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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIENCIÂS BIOLÓGICAS E DA
SAÚDE CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Ariane Miranda de Freitas
Juliana Lopes Mussolini
Transtorno do Espectro Autista: estudo de uma série de casos com alterações
genéticas
São Paulo
2016
UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA
SAÚDE CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Ariane Miranda de Freitas
Juliana Lopes Mussolini
Transtorno do Espectro Autista: estudo de uma série de casos com alterações
genéticas
Monografia apresentada ao Centro de Ciências
Biológicas e da Saúde, da Universidade
Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos
exigidos para a conclusão do Curso de Bacharelado
em Ciências Biológicas.
Área: Citogenética Humana
Orientador: Prof.º Dr.º Decio Brunoni
São Paulo
2016
“ No fim do dia não sonhamos nossas vidas...nós vivemos elas! ”
Anthony Ianni
Agradecimentos
Agradecemos, primeiramente, à Universidade Presbiteriana Mackenzie por nos
proporcionar um excelente curso, com professores excepcionais e atenciosos, que nos
guiaram, inspiraram e proporcionaram uma visão mais humana e ética da Biologia.
Ao nosso orientador Prof.° Dr. Decio Brunoni, que nos orientou e ensinou tanto
nesse último ano, crucial para nossas vidas acadêmicas e profissionais.
Um agradecimento especial ao coordenador do curso, Prof.° Dr. Adriano Monteiro
de Castro, pelo apoio, carinho, atenção e conselhos quando decidimos enfrentar essa
última etapa do curso juntas.
Agradecemos imensamente aos nossos queridos pais, Andréa e Juliano, Adriana
e Paulo, por todo o carinho, suporte, paciência e, acima de tudo, amor por nós. Aos
demais familiares, um muito obrigada, por nos acompanhar por toda essa trajetória, pelos
abraços, risadas, lágrimas e, agora, estarem presentes em mais uma vitória em nossas
vidas.
Um obrigada muito especial para os nossos namorados, José Valério e Danilo,
pelo apoio, pela paciência, compreensão e estarem sempre ao nosso lado, independente
do que houver nos nossos caminhos.
Um grande agradecimento à UNIFESP e à Dra. Thais Zanolla por nos receber e
conceder conhecimentos imprescindíveis ao nosso trabalho.
À Dra. Leslie Kulikowski e toda a sua equipe por nos receber, ensinar e inspirar do
começo ao fim nessa difícil trajetória que foi esse último ano.
Resumo
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um distúrbio do neurodesenvolvimento com
acometimento na comunicação e interação social, além de comportamentos e atividades
restritos e repetitivos. Afetando cerca de 1% da população o TEA possui um quadro
clínico heterogêneo, além de diversas síndromes e psicopatias em comorbidade. Entre
os fatores causais sabe-se que as causas genéticas representam até 20% sendo que
as copy number variations (CNVs) na forma de microdeleções e microduplicações são as
principais. Estas alterações citogenômicas envolvem dezenas de genes. O objetivo do
presente trabalho é o descrever uma amostra de conveniência das alterações genéticas
encontradas em 6 pacientes com TEA. Os pacientes foram averiguados na Clínica TEA
da Universidade Presbiteriana Mackenzie e os testes genéticos foram realizados em
laboratórios comerciais. Cinco pacientes foram diagnosticados pelo array genômico e um
pelo sequenciamento do exoma. A interpretação das coordenadas genômicas foi
realizada com ferramentas de bioinformática usuais como o genome browser. As regiões
cromossômicas envolvidas foram: 3p26.3; 6q; 7q31.3; 7q36.3; 9p21.1; 17q22 e os
possíveis genes relevantes na manifestação do quadro clínico são: B4GALT1, PTPRN2,
CNTN4, CNTN6, OXTR, GRM7, SETD5, BZRAP1, SYNGAP1 e IMMP2L. Estes
resultados já foram publicados em outros pacientes com TEA. Centenas de amostras de
pacientes com TEA são relatadas na literatura internacional. Os indivíduos que
apresentam alterações genéticas similares aos dos pacientes aqui estudados tem em
comum a deficiência intelectual. Assim essa característica clinica deve ser a principal
indicação para investigar uma comorbidade de causa genética em pacientes com TEA.
Palavras-Chave: Autismo, TEA, CNVs, aCGH-Array, alterações genéticas, genes
candidatos.
Abstract
The Autism Spectrum Disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder with
communication and social interaction impairments, also repetitive and restricted
behaviors. Affecting about 1% of population, ASD has a heterogeneous clinical picture,
besides several syndromes and psychopathies in comorbidity. Between the causal
factors, it’s known that the genetic causes represent up to 20% being that the copy number
variations (CNVs) in microdeletions and microduplications forms are the principal ones.
These citogenomic alterations involve dozens of genes. The objective of this present work
is to describe a convenience sample found in 6 ASD patients. The patients were
investigated in the Clínicas TEA of Universidade Presbiteriana Mackenzie and the testes
were performed in comercial laboratories. Five patients were diagnosed by MicroArray
and one by exoma sequencing. The genomic coordinates interpretation was performed
with usual bioinformatics tools, like Genome Browser. The cromossomic regions involved
were: 3p26.3; 6q; 7q31.3; 7q36.3; 9p21.1; 17q22 and the possible relevant genes in the
manifestation of the clinical picture were: B4GALT1, PTPRN2, CNTN4, CNTN6, OXTR,
GRM7, SETD5, BZRAP1, SYNGAP1 e IMMP2L. These results were already been
published in other patients with ASD. Hundreds of ASD patients samples are mentioned
in international literature. Individuals who present genetic alterations similar to the studied
patients has in common the intelectual desability. Thus, this clinical feature should be the
main indication to investigate a genetic cause comorbidity in patients with ASD.
