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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO

JANAINA DE OLIVEIRA BRITO

MECANISMOS ASSOCIADOS ÀS DISFUNÇÕES CARDIOMETABÓLICAS EM

UM MODELO EXPERIMENTAL DE MENOPAUSA E SÍNDROME

METABÓLICA: PAPEL DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO OU

RESISTIDO

São Paulo

2014

JANAINA DE OLIVEIRA BRITO

MECANISMOS ASSOCIADOS ÀS DISFUNÇÕES CARDIOMETABÓLICAS EM

UM MODELO EXPERIMENTAL DE MENOPAUSA E SÍNDROME

METABÓLICA: PAPEL DO TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO OU

RESISTIDO

Tese apresentada à Universidade

Nove de Julho, para obtenção do

título de Doutor em Ciências da

Reabilitação

Orientadora: Profa. Dra. Kátia

De Angelis

São Paulo

2014

Brito, Janaina de Oliveira.

Mecanismos associados às disfunções cardiometabólicas em um modelo

experimental de menopausa e síndrome metabólica: papel do treinamento

físico aeróbio ou resistido. / Janaina de Oliveira Brito./ 2014.

167 f.

Dissertação (mestrado) – Universidade Nove de Julho - UNINOVE,

São Paulo, 2014.

Orientador (a): Prof. Dra. Kátia De Angelis.

1. Hipertensão 2. Menopausa 3. Síndrome metabólica 4. Modulação

autonômica 5. Estresse oxidativo e marcadores inflamatórios. I. De Angelis, Kátia. II. Titulo

CDU 615.8

“o único lugar onde o sucesso vem antes do

trabalho é no dicionário”.

Albert Einstein

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais, Elza Francisca de Oliveira Brito e José de Brito, que sempre

fizeram (e ainda fazem) o possível e o impossível para me proporcionar tudo o que for de

melhor nessa vida! Agradeço pelo carinho incondicional, amor, respeito e também pelos

puxões de orelha! rs. Obrigado por lutarem comigo para que esse sonho pudesse se tornar

realidade.

Ao meu único e eterno irmão, Sebastião de Brito (Cbass Fomerase), por dividir a sua

data de aniversário comigo, por compartilhar as latinhas de coca-cola, pelo carinho e

respeito, pelos conselhos e explicações psicológicas e filosóficas, por me apoiar sempre

nas minhas escolhas acadêmicas, por ser essa pessoa maravilhosa que eu admiro muito!

Ao meu noivo, Emerson Monzani, pela paciência em dias de TPM, por aceitar e

compreender as minhas ausências, por incentivar os meus ideais, por me ajudar

encorajando-me a enfrentar todos os momentos difíceis.

Aos meus familiares: meus avós que não estão mais presentes, meus tios, tias, primos,

primas, cunhadas, sogro, sogra, ex-professores e amigos. Todos, mesmo aqueles que

moram longe e encontro pouquíssimo, contribuem para a minha formação enquanto ser

humano.

Dedico aos meus amigos de laboratório, ANGELITOS e agregados: Catarina Barbosa

(Patti LaBelle), Christiane Malfitano (Chris Malf Brooklin), Fernando Alves (Tenente),

Guilherme Shimojo (Bigode), Hugo Quintero (Huguinho), Íris Callado Sanches (cabelo

de leão), Michelle Sartori (Boobs), Morgana Buzin e Renata Kelly da Palma (Ladra de

namorados, rs). Pessoas que, às vezes, passam mais tempo ao meu lado do que meus

próprios pais. Pessoas com diversas características e que temos que conviver na

harmonia.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeço a Deus, pela dádiva da vida e por ter guiado os meus passos

para que pudesse escolher os caminhos a serem percorridos.

À professora Kátia De Angelis por ter acreditado em mim desde o 2º ano da graduação,

orientando minha pesquisa de Iniciação Científica, meu Trabalho de Conclusão de Curso, minha

Dissertação e minha Tese!! Muito obrigada por fazer parte da minha vida e por ter me mostrado o

brilhante mundo da Fisiologia do Exercício!

À três amigos especiais do Laboratório de Fisiologia Translacional, Danielle Dias, Filipe

Fernandes Conti e Nathalia Bernardes. Obrigado pelo carinho, pela companhia, pelos

conselhos e conversas, pelos lanches no Mc Donalds, pelas risadas, pela paciência, por me

ajudarem sempre que precisei.

À Universidade Nove de Julho pela bolsa de estudos, a CAPES pelo doutoramento

sanduíche no exterior, no qual pude conhecer uma pessoa especial, que só veio a

acrescentar na minha vida, Martha Manchini (roommate). E por fim, ao apoio

financeiro da FAPESP (Processo: 2010/17188-4).

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da privação dos hormônios ovarianos

associado à hipertensão e ao consumo crônico de frutose em parâmetros metabólicos,

cardiovasculares, autonômicos, de inflamação e de estresse oxidativo. Adicionalmente,

objetivou-se investigar os efeitos do treinamento físico dinâmico aeróbio ou resistido

nessa condição de associação de fatores de risco. Ratas fêmeas Wistar (n=8) e SHR

(n=32) foram divididas em: normotensas (C), hipertensas (H), hipertensas

ooforectomizadas (HO), hipertensas ooforectomizadas tratadas com frutose (FHO)

submetidas ao treinamento físico aeróbio (FHOTa) ou treinamento físico resistido

(FHOTr). O treinamento físico aeróbio (esteira; 1h/dia; 5x/sem) e o treinamento físico

resistido (escada adaptada para ratos; 1h/dia; 5x/sem) foram realizados durante 8

semanas. Parâmetros de função cardiovascular, de regulação autonômica cardiovascular,

metabólicos e de capacidade física e sua relação com alterações de estresse oxidativo e de

inflamação foram avaliados no tecido cardíaco e renal. A somatória dos fatores de risco

promoveu aumento exacerbado nos níveis pressóricos (FHO:173±1 vs. C:108±1 mmHg).

Em contrapartida, foi observado a bradicardia de repouso após o treinamento físico

(FHO:393±10 vs. FHOTa:336±9 e FHOTr:330±13bpm). O grupo FHO apresentou

prejuízo na sensibilidade dos pressorreceptores, na modulação autonômica cardiovascular

e menor biodisponibilidade de óxido nítrico. Tanto o treinamento físico aeróbio quanto o

resistido normalizou o RMSSD (índice de modulação parassimpática) e aumentou a

sensibilidade dos pressorreceptores. O TNF alfa e a leptina estavam aumentados no grupo

FHO (65,8±9,9 pg/mg proteína e 1346,65±127,28pg/ml) em relação ao grupo C

(23,66±4,35 pg/mg proteína e 974,28±90,90 pg/ml), o que foi normalizado pelos

treinamentos. Correlação entre TNF alfa e leptina (positiva) foi obtida nos grupos

tratados com frutose (sedentários e treinados). Por outro lado, o treinamento físico

promoveu maior biodisponibilidade de óxido nítrico (FHOTa:0,32±0,2;

FHOTr:1,46±0,18 vs. FHO:1,35±0,21 C:1,1±0,15 nmol/mg de proteína) e aumento da IL-

10 (somente FHOTr: 40,25±7,97 vs. FHO:16,26±2,52pg/mg proteína). Correlação

positiva foi obtida entre o RMSSD e a IL-10. A sobrecarga de frutose induziu um

aumento da lipoperoxidação de membrana no tecido cardíaco (FHO:15043±1333;

FHOTa:10652±814; FHOTr:11551±1350 vs. C:2661±358µlmol/mg proteína), o qual foi

reduzido por ambos os tipos de treinamento. O grupo HOF apresentou aumento de dano

à proteína no tecido renal (FHO:4,40±0,37 vs. C: 1,97±0,21nmol/mg proteína), e ambos

os treinamentos foram eficazes em diminuir essa variável. Correlação negativa foi obtida

entre o RMSSD e a QL cardíaca. Correlação positiva foi obtida entre BF-PAS e o

TBARS renal. A sobrecarga de frutose reduziu a TRAP cardíaca, entretanto ambos os

tipos de treinamento físico aumentaram essa variável. O consumo de frutose induziu

prejuízo no balanço redox (FHO: 8,2±0,51 vs. C: 10,4±0,63), o qual pode ser revertido

pelo treinamento aeróbio (FHOTa: 12,9±0,44) e resistido (FHOTr:). O balanço redox foi

positivamente relacionado com o RMSSD e negativamente correlacionado com o TNF

alfa. Concluindo, os resultados evidenciam que a sobrecarga de frutose induziu prejuízo

da modulação autonômica cardiovascular associado ao aumento de parâmetros

inflamatórios e de estresse oxidativo em ratas ovariectomizadas hipertensas. O

treinamento físico dinâmico aeróbio ou resistido de intensidade moderada neste modelo

de associação de fatores de risco atenuou algumas das disfunções metabólicas,

cardiovasculares e autonômicas provavelmente por melhorar o perfil de marcadores

inflamatório e o estresse oxidativo.

Palavras-chave: hipertensão, menopausa, síndrome metabólica, modulação

autonômica, estresse oxidativo e marcadores inflamatórios.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate effects of the ovarian hormones deprivation

associated with hypertension and fructose overload in metabolic, cardiovascular,

autonomic, inflammation and oxidative stress parameters. Additionally aimed to

investigate the effects of the dynamic or resistance exercise training this condition by

association of the risk factors. Female rats Wistar (n=8) and SHR (n=32) were divided in:

normotensive (C), hypertensive (H), hypertensive ovariectomized (HO), hypertensive

ovariectomized treated with fructose (FHO), and submitted aerobic exercise training

(FHOTa) or resistance exercise training (FHOTr). The aerobic exercise training

(treadmill; 1h/day; 5d/wk) and resistance exercise training (ladder adaptated for rats;

1h/day; 5d/wk) were performed during 8 weeks. Cardiovascular function, autonomic

cardiovascular modulation, metabolic and physical capacity were evaluated, as weel as

the relationship of these variables with cardiac oxidative stress and inflammation in the

cardiac and renal tissues. The association of risk factors promoted an exarcebated

increase in blood pressure (FHO: 173±1 vs. C:108±1 mmHg). In contrast, was observed

resting bradycardia after exercise training (FHO: 393±10 vs. FHOTa:336±9 and

FHOTr:330±13bpm). The FHO group showed impairment in the pressoreceptors

sensibility, autonomic modulation and lower nitric oxide bioavaliability. Both aerobic

and resistance exercise training normalized the RMSSD (parasympathetic modulation

index) and increased the pressoreceptors sensibility. TNF alpha and leptin were

increased in the FHO group (65.8±9.9 pg/mg protein and 1346.65±127.28pg/ml) in

relation to C group (23.66±4.35 pg/mg protein and 974.28±90.90 pg/ml), which was

normalized of the trainings. Correlation between TNF alpha and leptin (positive) was

obtained in the treated with fructose groups (sedentary and trained). On the other hand,

the exercise training promoted higher nitric oxide bioavaliability (FHOTa:0.32±0.2;

FHOTr:1.46±0.18 vs. FHO:1.35±0.21 C:1.1±0.15 nmol/mg protein) and increase oh the

IL-10 (only FHOTr: 40.25±7.97 vs. FHO:16.26±2.52pg/mg protein). Positive correlation

was obtained between RMSSD and IL-10. The fructose overload induced an increase

membrane lipoperoxidation in the cardiac tissue (FHO:15043±1333; FHOTa:10652±814;

FHOTr:11551±1350 vs. C:2661±358µlmol/mg protein), which was reduced by both

types of the training. The FHO group showed increase proteins damage in the renal tissue

(FHO:4.40±0.37 vs. C: 1.97±0.21nmol/mg protein) and both exercise training were

effective in decrease this variable. Negative correlation was obtained between cardiac

RMSSD and QL. Positive correlation was obtained between renal LF-PAS and TBARS.

Fructose overload reduced the cardiac TRAP, however, both exercise training enhance

this variable. Fructose consumption induced impairment in the redox balance (FHO:

8.2±0.51 vs. C:10.4±0.63), which can be reversed by aerobic (FHOTa: 12.9±0.44) and

resistance exercise training (FHOTr:). The redox balance was positively related with

RMSSD and negatively correlated with TNF alpha. Concluding, the results evidences that

fructose overload induced impairment in the cardiovascular autonomic modulation

associated increase inflammatory and oxidative stress parameters in hypertensive

ovariectomized rats. Dynamic aerobic or resistance exercise training of the moderate

intensity this model of risk factors association attenuated some of the metabolic,

cardiovascular and autonomic dysfunctions probably by improving inflammatory markers

and oxidative stress.

Key words: hypertension, menopause, metabolic syndrome, autonomic modulation,

oxidative stress and inflammatory markers.

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS

1. CONTEXTUALIZAÇÃO 1

1.1. Climatério, Doença Cardiovascular e Síndrome Metabólica............................................ 1

1.2. Estresse Oxidativo, Biodisponibilidade de Óxido Nítrico e Disfunções Fisiológicas...... 3

1.3. Marcadores Inflamatórios e Disfunções Fisiológicas........................................................ 5

1.4. Treinamento Físico e Manejo de Risco após a Menopausa.............................................. 6

2. OBJETIVOS.......................................................................................................................... 9

2.1. Objetivo Geral................................................................................................................... 9

2.2. Objetivos Específicos........................................................................................................ 9

3. RESULTADOS...................................................................................................................... 12

3.1. Artigo 1: Cardiovascular autonomic dysfunction and oxidative stress induced by

fructose overload in an experimental model of hypertension and menopause……................. 13

3.2. Artigo 2: Cardiometabolic benefits of exercise training in an experimental model of

metabolic syndrome and menopause…………………………………………………………... 25

3.3. Artigo 3: Treinamento físico aeróbio ou resistido melhora o controle autonômico da

circulação em ratas ooforectomizadas com disfunção cardiometabólica: impacto no estresse

oxidativo renal..................................................................................................................... 38

3.4. Artigo 4: Treinamento físico resistido ou aeróbio atenua a disfunção autonômica

cardíaca em um modelo de menopausa e síndrome metabólica: papel do estresse oxidativo e

da inflamação............................................................................................................................. 52

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................................ 67

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................. 81

6. ANEXOS................................................................................................................................. 96

6.1. Parecer do COEP.............................................................................................................. 96

6.2. Artigo submetido à revista Diabetes, Obesity and Metabolism........................................ 100

6.3. Artigo publicado na revista Menopause.......................................................................... 123

6.4. Artigos publicados e submetidos durante o período do Doutorado.................................. 131

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Avaliações metabólicas nos grupos estudados............................................................ 20

Tabela 2. Avaliações hemodinâmicas e autonômicas nos grupos estudados............................ 21

Tabela 3. Marcadores inflamatórios nos grupos estudados....................................................... 22

Tabela 4. Avaliações de estresse oxidativo cardíaco nos grupos estudados.............................. 23

Tabela 5. Avaliações metabólicas nos grupos estudados........................................................... 34

Tabela 6. Avaliações cardiovasculares e autonômicas nos grupos estudados........................... 35

Tabela 7. Avaliações hemodinâmicas e autonômicas nos grupos estudados............................. 47

Tabela 8. Estresse oxidativo renal nos grupos estudados........................................................... 48

Tabela 9. Capacidade física e avaliações metabólicas nos grupos estudados............................ 62

Tabela 10. Avaliações hemodinâmicas e autonômicas nos grupos estudados.......................... 63

Tabela 11. Estresse oxidativo cardíaco nos grupos estudados................................................... 64

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Correlação de Pearson obtida entre o tecido adiposo e os níveis de IL-10 em todos

os grupos estudados..................................................................................................................... 24

Figura 2. Sensibilidade à insulina avaliada pela constante de decaimento da glicose (KITT)

em resposta ao teste de tolerância à insulina em ratos hipertensos ooforectomizados

sedentários (SHO) e treinados (THO) e ratos hipertensos ooforectomizados sedentários

submetido a sobrecarga de frutose sedentário (SHOF) e treinado

(THOF)........................................................................................................................................ 36

Figura 3. Raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças entre intervalos

adjacentes (RMSSD); B. Banda de alta frequência do intervalo de pulso (AF-IP); C. Banda

de baixa frequência do intervalo de pulso (BF-IP); D. Banda de baixa frequência da pressão

arterial sistólica (BF-PAS); E. Sensibilidade barorreflexa espontânea avaliada pelo índice

alfa em ratos hipertensos ooforectomizados sedentários (SHO) e treinados (THO) e em ratos

hipertensos ooforectomizados sedentários submetidos à sobrecarga de frutose sedentário

(SHOF) e treinado (THOF)......................................................................................................... 37

Figura 4. Banda de baixa frequência da pressão arterial sistólica nos grupos estudados C:

grupo controle; H: hipertenso; FHO: grupo hipertenso ooforectomizado submetido ao

consumo de frutose; FHOTa: grupo hipertenso ooforectomizado tratado com frutose

submetido ao treinamento físico aeróbio; FHOTr: grupo hipertenso ooforectomizado tratado

com frutose submetido ao treinamento físico resistido........................................................... 49

Figura 5. Índice Nox nos grupos estudados. C: grupo controle; H: hipertenso; FHO: grupo

hipertenso ooforectomizado submetido ao consumo de frutose; FHOTa: grupo hipertenso

ooforectomizado tratado com frutose submetido ao treinamento físico aeróbio; FHOTr:

grupo hipertenso ooforectomizado tratado com frutose submetido ao treinamento físico

resistido....................................................................................................................................... 50

Figura 6. Correlações obtidas entre: A) RMSSD e QL ; B) RMSSD e carbonilas; C)

RMSSD e Razão GSH/GSSG e D) RMSSD e IL-10.................................................................. 51

Figura 7. A) Fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e B) Interleucina 10 (IL-10) no tecido

cardíaco; C) Leptina e D) Adiponectina no tecido adiposo branco visceral dos grupos

estudados. C: grupo controle; FHO: grupo hipertenso ooforectomizado submetido ao


submetido ao treinamento físico aeróbio; FHOTr: grupo hipertenso ooforectomizado tratado

com frutose submetido ao treinamento físico resistido..................................................... 65

Figura 8. Correlações positivas obtidas entre: A) TBARS e Carbonilas; B) BF-PAS e

TBARS.Correlação negativa obtida entre C) Índice NOX e TBARS ....................................... 66

LISTA DE ABREVIATURAS

AF-IP: Banda de Alta Frequência do Intervalo de Pulso

BF-IP: Banda de Baixa Frequência do Intervalo de Pulso

BF-PAS: Banda de Baixa Frequência da Pressão Arterial Sistólica

C: Normotenso

CAT: Catalase

DCV: Doença Cardiovascular

DNPH: Dinitrofenil Hidrazina

EPM: Erro padrão da Média

FC: Frequência Cardíaca

GPx: Glutationa Peroxidase

GSH/GSSG: Balanço Redox

GSH: Glutationa Reduzida

GSSG: Glutationa Oxidada

H: Hipertenso

H2O2: Peróxido de Hidrogênio

HFO: Hipertenso Ooforectomizado Tratado com Frutose

HFOTa: Hipertenso Ooforectomizado Tratado com Frutose Treinado Aeróbio

HFOTr: Hipertenso Ooforectomizado Tratado com Frutose Treinado Resistido

HO: Hipertenso Ooforectomizado

HS: Hipertenso Sedentário

IL-6: Interleucina 6

IL-10: Interlucina 10

IP: Intervalo de Pulso

KCL: Cloreto de Potássio

NO: Óxido Nítrico

PA: Pressão Arterial

PAD: Pressão Arterial Diastólica

PAM: Pressão Arterial Média

PAS: Pressão Arterial Sistólica

PCR: proteína C reativa

PMSF: Fluoreto de Fenil Metil Sulfonila

QL: Quimiluminescência

RMSSD: Raiz Quadrada da Média da Soma dos Quadrados das Diferenças entre

Intervalos Adjacentes (Atividade Parassimpática)

SHR: Ratos Espontaneamente Hipertensos

SM: Sindrome Metabólica

SOD: Superóxido Dismutase

TBA: Ácido Tiobarbitúrico

TBARS: Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

t-BOOH: Hidroperóxido de Tert-Butil

TCA: Ácido Tricloroacético

TNF alfa: Fator de Necrose Tumoral

VAR-IP: Variabilidade do Intervalo de Pulso

VFC: Variabilidade da Frequência Cardíaca

VPAS: Variabilidade da Pressão Arterial Sistólica

1

CONTEXTUALIZAÇÃO

1.1. Climatério, Doença Cardiovascular e Síndrome Metabólica

A menopausa é um processo biológico que ocorre como parte do envelhecimento

nas mulheres. A menopausa não deve ser considerada como uma doença, no entanto,

pode afetar adversamente a saúde da mulher pela falta de estrogênio em tecidos alvo,

incluindo o cérebro, esqueleto e pele, bem como o sistema cardiovascular (WANG et al.,

2003).

Com o advento da menopausa, são observadas alterações como redução na

capacidade física, na força muscular e na massa óssea, bem como aumento do peso

corporal e da prevalência de doenças (SOWERS & LA PIETRA, 1995). Neste período,

comumente os níveis pressóricos estão elevados nas mulheres quando comparados aos

homens, tornando mais prevalente a hipertensão (STAMLER et al., 1993). Neste sentido,

estudos sugerem que os hormônios ovarianos podem ser responsáveis pela pressão

arterial (PA) mais baixa em mulheres pré-climatério, e a sua ausência pelo aumento da

PA em mulheres menopausadas (STAESSEN et al., 1997).

Em 2012, o American Heart Association realizou um levantamento estatístico e

constatou que as doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade em todas

as idades. Adicionalmente, notou-se que as mulheres com idade superior a 55 anos (faixa

etária em que as mulheres normalmente já estão menopausadas) apresentavam um

aumento na prevalência da doença cardiovascular quando comparadas com os homens

(SOWERS E LA PIETRA, 1995). Dessa forma, tem-se sugerido que o estrogênio poderia

promover uma cardioproteção no sexo feminino e com isso reduzir o desenvolvimento de

doenças cardiovasculares (MILLER, 1999).

Após o advento da menopausa, o risco de eventos cardiovasculares tem sido

associado a alterações metabólicas e cardiovasculares que pode também estar relacionado

à disfunção autonômica (SINAGRA & CONTI, 2007). De fato, a menopausa e o

envelhecimento alteram o controle autonômico cardiovascular (KUO et al., 1999). Nesse

sentido, um estudo demonstrou que 24% das mulheres com mais de 40 anos de idade

apresentavam uma marcante diminuição na sensibilidade barorreflexa em relação a

mulheres jovens (LAITINEN et al., 1998). Vale lembrar que a sensibilidade barorreflexa

e a variabilidade da freqüência cardíaca (VFC), que são excelentes marcadores da função

2

autonômica (DE ANGELIS et al., 2004), quando reduzidos têm sido associados a maior

morbidade e mortalidade por doenças cardiovasculares tanto em populações saudáveis

(DEKKER et al., 1997; TSUJI et al.,1994) quanto em pacientes após um evento

coronariano agudo (LA ROVERE et al.,1998).

Dados já publicados de nosso grupo evidenciam que ratas fêmeas submetidas à

privação dos hormônios ovarianos (ooforectomia) apresentavam aumento da PA, redução

da sensibilidade barorreflexa e do tônus vagal cardíaco e aumento do tônus simpático

(IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010). Todavia, os valores de PA obtidos após a

ooforectomia são em torno de 120 mmHg, não caracterizando um quadro de hipertensão

estabelecida como observa-se em muitas mulheres menopausadas. Neste sentido, um

modelo experimental que se assemelha as disfunções observadas na fase climatérica da

mulher é o da hipertensão espontânea em ratos. Nos ratos espontaneamente hipertensos

(SHR), assim como na hipertensão essencial humana, o aumento da pressão arterial se dá

de forma progressiva (PRAVENEC et al., 2004; GOUVEIA et al., 2000).

Vale lembrar que após a menopausa observa-se aumento do peso corporal

associado muitas vezes a maior prevalência de diabetes e dislipidemia (SOWERS & LA

PIETRA et al., 1995). De fato, a prevalência de síndrome metabólica (SM) que engloba

variáveis que aumentam o risco para as doenças cardiovasculares (REVISTA DA

SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2004), tais como, resistência à

insulina, intolerância à glicose, adiposidade abdominal, elevação de triglicerídeos

plasmáticos, baixos níveis de colesterol HDL, hipertensão e dislipidemia (LOPES et al.,

2005) aumenta após a menopausa. Vale ainda lembrar que outros fatores importantes no

desenvolvimento da SM são os maus hábitos alimentares, o tabagismo e principalmente,

a inatividade física (THE WORLD HEALTH REPORT, 2002; BASCIANO et al., 2005).

