±)-citronelol
Os alcanoatos de citronila foram caracterizados por espectroscopia no Infravermelho,
RMN de 1H e Massas. A Figura 33 mostra o espectro do octanoato de citronila onde se pode
73
observar a banda característica da carbonila de éster em 1735 cm-1. Na região de 2856 a 3000
cm-1 observa-se a banda de deformação axial de C-H alifático. Entre 1100 a 1300 cm-1
aparecem duas vibrações de deformação axial assimétrica acoplados, que correspondem a C-
C(=O)–C e O-C-C. Também é observada a deformação axial de =C-H em 3010 cm-1.
Figura 33: Espectro de Infravermelho do octanoato de citronila em filme.
A partir da análise do octanoato de citronila pela espectroscopia no infravermelho,
Figura 33 confirmam-se as principais freqüências de absorção dos seus grupos constituintes.
Para os demais ésteres os espectros foram similares, conforme Tabela 9.
Tabela 9: Valores de deformações axial e angular das amostras de alcanoatos de citronila.
Éster Def. Axial de C-H (1/cm)
Def. Axial de C=O (1/cm)
Def. Axial de C-C(=O)-C e O-C-C (1/cm)
Def. Angular C-H (1/cm)
Butirato de Citronila
2927 1737 1180 1458
Hexanoato de Citronila
1927 1737 1170 1454
Octanoato de Citronila
2926 1736 1215 a 1165 1456
Dodecanoato de Citronila
2924 1735 1150 a 1165 1460
74
Os alcanoatos de citronila, também foram caracterizadas por espectrometria de
massas. A Figura 34 mostra a análise cromatográfica e o espectro de massas para o butirato de
citronila. O tempo de retenção para o butirato de citronila foi de 12 minutos.
Figura 34 - Espectroscopia de massa para o butirato de citronila. (a) análise cromatográfica. (b) espectro de massa.
O espectro de massa do butirato de citronila apresenta as fragmentações da cadeia
lateral a partir do íon molecular 227, fornecendo o íon pico base em 81 e os íons de maior
intensidade em m/z 138, 123, 95, 67, 55, 41 cuja rota de fragmentação proposta está
representada na Figura 35. O .+ +. +..+ +. +. +.m/z 139 m/z 123 m/z 109
m/z 95 m/z 81 m/z 69 m/z 55m/z 226
o CH2 CH CH 2CH CH CH2 C H.+ CCHm/z 67
Figura 35: Rota de fragmentação do butirato de citronila associada ao espectro de massas.
75
A Figura 36 mostra o espectro de RMN de 1H para o octanoato de citronila, onde
observa-se um triplete em 4,1 ppm que corresponde aos prótons metilênicos (-CH2OOC)
ligados ao oxigênio do grupo éster. O singlete observado em 5,1 ppm corresponde ao próton
de =C-H, os demais prótons estão distribuídos conforme a estrutura do éster na Figura 36. O
singlete observado em 7,1 ppm corresponde ao solvente clorofórmio, TMS como padrão
interno.
Figura 36: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) para o Octanoato de citronila em
TMS como padrão interno.
5.2.2 Avaliação da enantiosseletividade da CAL-B para a preparação dos alcanoatos de
citronila
Foi realizada medida de rotação óptica dos alcanoatos de citronila obtidos e
determinados os excessos enantioméricos para os isômeros reativos e não-reativos.
A lipase CAL-B confirmou a preferência pelo isômero com rotação óptica negativa
igual para o ácido citronélico, porém com uma enantiosseletividade bem inferior aquelas
obtidas para o ácido citronélico. A reação esta representada no Esquema IV e os resultados
podem ser observados na Tabela 10.
(b) (a)
(c)
(d)
(e)
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)(f)
(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 6
C H 3
(f, g)
(g)
76
CH3
CH3CH3
OH
CH3
CH3CH3
OOCR+ RCOOH CAL-B
37 °C
+
CH3
CH3CH3
OH+ H2O
( )- + ( )
CH3
CH3CH3
OH
KOH alc.
H2O
-
R = C Hn 2n 1+
onde n = 3, 5, 7, 11
( )
(±)
Esquema IV
As amostras das hidrolises foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho,
a Figura 37 mostra o espectro do produto de hidrólise do octanoato de n-citronila, onde se
pode observar a banda característica de ácido em 3360 a 3427 cm-1. Na região de 2924 a 2900
cm-1 observa-se a banda de deformação axial de C-H alifático. A partir da análise do
octanoato de n-citronila pela espectroscopia no infravermelho, Figura 37, confirma-se as
principais freqüências de absorção dos seus grupos. Para os demais ésteres citronelatos de n-
alquila os espectros foram similares, de acordo com os valores presentes na seção 5.3.