Key-Words: Autism, ASD, CNVs, MicroArray, genetic alterations, candidate genes.
Índice
QUADRO 1. CARACTERIZAÇÃO DO TEA SEGUNDO O DSM-V. ............................................... 10
QUADRO 2. AUTISMO SINDRÔMICO COM CNVS RECORRENTES. ............................................ 12
QUADRO 3. GENES CANDIDATOS PARA TEA. ...................................................................... 13
QUADRO 4. RESULTADOS GERAIS ...................................................................................... 18
Sumário
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 8
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................. 9
2.1. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ................................................................... 9
2.2. CAUSAS GENÉTICAS ............................................................................. 11
2.3. TESTES GENÉTICOS ............................................................................. 14
3. MÉTODO E CASUÍSTICA .............................................................................. 15
3.1. CASUÍSTICA ................................................................................................... 15
3.2. MÉTODOS ..................................................................................................... 16
4. RESULTADOS ............................................................................................... 17
5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 19
5.1. CASO 1 ...................................................................................................... 19
5.2. CASO 2 ...................................................................................................... 19
5.3. CASO 3 ...................................................................................................... 20
5.4. CASO 4 ...................................................................................................... 23
5.5. CASO 5 ...................................................................................................... 23
5.6. CASO 6 ...................................................................................................... 24
6. CONCLUSÃO ................................................................................................. 25
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 26
8
1. INTRODUÇÃO
Segundo o DSM-V, Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, o
Transtorno do Espectro Autista é um distúrbio do neurodesenvolvimento, com déficits
persistentes na comunicação e interação social e padrões restritos e repetitivos de
comportamento. Com um fenótipo muito heterogêneo, os sintomas começam a se
manifestar aos três anos, de tal maneira que já é possível o seu diagnóstico.
Intensa pesquisa interdisciplinar, principalmente a partir dos anos de 1970, estabeleceu
o TEA como um transtorno que afeta principalmente indivíduos do sexo masculino.
Possui prevalência em torno de 1% da população, sem predileção com antecedentes
étnicos e com ampla diversidade sintomatológica na área cognitivo comportamental. Os
quadros variam de muito graves, nos quais prepondera a deficiência intelectual, até os
casos clínicos cujos indivíduos têm inteligência normal e razoável capacidade adaptativa.
Têm sido estabelecidas, também, diversas comorbidades com TEA, como a epilepsia, o
Transtorno do Déficit de Atenção com Hiperatividades e diversas síndromes genéticas e
ambientais (ABRAHMS, GESCHWIND, 2010; APA, 2002; APA, 2013; CID 10, 2000;
DAGLI, MUELLER, WILLIAMS, 2015; FOMBONNE, 2009; GRABRUCKER, 2013;
JESTE, GESCHWIND, 2014).
Quanto as causas do TEA temos as conhecidas na forma de comorbidades com
síndromes genéticas e ambientais, em torno de 20%. Entre as causas genéticas há três
grupos que se destacam: mutações de gene único; copy number variation (variação no
número de cópias) e aberrações cromossômicas. A maioria responde por um mecanismo
com causa multifatorial, que pressupõe vulnerabilidade genética dada pela adição de
variantes poligênicas somada a intercorrências perinatais que atuam epigeneticamente.
(ABRAHAMS, GESCHWIND, 2010; CARTER, SCHERER, 2013; FAKHOURY et al, 2015;
PINTO et al, 2010).
Entre as comorbidades genéticas, apresentam papel central as microdeleções e
microduplicações, genericamente designadas como variação do número de cópia, ou
CNVs. Estas são definidas como número de cópias submicroscópias anormais de
segmentos de DNA do genoma humano. Podem ser herdadas ou uma mutação
esporádica, ou seja, de novo. De acordo com o seu tamanho, sua localização e os genes
9
envolvidos ela pode ser considerada patogênica, benigna ou VOUS, Variants of uncertain
clinical significance, ou seja, são variações que ainda é incerta a sua patogenicidade
(ERIKSSON et al, 2015; ZANOLLA et al, 2015).
O objetivo do presente estudo é o de descrever as características genéticas de uma série
de casos de pacientes com TEA nos quais foram detectadas alterações genéticas.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, DSM-V (APA,
2015), indivíduos com TEA tendem a ter déficits de comunicação, como respostas
inapropriadas em conversas, entendimento errôneo de interações não verbais, e
dificuldade de desenvolver amizade com pessoas da mesma idade. Somado a isso, são
dependentes de suas rotinas, muito sensíveis a mudanças do ambiente, e intensamente
focados em coisas incomuns. Os sintomas e comportamentos de pessoas com esse
transtorno pode variar sendo em determinado indivíduo mais grave, e em outro, mais
ameno. A gravidade do caso é baseada nos prejuízos na comunicação social e nos
padrões de comportamento.