Neste sentido, estudos epidemiológicos sugerem que o aumento da prevalência da

SM pode estar correlacionado com o aumento do consumo de frutose, principalmente na

forma de xarope de milho (ELLIOT et al., 2002; FORRESTER et al., 2004; CORDAIN

2006). Esse açúcar tem sido altamente utilizado pelas indústrias alimentícias desde a

década de 60, sendo encontrado principalmente em cereais matinais, refrigerantes, pães e

condimentos (ELLIOT et al., 2002). A frutose é um monossacarídeo, predominantemente

metabolizado no fígado, e que vem sendo consumido em grandes quantidades nas últimas

décadas pela população em geral (BASCIANO et al., 2005; BRAY et al., 2004; BRAY,

2008). Dessa forma, seria interessante que o modelo experimental utilizado para estudar

alterações no sexo feminino após a menopausa, associasse disfunções metabólicas além

3

de hipertensão. Dados do nosso grupo demonstraram em ratas fêmeas submetidas à

sobrecarga de frutose um aumento da resistência à insulina correlacionada à redução do

tônus vagal (BRITO et al., 2008). Adicionalmente, evidenciamos que a sobrecarga de

frutose induziu aumento da PA e da modulação simpática cardiovascular em

camundongos machos (FARAH et al., 2006), os quais foram correlacionadaos à

disfunção e vacualização do epitélio tubular em tecido renal (CUNHA et al., 2006). Mais

recentemente, avaliando o curso temporal das alterações induzidas pelo consumo crônico

de frutose, demonstramos que a disfunção autonômica cardiovascular precede as

alterações em triglicerídeos, insulina e leptina em camundongos machos (DE ANGELIS

et al., 2012).

Apesar de estudos já terem evidenciado prejuízo fisiológico decorrente da

hipertensão em animais SHR, bem como em animais submetidos ao consumo de frutose,

não se conhecem bem as alterações metabólicas, cardiovasculares e autonômicas

decorrentes da associação desses dois modelos, principalmente no sexo feminino após a

privação dos hormônios ovarianos. Além disto, os possíveis mecanismos envolvidos

nessas possíveis alterações foram muito pouco estudados. Neste sentido, acreditamos que

alterações no estresse oxidativo, na biodisponibilidade do óxido nítrico e em marcadores

inflamatórios poderiam estar envolvidas nessas disfunções.

1.2. Estresse Oxidativo, Biodisponibilidade de Óxido Nítrico e Disfunções

Fisiológicas

O organismo humano sofre ação constante de espécies reativas de oxigênio (EROs)

geradas pelo processo de respiração e sinalização celular (KIM et al., 1996). As EROs

reagem com lipídeos e com proteínas das membranas celulares, além do DNA. Neste

aspecto, a lipoperoxidação ocasionadas pelas EROs podem alterar a permeabilidade,

secreção e morte celular (MEERSON et al., 1982), o que de fato pode promover também

mudanças na disposição de receptores de membrana. Portanto, em uma condição

biológica em que ocorre desequilíbrio entre a produção de EROSs e a sua desintoxicação

através de sistemas biológicos que as removam ou reparem os danos por elas causados

temos um quadro de estresse oxidativo (NORDMANN, 1994).

4

Por outro lado, na tentativa de minimizar os efeitos decorrentes do estresse oxidativo,

há em nosso organismo o sistema de defesa antioxidante, cuja função é inibir e/ou reduzir

os danos causados pela ação deletéria dos radicais livres e espécies reativas não

radicalares, atuando como sistema de prevenção, de varredura e de reparo (CLARKSON

e THOMPSON, 2000; KOURY et al., 2003). Esse sistema é dividido em não enzimático

e enzimático. O sistema não enzimático inclui os compostos antioxidantes de origem

dietética, entre os quais se destacam: vitaminas, minerais e compostos fenólicos. Já o

sistema enzimático é composto pelas enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase

(CAT) e glutationa peroxidase (GPx) (DORMANDY, 1978; SIES, 1986; SCHNEIDER e

OLIVEIRA, 2004). Estudos evidenciam o papel importante do estresse oxidativo na SM

principalmente relacionado ao desenvolvimento de doenças/disfunções como: o diabetes

tipo II, a obesidade, a hipertensão, a aterosclerose (CERIELLO e MOTZ, 2004) e a

resistência à insulina (FORD et al., 2003). Pacientes com SM apresentam aumento do

dano oxidativo e redução da defesa antioxidante, ou seja, diminuição da superóxido

dismutase (SOD), aumento da lipoperoxidação de membrana e dano a proteínas

(ARMUTCU et al., 2005, PALMIERI et al., 2006).

Neste sentido, foi observado um aumento do estresse oxidativo em pacientes com

hipertensão e diabetes associado a disfunções no endotélio vascular (CAI e HARRISON,

2000; ORIEN et al., 1999). Vale lembrar que as EROs quando geradas em grandes

quantidades causam uma diminuição expressiva do óxido nítrico (NO), o que induz

prejuízo na função endotelial e cardíaca (PANZA et al., 1990). O NO pode ser destruído

pelo radical superóxido e protegido por mecanismos antioxidantes como a enzima SOD

(RUBANYI & VANHOUTE, 1993; GRYGLEWSKI et al., 1986). Sugere-se ainda que o

aumento do NO e do ânion superóxido em situações de estresse exerça função em

alterações dos pressorreceptores (CHOWDHARY et al., 2000; DE ANGELIS et al.,

1999; LI et al., 1996; SHULTZ & USTINOVA, 1998). Além disto, é plausível que exista

uma associação entre moléculas bioativas liberadas a partir de tecido adiposo e o estresse

oxidativo, sendo essa associação responsável pelo menos em parte pelo desenvolvimento

de resistência à insulina e disfunção endotelial. Vários estudos relataram que a resistência

à insulina e a hiperinsulinemia aumentam a peroxidação lipídica e diminuem os

antioxidantes no plasma, sugerindo que os dois estejam interligados (MIZUNO et al.,

2004; XU et al.,1999). O aumento do estresse oxidativo foi ainda relacionado com um

aumento da insulina circulante e redução da concentração da CAT em animais (XU et al.,

5

1999). Essas e outras evidências têm levado muitos investigadores a sugerir que o

aumento excessivo de EROs pode ser considerado um mecanismo envolvido no

desenvolvimento de resistência à insulina, diabetes e doença cardiovascular.

No sexo feminino ocorre uma diminuição dos hormônios sexuais (estrógeno) após

a menopausa. Esses hormônios exercem um papel de proteção no sexo feminino. Além

disso, os maiores níveis de estrôgenio circulantes podem estar relacionados ao aumento

da síntese de NO (MONCADA et al. 1991; DUBEY, 1994; DUBEY et al., 1995). Em

nosso grupo evidenciamos aumento do estresse oxidativo após a ooferectomia,

caracterizada por aumento da lipoperoxidação de membrana e redução das enzimas CAT

e SOD em tecido cardíaco (ROLIM et al., 2007; DA PALMA, 2012). Entretanto, o perfil

de estresse oxidativo ainda necessita ser bem estudado na associação de fatores de riscos

em modelos experimentais, pincipalmente em tecidos alvo da hipertensão como o

coração e o rim.

1.3. Marcadores Inflamatórios e Disfunções Fisiológicas

A inflamação é uma reação biológica complexa do nosso organismo frente à

diversos estímulos prejudiciais, ou seja, é uma resposta do sistema imune para infecções e

traumas. Este processo pode ser rápido e agudo (injúria física transitória ou infecções) ou

lento e crônico (doenças autoimune), resultando em aumento significativo dos níveis

circulantes de marcadores inflamatórios (GABAY e KUSHNER, 1999; COLBERT et al.,

2004). A resposta inflamatória é sinalizada predominantemente por pequenas proteínas

ou peptídeos, algumas contendo glicoproteínas, chamadas de citocinas. Estas citocinas

podem ser classificadas nas seguintes categorias: interferon (IFN), interleucinas (IL),

fator estimulador de colônias (CSF), fator de necrose tumoral (TNFα e TNFβ) e fator de

transformação de crescimento (TGFβ) (WOODS et al., 2009). Nesse contexto, o sistema

imunológico tem sido alvo de grande interesse nos últimos anos para o entendimento da

doença cardiovascular (JANSZKY et al., 2004).

Neste sentido, o aumento de algumas citocinas pró-inflamatórias como o fator de

necrose tumoral alfa (TNFα) e a interleucina 6 (IL-6) foi associado ao aumento da

mortalidade por doença cardiovascular (RIDKER et al., 2000a; RIDKER et al., 2000b;

PRADHAN et al., 2002). Adicionalmente, há evidências que a SM possa contribuir para

6

uma piora no perfil inflamatório. Dessa forma, o reconhecimento do tecido adiposo como

um órgão ativo, permitiu o melhor entendimeno dos efeitos sistêmicos da SM, pois este

tecido produz e libera uma série de biomoléculas entre essas destaca-se: o TNF-α, a IL6,

a leptina, a adiponectina, a resistina, o inibidor do ativador de plasminogênio, a visfatina,

entre outras (ANTUNA PUENTE et al., 2008). A concentração de leptina circulantes está

altamente correlacionada com índices de adiposidade (índice de massa corporal e

percentual de massa gorda) em humanos e animais (MAFFEI et al., 1995; HAVEL et al.,

2005). Já a adiponectina, possui uma resposta contrária a da leptina e tem efeito anti-

inflamatório, pois esta promove a oxidação dos ácidos graxos e sensibiliza o corpo a

produzir insulina. Vale ressaltar que na obesidade ocorre a diminuição desse marcador

(YAMAUCHI et al., 2006; BERG et al., 2001).

De fato, estudos recentes sugerem que a inflamação decorrente do sistema

imunológico é uma característica da SM (KOH et al., 2005; NAKAGAWA et al., 2005).

Neste sentido, foi observada correlação negativa entre adiponectina e resistência à

insulina, bem como correlação positiva entre leptina plasmática e resistência à insulina

(TAPSELL et al., 2004). Além disso, um estudo experimental de GLUSHAKOVA et al.

(2008) com animais submetidos a uma dieta rica em frutose demonstrou alteração em

marcadores inflamatórios nos rins. Foi também observado aumento da resistência à

insulina acompanhada de aumento nos níveis de IL-6, bem como desrregulação de

adipocitocinas e leptina em ratos alimentados com uma dieta rica em frutose

(ARMUTCU et al., 2005).

Interessantemente, as alterações observadas com marcadores inflamatórios podem

estar associadas com disfunção autonômica. Neste sentido, a redução da VFC foi

associada com maiores níveis de TNF-α e IL-6 (BOSSENMAIER et al., 2000). No estudo

de Janszky et al. (2004) os autores demonstraram uma forte correlação dos níveis de IL-6

com a VFC em mulheres com doença coronariana.

Apesar de estudos já terem evidenciado prejuízo fisiológico decorrente da

hipertensão em animais SHR, bem como em animais submetidos ao consumo de frutose,

pouco se sabe sobre os efeitos decorrentes da associação de fatores de risco (hipertensão

+ frutose), principalmente no sexo feminino após a privação dos hormônios ovarianos.

Portanto, neste estudo buscamos testar a hipótese de que as alterações do controle

autonômico estão diretamente relacionadas ao aumento de marcadores inflamatórios e de

7

estresse oxidativo, além de redução da biodisponibilidade de óxido nítrico em ratas

ooforectomizadas hipertensas submetidas à sobrecarga de frutose.

1.4. Treinamento Físico e Manejo de Risco após a Menopausa

As constantes evidências dos benefícios cardiovasculares, metabólicos e

autonômicos após o exercício físico agudo e crônico têm levado muitos pesquisadores a

sugerir o treinamento físico como uma conduta não farmacológica em diferentes

patologias (PEDERSEN e SALTIN, 2006; HAGBERG et al., 2000).

Neste sentido, a adoção de um estilo de vida ativo tem sido preconizada,

principalmente no sexo feminino após a menopausa (MOSCA et al., 2007). Davi et al.

(1996) demonstraram melhora na sensibilidade barorreflexa e na VFC pós treinamento

físico aeróbio em mulheres menopausadas. Neste mesmo sentido, um estudo

experimental de nosso grupo com ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos

demonstrou bradicardia de repouso, normalização dos valores de PA e melhora da

sensibilidade dos pressorreceptores após 8 semanas de treinamento físico aeróbio

(IRIGOYEN et al., 2005). Estudos de nosso grupo em animais submetidos ao treinamento

físico aeróbio evidenciaram adicionalmente redução do estresse oxidativo e aumento das

enzimas antioxidantes que foram correlacionados com melhora em parâmetros

cardiovasculares e autonômicos, inclusive em ratas ooforectomizadas (IRIGOYEN et al.,

2005; BERTAGNOLI et al., 2006; BERTAGNOLI et al., 2008). Benefícios

cardiovasculares e autonômicos foram também observados por nosso grupo em ratas

diabéticas ooforectomizadas (SOUZA et al., 2007), dislipidêmicas ooforectomizadas

(HEEREN et al., 2009), bem como na associação de treinamento físico e reposição

hormonal (FLUES et al., 2010).

Alguns estudos têm mostrado o efeito anti-inflamatório do exercício físico. Lira et

al. (2009) demonstraram aumento da interleucina 10 (IL-10) e redução do TNF-α no

tecido adiposo após 8 semanas de treinamento físico aeróbio. Assim, observou-se um

aumento na razão IL-10/TNF alfa, esse índice tem sido adotado como indicador de estado

inflamatório em roedores. Além disso, estudos também demonstraram benefícios

associados ao treinamento físico em indivíduos saudáveis mostrando um aumento das

citocinas IL-6 e IL-10 e redução do TNFα (PETERSEN et al., 2005; FLYNN et al.,

2007). Resultados semehnates também foram observados em idosos (BRUUNSGAARD

8

et al., 2003). Já em pacientes com predisposição a SM, foi observado que o treinamento

físico aeróbio aumentou a adiponectina sérica (RING-DIMITROU et al., 2006). Por outro

lado, uma sessão de exercício resistido em indivíduos treinados não alterou o TNFα e a

IL-6 (BRUNELLI et al., 2014). Já em mulheres com síndrome metabólica este tipo de

exercício não promoveu aumento adicional nas citocinas pró-inflamatórias, bem como

não reduziu as citocinas anti-inflamatórias (PEREIRA et al., 2013). Em relação ao

treinamento físico resistido, Prestes et al. (2009) demonstraram em mulheres pós-

menopausa redução das concentrações de leptina e de IL-6 após 16 semanas de

treinamento físico.

Nota-se que os benefícios induzidos pelo treinamento físico aeróbio dinâmico,

estão bem descritos na literatura, no entanto, faz-se necessário um entendimento sobre os

mecanismos que poderiam explicar esses benefícios, principalmente no sexo feminino.

Embora o exercício aeróbio venha sendo o mais recomendado, as atuais diretrizes

indicam a inclusão de treinamento resistido para pessoas de todas as idades e para muitos

pacientes com doenças crônicas (POLLOCK et al., 2000; ACSM, 2003). Devido à

limitação da utilização do treinamento resistido, a literatura ainda carece de estudos sobre

o assunto e mesmo assim os achados ainda são controversos. Alguns benefícios também

podem ser observados após treinamento resistido como diminuição do peso corporal

(HAUSER et al., 2004) e melhora no controle metabólico (PRADO e DANTAS, 2002) e

da pressão arterial (MEDIANO et al., 2005); assim alterações cardiovascualares são

observadas após o exercício resistido como manutenção/ diminuição da pressão arterial

diastólica (FORJAZ et al., 1998) e aumento da modulação simpática cardíaca (FORJAZ

et al., 2003).

Acredita-se que em pacientes hipertensos a utilização do treinamento resistido é

um importante complemento ao treinamento aeróbio devido aos seus benefícios

osteomusculares (CARDOSO JR et al., 2010). Recentemente, em mulheres na pós

menopausa submetidas ao treinamento resistido observou-se diminuição da porcentagem

de tecido adiposo e aumento da massa muscular e da força (ORSATTI et al., 2010). O

treinamento resistido em pacientes com hipertensão essencial reduziu os níveis de TNF

alfa, aumentou enzimas antioxidantes e a biodisponibilidade de óxido nítrico

(AGARWAL et al., 2012). Benefícios metabólicos (colesterol, triglicerídeos), bem como

redução de PA sistólica, foram observados em pacientes diabéticos submetidos a um

portocolo de treinamento resistido durante 8 semanas (ARORA et al., 2009). Entretanto,

9

o papel do treinamento resistido em parâmetros autonômicos, no estresse oxidativo e em

marcadores inflamatórios após a privação dos hormônios ovarianos foi muito pouco

estudado na literatura. Neste sentido, o presente trabalho teve por objetivo testar a

hipótese que o treinamento físico aeróbio ou resistido induziria benefícios metabólicos,

cardiovasculares, autonômicos e na capacidade física relacionados à redução de

parâmetros inflamatórios e de estresse oxidativo em ratas ooforectomizadas hipertensas

submetidas à sobrecarga de frutose.

10

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da privação dos hormônios

ovarianos associado à hipertensão e ao consumo crônico de frutose em parâmetros

metabólicos, cardiovasculares, autonômicos, de inflamação e de estresse oxidativo.

Adicionalmente objetivou-se investigar os efeitos do treinamento físico dinâmico aeróbio

ou resistido nessa condição de associação de fatores de risco.

2.2. Objetivos Específicos

O presente estudo foi dividido em 4 objetivos específicos.

1) Avaliar os efeitos do consumo crônico de frutose em ratas ooforectomizadas

espontaneamente hipertensas em parâmetros:

metabólicos (peso corporal e do tecido adiposo branco visceral, glicemia e

triglicerídeos sanguíneos, sensibilidade à insulina);

hemodinâmicos (pressão arterial e frequência cardíaca);

de modulação autonômica cardiovascular (variabilidade da frequência cardíaca e

da pressão arterial);

de inflamação no tecido cardíaco (TNF-α, IL-6 e IL-10);

e de estresse oxidativo cardíaco (lipoperoxidação por quimiluninescência, balanço

redox pela razão glutationa oxidada/reduzida, proteínas carboniladas, catalase,

glutationa peroxidase e superóxido dismutase).

(Artigo 1)

11

2) Investigar os efeitos do treinamento físico aeróbio em ratas ooforectomizadas

espontaneamente hipertensas submetidas ou não à sobrecarga de frutose em

parâmetros:

hemodinâmicos (pressão arterial e frequência cardíaca);

de regulação autonômica cardiovascular (tônus simpático, tônus vagal e

frequência cardíaca intrínseca; variabilidade da frequência cardíaca e da pressão

arterial);

e metabólicos (peso corporal e do tecido adiposo branco visceral, glicemia e

triglicerídeos sanguíneos, sensibilidade à insulina).

(Artigo 2)

3) Investigar os efeitos hemodinâmicos, vasculares, autonômicos e renais do

treinamento físico aeróbio ou resistido em ratas ooforectomizadas

espontaneamente hipertensas submetidas à sobrecarga de frutose, avaliando

parâmetros:

hemodinâmicos (pressão arterial sistólica, diastólica e frequência cardíaca);

de modulação autonômica vascular (variabilidade da pressão arterial);

de sensibilidade dos pressorreceptores;

de metabolização de óxido nítrico (concentração de nitritos e nitratos

plasmáticos);

de estresse oxidativo no tecido renal (lipoperoxidação por TBARS, proteínas

carboniladas, catalase e superóxido dismutase).

(Artigo 3)

12

4) Investigar os efeitos metabólicos, cardíacos e autonômicos do treinamento físico

aeróbio ou resistido em ratas ooforectomizadas espontaneamente hipertensas

submetidas à sobrecarga de frutose, avaliando parâmetros:

metabólicos (peso corporal e do tecido adiposo branco visceral, glicemia e

triglicerídeos sanguíneos, sensibilidade à insulina);

de capacidade física (teste máximo de corrida em esteira e teste de carga máxima

em escada);

hemodinâmicos (pressão arterial média e frequência cardíaca);

de modulação autonômica cardíaca (variabilidade da frequência cardíaca);

de inflamação no tecido cardíaco (TNF-α, IL-6, IL-10, leptina e adiponectina);

e de estresse oxidativo no tecido cardíaco (lipoperoxidação por

quimiluminescência, balanço redox pela razão glutationa oxidada/reduzida,

proteínas carboniladas, catalase, glutationa peroxidase, superóxido dismutase e

potencial antioxidante total).

(Artigo 4)

13

3. RESULTADOS

Os resultados são apresentados em 4 artigos científicos.

- Artigo 1. Cardiovascular autonomic dysfunction and oxidative stress induced by

fructose overload in an experimental model of hypertension and menopause.

- Artigo 2. Cardiometabolic benefits of exercise training in an experimental model of

metabolic syndrome and menopause.

- Artigo 3. Treinamento físico aeróbio ou resistido melhora o controle autonômico da

circulação em ratas ooforectomizadas com disfunção cardiometabólica: impacto no

estresse oxidativo renal.

- Artigo 4. Treinamento físico resistido ou aeróbio atenua a disfunção autonômica

cardíaca em um modelo de menopausa e sindrome metabólica: papel da inflamação e do

estresse oxidativo.

14

3.1. Artigo 1 - Submetido para a revista Diabetes, Obesity and Metabolism - Qualis: A1

(Educação Física) (Anexo 2)

CARDIOVASCULAR AUTONOMIC DYSFUNCTION AND OXIDATIVE

STRESS INDUCED BY FRUCTOSE OVERLOAD IN AN EXPERIMENTAL

MODEL OF HYPERTENSION AND MENOPAUSE

O objetivo deste artigo foi verificar os efeitos do consumo crônico de frutose em

ratas ooforectomizadas espontaneamente hipertensas em parâmetros metabólicos,

hemodinâmicos, de modulação autonômica cardiovascular, de inflamação e de estresse

oxidativo cardíaco.

Vale ressaltar que este artigo nos permitiu compreender os efeitos da sobrecarga de

frutose frente a um modelo com associação de fatores de risco (hipertensão +

menopausa + frutose) e os possíveis mecanismos que poderiam explicar tal fenômeno.

15

MÉTODOS

Ratas fêmeas SHRs com 21 dias foram obtidas do Biotério do Instituto de

Cardiologia do Rio Grande do Sul. As ratas foram divididas em grupos: hipertenso (H;

n=8), hipertenso ooforectomizado (HO; n=8) e hipertenso ooforectomizado submetidos à

sobrecarga de frutose (FHO; n = 8). Todos os procedimentos foram aprovados pelo

Comitê de Ética da Universidade Nove de Julho (Protocolo AN002/12) e foram

conduzidos de acordo com o Guia para Cuidados e Uso de Animal de Laboratório,

publicado pelo Instituto Nacional de Saúde.

Sobrecarga de Frutose

As ratas FHO receberam D-frutose (100 g/L) na água de beber por 19 semanas.

Os animais H e HO receberam ração e água ad libitum. O consumo de ração e água (com

ou sem frutose) foi mensurado semanalmente.

Ooforectomia

Após 10 semanas de sobrecarga de frutose, os animais foram anestesiados (80

mg/kg cetamina e 12 mg/kg xilazina), e os ovidutos foram seccionados e os ovários

removidos com descrição detalhada em artigos previamente publicados (IRIGOYEN et

al., 2005; FLUES et al., 2010; SOUZA et al., 2007). Dados do nosso laboratório têm

demostrado que a concentração de estrógeno medida por meio do método de imunoensaio

foi de 39±7 pg/mL em ratas fêmeas saudáveis. Entretanto, no presente estudo, a

concentração de estrogênio não foi detectável em nossos grupos ooforectomizados,

confirmando assim a privação de hormônios ovarianos (FLUES et al., 2010).

16

Avaliações metabólicas

Ao final do protocolo (19 semanas de sobrecarga de frutose), foram medidas as

concentrações de glicose e triglicerídeos no sangue (Accucheck and Accutrend, Roche)

após 4 horas de jejum. Para testar a intolerância à insulina, com jejum de 2 horas, os ratos

foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg peso corporal, IP). Uma gota de

sangue foi coletada da cauda do animal para medida de glicose no sangue no início, 4, 8,

12 e 16 minutos após a injeção de insulina (0,75 U/kg). A constante de decaimento da

glicose sanguínea (KITT) foi calculada pela fórmula 0,693/t1,2. A constante de

decaimento da glicose sérica (Kitt) foi calculada pela inclinação da reta obtida através da

análise dos mínimos quadrados das concentrações na fase linear de declínio (BRITO et

al., 2008; BONORA et al., 1989).