Figura 37: Espectro de Infravermelho do produto de hidrólise do octanoato de n-citronila em
filme.
77
Tabela 10: Avaliação da rotação ótica e excesso enantiomérico para os alcanoatos de citronila.
Ácido
[α] D25 Éster
(c, CHCl3)(d)
[α]D25 Álcool não
reativo (c, CHCl3) (d)
eep (c)
ees (b)
E
Butírico -0,16 (13)
+0,07 (45) 3,0
1,3 1,08
Hexanóico -0,26 (12)
+0,97 (5,4) 6,4 19,0 1,31
Octanóico -0,04 (24)
+2,05 (14) 0,7
25,6 1,16
Dodecanóico
-0,02 (49) ----- 0,4 ----
(a) Condições da reação: tempo de 7 dias, concentração de substratos (1:1), solvente hexano, 37 °C. (b) ees é o
excesso enantiomérico do isômero ácido não reativo; (c) eep é o excesso enantiomérico do isômero ácido reativo
derivado da hidrólise básica do éster. [α]D25
para o citronelol 5,3 puro (Aldrich 2005-2006). (d) valor da
concentração da solução para 100 mL.
Os excessos enantioméricos determinados a partir do produto da hidrólise do éster
(álcool óticamente ativo) bem como do isômero não reativo não passaram de 30%. Neste caso
novamente a regra de Kazlauskas faz-se presente, sendo a seletividade observada muito baixa,
apesar da conversão para éster ser boa (31 a 75%). Sendo a assimetria apresentada no terceiro
carbono da cadeia do álcool, e não diretamente ao carbono ligado à hidroxila reativa, pode-se
admitir que a enantiosseletividade neste caso praticamente não é reconhecida, uma vez que o
complexo aci-enzima é formado primeiramente com o ácido alifático para depois ocorrer o
reconhecimento da lipase por um dos enantiômero. Novamente fica evidente que ocorre uma
competição cinética.
Para confirmação dos resultados obtidos foram preparados os alcanoatos de citronila
(butirato, hexanoato, octanoato e dodecanoato) via catalise ácida obtendo-se os ésteres
racêmicos cuja reação está apresentada no Esquema V.
CH3
CH3CH3
OH H2SO4 / H2O
Refluxo
CH3
CH3CH3
OOCR + H2O
(±)(±)
+ RCOOH
Esquema V
78
As amostras dos ésteres obtidos via química foram caracterizadas por espectroscopia
no infravermelho, a Figura 38 mostra o espectro do éster do dodecanoato de citronila, onde se
pode observar a banda característica de éster em 1735.
Figura 38: Espectro via catalise ácida do dodecanoato de citronila.
A partir da análise do dodecanoato de citronila pela espectroscopia de infravermelho,
Figura 38, confirmam-se as principais freqüências de absorção dos seus grupos. Para os
demais ésteres alquilatos de n-citronila os espectros foram similares, de acordo com os
valores presentes no item 5.3.
5.2.3 Efeito de solvente na preparação dos alcanoatos de citronila catalisada pela CAL-B
O desempenho catalítico da lipase de Candida antarctica (CAL-B) em diferentes
solventes, foi avaliado na esterificação do (±)-citronelol com o ácido butírico para a formação
do (-)-butirato de citronila, e os resultados podem ser observados na Tabela 11 e Figura 39.
79
Tabela 11: Efeito do solvente na obtenção do (-)-butirato de citronila catalisado pela CAL-
B(a).
Solvente Coeficiente de
partição (log P)(b)
Rendimento
(%)
eep
Acetonitrila -0,33 28 6,6
Ciclohexano 3,2 36 4,5
Hexano 3,5 59 12,6
Heptano 4,0 38 3,6
(a) Condições da reação: tempo de 7 dias, concentração de substratos (1:1), 37 °C.(b) valores de log P extraídos
(LAANE, 1987).
Novamente confirma-se o melhor desempenho da lipase de Candida antarctica em
solventes com log P > 3,0.
-1 0 1 2 3 40
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Heptano
Hexano
Ciclohexano
Acetonitrila
Ren
dim
ento
(%
)
Log P
Figura 39: Efeito do solvente no rendimento da reação de esterificação entre o álcool
citronelol e ácido butírico catalisada pela CAL-B a 37 ºC.
5.2.4 Efeito da massa da enzima CAL-B na preparação dos alcanoatos de n-citronila
A preparação do (-)-butirato de citronila, utilizando diferentes massas de lipase CAL-
B, foi avaliada. As massas da lipase variaram de 100 a 300 mg em 25 mL de hexano. Na
Figura 40 a conversão molar do ácido butírico com citronelol em éster é demonstrada em
função da massa de enzima e rendimento obtido.