No âmbito da linguagem há diversas alterações como ecolalia, inversão pronominal e
frases inapropriadas. Consequentemente, essas perturbações afetam a comunicação
não verbal resultando em comportamentos estereotipados, interesses restritos e
transtornos das capacidades sociais (VELLOSO et al, 2011).
No quadro 1 é apresentado as principais características do TEA, divididas nos dois
critérios do DSM-V (APA, 2013). No critério Comunicação e Interação Social são
descritos os transtornos referentes a essa área, como pouco contato visual, ausência de
expressão facial, déficit na interação verbal e não verbal e falta de reciprocidade
emocional. No critério Comportamentos, Interesses ou Atividades Repetitivos e Restritos
são descritos os transtornos referentes a comportamentos inadequados, movimentos
10
repetitivos e interesses restritos, como estereotipias motoras e apego excessivo a objetos
incomuns.
Quadro 1. Caracterização do TEA segundo o DSM-V.
Caracterização TEA
A) Comunicação e
Interação Social.
- Dificuldades na interação verbal e não-verbal;
- Acentuada falta de reconhecimento da existência ou
dos sentimentos dos demais;
- Pouco contato visual;
- Déficit no entendimento e uso de gestos;
- Ausência de expressão facial;
- Falta de habilidade em iniciar ou manter uma conversa;
- Dificuldade em desenvolver relações com outros da
mesma idade;
- Falta de reciprocidade emocional;
B) Comportamentos,
interesses ou
Atividades, Repetitivos
e Restritos.
- Atração por partes específicas de um objeto;
- Difícil adaptação a mudanças na rotina e rituais;
- Padrões ritualizados de comportamento;
- Estereotipias motoras;
- Ecolalia;
- Frases idiossincráticas;
- Apego excessivo com objetos incomuns;
- Interesses limitados e persistentes;
- Insensibilidade a dor;
-Brincadeiras inapropriadas com objetos e brinquedos;
11
2.2. CAUSAS GENÉTICAS
Em todos ou, pelo menos, na maioria dos indivíduos com TEA, acredita-se que causas
genéticas desempenham importante papel causal. Podem ser principais, nas quais a
alteração genética deve ser responsável inteiramente pelo quadro clinico: são as
aberrações cromossômicas, quase sempre reconhecidas clinicamente; as síndromes
monogênicas, diagnosticadas pelo quadro clínico ou através da pesquisa de mutações
específicas e as microdeleções, microduplicações e outras variações do número de
cópias, diagnosticas pelo array genômico. Em todas estas causas, em torno de 15% dos
indivíduos com TEA, o denominador comum clínico é a deficiência intelectual (DI). De
fato, a DI está tão associada com as comorbidades genéticas no TEA que está presente
em praticamente todos os indivíduos com uma alteração genética principal. No entanto,
na maioria das vezes, cerca de 80% dos casos de TEA a responsabilidade causal
repousa no modelo multifatorial com interação epistática (ZANOLLA, 2015).
Os primeiros estudos sobre a genética do autismo se basearam em síndromes como X
Frágil, Fenilcetonúria, Síndrome de Angelman. Nestas clássicas síndromes genéticas
monogênicas, os pacientes apresentam comorbidade com TEA em proporção maior do
que o esperado pelo acaso. Dezenas de estudos focaram nesta comorbidade, nos
últimos anos, indicando genes candidatos em diversos cromossomos e dezenas de loci.
Atualmente cerca de uma centena de loci são apontados como envolvidos. Existem
dezenas de artigos sobre estas síndromes em comorbidade com o TEA, fugindo do
objetivo desta revisão a descrição destes quadros. Um artigo que faz uma revisão com
boa relação entre a alteração genética e o fenótipo é o de Geste e Geschwind, 2014.
No TEA, a variação do número de cópias (CNVs) representa a causa genética mais
frequente. Além deste, outras psicopatias também estão relacionadas às essas CNVs,
como, por exemplo, epilepsia, déficit de atenção, deficiência intelectual e esquizofrenia
(Quadro 2). As principais regiões cromossômicas afetadas pelas CNVs e que causam
autismo são 1q21, 2p15-2p16.1, 15q13, 16p11.2. Tanto deleções quanto duplicações
causam diferentes consequências orgânicas para o indivíduo, majoritariamente afetando,
também, o intelecto (ZANOLLA, 2015).
12
Quadro 2. Autismo sindrômico com CNVs recorrentes.
Região
Cromossômica Del/Dup Sinais e Sintomas
1q21 Del
Autismo, déficit de atenção, hiperatividade,
comportamento anti-social.
Dup Autismo, déficit de atenção, hiperatividade, epilepsia, DI.
2p15-2p16.1 Del Autismo, atraso no desenvolvimento, microssomia,
microcefalia.
15q13
Del Autismo, déficit de atenção, hiperatividade, agressão,
ansiedade.
Dup Autismo, ansiedade, transtorno bipolar, DI, atraso no
desenvolvimento.
16p11.2
Del Autismo, Síndrome de Asperger, déficit de atenção,
hiperatividade.
Dup Autismo, déficit de atenção, hiperatividade, ansiedade,
epilepsia.
Fonte: ZANOLLA et al (2015, p. 33).