Avaliações cardiovasculares

Após a avaliação metabólica, as ratas foram anestesiadas com cetamina (80

mg/kg) e xilazina (12 mg/kg), e foram implantadas duas cânulas de polietileno Tygon na

artéria carótida e veia jugular para medidas diretas de PA e administração de drogas,

respectivamente. Durante o experimento, as ratas receberam ração e água ad libitum. As

ratas estavam conscientes nas caixas e podiam circular livremente durante a avaliação

hemodinâmica. A cânula arterial foi conectada a um transdutor (Pressão Arterial XDCR,

Kent Scientific), e os sinais de pressão arterial foram registrados durante um período de

30 minutos utilizando equipamento microcomputador com conversor digital (CODAS,

2Kz, DATAQ Instruments). Os dados registrados foram analisados batimento a

batimento para quantificar mudanças de pressão arterial sistólica (PAS), diastólica

(PAD), pressão arterial média (PAM) e frequência cardíaca (FC) (SANCHES et al., 2012;

IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010).

17

Avaliações autonômicas

A análise no domínio do tempo consistiu em um cálculo de intervalo de pulso (IP)

e da PAS, com a variabilidade do IP e a variabilidade da PAS medidas a partir do seu

respectivo tempo de série (três séries de cinco minutos, para cada animal). Para a análise

no domínio da frequência, a mesma série temporal de IP e PAS foram interpolados por

splineY cúbico (250 Hz). A densidade espectral de potência foi obtida através da

transformação rápida de Fourier (FFT). A potência espectral das bandas de baixa

frequência (BF; 0,20-0,75 Hz) e alta frequência (AF; 0,75-4,0 Hz) foram calculadas pela

integração de densidade da potência espectral dentro de cada banda de frequência usando

rotina padronizada (MATLAB 6.0, Mathworks) (SOARES et al., 2004).

Marcadores inflamatórios

Os níveis de IL-6, IL-10 e TNF-α foram avaliados em tecido cardíaco utilizando

kit comercial ELISA (R&D Systems Inc.), de acordo com as informações do fabricante.

O ELISA foi realizado em microplacas de poliestireno de 96 poços com um anticorpo

monoclonal específico de revestimento. A sensibilidade do ensaio foi de 15pg/ml. A

absorbância foi medida a 540nm em um leitor de microplacas.

Perfil de estresse oxidativo

Um dia após as avaliações hemodinâmicas os animais foram eutanasiados e o

coração (ventrículos) foi imediatamente retirado, lavado com soro fisiológico, e aparado

para remover o tecido de gordura e tecido conjuntivo visível. O tecido foi cortado em

pequenos pedaços, colocada em tampão gelado, e homogeneizados em um

homogenizador de tecidos -Ultra-Turrax, na proporção de 1g de tecido por 5mL de

150mM de KCl e 20nM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4. O homogeneizado foi

centrifugado a 600 g durante 10min à 4ºC.

18

Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS): Para o ensaio TBARS, o ácido

tricloroacético (10%, p/v) foi adicionado ao homogeneizado para precipitar as proteínas e

para acidificar as amostras (BUEGE et al., 1978). Esta mistura foi, em seguida,

centrifugada (10000 g, 3 min), e a amostra livre de proteína foi extraída. O ácido

tiobarbitúrico (0,67%, p/v) foi adicionada ao meio de reação. Os tubos foram colocados

num banho de água (100°C) durante 15 min. As absorbâncias foram medidas a 535nm

usando um espectrofotômetro. Os resultados são expressos como nanomoles por

miligrama de proteína.

Quimiluminescência (QL): A lipoperoxidação de membrana foi avaliada adicionalmente

por quimiluminescência. A quimiluminescência foi medida em um contador beta

(TriCrab 2800TR, PerkinElmer) com o circuito de coincidência desconectado e

utilizando o canal de trítio 1215 (LKB Producer AB, USA) em temperatura ambiente. O

homogenizado cardíaco foi diluído em 140 mM KCl e 20 mM tampão fosfato de sódio,

pH 7,4. Foi adicionado aos frascos de cintilação 3 mM de hidroperóxido de tert-butil e a

quimiluminescência foi determinada pelo nível máximo de emissão (IRIGOYEN et al.,

2005; GONZALES et al., 1991).

Atividade das enzimas antioxidantes: A quantificação da atividade da superóxido

dismutase (SOD) expressada como U/mg de protein e foi baseada na inibição da reação

do ânion superóxido e do pirogalol (MARKLUND, 1985). A concentração da catalase

(CAT) foi determinada pela diminuição do peróxido de hidrogênio na absorbância de

240nm. A concentração da CAT foi expressa como μmol H2O2 reduzido/min/mg protein

(AEBI, 1984). A atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi expressa como nmol

peróxido/hidroperóxido reduzido/min/mg protein e foi baseada no consumo de NADPH

à 480 nm (FLOHE & GUNZLER, 1984).

19

Concentração de Glutationa total e GSSG: Para determiner a glutationa oxidada (GSSG)

e a concentraação da glutationa total (GSH), o tecido foi homogenizado em 2M de ácido

perclórico e centrifugado à 1000 g durante 10min, e 2M KOH foi adicionado ao

sobrenadante. A reação média continha 100mM de tampão fosfato (pH 7,2), 2mM de

NADPH, 0,2U/mL de glutationa redutase e 70μMácido 2,2'-dinitro-5-5'-ditio-dibenzóico.

Para determinar a concentração de GSSG o sobrenadante foi neutralizado com 2M KOH

e inibido por adição de 5μM N-etilmaleimida. A absorbância foi lida à 420nm

(ANDERSON, 1985). Os valores de GSH reduzida foram determinados a partir da

subtração da concentração total de glutationa da concentração de GSSG.

Análise estatística

Os dados são expressos como media±erro padrão da media. O teste Levene foi

usado para avaliar a homogeneidade das variâncias. A análise de variância de um

caminho seguida do teste de Student-Newman-Keuls foi usado para comparar os grupos.

A análise de correlação de Pearson foi usada para identificar a associação entre as

variáveis. Nível de significância estabelecido foi P≤0,05.

RESULTADOS

O peso corporal e o peso do tecido adiposo branco visceral foram maiores no

grupo FHO quando comparado aos outros grupos. A glicemia foi similar entre os grupos.

Os triglicerídeos sanguíneos foram maiores no grupo FHO quando comparado com todos

os outros grupos. A sensibilidade à insulina foi menor no grupo FHO quando comparado

ao grupo H (Tabela 1).

20

Taquicardia de repouso foi observada no grupo FHO quando comparado com os

outros grupos. A PAD e a PAM foram maiores no grupo HO quando comparado ao grupo

H e o grupo FHO teve um aumento adicional na PAS, PAD e PAM (Tabela 2).

O desvio padrão (DP) e a variância (VAR) total do IP foram menores no grupo

FHO quando comparado com o grupo HO. A VAR total da PAS foi maior no grupo HO

em relação ao grupo H. A VAR e a banda de baixa frequência da PAS foram maiores no

grupo FHO quando comparado com todos os grupos estudados (Tabela 2).

O TNF alfa foi maior no grupo FHO quando comparado com todos os grupos e a

IL10 foi menor no grupo FHO quando comparado com o grupo H.

Correlação negativa foi observada entre o peso do tecido adiposo branco visceral

e a IL10 nos grupos estudados (r= - 0,6) (Figura 1).

O TBARS foi maior em nos grupos HO e FHO em relação ao grupo H; e um

aumento adicional no TBARS foi observado nos animais do grupo FHO em relação aos

animais do grupo HO. Além disso, a QL estava aumentada no grupo FHO quando

comparada com todos os grupos. A privação dos hormônios ovarianos promoveu um

aumento na concentração da CAT e a sobrecarga de frutose promoveu um aumento

adicional neste parâmetro. Não observamos qualquer diferença na atividade da SOD entre

os grupos. A GPx foi menor no grupo HO quando comparado com o grupo H, e a

sobrecarga de frutose promoveu um aumento adicional neste parâmetro (Tabela 4).

21

Tabela 1. Avaliações metabólicas nos grupos estudados.

H HO HFO

Peso Corporal (g) 197±2 264±3† 261± 2†#

Tecido Adiposo Branco

Visceral (g)

1,91±0,16 2,96±0,45 5,25±0,39†¥

Glicemia (mg/dL) 83±5,0± 84±2,0 92±2,1

Triglicerídeos (mg/dL) 132±4,0 125±6,4 160±8,0†¥

KITT (%/min) 4,15±0,26 4,69±0,33 3,4±0,28†

Dados são apresentados como média±EPM. †P<0,05 vs. H; ¥ P<0,05 vs HO. KITT:

constante de decaimento da glicose sanguínea.

22

Tabela 2. Avaliações hemodinâmicas e autonômicas nos grupos estudados.

H HO FHO

PAS (mmHg) 174±5 183±6 206±4†¥

PAD (mmHg) 121±7 144±5† 153±2†¥

PAM (mmHg) 146±6 164±5† 174±4†¥

FC (bpm) 352±13 348±16 403±12†¥

VFC

DP (ms) 6,62±0,61 8,63±1,00 5,43±0,96¥

VAR (ms²) 53,97±7,98 63,64±10,34 30,84 ±6,81¥

BF (ms²) 3,18±0,55 3,94±0,97 0,90±0,12¥

AF (ms²) 5,97±1,41 9,22±2,03 2,77±0,18¥

VPA

VAR (mmHg²) 31,08±2,66 51,94±6,94† 77,79±11,87†¥

BF (mmHg²) 5,06±0,91 5,07±0,52 10,62±2,33†¥

Dados são apresentados como média±EPM. †P<0,05 vs. H; ¥ P<0,05 vs. HO. PAS: pressão

arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; MAP: pressão arterial média; FC:

frequência cardíaca; VFC: variabilidade da FC; VPA: variabilidade da pressão arterial

sistólica computada de 0,20 à 3 Hz (potência total). DS: desvio padrão; VAR: variância total;

BF: banda de baixa frequência (0,20-0,75 Hz); AF: banda de alta frequência (AF: 0,75-4 Hz).

23

Tabela 3. Marcadores inflamatórios no tecido cardíaco nos grupos estudados.

H HO FHO

TNF α (pg/mg proteína) 32,9±7,5± 31,7±8,6 65,8±9,9¥†

IL-6 (pg/mg proteína) 379±27 368±26 401±35

IL-10 (pg/mg proteína) 37,1±9,0 29,6±3,4 16,2±2,5†

Dados são apresentados como média±EPM. †P<0,05 vs. H; ¥ P<0,05 vs. HO. TNFα:

fator de necrose tumoral; IL-6: interleucina 6; IL-10: interleucina 10.

24

Tabela 4. Avaliações de estresse oxidativo no tecido cardíaco nos grupos estudados.

HS HO FHO

TBARS

(µmol/mg proteína) 4,95±0,89 8,27±0,98† 12,03±0,93†¥

QL

(cps/mg proteína) 6661±566 6514±547 15043±1333†¥

CAT

(nmol/mg proteína) 0,29±0,04 0,47±0,05† 0,63±0,05†¥

SOD

(USOD/mg proteína) 11,47±0,37 11,17±0,41 13,05±0,86

GPx

(nmol/min/mg proteína) 54,78±3,10 38,55±1,67† 63,39±5,52¥

GSH/GSSG

(nmol/min/mg proteína) 11,07±0,7 13,00±1,4 8,94±0,8¥

Dados são apresentados como média±EPM.†P<0,05 vs. H; ¥ P<0,05 vs. HO. TBARS:

substância reativas ao ácido tiobarbitúrico; QL: quimiluminescência; CAT: catalase;

SOD: superóxido dismutase; GPx: glutationa peroxidase; GSH/GSSG: glutationa

oxidada/reduzida.

25

Figura

Figura 1. Correlação de Pearson (r = -0,6; p<0,05) obtida entre o tecido adiposo branco

visceral e os níveis de IL-10 em todos os grupos estudados.

26

3.2. Artigo 2 – Publicado na revista Menopause - Qualis: A2 (Educação Física) (Anexo

3).

CARDIOMETABOLIC BENEFITS OF EXERCISE TRAINING IN AN

EXPERIMENTAL MODEL OF METABOLIC SYNDROME AND MENOPAUSE

O objetivo deste artigo foi investigar os efeitos cardiometabólicos do treinamento

físico em ratas hipertensas ooforectomizadas submetidas ou não a sobrecarga de frutose.

Vale ressaltar que este artigo nos permitiu compreender os efeitos do treinamento

físico aeróbio em um modelo experimental de menopausa e hipertensão associado ou não

ao consumo crônico de frutose em parâmetros metabólicos, cardiovasculares e

autonômicos. Esse artigo, no entanto, não avaliou os possíveis mecanismos

desencadeados ou concomitantes a melhora autonômica observada nos grupos treinados

(Anexo 3).

27

MÉTODOS

Amostra

Foram utilizadas ratas SHR fêmeas com 21 dias obtidas do Biotério do Instituto

de Cardiologia do Rio Grande do Sul. Os animais foram divididos em grupos:

ooforectomizado hipertenso sedentário (SHO; n=7), ooforectomizado hipertenso treinado

(THO; n=7), ooforectomizado hipertenso sedentário submetido à sobrecarga de frutose

(SHOF; n=7), ou ooforectomizado hipertenso treinado submetido à sobrecarga de frutose

(THOF; n=7). Todos os protocolos e procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo

Comitê de Ética (Protocolo 064/2006) e foram conduzidos de acordo com o Guia para

Cuidados e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde.

Sobrecarga de frutose

Os grupos SHOF e THOF receberam D-frutose (100g/L) na água de beber durante

19 semanas. Já os grupos SHO e THO receberam água e comida padrão do laboratório ad

libitum. O consumo de comida e água (com ou sem frutose) foi mensurado

semanalmente. A ingestão calórica total foi calculada considerando que 2,89 kcal podem

ser obtidos a partir de cada grama consumida de comida e que 4,0 kcal podem serobtidos

a partir de cada grama de frutose ingerida (BRITO et al., 2008).

Ooforectomia

Depois de 10 semanas de sobrecarga de frutose, os animais foram anestesiados

(80mg/kg cetamina e 12 mg/kg xilazina), os ovidutos foram seccionados e os ovários

removidos como já descritos em artigos previamente publicados (IRIGOYEN et al.,

2005; FLUES et al., 2010; SOUZA et al., 2007). Dados do nosso laboratório tem

demostrado que a concentração de estrógeno medida por meio do método de imunoensaio

28

foi de 39±7 pg/mL em ratas fêmeas saudáveis. Entretanto, no presente estudo, a

concentração de estrogênio não foi detectável em nossos grupos ooforectomizados,

confirmando assim a privação de hormônios ovarianos (FLUES et al., 2010).

Protocolo de treinamento físico

Todos os animais foram adaptados na esteira (10min/dia; 0,3 km/h) durante 1

semana antes de iniciar o protocolo de treinamento físico. Os animais sedentários e

treinados foram submetidos a um teste máximo na esteira, como descrito previamente

(RODRIGUES et al., 2007). Os testes de esforço foram realizados após 11 semanas de

sobrecarga de frutose antes do início do treinamento e na quarta e oitava semana de

treinamento físico. O objetivo destes testes foi determinar a capacidade física e a

intensidade do treinamento físico.

Depois de 11 semanas de sobrecarga de frutose, o treinamento físico foi realizado

em uma esteira rolante (Imbramed TK-01) com intensidade baixa à moderada

(aproximadamente 50%-60% da velocidade máxima de corrida) durante 1 hora por dia, 5

dias da semana durante 8 semanas, com um aumento gradual na velocidade de 0,3 à 1,2

km/h (IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010; SOUZA et al., 2007).


Ao final do protocolo (19 semanas de sobrecarga de frutose), as concentrações de

glicose e triglicerídeos sanguíneos foram mensuradas (Accucheck e Accutrend, Roche)

depois de 4 horas em jejum. Para o teste de tolerância à insulina os animais ficaram em

jejum por 2 horas e foram anestesiados utilizando pentobarbital sódico (40mg/kg peso

corporal, i.p). Uma gota de sangue foi coletada da cauda para mensuração dos níveis de

glicose no basal, 4, 8, 12 e 16 minutos após a injeção de insulina (0,75 U/kg). A taxa

constante do decaimento da glicose sanguínea (KITT) foi calculada utilizando a fórmula

29

0,693/ t1/2. A glicemia t1/2 foi calculada pela inclinação dos mínimos quadrados da

concentração de glicose sanguínea durante uma fase linear do declínio (BRITO et al.,

2008; BONORA et al., 1989).

Mensurações cardiovasculares

Depois das avaliações metabólicas, os animais foram anestesiados utilizando

cetamina (80mg/kg) e xilazina (12mg/kg) e duas cânulas de polietileno contendo heparina

e salina foram implantadas na artéria carótida e na veia jugular para medida direta da

pressão arterial e administração de drogas, respectivamente. Durante os experimentos, os

animais receberam água e comida ad libitum; os animais estavam conscientes em suas

caixas e foi permitido livre movimentação durante o experimento hemodinâmico. A

cânula arterial foi conectada a um transdutor (Blood Pressure XDCR, Kent Scientific), e

os sinais de pressão arterial foram gravados durante 30 minutos utilizando um

microcomputador equipado com um conversor analógico para digital (CODAS, 2Kz,

DATAQ Instruments). Os dados gravadosforam analisados batimento a batimento para

quantificar as mudanças na pressão arterial sistólica (PAS), diastólica, e média (PAM) e

frequência cardíaca (FC) (IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010; SOUZA et al.,

2007; BRITO et al., 2008).


O tônus vagal, o tônus simpático e a frequência cardíaca intrínseca do coração

(FCI) foram medidos por determinação da resposta de metilatropina (3mg/kg, i.v.) e

propranolol (4mg/kg, i.v.), descrito em detalhes em outros artigos, depois do registro da

PA basal (SOUZA et al., 2007; BRITO et al., 2008).

A análise no domínio do tempo consistiu no cálculo da média do intervalo de

pulso (IP) e PAS, com a variabilidade do IP e variabilidade da PAS como o desvio padrão

30

dos respectivo trechos (três séries de 5 minutos para cada animal). Para a análise no

domínio da frequência, o mesmo tempo de série do IP e da PAS foram interpolados por

splineY cúbico (250 Hz). A densidade espectral de potência foi obtida através da

transformação rápida de Fourier (FFT). A potência espectral das bandas de baixa

frequência (BF; 0.20-0.75 Hz) e alta frequência (AF;0.75-4.0 Hz) foram calculadas pela

integração de densidade da potência espectral dentro de cada banda de frequência usando

rotina padronizada (MATLAB 6.0, Mathworks). Valores batimento à batimento da PAS e

do IP foram usados para estimar a sensibilidade barorreflexa cardíaca através da análise

espectral, utilizando o índice alfa para a banda de baixa frequência (0,20-0,75 Hz). A

coerência entre o intervalo de pulso e o sinal da variabilidade da PAS foi avaliada através

de uma análise espectral cruzada. O índice alfa foi calculado somente quando a

magnitude da coerência entre os sinais do IP e da PAS excedido 0,5 (variação, 0-1) na

banda de baixa frequência. Após o cálculo da coerência, o índice alfa foi obtido a partir

da raiz quadrada da relação entre IP e a variabilidade PASnas duas maiores bandas de

baixa frequência (SOARES et al, 2004).

Análise Estatística

Os dados estão apresentados como média±erro padrão da média. A análise de

variância de dois caminhos seguido do teste Student-Newman-Keuls foi usado para

comparação dos grupos. O nível de significância estabelecido foi P<0,05.

31

RESULTADOS

Sobrecarga de fructose

Os animais submetidos à sobrecarga de fructose apresentaram maior ingestão de

líquido diariamente (SHOF: 42±3,04mL por rato; THOF: 38±3,6mL por rato) e menor

consumo diário de comida (SHOF: 13±0,37g por rato; THOF: 13±0,49 por rato) nas

últimas 10 semanas de protocolo em relação aos seus respectivos controles (SHO:

29±0,96mL e 20±0,65g por rato; THO: 26±3,42mL e 18±0,74g por rato; P<0,05). A

ingestão calórica promovida pela fructose não foi diferente entre os grupos SHOF

(17±0,38 kcal/dia) e THOF (15±0,27kcal/dia; P <0,05). Os animais submetidos à

sobrecarga de fructose (SHOF: 36± 1,09kcal/dia; THOF: 36± 1,41 kcal/dia) apresentaram

menor ingestão calórica proveniente da comida quando comparado com os controles

(SHO: 56± 1,24kcal/dia; THO: 51± 2,36kcal/dia; P<0,05), entretanto, a ingestão calórica

(quilocalorias de fructose + quilocalorias de comida) não foi diferente entre os grupos

estudados (SHO: 56±1,24 kcal/dia; THO: 51±2,36 kcal/dia; SHOF:53±1,25 kcal/dia;

THOF: 51±1,51 kcal/dia; P>0,05).

Capacidade física

O teste máximo na esteira foi usado para avaliar a capacidade física aeróbia. No

início do experimento, a capacidade física foi similar entre os grupos estudados (SHO:

2,46±0,06km/h; THO: 2,49±0,08km/h; SHOF: 2,55km/h; THOF: 2,56±0,08km/h;

P>0,05). Entretanto, depois da 4ª e 8ª semana de treinamento físico, os animais treinados

(THO e THOF) demonstraram um aumento da velocidade máxima de corrida

comparados com os animais sedentários (SHO e SHOF; quarta semana: SHO vs. THO:

2,34±0,08 vs. 2,92±0,17km/h; P<0,05; SHOF vs. THOF: 2,41±0,15 vs. 2,89±0,07km/h;

32

P<0,05; oitava semana: SHO vs. THO: 2,34±0,06 vs. 3,09±0,15km/h; P<0,05; SHOF vs.

THOF, 2,2±0,1 vs. 2,87±0,03km/h; P<0,05).


As avaliações metabólicas são apresentadas na Tabela 5. Todos os grupos

demonstraram maior peso corporal ao final do protocolo quando comparados com os

valores no início do protocolo; entretanto, não foram observadas diferenças no peso

corporal entre os grupos. O tecido adiposo branco visceral foi maior no grupo SHOF do

que nos outros grupos estudados. O grupo SHOF demonstrou aumento da glicemia e

triglicerídeos quando comparado com o grupo SHO. Não houve diferença no tecido

adiposo branco visceral, glicemia e triglicerídeos entre os grupos SHO e THOF (P>0,05).

Além disso, o grupo SHOF demonstrou menor sensibilidade à insulina, o que foi

evidenciado pela redução no KITT. Dessa forma, o treinamento físico foi eficaz em

normalizar os valores de KITT no grupo THOF (Figura 2).


Como demonstrado na Tabela 6, o treinamento físico foi eficaz em reduzir os

valores de PAS, PAD e PAM no grupo THO quando comparado com o grupo SHO. A

sobrecarga de fructose induziu aumento na PAS e PAM nos grupos SHOF e THOF

quando comparados com os grupos SHO e THO, respectivamente. Os animais do grupo

SHOF apresentaram taquicardia de repoem relação aos animais do grupo SHO. Não

foram observadas diferenças na FC entre os grupos SHO e THOF.


O treinamento físico aumentou o tônus vagal no grupo THO quando comparado

com o grupo SHO. A sobrecarga de frutose reduziu o tônus vagal dos animais dos grupos

33

SHOF e THOF em relação aos animais SHR tratados com água (SHO e THO). O grupo

SHOF teve um aumento significante do tônus simpático quando comparado com o grupo

SHO. O treinamento físico, entretanto, foi eficaz em reduzir tônus simpático no grupo

THOF em relação ao grupo SHOF. A FCI foi maior no grupo THO em relação ao grupo

SHO. A sobrecarga de frutose induziu redução da FCI nos grupos SHOF e THOF quando

comparados com os SHR tratados com água (SHO e THO), respectivamente.

