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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM
MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA APLICADAS (MIP/PPGMPA)
Taíssa Angélica Lemos Trancoso
Comparação de técnicas para o diagnóstico de filarioses caninas
NITERÓI
2017
Taíssa Angélica Lemos Trancoso
Comparação de técnicas para o diagnóstico de filarioses caninas
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração:
Parasitologia.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Claudia Maria Antunes Uchôa Souto Maior
NITERÓI
2017
Taíssa Angélica Lemos Trancoso
Comparação de técnicas para o diagnóstico de filarioses caninas
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Microbiologia e Parasitologia Aplicadas da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração:
Parasitologia.
Aprovada em 22 de Fevereiro de 2017.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Otilio Machado Pereira Bastos – UFF – Presidente
Prof.ª Alynne da Silva Barbosa – UFF
Profa Norma Vollmer Labarthe – FIOCRUZ
Profa Daniela Leles de Souza – UFF - Suplente
Prof. Valmir Laurentino da Silva _ FIOCRUZ - Suplente
Niterói
2017
AGRADECIMENTOS
À Deus por ter me dado a vida, por me abençoar e me guiar nas conquistas de meus ideais, sempre me
dando forças para seguir em frente.
À minha orientadora, professora Claudia Uchôa, por ter me dado essa grande oportunidade. Pelos
ensinamentos, dedicação e paciência. Pelo carinho de mãe e apoio incondicional, inclusive nos
momentos mais difíceis. Pela grande e valiosa ajuda, não apenas na elaboração e contrução desse
trabalho, mas por ter estado presente em minha vida, se tornando um modelo de profissional que eu
quero ser um dia.
À professor Otilio Machado Pereira Bastos pela revisão criteriosa. Por todo auxílio, inclusive
financeiro, e ensinamento, enriquecendo cada passo dado com sua experiência e sabedoria.
Às alunas Anna Luiza Finkelstein e Nathália Lima por muito terem me ensinado, ao mesmo tempo em
que aprendiam. Pela dedicação e esforço, sem o qual o estudo não teria acontecido.
Ao Dr Bruno Pinho por ter autorizado a execução do trabalho na Clínica Veterinária Cabo Frio e aos
demais profissionais: Dra. Amanda Monteiro, Dr. Rodrigo Teixeira, Dr. Renan Queiróz, ao enfermeiro
Vitor Oliveira e a recepcionista Daniele Alves por todo apoio, sem o qual esse estudo não seria possível.
À toda minha família, por estarem sempre ao meu lado me dando amor, confiança, suporte e incentivo.
Por me ajudarem a dar todos os meus passos, segurando minha mão no sucesso e na derrota.
Ao meu esposo e companheiro, Thiago Bustamante, pelo amor, carinho, apoio, companheirismo e
paciência. Por compreender minha ausência e nervosismo, por me dar ombros e ouvidos e estar ao meu
lado nos melhores e piores momentos.
Ao professor Walter Lillenbaun pelo empréstimo de parte do material de consumo para execução da
PCR.
À professora Tatiana Xavier pelo apoio e orientação no procedimento de extração de DNA das
amostras de sangue e a professora Silvia Maria Baeta Cavalcanti e professora Rita Cubel Garcia pela
disponibilidade em compartilhar sua experiência no diagnóstico molecular.
À professora Daniela Leles pelo apoio e orientação na realização da PCR das amostras.
À professora Ana Beatriz Monteiro Fonseca pela análise estatística dos resultados obtidos no trabalho.
À professora Alynne da Silva Barbosa pelo apoio, empréstimo de material de consumo para biologia
molecular e incentivo na realização do trabalho.
À toda equipe de estudantes e profissionais que atuam na Parasitologia da UFF pelo apoio nos
momentos difíceis desse caminho.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Microbiologia e Parasitologia Aplicadas pelos
ensinamentos transmitidos durante esse percurso, e à Anna Soares, secretária do curso, por toda a
paciência, carinho e pela pronta atenção.
Às minhas companheiras de turma do mestrado, Clarissa Silveira, Gabriela Góes e Karina Gonçalves
pelos momentos de alegria e dificuldade que compartilhamos e pelo que juntas aprendemos.
À todos os meus amigos que direta ou indiretamente participaram do estudo, dando força e incentivo
para que o trabalho fosse concluído.
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades lembrai-vos de que as grandes coisas do
homem foram conquistadas do que parecia impossível”
Charles Chaplin
RESUMO
A dirofilariose é uma infecção parasitária potencialmente zoonótica, sendo uma grande preocupação
para proprietários de pequenos animais, principalmente de regiões costeiras de países tropicais e
subtropicais. Esta parasitose é determinada pelos nematóides do gênero Dirofilaria sp., sendo
Dirofilaria immitis a espécie mais frequente no Brasil. Têm como hospedeiros definitivos
principalmente, os canídeos domésticos e silvestres. Sua frequência, particularmente nos cães,
apresenta índices variáveis, dependendo da localização geográfica, da população canina suscetível e
das técnicas utilizadas para o diagnóstico laboratorial, as quais apresentam sensibilidade variada.
Poucos estudos comparam a eficácia das diversas técnicas utilizadas no diagnóstico dessa parasitose.
Considerando essa carência de informações, o objetivo deste estudo foi comparar as técnicas
parasitológicas microscópicas, imunológicas e moleculares no diagnóstico da dirofilariose canina.
Foram coletadas 103 amostras de sangue de cães de Cabo Frio, RJ, as quais foram processadas pelas
técnicas parasitológicas microscópicas (TPMs) como o exame direto, distensão espessa, distensão
delgada e Knott modificada, além da Reação em cadeia da Polimerase (PCR) e o ensaio
imunoenzimático (ELISA) para captura de antígeno (Snap™ 4Dx® IDEXX). Dessas, 19,4% foram
positivas pelas técnicas parasitológicas por microscopia (TPM), e 15,5% pela PCR sem diferença
estatística significativa. As técnicas de Knott modificada e distensão espessa foram positivas nas 20
amostras positivas (K=1,0). O índice de concordância entre as técnicas parasitológicas por microscopia
foi excelente e entre as TPMs e a PCR (K=0,79) substancial. Ao analisar amostras de sangue de 60
animais pelo ELISA pode-se evidenciar positividade de 26,9% (25/60), havendo detecção de
dirofilariose oculta em 30,7% (8/25), o que favoreceu diferença estatística significativa entre o ELISA
e a PCR e entre o ELISA e as TPMs. A mensuração das microfilárias e o seqüenciamento do
fragmento genômico amplificado de uma amostra confirmaram a infecção por D. immitis. Dentre as
técnicas parasitológicas por microscopia, em áreas endêmicas, sugere-se o uso da distensão espessa
por ser de menor custo e gerar uma lâmina permanente, o que possibilita releitura e avaliação
morfológica. Os resultados obtidos reafirmam a importância do uso do ELISA para captura de
antígenos no diagnóstico clínico e em estudos epidemiológicos da dirofilariose canina.
Palavras chaves: Cães, Dirofilaria immitis, Distensão espessa, Knott modificada, ELISA, PCR
ABSTRACT
Heartworm infection is a potentially zoonotic parasitic disease and is a major concern for small animal
owners, mainly coastal regions of tropical and subtropical countries. This parasite is to be determined
by the parasites of the genus Dirofilaria sp., being Dirofilaria immitis the most frequent species in
Brazil. They have as definitive hosts mainly the domestic and wild canids. Their frequency,
particularly in dogs, varies depending on the geographic location, the susceptible canine population
and the techniques used for laboratory diagnosis, which vary in sensitivity. Few studies compare the
efficacy of several techniques used in the diagnosis of this parasite. Considering this lack of
information, the objective of this study was to compare microscopic parasitological, immunological
and molecular techniques in the diagnosis of canine heartworm infection. A total of 103 blood samples
were collected from dogs from Cabo Frio, RJ, Brazil, which were processed by microscopic
parasitological techniques such as wet fresh blood film, thick smear, thin smear and modified Knott,
Polymerase Chain Reaction (PCR) and or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antigen
capture (Snap ™ 4Dx® IDEXX). Of these, 19.4% were positive by parasitological techniques by
microscopy (PTM), and 15.5% by PCR, without significant statistical difference. The modified Knott
and thick smear techniques were positive in 20 samples (K = 1.0). The concordance index between
parasitological techniques by microscopy among each other was excellent and substantial between
PTMs and PCR (K = 0.79). When analyzing blood samples from 60 animals by the ELISA, a positivity
of 26.9% (25/60) could be detected, with hidden heartworm detected in 30.7% (8/25), favoring a
statistically significant difference Between ELISA and PCR and between ELISA and PTMs.
Measurement of microfilariae and sequencing of the amplified genomic fragment of a sample
confirmed D. immitis infection. Among the parasitological techniques by microscopy, in endemic
areas, it is suggested the use of thick smear because it is of lower cost and generate a permanent slide,
which allows re-reading and morphological evaluation. The results obtained reaffirm the importance of
the use ELISA for antigen capture in clinical diagnosis and in epidemiological studies of canine
heartworm disease.
Key words: Dogs, Dirofilaria. immitis, Thick Smear, Modified Knott, ELISA, PCR.
LISTA DE TABELAS, FIGURAS E QUADROS
Tabela 1: Resultados por faixa etária obtidos por técnicas parasitológicas microscópicas e PCR para
pesquisas de D. immitis em 103 cães do município de Cabo Frio, RJ....................................................51
Tabela2: Resultado de positividade pelas quatro técnicas parasitológicas por microscopia e molecular
em 20 cães com microfilárias de Cabo Frio, RJ..................................................................................... 51
Tabela 3: Resultados do grau de concordância e dicordância pelo teste de McNemar entre as técnicas
parasitológicas por microscopia e molecular para pesquisas de D. immitis em 103 cães do município de
Cabo Frio, RJ..........................................................................................................................................52
Tabela 4: Relação entre a positividade obtida por técnicas parasitológicas microscópicas e molecular
para pesquisa de microfilárias e o gênero em 103 cães do município de Cabo Frio,
RJ............................................................................................................................................................53
Tabela 5: Resultados obtidos por técnicas parasitológicas por microscopia e molecular em relação
com local de permanência na residência de de 102 cães do município de Cabo Frio, RJ......................53
Tabela 6: Resultado de positividade pelas quatro técnicas parasitológicas por microscopia, PCR e pelo
ELISA (Snap™ 4Dx®) em 60 cães de Cabo Frio, RJ............................................................................54
Tabela 7: Comparação do grau de concordância e dicordância (teste de McNemar) entre as técnicas
parasitológicas por microscopia, PCR e ELISA para pesquisas de D. immitis em 60 cães do município
de Cabo Frio, RJ......................................................................................................................................55
Tabela 8: Resultados para contagem de microfilárias de filarídeos obtidos por técnicas parasitológicas
com leitura por microscopia em amostras de sangue de 20 cães do Município de Cabo Frio, RJ.........55
Tabela 9: Resultado da contagem de microfilárias de filarídeos por estimativa considerando a técnica
de exame direto em amostras de 20 cães de Cabo Frio, RJ....................................................................56
Figura 1: Figura 1: A: Aulto macho de Dirofilaria immitis encontrado em um chacal dourado na
Bulgaria. A1: Extremidade anterior do corpo – abertura oral (1), papilas cefálicas(2), esôfago(3), anel
nervoso(4); A2: Espículas – peqeunas espículas (1), e grande espículas (2). B1: Partes distais das
pequenas espículas (1) e grandes espículas (2); B2: Papilas cloacais – papilas pré cloacais(1) e pós
cloacais(2). C: Adulto fêmea espécime de Dirofilaria immitis encontrado em um chacal dourado da
Bulgária:C1: Vulva, C2: Anus. Fonte: Panayoutova-Pencheva et al. 2016............................................21
Figura 2: Microfilária de A. reconditum (1) e Dirofilaria immits (2). Fonte: www.capvet.org............21
Figura 3: Ilustração do ciclo biológico de Dirofilaria immitis.. Fonte: http://memorize.com/parasit-
heartworms/drraythe.............................................................................................................................. 23
Figura 4: A: Fotografia de radiografia de tórax de um cão infectado de 12 anos de idade com
cardiomegalia do lado direito e grave doença vascular pulmonar. B: Fotografia da imagem do
ecocardiograma do mesmo cão da figura A. Vermes são visualizados como dupla paralela, objetos
lineares (seta) flutuante para dentro do lúmen da artéria pulmonar direita.............................................30
Figuras 5: Fotografia de radiografia de um homem adulto com lesões pulmonares causadas por
Dirofilaria immtis. Fonte: Klinge et al., 2011. B: Edema da córnea e hiperemia episcleral no olho
esquerdo de um menino de 16 anos de idade, do Brasil e um filarídeo macho adulto livre câmara
anterior....................................................................................................................................................37
Figura 6: Mapa do município de Cabo Frio com localização aproximada da Clínica Veterinária (seta
negra) de onde as amostras dos cães foram obtidas. ..............................................................................43
Figura 7: Fotografia referente a contenção mínima dos cães (A) e coleta de amostra de sangue por
punção de veia braquio-cefálica (B)........................................................................................................43
Figura 8: Técnica de distensão espessa para diagnóstico de D. immitis. A: seqüência de lâminas na
ordem de processamento (distensão espessa de sangue após secagem, distensão espessa após
desemoglobinização e distensão espessa corada pelo Giemsa). B: microfilárias visualizadas em
distensão espessa no aumento de 400X. C: microfilárias visualizadas em distensão espessa no aumento
de100X....................................................................................................................................................46
Figura 09: Produto da PCR submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5% usando primers COIR
e COIF.1) DNA Ladder(50bp);C+)Controle positivo com DNA de parasito adulto;PV)Poço vazio ...56
Figura 10: Produto da PCR submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5% usando primers COI R
e COI F. 1) DNA Ladder (50bp); C+) Controle positivo com DNA de parasito adulto....................... .57
Figura 11: Alinhamento de sequências de fragmento do gene COI de Dirofilaria immitis. Legenda:
KC985239. Número de acesso de sequência de D. immitis depositada no Genbank usada para
comparação; Adulto: Parasito adulto de D. immitis usado como controle positivo nas reações de PCR.