Diversas pesquisas apontam genes candidatos para o TEA, porém é difícil afirmar se são
inteiramente responsáveis pela doença. Há muitos fatores envolvidos no
desenvolvimento do TEA, além de um espectro muito amplo de fenótipos. Assim,
relacionar esses genes com os fenótipos é trabalhoso. Foram relatados na literatura
genes associados ao TEA (quadro 3), como por exemplo: SHANK3, CNTN4, CNTN6,
RELN, OXTR, SYNGAP1, ADNP; CNTNAP2, entre outros (RIBEIRO et al, 2013;
GRISWOLD, et al, 2012; ALVAREZ-MORA, et al, 2016; PINTO et al, 2010)
13
Quadro 3. Genes Candidatos para TEA.
GENE Região
Cromossômica Comorbidades Referência
SHANK3 22q13.33
Síndrome de Phelan-McDermid
Transtorno Bipolar Epilepsia
ZANOLLA, 2015; ERIKSSON, 2015; FREITAG; 2010;
PINTO, 2014;
RELN 7q22.1 Epilepsia LIU, TAKUMI, 2014;
FREITAG, 2010;
ADNP 20q13.13 Epilepsia RUBEIS, 2015;
IOSSIFOV, 2015;
CHD2 20q13.12 TDAH RUBEIS, 2015; PINTO, 2014;
OXTR 3p25.3 DI LIU, TAKUMI, 2014;
FREITAG, 2010;
CNTN4 3p26.3-p26.2 DI LIU, TAKUMI, 2014;
FREITAG, 2010; HU, 2015;
CNTN6 3p26.3 TDAH MERCATI, 2016;
HU, 2015
NRXN1 2p16.3
TDAH Esquizofrenia
Transtorno Bipolar Epilepsia
ERIKSSON, 2015; PINTO, 2014;
SYNGAP1 6p21.32 Epilepsia LIU, TAKUMI, 2014; ERIKSSON, 2015;
PINTO, 2014;
CNTNAP2 7q35-q36.1
TDAH Esquizofrenia
Transtorno Obsessivo
Compulsivo
LIU, TAKUMI, 2014; ERIKSSON, 2015;
FREITAG, 2010
TSC1/TSC2 9q34.13/16p13.3 Esclerose tuberosa ZANOLLA, 2015; FREITAG, 2010;
LIU, TAKUMI, 2014
FMR1 Xq27.3 X-Frágil
Epilepsia TDAH
ZANOLLA, 2015; LIU, TAKUMI, 2014;
SETD5 3p25.3 Transtorno Obsessivo
Compulsivo
PINTO, 2014; GROZEVA, 2014
GRM7 3p26.1 Esquizofrenia
Transtorno Bipolar MAKOFF, 1996;
YANG, PAN, 2013;
BZRAP1 17q22 DI BUCAN, 2009;
14
2.3. TESTES GENÉTICOS
O MicroArray é uma técnica laboratorial que detecta perdas e ganhos cromossomais ao
nível de kilobases e é feita a partir da comparação da intensidade de hibridação das
amostras teste e controle. Com esse método foi possível detectar microdeleções e
microduplicações, como CNVs e SNPs (single necleotide polimorfism), dissomia
uniparental e perda de heterozigodade. A técnica revolucionou a citogenética com sua
alta resolução, que levou a um aumento de diagnósticos de indivíduos com defeitos
congênitos, autismo e deficiência intelectual não detectados pelos métodos
convencionais de citogenética, como a banda G. Além disso o Array-CGH analisa DNA
extraído de diversos tipos de células não cultivadas, reduzindo os requisitos de qualidade
da amostra. Porém, alguns métodos citogenéticos, como o FISH são necessários depois
de realizado o Array-CGH para confirmar os resultados e identificar translocações ou
inserções, visto que o Array-CGH não detecta arranjos balanceados como translocações
equilibradas, inversões e inserções balanceadas, mutações de ponto e baixo nível de
mosaicismo (>30%) (BI et al, 2012; KULIKOWSKI, 2013; FAN et al, 2013).
Assim como o MicroArray, o sequenciamento do exoma é um método utilizado para
identificar perdas e ganhos genômicos, ou seja, alterações microscópicas ao nível de um
par de bases em alta resolução, apenas nas porções codificantes do DNA, o Exoma. O
material genético é corrido por uma máquina específica, onde passa por um polímero
especial, no qual é realizada a sua leitura. A máquina separa a amostra por tamanho e é
analisada a sua fluorescência. O resultado é obtido na forma de gráfico ou
cromatogramas. Esses dados, então, passam por uma análise pelo software, que vai
comparar as informações obtidas com uma amostra controle. É possível observar, assim,
picos, mostrando as bases alteradas (KULIKOWSKI, 2013; BUXBAUM et al., 2012).
Na internet há diversos bancos de dados e ferramentas específicas para auxiliar a
interpretação das variantes genômicas encontradas em testes citogenômicos, como o
MicroArray. Entre eles, os principais são: Database of Chromosomal Imbalance and
Phenotype in Humans Using Ensembl Resources (DICIPHER, 2009), Genome Browser
15
(UCSC GENOME BROWSER, 2002), Database of Genomic Variants (MACDONALD,
2013) e o Nacional Center for Biotetechnology Information (NCBI) (GEER, 2010).
O SFARI, Simon Foundation Autism Research Initiative, é um site voltado para o suporte
de projetos científicos inovadores para doenças do desenvolvimento, em especial o TEA.