80
50 100 150 200 250 3000
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
Ren
dim
ento
(%
)
Massa de enzima (mg)
Figura 40: Comportamento da variação do rendimento de éster pela variação da massa de enzima adicionada.
Observa-se na Figura 40 um aumento do rendimento da reação de esterificação com o
aumento da quantidade de enzima, ou seja, com o aumento da massa da enzima adicionado ao
meio. Este resultado pode ser devido à maior disponibilidade de enzima na presença de
reagentes, aumentando dessa forma a probabilidade da reação de esterificação acontecer,
resultando numa maior quantidade de produtos formados. Mostrando que para o alcanoatos de
citronila a quantidade de enzima influência tanto como a concentração dos reagentes, para a
formação dos produtos.
5.2.5 Avaliação da razão molar na preparação do (-)-butirato de citronila
Nos estudos da razão molar a concentração do álcool foi fixada em 0,02 mol, e a
concentração do ácido variou em 0,005; 0,01; 0,02 e 0,03 mol (Figura 41).
0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,500
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ren
dim
ento
(%
)
[ácido]/[álcool]
Figura 41: Efeito da razão molar do ácido/álcool na preparação do (-)-butirato de citronila.
81
A reação para a formação do éster foi limitada pela disponibilidade de álcool citronelol
no meio reacional, na menor razão molar [0,005]/[0,02] foi obtido um valor de conversão para
a formação do (-)-butirato de citronila na ordem de 60,6%. Esta conversão diminuiu com o
aumento de ácido no meio reacional. Razão molar de 0,02 e 0,03 de álcool forneceu
conversões a produtos de 30 a 38 %. Este resultado pode ser devido à enzima formar
inicialmente o complexo acil-enzima com o ácido sendo que, aumentando a quantidade de
ácido no meio diminui a concentração de álcool disponível para a reação de esterificação.
5.2.6 Avaliação da reutilização do biocatalisador
Foram realizadas quatro reações consecutivas com a mesma amostra de biocatalisador
recuperado após cada reação para observar qual seria o rendimento dos produtos nessas
reações. A Tabela 12 mostra os rendimentos das reações.
Tabela 12: Avaliação da reutilização do biocatalisador na obtenção do (-)-butirato de citronila
catalisado pela CAL-B recuperada.
Éster formado Reações
Rendimento (%)
Reação 1a 49,6 Reação 1b 48,4 Reação 1c 44,8
butirato de citronila
Reação 1d 39,7
Pode-se observar pela Tabela 12 que a enzima pode ser reutilizada em até quatro vezes
sem perda acentuada do rendimento para éster. Isso indica que o biocatalisador esta
imobilizado em um meio que permite manter sua atividade catalítica.
82
5.3 CARACTERIZAÇÃO DOS PRODUTOS
• Ácido (±)-citronelico: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 10,8 (a, s, 1H, COOH), 5,2 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 6H, CH2), 1,8-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, d, 3H,
CH3); IV (filme) 1710 cm-1 (C=O).
• (-)-citronelato de n-butila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 10H, CH2), 1,8-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, d, 3H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1737 cm-1 (C=O);
massa: íon molecular 227, fornecendo os íons
de m/z 172, 152, 110, 81.
• (-)-citronelato de n-pentila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC) 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 12H, CH2), 1,8-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, d, 6H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1735 cm-1 (C=O).
• (-)-citronelato de n-hexila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 16H, CH2), 1,7-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, d, 6H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1735 cm-1 (C=O);
(d)(d)
(b)(c)
(c) (c)
(f)
(a)(e)
C H 3CH 3
C H 3
O H
O
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 2
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)
(f)
(e)(c)
(a)
(c)
(g)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 3
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)
(g)(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 5
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)
(g)(a)
(e)
83
• (-)-citronelato de n-octila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t,
1H, CH), 2,4-1,8 (c, m, 18H, CH2), 1,7-1,5 (d, s,
6H, CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, d,
6H, CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1735 cm-1
(C=O); massa: íon molecular 282, fornecendo os
íons de m/z 172, 152, 110, 81.
• (-)-citronelato de n-dodecila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t,
1H, CH), 2,4-1,8 (c, m, 26H, CH2), 1,7-1,5 (d, s,
6H, CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, d,
6H, CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1735 cm-1
(C=O); massa: íon molecular 339, fornecendo
os íons de m/z 172, 152, 110, 94.