Em relação à avaliação da modulação autonômica no domínio do tempo e da

frequência, não foram observadas diferenças na variância total do IP entre os grupos

estudados (SHO: 79,93±14,05ms2; SHOF: 67,37±13,57ms

2; THOF: 46,30±10,51ms

2;

P>0,05). O RMSSD (raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças entre

intervalos adjacentes), um indicador da atividade parasimpática, foi similar entre os

grupos SHO e SHOF (5,90±0,81 e 3,33±0,40ms, respectivamente; P>0,05), mas foi

menor no grupo THOF quando comparado com o grupo THO (4,22±0,49 vs

7,42±0,75ms, respectivamente; P<0,05). O consumo de frutose induziu uma significante

redução na banda de baixa frequência do IP (SHO: 3,94±0,97 ms2; THO: 5,31±1,15ms

2

vs SHOF: 0,88±0,06ms2; THOF: 1,74±0,26ms

2; P<0,05) e na banda de alta frequência do

IP (SHO: 9,22±2,03ms2; THO: 11,57±1,45ms

2 vs SHOF: 3,20±0,80ms

2; THOF:

4,24±0,65ms2; P<0,05) nos grupos hipertensos submetidos à sobrecarga de frutose

(SHOF e THOF) em relação aos grupos somente hipertensos (SHO e THO; Figura. 3A-

C).

Não houve diferença na variância total da PAS entre os grupos (SHO:

51,94±6,94mmHg2; THO: 43,21±7,14mmHg

2; SHOF: 77,79±11,87mmHg

2; THOF:

64,94±7,68mmHg2; P>0,05). Entretanto, o consumo de frutose induziu um aumento

significante na banda de baixa frequência da PAS no grupo SHOF (10,62±2,33mmHg2)

quando comparado com o grupo SHO (5,07±0,52mmHg2; P<0,05). O treinamento físico

34

foi eficaz em reduzir a banda de baixa frequência da PAS no grupo THOF

(4,95±0,68mmHg2; P<0,05) em relação ao grupo SHOF, normalizando a modulação

simpatico vascular (Figura 3D).

A sobrecarga de frutose induziu redução no índice alfa, um indicador da

sensibilidade barorreflexa espontânea, no grupo SHOF (0,29±0,03ms/mmHg) quando

comparado com o grupo SHO (0,79±0,11ms/mmHg; P<0,05). O treinamento físico

induziu aumento no índice alfa em ambos os grupos treinados quando comparados com

os seus respectivos pares sedentários. Entretanto, o índice alfa foi menor no grupo THOF

(0,67±0,09ms/mmHg) comparado com o grupo THO (1,13±0,13ms/mmHg; P<0,05;

Figura 3E).

35

Tabela 5. Avaliações metabólicas nos grupos estudados.

Grupos

Parâmetros SHO THO SHOF THOF

Peso Corporal (g)

Inicial 193±3 186±2 193±3 195±3

Final 264±3# 262±4# 261±2# 264±5#

Tecido adiposo branco

visceral (g)

Final 3,7±0,18 3,6±0,22 4,4±0,20 *‡ 3,7±0,19 †

Glicemia (mg/dL)

Final 84±2 81±1 92±2 * 79±2 †

Triglicerídeos (mg/dL)

Final 125±6 127±10 160±8 * 148±7

Dados são apresentados como média ± EPM. Início: 10 semanas depois do protocolo;

Final: Ao final do protocolo. SHO: ooforectomizado hipertenso sedentário; THO:

ooforectomizado hipertenso treinado; SHOF: ooforectomizado hipertenso sedentário

submetido a sobrecarga de frutose; THOF: ooforectomizado hipertenso treinado

submetido a sobrecarga de frutose (n=7 em cada grupo). #p<0,05 vs. 10 semanas depois

do incio do protocolo no mesmo grupo; *p<0,05 vs. SHO; †p<0,05 vs. SHOF; ‡p<0,05

vs. THO

36

Tabela 6. Avaliações cardiovasculares e autonômicas nos grupos estudados.

Grupos

Parâmetros

SHO THO SHOF THOF

Pressão arterial sistólica (mmHg) 183±6 164±3 * 198±5 * 207±3 †

Pressão arterial diastólica (mmHg) 144±5 128±3 * 151±4† 151±3 †

Pressão arterial média (mmHg) 162±5 146±3 * 174±4 * 178±2 †

Frequência cardíaca (bpm) 348±16 332±9 398±14 * 343±16 ‡

Tônus vagal (bpm) 35±7 52±5 * 5±3 * 6±2 †

Tônus simpático (bpm) 60±3 69±6 91±18 * 39±5 ‡

Frequência cardíaca intrínseca (bpm) 323±9 354±6 * 297±8 * 293±9 †

Dados são apresentados como média ± EPM. SHO: ooforectomizado hipertenso

sedentário; THO: ooforectomizado hipertenso treinado; SHOF: ooforectomizado

hipertenso sedentário submetido a sobrecarga de frutose; THOF: ooforectomizado

hipertenso treinado submetido a sobrecarga de frutose (n=7 em cada grupo). *p<0,05 vs.

SHO; †p<0,05 vs. THO; ‡p<0,05 vs. SHOF.

37

Figura 2. Sensibilidade à insulina avaliada pela constante de decaimento da glicose

(KITT) em resposta ao teste de tolerância à insulina em ratos hipertensos

ooforectomizados sedentários (SHO) e treinados (THO) e ratos hipertensos

ooforectomizados sedentários submetido a sobrecarga de frutose sedentário (SHOF) e

treinado (THOF) (n=7 em cada grupo). *p<0,05 vs. SHO.

38

Figura 3. Raiz quadrada da média da soma dos quadrados das diferenças entre intervalos

adjacentes (RMSSD); B. Banda de alta frequência do intervalo de pulso (AF-IP); C.

Banda de baixa frequência do intervalo de pulso (BF-IP); D. Banda de baixa frequência

da pressão arterial sistólica (BF-PAS); E. Sensibilidade barorreflexa espontânea avaliada

pelo índice alfa em ratosem ratos hipertensos ooforectomizados sedentários (SHO) e

treinados (THO) e ratos hipertensos ooforectomizados sedentários submetido a

sobrecarga de frtuosesedentário (SHOF) e treinado (THOF) (n=7 em cada grupo).

*p<0,05 vs. SHO, †p>0,05 vs. THO, ‡p<0,05 vs. SHOF.

39

3.3. Artigo 3 – Em preparação para a submissão à revista de Qualis: A2 (Educação

Física)

TREINAMENTO FÍSICO AERÓBIO OU RESISTIDO MELHORA O

CONTROLE AUTONÔMICO DA CIRCULAÇÃO EM RATAS

OOFORECTOMIZADAS COM DISFUNÇÃO CARDIOMETABÓLICA:

IMPACTO NO ESTRESSE OXIDATIVO RENAL

O objetivo deste artigo foi investigar os efeitos hemodinâmicos, vasculares,

autonômicos e renais do treinamento físico aeróbio ou resistido em ratas

ooforectomizadas espontaneamente hipertensas submetidas à sobrecarga de frutose.

É importante salientar que esse artigo foi elaborado na tentativa de compreender

os possíveis mecanismos relacionados às alterações na pressão arterial decorrente dos

diferentes tipos de treinamento físico (aeróbio ou resistido) em um modelo experimental

de associação de fatores de risco (hipertensão+menopausa+síndrome metabólica)

avaliando a modulação autonômica vascular, os níveis de nitritos e nitratos plasmáticos

e o estresse oxidativo em tecido renal, um órgão-alvo da hipertensão e principal

regulador da PA em longo prazo.

40

MÉTODOS

Ratas fêmeas Wistar e SHRs com 21 dias foram obtidas do Biotério do Instituto

de Cardiologia do Rio Grande do Sul. As ratas foram divididas em grupos: controle (C;

n=8), hipertenso (H; n=8), hipertenso ooforectomizado tratado com frutose sedentário

(FHO; n = 8), hipertenso ooforectomizadotratado com frutose submetido ao treinamento

físico aeróbio (FHOTa; n=8) e hipertenso ooforectomizado submetido ao treinamento

físico resistido (FHOTr; n=8). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de

Ética da Universidade Nove de Julho (Protocolo AN002/12) e foram conduzidos de

acordo com o Guia para Cuidados e Uso de Animal de Laboratório, publicado pelo

Instituto Nacional de Saúde.


As ratas dos grupos FHOS, FHOTa e FHOTr receberam D-frutose (100 g/L) na

água de beber por 19 semanas. Os animais do grupo C receberam ração e água ad libitum.

O consumo de ração e água (com ou sem frutose) foi mensurado semanalmente.

Ooforectomia




al., 2005; FLUES et al, 2010; SOUZA et al., 2007).

Protocolo de treinamento aeróbio

Uma semana após a ooforectomia, os grupos de ratas treinadas aerobicamente

foram submetidos a um protocolo de treinamento físico (50-70% da velocidade máxima

41

alcançada no teste de esforço) em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva

durante 8 semanas (IRIGOYEN et al., 2005; SANCHES et al., 2012).

Protocolo de treinamento resistido

Este protocolo foi realizado em uma escada adaptada para ratos, como descrito

previamente por Sanches et al., 2013. Os animais foram adaptados para subir as escadas

durante 5 dias consecutivos, antes do teste de carga máxima. O teste consistiu em uma

carga inicial de 75% do peso corporal. Depois da primeira escalada, os animais

descansavam por 2 min. Para a próxima escalada, a carga foi aumentada 15%, 25% ou

40% do peso corporal do teste realizado na 1ª, 4ª e 8ª semana, respectivamente. Este

incremento foi repetido sucessivamente até que o animal não conseguisse completer a

escalada (máximo 6 escaladas). O protocolo de treinamento físico resistido foi realizado

utilizando o valor normalizado da carga máxima de cada rato, e foi ajustado

semanalmente, de acordo com o peso corporal do animal. O protocolo de treinamento

físico foi realizado durante 8 semanas, 5 dias na semana e com intensidade moderada (40-

60% da carga máxima) com 15 escaladas por sessão e com 1 minuto de intervalo entre as

subidas.


Ao final do protocolo (19 semanas de sobrecarga de frutose), foram medidas a

concentração de glicose e triglicerídeos no sangue (Accucheck and Accutrend, Roche)

após 4 horas de jejum. Para testar a intolerância à insulina, com jejum de 2 horas os

animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg peso corporal, i.p.). Uma

gota de sangue foi coletada da cauda do animal para medida de glicose no sangue no

início, 4, 8, 12 e 16 minutos após a injeção de insulina (0,75 U/kg). A constante de

decaimento da glicose sanguínea (KITT) foi calculada pela fórmula 0,693/t1/2. A glicose

42

sérica t1/2foi calculada pela inclinação da reta obtida através da análise dos mínimos

quadrados das concentrações na fase linear de declínio (BRITO et al., 2008a; BONORA

et al., 1989).

Avaliações hemodinâmicas


mg/kg) e xilazina (12 mg/kg), e foi implantada uma cânula de polietileno Tygon na

artéria carótida para medidas diretas de PA e administração de drogas, respectivamente.

Durante o experimento, as ratas receberam ração e água ad libitum, as ratas estavam

conscientes nas caixas e podiam circular livremente durante a análise hemodinâmica. A

cânula arterial foi conectada a um transdutor (Pressão Arterial XDCR, Kent Scientific), e

os sinais de pressão arterial foram registrados durante um período de 30 minutos

utilizando equipamento microcomputador com conversor digital (CODAS, 2Kz, DATAQ

Instruments). Os dados registrados foram analisados batimento a batimento para

quantificar mudanças na pressão arterial sistólica (SAP), diastólica (DAP) e média

(PAM) (SANCHES et al., 2012; IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010).

Avaliação da sensibilidade dos pressorreceptores

Doses crescents de fenilefrina (0,5 à 2,0 µg/mL) e nitroprussiato de sódio (5 à 20

µg/mL) foram injetados doses sequenciais (0,1 mL) para produzir respostas pressóricas e

depressoras que variam de 5 à 40 mmHg. Um intervalo de 3 à 5 min entre as doses foi

necessário para que a pressão arterial retornasse ao estado basal. Picos maiores ou

menores na pressão arterial média após a injeção de fenilefrina ou nitroprussiato de sódio

e as correspondentes alterações no pico reflexo da frequência cardíaca foram registradas

para cada dose de droga. A sensibilidade barorreflexa foi avaliada por um índice médio,

calculado através da divisão entre as variações da frequência cardíaca e as variações da

43

pressão arterial média, permitindo uma análise separada de bradicardia reflexa e

taquicardia reflexa. O índice foi expresso em batimento por minuto por milímetro de

mercúrio, como descrito previamente (IRIGOYEN et al., 2005; SOUZA et al., 2007;

FLUES et al., 2010).

Avaliações da variabilidade da pressão arterial

A análise no domínio do tempo consistiu no cálculo da média da pressão arterial

sistólica lso (IP), com a variabilidade do IP como o desvio padrão dos respectivo trechos

(três séries de 5 minutos para cada animal). Para a análise no domínio da frequência, o

mesmo tempo de série do IP foi interpolado por splineY cúbico (250 Hz). A densidade

espectral de potência foi obtida através da transformação rápida de Fourier (FFT). A

potência espectral das bandas de baixa frequência (BF; 0.20-0.75 Hz) e alta frequência

(AF;0.75-4.0 Hz) foram calculadas pela integração de densidade da potência espectral

dentro de cada banda de frequência usando rotina padronizada (MATLAB 6.0,

Mathworks) (SOARES et al., 2004).

Nitritos e Nitratos Plasmáticos

Os níveis de nitritos e nitratos no plasma foram medidos pela reação das amostras

com o reagente de Griess microplacas (96 poços) em aparelho leitor de ELISA.Alíquotas

de 50µL de homogeneizado de tecido foram incubadas com cofatores enzimáticos e

nitrato redutase (3U/ml) por uma 30 minutos para conversão de nitrato em nitrito em

temperatura ambiente. O total de nitrito tecidual foi então analisado pela reação das

amostras com 50 µl de reagente de Griess. O total de nitrito tecidual foi estimado a partir

de uma curva padrão de absorbância em 592 nm (GRANGER et al., 1999). Foi calculado

o Nox, índice da produção de óxido nítrico (Nox) através da razão total de nitratos por

nitritos como descrito por Miranda e colaboradores (2001).

44

Estresse oxidativo renal

Um dia após as avaliações hemodinâmicas os animais foram eutanasiados, o rim

foi imediatamente retirado, lavado com soro fisiológico, e aparado para remover o tecido

de gordura visível. O tecido foi cortado em pequenos pedaços, colocados em tampão

gelado, e homogeneizado em um homogenizador Ultra-Turrax; para cada 1g de tecido

adicionou-se 5mL de 150mM de KCl e 20nM de tampão de fosfato de sódio, pH 7,4. O

homogeneizadodo foi centrifugado a 600 g durante 10min a-4ºC.










dismutase (SOD) expressada como U/mg de proteina e foi baseada na inibição da reação



240nm. A concentração da CAT foi expressa como μmol H2O2 reduzido/min/mg proteina

(AEBI, 1984).

45


Os dados são apresentados como média±erro padrão da média. O teste Levene foi

usado para avaliar a homogeneidade. A análise de variância de um caminho seguida do

teste de Student-Newman-Keuls foi usado para comparar os grupos. A análise de

correlação de Pearson foi usada para identificar a associação entre as variáveis (n= 5 à 7

animais por grupo). Nível de significância estabelecido foi P≤0,05.

RESULTADOS

No final do protocolo, observou-se aumento de 32% e 35% no desempenho nos

testes máximos em esteira e escada para os grupos HFOTa e HFOTr, respectivamente,

evidenciando a eficácia na prescrição do treinamento físico.

A hipertensão a per se já induz aumento nos níveis pressóricos em relação ao

grupo controle. Já a associação de fatores de risco promoveu aumento adicional nos

níveis pressóricos, PAS e PAD, em todos os grupos estudados em relação ao grupo

controle. O treinamento físico aeróbio ou resistido não induziu redução da PAS ou da

PAD em relação ao grupo HFO.

Todos os grupos hipertensos demonstraram prejuízo na sensibilidade barorreflexa,

tanto para respostas taquicárdicas quanto para as respostas bradicárdicas, quando

comparados com o grupo controle. O treinamento físico aeróbio atenuou essas alterações

para as respostas taquicárdicas, enquanto que, o treinamento físico resistido melhorou as

respostas bradicárdicas (Tabela 7). Além disso, não foram observadas diferenças

estatísticas no DP-PAS (Tabela 7). Já na banda de baixa frequência da PAS

(representativa modulação simpática vascular), o grupo HFO apresentou um aumento

46

quando comparado ao grupo C. Em contrapartida, ambos os tipos de treinamento físico

demonstraram-se eficazes em normalizar tal prejuízo (Figura 4).

A sobrecarga de frutose promoveu redução no índice NOx em relação ao grupo C

e H (HFO:0,32±0,20 vs. H: 0,75±0,13; C: 1,1±0,15). Contudo, ambos os tipos de

treinamento físico foram eficazes em elevar os valores deste índice (HFOTa: 1,35±0,21;

HFOTr: 1,46±0,18) (Figura 5).

Na Tabela 8, estão apresentados os valores da análise do estresse oxidativo renal.

O consumo crônico de frutose induziu um aumento de lipoperoxidação de membrana no

grupo HFO quando comparado com o grupo C e H (HFO:4,24±0,47 vs. H:2,78±0,39;

C:1,69±0,09 cps/mg proteína). Entretanto, ambos os tipos de treinamento físico foram

eficientes em reduzir e/ou normalizar essa variável. Na avaliação de dano a proteínas,

observamos um aumento no grupo H (3,98±0,33 nmol/mg proteína) e HFO (4,17±0,36

nmol/mg proteína) quando comparados ao grupo C (1,97±0,21 nmol/mg proteína). Em

contrapartida, tanto o treinamento aeróbio (HFOTa: 2,80±0,21 nmol/mg proteína) quanto

o resistido (HFOTr: 2,87±0,27 nmol/mg proteína) promoveram uma melhora nos grupos

hipertensos com sobrecarga de frutose. Houve correlação positiva entre os valores de

TBARS e carbonilas no tecido renal (r=0,65, p<0,05) em análise envolvendo os animais

de todos os grupos estudados (Figura 6A).

Em relação às enzimas antioxidantes, não foram encontradas diferenças na

concentração da CAT. A hipertensão induziu aumento na atividade da SOD (H: 13±0,48;

HFO: 12±0,64; HFOTa: 12±0,74 vs. C: 10±0,49 USOD/mg proteína), contudo, o

treinamento resistido (HFOTr: 9±0,39 USOD/mg proteína) reduziu esses valores quando

comparado com os mesmos grupos que apresentaram o aumento da atividade enzimática.

47

O estudo de correlação envolvendo os grupos tratados com frutose evidenciou

correlação positiva entre o LF-PAS e o TBARS no tecido renal (r=0,63, p<0,05; Figura

6B); adicionalmente os valores de TBARS foram inversamente correlacionados com o

índice NOx (r=-0,66, p<0,05; Figura 6C).

48


C H FHO FHOTa FHOTr

PAS (mmHg) 128±2 180±4† 199±2†‡ 205±3†‡ 191±7†‡

PAD (mmHg) 95±2 130±4† 148±2†‡ 151±4†‡ 146±5†‡

DP-PAS (mmHg) 4,48±0,46 5,23±0,29 5,79±1,06 7,16±0,51 5,57±0,23

RT (bpm/mmHg) 4,37±0,34 1,91±0,17† 1,06±0,06† 1,54±0,07†¥ 1,04±0,07†‡§

RB (bpm/mmHg) -1,52±0,08 -1,12±0,08† -1,01±0,15† -0,9±0,07† -1,59±0,13¥§

Dados estão apresentados como média±EPM. PAS: pressão arterial sistólica; PAD:

pressão arterial diastólica; MAP: pressão arterial média; FC: frequência cardíaca; VFC:

variabilidade da FC; DP-PAS: desvio padrão da pressão arterial sistólica; RT: resposta

taquicárdica; RB: resposta bradicárdica. † p<0,05 vs. C; ‡ p<0,05 vs.H; ¥ p<0,05 vs. HFO; §

p<0,05vs. HFOTa.

49

Tabela 8. Estresse oxidativo renal nos grupos estudados.

C H FHO FHOTa FHOTr

TBARS

(cps/mg proteína)

1,69±0,09 2,78±0,39 3,72±0,47‡† 2,55±0,27¥ 2,30±0,05¥

Carbonilas

(nmol/mg proteína)

1,97±0,21 3,98±0,33† 4,17±0,36† 2,80±0,21‡¥ 2,87±0,27‡¥

Catalase

(nmol/mg proteína)

1,72±0,16 1,64±0,16 1,41±0,09 1,48±0,29 1,82±0,16

Superóxido dismutase

(USOD/mg proteína)

10±0,49 13±0,48† 12±0,64† 12±0,74† 9±0,39‡¥§

Dados são apresentados em média±erro padrão da média. C: grupo controle; FHO: grupo

hipertenso ooforectomizado submetido ao consumo de frutose; FHOTa: grupo hipertenso



resistido. † p<0,05 vs. C; ‡ p<0,05 vs.H; ¥ p<0,05 vs. FHO; § p<0,05vs. FHOTa.

50

Figura 4. Banda de baixa frequência da pressão arterial sistólica nos grupos estudados C:

grupo controle; H: hipertenso; FHO: grupo hipertenso ooforectomizado submetido ao


submetido ao treinamento físico aeróbio; FHOTr: grupo hipertenso ooforectomizado

tratado com frutose submetido ao treinamento físico resistido. † p<0,05 vs. C; ¥ p<0,05

vs. FHO.

51

Figura 5. Índice Nox nos grupos estudados. C: grupo controle; H: hipertenso; FHO:

grupo hipertenso ooforectomizado submetido ao consumo de frutose; FHOTa: grupo

hipertenso ooforectomizado tratado com frutose submetido ao treinamento físico aeróbio;

FHOTr: grupo hipertenso ooforectomizado tratado com frutose submetido ao treinamento

físico resistido. † p<0,05 vs. C; ‡ p<0,05 vs.H; ¥ p<0,05 vs. FHO.

52

Figura 6. Correlações positivas obtidas entre: A) TBARS e Carbonilas (r= 0,65; p<0,05);

B) BF-PAS e TBARS (r= 0,63; p<0,05). Correlação negativa obtida entre C) Índice NOx

e TBARS (r= -0,68; p<0,05).

53

3.4. Artigo 4 – Em preparação para a submissão à revista de Qualis A1 (Educação Física)

TREINAMENTO FÍSICO RESISTIDO OU AERÓBIO ATENUA A DISFUNÇÃO

AUTONÔMICA CARDÍACA EM UM MODELO DE MENOPAUSA E

SÍNDROME METABÓLICA: PAPEL DA INFLAMAÇÃO E DO ESTRESSE

OXIDATIVO.

O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos metabólicos, cardíacos e

autonômicos do treinamento físico aeróbio ou resistido em ratas ooforectomizadas

espontaneamente hipertensas submetidas à sobrecarga de frutose.

Considerando os benefícios cardiometabólicos do treinamento físico aeróbio em

um modelo de associação de fatores de risco observado no artigo anterior, este artigo

visou avaliar possíveis mecanismos que explicariam os benefícios deste tipo de

treinamento, bem como as resposta do treinamento físico dinâmico resistido utilizando

este mesmo modelo experimental.

54

MÉTODOS

Ratas fêmeas Wistar e SHRs com 21 dias foram obtidas do Biotério do Instituto

de Cardiologia do Rio Grande do Sul. As ratas foram randomizadas e divididas em

grupos: controle (C; n=8), hipertenso ooforectomizado tratado com frutose sedentário

(FHO; n = 8), hipertenso ooforectomizadotratado com frutosesubmetido ao treinamento

físico aeróbio (FHOTa; n=8) e hipertenso ooforectomizado submetido ao treinamento

físico resistido (FHOTr; n=8). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de

Ética da Universidade Nove de Julho (Protocolo AN002/12) e foram conduzidos de

acordo com o Guia para Cuidados e Uso de Animal de Laboratório, publicado pelo

Instituto Nacional de Saúde.


As ratas dos grupos FHOS, FHOTa e FHOTr receberam D-frutose (100 g/L) na

água de beber por 19 semanas. Os animais do grupo C receberam ração e água ad libitum.

O consumo de ração e água (com ou sem frutose) foi mensurado semanalmente.