Disponibiliza gratuitamente trabalhos científicos voltados para essa área e recruta
indivíduos com TEA e suas respectivas famílias para participarem de estudos como
sujeitos de pesquisa. Além de outros recursos, o SFARI Gene disponibiliza um banco de
dados online em evolução que auxilia cientistas a acompanharem e utilizarem como
referência em suas pesquisas os avanços da genética do TEA e fatores de risco
(ABRAHAMS, 2013).
O Genome Browser é imprescindível para análises do genoma humano. Possui acesso
fácil e rápido a pesquisas relacionadas a qualquer região de interesse do genoma. Há
diversas ferramentas, cada qual com sua especificidade e base de dados de acordo com
o que é pedido. Além disso, o site oferece um mapa completo do genoma humano, com
genes, doenças relacionadas, possíveis causas e relatos de pesquisas anteriores
referentes à aquela região para servir como referência para trabalhos futuros (UCSC
GENOME BROWSER, 2002).
O OMIM, do inglês Online Mendelian Inheritance in Man, é outra base de dados online,
que compila diversos dados sobre genes, suas respectivas doenças e outras informações
(OMIM, 2016).
O GeneCard também compila informações sobre genes, suas doenças, mapeamento
cromossômico, entre diversos outros aspectos (GENECARD, 2016).
3. MÉTODO e CASUÍSTICA
3.1. Casuística
A casuística compreendeu seis pacientes com o diagnóstico de TEA, de ambos os sexos,
averiguados na Clínica de Transtornos do Espectro do Autismo da Universidade
16
Presbiteriana Mackenzie. Os sujeitos são agendados na clínica e estudados de acordo
com o protocolo de Velloso e cols (2011). Os testes genéticos necessários são solicitados
e as famílias que dispõem de Planos de Saúde utilizam Laboratórios Comerciais. Em
todas as crianças o quadro clínico de TEA foi considerado grave.
É importante salientar, que trata se uma amostra de conveniência, ou seja, uma técnica
que seleciona uma amostra da população que seja de fácil acesso para determinada
pesquisa que está em andamento. Geralmente essa conveniência representa uma maior
facilidade operacional e baixo custo de amostragem, mas tem como consequência a
incapacidade de fazer afirmações gerais com rigor estatístico sobre a população. Em
nosso trabalho, é possível observar essa dificuldade de dados estatísticos justamente
pelo número pequeno de amostras selecionadas para o estudo.
3.2. Métodos
Todos os pacientes foram avaliados da Clínica TEA-MACK ou do Centro de Genética
Médica da UNIFESP e seus representantes legais deram o consentimento informado
segundo o protocolo aprovado (CEP-UPM:910/03/06).
Após a avaliação realizada pelas clínicas citadas, foram pedidos testes genéticos
realizados por laboratórios comerciais como o MicroArray, no qual foi possível detectar
erros em cinco, dos seis casos e o Sequenciamento do Exoma que foi utilizado em
apenas um dos casos, o seis. A partir, então, da análise desses testes genéticos,
conseguimos identificar um ou mais genes descritos em cada caso. E o entendimento de
cada gene, sua função, onde ele atua e quais comormidades são associadas a ele, se
deu mediante às ferramentas informatizadas: o Genome Browser, OMIM, SFARI e o
GeneCard, que possuem uma biblioteca online de genomas e/ou genes para consulta
acadêmica, compartilhando resultados de pesquisas genéticas, citogenéticas e
citogenômicas que contribuem para um melhor conhecimento de doenças envolvendo o
genoma humano.
17
4. Resultados
No quadro 4 estão descritos os casos da casuística, sendo descritos os endereços
genômicos, os genes candidatos encontrados e suas respectivas funções. Foi um caso
do sexo feminino e 5 do sexo masculino, com idades entre 4 e 16 anos e com os seguintes
cromossomos afetados: 3, 6, 7, 9 e 17.
As regiões cromossômicas foram analisadas segundo diversos bancos de dados online,
como o GENOME BROWSER (UCSC GENOME BROWSER, 2002), SFARI
(ABRAHAMS, 2013), OMIM (2016) e GeneCards (GENECARDS, 2016).
Ainda no quadro 4 é possível visualizar os genes: B4GALT1, PTRN2, CNTN4, CNTN6,
OXTR, GRM7, SETD5, BZRAP1, SYNGAP1 e o IMMP2L.
Todos os indivíduos possuem o exame de MicroArray realizado por laboratórios
comerciais com selo de qualidade. O caso 5, porém, se trata de um sequenciamento do
Exoma.
18
Quadro 4. Resultados Gerais
Caso Sexo Idade Endereço Genômico Genes
Candidatos Função do
Gene
1 Masculino 4 anos arr[GRCh37] 9p21.1p13.3
(33,141,051-33,250,767)x3 B4GALT1
Enzima Galactosiltranferase
2 Masculino 5 anos
arr[GRCh37]7q36.3
(158.215.549-158.649.005)x3
PTPRN2 Proteína receptor tirosina-fosfatase
3 Masculino 4 anos arr[GRCh37] 3p26.3p25.3
(61,495-9,769,043)x3
CNTN4
CNTN6
OXTR
GRM7
SETD5
Diversas proteínas relacionadas à adesão celular, receptores de neurotransmissores,
plasticidade e manutenção neuronal.