Amostra 13: amostra de sangue positiva para D. immitis no exame parasitológico e imunológico. Obs:
os primers não foram removidos da análise...........................................................................................57
Quadro 1: Mensurações de microfilárias de filarídeos que infectam cães recuperadas da literatura no
período de 1965 a 2013...........................................................................................................................25
Quadro 2: Prevalência da dirofilariose em diversos municípios de estados do Brasil..........................40
Quadro 3: Fórmula de Kappa................................................................................................................52
Quadro 4: Valores de referência para interpretação do valor de Kappa...............................................52
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................................... 7
ABSTRACT................................................................................................................................ 8
LISTA DE TABELAS, QUADROS E FIGURAS.................................................................. 9
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................................ 13
2 JUSTIFICATIVA.................................................................................................................... 16
3 OBJETIVOS............................................................................................................................. 17
3.1 Geral........................................................................................................................................ 17
3.2 Específicos............................................................................................................................... 17
4 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA........................................................................................... 18
4.1 Filarioses caninas.....................................................................................................................
4.1.1 Acanthocheilonema (Dipetalonema) reconditum................................................................
18
18
4.1.2 Dirofilaria repens................................................................................................................. 19
4.1.3 Dirofilaria immitis................................................................................................................ 20
4.1.3.1 Taxonomia................................................................................................................... 20
4.1.3.2 Morfologia................................................................................................................. 21
4.1.3.3 Ciclo Biológico............................................................................................................ 22
4.2 Diagnóstico.............................................................................................................................. 23
4.2.1 Técnicas Parasitológicas Microscópicas (TPMs) ........................................................... 23
4.2.2 Técnicas Imunológicas..................................................................................................... 26
4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ......................................................................... 27
4.2.4 Outras técnicas de Diagnóstico......................................................................................... 29
4.2.5 Estudos de Diagnóstico da Dirofilariose por Diferentes Técnicas................................... 30
4.3 Epidemiologia das Dirofilarioses............................................................................................ 34
4.3.1 Vetores............................................................................................................................... 35
4.3.2 Dirofilariose Humana........................................................................................................ 36
4.3.3 Wolbachia sp..................................................................................................................... 37
4.3.4 Distribuição Geográfica.................................................................................................... 38
5. METODOLOGIA................................................................................................................... 42
5.1 Amostragem............................................................................................................................. 42
5.1.1 Local de Estudo................................................................................................................ 42
5.1.2 Coleta das Amostras.......................................................................................................... 43
5.2 Processamento Laboratorial..................................................................................................... 44
5.2.1 Técnicas Parasitológicas Microscópicas (TPMs) ................................................................ 44
5.2.1.1 Exame Direto.................................................................................................................. 44
5.2.1.2 Distensão Delgada.......................................................................................................... 45
5.2.1.3 Distensão Espessa........................................................................................................... 45
5.2.1.4 Coloração por Azul de Metileno Segundo de Giemsa................................................... 46
5.2.1.5 Técnica de Knott Modificada ....................................................................................... 46
5.2.1.6 Ensaio Imunoenzimático - ELISA.................................................................................. 47
5.2.7 Biologia Molecular............................................................................................................
5.2.7.1 Extração de DNA .........................................................................................................
47
47
5.2.7.2 Reação em Cadeia da Polimerase................................................................................. 48
5.2.7.3 Sequenciamento dos Fragmentos Amplificados na PCR............................................ 49
5.3 Análise Estatística................................................................................................................... 49
6. CONSIDERAÇÕES ÉTICAS................................................................................................ 50
7. RESULTADOS........................................................................................................................ 51
8. DISCUSSÃO............................................................................................................................ 58
9 CONCLUSÃO......................................................................................................................... 66
10. REFERÊNCIAS BIBLOGRÁFICAS.................................................................................. 67
11 ANEXOS.................................................................................................................................. 80
12 APÊNDICES........................................................................................................................... 82
13
1. INTRODUÇÃO
As filarioses caninas têm como etiologia Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens,
Acanthocheilonema reconditum, Acanthocheilonema dracunculoides e Cerapitifilaria grassi. As
espécies com os maiores taxas de prevalencia são D. immitis, A. reconditum e D. repens, sendo que as
duas primeiras apresentam distribuição mundial e a última restringe-se a Europa, Oriente Médio, Ásia
e África (SCARAMOZZINO et al., 2005).
A dirofilariose é uma infcção parasitária potencialmente zoonótica, causada pelo filarídeo do
gênero Dirofilaria que infecta preferencialmente canídeos domésticos e silvestres, mas também outros
mamíferos incluindo o ser humano. Essa parasitose é uma grande preocupação para proprietários de
pequenos animais, principalmente em regiões costeiras de países tropicais e subtropicais (BATISTA et
al., 2008), sendo determinada, principalmente, pelos parasitos Dirofilaria immitis e Dirofilaria repens.
Os hospedeiros intermediários ou vetores da dirofilariose são dípteros da família Culicidae, dos
gêneros Aedes, Anopheles e Culex susceptíveis à infecção pelo parasito (FERNANDES et al., 1999).
D. immitis e D. repens tem como habitat sistema cardiovascular e tecido subcutâneo de cães
respectivamente (SIMÓN et al., 2009). A doença determinada por D. immitis começa com um quadro
vascular progressivo, que em seus estágios finais afetam as câmaras cardíacas direitas. Também pode
apresentar uma evolução aguda intravascular causando hemólise, anemia e hemoglobinúria.
Manifestações clínicas típicas incluem tosse crônica, dispneia, intolerância ao exercício e perda de
peso (KLINGE et al., 2006).
A prevalência da dirofilariose, particularmente nos cães, apresenta índices variáveis,
dependendo da localização geográfica, da técnica utilizada para o diagnóstico e do manejo dos
animais. A incidência de animais positivos em cidades litorâneas pode aumentar devido à maior
densidade de vetores. No Brasil, a dirofilariose canina já foi descrito 15 focos hiperendêmicos em
diversas localidades, estando presente em todas as regiões do país (LABARTHE et al, 2014).
Entretanto, a maioria dos estudos está concentrada nas regiões sudeste e sul. No estado do Rio de
Janeiro, Labarthe et al. (1997a) evidenciaram prevalência de 16,85% (134/795) por microfilaremia,
sendo 8,61% de cães do Rio de Janeiro e 21,76% de Niterói e seus arredores, por meio da técnica de
Knott modificada. Na Região dos Lagos, que se localiza no litoral norte do estado do Rio de Janeiro,
14
pertencendo a mesorregião das baixadas litorâneas, Labarthe et al. (2014) relataram em Cabo Frio e
Armações dos Búzios, frequências de 27,5% (11/40) e 62,2 % (23/37), respectivamente e Labarthe et
al. (1997b) relataram a prevalência de 33,3% (5/15) na região costeira que englobou Maricá a Cabo
Frio.
O diagnóstico desses filarídeos pode ser realizado por meio de diversas técnicas laboratoriais
parasitológicas microscópicas, imunológicas e moleculares. As técnicas parasitológicas mais utilizadas
são o exame direto do sangue a fresco, técnica de Knott modificada, concentração em filtro com
membrana de milipore ou nucleopore, gradiente de densidade por centrifugação e ou distensão
espessa. As diferentes técnicas apresentam sensibilidades variadas e limitações (BATISTA et al.,
2008).
Na maioria dos cães microfilarêmicos, a parasitose pode ser detectada por exame microscópico
direto que consiste na visualização da movimentação das hemácias na presença da larva do filarídeo
em amostra de sangue a fresco. No entanto, essa técnica é pouco sensível para o exame de amostras
com números (50 a 100 por ml) de microfilárias baixos. A técnica de Knott modificada é a mais
eficiente para observar a morfologia e fazer a mensuração das dimensões do corpo da larva
possibilitando diferenciar D. immitis de outras dirofilárias e de espécies filarídeos não patogênicos,
como Acanthocheilonema (Dipetalonema) reconditum (MCCALL et al.,2004).
A negatividade dos testes de detecção de microfilárias não permite excluir a infecção, na
medida em que não detectam infecções amicrofilarémicas. Além desse fato, pode haver resultados
falsos negativos, particularmente se o número de microfilárias em circulação for reduzido e se a
quantidade de sangue colhido não for suficiente (MCCALL et al., 2004).
O ensaio imunoenzimático (ELISA) para pesquisa de antígenos é considerado indispensável,
específico e sensível no diagnóstico da parasitose (OGAWA, 2013). Ele permite um diagnóstico mais
eficiente do que aqueles obtidos pela técnica de Knott modificada, uma vez que as microfilárias podem
estar ausentes, caso o cão esteja parasitado somente por adultos do mesmo sexo; de ambos os sexos,
mas estéreis; esteja em período pré-patente, que é de 5 a 6 meses após a infecção ou, ainda,
amicrofilaremico por outras causas (FERNANDES et al.,1999).
Segundo Goodwin et al. (1998) podem ocorrer resultados falsos-negativos em técnicas
imunológicas, em cães com carga parasitária muito baixa. Nessas situações, a reação em cadeia da
polimerase (PCR) tem demonstrado resultados específicos e sensíveis por meio da detecção do ácido
desoxiribonucléico (DNA) de D. immitis (SIMSEK et al., 2011).
Considerando esse contexto, o objetivo desse estudo foi comparar diferentes fundamentos de
técnicas de diagnóstico para dirofilariose canina em cães atendidos em uma clínica médica veterinária
de Cabo Frio, RJ.
15
16
2. JUSTIFICATIVA
A dirofilariose é uma parasitose que acomete principalmente cães, com frequências variadas
determinando quadros clínicos diversos e até mesmo a morte de animais infectados. No diagnóstico
dessa parasitose diversas metodologias parasitológicas por microscopia, imunológicas e molecular são
utilizadas, porém poucos estudos comparam a concordânica e eficácia dos resultados das diferentes
técnicas. Frente a esse contexto, esse estudo torna-se relevante pois propõe ampliar o arcabouço
teórico sobre o diagnóstico da dirofilariose por meio da comparação de quatro técnicas parasitológicas
por microscopia, imunológica e molecular e dessa forma possibilitar maior eficiência no diagnóstico,
fomentando esta área do conhecimento, além de ampliar informações sobre a frequência dessa
parasitose.
17
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Comparar técnicas para o diagnóstico da infecção de cães por Dirofilaria immitis.
3.2 Específicos
Diagnosticar a infecção por Dirofilaria immitis em cães domiciliados por técnicas parasitológicas
por microscopia das microfilárias, por técnica imunológica para pesquisa de antígeno e pela reação em
cadeia da polimerase;
Comparar a eficiência e concordância das técnicas parasitológicas, imunológica e molecular no
diagnóstico da dirofilariose;
Identificar a frequência da parasitose no grupo de cães estudados, de acordo com a idade e sexo
dos animais, hábito do cão, sintomas e profilaxia medicamentosa.
18
4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
4.1 Filarioses Caninas
Várias espécies de filarídeos podem infectar os animais, inclusive o ser humano. Em cães as
espécies mais frequentes são Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens, Acanthocheilonema
(Dipetalonema) reconditum, embora na literatura também sejam relatadas infecções por
Acanthocheilonema dracunculoides e Cerapitifilaria grassi (SCARAMOZZINO et al., 2005). Todos
esses parasitos liberam microfilárias na corrente sanguínea dos hospedeiros infectados, sendo que
Dirofilaria immitis e Acanthocheilonema (Dipetalonema) reconditum apresentam distribuição
geográfica similares (GOMES et al., 2012).
Dirofilariose é considerada como a infecção de hospedeiros suscetíveis por um grupo de
parasitos do gênero Dirofilaria transmitidas por vetores. De todas as espécies, as mais relevantes são
Dirofilaria immitis e D. repens devido ao seu quadro clínico, prevalência e incidência. (SIMÓN et al.,
2012).
No Brasil, oito espécies de Dirofilaria já foram relatadas: D. acutiuscula, D. freitasi, D.
incrassata, D. immitis, D. magalhaesi, D. repens, D. spectans e D. striata, mesmo que algumas
tenham validade questionável, como D. magalhaesi (VICENTE et al., 1997).
Apesar da ampliação de recursos para o diagnóstico dessa parasitose e do desenvolvimento de
métodos preventivos, a dirofilariose ainda representa grande preocupação na área da medicina
veterinária, associada à sua ocorrência em humanos em várias regiões tropicais, subtropicais e
temperadas do mundo (TORRES & OTRANTO, 2013).
4.1.1 Acanthocheilonema (Dipethalonema) recoditum
A. reconditum é um parasito que se localiza nos tecidos subcutâneos, rins e cavidade corporal
de cães (TAYLOR et al., 2007). Acomete cães e vários outros canídeos. A. reconditum é transmitida
por carrapatos, piolhos e pulgas tendo como principais espécies vetoras as pulgas Ctenocephalides
canis, Ctenocephalides felis e Pulex irritans e os piolhos malófagos Trichodectes canis, Heterodoxus
spiniger e Linognathus setosus (TAYLOR et al., 2007; TORRES et al., 2007). Macroscopicamente, os
machos de A. reconditum medem 1,5cm de comprimento em média e as fêmeas cerca de 2,5cm. As
microfilárias medem 246 a 292µm X 4,7-5,8µm e tem a cauda com um gancho em forma de botão
(TAYLOR et al., 2007).
Dirofilaria immitis e Acanthocheilonema reconditum produzem microfilárias com aspectos
morfológicos semelhantes (PATTON & FAULKNER, 1992). A diferenciação entre essas espécies é
19
importante, uma vez que a infecção por Dirofilaria immitis em cães pode resultar em doença e morte,
enquanto que a infecção por Acanthocheilonema reconditum causa no hospedeiro somente uma
infecção transitória e sem consequências mais grave, exceto por causar ulcerações cutâneas e
abscessos subcutâneos ocasionais (PATTON & FAULKNER, 1992).
4.1.2 Dirofilaria repens
D. repens (Railliet & Henry, 1911), também denominada de Nochtiella repens, é um agente
etiológico de dirofilariose em cães, gatos e canídeos silvestres e pode acometer também o ser humano.