Ooforectomia




al., 2005; FLUES et al, 2010; SOUZA et al., 2007).

Protocolo de treinamento aeróbio

Uma semana após a ooforectomia, os grupos de ratas treinadas aerobicamente

foram submetidos a um protocolo de treinamento físico (50-70% da velocidade máxima

55

alcançada no teste de esforço) em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva

durante 8 semanas (IRIGOYEN et al., 2005; SANCHES et al., 2012).

Protocolo de treinamento resistido

Este protocolo foi realizado em uma escada adaptada para ratos, como descrito

previamente por Sanches et al., 2013. Os animais foram adaptados para subir as escadas

durante 5 dias consecutivos, antes do teste de carga máxima. O teste consistiu em uma

carga inicial de 75% do peso corporal. Depois da primeira escalada, os animais

descansavam por 2 min. Para a próxima escalada, a carga foi aumentada 15%, 25% ou

40% do peso corporal do teste realizado na 1ª, 4ª e 8ª semana, respectivamente. Este

incremento foi repetido sucessivamente até que o animal não conseguisse completer a

escalada (máximo 6 escaladas). O protocolo de treinamento físico resistido foi realizado

utilizando o valor normalizado da carga máxima de cada rato, e foi ajustado

semanalmente, de acordo com o peso corporal do animal. O protocolo de treinamento

físico foi realizado durante 8 semanas, 5 dias na semana e com intensidade moderada (40-

60% da carga máxima) com 15 escaladas por sessão e com 1 minuto de intervalo entre as

subidas.


Ao final do protocolo (19 semanas de sobrecarga de frutose), foram medidas a

concentração de glicose e triglicerídeos no sangue (Accucheck and Accutrend, Roche)

após 4 horas de jejum. Para testar a intolerância à insulina, com jejum de 2 horas os

animais foram anestesiados com pentobarbital sódico (40 mg/kg peso corporal, i.p.). Uma

gota de sangue foi coletada da cauda do animal para medida de glicose no sangue no

início, 4, 8, 12 e 16 minutos após a injeção de insulina (0,75 U/kg). A constante de

decaimento da glicose sanguínea (KITT) foi calculada pela fórmula 0,693/t1/2. A glicose

56

sérica t1/2foi calculada pela inclinação da reta obtida através da análise dos mínimos

quadrados das concentrações na fase linear de declínio (BRITO et al., 2008; BONORA et

al., 1989).



mg/kg) e xilazina (12 mg/kg), e foi implantada uma cânula de polietileno Tygon na

artéria carótida para medidas diretas de PA. Durante o experimento, as ratas receberam

ração e água ad libitum, as ratas estavam conscientes nas caixas e podiam circular

livremente durante a análise hemodinâmica. A cânula arterial foi conectada a um

transdutor (Pressão Arterial XDCR, Kent Scientific), e os sinais de pressão arterial foram

registrados durante um período de 30 minutos utilizando equipamento microcomputador

com conversor digital (CODAS, 2Kz, DATAQ Instruments). Os dados registrados foram

analisados batimento a batimento para quantificar mudanças na pressão arterial sistólica

(SAP), diastólica (DAP) e média (PAM) e frequência cardíaca (FC) (SANCHES et al.,

2012; IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010).

Variabilidade da frequência cardíaca

A análise no domínio do tempo consistiu no cálculo da média do intervalo de

pulso (IP), com a variabilidade do IP como o desvio padrão dos respectivos trechos (três

séries de 5 minutos para cada animal). Para a análise no domínio da frequência, o mesmo

tempo de série do IP foi interpolado por splineY cúbico (250 Hz). A densidade espectral

de potência foi obtida através da transformação rápida de Fourier (FFT). A potência

espectral das bandas de baixa frequência (BF: 0,20-0,75 Hz) e alta frequência (AF:0,75-

4,0 Hz) foram calculadas pela integração de densidade da potência espectral dentro de

57

cada banda de frequência usando rotina padronizada (MATLAB 6.0, Mathworks)

(SOARES et al., 2004).

Marcadores inflamatórios e hormonais

Os níveis de IL-6, IL-10 e TNF-α foram avaliados no tecido cardíaco utilizando

kit comercial ELISA (R&D Systems Inc.) de acordo com as informações do fabricante. A

ELISA foi realizada em microplacas de poliestireno de 96 poços com um anticorpo

monoclonal específico de revestimento. A absorbância foi medida a 540nm em um leitor

de microplacas. A sensibilidade do ensaio foi de 15pg/ml.

A leptina e a adiponectina foram mensuradas em tecido adiposo utilizando a

tecnologia Luminex através do kit Miliplex Millipore.

Estresse oxidativo cardíaco

Um dia após as avaliações hemodinâmicas os animais foram eutanasiados, o

coração (ventrículos) foi imediatamente retirado, lavado com soro fisiológico, e aparado

para remover o tecido de gordura visível. O tecido foi cortado em pequenos pedaços,

colocados em tampão gelado, e homogeneizado em um homogenizador Ultra-Turrax;

para cada 1g de tecido adicionou-se 5ml de 150mM de KCl e 20nM de tampão de fosfato

de sódio, pH 7,4. O homogeneizadodo foi centrifugado a 600 g durante 10min a-4ºC.







58




dismutase (SOD) expressada como U/mg de proteína e foi baseada na inibição da reação



240nm. A concentração da CAT foi expressa como μmol H2O2 reduzido/min/mg proteina

(AEBI, 1984). A atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi expressa como nmol

peróxido/hidroperóxido reduzido/min/mg protein e foi baseada no consumo de NADPH à

480 nm (FLOHE & GUNZLER, 1984).

Capacidade Antioxidante Total (TRAP) - Esta técnica é baseada na formação de um

radical que emite luz, e que é detectado por contador beta (TriCrab 2800TR,

PerkinElmer) com o circuito de coincidência desconectado e utilizando o canal de trítio

em sala escura. O meio de reação consiste em: 3,0 mL de uma solução de AZO, a qual foi

adicionado 10 L de luminol, realizando-se uma leitura basal. Após, adiciona-se amostra

(em torno de 10 L). Para estabelecer a curva padrão foram realizadas duas leituras

contendo Trolox, nas quantidades 5 L e 10 L. Esta técnica foi baseada na

decomposição do 2,2’ Azo-bis (2-amidino-propano ABAP) diidrocloreto que gera

radicais livres. A primeira leitura foi realizada com ABAP e luminol. Nesta, verificou a

formação de radicais livres, posteriormente foi realizada uma curva padrão utilizando o

Trolox como antioxidante e, foi medido a capacidade antioxidante de nossas amostras

observando-se o tempo que a amostra inibiu a formação dos radicais do luminol (LISSI

et al., 1995).

59

Concentração de Glutationa total e GSSG: Para determiner a glutationa oxidada (GSSG)

e a concentraação da glutationa total (GSH), o tecido foi homogenizado em 2M de ácido

perclórico e centrifugado à 1000 g durante 10min, e 2M KOH foi adicionado ao

sobrenadante. A reação média continha 100mM de tampão fosfato (pH 7,2), 2mM de

NADPH, 0,2U/mL de glutationa redutase e 70μMácido 2,2'-dinitro-5-5'-ditio-dibenzóico.

Para determinar a concentração de GSSG o sobrenadante foi neutralizado com 2M KOH

e inibido por adição de 5μM N-etilmaleimida. A absorbância foi lida à 420nm

(ANDERSON, 1985). Os valores de GSH reduzida foram determinados a partir da

subtração da concentração total de glutationa da concentração de GSSG.


Os dados são apresentados como média±erro padrão da média. O teste Levene foi

usado para avaliar a homogeneidade. A análise de variância de um caminho, seguida do

teste de Student-Newman-Keuls, foi utilizada para comparar os grupos. A análise de

correlação de Pearson foi usada para identificar a associação entre as variáveis (n= 5 à 7

animais por grupo). Nível de significância estabelecido foi P≤0,05.

RESULTADOS

Conforme demonstrado na Tabela 9, após 19 semanas de protocolo experimental,

os animais apresentaram aumento do peso corporal, e o grupo submetido ao treinamento

físico resistido reduziu essa variável. Além disso, os animais do grupo HOF apresentaram

maiores valores nos testes de esforço máximo e de carga máxima em relação ao grupo C,

entretanto, ambos os grupos treinados (HOFTa e HOFTr) demonstraram um aumento da

capacidade ou desempenho físico, evidenciando a eficácia na prescrição do treinamento

físico.

60

Foi observada redução do tecido adiposo branco visceral em ambos os grupos

treinados. Na avaliação da glicemia sanguínea e dos triglicerídeos, a associação de fatores

de risco (grupo HOF) induziu um aumento destas variáveis em relação ao grupo C.

Entretanto, somente o treinamento físico aeróbio foi eficaz em normalizar o aumento

desses parâmetros. A sensibilidade à insulina estava reduzida no grupo HFO em relação

ao grupo C, o que não foi observado nos grupos treinados.

A associação de fatores de risco promoveu aumento da PAM em todos os grupos

estudados (sedentários ou treinados) em relação ao grupo controle. Entretanto, ambos os

treinamentos não foram eficazes em reduzir essa variável. Taquicardia pode ser

observada após no grupo HFO em relação ao grupo C. Em contrapartida, ambos os

grupos treinados apresentaram bradicardia de repouso em relação ao respectivo grupo

sedentário.

Na avaliação autonômica cardíaca, o consumo crônico de frutose induziu prejuízo

no RMSSD (representativo do tônus vagal) e na VAR-IP em relação ao grupo controle, o

que não foi observado nos grupos treinandos. Contudo, o treinamento físico aeróbio foi

eficaz em promover um aumento na VAR-IP. Além disso, não foi observada diferença

entre os grupos no DP-IP. Entretanto, as bandas de baixa frequência (representativa da

modulação simpática) e de alta frequência (representativa da modulação parassimpática)

do IP estavam reduzidas nos grupos hipertensos ooforectomizados submetidos ao

consumo crônico de fructose sedentários e treinados (Tabela 10).

Não foi observada diferença significante entre os grupos para IL-6. Entretanto, o

grupo HFO (65,8±9,9 pg/mg de proteína) apresentou maior valor de TNF-α em relação

ao grupo C (23,6±4,3 pg/mg de proteína). Com relação a IL-10, o grupo treinado resistido

HFOTr (40,2±7,9pg/mg de proteína) apresentou maiores valores quando comparado ao

61

grupo HFO (16,26±2,52 pg/mg de proteína). Além disso, os animais submetidos a

sobrecarga de frutose apresentaram um aumento da leptina (HFO:1346,65 vs. C:

974,28±90,90pg/ml). Contudo, o treinamento resistido promoveu redução dessa variável

(HFOTr: 961,50±50,97pg/ml). Já em relação à adiponectina, houve redução nos grupos

submetidos à associação de fatores de risco (HFO: 2227968±64153, HFOTa:

2162641±59746; HFOTr: 1986618±38055 vs. C:2638992±48455 pg/ml) quando

comparados ao grupo C (Figura 4A-D).

Com relação aos parâmetros do estresse oxidativo cardíaco, a associação de

fatores de risco promoveu aumento de lipoperoxidação de membrana e dano à proteínas

quando comparado com o grupo C. Entretanto, ambos os tipos de treinamento físico

mostraram-se eficazes em normalizar este parâmetro. A sobrecarga de frutose induziu

redução na concentração de catalase quando comparado com o grupo controle. Em

contrapartida, o treinamento físico aeróbio promoveu aumento desta enzima em relação

ao HFO. Já o treinamento resistido mostrou-se reduzido quando comparado com o grupo

controle (C) e com o grupo treinado aerobicamente (HFOTa). Além disso, o consumo

crônico de frutose induziu redução na atividade da SOD e esta pode ser aumentada após o

treinamento resistido. A atividade da GPx estava aumentada nos grupos HFO, HFOTa

com um aumento adicional no grupo HFOTr. Na avaliação do balanço redox da

glutationa (GSH/GSSG), a sobrecarga de frutose (HFO) induziu uma redução neste

parâmetro e treinamento físico aeróbio (HFOTa) foi eficaz em aumentar os valores deste

índice) (Tabela 11).

Foi observada correlação entre o RMSSD e parâmetros de estresse oxidativo e

inflamação. Desta forma, na análise envolvendo todos os grupos estudados, o RMSSD

correlacionou-se negativamente com a QL (r=-0,7, p<0,05) e com as carbonilas (r=-0,65,

p<0,05), bem como positivamente com a razão redox da glutationa (r=0,63, p<0,05).

62

Adicionalmente, o RMSSD foi positivamente correlacionado com os níveis de IL-10

cardíacos (r=0,7, p<0,05) nos grupos hipertensos (Figura 8).

O TNF-α apresentou correlação negativa com a razão redox da glutationa (r=-

0,55, p<0,05) e positiva com a leptina (r=0,68, p<0,05) (Figura 7).

63

Tabela 9. Capacidade física e avaliações metabólicas nos grupos estudados.

C FHO FHOTa FHOTr

Peso Corporal (g) 266±4 261± 2 264±5 241±3†¥§

Tecido Adiposo Branco

Visceral (g)

5,22±0,33 5,25±0,39 3,7±0,19†¥ 3,59±0,28†¥

Glicemia (mg/dL) 75±1,2 92±2,1† 79±1,8¥ 92±4,7†§

Triglicerídeos (mg/dL) 125±7,7 160±8,0† 148±7,4¥ 163±6,9†

KITT (%/min) 4,42±0,29 3,4±0,28† 4,02±0,15 4,19±0,22

Teste Máximo Aeróbio (min) 18±1,5 22±1,0† 29±0,3†¥ -

Teste Máximo Resistido (g) 204±11 410± 20† - 554±15†¥

Dados estão apresentados em média±EPM. C: grupo controle; FHO: grupo hipertenso

ooforectomizado submetido ao consumo de frutose; FHOTa: grupo hipertenso



resistido. KITT: constante de decaimento da glicose plasmática durante o teste de

tolerância à insulina. †p<0,05 vs. C; ¥ p<0,05 vs.FHO; § p<0,05vs. FHOTa.

64


C FHO FHOTa FHOTr

Pressão arterial média (mmHg) 108±1 173±1† 177±2† 166±5†

Frequência cardíaca (bpm) 352±11 393±10† 336±9¥ 330±13¥

VFC

DP-IP (ms) 6,7±0,63 5,43±0,96 6,29±0,45 5,05±0,34

RMSSD (ms) 4,8±0,58 2,98±0,51† 4,23±0,50 4,45±0,42

VAR-IP (ms²) 44,5±5,7 29,49±4,07† 46,30±2,10¥ 37,57±2,79

BF-IP (ms²) 6,91±1,22 0,88±0,06† 1,74±0,26† 1,44±0,31†

AF-IP (ms²) 17,79±4,30 3,20±0,80† 4,24±0,65† 5,78±0,85†

Dados estão apresentados como média±EPM.VFC: variabilidade da FC; DP-IP: desvio

padrão do interval de pulso; RMSSD: raiz quadrada da média da soma dos quadrados das

diferenças entre intervalos adjacentes VAR-IP: variância total do interval de pulso; BF-

IP: banda de baixa frequência do interval de pulso (0,20-0,75 Hz); AF-IP: banda de alta

frequência do interval de pulso (HF: 0,75-3 Hz).† p<0,05 vs. C; ¥ p<0,05 vs. HFO.

65

Tabela 11. Estresse oxidativo cardíaco nos grupos estudados.

C FHO FHOTa FHOTr

QL

(cps/mg proteína) 2661±358 15043±1333† 10652±814†¥ 11551±1350†¥

Carbonilas

(nmol/mg proteína)

3,00±0,23 5,53±0,45† 4,11±0,53¥ 4,59±0,23†¥

Catalase

(nmol/mg proteína)

0,80±0,04 0,64±0,03† 0,80±0,03¥ 0,65±0,05†§

Superóxido dismutase

(USOD/mg proteína)

16 ±0,58 14±0,69† 14±0,80 20±1,21†¥§

Glutationa peroxidase

(nmol/min/mg proteína)

41±4 65±6† 66±3† 100±2†¥§

TRAP (nmol/mg proteína) 8,0±1,08 10,7±1,12 17,3±2,22†¥ 19,6±2,40†¥

Razão GSH/GSSG 10,4±0,63 8,2±0,51† 12,9±0,44†¥ 10,5±0,46¥§

Dados são apresentados em média±erro padrão da média. QL: quimiluminescência; GSH/GSSG:

glutationa total/glutationa reduzida C: grupo controle; FHO: grupo hipertenso ooforectomizado

submetido ao consumo de frutose; FHOTa: grupo hipertenso ooforectomizado tratado com

frutose submetido ao treinamento físico aeróbio; FHOTr: grupo hipertenso ooforectomizado

tratado com frutose submetido ao treinamento físico resistido. † p<0,05 vs. C; ¥ p<0,05 vs. HFO;

§ p<0,05vs. HFOTa.

66

Figura 7. A) Fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e B) Interleucina 10 (IL-10) no tecido

cardíaco, C) Leptina e D) Adiponectina no tecido adiposo branco visceral dos grupos estudados.

C: grupo controle; FHO: grupo hipertenso ooforectomizado submetido ao consumo de frutose;

FHOTa: grupo hipertenso ooforectomizado tratado com frutose submetido ao treinamento físico

aeróbio; FHOTr: grupo hipertenso ooforectomizado tratado com frutose submetido ao

treinamento físico resistido . † p<0,05 vs. C; ¥ p<0,05 vs. FHO.

67

Figura 8. Correlação de Person obtidas entre: A) RMSSD e QL (r= -0,7; p<0,05); B)

RMSSD e Carbonilas (r= -0,65; p<0,05); C) RMSSD e Razão GSH/GSSG (r= 0,63;

p<0,05) e D) RMSSD e IL-10 (r=0,7; p<0,05).

68

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Considerando o aumento da prevalência de mulheres menopausadas com

disfunções cardiometabólicas ou mesmo com SM (MOSCA et al., 2007), neste trabalho

objetivou-se investigar os efeitos da privação dos hormônios ovarianos associado à

hipertensão e ao consumo crônico de frutose em parâmetros metabólicos,

cardiovasculares, autonômicos, de inflamação e de estresse oxidativo em ratas fêmeas, na

tentativa de compreender os mecanismos envolvidos/determinantes nessa condição de

elevado risco cardiovascular e mau prognóstico. Adicionalmente, foram avaliados os

efeitos do treinamento físico dinâmico aeróbio ou resistido, duas abordagens não

farmacológicas cada vez mais divulgadas, nessa condição de associação de fatores de

risco.

Os resultados evidenciam que a privação dos hormônios ovarianos associada à

hipertensão e à sobrecarga de frutose levam a prejuízos na modulação autonômica

cardiovascular e induzem aumento de marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo

em tecido cardíaco.

Estudos anteriores do nosso grupo haviam demonstrado que a privação dos

hormônios ovarianos induziu aumento da PA e prejuízo na sensibilidade barorreflexa em

ratos (IRIGOYEN et al., 2005; FLUES et al., 2010). Além disso, ao observamos os

efeitos da sobrecarga de frutose em ratas Wistar ou camundongos machos verificou-se

prejuízo metabólico, hemodinâmico e autonômico (BRITO et al., 2008; DE ANGELIS et

al., 2012). No presente estudo verificamos que ratas hipertensas ooforetomizadas

submetidas à sobrecarga de frutose apresentaram aumento de tecido adiposo branco

visceral, dos triglicerídeos plasmáticos e resistência à insulina quando comparadas a ratas

somente hipertensas ou mesmo hipertensas ooforectomizadas. Tal fato se deve

provavelmente a exposição do fígado a altas doses de frutose promovendo uma

69

estimulação rápida de lipogênese, o que contribui para o acúmulo de triglicérideos,

levando a diminuição dos receptores de insulina e consequentemente redução da

sensibilidade à insulina (MURAKAMI et al., 1997).

Ademais, a somatória de fatores de risco (menopausa+hipertensão+frutose)

induziu prejuízos adicionais na PA, na VFC e na VPA, além de taquicardia de repouso

em relação às ratas SHR ooforectomizadas ou não. Alguns autores têm observado

aumento de PA após a sobrecarga de frutose (FARAH et al., 2006; CUNHA et al., 2006;

BRITO et al., 2008; SANCHES et al., 2012; RENNA et al., 2013; VAZQUEZ-PRIETO

et al., 2011). No presente estudo, o consumo crônico de frutose promoveu adicionalmente

redução em parâmetros da VFC, bem como um aumento na modulação simpática

vascular, demonstrado pelo aumento da VAR-PAS e da banda BF-PAS. Estudos

anteriores também demonstraram que a sobrecarga de frutose promoveu diminuição do

tônus vagal, redução da sensibilidade barorreflexa, além de prejuízo na VFC e na VPA

em ratas Wistar ou camundongos machos (FARAH et al., 2006; BRITO et al., 2008; DE

ANGELIS et al., 2012).

Vale destacar que um estudo anterior de nosso grupo evidenciou que a disfunção

autonômica cardiovascular precede a disfunção metabólica em camundongos machos

submetidos ao consumo crônico de frutose (DE ANGELIS et al., 2012). Além disto,

estudos evidenciam que o vago pode modular a resposta inflamatória e o estresse

oxidativo em algumas situações fisiopatológicas (BOROVIKOVA et al., 2000; VAN

GAAL et al., 2006). Neste sentido, para compreender o papel da inflamação neste modelo

experimental, avaliamos o TNF-α, IL-6 e IL-10 no tecido cardíaco. Verificou-se que o

TNF-α foi maior no grupo FHO quando comparado a outros grupos. Além disto, a

sobrecarga de frutose promoveu uma redução de IL-10 nesse grupo. Observou-se também

uma correlação negativa entre o peso do tecido adiposo branco visceral e a concentração

70

de IL-10. Neste sentido, vale lembrar que o tecido adiposo por ser considerado um órgão

endócrino ativo e parácrino que libera uma grande quantidade de citocinas e mediadores

bioativos, tais como leptina, IL-6 e TNF-α (LAU et al., 2005; VAN GAAL et al., 2006).

Estas substâncias influenciam negativamente a homeostase da glicose e lipídeos, a PA, de

coagulação, fibrinólise e a inflamação, que podem conduzir à disfunção endotelial e a

aterosclerose (LAU et al., 2005; VAN GAAL et al., 2006).

Adicionalmente, ao analisarmos os parâmetros de estresse oxidativo, observou-se

uma diminuição da capacidade antioxidante juntamente com o aumento da peroxidação

lipídica no tecido cardíaco do grupo FHO, similar ao observado em pacientes obesos ou

com SM. De fato, parece haver uma correlação entre a quantidade de tecido adiposo

branco visceral e marcadores de estresse oxidativo sistêmico, o que indica que esse tecido

é um regulador independente de alterações oxidativas (GRATTAGLIANO et al., 2008).

Em relação às enzimas antioxidantes, a privação hormonal nas ratas SHR

promoveu aumento da concentração da CAT e uma diminuição da atividade da GPx. Tal

fato pode ser explicado, pois ambas as enzimas competem pelo mesmo substrato

(peróxido de hidrogênio). Neste sentido, Ruiz et al. (2000) demonstraram que o uso

contínuo de 17β-estradiol promoveu um aumento da concentração de catalase,

provavelmente associada a uma maior produção de peróxido de hidrogênio; sugerindo,

portanto, que a ausência desse hormônio interfere na ação enzimática.

É importante ressaltar que a peroxidação lipídica (TBARS) foi aumentada nas

SHRs ooforectomizadas quando comparados com as SHRs intactas, o que sugere

aumento do estresse oxidativo. Um estudo anterior do nosso grupo demonstrou uma

correlação positiva entre a PA sistólica e a lipoperoxidação, reforçando o papel do

estresse oxidativo na manutenção da PA após a privação do hormônio feminino

(IRIGOYEN et al., 2005). Além disso, no presente estudo a peroxidação lipídica

71

(TBARS e QL) foi significativamente aumentada no grupo frutose (FHO), bem como

houve redução do balanço redox (GSH/GSSG), demonstrando assim, desequilíbrio entre

os fatores pró-oxidantes e oxidantes no grupo com maior associação de fatores de risco.

Neste contexto, ao observamos os prejuízos induzidos na modulação autonômica

cardiovascular em um modelo experimental de associação de fatores de risco, decidimos

investigar o papel do treinamento físico aeróbio nessa condição; uma vez que está bem

descrito na literatura os benefícios desta prática não farmacológica no manejo do risco

cardiometabólico.