4 Feminino 5 anos
arr[GRCh37]17q22q223.1
(57,408,181-57,742,624)x3
BZRAP1 Receptor de
Benzodiazepina
5 Masculino 16 anos Chr6: 33,405,539 SYNGAP1 Ativação sináptica
específica do cérebro
6 Masculino 6 anos arr[hg19] 7q31.1
(110,931,993-111,309,975) x1 IMMP2L
proteína envolvida no processamento das
sequências de peptídeos de sinal para
as mitocôndrias
19
5. Discussão
5.1. Caso 1
O gene B4GALT1, localizado no cromossomo 9p, traduz a enzima
galactosiltransferase e é um dos sete beta-1,4-galactosil-transferase (beta4GalT
genes). Codificam glicoproteínas tipo II ligadas a membrana. Esse gene é único
entre os genes beta4GalT, pois codifica uma enzima que participa tanto no
glicoconjugado, quanto na biossíntese da lactose. Catalisa a reação que envolve a
UDP-galactose e N-acetilglicosamina para a produção de galactose beta-1,4-N-
acetilglicosamina. A enzima galactosiltransferase pode formar, também, um
heterodímero em conjunto com a proteína regulatória alfa-lactobumina para formar
a lactose sintetase. A galactosiltransferase pode ser um componente da membrana
plasmática, funcionando no reconhecimento e adesão celular (OMIM, 2016;
ABRAHAMS, 2013; GENECARDS, 2016).
Segundo o estudo de Van der Zwaag et al (2009), para se obter uma coorte
uniforme, o grupo analisado foi dividido em dois: autismo-complexo e autismo-não
complexo, sendo o primeiro, casos com CNVs sobrepostas, enquanto que o
segundo, casos não sobrepostos. No grupo não-complexo, foi encontrada CNVs na
região do gene B4GALT1. Defeitos nesse gene pode causar diversas doenças,
como distúrbios congênitos de glicosilação. Van der Zwaag et al (2009) constatou
que houve uma grande representação de genes relacionados a glicosilação no
grupo não-complexo. Sugere que as alterações de dosagem destes genes podem
contribuir para o fenótipo de TEA. O estudo conclui que os genes envolvidos nas
vias da glicosilação estão diretamente envolvidos no desenvolvimento cerebral, e
que perdas ou ganhos nessas regiões podem levar a consequências orgânicas
graves no sistema nervoso.
5.2. Caso 2
O gene PTPRN2 codifica uma proteína com a sequência semelhante à da proteína
do receptor tirosina fosfatase. PTPRN2 contém uma região extracelular, uma única
20
região transmembranar e um único domínio catalítico intracelular. Estudos sugerem
que a proteína codificada pode funcionar como uma fosfatase fosfatidilinositol com
a capacidade de desfosforilar a fosfatidilinositol-3-fosfato e fosfatidilinositol 4.5-
difosfato, e esta função pode estar envolvida na regulação da secreção de insulina
(OMIM, 2016; GENECARDS, 2016).
Ele possui um papel importante nos processos de secreção, mediada por vesículas,
ou seja, é necessário para que haja o acúmulo das mesmas contendo insulina e
impedir sua degradação. É preciso que tenha uma quantidade normal de
neurotransmissores de noradrenalina, dopamina e serotonina no cérebro.
Segundo um estudo, o gene PTPRN2 junto com mais sete genes, é encontrado na
região 7q causando uma deleção e podendo estar associada a deficiência
intelectual, microcefalia, malformações. Além disso, a proteína codificada pelo
PTPRN2 é um membro da família de proteína-tirosina-fosfatase (PTP) que são
moléculas de sinalizam que regulam uma variedade de processos celulares,
incluindo crescimento celular, diferenciação, ciclo mitótico e transformação
oncogênica (WU, et al. 2010).
5.3. Caso 3
O gene CNTN6, localizado no cromossomo 3p, traduz a contactina 6, que é membro
do subgrupo da família das imunoglobulinas. É um glicosilfosfatidilinositol (GPI) –
proteína de membrana ancorada - que medeia as interações de superfície de célula
durante o desenvolvimento do sistema nervoso (OMIM, 2016; ABRAHAMS, 2013;
GENECARDS, 2016). É regulado pelo T- Brain 1, uma proteína de risco para o TEA
(CHUANG, H.; HUANG, T.; HSUEH, 2015) e que interage com a molécula de
adesão celular L1-like, outra proteína associada com deficiência intelectual e
dificuldades na fala (TASSANO et al, 2014). Além dessas associações, o CNTN6
faz interação com o gene NOTCH1, que promove a ativação deste, através da
liberação do Domínio Intercelular Notch (NICD, do inglês notch intercellular domain).
E traduz a proteína Notch 1, para a geração de oligodendrócitos, células
responsáveis pela produção e manutenção da bainha de mielina dos axônios. Por
21
desempenhar um papel na formação de ligação de axônio no sistema nervoso em
desenvolvimento e, embora tenha poucos estudos sobre a prevalência, há relatos
que relacionam esse gene mutado com indivíduos com TEA (MERCATI, et al, 2016).