Esse parasito habita os tecidos subcutâneos e intermusculares dos hospedeiros suscetíveis (TAYLOR
et al., 2007). A maior parte dos animais infectados por D. repens não mostra quaisquer sinais clínicos
aparentes ou anormalidades. No entanto, alguns animais infectados podem desenvolver nódulos
subcutâneos (TORRES & OTRANTO, 2013).
D. repens em sua morfologia é um nematoide robusto. As fêmeas maduras têm um
comprimento de 1,5 a 17 cm e um diâmetro de 650 µm, ao passo que os machos apresentam cerca de 5
a 7 cm de comprimento por 450 µm de diâmetro (ORIhEL et al., 1998; TAYLOR et al., 2007).
Segundo Magnis et al. (2013) as microfilárias de Dirofilaria repens medem em torno de 369
µm de comprimento e 9 µm de largura, sendo confirmadas, atualmente, através da PCR.
Seu ciclo é bem parecido com o ciclo de Dirofilaria immitis, sendo os hospedeiros
intermediários dípteros de espécies do gênero Culex, Aedes, Mansonia e Anopheles. Os parasitos
adultos vivem em nódulos subcutâneos dos seus hospedeiros definitivos, embora também possam ser
encontrados na cavidade abdominal e sob a fáscia muscular (SIMÓN et al., 2012). As fêmeas liberam
microfilárias que vão para a corrente sanguínea e são ingeridas pelas fêmeas dos dípteros durante a
alimentação. O desenvolvimento para a L3, larva infectante, ocorre no vetor e o hospedeiro definitivo
infecta-se quando o díptero se alimenta de sangue novamente. No cão, a L3 migra para os tecidos
subcutâneos ou sub-serosos e após duas mudas nos meses subsequentes dão origem a adultos. O
período pré-patente para esse parasito é de 6 a 9 meses (TAYLOR et al., 2007).
D. repens é mais evidenciada em países do Velho Mundo podendo co-circular com D. immitis
em reservatórios (animais silvestres), sendo relatada na Europa, Oriente Médio, Ásia e África
(SCARAMOZZINO et al., 2005). Na Índia, Rani et al. (2010), evidenciaram D. repens em 6,6%
(35/527) de cães e na região centro-oriental da Polônia, Demiaszkiewicz et al. (2014) detectaram em
25,85% (119/462). Na Eslováquia, Miterpáková et al. (2010) relataram infecção por D. repens em
20% de cães policiais e 8,5% dos cães militares, sendo nesses últimos observado co-infecção entre D.
repens e D. immitis em 3 animais. Estudos recentes evidenciaram a expansão desse parasito em
direção as regiões norte e central da Europa. Há focos endêmicos, principalmente na Itália, França,
Grécia e Espanha (BAPTISTA-FERNANDES et. al., 2015).
20
Nas Américas, várias espécies de Dirofilaria vêm sendo relatadas. A presença de D. repens foi
relatada pela primeira vez no Brasil em um cão, no estado de São Paulo (LENT & FREITAS, 1937).
López et al. (2012) demostraram microfilárias que se assemelharam às de D. repens em cães de um
distrito semi-rural perto de Santiago, Chile, porém as microfilárias eram maiores e geneticamente
distintas de D. repens e não houve até o momento confirmação da presença desse parasito em outros
países das Américas. Por outro lado, esses relatos indicam a necessidade de investigações mais
cuidadosas sobre a diversidade de espécies de Dirofilaria nas Américas. Também se torna importante
determinar se existem casos de D. repens sendo diagnosticados como D. immitis, com base na
recuperação de microfilárias circulantes no sangue.
4.1.3 Dirofilaria immitis
Dirofilaria immitis (Leidy, 1856) é o principal agente etiológico da dirofilariose em cães e
gatos. Esse parasito habita o sistema cardiovascular, sendo geralmente detectado na veia cava inferior,
no átrio direito, ventrículo direito e na artéria pulmonar. É conhecido popularmente, por isso, como
verme do coração (SOULSBY, 1982).
4.1.3.1 Taxonomia
Dirofilaria immitis (Leidy, 1856), pertence ao filo Nemathelminthes, Classe Nematoda,
SubClasse Secernentea (Dougherty, 1958), Ordem Spirurida (Chitwood, 1933), Superfamília
Filaroidea (Weinland, 1958), Família Filariidae (Claus, 1885), gênero Dirofilaria (Railliet & Henry,
1911) (SOULSBY, 1982). Subsidiado pela filogenia genética, utilizando o gene SSU do RNA
(SMYTHE et al., 2006) e baseado em critérios morfológicos e biológicos, Bowman e Atkins (2009)
inseriram Dirofilaria immitis no Filo Nematoda, classe Secernentea, ordem Spirurida, Subordem
Spirurina, superfamília Filaroidea, família Onchocercidade, subfamília Dirofilariinae e gênero
Dirofilaria.
4.1.3.2 Morfologia
Dirofilaria immitis na forma adulta, apresenta macroscopicamente corpo delgado e longo,
esbranquiçado, com 15 a 30 cm de comprimento. As fêmeas medem de 25 a 30 cm por 1 a 13 mm de
diâmetro e os machos cerca 12 a 16 cm e 0,7 a 0.9 mm de diâmetro (Figura 1) (SOULBY, 1982;
OTTO, 1969).
21
Figura 1: A: Adulto macho de Dirofilaria immitis encontrado em um chacal dourado na Bulgaria. A1:
Extremidade anterior do corpo – abertura oral (1), papilas cefálicas (2), esôfago (3), anel nervoso (4);
A2: Espículas – peqeunas espículas (1), e grandes espículas (2). B1: Partes distais das pequenas
espículas (1) e grandes espículas (2); B2: Papilas cloacais – papilas pré cloacais (1) e pós cloacais (2).
C: Adulto fêmea espécime de Dirofilaria immitis encontrado em um chacal dourado da Bulgária:
C1: Vulva, C2: Anus. Fonte: Panayoutova-Pencheva et al. (2016).
Microscopicamente, nos machos observa-se cauda em espiral frouxa típica dos filarídeos e
presença de uma pequena asa lateral. Existem quatro a seis pares de papilas ovoides na cauda. O
espículo esquerdo é longo e pontiagudo e o direito é menor e termina em uma extremidade romba. Na
fêmea, a vulva está situada logo atrás da extremidade do esôfago. As fêmeas apresentam extremidade
anterior simples (SOULSBY, 1982). As microfilárias no sangue não possuem bainha, são retilíneas e
apresentam 307 a 322 µm de comprimento, com média de 313 µm por 6,8 µm de largura, possuindo
extremidade anterior cônica e a posterior afilada (SOULSBY, 1982). Existem divergências quanto a
mensuração das microfilárias com variações de comprimento de 290 a 340 µm (LINDSEY, et al.,
1965; SOULSBY, 1982; CRINGOLI et al., 2001; BRITO et al., 2001; McCALL et al., 2008; LÓPEZ
et al., 2012; MAGNIS et al., 2013) (Figura 2). As formas juvenis diferem das adultas principalmente
pelo tamanho e pela ausência das gônadas e órgãos copuladores (REY, 2001). A mensuração das
microfilárias apresenta variação segundo diversos autores.
Figura 2: Microfilária de A. reconditum (1) e Dirofilaria immits (2). Fonte: www.capvet.org
1
2
22
4.1.3.3 Ciclo de vida
Dirofilaria immitis apresenta ciclo heteroxeno, sendo os hospedeiros intermediários fêmeas de
dípteros hematófagos (Figura 3). A literatura descreve mais de 70 espécies da família Culicidae como
hospedeiros intermediários, embora apenas cerca de 12 espécies possam atuar efetivamente como
vetor (SOULSBY, 1982; MORCHÓN et al., 2012).
O cão é o principal hospedeiro definitivo. Nesse, o helminto pode habitar a artéria pulmonar,
ventrículo direito e o átrio direito, e ali se desenvolver (OTTO, 1969). O ciclo inicia-se quando uma
fêmea de díptero suscetível faz o repasto sanguíneo em um cão infectado ingerindo a larva L1 que nas
primeiras 24 horas permanecem do intestino do vetor. Nas próximas 24 horas, as larvas migram
ativamente para os túbulos de Malpighi, invadem as células onde permanecem por 6 ou 7 dias se
desenvolvendo de L1 até L3. Entre o 9° e o 15° dia de infecção, as larvas L3 podem ser observadas no
lúmen dos túbulos de Malpighi (MCCALL et al., 2008). Essas larvas migram pela cavidade geral do
díptero até a região cefálica e se depositam nos espaços do lábio (SOULSBY, 1982). Quando o inseto
faz, novamente o repasto sanguíneo, a larva deixa a região do lábio do díptero, entra pela ferida da
picada e migra pelas camadas da pele. Cerca de 85 a 120 dias após a infecção, formas evolutivas em
desenvolvimento já podem ser encontradas no coração e artéria pulmonar, sendo a maturidade sexual
alcançada cerca de dois meses após essa chegada. A partir desse momento começa a haver a liberação
de microfilárias (SOULSBY, 1982; BOWMAN & ATKINS, 2009; BIELAWSKI et al., 2001;
MIYOSHI et al., 2006; MILANEZ et al., 1997). As microfilárias podem sobreviver na circulação por
períodos superiores a dois anos (SOULSBY, 1982) e podem ser transmitidas via transplacentária,
sendo encontrada em filhotes recém natos (SOULSBY, 1982, TODD & HOWLAND, 1983)
23
Figura 3 – Ilustração do ciclo biológico de Dirofilaria immitis.. Fonte: http://memorize.com/parasit-
heartworms/drraythe.
4.2. Diagnóstico
O diagnóstico da infecção por D. immitis pode ser realizado por meio de várias métodos
laboratoriais diferentes. As mais utilizadas são técnicas parasitológicas, imunológicas e moleculares.
4.2.1 Técnicas Parasitológicas Microscópicas (TPMs)
As TPMs mais utilizadas são o exame direto (ED) do sangue a fresco, técnica de Knott, técnica
de Knott modificada por Newton e Wrigth, 1956 (TKM), concentração em filtro com membrana de
milipore ou nucleopore, gradiente de densidade por centrifugação, gota espessa ou distensão espessa
(DE) e a distensão delgada (DD). As diferentes metodologias apresentam sensibilidades variadas e
limitações (BATISTA et al., 2008).
Nas técnicas parasitológicas, o diagnóstico é realizado por meio da detecção de microfilárias
em amostras de sangue periférico após a leitura da lâmina em microscópio óptico. Além de Dirofilaria
immitis, outros parasitos como Dirofilaria repens e Acanthocheilonema reconditum podem liberar
microfilárias na corrente sanguínea, tornando-se importante a diferenciação dessas formas evolutivas
para o correto diagnóstico (BRITO et al., 2001; GOMES et al., 2012).
O exame direto é uma técnica simples e de baixo custo e utilizada como diagnostico rápido da
dirofilariose. Vários estudos têm utilizado essa técnica em associação à outras no diagnóstico da
24
dirofilariose para se ter um prévio diagnóstico (MYLONAKIS et al., 2004; GUILARTE et al., 2011;
BORTHAKUR et al., 2015)
A técnica de distensão delgada é realizada com uma gota de sangue total, que é espalhada sobre
pequena superfície de uma lâmina de microscopia com a ajuda de uma lâmina extensora, seguida por
fixação em metanol e coloração por Giemsa. Sua sensibilidade mostra-se ser baixa com relação as
técnicas de concentração de microfilárias. Guilarte et al. (2011) realizaram a técnica de distensão
delgada corada por Giemsa para facilitar a observação microscópica da morfologia parasitária.
A técnica de distensão espessa é uma técnica simples e de baixo custo sendo realizada com 3
gotas de sangue total disposta em uma lâmina de microscopia seguida de desemoglobinização e
corada. Esta técnica é utilizada por muitos autores para diagnóstico sem diferença significativa quando
comparada com a técnica de Knott modificada (GUILARTE et al., 2011, BOLIO-GONZALEZ et al.,
2007 e GARCEZ et al., 2006). Os autores afirmaram que a diferença entre as técnicas não permite
descartar o uso da distensão espessa e sugeriram que seja realizada a leitura de duas a três laminas de
Knott para aumento de sua eficiência, porém Vivas et al. (1994) relataram que a distensão espessa não
é uma técnica eficiente para detecção de dirofilariose em áreas de baixa prevalência.
A técnica de Knott modificada descrita por Newton & Wright, 1956 vem sendo amplamente
utilizada pelos autores, é realizada com 1 ml de sangue total com EDTA e 9 ml de formalina a 2%.
Alguns autores mostraram que a técnica de concentração de Knott modificada é uma técnica sensível
superando a distensão espessa (MYLONARKS et al., 2004). Por outro lado, Guilarte et al. (2011),
Bolio-Gonzalez et al. (2007) e Garcez et al. (2006) não evidenciaram diferença significativa entre as
técnicas de distensão espessa e Knott modificada.
A técnica de Knott tem sido apontada por diversos autores como a de escolha na diferenciação
das microfilárias de D. immitis, que é patogênica, das de Acanthocheilonema reconditum, que não é
patogênica (KNIGHT,1987; MYLONARKS et al., 2004; GUILARTE et al., 2011; GOMES et al.,
2012; AHS, 2014), sendo considerada padrão ouro por Guilarte et al., (2011).
Na diferenciação de microfilárias por meio da morfologia, o principal critério adotado é a
mensuração do comprimento e largura das microfilárias. Segundo Bowman (2010), a medida de
comprimento é mais tendenciosa e menos confiável como critério diferencial, porém López et al.
(2012) realizaram diferenciação entre as microfilárias de D. immitis, D. repens e A. reconditum por
meio da mensuração do comprimento e largura das microfilárias. Os autores descreveram como D.
immitis microfilárias com mensurações de 290 a 330 µm de comprimento e 5,0 a 7,0 µm de largura e
A. reconditum de 260 a 283 µm de comprimento e 5µm de largura. Já Brito et al. (2001) em Alagoas,
encontraram microfilarias de D. immitis com 298,1 ± 5,5 μm de comprimento e 7,3 ± 0,3 μm de
largura, apresentando em exame direto movimento de ondulação no lugar sem deslocamento para trás
25
e A. reconditum mediram 249,2 ± 8,7 μm de comprimento e 4,4 ± 1,2 μm de largura. O quadro 1
mostra informações relacionadas as mensurações de microfilárias evidenciadas por diferentes autores.