Sendo assim, evidenciamos que o treinamento físico aeróbio atenuou disfunções

em parâmetros metabólicos, induziu bradicardia de repouso, reduziu o simpático

cardíaco (TS) e vascular (BF-PAS) e aumentou a sensibilidade barorreflexa espontânea,

apesar de não reduzir PA, em ratas ooforectomizadas hipertensas submetidas ao consumo

crônico de frutose. É importante ressaltar que quando se comparou os grupos

ooforectomizados treinados (hipertenso vs. hipertenso+frutose), observou-se que o grupo

frutose apresentou PA elevada e um índice alfa menor, acompanhado por disfunção

marcante do parassimpático em comparação com o grupo somente hipertenso. Estes

resultados mostraram que o consumo crônico de frutose induz prejuízo hemodinâmico e

no controle autonômico da circulação e, adicionalmente, claramente bloqueia e/ou atenua

alguns benefícios do treinamento físico aeróbio em ratas hipertensas submetidas à

privação dos hormônios ovarianos.

No que diz respeito as avaliações metabólicas, o peso corporal e a ingesta calórica

total (kcal de ração + kcal de frutose) não foram diferentes nos grupos estudados, ou seja,

após a sobrecarga de frutose não observamos aumento de peso corporal. Entretanto,

observou-se aumento do tecido adiposo branco visceral após a sobrecarga de frutose, o

72

qual desempenha papel fundamental no desenvolvimento de doenças cardiometabólicas

(VAN GAAL et al., 2006). Por outro lado, o treinamento físico aeróbio

normalizou/reduziu o ganho do tecido adiposo branco visceral, a glicemia, os

triglicerídeos e a resistência à insulina nos animais submetidos ao consumo crônico de

frutose. Esses benefícios provavelmente se devem a utilização dos triglicerídeos

muscular, aumentando a absorção, ativação e oxidação dos ácidos graxos (MURAKAMI

et al., 1997).

Em relação aos parâmetros hemodinâmicos, a redução da PA só foi obsevada no

grupo ooforectomizado hipertenso sem a sobrecarga de frutose (THO). Nosso grupo já

havia demonstrado redução da PA associada a redução de lipoperoxidação em tecido

cardíaco em ratas Wistar ooforectomizadas. Green et al . (2002) mostram que a redução

na PA nas mulheres treinadas pre e pós- menopausa foi associada a uma redução da

resistência vascular periférica. Em contraste, outros estudos não encontraram nenhuma

redução na PA em mulheres na menopausa (ASIKAINEN et al., 2004). Alguns

mecanismos que podem ser diretamente associados com a redução da PA em humanos

hipertensos treinados e podem ter ocorrido nas ratas hipertensas ooforectomizadas no

presente estudo, são a redução do débito cardíaco (HAGBERG et al., 1989) e/ou da

resistência vascular periférica (JENNINGS et al., 1991). Entretanto, as ratas hipertensas

ooforectomizadas não apresentaram bradicardia de repouso, um achado que pode ser

explicado, pelo menos em parte, pelo aumento da FCI, que foi sobreposto ao aumento do

tônus vagal (associado com a inalteração do tônus simpático). No entanto, o aumento na

sensibilidade do barorreflexo após o treinamento nas ratas hipertensas ooforectomizadas

pode ser o mecanismo envolvido na redução da PA neste grupo. Em contrapartida, a

inalteração da PA no grupo hipertenso ooforectomizado submetido à sobrecarga de

frutose pode ser atribuído não só a fatores relacionados a privação dos hormônios

73

ovarianos, mas também ao consumo de frutose. Dessa forma, o aumento da resistência à

insulina (VERMA et al., 1996; FARAH et al., 2006), aumento na função do sistema

renina angiotensina (VERMA et al., 1996), comprometimento da função endotélial

(VERMA et al., 1996; FARAH et al., 2006) e ativação simpática (FARAH et al., 2006;

DE ANGELIS et al., 2012) devem ter colaborado para o aumento da PA induzido pela

sobrecarga de frutose, bem como para a inalteração da PA pós treinamento aeróbio, ou

mesmo treinamento resistido. De fato, os animais do grupo SHOF apresentaram prejuízo

na sensibilidade barorreflexa e redução da atividade parassimpática (diminuição de tônus

vagal e banda de alta frequência), hiperatividade simpática (aumento do tônus simpático e

da BF-PAS) e diminuição acentuada nas bandas de baixa e alta frequência. Por outro

lado, o treinamento físico aeróbio induziu aumento na sensibilidade barorreflexa

espontânea. Tal benefício pode estar associado com a melhora do tônus vagal no grupo

THO ou a redução do tônus simpático cardíaco e normalização da BF-PAS no grupo

THOF.

Neste sentido, tendo em vista que o treinamento físico aeróbio atenuou/impediu

alterações metabólicas comuns na menopausa e na SM (aumento da glicemia,

triglicerídeos e maior resistência à insulina) induzidas pela sobrecarga de frutose, e

também melhorou a modulação autonômica cardiovascular (tônica e reflexa) (Artigo 2),

objetivamos em um segundo momento entender os possíveis mecanismos que poderiam

explicar o papel do treinamento físico aeróbio, bem como, avaliar a atuação do

treinamento físico resistido nas mesmas condições, avaliando marcadores de inflamação e

estresse oxidativo no tecido cardíaco e renal (Artigos 3 e 4).

Os achados do presente estudo evidenciam que a somatória de fatores de risco no

modelo experimental de hipertensão (SHR), menopausa (ooforectomia) e disfunção

metabólica (sobrecarga de frutose) induziu disfunção autonômica cardiovascular

74

acompanhada de aumento de TNF-α e leptina, redução de adiponectina e prejuízo em

parâmetros de estresse oxidativo cardíaco e renal, bem como, redução da

biodisponibilidade de óxido nítrico.

Nossos resultados evidenciam que a hipertensão a per se promoveu alterações na

sensibilidade barorreflexa e no estresse oxidativo renal (Artigo 3) dos animais do grupo

H. Algumas das alterações observadas na hipertensão isolada se deve às características

provenientes da linhagem SHR, ou seja, ratos espontaneamente hipertensos. Esse modelo

experimental se assemelha a hipertensão primária ou essencial em humanos (AMARAL

& MICHELINI, 2011). Um dos possíveis mecanismos das disfunções celulares causadas

pela hipertensão no tecido renal é o estresse oxidativo devido ao aumento da produção

das espécies reativas de oxigênio (superóxido e o peróxido de hidrogênio), sendo um

fator chave para a progressão da doença renal (GUIJARRO e EGIDO, 2001; WILCOX

2005; AGARWAL et al., 2012). Tal fato, pode ser observado no grupo H, evidenciado

pelo aumento no dano à proteinas e o aumento da enzima SOD, já que esta é a principal

enzima que remove ânion superóxido (ARAUJO e WILCOX, 2014). Portanto, o aumento

da PA pode ser correlacionada com aumento de estresse oxidativo, induzindo dano

tecidual. Pensando na regulação de PA, a sensibilidade barorreflexa foi prejudicada

também nas ratas SHR para ambas as respostas reflexas, o que poderia contribuir para o

aumento do estresse oxidativo, por promover prejuízo na regulação da circulação

momento-a-momento.

Além disto, o grupo que foi submetido ao consumo crônico de frutose apresentou

aumento adicional da PA, exacerbação da redução da sensibilidade barorreflexa, aumento

da modulação simpática vascular acompanhadas de aumento de lipoperoxidação e dano à

proteína em tecido renal e redução do NOx plasmático. Existem evidências que a

redução da biodisponibilidade de NO assim como o aumento dos componentes do

75

sistema renina angiotensina contribuem para o processo inflamatório e principalmente

para a hipertensão (AGARWAL et al., 2012). Portanto, o aumento da atividade simpática,

observada pela secreção de neurohormônios (noraepinefrina e aldosterona), aumenta a

expressão das citocinas pro-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-1β) através da transdução do

fator nuclear Kapa B (NFκB) (JANSSEN-HEININGE et al., 2000). Assim, estas

disfunções celulares em conjunto contribuem a um pior prognóstico no desenvolvimento

da hipertensão (WILCOX 2005; VAZIRI e RODRIGUEZ-ITURBE, 2006).

Neste sentido, um achado importante do presente estudo foi a melhora da

sensibilidade barorreflexa nos grupos treinados (resposta taquicárdica para o treino

aeróbio e resposta bradicárdica para o treino resistido), a qual pode estar relacionada com

a normalização da BF-PAS e com a melhora na modulação vagal cardíaca (RMSSD e

VAR-IP). Adicionalmente, ambos os protocolos de treinamento físico induziram redução

de TBARS e CARB e aumento do NOx plasmático. Estudos anteriores também

evidenciaram aumento da biodisponibilidade de NO pós treinamento aeróbio em machos

SHR (BERTAGNOLLI et al., 2008). Vale lembrar que a banda de BF-PAS foi

positivamente correlacionada com o TBARS (nos grupos FHO, FHOTa e FOHTr),

sugerindo que animais com menor modulação simpática vascular apresentavam menor

lipoperoxidação em tecido renal. O TBARS foi também correlacionado com o NOx,

sugerindo que quanto menor a lipoperoxidação maior a biodisponibilidade de NO nos

animais tratados com frutose (sedentários e treinados) (Artigo 3). Em conjunto, esses

resultados sugerem que, apesar de não modificar a PA de repouso, o treinamento físico

dinâmico aeróbio ou resitido têm um impacto positivo na regulação autonômica da

circulação (melhora da modulação simpática vascular e do barorreflexo), a qual pode

estar associada a redução do estresse oxidativo em tecido renal, bem como a maior

biodisponibilidade de NO.

76

O consumo crônico de frutose nas ratas hipertensas ooforectomizadas promoveu

um aumento de leptina no tecido adiposo branco visceral. Este hormônio pode estar

associado com lipogênese, uma vez que o tecido adiposo branco subcutâneo é

responsável por 80% da produção de leptina, sendo quase exclusivamente expressa e

produzida no tecido adiposo branco (AHIMA & FLIER, 2000). O principal efeito

biológico da leptina é no sistema nervoso central (controle da ingesta de alimentos versus

energia consumida), sendo que seu aumento contribui no processo inflamatório (AHIMA

e FLIER, 2000). Um estudo recente do nosso grupo demonstrou em camundongos

submetidos a uma dieta rica em frutose índices elevados de leptina (DE ANGELIS et al.,

2012). Uma das contribuições da leptina no processo inflamatório é o controle da

produção de TNF-α e ativação de macrófagos (LOFFREDA et al., 1998). Em

contrapartida, algumas citocinas como o TNF-α, a IL-1 e a IL-6 podem aumentar a

expressão de RNAm para a síntese de leptina (SILVEIRA et al., 2009). No presente

estudo, observamos aumento de TNF-α e este foi positivamente correlacionado com a

leptina em tecido cardíaco, reforçando a hipótese acima de que o aumento de leptina

promove inflamação por meio do aumento de TNF-α. Corroborando com os nossos

achados, Renna et al. (2012) verificaram em ratos machos submetidos à sobrecarga de

frutose um aumento deste marcador inflamatório. Adicionalmente, o aumento do TNF-α

pode estar relacionado com o aumento da sensibilidade à insulina, uma vez que, esta

citocina está envolvida na patologia da resistência à insulina (HOSTAMISLIGIL et al.,

1996).

Por outro lado, o aumento da secreção da adiponectina contraregula à ação da

leptina, reduzindo a expressão do TNF- α, da IL-6, pelo aumento da expressão da citocina

antiinflamatória IL-10 (KUMADA et al., 2004; WOLF et al., 2004). Neste sentido,

77

observamos redução da adiponectina em tecido cardíaco no grupo FHO em relação ao

grupo C.

Diante deste cenário, as respostas de leptina e adiponectina frente aos protocolos

de treinamento físico indicam que a redução das concentrações de leptina e a redução da

massa corporal estão associadas com aumentos de adiponectinas séricas. Porém, a

redução do tecido adiposo/peso corporal pode não estar associadas às mudanças nas

concentrações de adipocinas (LAU et al., 2010; AHMADIZAD et al., 2007). De fato, em

nosso estudo verificamos aumento dos níveis de leptina após a sobrecarga de frutose com

redução dos níveis após o treinamento resistido, bem como redução de adiponectina em

todos os grupos frutose estudados (sedentário e treinados). Além disso, a redução de

leptina pode ser correlacionado com o redução do TNF-α pós treinamento. Neste sentido,

vale lembrar novamente a correlação obtida entre leptina e TNF-α, sugerindo que a

redução de leptina pós treinamento aeróbio (não sendo mais diferente do grupo C como o

grupo FHO) e resistido (vs. grupo FHO) pode ter induzido redução da inflamação e

consequentemente de estresse oxidativo em tecido cardíaco. Dessa forma, a correlação

inversa entre TNF-α e a razão redox da glutationa (aumentada pós treinamentos,

principalmente aeróbio) reforça que a redução de TNF-α possa ter modulado o estado

redox cardíaco. Um primeiro estudo realizado com adultos jovens portadores de

Síndrome de Down, utilizou o treinamento resistido e demonstrou redução de marcadores

inflamatórios sistêmicos em adultos, tais como leptina, TNFα e IL-6, mostrando uma

melhora na composição corporal (ROSETY-RODRIGUEZ et al., 2013). A diminuição da

leptina nos remete ao efeito que esse hormônio exerce sobre a insulina, o qual pode ser

mensurado através da utilização de glicose, e conforme comentado anteriormente pode

ter efeito sobre a resistência à insulina.

78

Vale ressaltar que a prescrição do treinamento físico resistido envolve a

combinação de diferente variáveis (intensidade, duração, carga, número de séries, número

de exercícios, massa muscular) e estes critérios dificultam a comparação dos dados

obtidos na literatura com relação a esse tipo de treinamento físico. Um estudo de Pereira

et al. (2013) avaliou em mulheres com/sem SM os efeitos do treinamento físico resistido

em alguns marcadores inflamatórios, demonstrando não haver alterações nas citocinas.

Possivelmente um dos mecanismos que explicaria tal fato, seria a depleção de glicogênio

do músculo esquelético, o que pode afetar diretamente a produção de IL-6. Desta forma,

os efeitos moduladores de IL-6 sobre a produção de TNF alfa e outras citocinas anti-

inflamatórias, tais como IL-1ra e IL-10 poderiam ser suprimidas. Entretanto, esse dado

difere do resultado obtido no grupo HFOTr no presente estudo. Talvez pela característica

bastante dinâmica do treinamento resistido em escada, bem como pela carga moderada

aplicada durante o treinamento resistido observamos redução de leptina, de TNF alfa,

além de aumento da IL-10 no grupo HFOTr. A IL-10 secretada por adipócitos atua como

antagonista do TNF-α, inibindo a sinalização do fator nuclear kappa B (NF-kB) (FAIN et

al., 2004). Speretta et al. (2012) observaram em ratos submetidos ao protocolo de

treinamento físico resistido redução do TNF-α e um aumento discreto da IL-10, porém

estes resultados foram mais expressivos quando os animais foram submetidos ao

treinamento de natação. Neste contexto, poucos são os estudos que utilizam o

treinamento físico resistido no manejo das doenças cardiovasculares. Além disso,

normalmente o aumento dos níveis de IL-10 são provenientes do treinamento físico

aeróbio, sugerindo benefícios anti-inflamatórios e redução da resistência à insulina pós

treino, pois esta interleucina exerce um papel fundamental modulando o metabolismo da

glicose (PEDERSEN et al., 2007 e 2006). No presente estudo, o aumento de IL-10 foi

mais expressivo (com diferenças estatísticas) no grupo HFOTr em relação ao grupo

79

HFOTa. No entanto, apesar disto, a normalização do RMSSD foi associada ao aumento

de IL-10, sugerindo que o aumento da modulação parassimpática cardíaca em ambos os

grupos treinados possa induzir aumento de marcadores anti-inflamatórios no coração

(Artigo 4).

Somado à isto, a inflamação vem sendo associada à aumento de estresse

oxidativo. Neste sentido, Delbosc et al. (2005) verificaram que o consumo de frutose

induziu estresse oxidativo cardíaco caracterizado por uma maior produção do ânion

superóxido levando a um aumento da concentração de TBARS, indicando

lipoperoxidação de membrana. Somado a isto, observou-se também em tecido cardíaco

diminuição da TRAP, SOD e GPx evidenciando redução das defesas antioxidantes em

machos SHR submetidos a ingesta crônica de frutose (GIRARD et al., 2006). Nossos

achados mostraram redução da TRAP, CAT e SOD no tecido cardíaco, sugerindo um

desbalanço nas defesas antioxidantes provavelmente em na tentativa de compensar o

aumento da lipoperoxidação de membrana (QL) e do danos às proteínas (CARB). Esses

dados corroboram com o estudo de Taleb-Dida et al. (2013) que avaliaram o perfil de

estresse oxidativo cardíaco e observaram redução da SOD em ratos submetidos a 60% de

sobrecarga de frutose. Além disto, reforçando o cenário de estresse oxidativo neste

modelo de associação de fatores de risco, a razão GSH/GSSG no tecido cardíaco estava

reduzida no grupo com associação de fatores de risco (FHO vs. C).

Entretanto, ambos os tipos de treinamento físico dinâmico, aeróbio ou resistido,

promoveram um aumento do balanço redox (mais expressiva no grupo FHOTa). Dessa

forma, podemos associar esse benefício à uma redução da QL e CARB com aumento da

TRAP e da CAT para o treinamento aeróbio e com o aumento da TRAP e da GPx para o

treinamento resistido. Bertagnolli et al. (2006) demonstraram redução de lipoperoxidação

de membranas e melhora de enzimas antioxidantes pós treinamento físico aeróbio em

80

ratos SHR. Parise et al. (2005) observaram aumento das enzimas antioxidantes no tecido

muscular (CAT e na isoforma CuZnSOD) salientando que o treinamento resistido resulta

em adapatações citosólico favoráveis. Além disto, em modelo de sobrecarga de frutose

em ratos machos foi demonstrado prejuízo na defesa antioxidante enzimática e não

enzimática, sendo esse revertido pelo treinamento físico aeróbio, que reduziu a

lipoperoxidação de membrana e aumentou a defesa antioxidante. Tais achados sugerem

um mecanismo adaptativo ao exercício físico crônico (THIRUNAVUKKARASU et al.,

2003). Redução de estresse oxidativo foi também observada no estudo de Scheffer et al.

(2012), no qual os animais machos saudáveis submetidos ao treinamento físico resistido

em escada com intensidade moderada apresentaram menos dano celular. Recentemente,

demonstramos uma redução da lipoperoxidação de membrana e danos à proteínas

associadas à um aumento da GPx em animais SHR ooforectomizados submetido ao

treinamento resistido com um protocolo semelhante ao empregado para o grupo FHO

(DA PALMA, 2012). Vale destacar que poucos estudos avaliaram o efeitos do

treinamento físico resistido no estresse oxidativo, principalmente de moderada

intensidade em situações fisiopatológicas. Neste sentido, o presente estudo evidencia pela

primeira vez os benefícios desta abordagem, prescrita de forma individualizada, dinâmica

e em intensidade moderada (40-60% da carga máxima), em um modelo experimental de

associação de fatores de risco.

Adicionalmente, vale lembrar que não houve redução do RMSSD, representativo

da modulação vagal cardíaca, nos grupos treinados (aeróbio ou resistido) conforme

observado no grupo sedentário (FHO). Este importante índice parassimpático foi

inversamente correlacionado com a QL, com as carbonilas e positivamente

correlacionado com o balanço redox, sugerindo que os animais que apresentavam

81

melhora da modulação vagal cardíaca pós treinamento tinham menor balanço redox e

consequentemente menor lesão à proteínas e lipídeos (Artigo 4).

Concluindo, nossos resultados evidenciam que a sobrecarga de frutose induziu

prejuízo da modulação autonômica cardiovascular associado ao aumento de parâmetros

inflamatórios e de estresse oxidativo em ratas ovariectomizadas hipertensas. O

treinamento físico dinâmico aeróbio ou resistido de intensidade moderada neste modelo

de associação de fatores de risco atenuou algumas das disfunções metabólicas,

cardiovasculares e autonômicas provavelmente por melhorar o perfil de marcadores

inflamatório e o estresse oxidativo. Nossos achados reforçam o papel das alterações

autonômicas cardiovasculares na modulação da função imunológica (DE ANGELIS et

al., 2012; LAU et al., 2005; VAN GAAL et al., 2006; BOROVIKOVA et al., 2000),

induzindo a liberação de moléculas bioativas que estão envolvidos no aumento do

estresse oxidativo e desenvolvimento das alterações cardiometabólicas após a privação

dos hormônios ovarianos.

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96

6. ANEXOS

6.1. ANEXO 1 – PARECER DO COEP

100

6.2. ANEXO 2 – Artigo submetido à revista Diabetes,

Obesity and Metabolism

102

Cardiovascular autonomic dysfunction and oxidative stress induced by fructose overload in

an experimental model of hypertension and menopause.

Filipe Fernandes Conti1; Janaina de Oliveira Brito

1; Nathalia Bernardes

2; Danielle da Silva

Dias1; Iris Callado Sanches

1; Christiane Malfitano

1; Maria-Claudia Irigoyen

2; Kátia De Angelis

1

¹ Laboratory of Translational Physiology, Universidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo,

SP, Brasil.

2 Hypertension Unit, Heart Institute (InCor), School of Medicine, University of Sao Paulo, São

Paulo, SP, Brasil.

Running title

Cardiometabolic dysfunctions in OVX rats

Correspondence author:

Kátia De Angelis

Laboratory of Translational Physiology, Universidade Nove de Julho

Rua Vergueiro, 235/249 – Liberdade – Sao Paulo – SP - Brasil

ZIP Code - 01504-001

Fone: 55 11 3385 9067

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

103

ABSTRACT

The aim of this study was to assess the effects of fructose overload on cardiovascular autonomic

modulation, inflammation and cardiac oxidative stress in an experimental model of hypertension

and menopause. Female SHR rats were divided into (n=8/group): hypertensive (H), hypertensive

ovariectomized (HO) and hypertensive ovariectomized submitted to fructose overload (100g/L in

drinking water) (FHO). Arterial pressure (AP) signals were directly recorded. Cardiac autonomic

modulation was evaluated by spectral analysis. Oxidative stress was evaluated in cardiac tissue.

AP was higher in the FHO group when compared to the other groups. Fructose overload induced

an increase in body and fat weight, triglyceride concentration and a reduction in insulin

sensitivity. IL-10 was reduced in the FHO group when compared to the H group. TNF-α was

higher in the FHO in comparison to all other groups. Lipoperoxidation was higher and

glutathione redox balance was reduced in the FHO group when compared to other groups, an

indication of increased oxidative stress. A negative correlation was found between IL-10 and

adipose tissue. In conclusion, fructose overload induced an impairment in cardiac autonomic

modulation associated with inflammation and oxidative stress in hypertensive rats undergoing

ovarian hormone deprivation.

Key words: menopause, metabolic syndrome, heart rate variability, blood pressure variability,

inflammation, oxidative stress.

104

INTRODUCTION

Metabolic syndrome is characterized by the association of 3 or more risk factors,

including: abdominal obesity associated with an excess of abdominal fat, insulin resistance, type

2 diabetes, dyslipidemia and hypertension. Changes in dietary habits are among the leading

contributors to the growing worldwide prevalence of metabolic syndrome, obesity, and type 2

diabetes. These changes are characterized by increased intake of simple sugars, particularly

fructose, commonly used in the food industry and sugar-sweetened drinks [1]. Indeed, several

studies have pointed to the adverse cardiac and metabolic effects of a high fructose diet in animal

models. Fructose-fed rats and mice show moderate hypertension and glucose intolerance,

associated with increased levels of plasma insulin, cholesterol and triglycerides [2,3,4,5]. Our

group has demonstrated that only eight weeks consumption of fructose was sufficient to induce

prominent metabolic and cardiovascular changes associated with autonomic dysfunctions in mice

and rats [2,5,6]. Recently, we have demonstrated that increased sympathetic modulation for

vessels and heart preceded the development of metabolic dysfunction in fructose fed mice [4].