O gene CNTN4, localizado no cromossomo 3p, traduz a contactina 4, proteína de
adesão associada ao axônio, da família das imunoglobulinas que possui um
importante papel na manutenção e plasticidade das redes neuronais funcionais. A
contactina 4 é um glicosilfosfatidilinositol, uma proteína de membrana ancorada,
com função de formação de ligações de axônios no sistema nervoso em
desenvolvimento por isso, está mais expressa no cérebro, principalmente no
cerebelo, tálamo, amigdala e cótex cerebral (OMIM, 2016; ABRAHAMS, 2013;
GENECARDS, 2016).
Roohi et al (2009) descreveu variações de número de cópias (CNVs) em três casos
de indivíduos com TEA que interromperam o gene CNTN4. Essas mutações
resultaram em recombinações desiguais, mediadas pela sequência Alu. Sequências
Alu são repetições curtas de DNA não codificante, fazem parte da família SINE (do
inglês, short interspersed nuclear elements) e são consideradas retrotransposóns
(BATZER & DEININGER, 2002).
A proteína codificada pelo gene OXTR, localizado no cromossomo 3p, pertence à
família dos receptores acoplados a proteína G e atua como um receptor de oxitocina
no qual desempenha um papel importante no útero durante o parto, na lactação e
ligação hormônio peptídeo, sendo um potente modulador de comportamentos
sociais e reprodutivos. Está associada a peptídeos receptores de ligação e a via de
sinalização AMPc. Sua atividade é mediada por proteína G, que também ativa o
sistema de segundo mensageiro fosfatidilinositol- cálcio (OMIM, 2016; ABRAHAMS,
2013; GENECARDS, 2016).
Foram identificados diversos tipos de variações no gene OXTR relacionados com o
TEA, como rs2254298 e rs53576 (WU et al., 2005; JACOB et al., 2007; LIU et al.,
2010; WERMTER et al., 2010).
22
Tost et al (2010) estudou mais de 200 indivíduos saudáveis com polimorfismos “G-
to-A” no intron 3 (rs53576). O alelo “A” foi associado a uma deficiência no domínio
comportamentos sociais, portanto, sujeitos homozigotos para esse alelo de risco
foram caracterizados por um nível de sociabilidade baixo, além de comportamentos
parentais comprometidos. O estudo concluiu que o polimorfismo está ligado a
distúrbios de comportamento, alterações morfológicas no hipotálamo, amígdala e
na massa cinzenta. Além disso, os achados foram consistentes com dados
anteriores que associam o alelo de risco ao TEA.
Gene GRM7, localizado no cromossomo 3p, codifica um receptor acoplado à
proteína G para glutamato. O L-glutamato é o principal neurotransmissor excitatório
no sistema nervoso central, e ativa os receptores de glutamato ionotrópicos e
metabotrópicos. A neurotransmissão glutamatérgica está envolvida na maioria dos
aspectos da função cerebral normal e pode ser perturbada em muitas condições
neuropatológicas. Os receptores metabotróficos de glutamato são de uma família
de receptores acoplados a proteina G que foram divididos em três grupos com base
na homologia de sequência, mecanismos putativos de transdução de sinal e
propriedades farmacológicas. O gene GRM7 está inserido no grupo III, receptores
ligados à inibição da cascata do AMPc. (OMIM, 2016; GENECARDS, 2016).
A via do glutamato tem sido considerada como desempenhando papéis importantes
na plasticidade neural, desenvolvimento neural e neurodegeneração e, através de
modelos animais e estudos neuroquímicos e neurofarmacológicos, o autismo tem
sido proposto ser um distúrbio que envolve a concentração alterada de glutamato
(YANG, PAN, 2013).
Makoff (1996) concluiu que esse gene foi expresso em várias áreas do cérebro
humano: hipocampo, cerebelo e o córtex cerebral ao encontrar o mRNA nessas
regiões.
Gene SETD5, localizado no cromossomo 3p, é um gene previsto para codificar a
enzima metiltransferase, com base na sequência de homologia de outras proteínas
SET (OMIM, 2016; GENECARDS, 2016). Embora esteja ativamente presente em
23
vários mamíferos e expresso no cérebro, sua função ainda é pouco conhecida. Com
base nos outros membros da família de proteínas SET, a SETD5 pode ser
importante no controle das histonas do DNA e age como reguladora de transcrição.
Genes que codificam especificamente metiltransferases e genes que codificam
modificadores de histonas são altamente reconhecidos por ter uma contribuição no
fenótipo de deficiência intelectual (GROZEVA et al, 2014). Mutações de novo de
perda de função nesse gene são uma importante causa de deficiência intelectual
moderada a grave, além de ser um forte gene candidato para a síndrome de deleção
do 3p, devido aos fenótipos similares (SZCZAŁUBA et al, 2016).
5.4. Caso 4
Gene BZRAP1, localizado no cromossomo 17q, codifica o receptor periférico de
benzodiazepina, associado a proteína. É uma molécula de adaptação considerada
como reguladora da transmissão sináptica, ao liberar a maquinaria responsável pela
liberação de vesículas de cálcio (Ca2+) para os canais dependentes (BUNCAN et
al, 2009). Gene candidato ao autismo com um score de 4 (evidência mínima) no
SFARI.
5.5. Caso 5
Gene SYNGAP1, localizado no cromossomo 6p, codifica uma proteína Ras GTPase
de ativação sináptica específica do cérebro, a SynGAP, majoritariamente localizada
nas árvores dendríticas de neurônios piramidais neocorticais. É um componente do
complexo receptor-NMDA (N-Metil-D-Aspartato), que atua juntamente com o
mesmo, bloqueando a inserção do AMPA (ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
isoxazol propiônico) na membrana pós-sináptica por inibição da via RAS-ERK.