Quadro 1 – Mensurações de microfilárias de filarídeos que infectam cães, recuperadas da literatura
com artigos publicados em 1965 a 2013.
Artigos Dirofilaria immitis Dirofilaria repens A. reconditum
Comprimento
(µm)
Largura
(µm)
Comprimento
(µm)
Largura
(µm)
Comprimento
(µm)
Largura
(µm)
Lindsey, et al., 1965 314 (286 – 340) 6.8 (6.1 – 7.2) - - 270 (258 – 292) 5.2(4.7 –
5.8)
Soulsby, 1982 307 – 322 - - - 246 – 293 -
Cringoli et al., 2001 311.3 (±9.5) 5.96 (±0.15) 366.2 (12.1) 6.4 (0.31) 265(10.1) 5.01(0.49)
Brito et al., 2001 298.1(±5.5) 7.3(±0.3) - - 249.2(8.7) 4.4(1.2)
McCall et al., 2008 290-330 5-7 330-360 6-8 260-283 4
López et al., 2012 290 – 330 5.0 – 7.0 300 – 360 7 - 8 260 – 283 5.0
Magnis et al., 2013 301.77(±6.29) 6.8(±0.26) 369(10.76) 8.87(0.58) 264(5.47) 4.63(0.52)
Ciucã et al., 2016 305,51 (±7,3) 5,20 (±1,79) 364,87 (±2,73) 7,9 (±1,2) 274,11(±3,56) 5,01(±0,24)
Outro método de diferenciação morfológica, além da mensuração, é a observação da cauda,
quando fixada. As microfilárias de A. reconditum tendem a se curvar como um gancho. A extremidade
anterior da microfilária de D. immitis afina delicadamente, enquanto a de A. reconditum mantém seu
diâmetro relativamente igual em toda extensão. O gancho cefálico de A. reconditum é uma
característica também importante para diferenciação (BOWMAN, 2010, GOMES et al., 2012).
Segundo Gomes et al. (2012), as microfilárias de D. immitis realizam movimentos ondulantes
do tipo serpentiforme, deslocando-se lentamente no campo, enquanto as de A. reconditum deslocam-se
com maior rapidez movendo-se erraticamente. Na maioria dos cães microfilarêmicos, a parasitose
pode ser detectada por exame microscópico de sangue fresco com a visualização da movimentação das
hemácias pelo filarídeo. No entanto, essas técnicas são pouco sensíveis para o exame de amostras com
números baixos (50 a 100 por ml) de microfilárias (MCCALL et al., 2004)
A negatividade dos testes de detecção de microfilárias não permite excluir a infecção, na
medida em que não detectam infecções amicrofilarêmicas. Além deste fato, pode haver resultados
falsos negativos, particularmente se o número de microfilárias em circulação for reduzido e se a
quantidade de sangue coletado for pouca (MCCALL et al., 2004).
26
4.2.2 Técnicas Imunológicas
Existem métodos imunológicos para pesquisa de antígenos e anticorpos, sendo que os testes
com pesquisa de anticorpos contra Dirofilaria spp. não são muito utilizados devido a sua baixa
especificidade (LANDUM, 2012). Segundo Knight (1987) uma elevada microfilaremia pode ser
consequência de uma baixa resposta imune do hospedeiro e com isso pode diminuir a quantidade de
anticorpos na circulação devido ao excesso de antígeno ou da imunossupressão.
Os métodos imunológicos para detecção de antígenos de parasitos adultos de Dirofilaria
immitis, como os baseados em ensaio imunenzinático (ELISA) e imunocromatografia são considerados
altamente específicos e não apresentam reatividade cruzada com outros parasitos como D. repens e
Acanthocheilonema spp. (MCCALL et al., 2008). Essas técnicas são mais sensíveis e específicas do
que testes imunológicos para pesquisa de anticorpos (GODWIN et al., 1998). Mesmo com alta
sensibilidade esses testes podem apresentar resultados falsos negativos (MCCALL et al, 2008).
A pesquisa de antígenos é considerada indispensável, específica e sensível no diagnóstico da
parasitose, sendo considerada padrão ouro por Ogawa (2013). Ela permite um diagnóstico mais
eficiente do que aqueles obtidos pela técnica de Knott modificada, uma vez que as microfilárias podem
estar ausentes (FERNANDES et al.,1999). A ausência de microfilárias pode ser devido a vários fatores
como: período pré-patente; terapia microfilaricida com macrolídeos que atuam por 3 a 7 meses, os
quais além de eliminar as microfilárias, podem influenciar na potência sexual de filarídeos machos
adultos podendo as vezes resultar em estado oculto de infecção (GODWIN et al., 1998); parasitismo
somente por adultos do mesmo sexo ou de ambos os sexos, mas estéreis (FERNANDES et al., 1999);
infecções com poucos parasitos adultos; presença de fêmeas ainda imaturas ou destruição das
microfilárias por resposta imune do hospedeiro (SILVA & LANGONI et al., 2009).
As técnicas para pesquisa de antígeno disponíveis no mercado para D. immitis podem
identificar de forma confiável, infecções determinadas pela presença de 2 a 3 parasitos fêmeas adultos
no cão (GENCHI et al., 2007). Uma vez que menos de 1% das infecções são sintomáticas, a pesquisa
de antígeno irá detectar maior número de infecções do que as técnicas somente para detectar
microfilárias (MCCALL et al., 2004). A pesquisa de antígeno também é utilizada para verificar o
sucesso da terapia adulticida, podendo ser realizada após 5 meses do término da terapia (GENCHI et
al., 2007). Devido à sobrevivência das microfilárias após morte dos adultos, uma pequena
porcentagem de cães pode apresentar microfilaremia, sem formas adultas no coração. Os filhotes de
cadelas com alta contagem de microfilárias podem apresentar microfilaremia transitória, sem presença
do adulto devido a passagem dessas formas evolutivas pela placenta (TODD & HOWLAND, 1983) e o
teste imunológico para detecção do antígeno do filarídeo adulto é eficiente para descartar esses animais
como falsos positivos (FERNANDES et al., 1999; SOUZA & LARSSON, 2001; DILLON, 2007).
27
Em estudos publicados recentemente, vem sendo relatado que um prévio aquecimento de
amostras de soro ou sangue total que foram negativas pelo ELISA para captura de antígeno pode
promover um aumento da positividade. Apesar de ainda não ter sido elucidado completamente o
processo que leva a esse aumento de positividade, alguns autores vêm sugerindo que esse aumento
estaria associado à dissociação do complexo imune após o aquecimento, fato associado ao aumento da
densidade óptica em amostras positivas após o aquecimento detectado pela espectrofotometria
(LITTLE et al., 2014; VELASQUÉZ et al., 2014). Velasquéz et al. (2014) sugeriram que o
aquecimento de amostras antes do diagnóstico imunológicas para pesquisa de antígenos é
particularmente importante para uma maior acurácia diagnóstica, porém requer um grande volume de
soro, não sendo viável em algumas situações.
Drake et al. (2015) após o tratamento térmico de amostras de soro de 15 cães negativos na
sorologia usando o Kit DiroCheck®, obtiveram uma positividade de 53,3% (8/15). Ciucã et al. (2016)
em um estudo realizado na Romênia, ressaltaram a importância do aquecimento prévio de amostras,
em área endêmica de co-infecção de D. immitis e D. repens. Os autores conseguiram detecção de
infecção oculta por D. immitis em animais co-infectados somente após o aquecimento das amostras
(CIUCÃ et al., 2016).
4.2.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
As metodologias moleculares vêm apresentando crescente importância na parasitologia
veterinária uma vez que o uso de estudos baseados em material genético de células eucariotas são
aplicáveis ao estudo de parasitos e seus hospedeiros. A PCR é uma técnica que vem sendo utilizada
para identificação e diagnóstico de parasitos (PRICHARD, 1997). O conhecimento sobre o material
genético de parasitos pode ser utilizado para identificação, diagnóstico, epidemiologia molecular,
desenvolvimento de vacinas e estudos de evolução e fisiologia de parasitos e da relação parasito-
hospedeiro (PRICHARD, 1997).
Favia et al. (1996) desenharam dois primers para o diagnóstico de D. repens e D immitis em
amostras biológicas e conseguiram a identificação correta dos parasitos em amostra de sangue total,
estágios larvares encontrados nos dípteros e formas imaturas do parasito em tecidos, superando os
problemas relacionados a identificação de formas imaturas. Segundo os autores as técnicas baseadas
em PCR permitem a identificação do parasito e o processamento de grande número de amostras de
dípteros contribuindo para estudos de distribuição espacial e sazonal do parasito.
Watts et al. (1999) desenvolveram um primer para detecção de um segmento de 1.33 kb do
gene 16 S rRNA de D. immitis em vetores, como alternativa a dissecação e pesquisa microscópica das
formas larvares. Os autores verificaram que o primer apresentou capacidade de detectar pequenas
quantidades de DNA parasitário, além de elevada especificidade, sendo indicado como ferramenta para
28
mapeamento de grande número de insetos infectados e estudos epidemiológicos relacionados a taxa de
transmissão sazonal da parasitose.
Rishniw et al. (2006) propuseram a identificação de filarídeos que infectam cães por meio da
técnica de PCR utilizando diversos primers específicos para as diferentes espécies de filarídeos e
utilizaram um primer desenhado a partir do gene COI (citocromo oxidase subunidade 1) para
validação genotípica independente da espécie. Os autores concluíram que a PCR desenvolvida com
genes panfilariais representa uma ferramenta adequada para genotipar todos os membros da Família
Onchocercidae. Os autores sugerem que se for necessária confirmação, que podem ser realizados PCR
espécie específicos ou sequenciamento de amplicons, contudo eles pensam que um simples gel de
eletroforese é suficiente para o diagnóstico da maioria dos casos.
Ferri et al. (2009) verificaram coerência entre os resultados obtidos por análise morfológica e
DNA barcoding, que compreende no sequenciamento rápido de um ou pouco genes de diversos
indivíduos representativos da espécie, bem como a comparação dessas sequencias dentro e entre
espécies, objetivando desenvolver uma ferramenta universal, econômica e padronizada para
taxonomia. Os autores verificaram que tanto gene COI quando o 12S rDNA foram marcadores
moleculares apropriados para identificação de filarídeos de espécie pelo DNA barcoding, sendo que o
gene COX1 demonstrou maior consistência.
O gene COX1 ou COI é um gene que apresenta, com excessão dos cnidários, divergência
suficiente para garantir o diagnóstico específico. Além disso, esse gene mostra-se constante na mesma
espécie com variações inferiores a 1% e raramente maiores que 2%. Quando existem variações
grandes, normalmente esses indivíduos habitam regiões geográficas diferentes (HERBERT et al.,
2003). Segundo os autores, apesar de críticas relacionadas ao uso de DNA mitocondrial na
caraterização de espécies, por essa organela ser transferida horizontalmente, existe uma crescente
evidência de que o genoma mitocondrial e o nuclear apresentam uma ligação íntima. Esses efeitos
estão ligados a interações entre os produtos gênicos codificados pelo núcleo e pela mitocôndria e pela
dependência da presença de proteínas produzidas pelo núcleo para o funcionamento das enzimas do
sistema citocromo oxidase mitocondrial (HERBERT et al., 2003). A citocromo oxidadase mitocondrial
subunidade 1 é útil para maximizar a sensibilidade de protocolos de PCR e está presente em um
número elevado de cópias em cada organismo e que permitem a detecção do DNA de filarídeos
mesmo em amostras com baixa microfilaremia (MISHRA et al., 2007)
Morales-Hojas et al. (2009) afirmaram que os estudos filogenéticos moleculares concordam
com as classificações prévias baseadas na morfologia para os filarídeos. As espécies mais basais na
filogenia da Família Onchocercidae, baseadas nos genes COI e 12S mitocondriais, são os gêneros
Setaria e Ochoterenella. Esses genes são mais apropriados para a filogenia em níveis taxonômicos
29
mais baixos, pois apresentam homoplasia o que resulta em ruídos randômicos que reduzem a
confiabilidade do sinal filogenético (MORALES-HOJAS et al., 2009; CASIRAGHI et al., 2001).
Gioia et al. (2010) realizaram uma PCR multiplex (12S rDNA) para diagnóstico concomitante
de Dirofilaria immitis e Dirofilaria repens em amostras de sangue de cães. A técnica padronizada
apresentou sensibilidade similar a técnica de Knott. Os autores relataram que o diagnóstico diferencial
desses filarídeos em áreas de co-infecção algumas vezes é difícil e necessita de profissionais técnicos
experientes. O PCR multiplex padronizado reduz o custo com reagentes, o tempo de processamento e
o risco de contaminação, possibilitando também a detecção específica das duas espécies de filarídeos
mais comuns de de cães, sendo importante tanto para estudos epidemiológicos, como para diagnóstico
em áreas de co-infecção.
Na Romênia, Ciocan et al. (2010) realizaram PCR (12S rDNA e COXI genes) para
identificação da espécie de filarídeos presente em 8/188 cães positivos por técnicas parasitológicas por
microscopia (exame direto e Knott modificada) e imunológicas. A PCR permitiu o diagnóstico de
infecção por D. repens em todos os animais. Os autores concluíram que a PCR utilizada permitiu o
diagnóstico fácil e com elevada especificidade para diferenciação dos principais filarídeos que
infectam cães na Europa.
Borthakur et al. (2015) realizaram PCR com alvo para região ITS2 do rDNA e obtiveram
menor frequencia de positividade quando comparado com resultados obtidos por ELISA (Snap™
4Dx®), fato associado pelos autores a detecção de infecção ocula pelo ELISA ou falha na extração de
DNA. Os autores concluíram que o PCR confirmou ser válido para a identificação dos filarídeos de
cães.