• (±)-citronelol: 1H RMN (δppm, CDCl3/TMS) 4,0 (a,
s, 1H, OH), 5,2 (b, t, 1H, CH), 2,4-1,8 (c, m, 6H,
CH2), 1,8-1,5 (d, s, 6H, CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H,
CH), 1,0-0,8 (f, q, 3H, CH3);
• (-)-butirato de citronila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 12H, CH2), 1,7-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, q, 3H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1737 cm-1 (C=O);
Cromat. Massa: íon molecular 228, fornecendo os
íons de m/z 151, 109, 81.
C H 3CH 3
C H 3
O H
(d)(d)
(b)(c)
(c)
(f)
(e) (c)
(a)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 6
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)
(g)(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 )10
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)
(g)(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 )2
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)
(g)(a)
(e)
84
• (-)-hexanoato de citronila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 16H, CH2), 1,7-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, q, 3H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1737 cm-1 (C=O);
Cromat. Massa: íon molecular 255, fornecendo
os íons de m/z 138, 110, 81
• (-)-octanoato de citronila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 18H, CH2), 1,7-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, q, 3H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1736 cm-1 (C=O);
• (-)-dodecanoato de citronila: 1H RMN (δppm,
CDCl3/TMS) 4,1 (a, t, 2H, CH2OOC), 5,1 (b, t, 1H,
CH), 2,4-1,8 (c, m, 26H, CH2), 1,7-1,5 (d, s, 6H,
CH3), 1,4-1,2 (e, m, 1H, CH), 1,0-0,8 (f, q, 3H,
CH3, g, t, 3H, CH3); IV (filme) 1735 cm-1 (C=O);
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)(g)
(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 5
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)(g)
(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 6
C H 3
(d)(d)
(b)(c)
(c)(c)
(c)
(f)(g)
(a)
(e)
C H 3CH 3
C H 3
O
O
(CH 2 ) 10
C H 3
85
6. CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos, pode-se então fazer algumas considerações finais a
respeito da lipase de Candida antarctica (CAL-B) e suas aplicações na resolução do ácido
(±)-citronélico e do (±)-citronelol.
• Um aumento na cadeia do álcool na formação dos citronelatos de n-alquila favoreceu
um aumento no rendimento da reação até 8 carbonos. Após isso ocorre uma
diminuição, mostrando um máximo na cadeia hidrocarbônica do álcool na
esterificação do ácido (±)-citronélico catalisado pela CAL-B. Para o Citronelol
observou-se que um aumento na cadeia do ácido de C4 a C12, tanto na concentração de
1:1 e 1:2 de álcool:ácido, ocorreu um aumento no rendimento da reação.
• A lipase CAL-B teve a preferência pelo isômero com rotação óptica negativa (-) na
formação do éster. Os excessos enantioméricos determinados a partir do produto da
hidrólise do éster (álcool opticamente ativo) bem como do isômero não reativo não
passaram de 50%. A CAL-B mostrou-se melhor enantiosseletiva para o ácido
citronélico.
• Com o aumento da massa da enzima adicionado ao meio, observou-se um aumento do
rendimento na reação de esterificação do ácido-(±) citronélico e do (±)-citronelol.
• Solventes com log P >3,0 favorecem a formação de ésteres.
• Um aumento da razão molar [álcool/ácido] para a esterificação do acido-(±)
citronélico favorece a formação de produtos. Para o (±)-citronelol um aumento na
razão molar [ácido/álcool] diminui a formação de éster.
• A lipase Candida antarctica (CAL) mostrou-se uma boa opção na esterificação do
(±)-citronelol e do ácido (±)-citronélico obtendo-se alcanoatos de citronila e
citronelatos de alquila com bons rendimentos, porém com baixa enantiosseletividade.
86
BIBLIOGRAFIA
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94
ANEXOS
95
TRABALHOS SUBMETIDOS A EVENTOS CIENTIFICOS PROVENIENTES DESSES ESTUDOS:
• MARTINI, V.Q.; MACHADO, T. M.; WISNIEWSKI Jr, A.; JESUS, P.C.; Esterificação enantiosseletiva do ácido (±)-citronélico com 1-pentanol e 1-octanol catalisado pela lipase Candida antarctica. 29º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, SP, 2006.
• MARTINI, V.Q.; BALDI, F.; JESUS, P.C.; Resolução enzimática do (±)-citronelol
via esterificação com diferentes ácidos alifáticos. 30º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, SP, 2007.
• MARTINI, V.Q.; MACHADO, T. M.; JESUS, P.C.; Otimização das condições de
esterificação do ácido (±)-citronélico com n-octanol catalisado pela lipase de Candida antarctica. 30º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, SP, 2007.
96
97
98
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
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