Acredita-se que interrupções nos mecanismos moleculares e função controladora
da estrutura glutamatérgica de sinapse estão relacionadas a determinados
distúrbios do desenvolvimento neurológico e da cognição como a deficiência
intelectual e o TEA. Entretanto, ainda é desconhecido como uma disfunção sináptica
24
resultante de mutações patogênicas impacta o desenvolvimento e o comportamento
(OMIM, 2016; GENECARDS, 2016; CLEMENT et al, 2012; HAMDAM et al, 2011)
5.6. Caso 6
O gene IMMP2L (Inner Mitochondrial Membrane Peptidase Subunit 2), localizado
no cromossomo 7q, codifica uma proteína envolvida no processamento das
sequências de peptídeos de sinal utilizadas para direcionar proteínas mitocondriais
para as mitocôndrias. A proteína codificada reside nas mitocôndrias e é uma das
necessárias para a atividade catalítica do complexo mitocondrial peptidase de
membrana interna (IMP). Duas variantes que codificam a mesma proteína foram
descritas para este gene, a IMP1 e IMP2 (OMIM, 2016; ABRAHAMS, 2013;
GENECARDS, 2016).
Segundo alguns estudos, o gene IMMP2L pode estar associado ao TEA
isoladamente, mas de acordo com o score do SFARI, é um gene candidato de baixa
expressão. No entanto, há uma forte ligação com a Síndrome de Tourette, apesar
das causas não serem elucidadas (MIRANDA; ROMANO-SILVA; TEIXERA, 2007).
Em resumo esta série de casos mostrou alguns aspectos característicos de casos
descritos na literatura: maior número de meninos afetados e apresentação na forma
de síndromes dismórficas com DI (Zanolla et al). Quanto às regiões cromossômicas
envolvidas, todas já foram descritas na literatura. A região 7q é a mais recorrente e
em relação aos genes, CNTN6, CNTN4 e o SYNGAP1 são os mais vistos, também.
Os mecanismos neurais envolvidos nos TEA são migração neuronal, formação de
sinapses e neurotransmissores. Em relação aos neurotransmissores, sabe se que
as deficiências de alguns deles, como a dopamina e a serotonina, agravam
sintomas como a apatia, inercia, irritabilidade e desinibição por serem hormônios
associados a comportamentos sociais que, se defeituosos, resultam em anomalias
nestes. E, consequentemente, gerando uma pré-disposição para o autismo
(PEREIRA ET AL, 2012). A formação de sinapses está relacionada a atividades
neuronais importantes para o desenvolvimento cognitivo do indivíduo. Por isso, se
25
houver alguma ocorrência nesse processo, é possível que a aprendizagem,
memória, percepção e equilíbrio sejam de algum modo afetados. E, dependendo da
gravidade, podemos classificar o indivíduo como autista (INSTITUTO
NEUROLÓGICO, 2016). Como visto na discussão de cada caso, encontramos em
nosso estudo os genes B4GALT1, CNTN6, CNTN4, GRM7, BZRAP1 e o SYNGAP1
cujos mecanismos envolvidos com o TEA são dependentes principalmente de
enzimas, proteínas, neurotransmissores e formação de sinapses. Logo podemos
associar estes fatores a atividades do sistema nervoso que podem ser responsáveis
pela ocorrência desse transtorno.
Os casos também mostram que o teste genético mais resolutivo para pacientes com
este perfil clínico é o array Genômico. De fato, apenas em um paciente (caso 5) o
MicroArray não conseguiu descobrir a alteração, tendo sido necessário um teste
NGS (do inglês, New Generation Sequencing), o sequenciamento do Exoma.
6. Conclusão
Após analisar uma série de pacientes e estudos de caso, encontramos diversos
genes candidatos, sendo todos envolvidos com o TEA, além de diversos outros
distúrbios do desenvolvimento, deficiência intelectual, TDAH, TOC, esquizofrenia,
epilepsia e déficit de cognição.
Ao longo do trabalho foi possível notar uma escassez de material e pesquisas
relacionadas a alguns genes, como por exemplo, o gene IMMP2L e o gene
PTPRN2. O primeiro, talvez pela sua função complexa no organismo, fazendo com
que haja menos estudos relacionados a ele. E o segundo, por estar mais associado
a deficiência intelectual do que ao TEA propriamente dito, o que dificulta achados
sobre o mesmo.
Podemos concluir também que ambos os testes genéticos mais utilizados em nosso
estudo, o MicroArray e o Sequenciamento do Exoma são de grande utilidade e de
grande importância para as áreas de citogenética e citogenômica devido a sua alta
resolução, e pela facilidade de detectar erros que outras técnicas não conseguiriam.
Mas embora ambos os testes tenham sido bem-sucedidos, no caso 5 o erro foi
26
detectado apenas por sequenciamento, o que mostra que a técnica de Array não é
100% eficiente em determinados casos.
Diante do exposto fica claro que o estudo de casos deve ser ampliado utilizando os
testes genéticos já disponíveis clinicamente. Este conhecimento vai melhorar o
entendimento das modificações provocadas pelas alterações genéticas em
indivíduos com TEA.
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