4.2.4 Outras Técnicas de Diagnóstico
A pesquisa de filarídeos adultos ocorre quando outros testes não são elucidativos, quando não
há presença de microfilárias por exemplo. Nestes casos os exames de escolha são radiografias e
ecocardiogramas (MCCALL et al., 2008).
A radiografia é útil para avaliar a gravidade das lesões pulmonares, mas não para a avaliação
da carga de parasitos (VENCO et al., 2004). A radiografia mostra sinais de doença vascular pulmonar
avançada (Figura 4A). O ecocardiograma é realizado em cães, principalmente nos casos em que clínica
e achados radiológicos sugerem doença grave. O ultrassom cardíaco pode aumentar a precisão no
estadiamento da doença e avaliar o prognóstico (MCCALL et al., 2008) (Figura 4B).
30
Figura 4: A: Fotografia de radiografia de tórax de um cão infectado de 12 anos de idade com
cardiomegalia do lado direito e grave doença vascular pulmonar. .B: Fotografia da imagem do
ecocardiograma do mesmo cão da figura A. Nematoides são visualizados como dupla paralela, objetos
lineares (seta) flutuante para dentro do lúmen da artéria pulmonar direita. Fonte: Venco et al. (2007).
4.2.5 Estudos de Diagnóstico da dirofilariose por diferentes técnicas
Vários estudos relataram a eficiência das técnicas parasitológicas microscópicas, imunológicas
e moleculares para o diagnóstico da dirofilariose.
Roth et al. (1993), em área de baixa incidência na Califórnia, avaliaram a infecção por
Dirofilaria spp. em 1359 cães, dos quais 99,12% foram negativos pelas técnicas de Knott modificada,
filtração em membrana e por dois kits de diagnóstico imunológico para pesquisa de antígeno. Em 7/12
amostras positivas houve identificação de D. immitis pelo uso de técnicas de coloração com fosfatase
alcalina. Dirofilariose oculta foi detectada, por ELISA, em 5/12 (41.7%) cães negativos na pesquisa
por exame direto. Os autores alertaram, que devido a baixa frequência da infecção e eficiência das
técnicas parasitológicas por microscopia utilizadas, se não houvesse sido utilizado técnicas
imunológicas, não seria diagnosticado a infecção nos cinco cães. A negatividade das técnicas
parasitológicas foi associada ao uso de medicação microfilaricida que pode ter determinado
esterilidade temporária dos filarídeos adultos devido a terapêutica contínua, infecções monosexuais ou
esterilidade mediada por resposta imunológica.
Montaño et al. (2002) compararam a técnica de Woo (microhematócrito) com a técnica de
ELISA para pesquisa de antígenos, na Venezuela em 69 cães atendidos em uma Policlínica Médica
Veterinária e observaram positividade em 31 (44,9%), dos quais 2 (2,89%) foram positivos apenas
pela técnica de microhematócrito, 14 (20,28%) pelo ELISA e 15 (21,73%) por ambas as técnicas. Os
autores observaram maior percentual de positividade entre os cães de 3 a 5 anos de idade (17/26 -
65,38%) e menor nos acima de nove anos (3/12- 25%). Os autores destacaram que nos testes
imunológicos pode haver resultados falso negativos associados a baixa concentração de antígenos
31
circulantes devido a imaturidade dos parasitos adultos ou presença exclusiva de machos. Além desses
dois fatores, os resultados falsos positivos em ELISA com presença de microfilárias tem sido
relacionado a eliminação de antígenos circulantes devido a complexos antígeno-anticorpos, presença
de parasitos adultos mortos com persistência de microfilárias, contaminação da amostra de sangue com
outro sangue positivo, transfusão de sangue, transferência pré-natal e destruição de antígeno devido a
armazenamento inadequado da amostra.
Na República Dominicana, Duran-Struuck et al. (2005) em cães atendidos em uma clínica
médica veterinária particular, utilizaram dois métodos para identificação de Dirofilaria immitis, o
exame direto e o teste imunológico e observaram que na cidade de Samana 5/53 (9,4%) cães foram
positivos no teste imunológico (Witness HW Test®) e em 1/5 (20%) não foi observada microfilaremia,
na região de Limon 10/31 (32%) foram positivos no imunológico (Witness HW Test®), sendo 9 por
antígeno e 8 por microscopia. Nessa região um animal foi negativo no imunológico e foi positivo na
microscopia, o que foi relacionado a presença de parasitismo por algum outro filarídeo que não
Dirofilaria immitis. Na região de El Valle, 4/20 (20%) animais foram positivos no teste imunológico
(Witness HW Test®) e desses 2/4 estavam com microfilaremia. Os autores obtiveram positividade em
15,1% (5/33) dos machos e 20% (14/70) das fêmeas sem diferença estatística significativa.
Bolio-Gonzales et al. (2007) realizaram em amostras de cães de um centro de controle animal,
do México a técnica de distensão espessa e Knott modificada e obtiveram prevalência de 7% (47/676)
e 8,3% (56/676), respectivamente, sem diferença estatística significativa entre as duas técnicas. Os
autores obtiveram maior positividade nos cães com 3 anos ou mais, sendo a idade considerada
importante fator de risco, o que foi associado pelos autores a maior tempo de exposição a picada de
vetores.
Pantchev et al. (2009) na Alemanha realizaram teste imunológico para pesquisa de antígeno
(Snap™ 4Dx® IDEXX) e Knott modificada em dois grupos de estudo, sendo um composto por cães
de caça (A) e o outro por cães de companhia (B). Os autores detectaram no grupo A, 3/44 cães com
microfilarias sem bainha identificadas na PCR como D. repens. No grupo B nenhum animal foi
positivo (0/288) pela técnica imunológica. Os autores apontaram que a dirofilariose cutânea canina é
uma doença não exclusiva de cães importados, enquanto Dirofilaria immitis ainda não tem importância
na Alemanha.
Miterpáková et al. (2010) na Eslováquia avaliaram 710 cães policiais e militares e detectaram
118/591 (20%) e 10/119 (8,4%) respectivamente de positividade pela técnica de Knott modificada.
Dentre os cães positivos, todos apresentaram infecção por D. repens confirmada por PCR, sendo que
dentre os militares, três apresentaram co-infecção D. repens/D. immitis.
Em um estudo na Venezuela, Guilarte et al. (2011) realizaram diagnóstico parasitológico para
detecção de microfilárias usando as técnicas de exame direto, Knott modificada e o teste imunológico
32
(Snap™ 4Dx® IDEXX) em amostras de 138 cães domiciliados e obtiveram positividade em 21
(15,2%) por uma ou mais técnicas. Pelo exame direto os autores detectaram positividade em 8,7%
(12/138) pela Knott modificada em 8,7% (12/138) e pelo imunológico em 20/138 (14,5%). Dos 20
animais positivos pelo imunológico, 12 estavam positivos pelo exame direto e 11 pela Knott
modificada, sendo obtido índice de concordância Kappa entre exame direto e imunológico de 0,7195 e
entre técnica de Knott modificada e imunológico de 0,6494. Os autores obtiveram maior positividade
entre machos (52,4% - 11/21) do que entre fêmeas (47,6% - 10/21), sem diferença estatística
significativa. Também não houve diferença significativa da positividade entre as faixas etárias dos
animais.
Venco et al. (2011) evidenciaram 29% (221/608) de positividade entre cães atendidos em
hospitais veterináros, sendo que 80% (176/221) foram positivos tanto pela técnica de Knott modificada
quanto pela pesquisa de antígeno, 18% (40/221) apenas pelo imunológico e 2% (5/221) apenas pela
Knott modificada.
Ng et al. (2012) na Malásia avaliaram 100 cães domiciliados e 50 errantes e detectaram
infecção em 1,33% (2/150) dos animais por meio de exame direto, Knott modificada, e duas técncias
imunológicas (Snap™ 4Dx® IDEXX e Rapigen®), sendo uma amostra positiva apenas pela Knott
modificada e uma pela Knott modificada e pelo imunológico Snap™ 4Dx®.
Vieira et al. (2014), em Portugal, em cães atendidos em clínica veterinária para exames de
rotina, detectaram prevalência total de 27,3 % (83/304) com positividade de 19,4% (59/304) pelo
exame direto, de 20,1% (61/304) pela Knott modificada e de 25,7% (78/304) pelo Snap™ 4Dx®
IDEXX, com sensibilidade de 71,7% para o exame direto, 73,5% para a Knott modificada e 94% para
o Snap™ 4Dx® IDEXX. Esse estudo demostrou uma porcentagem de 26,5% (22/83) de infecção
oculta por D. immitis. Esses autores também detectaram 6% de amostras negativas pelo Snap™ 4Dx®
IDEXX e que foram positivas para a Knott modificada e sugerem que tenham sido pela baixa carga
parasitaria, presença somente de microfilaremia em casos de morte dos filarídeos adultos, pois a
espécie foi confirmada por meio da técnica de atividade da fosfatase ácida.
Borthakur et al. (2015) em um estudo na Índia, em cães de trabalho, detectaram 6,26%
(49/782) de positividade, utilizando a técnica de Knott modificada, o ELISA (Snap™ 4Dx® IDEXX) e
a PCR. Os autores obtiveram positividade de 11,38% (89/782) por Knott modificada, 18,03%
(141/782) pelo ELISA e 13,93% (109/782) pelo PCR. Esse estudo revelou 22.69% de dirofilariose
oculta. A menor positividade pelo PCR foi associada por algum erro na extração ou por infecção
oculta. Os autores destacaram que o benefício para utilização da PCR permitiu a diferenciação de
espécies, onde nesse estudo houve a identificação de quatro animais parasitados por D. repens.
Simsek et al. (2011) verificaram por meio do PCR, com sequência do gene COI, positividade
em 8,1% (10/123) de cães errantes da Turquia, obtendo maior eficiência de diagnóstico frente as
33
técnicas de ELISA “in house” para detecção de anticorpos (2,1%) e exame direto (4,8%), fato
associado a maior sensibilidade da PCR na detecção de baixas concentrações de microfilárias e menor
capacidade do ELISA em detectar níveis baixos de anticorpos circulantes, por ineficácia do teste ou
baixa resposta imune humoral.
Rojas et al. (2015) ao comparar a eficiência de diagnóstico para Dirofilaria sp. em cães
domiciliados na Costa Rica, utilizando PCR em tempo real associado a HMR (high resolution melt), e
evidenciaram que essa técnica apresentou maior eficiência no diagnóstico de filarídeos caninos (22,6%
- 33/146), possibilitando a discriminação das espécies, quando comparados com a técnica de Knott
modificada, a pesquisa em microhematócrito e a técnica imunológica de captura de antígenos. Os
autores obtiveram positividade de 8,9% (13/146) no microhemtócrito, 17% (24/146) na Knott
modificada e 11% (16/146) no imunológico.
No Brasil, vários estudos de técnicas de diagnóstico de dirofilariose foram realizados. Larsson
(1990), em São Paulo, em cães atendidos no Ambulatório da Faculdade de Medicina Veterinária,
utilizando a técnica de distensão espessa e Knott modificada encontraram positividade de 8,8%
(45/511) para D. immitis e 6,45% (33/511) para A. reconditum e não obtiveram diferença significativa
entre as técnicas. Também em São Paulo, Larsson et al. (1992), em 244 amostras de soro de cães
negativos para microfilárias circulantes evidenciaram 14,34% (35/244) de positividade para antígeno
de Dirofilaria immitis por técnica imunológica, concluindo que é importante e indispensável o uso dos
testes para detecção de antígenos para diagnóstico da dirofilariose oculta.
Souza (1992), no Estado do Rio de Janeiro considerando diversos municípios, ao avaliar a
freqüência de D. immitis em cães domiciliados, encontraram 25,35% (108/426) de cães positivos para
detecção de antígeno, 10,80% (46/426) pelo exame direto e 15,96% (68/426) pela Knott modificada.
Dos animais positivos, 68/108 (62,96%) eram assintomáticos.
Labarthe et al. (1997a), em áreas litorânesas de alta incidência no estado do Rio de Janeiro,
realizaram um estudo em duas fases, tendo obtido na primeira fase, 16,85% (134/795) pela técnica de
Knott modificada e na segunda fase 21,34% (127/595) positivos, dentre os quais 83 (13,95%)
apresentaram microfilaremia pela Knott modificada e dirofilariose oculta, confirmada pelo ELISA, em
44 (7,98%).
Alves et al. (1999) na cidade de Recife, Pernambuco, realizaram necropsia, Knott modificada e
ELISA em 611 cães e evidenciaram positividade de 2,3% (14/611), 1% (6/611) e 1,3% (8/611)
respectivamente. Dos cães positivos na necropsia, 57,1% (8/14) eram amicrofilaremicos, 6/14 tinham
microfilarias e antígenos e 57,1% (8/14) não apresentavam antígenos circulantes. Os autores
concluíram que a porcentagem de falsos positivos e falsos negativos em áreas de baixa prevalência são
mais altos do que em áreas de alta prevalência.
34
Brito et al. (2001) na cidade de Maceió, avaliaram 1.097 cães domiciliados, sendo 858
avaliados pela técnica de distensão espessa e verificaram que 2,1% (18/858) foram positivos, sendo 13
machos e cinco fêmeas. Em um segundo grupo de 239 cães domiciliados, os mesmos autores
detectaram pela distensão espessa e pelo teste imunocromatográfico (Witness®) 5% (12/239) de
animais positivos, sendo 3 desses animais diagnosticados somente pelo teste imunológico sendo
considerados portadores de uma possível dirofilariose oculta.
Araujo et al. (2003) realizaram um estudo em Santa Catarina, em cães militares, evidenciaram
positividade em 12/80 (15%) animais, sendo que 5 (6,25%) foram diagnosticados apenas pela técnica
de Knott modificada, 2 (2,25%) apenas pela distensão espessa e 5 (6,25%) por ambas as técnicas. Os
autores afirmaram que a discordância entre as técnicas não permitiu descartar o uso da distensão
espessa, além disso os autores sugeriram que seja realizada a leitura de duas a três laminas de
microscopia originadas da Knott modificada para aumento de sua eficiência.