However, it should be stressed that the prevalence of hypertension and metabolic

dysfunctions sharply increases after menopause. The association between autonomic dysfunction

and cardiovascular diseases strengthens evidence that alterations in the sympathovagal control

increase cardiovascular risk after menopause [7]. Moreover, seems to be an association between

oxidative stress inflammation, and both would play a role in the development of several

cardiovascular diseases [8]. However, the role of the oxidative stress and inflammation on

cardio-metabolic dysfunction after ovarian hormone deprivation is not well understood. Thus,

our study was designed to evaluate the hypothesis that in this context, fructose overload may

promote additional injuries on cardiovascular autonomic modulation, inflammation and oxidative

105

stress in hypertensive rats undergoing ovarian hormone deprivation. In this study, we assed the

effects of fructose overload on cardiovascular autonomic modulation, inflammation and

oxidative stress in an experimental model of hypertension and menopause.

METHODS

21 day old female SHRs were obtained from the Animals Facilities of the Institute of Cardiology

of Rio Grande do Sul. The rats were randomly divided into hypertensive (H; n = 8), hypertensive

OVX (HO; n = 8) and hypertensive OVX undergoing fructose overload (FHO; n = 8). All

surgical procedures and protocols were approved by the ethics committee of Universidade Nove

de Julho (Protocol AN002/12) and were conducted in accordance with the Guide for the Care

and Use of Laboratory Animals, issued by the National Institutes of Health.

Fructose overload

FHO rats received D-fructose (100 g/L) in the drinking water for 19 weeks. H and HO animals

received standard laboratory chow and water ad libitum. The consumption of chow and water

(with or without fructose) were measured weekly.

Ovariectomy

After 10 weeks of fructose overload, the animals were anesthetized (80 mg/kg ketamine and 12

mg/kg xylazine), and the oviduct was sectioned and the ovary removed as describedin detail

elsewhere [9,10,11]. Data from our laboratory have demonstrated that estrogen concentration,

measured through immunoassay, was 39±7 pg/mL in healthy female rats. However, in the

present study, estrogen concentration was not detectable in ovariectomized studied groups, thus

confirming ovarian hormone deprivation [10].

106

Metabolic evaluations

At the end of protocol (19 weeks of fructose overload), blood glucose and triglyceride

concentrations were measured (Accucheck and Accutrend, Roche) after 4-hour fasting. For

insulin tolerance test, the animals fasted for 2 hours and were then anesthetized with sodium

thiopental (40 mg/kg body weight, IP). A drop of blood was collected from the tail for blood

glucose level measurement at baseline and 4,8, 12, and 16 minutes after insulin injection (0.75

U/kg). The constant rate for blood glucose disappearance (KITT) was calculated using the

0.693/t1,2 formula. Blood glucose t1/2 was calculated from the slope of the least squares

analysis of blood glucose concentrations during the linear phase of decline [6,12].

Cardiovascular measurements

After metabolic evaluations, rats were anesthetized with ketamine (80 mg/kg) and xylazine (12

mg/kg), and two polyethylene-tipped Tygon cannulas filled with heparinized saline were

implanted into the carotid artery and jugular vein for direct measurements of AP and drug

administration, respectively. During the experiment, rats received food and water ad libitum; the

rats were conscious in their cages and were allowed to move freely during the hemodynamic

experiments.The arterial cannula was connected to a transducer (BloodPressure XDCR, Kent

Scientific), and blood pressure signals were recorded for a 30-minute period using a

microcomputerequipped with an analog-to-digital converter (CODAS, 2Kz,DATAQ

Instruments). The recorded data were analyzed on a beat-to-beat basis to quantify changes in

systolic (SAP), diastolic (DAP), and mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) [5,9,10].

Autonomic measurements

Time-domain analysis consisted of calculating mean pulse interval (PI) and SAP, with PI

variability and SAP variability measured from its respective time series (three time series of 5

107

min for each animal). For frequency domain analysis, the same time series of PI and SAP were

cubic splineY interpolated (250 Hz) and cubic splineY decimated to be equally spaced in time

after linear trend removal; power spectral density was obtained through the fast Fourier

transformation. Spectral power for low-frequency (LF; 0.20-0.75 Hz) and high-frequency

(HF;0.75-4.0 Hz) bands was calculated by power spectrum density integration within each

frequency bandwidth, using a customized routine (MATLAB 6.0, Mathworks) [13].

Inflammatory markers

IL-6, IL-10 and TNF-α levels were determined using a commercially available ELISA kit (R&D

Systems Inc.), in accordance with the manufacturer's instructions. ELISA was performed in

96-well polystyrene microplates with a specific monoclonal antibody coating. Absorbance was

measured at 540 nm in a microplate reader.

Oxidative stress profile

One day after hemodynamic evaluations the animals were killed by decapitation and the heart

(ventricles) was immediately removed, rinsed in saline, and trimmed to remove fat tissue and

visible connective tissue. The tissue was cut into small pieces, placed in ice-cold buffer, and

homogenized in an ultra-Turrax blender with 1 g tissue per 5 mL 150 mM KCl and 20 nM

sodium phosphate buffer, pH 7.4. The homogenate was centrifuged at 600 g for 10 min at -26C.

Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS): For the TBARS assay, trichloroacetic acid

(10%, w/v) was added to the homogenate to precipitate proteins and to acidify the samples [14].

This mixture was then centrifuged (10000g, 3 min), the protein-free sample was extracted, and

thiobarbituric acid (0.67%, w/v) was added to the reaction medium. The tubes were placed in a

water bath (100°C) for 15 min. The absorbencies were measured at 535 nm using a

spectrophotometer. The results are expressed as nanomoles per milligram of protein.

108

Chemiluminescence (CL): [Tissue] membrane lipoperoxidation was evaluated by

chemiluminescence. The chemiluminescence assay was carried out with an LKB Rack Beta

liquid scintillation spectrometer 1215 (LKB Producer AB, USA) in the out-of-coincidence mode

at room temperature (256 to 276C). The supernatants were diluted in 140 mM KCl and 20 mM

sodium phosphate buffer, pH 7.4, and added to glass tubes, which were placed in scintillation

vials; 3 mM tert-butylhydroperoxide was added, and chemiluminescence was determined up to

the maximal level of emission [9,15].

Antioxidant enzyme activities: The quantification of superoxide dismutase (SOD) activity,

expressed as U/mg protein, was based on the inhibition of the reaction between O2˙− and

pyrogallol [16]. Catalase (CAT) activity was determined by measuring the decrease in H2O2

absorbance at 240 nm. CAT concentration was expressed as μmol H2O2 reduced/min/mg protein

[17]. Glutathione peroxidase (GPx) activity was expressed as nmol peroxide/hydroperoxide

reduced/min/mg protein and was based on the consumption of NADPH at 480 nm [18].

Glutathione and GSSG concentration:To determine glutathione oxidized (GSSG) and total

glutathione concentration (GSH), tissue was homogenized in 2 M perchloric acid and centrifuged

at 1000 g for 10 min, and 2 M KOH was added to the supernatant. The reaction medium

contained 100 mM phosphate buffer (pH 7.2), 2 mM NADPH, 0.2 U/mL glutathione reductase

and 70 μM 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid). To determine the GSSG concentration, the

supernatant was neutralized with 2 M KOH and inhibited by the addition of 5 μM N-

ethylmaleimide. Absorbance was read at 420 nm [19]. GSH values were determined from the

total and GSSG concentration.

109

Statistical analysis

Data are expressed as mean±SEM. The Levene Test was used to evaluate data homogeneity. A

one-way analysis of variance followed by the Student-Newman-Keuls test was used to compare

groups. Pearson correlation analysis was used to identify an association between variables.

Significance level was established at P≤0.05.

RESULTS

Body weight and adipose tissue weight were higher in FHO group when compared to

other groups. Glycemia was similar between groups. Triglyceride was increased in the FHO

group when compared to all other groups. Insulin sensitive was lower in FHO group when

compared to the H group (Table 1).

Resting tachycardia was observed in the FOH group when compared to the other groups.

DAP and MAP were higher in HO group when compared to the H group and the FHO group had

an additional increase in SAP, DAP and MAP (Table 2).

Standard deviation (SD) and total variance VAR of PI were lower in FHO groups when

compared to the HO group. Total variance (VAR) of SAP was increased in the HO group in

relation to the H group. VAR and LF band of SAP were higher in the FHO group when

compared to all other studied groups (Table 2).

TNFα was higher in the FHO when compared to all other groups and IL-10 was lower in

FHO when compared to the H group. Negative correlation was observed between adiposity

tissue and IL-10 among hypertensive groups (r = -0.6) (Table 3 and Figure 1).

TBARS was enhanced in both HO and FHO groups in relation to H group; and additional

increase in TBARS was observed in FHO rats as compared to HO rats. Moreover, CL was higher

110

in FHO when compared to all other groups. Hormone deprivation promoted an increase in CAT

activity and fructose overload promoted an additional increase in this parameter. We did not

observe any difference in SOD activity between groups. GPx was lower in HO group when

compared to the H group and the fructose overload promoted an additional increase in this

parameter (Table 4).

DISCUSSION

In the present study, it was observed that ovarian hormone deprivation and fructose

overload led to impairments in cardiovascular autonomic modulation, and worsened both

oxidative stress and inflammation parameters.

Ovarian hormone deprivation induced an increase in AP and promoted an increase in

vascular sympathetic modulation in SHR rats in the present study. Previous studies from our

group have also demonstrated that ovarian hormone deprivation induces BP increase and led to

impaired baroreflex sensitivity in healthy Wistar rats [9,10]. In addition, it should be noted that

in the first decades of life, women have a greater cardioprotection when compared to men, as

evidenced by increased vagal modulation and lower sympathetic modulation. However,

approximately between the fifth and sixth decade of life this greater cardioprotection disappears

[7], a period that coincides with the advent of menopause, thus demonstrating the importance of

ovarian hormones in cardiovascular control.

Experimentally, fructose overload in drinking water or chow has been used to study

metabolic syndrome and promote similar metabolic and autonomic derangements [2,3,5,20,21].

Indeed, in present study, fructose overload promoted an additional impairment of metabolic,

autonomic, oxidative stress and inflammatory parameters in hypertensive ovariectomized rats. In

111

fact, the sum of risk factors (hypertension + ovariectomy + fructose overload) promoted an

increase in body weight, adipose tissue and triglyceride concentrations as well as impaired

insulin sensitivity in FHO rats. It has been demonstrated that the exposure of the liver to large

quantities of fructose promotes rapid stimulation of lipogenesis, which contributes to triglyceride

accumulation, leading to fewer insulin receptors and, consequently, reducing insulin sensitivity

[22].

Moreover, the sum of risk factors promoted an increase in the heart rate, an additional

increase in BP, impairment in heart rate variability and systolic arterial pressure variability.

Several studies have found an increase in BP after fructose overload [5,21,23]. In the present

study, we observed that both DAP and MAP were higher in HO group when compared to the H

group and FHO group had an additional increased in SAP, DAP and MAP. One possible

explication for this increased BP would be the impairment of cardiovascular autonomic

modulation.

Heart rate variability has considerable as a tool to to assess the role of autonomic nervous

system fluctuations in normal healthy individuals and in patients with various cardiovascular and

non-cardiovascular disorders [24]. Reduction in HRV has been associated with negative

outcomes [25]. In the present study, fructose overload promoted a reduction in HRV as well as

an increase in sympathetic activity as demonstrated by the increase in VAR-SAP and LF-SAP.

Moreover, previous studies from our group have shown that fructose overload also promotes an

increase in sympathetic tonus, a decrease in vagal tonus and a reduction in baroreflex sensitive

[5].

Regarding inflammation makers, we observed that in this study TNF-α was higher in

FHO when compared to other groups and fructose overload promoted a reduction in IL-10. We

112

also found a negative correlation between adipose tissue an IL-10. In fact, adipose tissue is an

active endocrine and paracrine organ that releases a large number of cytokines and bioactive

mediators, such as leptin, interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) [26,27].

These substances negatively influence glucose and lipid homeostasis, blood pressure,

coagulation, fibrinolysis and inflammation, which may lead to endothelial dysfunction and

atherosclerosis [26,27].

Moreover, a decreased antioxidant capacity together with increased lipid peroxidation has

been reported in patients with fatty liver, visceral obesity, and metabolic syndrome. There seems

to be a correlation between the amount of visceral fat and systemic oxidative markers, indicating

that visceral fat is an independent regulator of oxidative changes [28]. Regarding antioxidant

enzymes, hormone deprivation promoted an increase in CAT concentration and a decrease in

GPx activity in the HO group when compared to the H group. Ruiz et al. have shown that

17beta-estradiol has intrinsic antioxidant properties, and the lack of it would then result in

enhanced CAT activity, probably due to an increased concentration of hydrogen peroxide [29].

Our results are in agreement with Barp et al.,[30] who have likewise demonstrated an increased

cardiac CAT activity in ovariectomized rats. Moreover, the increase in CAT in the HO group (vs.

H) may be also associated with the observed decrease in GPx in this group, since these enzymes

compete for the same substrate (hydrogen peroxide). Importantly, lipoperoxidation (TBARS)

was increased in SHR ovariectomized rats when compared to intact SHR rats, suggesting

increased oxidative stress. A previous study from our group has demonstrated a positive

correlation between systolic AP and lipoperoxidation, thus reinforcing the role of oxidative stress

in AP changes during female hormone deprivation [9]. However, it should be stressed that,

despite favorable changes in antioxidant enzymes in fructose fed group observed in the present

113

work, lipoperoxidation was markedly increased in the fructose group (TBARS and CL) while

glutathione redox balance was reduced, thus demonstrating an imbalance between pro-oxidant

and antioxidant forces. This would point to increased oxidative stress in rats undergoing

association of risk factors.

In conclusion, fructose overload induced impairment of cardiovascular autonomic

modulation associated with increased oxidative stress and inflammatory parameter in

hypertensive ovariectomized rats. These data reinforce the role of autonomic changes in immune

function modulation [4,26,27,31], by inducing the release of bioactive molecules which are

involved in the increased oxidative stress and development of cardiometabolic changes after

menopause.

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117

Figure caption

Figure 1. Negative Pearson correlation (r = -0.6, P = 0.05) obtained between adipose tissue and

cardiac levels of IL-10 for studied groups.

118

TABLE 1. Metabolic evaluations in studied groups

H HO HFO

Body weight (g) 197±2 264±3† 261± 2†#

Adipose Tissue (g) 1.91±0.16 2.96±0.45 5.25±0.39†¥

Glucose (mg/dL) 83±5.0± 84±2.0 92±2.1

Triglyceride (mg/dL) 132±4.0 125±6.4 160±8.0†¥

KITT (%/min) 4.15±0.26 4.69±0.33 3.4±0.28†

Data are reported as mean± SEM. †P<0.05 vs. H; ¥ P<0.05 vs HO. KITT: constant rate for blood

glucose disappearance.

119

TABLE 2. Hemodynamic and autonomic evaluation in studied groups

H HO FHO

SAP (mmHg) 174±5 183±6 206±4†¥

DAP (mmHg) 121±7 144±5† 153±2†¥

MAP (mmHg) 146±6 164±5† 174±4†¥

HR (bpm) 352±13 348±16 403±12†¥

HRV

SD (ms) 6.62±0.61 8.63±1.00 5.43±0.96¥

VAR (ms²) 53.97±7.98 63.64±10.34 30.84 ±6.81¥

LF (ms²) 3.18±0.55 3.94±0.97 0.90±0.12¥

HF (ms²) 5.97±1.41 9.22±2.03 2.77±0.18

BPV

VAR (mmHg²) 31.08±2.66 51.94±6.94† 77.79±11.87†¥

LF (mmHg²) 5.06±0.91 5.07±0.52 10.62±2.33†¥

Data are reported as mean± SEM. †P<0.05 vs. H; ¥ P<0.05 vs. HO. SAP: systolic arterial pressure;

DAP: diastolic arterial pressure; MAP: mean arterial pressure; HR: heart rate; Heart rate (HRV) and

systolic blood pressure (BPV) variability computed from 0.20 to 3 Hz (total power). SD: standard

deviation; VAR: total variance; LF: low-frequency band (0.20-0.75 Hz); HF: high-frequency band

(HF: 0.75-3 Hz).

120

TABLE 3. Inflammatory markers in studied groups

H HO FHO

TNF α (pg/mg protein) 32.9±7.5± 31.7±8.6 65.8±9.9¥†

IL-6 (pg/mg protein) 379±27 368±26 401±35

IL-10 (pg/mg protein) 37.1±9.0 29.6±3.4 16.2±2.5†

Data are reported as mean± SEM. †P<0.05 vs. H; ¥ P<0.05 vs. HO.

121

TABLE 4. Oxidative stress evaluations in studied groups

HS HO FHO

TBARS

(µmol/mg protein)

4.95±0.89 8.27±0.98† 12.03±0.93†¥

CL

(cps/mg protein)

6661±566 6514±547 15043±1333†¥

CAT

(nmol/mg protein)

0.29±0.04 0.47±0.05† 0.63±0.05†¥

SOD

(USOD/mg protein)

11.47±0.37 11.17±0.41 13.05±0.86

GPx

(nmol/min/mg protein)

54.78±3.10 38.55±1.67† 63.39±5.52¥

GSH/GSSG

(nmol/min/mg protein)

11.07±0.7 13.00±1.4 8.94±0.8¥

Data are reported as mean± SEM. †P<0.05 vs. H; ¥ P<0.05 vs. HO.

122

Figure 1

123

6.3. ANEXO 3 – Artigo publicado na revista Menopause

131

6.4. ANEXO 4 – Artigos publicados e submetidos

durante o período do Doutorado

142

Impact of hypertension in exercise training induced-cardiometabolic benefits in

fructose-fed ovariectomized rats: role of autonomic and oxidative stress changes.

SHORT TITLE: Exercise training in SHR fructose-fed OVX rats

Janaina de O. Brito1*

, Iris Callado Sanches1*

, Nathalia Bernardes1,2

, Kátia Ponciano3,

Adriane Belló-Klein4, Maria Cláudia Irigoyen

2, Kátia De Angelis

1

1- Laboratory of Translational Physiology, Universidade Nove de Julho (UNINOVE), Sao

Paulo - Brazil.

2- Hypertension Unit, Heart Institute (Incor), Medical School, University of Sao Paulo,

Sao Paulo - Brazil.

3- Sao Judas Tadeu University, Sao Paulo - Brazil

4- Laboratory of Cardiovascular Physiology, Department of Physiology, Basic and

Health Science Institute, Federal University of Rio Grande do Sul, Porto Alegre,

Brazil

*These authors contributed equally to this paper.

Corresponding author

Kátia De Angelis, PhD

Universidade Nove de Julho - Science Rehabilitation Program.

Rua Vergueiro 235/249 – 2º subsolo – Mestrado, ZIP CODE 01504 001

Sao Paulo, SP, Brazil.

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

143

ABSTRACT

In this study we tested the hypothesis that the presence of hypertension favors the

development of additional cardiometabolic and oxidative stress changes in fructose rats

while blunting some beneficial effects of exercise training. Ovariectomized fructose-fed

rats were divided into: sedentary (SOF) and trained (TOF) normotensive groups,

sedentary (SHOF) and trained (THOF) hypertensive groups. Exercise training (ET) was

performed on a treadmill (8 wks). Arterial pressure (AP) was directly recorded (CODAS,

2kH). Cardiovascular autonomic modulation was evaluated in the time and in the

frequency (spectral analysis) domains. Chemiluminescence (CL) and antioxidant

enzymes were determined in the heart tissue. Hypertension induced a reduction in pulse

interval (VAR-PI) total variance, RMSSD and alpha index (spontaneous baroreflex),

while increasing systolic AP total variance (VAR-SAP) and low frequency band (LF-

SAP). SHOF rats presented resting tachycardia in relation to the other studied groups, and

ET induced resting bradycardia in both trained groups. ET increased RMSSD in TOF

group and VAR-PI in both trained groups; reduced VAR-SAP and LF-SAP in THOF

group and improved baroreflex sensitivity in both trained groups. AP, VAR-IP, RMSSD,

VAR-SAP and alpha index were impaired in THOF rats when compared to TOF rats. CL

was reduced and the catalase was increased in trained groups when compared to

sedentary ones. Negative correlations were obtained between RMSSD and CL (r=-0.60,

p<0.05), and baroreflex sensitivity and CL (r=-0.63, p<0.05). In conclusion, hypertension

induced additional hemodynamic and autonomic dysfunctions in fructose fed

ovariectomized rats and abolished some aerobic exercise training benefits. These

alterations may be related to changes in cardiovascular autonomic modulation associated

with oxidative stress.

144

KEY WORDS: Exercise training; Hypertension; Menopause; Metabolic Syndrome;

Autonomic Dysfunction; Oxidative Stress

145

INTRODUCTION

Since the Framingham Study, hypertension has been shown to predispose powerfully to

all of the major atherosclerotic cardiovascular events, including coronary disease, stroke,

peripheral artery disease and heart failure [1,2]. Moreover, it’s important to consider that

the tendency for risk factors to cluster in persons with hypertension has been found to

increase stepwise with weight gain [3]. In fact, a 5-lb weight gain imposed a 30%

increase in the extent of clustering [3]. Furthermore, it should be stressed that high

proportion of hypertensive individuals has increased prevalence of metabolic syndrome

[3], a cluster of conditions associated with a nearly two fold increase in cardiovascular

events [4]. However, the concept of the metabolic syndrome as a clinical syndrome has

recently been challenged and controversy exists as to whether metabolic syndrome adds

to cardiovascular risk above and beyond the sum of its independent metabolic

components, e.g., increased arterial pressure.

Given the epidemic of obesity in both industrialized and third world countries, high

dietary fructose has been regarded as a link to strong factor in the development of

metabolic and cardiovascular disorders. Our group has previously demonstrated that

normotensive female rats undergoing chronic fructose consumption showed increased

arterial pressure, insulin resistance and reduced vagal tonus [5]. More recently, given that

most of the above risk factors have been found in women after menopause [6], we

observed that the fructose overload led to increases in triglycerides, insulin resistance,

blood pressure and heart rate, and impairment in cardiovascular autonomic modulation in

hypertensive ovariectomized rats [7]

A large number of studies have consistently demonstrated the role of increased oxidative

stress in the pathogenesis of cardiometabolic disorders [8,9,10]. Importantly, in recent

years we have demonstrated that there is association between the impairment of

146

automomic control of circulation and oxidative stress in normotensive and hypertensive

rats [11,12,13], reinforcing the critical role of these markers in the development of

cardiovascular disease. However, few studies have evaluated changes in oxidative stress

induced by fructose overload and no evidence of the impact of hypertension on these

changes has been found. Likewise, there have been no studies lending support to a

possible association between impairment of cardiovascular autonomic modulation and

oxidative stress in this model of metabolic syndrome.

Finally, given the increased risk of cardiometabolic disease observed in after menopause,

compounded by changes in eating habits and sedentary style of life, therapeutic

alternatives have been sought for the management of this population. In this sense, we

have demonstrated that exercise training reduces body weight, arterial pressure, resting

heart rate, and improves baroreflex sensitivity correlated with reduction in oxidative

stress markers in ovariectomized Wistar rats [11]. Aerobic exercise training also

attenuated metabolic impairment, resting tachycardia, cardiac and vascular sympathetic

increases, and baroreflex sensitivity decrease induced by fructose overload in

hypertensive ovariectomized rats, but it did not reduce AP [7]. However, the impact of

hypertension on these exercise training-induced benefits after fructose overload remains

poorly understood. In this study we tested whether hypertension favors the development

of additional cardiometabolic and oxidative stress changes in fructose rats and blunts

some beneficial effects of exercise training. These hypertension-induced adverse effects

may be related to impairment in cardiovascular autonomic control mediating changes in

oxidative stress. Thus, the purpose of the present study was to assess the impact of

hypertension on the metabolic, cardiovascular, autonomic and oxidative stress effects

induced by aerobic exercise training in ovariectomized rats undergoing fructose overload.

147

METHODS

Wistar and SHR female rats with 21 days of age were obtained from the Animals

Facilities of the Institute of Cardiology of Rio Grande do Sul. All rats underwent fructose

overload and ovariectomy, and were divided into 4 groups (n=8 each): normotensive

sedentary (SOF) and trained (TOF), hypertensive sedentary (SHOF) and trained (THOF).

This study was carried out in strict accordance with the recommendations in the Guide

for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health. The

protocol was approved by the Ethic Committee of Sao Judas Tadeu University (Protocol:

01/2008).

Fructose overload. All the groups received D-fructose (100g/L) in the drinking water [5]

from it weans until the end of protocol (19 wks of treatment). Chow and fructose

consumption were measured weekly.