Garcez et al. (2006) na Ilha de Marajó no norte do Brasil, avaliaram amostra de 90 cães que
habitavam as Vilas Pingo D’Água e União e obtiveram positividade de D. immitis em 73,5% (25/34)
pelo ELISA (Snap™ 3Dx® IDEXX), 67,6% (23/34) pela distensão espessa e 61,8% (21/34) pela
técnica de Knott modificada, sem diferença estatística significativa. Os autores associaram a
concordância entre as técnicas parasitológicas e sorológicas à alta carga parasitária. Foi evidenciado
que todos os cães acima de dois anos estavam com microfilaremia
Ogawa et al. (2013) em estudo realizado em Porto Velho-RO, em cães domiciliados,
evidenciaram 12,8% (93/727) de amostras positivas pelo teste imunocromatográfico para pesquisa de
antígenos (Heartworm Antigen Bionote), 0% (0/727) de positividade para microfilaremia com
distensão espessa e 10% (73/727) para PCR. Os autores não evidenciaram diferença de positividade
entre os cães que ficavam dentro de casa e os que ficavam do lado de fora da residência.
4.3 Epidemiologia das dirofilarioses
A dirofilariose é uma infecção parasitária zoonótica, sendo uma grande preocupação para
proprietários de pequenos animais, principalmente, de regiões costeiras de países tropicais e
subtropicais (BATISTA et al., 2008). Esta parasitose é determinada pelos parasitos do gênero
Dirofilaria, no Brasil, e têm principalmente, os canídeos domésticos e silvestres como hospedeiros
definitivos e outros mamíferos como hospedeiros eventuais, incluindo o ser humano. Os hospedeiros
intermediários ou vetores da dirofilariose são dípteros da família Culiciidae, dos gêneros Aedes,
Anopheles, e Culex suscptíveis à infecção pelo parasito (FERNANDES et al., 1999).
A prevalência de Dirofilaria immitis apresenta índices variáveis. A população canina exposta
maior risco é aquela que está submetida à maior exposição aos vetores, tais como os cães não
35
controlados sanitariamente em zonas rurais, os que não possuem abrigo permanente, os de caça, de
guarda, competição ao ar livre e os que são transportados para locais em que a infecção é endêmica
(POUBEL et al., 2008; TZIPORY et al., 2010).
O sexo, a raça e a pelagem podem estar associados à prevalência de infecção nos cães na
medida em que condicionam a aptidão e a exposição do animal, uma vez que existem raças mais
condicionadas para o trabalho de campo do que outras. (BYEON et al., 2007; CRINGOLI et al., 2001;
POUBEL et al.,2008). Montoya et al. (1998) demonstraram que machos apresentam maior
probabilidade de infecção do que as fêmeas, o que pode estar associado ao fato de estes animais serem
mais utilizados na área externa das propriedades. Cringoli et al. (2001) também obtiveram maior
positividade entre machos, não apontando explicações para esse fato e sugerindo que esta situação
deva merecer mais atenção em estudos futuros. A idade é também um importante fator de risco,
determinado pelo tempo de exposição em áreas em que esta parasitose é endêmica. Assim sendo, cães
adultos apresentam uma maior prevalência de infecção por Dirofilaria sp do que cães mais novos
(MONTOYA et al., 1998; CRINGOLI et al., 2001). A relação entre a idade e a prevalência da
infecção também se vincula ao tempo de vida do parasito adulto, em média 5 a 7 anos, e a resposta
imunitária do hospedeiro (NEWTON, 1968 apud MCCALL et al, 2008). Estes fatos justificam a
ocorrência de maior prevalência entre cães de 3 a 7 anos de idade e redução da mesma em animais
mais velhos 10 anos (BYEON et al., 2007; MORCHON et al., 2008).
4.3.1 Vetores
Os culicídeos tem uma distribuição geográfica ampla, com mais de 3500 espécies em todo o
mundo. O elevado grau de adaptabilidade desses insetos tem assegurada a sua presença em todo o tipo
de ambiente (CANCRINI & GABRIELLI et al., 2007). Cerca de 70 espécies de dípteros culicídeos,
principalmente dos gêneros Culex spp., Aedes spp., Anopheles spp., Culiseta spp., e Coquilletidia spp.
têm sido identificadas, e consideradas vetores potenciais da dirofilariose animal e humana, embora
apenas em alguns casos, a sua capacidade vetorial real tenha sido comprovada (MORCHÓN et al.,
2012).
A transmissão da filariose canina está relacionada com as características comportamentais dos
dípteros. Estudos de infecções experimentais mostraram que muitas espécies podem ser potencias
vetores da filariose canina (OGAWA, 2013). Mesmo com grande número de espécies vetoras, pouco
se sabe da transmissão vetorial (AHID et al., 1999). Labarthe et al. (1998) pesquisaram vetores da
dirofilariose em Niterói, RJ e encontraram seis espécies infectadas, sendo elas: A. scapularis, A.
taeniorhynchus, C. quinquefasciatus, C. declarator, C. saltanensis e W. Bourrouli. Dentre essas,
Ochlerotatus scapularis, A. thaeniorhyncus, C. quinquefasciatus foram as melhores espécies vetoras
36
com alternância sazonal. Estudos sobre prevalência de infecção natural de vetores foram realizados em
diversos países do mundo (CANCRINI & GABRIELLI, 2007; MORCHÓN et al., 2012).
A importância de um inseto na epidemiologia de infecções por Dirofilaria sp não só depende
da receptividade à infecção e da eficiência na transmissão de larvas infectantes, mas também do
tamanho da população de vetores, seu padrão de alimentação, tempo de vida e sazonalidade
(CANCRINI & GABRIELLI, 2007).
4.3.2 Dirofilariose Humana
Parasitos do gênero Dirofilaria podem infectar vários tecidos do ser humano produzindo
infecções sintomáticas ou assintomáticas. Embora seja considerada uma infecção acidental, hoje esta
doença está na lista de doenças zoonóticas emergentes, e tem sido descrita em vários países do
Mediterrâneo, sendo muitos casos encontrados na Espanha, Itália, França e Grécia (MCCALL et al.,
2008). Em 2005, um estudo retrospectivo foi publicado nos Estados Unidos da América (EUA) com
casos de dirofilariose humana (THEIS, 2005). Na América Central, Vezzani et al. (2006) também
publicaram uma revisão com casos humanos. Klinge et al. (2011) apresentaram a dirofilariose como
uma zoonose que tem distribuição geográfica mundial e apontaram 50 casos humanos relatados nos
EUA e também casos no Japão, Ásia, Austrália, Brasil e Argentina. No ser humano, diferente do cão
não há microfilaremia (SIMON et al., 2007; KLINGE et al., 2011).
No Brasil, Rodrigues-Silva et al., (2004), relataram um caso clínico de dirofilariose pulmonar
humana no Rio de Janeiro. Em Florianópolis, Cavallazzi et al. (2002) relataram sete casos de
dirofilariose humana, sendo que em seis o diagnóstico ocorreu por meio de achado radiológico e
biopsia pulmonar excisional e um por biopsia transbrônquica.
A infecção em humanos por D. immitis, pode ocasionar comprometimento do parênquima
pulmonar, e pode ser observado formas imaturas do filarídeo, normalmente estágios de L4, que se
alojam e morrem nos ramos das artérias pulmonares formando nódulos (Figura 5A), que podem
culminar em embolia ou inflamação localizada. Esses parasitos podem também ser encontrados em
globo ocular, embora no relato de Otranto et al. (2011) não tenha sido possível confirmar a espécie
(Figura 5B). A grande preocupação em torno da dirofilariose pulmonar humana é o diagnóstico errado
dos nódulos pulmonares como lesão maligna (SIMÓN et al., 2012). Na maioria das vezes, a infecção
apresenta-se assintomática, sendo descoberta por exames de rotina para outras doenças pulmonares e
respiratórias. A dirofilariose é uma zoonose e constitui diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares
em humanos (OGAWA, 2013).
37
Figuras 5: Fotografia de radiografia de um homem adulto com lesões pulmonares causadas por
Dirofilaria immtis. Fonte: Klinge et al., 2011. B: Edema da córnea e hiperemia episcleral no olho
esquerdo de um menino de 16 anos de idade, do Brasil e um filarídeo macho adulto livre câmara
anterior. Fonte: Otranto et al. (2011).
Dirofilaria repens é responsável por quadros cutâneos e por lesões oculares quando infecta o
ser humano. Os nódulos crescem gradualmente, durante um período de semanas ou meses, com
consistência elástica e estão associados com eritema e prurido. Na localização ocular alguns casos
podem ter consequências graves, com sintomatologia como visão danificada ou perda de visão.
Complicações permanentes, tais como descolamento de retina, glaucoma, opacidade do humor vítreo e
cristalino, ou outra perda de acuidade visual, irá desenvolver-se em 10% dos pacientes normalmente.
Alguns riscos e os efeitos secundários estão associados com a extração cirúrgica dos nematoides de
áreas sensíveis, como o nervo óptico. Em casos de localização orbital, os sintomas, tais como
blefaredema e desconforto ocular podem ocorrer. Os filarídeos quando estão na conjuntiva ocular
também pode causar inflamação, tumefação e hiperemia conjuntival (SIMÓN et al., 2012).
4.3.2 Wolbachia sp.
Wolbachia pipientis, é a única espécie até agora identificada dentro do gênero Wolbachia. São
bactérias gram-negativas pertencentes à ordem Rickettsiales. Elas são intimamente relacionadas com
outras bactérias pertencentes ao mesmo grupo, tal como Ehrlichia spp. e Anaplasma spp. (BANDI et
al., 2001).
O reconhecimento da presença de Wolbachia spp. em várias espécies de filárias que infectam
seres humanos e outros animais levantou a questão do papel que essa poderia ter na doença
determinada por estas filarioses (SIMÓN et al., 2007; MCCALL et al., 2008). Assim como outras
espécies de filarídeos, D. immitis e D. repens, possuem bactérias intracelulares do gênero Wolbachia
(Rickettsiales), cuja participação no desenvolvimento da doença inflamatória como também no
tratamento da dirofilariose, tem sido extensivamente investigada (SÍMON et al., 2007)
B A
38
Em adultos de D. immitis, Wolbachia spp. encontra-se predominantemente ao longo de células
na hipoderme, que está diretamente sob a cutícula do helminto. Nas fêmeas, Wolbachia spp. também
está presente nos ovários, oócitos e estágios embrionários em desenvolvimento dentro do útero. Isto
sugere que a bactéria é transmitida verticalmente através do ovo (KRAMER et al., 2007).
As evidências sugerem que Wolbachia spp. é um simbionte de filarídeos (TAYLOR et al.,
2005), isto é, a presença da bactéria é essencial para a sobrevivência do helminto. O fenômeno da
endossimbiose bacteriana é bem conhecido nos artrópodes, mas em menor grau em nematoides. Há, no
entanto, várias características da relação entre Wolbachia spp. e filarídeos (incluindo D. immitis) que
sugerem sua natureza simbiótica. Dos estudos realizados, foi relatado que 100% dos filarídeos
pesquisados estavam infectados por Wolbachia spp. A bactéria é transmitida pelo sexo feminino à
prole, por análises filogenéticas e a Wolbachia spp. evolui junto com os filarídeos. A remoção de
Wolbachia spp. pelo uso de antibióticos leva à esterilidade das fêmeas e eventual morte de adultos
(MCCALL et al., 2008).
Numerosos estudos mostram protocolos e dosagens de tratamento que podem reduzir
drasticamente ou eliminar Wolbachia spp. (MCCALL et al., 2008). Bandi et al. (1999) relataram o
tratamento com doxiciclina em cães naturalmente infectados por D. immitis e evidenciaram redução
drástica da carga da Wolbachia spp. em D. immitis pela PCR. Em longo prazo, a terapia intermitente
resultou em uma diminuição constante e lenta de microfilárias na circulação. Segundo McCall et al.
(2008), estudos com esta bactéria podem ser a chave para novas estratégias de controle e/ou tratamento
da infecção por filarídeos incluindo a dirofilariose em seus hospedeiros.
4.3.4 Distribuição Geográfica
A dirofilariose tem uma distribuição mundial em climas temperados e tropicais (KNIGHT,
1987). As regiões de clima tropical favorecem a procriação de vetores, embora em climas temperados
também venha sendo notificados casos da dirofilariose. (OGAWA, 2013).
Na América do Norte o filarídeo já foi diagnosticado em cães domésticos em todos os 50
estados dos Estados Unidos da América (MCCALL et al., 2008). Brown et al. (2012) relataram em um
estudo realizado pelo Conselho de Parasitose em Animais de Companhia nos EUA que 1,18% dos
animais albergavam Dirofilaria immitis. Pesquisas realizadas pela American Heartworm Society nos
EUA mostraram que o número de casos diagnosticados chega a 250 mil (MCCAL et al., 2008). No
Canadá, Villeneuve et al. (2011) encontraram soroprevalência de 0,22% concordando com estudos
anteriores de Slocombe et al. (1991) que obtiveram soroprevalência de 0,18%. No México, foi
detectada prevalência nacional de 8.3% (BOLIO-GONZALEZ et al., 2007).
39
Na Europa, D. immitis já foi encontrada em cães domésticos nas regiões leste e sul. Estudos já
relataram ocorrência na Itália, Portugal, Espanha, França, Grécia, Turquia, Hungria, República Tcheca,
Eslováquia, Polônia e Croácia com uma prevalência que varia de 2 a 80%. Na Alemanha, Áustria,
Rússia e Holanda casos alóctones já foram registrados (GENCHI et al., 2005; VENCO et al., 2007;
CARDOSO et al., 2012; MORCHÒN et al., 2012). Na última década foram encontrados casos de
dirofilariose em áreas indenes e vulneráveis e estudos creditam que esse aumento na dispersão do
parasito esteja relacionado ao aquecimento global e a maior circulação de animais nessas áreas
(BROWN et al., 2012; MORCHÓN et al., 2012). No sul da Europa, Portugal, Espanha, Grécia, sul da
França e Itália são consideradas áreas endêmicas (POLIZOPOULOUS et al., 2000).
Na África, a infecção em cães parece ser fequente, mas não muito relatada. Está presente em
partes do leste, que se estende desde a República da África do Sul a República do Sudão (SCHWAN &
DURAND et al., 2002). Matola et al. (1991) relataram prevalência de 10,2% em cães na Tanzânia. Na
Tunisia, Rjeibi et al. (2016) encontraram prevalência de 14,5% para D. immitis e 3% para D. repens.
Na Ásia, D. immitis já foi encontrada em cães no Irã, Japão, China, Coréia do Sul, Índia e
Taiwan (LEE et al., 1996; WU & FAN et al., 2003). Em um estudo realizado recentemente em Tókio,
Oi et al. (2014) detectaram durante dois períodos de dois anos soroprevalência de 46% no período de
1999-2001 e 23% de 2009-2011. Na China, Hou et al. (2011) encontraram prevalência de 24%, e em
estudo recente Wang et al. (2016) relataram prevalência de 13% em Henan, província central da
China. No Irã, Khedri et al. (2014) detectaram prevalência de 27.5%. Na Índia, Borthakur et al. (2015)
encontraram uma prevalência de 9,02% em cães domiciliados e 24,54% em cães errantes.
D. immitis já foi encontrada em cães na Austrália, na região costeira e em alguns estados do
leste desse país. Na cidade de Sidney, foi detectada prevalência em cães de 11,4% (BIGGOOD et al.,
1996), e em Melbourne foi de 6.4% em raposas urbanas (MARKS & BLOOMFIELD., 1998),
recentemente, Nguyen et al. (2016) relataram que a prevalência da dirofilariose na Austrália ainda não
é bem estudada.
Na América Central e Caribe, Kosek et al. (1995) realizaram um levantamento epidemológico
em cães domiciliados nas Ilhas Caribenhas e observaram prevalência em Porto Rico que variou de
3.1% a 20.4%. Em Cuba, a prevalência variou de 7% para 19% e 37% para 63% na Ilha da Juventude,
em Curaçao a parasitose apresentou variação de 9% para 11% e nas Bahamas prevalência de 53% e
18%.
Dos 13 países que compõem a América do Sul, só existem relatos da parasitose em cães
domésticos no Peru, Colômbia, Argentina e Brasil (LABARTHE & GURREIRO, 2005). No Peru, D.
immitis foi relatado pela primeira vez em 1945 (ACUÑA & CHAVEZ et al., 2002). Posteriormente
houve detecção de prevalência de 0% a 12,8% (ACUÑA & CHAVEZ et al., 2002; BRAVO et al.,
2002; CHIPANA et al., 2002; ADRIAZÉN et al., 2003). Labarthe & Guerrero (2005) em uma revisão
40
das dirofilarioses apresentaram que na Colômbia há relatos de prevalência de 3,8% a 4,8% e no Chile
não foi encontrado cães positivos por D. immitis. Na Argentina, Vezzani et al. (2006) relataram
prevalência que varia de 1% a 71%.
No Brasil, a dirofilariose canina determinada por Dirofilaria immitis já foi detectada em 15
áreas hiperendêmicas estando presente de todas as regiões (LABARTHE et al., 2014). Entretanto, a
maioria dos estudos está concentrada nas regiões sudeste, nordeste e sul. Segundo Labarthe et al.
(2003) a prevalência nacional era de 2 %, embora outros autores tenham encontrado prevalências
locais mais elevadas. Na região centro-oeste, na Grande Cuiabá, 5,8% dos cães testados foram
microfilarêmicos para D. immitis (FERNANDES et al., 1999). Na região Norte, em Belém do Pará
obteve-se positividade de 10.7% (SOUZA et al., 1997) e na Ilha de Marajó foi de 53,4% (GARCEZ et
al, 2006). A prevalência na região Nordeste, incluindo Alagoas e Pernambuco, tem sido relatada na
faixa de 1,4% a 10,3% (AHID et al., 1999; ALVES et al., 1999; BRITO et al., 2001; LABARTHE et
al., 2003). Na região Sul, a prevalência variou de 0,94% em Guaratuba-PR a 15% em Florianópolis-SC
(LEITE et al, 2007; ARAÚJO et al, 2003) e na região sudeste, incluindo estados de Rio de Janeiro e
São Paulo, de 2,2% a 52,5% (SOUZA & LARSSON et al., 2001; LABARTHE et al., 1997a;
LABARTHE et al., 2003).
Diversos estudos têm detectado a prevalência da dirofilariose em diferentes municípios
brasileiros. O quadro 2 apresenta um resumo dessas frequências.
Quadro 2 – Frequência da dirofilariose em diversos municípios de estados do Brasil
Estudo Localidade Frequência Técnica
Souza et al., 1997 Belém - PA 10.7% (58/540) Distensão espessa
Microhematócrito
Knott
Labarthe et al., 1997a Rio de Janeiro e
Niterói - RJ
16,85%
(134/795)
8,61% (RJ)
21,76%
(Niterói)
33,3% (Maricá
a Cabo Frio)
Knott mod.
Labarthe et al., 1997b Niterói - RJ 21,24% Knott mod.
Fernandes et al., 1999 Cuiabá - MS 5.8% (29/500)
Di
0,6% (3/500) Ar
Knott
Ahid et al., 1999 São Luis - MA 15% Necrópsia e Knott
Alves et al., 1999 Recife - PE 2,3%
1%
1,3%
Necropsia
Parasitológico
Imunológico
Fernandes et al., 2000 Cuiabá - MS 12.8% Immunoblot
41
Almeida et al., 2001 Salvador e Lauro
Freitas - BA
10,4% (64/613) Exame direto
Knott
Brito et al., 2001 Maceió - AL 1.3% (15/1097)-
Di
1,3% (15/
1097)- Ar
Imunológico
Exame direto
Knott
Souza e Larsson, 2001 São Paulo - SP 8% (25/310) Knott e ELISA
Suassuana et al., 2003 Mossoró - RN 8,6% Cromatografia rápida
Araújo et al., 2003 Ilha dos Araças –
Florianópolis - SC
15% (12/80) Knott
Distensão espessa
Labarthe et al., 2003 Niterói - RJ 2% (51/2553) Imunológico
Reifur et al., 2004 Área costeira - PR 5,47% Knott, filtração e
Imunológico (Ag)
Machado, 2005 Florianópolis - SC 0% (0/138) Knott
Garcez et al., 2006 Ilha de Marajó - PA 53.5% (48/90) Knott
Distensão espessa
Imunologico
Silva et al., 2008 Coari - AM 12.5% Distensão espessa e
delgada
Ogawa et al., 2013 Porto Velho - RO 0%
12,8% (93/727)
10% (73/727)
Distensão espessa
Imunocromatográfico
PCR
Labarthe et al., 2014 15 localizações - RJ
Cabo Frio – RJ
Armações dos
Búzios - RJ
23,1%
(354/1531)
27,5% (11/40)
62,2 % (23/37)
Imunológico
*¹ Di- Dirofilaria immitis; *² Ar- Acanthocheionema reconditum, Knott mod.- Knott
modificado.
No Rio de Janeiro, Labarthe et al. (1997a) evidenciaram em um total de 134 (16,85%)
amostras positivas com microfilaremia, sendo 8,61% do Rio de Janeiro e 21,76% de Niterói e seus
arredores, por meio da técnica de Knott modificada. No Brasil, a pesquisa mais extensa foi realizada
no Rio de Janeiro, onde a prevalência foi em 1990 de 21,24% e diminui para 3,8% (LABARTHE et
al., 1997a; LABARTHE et al., 2003). Essa queda também foi observada na região oceânica em
Niterói, onde em 1988 foi de 43,4% e em 2003 de 0,6% (LABARTE & GUERRERO, 2005). No
bairro de Itacoatiara houve também diminuição gradual da dirofilariose, em 1993 a prevalência foi de
37% e em um último estudo, em 2003 não foram identificadas microfilaremia em 113 cães
(LABARTHE & GUERREIRO, 2005). Na Região dos Lagos, que se localiza no litoral norte do estado
do Rio de Janeiro, pertencendo a mesorregião das baixadas litorâneas, encontrou-se os estudos de
Labarthe et al. (1997a) que relataram prevalência na região costeira que englobou Maricá a Cabo Frio
prevalência de 33,3% (5/15) e Labarthe et al. (2014) Cabo Frio e Armações dos Búzios, frequências de
27,5% (11/40) e 62,2 % (23/37), respectivamente.
42
5. METODOLOGIA
5.1 Amostragem
O estudo foi realizado com cães residentes no município de Cabo Frio, RJ. Foram contatados
proprietários de cães que os levaram para atendimento em uma Clínica Médica Veterinária privada em
Cabo Frio, RJ, independente do motivo da consulta. O projeto foi apresentado e em caso de interesse
do proprietário, o mesmo foi convidado a assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE) (Apêndice 1). Foi preenchida uma ficha com informações referentes ao animal (Apêndice 2),
como principais informações como sexo, permanência dentro ou fora da residência, sintomas e
tratamento.
O estudo previu a inclusão de no máximo 150 cães de diferentes faixas etárias e gênero
atendidos na clínica médica veterinária.
Os animais foram divididos em 4 grupos que foram compostos por uma amostragem prevista
de no máximo 30 cães cada por ser um número mínimo que permite análise em projetos piloto (Miot,
2011; Fontelles et al, 2010). No grupo 1 – 13 animais de 3 meses até 1 ano de idade; grupo 2 – 30
animai de 1 ano a 3 anos de idade; grupo 3 – 30 animais de 3 até 6 anos de idade e grupo 4 – 30
animais com mais de 6 anos de idade.
5.1.1 Local de Estudo
O estudo foi realizado na cidade de Cabo Frio, localizada na região litorânea do estado do Rio
de Janeiro localizado a uma altitude de 4 metros acima do nível do mar. Faz divisa com os municípios
de Armação dos Búzios a leste, Arraial do Cabo a sul, Araruama e São Pedro da Aldeia a oeste, e
Casimiro de Abreu e Silva Jardim a norte. É o sétimo município mais antigo do Brasil. O município de
Cabo Frio possui uma área de de 400.415km², tem uma população de 200.380 habitantes (dados
fornecidos pelo IBGE em 2013) e é uma cidade com clima predominantemente tropical (Homepage
PREFEITURA MUNICIPAL DE CABO FRIO).
43
Figura 6: Mapa do município de Cabo Frio com localização aproximada da Clínica Veterinária (seta
negra) de onde as amostras dos cães foram obtidas. Fonte: www.axefacil.com.br
5.1.2 Coleta das Amostras
No período de julho de 2015 a abril de 2016 foram coletadas amostras de sangue de cães. Foi
realizada punção na veia braquio-cefálica de cada animal, após contenção mínima, sendo obtidos 4,0
ml de sangue, sendo utilizados equipamentos de proteção individual (Figura 6A e 6B).
Figura 7: Fotografia referente à contenção mínima dos cães (A) e coleta de amostra de sangue por
punção de veia braquio-cefálica (B). Fonte: do autor
A amostra de sangue foi distribuída em três tubos de ensaio, sendo: 1ml em tubo BD
Vacuntainer® sem anticoagulante, 2,0 ml em tubo BD Vacuntainer® com anticoagulante EDTA
(ácido etilenodiamino tetra-acético) e 1,0 ml em tubo BD Vacuntainer® com anticoagulante EDTA
A B
44
para PCR (reação em cadeia da polimerase). As amostras de sangue foram identificadas e os tubos
foram acondicionados em recipiente isotérmico, sendo posteriormente encaminhados ao Laboratório
de Diagnóstico Imunoparasitológico da Disciplina de Parasitologia do Departamento de Microbiologia
e Parasitologia do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense.
5.2 Processamento Laboratorial
As amostras de sangue com anticoagulantes EDTA ficaram armazenadas a 4ºC e foram
processadas em no máximo 4 dias. Essas amostras foram submetidas às técnicas de: exame direto,
distensão delgada, distensão espessa e técnica de Knott modificado (DE CARLI, 2001, SOUZA et al.,
1997.). A outra amostra de sangue coletada com anticoagulante foi transferida para um microtubo tipo
Eppendorf® de 2 ml e armazenada a -200C para posterior processamento pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) utilizando primer do gene COI (SIMSEK et al., 2011). As amostras acondicionadas
em tubos sem anticoagulante, foram deixadas sobre a bancada a temperatura ambiente por um período
de 30 minutos e depois foram centrifugadas em centrifuga RDEi® a 5000 rpm por 5 minutos. Após
esse procedimento, retirou-se um volume mínimo de 500 µl de soro com micropipeta, sendo esse
acondicionado em um microtubos tipo Eppendorf® de 2 ml. Em caso de volume superior, o mesmo foi
armazenado em outro microtubo. O soro foi armazenado a - 200C para posterior processamento pela
técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA – SNAPP 4DX IDEXX®) (LIU et al., 2013).
As fotomicrografias das microfilárias foram realizadas no microscópio óptico binocular
Olympus® BX 41, inicialmente, em aumento de 100 vezes e 400 vezes, acoplado a câmera digital
Samsung® SDC415 com software de captura Honestech® PVR. Para morfometria das formas
evolutivas de parasitos foi utilizado o microscópio óptico uniocular Olympus® CH30 em 400 vezes
com uma ocular micrométrica Olympus® SWH.
5.2.1 Técnicas Parasitológicas Microscópicas (TPMs)
5.2.1.1 Exame Direto
Em até 4 dias, o exame direto, era realizado utilizando 40µl de sangue com EDTA após
homogeneização. O material foi examinado entre lâmina de microscopia e lamínula (24 X 32mm). A
lâmina foi examinada em microscópio óptico com aumento de 100x. A presença de microfilárias foi
verificada indiretamente pela movimentação dos eritrócitos, devido aos movimentos serpentiformes
característicos desse filarídeo (DE CARLI, 2001; GOMES et al. 2012). A contagem de microfilárias
no exame direto foi realizada por meio de estimativa sendo categorizadas em: leve, moderada ou
intensa. Considerou-se como leve quando na leitura do total de 96 campos da lamínula (24X32mm)
45
foram evidenciadas menos de uma microfilária por campo; moderada quando havia 1 a 2 microfilárias/
campo e intensa quando eram observadas 5 microfilárias/campo.