Ovariectomy. After 10 weeks of fructose overload, animals were anesthetized (80 mg/kg

ketamine and 12 mg/kg xylazine), their oviduct was sectioned and the ovary removed as

described in detail elsewhere [11,14].

Exercise training protocol. All animals were adapted to the treadmill (10min/day; 0.3

km/h) for 5 days before beginning the exercise training protocol and underwent a

maximal treadmill test, as described previously [15]. The tests were carried out after 11

weeks of fructose overload, at the middle (4th

week) and at the end of protocol (8th

week).

The purpose of these tests was to determine exercise capacity and to prescribe exercise

training intensity.

Exercise training was performed on a motorized treadmill (Imbramed TK-01) at low [to]

moderate intensity (40 – 60% maximal running speed) for 1h a day, 5 days/week for 8

weeks, with a gradual increase in speed from 0.3 to 1.2 km/h [11,14].

148

Metabolic evaluations. At the time of ovariectomy (10 wks of fructose overload) and at

end of protocol (19 wks of fructose overload) body weight, blood glucose (Accucheck®,

Roche) and triglycerides (Accutrend®, Roche) concentrations were measured

(Accucheck® and Accutrend®, Roche) after a 4h fasting. Additionally, the intravenous

insulin tolerance test (ITT) was performed at these times. For this procedure, the animals

were fasted for 2-3h, and anesthetized with sodium thiopental (40 mg/kg body weight,

ip). A drop of blood was collected from the tail for blood glucose level measurement at

baseline and 4, 8, 12 and 16 minutes after insulin injection (0.75 U/kg). The constant rate

for blood glucose disappearance (KITT) was calculated from the slope of the least

squares analysis of the blood glucose concentrations during the linear phase of decline

[5,16].

Cardiovascular measurements. One day after the final metabolic evaluations, rats were

anesthetized with ketamine (80 mg/kg) and xylazine (12 mg/kg), and polyethylene-tipped

Tygon cannula filled with heparinized saline was implanted into the carotid artery for

direct measurements of arterial pressure. During experiments, rats received food and

water with fructose ad libitum; they were conscious in their cages and allowed to move

freely during the hemodynamic experiments. Twenty four hours after surgical

procedures, an arterial cannula was connected to a transducer (Blood Pressure XDCR,

Kent© Scientific), and blood pressure signals were recorded for a 30min period using a

microcomputer equipped with an analog-to-digital converter (CODAS, 2Kz, DATAQ

Instruments). The recorded data were analyzed on a beat-to-beat basis to quantify

changes in systolic (SAP), diastolic (DAP) and mean arterial pressure (MAP) and heart

rate (HR) [11,14].

Autonomic measurements. Time-domain analysis consisted in calculating mean pulse

interval (PI) and SAP, PI variability (PI-VAR) and SAP variability (SAP-VAR) as the

149

standard deviation from its respective time series. For frequency domain analysis, the

whole 20min time series of PI and SAP were cubic-spline-interpolated (250 Hz) and

decimated to be equally spaced in time. Following linear trend removal, power spectral

density was obtained by the Fast Fourier Transformation. Spectral power for low- (LF:

0.20-0.75 Hz) and high (HF: 0.75-4.0 Hz) frequency bands was calculated by means of

power spectrum density integration within each frequency bandwidth, using a customized

routine (MATLAB 6.0, Mathworks). Beat-to-beat values of SAP and PI were used to

estimate cardiac baroreflex sensitivity by spectral analysis, using the alpha index for the

LF band (0.20-0.75 Hz). Coherence between the PI and SAP variability signals was

assessed by means of cross-spectral analysis. Alpha index was calculated only if the

magnitude of the squared coherence between the PI and SAP signals exceeded 0.5 (range,

0-1) in the LF band. After coherence calculation, alpha index was obtained from the

square root of the ratio between PI and SAP variabilities in the two major bands of LF

[17].

Tissue collection. One day after cardiovascular measurements, rats were killed by

decapitation. The hearts were rapidly excised, weighed, and frozen in liquid nitrogen. The

remainder of the hearts was homogenized with Ultra-Turrax (1.15%, wt/vol KCl and 20

mmol/l phenyl methyl sulphonyl fluoride). The homogenates were centrifuged at 600g

for 15 min at 4 °C (Sorvall RC 5B—Rotor SM 24) to discard nuclei and cell debris. The

supernatant fraction obtained was frozen at −80 °C and used to determine oxidative stress

profile.

Protein was measured by the method of Lowry et al. [18] using bovine serum albumin as

the standard.

Oxidative stress evaluations. Lipid peroxidation was measured by the tert-butyl

hydroperoxide–initiated chemiluminescence assay, as previously described by Gonzalez

150

Flecha et al. [19]. This assay was carried out with a Liquid Scintillation

Spectrophotometer (TriCrab 2800TR, PerkinElmer) in the out-of-coincidence mode at

room temperature. This method consists of adding a highly unstable organic synthetic

hydroperoxide to the sample homogenates and the observation of the response.

Hydroperoxides can react with membrane lipids, which initiate[s] a lipid peroxidation

process, yielding singlet oxygen and excited carbonyls. These species are excited and can

be stabilized by light emission. The heart supernatant fractions were diluted in 140

mmol/l KCl and 20 mmol/l phosphate buffer, pH 7.4, which were added to glass tubes

placed in scintillation vials. Then, 3 mmol/l of tert-butylhydroperoxide was added, and

chemiluminescence was determined by the maximal level of emission. The results were

reported as counts per second (cps)/mg of protein.

Superoxide dismutase activity was measured spectrophotometrically in heart

homogenates by rate inhibition of pyrogallol auto oxidation at 420 nm [20]. Enzyme

activity was reported as U/mg protein. Catalase activity was measured by monitoring the

decrease in H2O2 concentration at 240 nm, and the results are reported as pmol of

H2O2/mg protein [21]. Glutathione peroxidase activity was determined in cardiac samples

by monitoring NADPH oxidation spectrophotometrically at 340 nm, and the results are

reported as nmol/min/mg protein [22].

Statistics analysis. Data are expressed as means ± standard errors. Two-way ANOVA

followed by the Student-Newman-Keuls test were used to compare groups. Pearson

correlation was used to study the association between variables. Significance level was

established at p<0.05.

RESULTS

151

Maximal Exercise Test

Exercise capacity was evaluated through performance in the maximal treadmill test.

Exercise capacity was higher in hypertensive groups at the beginning and at the end of

the exercise training protocol when compared to normotensive groups. Moreover, the

animals undergoing exercise training protocol showed an increase in maximum running

speed when compared to the respective sedentary group after 8 weeks of training (Table

1).

Metabolic evaluation

Metabolic evaluations are shown in Table 1. SHR groups (SHOF and THOF) had lower

body weight than normotensive rats (SOF and TOF). All groups showed higher body

weight at the end of the protocol when compared to the respective values at ovariectomy.

Exercise training reduced blood glucose in TOF and THOF groups and triglycerides in

TOF group. The hypertensive groups presented a decrease in insulin sensitivity after 10

weeks of fructose overload when compared to normotensive groups. At the end of the

protocol (19 wks of fructose overload) the SOF group also showed reduced kitt in

relation to its initial values, and no difference was observed between SOF, SHOF and

THOF groups at this time. However, the TOF group presented increased insulin

sensitivity when compared to SOF group at the end of the protocol (Table 1).

Hemodynamic Assessments

As shown in Table 2, the hypertensive rats (SHOF and THOF groups) showed higher AP

when compared to normotensive rats (SOF and TOF groups). Additionally, the SHOF

group showed resting tachycardia (vs. SOF). However, the trained animals (TOF and

THOF groups) presented resting bradycardia when compared to sedentary animals (SOF

and SHOF groups).

152

Cardiovascular Autonomic Modulation

Hypertension induced a reduction in SD-PI, RMSSD and VAR-PI when compared to

SOF and SHOF rats. Exercise training induced an increase in RMSSD and VAR-PI in the

TOF group when compared to SOF and THOF groups; however, VAR-PI was higher in

THOF group in relation to SHOF group (Table 2).

The LF band of PI showed an exacerbated reduction in both hypertensive groups when

compared to both normotensive groups. The HF band of PI was lower in THOF groups in

relation to TOF group (Table 2).

Hypertensive rats showed an increase in VAR-SAP, although exercise training attenuated

this dysfunction, as demonstrated by the fact that VAR-SAP was lower in THOF group

in relation to SHOF group (SOF: 23.13 ± 3.38; TOF: 23.65 ± 2.09; SHOF: 74.16 ± 6.63;

THOF: 49.17 ± 4.86 mmHg2) (Figure 1A). The LF band of SAP was higher in SHOF

group when compared to SOF and TOF groups (SOF: 9.24 ± 1.19; TOF: 6.10 ± 0.54;

SHOF: 15.54 ± 2.35; THOF: 7.97 ± 1.69 mmHg2). However, exercise training was

effective in normalizing this variable in THOF (Figure 1B).

The sedentary SHR animals showed a reduction in the α index in relation to sedentary

normotensive rats (SHOF: 0.34 ± 0.16 ms/mmHg vs. 0.73 ± 0.08 ms/mmHg in SOF).

Exercise training induced an increase in spontaneous baroreflex sensitivity in both trained

groups when compared to their respective sedentary groups (TOF: 1.06 ± 0.09 vs. SOF:

0.73±0.08 ms/mmHg and THOF: 0.56 ± 0.07 vs. SHOF: 0.34 ± 0.16 ms/mmHg).

However, alpha index was higher in THO rats when compared to TOHF and SHOF rats

(Figure 1C).

Oxidative Stress Profile

153

Cardiac lipid peroxidation, as analyzed by chemiluminescence, was lower in TOF

and THOF groups (9270 ± 1438 and 11183 ± 818 cps/mg protein) when compared to

SOF and SHOF groups (15432 ± 1010 and 14914 ± 2159 cps/mg protein).

No differences were found in superoxide dismutase (SOF: 12.56 ± 2.09; TOF:

12.04 ± 0.94; SHOF: 10.53 ± 0.65; THOF: 10.72 ± 0.75 USOD/mg protein) and

glutathione peroxidase activities (SOF: 14.14 ± 1.58; TOF: 12.68 ± 0.80; SHOF: 15.61 ±

1.29; THOF: 14.26 ± 1.34 nmol/mg protein) among the studied groups. However, cardiac

catalase concentration was increased in both trained groups when compared to their

respective sedentary pairs (SOF: 52.39 ± 4.80 and SHOF: 60.79 ± 4.97 vs. TOF: 80.17 ±

8.27 and THOF: 82.35 ± 4.58 pmol/mg protein).

Negative correlations were obtained between RMSSD and chemiluminescence

(r=-0.60, p<0.05) (Figure 2A) and alpha index and chemiluninescence (r= -0.63, p<0.05)

(Figure 2B).

DISCUSSION

Our results showed the adverse cardiometabolic effects of fructose consumption

associated with hypertension, determined genetically in SHR, in an experimental model

with similar dysfunctions observed in metabolic syndrome. Given that this syndrome is

more prevalent on women in climacterium, the ovarian hormone deprivation model used

in this study enabled us to evaluate the metabolic syndrome characteristics in ovarian

hormone absence. Finally, the use of aerobic training also enabled us to clearly

demonstrate the benefits of this non-pharmacological approach that, in partly, it seems

attenuated when to be added cardiovascular risks factors.

The experimental model of menopause induced by ovariectomy has been extensively

used in relatively young (6 to 12 weeks) female OVX rats for short periods (3 to 9

154

weeks). The model promotes metabolic and hemodynamic alterations similar to those

observed in postmenopausal women [23, 24,25,26,27]. Although this model may not be

appropriate to determine long-term changes in cardiovascular regulation after menopause,

the OVX procedure is an effective way to simulate menopause status and promotes

increased body weight, blood glucose and blood pressure, together with a reduction in

baroreflex sensitivity and impairment in cardiovascular autonomic modulation when

compared to rats of the same age with intact ovaries [11,23,25,26,27,28].

In normotensive ovariectomized rats undergoing fructose overload, exercise training

(TOF group) promoted an improvement in exercise capacity and a reduction in blood

glucose, triglycerides and insulin resistance associated with resting bradycardia and

increased RMSSD, PI-VAR and alpha index (spontaneous baroreflex sensitivity).

Possibly, this increase in cardiac parasympathetic modulation (RMSSD and PI-VAR)

might be associated with the improved alpha index, as well as decreased cardiac lipid

peroxidation (chemiluninescence) and increased catalase concentration.

In fact, several physiological alterations may be associated with both fructose

consumption and the onset of menopause, e.g., increased body weight, reduction in

insulin sensitivity, hypertriglyceridemia and high blood pressure [6,11,29,30]. However,

differences in body weight have not been found after fructose overload in SHR rats [31]

and some studies failed to demonstrate any reduction in body weight, neither in trained

males [32] nor in female [33] SHR animals. Despite unchanged body weight at the end of

the protocol, we observed in the present study increased values of blood glucose and

triglyceride together with impaired insulin sensitivity in sedentary normotensive or

hypertensive fructose groups when compared to previously published data for control rats

[5,7]. In these sense, it has been demonstrated that the exposure of the liver to large

quantities of fructose promotes a rapid stimulation of lipogenesis, which contributes to

155

triglyceride accumulation and leads to a decreased number of insulin receptors and,

consequently, to decreased insulin sensitivity [34]. Indeed, a causative link between

elevated circulating triglyceride and impaired insulin action has been observed in

fructose-fed rats in other studies [29,30,35]. Moreover, the sustained elevation of plasma

triglyceride concentrations after fructose ingestion suggests that chronic consumption of

fructose could also contribute to cardiovascular disease [23,36].

Importantly, we also observed in this study that exercise training reduced both blood

glucose and triglyceride levels along with insulin resistance in trained ovariectomized rats

undergoing fructose overload (TOF group). However, it should be emphasized that these

metabolic benefits were sharply attenuated in hypertensive rats, since only reduced

glycemia was observed in THOF group when compared to SHOF group. A probable

mechanism for exercise training improvement of fructose-induced hypertriglyceridemia

would then be the suppression of the conversion of fructose into triglycerides at the liver

and the promotion of triglyceride muscle utilization, since trained rats increased uptake,

activation, and oxidation of fatty acids in muscle tissue [34]. In this regard, the higher

velocity obtained in the maximal exercise tests after 4 and 8 weeks of exercise training in

trained groups is a marker of effectiveness of the exercise training protocol applied in the

present study [11,15,23,28,37].

Although the causes of higher cardiovascular morbidity and mortality in postmenopausal

women remain poorly understood, they may involve changes in arterial pressure (AP) and

its regulation after estrogen deprivation [38,39,40]. Moreover, low baroreflex sensitivity,

a marker of autonomic control, is associated with severity of cardiovascular disease

[41,42]. In these sense, fructose overload promotes an increase in AP which may be

attributed to increased VAR-SAP and LF-SAP [43] and a reduction in spontaneous

baroreflex sensitivity [44] in male mice. In the present study the hypertensive

156

ovariectomized rats undergoing fructose overload (SHOF group) showed a well

established systolic and diastolic hypertension accompanied by resting tachycardia,

reduced cardiac parasympathetic modulation (SD-PI, RMSSD, VAR-PI), increased

vascular sympathetic modulation (LF-SAP band and SAP-VAR), and impairment in

spontaneous baroreflex sensitivity (alpha index) in relation to normotensive rats

undergoing fructose overload (vs. SOF group). We also observed an exacerbated

reduction in LF band of PI, which has been associated with cardiac sympathetic

overactivity in heart failure. It should be noted that although exercise training did not

reduce AP among hypertensive rats, this approach induced attenuation of the resting

tachycardia, reduction in vascular sympathetic modulation (LF-SAP band, SAP-VAR)

and increase in VAR-PI and in spontaneous baroreflex (alpha index) in hypertensive rats

(THOF vs. SHOF).

In this study, exercise training promoted improvement in spontaneous baroreflex

sensitivity in both trained groups (TOF and THOF), but hypertensive rats (THOF group)

showed a reduction in this parameter when compared to normotensive group (TOF

group). The reduced alpha index in hypertensive groups (vs. normotensive) may be

related to the inefficiency of exercise training in lowering blood pressure and normalizing

cardiac and vascular autonomic modulation in THOF group (vs. SHOF). The mechanism

involved in baroreflex sensitivity improvement after exercise training in the present study

can be associated with a reduction of LF-SAP band and in VAR-SAP in THOF group (vs.

SHOF), as well as an improvement in VAR-PI. In fact, we have recently reported

improved baroreflex sensitivity associated with improved sympathovagal cardiac balance

in infarcted [45] or diabetic ovariectomized rats undergoing exercise training [28].

Beyond alterations in the efferent branch of baroreflex, there is a general agreement that

the afferent pathway of this reflex is important for the activation of neurovascular

157

adjustments to exercise training, since improved baroreflex sensitivity in trained SHR rats

has been related to a significant increase in aortic depressor nervous activity [46].

Furthermore, we may speculate that after exercise training, arterial compliance would be

improved at the vascular network [47,48], including the aorta and carotid arteries, thus

ameliorating the mechanic transduction of baroreceptors and, consequently, baroreflex

control. In this respect, Bertagnolli et al. [12] have reported a significant improvement in

oxidative stress of the aorta in trained SHR, associated with an increase in baroreflex

sensitivity in trained rats. Finally, we cannot rule out that the changes in central nervous

system may be related to the improvement in baroreflex sensitivity after exercise training.

In fact, Felix et al. [49] have recently observed that exercise training normalizes the

central high angiotensinogen RNAm levels in SHR.

Previous studies have shown that the consumption of a high fructose diet negatively

affects the balance between free radical production and antioxidant defense in rats,

leading to increased lipid susceptibly to peroxidation [50,51]. Lipid peroxidation

indicates oxidative damage particularly in the membrane lipids, and its association with

decreased antioxidant defense determines oxidative stress status [19]. Female

ovariectomized rats have demonstrated a higher susceptibility to lipid peroxidation in fed

sucrose [50]. Bertagnolli et al [12,13] have shown that trained male SHR showed reduced

cardiac lipid peroxidation correlated with autonomic improvement. In our study, both

trained groups presented reduced cardiac lipoperoxidation, as evaluated by

chemiluminescence, and increased catalase, while no differences were found in

superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities among studied groups. Girard

et al. [31] have demonstrated similar results in cardiac tissue of male Wistar rats and SHR

undergoing fructose overload. Moreover, our data reinforces the role of exercise training

in the increase in antioxidant defenses, which leads to improvement in the oxidative

158

stress profile, as previously observed in trained male SHR and ovariectomized Wistar rats

[11,12].

It should be stressed that although hypertension adversely affects exercise training

benefits in rats undergoing fructose consumption, our study demonstrated correlations

between training-induced cardiovascular autonomic improvement and oxidative stress

reduction, thus indicating that rats presenting higher RMSSD (a parasympathetic index)

or baroreflex sensitivity also presented reduced cardiac lipoperoxidation. In fact, current

evidence points that parasympathetic function may modulate inflammatory and oxidative

stress in physiopathological conditions [52] In this sense, we hypothesize that aerobic

exercise training promoted cardiovascular autonomic control improvement which would,

in turn, trigger oxidative stress changes and prompt clinical cardiometabolic benefits in

this experimental model of metabolic syndrome.

In conclusion, hypertension promoted additional hemodynamic and autonomic

dysfunctions in fructose fed ovariectomized rats and abolished some aerobic exercise

training benefits. These alterations might very well be related to changes in

cardiovascular autonomic modulation associated with oxidative stress.

No disclosure

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was supported by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES-PROSUP), CNPq (563961/2010-4, 479766/2011-8) and FAPESP

(2010/17188-4, 2012/20141-5). K. De Angelis, M.C. Irigoyen and A Belló-Klein are the

recipients of CNPq-BPQ fellowships.

159

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163

Table 1. Metabolic evaluations in sedentary ovariectomized submitted to fructose

overload (SOF, n=8), trained ovariectomized submitted to fructose overload (TOF, n=8),

sedentary hypertensive ovariectomized submitted to fructose overload (SHOF, n=8),

trained hypertensive ovariectomized submitted to fructose overload (THOF, n=8).

PARAMETERS SOF TOF SHOF THOF

Physical capacity, km/h

10 wks-fructose 1.71±0.38 1.70±0.15 2.73±0.08† 2.79±0.08†‡

19 wks-fructose 1.55±0.21* 2.05±0.23†* 2.30±0.12†* 3.03±0.03†‡§*

Body weight, g

10 wks-fructose 246±8.9 248±4.9 192±11.3† 191±8.9†‡

19 wks-fructose 365±10.8* 329±15.7*† 257±9.6*† 245±10.8*†‡§

Blood glucose, mg/dL

10 wks-fructose 88±2.63 88±1.15 88±1.50 92±2.87

19 wks-fructose 94±2.06 80±3.30*† 88±1.59 80±1.54*†§

Triglycerides, mg/dL

10 wks-fructose 136±9.39 156±8.10 162±8.59 163±14.32

19 wks-fructose 161±12.81 94±7.26*† 145±6.09 147±6.49‡

Insulin Tolerance Test

(KITT %/min)

10 wks-fructose 5.30±0.37 4.93±0.38 3.97±0.18† 4.00±0.17†

19 wks-fructose 3.34±0.16* 4.55±0.22† 3.82±0.17 4.05±0.19

Data are reported mean ± SEM. 10 wks of fructose: after 10 weeks of fructose overload-

day before ovariectomy; 19 wks-fructose: after 19 weeks of fructose overload, at the end

of the exercise training period. *p<0.05 vs. 10 wks of fructose in the same group.

†p<0.05 vs SOF; ‡p<0.05 vs TOF; § p<0.05 vs SHOF.

164

Table 2. Hemodynamic evaluations and heart rate variablity in sedentary ovariectomized

submitted to fructose overload (SOF, n=8), trained ovariectomized submitted to fructose

overload (TOF, n=8), sedentary hypertensive ovariectomized submitted to fructose

overload (SHOF, n=8), trained hypertensive ovariectomized submitted to fructose

overload (THOF, n=8).

PARAMETERS SOF TOF SHOF THOF

SAP, mmHg 129±1.7 129±2.6 206±3.8† 210±10.9†‡

DAP, mmHg 93±2.4 96±1.5 153±2.5† 154±1.8†‡

MAP, mmHg 109±1.9 111±1.4 179±2.9† 180±1.6†‡

HR, bpm 358±7 334±6† 394±11† 348±6§

SD-PI, ms 7.26±0.56 10.03±0.85 6.80±0.43* 6.29±0.45*#

RMSSD, ms 4.56±0.23 5.64±0.48* 3.70±0.15* 3.45±0.17*#

VAR-PI, ms2 41.35±4.44 77.66±11.21* 29.49±4.07* 51.22±6.53#§

LF-PI, ms2 4.37±1.44 4.66±0.74 1.74±0.25* 1.42±0.21*#

HF-PI, ms2 6.49±0.99 8.51±0.82 4.96±0.54 4.14±0.64#

Data are reported mean ± SEM. SAP: systolic arterial pressure; DAP: diastolic arterial

pressure; MAP: mean arterial pressure; HR: heart rate; PI: pulse interval; SD: standard

deviation; VAR: total variance; LF: low frequency band; HF: high frequency band. †

p<0.05 vs SOF; ‡ p<0.05 vs TOF; § p<0.05 vs SHOF.

165

FIGURE CAPTIONS

Figure 1. A) Variance low-frequency band of systolic arterial pressure; B) Low-

frequency band of systolic arterial pressure; C) Spontaneous baroreflex sensitivity

evaluated by α index in SOF and TOF rats and in SHOF and THOF (n = 8 in each group).

† p<0.05 SOF, ‡ p< 0.05 vs TOF, § p< 0.05 vs SHOF. SOF, sedentary ovariectomized

submitted fructose overload; TOF, trained ovariectomized submitted fructose overload;

SHOF, sedentary hypertensive ovariectomized submitted to fructose overload; THOF,

trained hypertensive ovariectomized submitted to fructose overload

Figure 2. Negative correlation obtained by linear regression in SOF, TOF, SHOF and

THOF groups between A) RMSSD and chemiluminescence; and B) alpha index and

chemiluminescence.

166

Figure 1

167

Figure 2

universidade nove de julho programa de pÓs … de... · inflamação foram avaliados no tecido...

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