5.2.1.2 Distensão Delgada
A distensão delgada foi realizada por meio da deposição de 10µl de sangue total com EDTA
sobre a extremidade de uma lâmina de microscopia nova e desengordurada. A gota foi distendida com
auxílio de uma lâmina de vidro com extremidades aparadas, resultando em uma largura de distensão de
2,2 mm. A distensão foi deixada sobre superfície plana por cinco minutos para a secagem total. Uma
vez seco, o material foi coberto com três ml de Metanol PA (Merck®) por um minuto. A distensão foi
então depositada em rack de madeira em plano obliquo para secagem e posteriormente corada com
corante Giemsa (Reagen®) por vinte minutos (DE CARLI, 2001).
As distensões delgadas apresentaram em média 4,5±0,2cm de comprimento. A contagem de
microfilárias, presente em cada amostra, foi realizada pela leitura total de cada lâmina em aumento de
100X. A contagem foi realizada por 3 profissionais às cegas, sendo o resultado final expresso em
média e desvio padrão.
5.2.1.3 Distensão Espessa
A distensão espessa também é conhecida como gota espessa. Após homogeneização delicada,
foi retirado 40µl de sangue do tubo com EDTA, sendo esse depositado sobre uma lâmina de vidro de
microscopia nova e desengordurada e espalhado em pequena área da superfície formando uma gota
espessa com cerca de 1,5 cm de diâmetro. Após a secagem por um período de 24 horas em superfície
plana, o material foi desemoglobinizado por imersão em água destilada a temperatura ambiente,
aguardando em torno de 10 a 20 minutos. A lamina foi depositada em rack em plano obliquo para
secagem. Após a secagem, o material foi fixado com 3 mL de metanol PA (Merck®) e corado pelo
Giemsa (Reagen®) na proporção de 2:3 (Figura 6).
Foi realizada a contagem de microfilárias pela leitura de todos os campos da distensão espessa
em aumento de 100X. A contagem foi realizada por 3 profissionais às cegas, sendo o resultado final
expresso em média e desvio padrão.
46
Figura 8: Técnica de distensão espessa para diagnóstico de D. immitis. A: seqüência de lâminas na
ordem de processamento (distensão espessa de sangue após secagem, distensão espessa após
desemoglobinização e distensão espessa corada pelo Giemsa). B ; microfilárias visualizadas em
distensão espessa no aumento de 400X. C: microfilárias visualizadas em distensão espessa no aumento
de 100X. Fonte: do autor
5.2.1.4 Coloração por Azul de Metileno segundo Giemsa
As lâminas de distensão delgada e distensão espessa foram depositadas sobre um suporte
confeccionado de bastões de vidro de 8 mm unidos por tubo de borracha de silicone. Esse suporte foi
apoiado sobre uma bandeja plástica. O corante Giemsa (Reagen®) foi diluído em tampão fosfato de
coloração na proporção 2:3. Cada lâmina foi coberta por 3 ml de solução corante por um período de 20
minutos. Após esse tempo, a solução foi drenada e a lâmina foi lavada em fluxo corrente de água
destilada e depositadas em suporte inclinado para secagem.
5.2.1.5 Técnica de Knott Modificada
A técnica de Knott modificada (KNOTT, 1939 modificada por NEWTON & WHRIGHT,
1956) consistiu em utilizar 1,0 ml de sangue com anticoagulante EDTA, acrescido de 9,0 ml de
formalina a 2% em um tubo de centrífuga. Após homogeneização, o material foi centrifugado
(Centrifuga Daiki®) a 2500 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado. Foi retirada uma
gota do sedimento (40 µl) e depositada sobre uma lâmina de microscopia para confecção de uma
distensão espessa. Adicionou-se então ao sedimento restante uma gota de azul de metileno (1:1000).
Retirou-se uma gota desse sedimento (40 µl), a qual foi transferida para uma lâmina de vidro e coberta
com uma lamínula 24X32mm. Em seguida, o material foi examinado ao microscópico óptico em
aumento de 100x para observar a presença, contagem, mensuração e características morfológicas das
microfilárias (DE CARLI, 2001; LÓPEZ et al., 2012).
47
A contagem de uma mesma lâmina foi realizada por três profissionais às cegas, sendo o
resultado final expresso em média e desvio padrão.
5.2.6 Ensaio Imunoenzinático - ELISA
O diagnóstico imunológico foi realizado usando um kit comercial (SNAP 4Dx IDEXX® - Ref.
9926193, Lote SNEM788) ELISA de IDEXX Laboratories, Inc., para a identificação do antígeno do
ovário da fêmea de D. immitis. Esse diagnóstico foi realizado de acordo com as especificações do
fabricante.
O técnica imunológica realizada pelo kit comercial SNAP 4Dx IDEXX® trata-se de um ELISA
não covencional que pode ser realizado a campo com soro, plasma ou sangue total canino. Segundo
Labarthe et al (2003) na elaboração do kit Snap 3Dx IDEXX® que é semelhante e do mesmo
fabricante que o kit utilizado nesse estudo, foi utilizado um conjugado do peptídeo C6 com albumina
do soro de bovinos (BSA) e peroxidase de cavalos (HRP). No diluente que acompanha o kit contém
anticorpos anti-HRP para D.immitis e peptídeos de E.canis anti-HRP, proteínas não específicas e
detergentes. Se antígenos de D. immitis e anticorpos de E.canis e B. burgdorferi estiverem presentes na
amostra, ligam-se ao conjugado sintético HRP e ao conjugado BSA. A amostra com o diluente são
dispensados na matriz do dispositivo que continha reagentes ao substrato. Se a amostra for positiva
para algum dos agentes ocorrerá uma reação de cor na matriz, se o teste for realizado corretamente e a
amostra devidamente preparada.
Devido a limitações financeiras, foram adquiridos 60 kits para diagnóstico pelo ELISA. A
seleção de amostras para processamento pelo ELISA seguiu os seguintes critérios: foram incluídas as
amostras dos 60 animais inseridos na faixa etária de um ano até seis anos de idade. Excluiu-se as
amostras de animais com idade inferior a um ano, devido ao período pré-patente do parasito ser de 6 a
7 meses, período necessário para o desenvolvimento e maturação dos adultos (GUILARTE et al.,
2011). Da mesma forma, excluiu-se desse processamento as amostras dos animais com mais de seis
anos, uma vez que a vida média dos parasitos adultos é de cerca de cinco a seis anos segundo a
literatura (NEWTON, 1968)
5.2.7. Biologia Molecular
5.2.7.1 Extração de DNA
Para a extração de DNA das amostras de sangue canino em EDTA utilizou-se o Kit comercial
High Pure PCR Template preparation Kit Roche® (Ref.: 11796828001, Lote: 14545100) de acordo
com as orientações do fabricante. Procedeu-se a extração do DNA de um exemplar de Dirofilaria
immitis adulto, a qual foi realizada com o kit comercial para extração de DNA e de amostras de sangue
48
de cães positivo para microfilárias e negativo com o Kit (Promega®) para produção dos controles
positivo e negativo. O parasito adulto foi recuperado na necrospsia de um cão e foi armazenado a -
20°C, por cerca de um mês até a extração do DNA. Foi retirado um pequeno fragmento do parasito, o
qual foi macerado em gral de porcelana com pistilo. Foi acrescentado cerca de 1 ml de nitrogênio
liquido. Adicionou cerca de 150 µl de água destilada estéril, sendo o material resultante tranferido para
um microtubo tipo eppendorff de 2,0 ml. Esse material foi submetido a extração do DNA pelo Kit
comercial (Promega®) e armazenado a -200C.
5.2.7.2 Reação em Cadeia da Polimerase
A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada utilizando-se pares de iniciadores
(primers) 5 -AGTGTAGAGGGTCAGCCTGAGTTA-3 forward e
5ACAGGCACTGACAATACCAAT-3 – reverse, para amplificar uma sequência de 203 pb do gene da
citocromo oxidase mitocondrial (COI) (RISHNIW et al., 2006) seguindo procotolo adaptado a partir
do descrito por Simsek et al. (2011), havendo aumento na concentração do primer (250mM).
A PCR teve um volume final de 20 µl contendo 10 µl com 200mM de GoTaq Green Master
Mix (Promega®), 0,5 µl de cada primer contendo 250mM, 1µl do DNA extraído e 8 µl de água
destilada para ajuste do volume final. As reações foram realizadas em termociclador (2720 Applied
Biosystems®) seguindo o protocolo: uma fase de pré-desnaturação de 94°C por 2 minutos, 32 ciclos
de desnaturação de 94°C por 30 segundos cada, um ciclo de anelamento de 63°C por 30 segundos, um
ciclo de extensão com 72°C por 30 segundos e um ciclo final de extensão de 72°C por 7 minutos
(SIMSEK et al., 2011).
Alíquotas de 8 µl dos produtos amplificados foram submetidos à eletroforese horizontal, em gel
de agarose a 1,5%, em tampão de corrida TBE (Tris-borato 9mM e EDTA 1mM, pH 8,6, Ambion ®).
A corrida eletroforética foi realizada em cuba eletroforética (Hoefler®) a 80V/40 minutos e depois
70V/20 minutos. Para a determinação do tamanho dos produtos amplificados foi utilizado um
marcador de peso molecular de 50 pares de bases (Promega®). A seguir, o gel foi corado em Brometo
de Etídio por 10 minutos e os produtos foram visualizados em transiluminador ultravioleta e
fotografados (L.PIX – Loccus Biotecnologia®).
Todas as reações de amplificação foram realizadas em ensaio cego e comparadas ao resultado
de controle positivo, controle negativo e peso molecular realizados concomitantemente. O DNA de D.
immitis controle positivo foi obtido de exemplar adulto do parasito. Como controle negativo foi
utilizado o DNA extraído de amostras de sangue de cão que não apresentava microfilárias e nem
antígenos do parasito adulto D. immitis, testado pelo Snap™ 4DX® (IDEXX). Os controles foram
previamente testados utilizando o mesmo protocolo da PCR.
49
Para amostras que apresentaram resultado parasitológico por microscopia positivo (presença de
microfilárias) e PCR negativa foi realizada uma outra PCR (PCR2) onde inclui-se na análise dessas
amostras 1µl da solução contendo DNA extraído do parasito adulto, para avaliar presença de
inibidores. No caso de haver amplificação, realizou-se outra PCR (PCR3), com o dobro de volume da
amostra (2 µl), dessa forma possibilitando aumento da chance de encontro de DNA parasitário. Após
esse procedimento, quando a amostra se manteve negativa realizou-se nova extração de DNA sendo
repetida a PCR3.
5.2.7.3 Sequenciamento de Fragmentos Amplificados na PCR
Os fragmentos amplificados do parasito adulto e de uma das amostras positivas foram
submetidos ao seqüenciamento. Os produtos da PCR amplificados foram purificados em colunas
Wizard® SV Gel and PCR Clean - Up System (®Promega) seguido de sequenciamento nucleotídico
direto usando o Kit comercial Big Dye Terminator v 3. 1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
(®Applied Biosystems). O sequenciamento foi realizado em ambas as fitas no Sequenciador ABI-
Prism 3130, alocado no Laboratório Multiusuários de Microbiologia e Parasitologia (LMMP), Instituto
Biomédico - UFF. As sequências foram editadas e analisadas nos programas Chromas 2.1.1 e Bioedit
7.1.9. Após edição as sequências foram comparadas às disponíveis no GenBank pelo uso da
ferramenta Blast (NCBI), disponível no sítio https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Não foi possível
a realização do sequenciamento de todas as amostras devido a limitações financeiras.
5.3 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram analisados de forma descritiva e pelos testes de McNemmar, Exato
de Fisher e obtido o índice de concordância. A concordância de resultados entre as diferentes técnicas
foi avaliada por meio do índice de concordância (Kappa) e do teste estatístico de McNemar. No teste
de McNemar quando o valor de P for maior ou igual a 0,05 aceita-se a hipótese nula, ou seja, existe
concordância entre a maioria dos resultados das técnicas considerando-se a mesma amostra. Quando o
valor de P for menor que 0,05 aceita-se a hipótese alternativa, o que indica que os resultados das
técnicas discorcordam em muitas amostras.
A análise da significância entre os resultados positivos para infecção obtidos e as variáveis
idade, local de permanência do cão na residência e sexo dos animais foram avaliadas pelo teste de
Exato de Fischer, com intervalo de confiança de 5%. Todas as análises estatísticas foram realizadas no
programa SPSS® versão 17.
Quadro 3 : Fórmula de Kappa
Positivo negativo total
positivo A B a+b
50
negativo C D c+d
Total a+c b+d n
pa= a+d
n
pe = (a+b X d) + (c+d X b+d)
n n n n
K= pa – pe
1 – pe
pa – probabilidade de concordância geral
pe – probabilidade esperada de concordância
Fonte: Landis & Koch (1977).
Quadro 4 – Valores de referência para interpretação do valor de Kappa
K CONCORDÂNCIA
< 0,00
0,00 – 0,21
0,21 – 0,41
0,41 – 0,61
0,61 – 0.81
0,81 – 1,00
Sem concordância
Fraca
Ligeiramente Fraca
Moderada
Substancial
Quase perfeita (excelente)
Fonte: Landis & Koch (1977).
5.4 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Esse projeto foi submetido a Comissão de Ética Animal da Universidade Federal Fluminense e
obteve parecer favorável em 18 de junho de 2015, sob número 168 (Anexo 1).
51
7. RESULTADOS
Foram coletadas 103 amostras de sangue de cães, sendo que dessas 20 (19,4%) apresentavam
microfilárias e/ou presença de DNA parasitário. A faixa etária que apresentou maior número de
animais infectados foi de três a seis anos com 10 animais, apresentando diferença estatística
significativa com as demais faixas (Tabela 1).
Tabela 1 – Resultados por faixa etária obtidos por técnicas parasitológicas microscópicas e PCR para
pesquisas de D. immitis em 103 cães do município de Cabo Frio, RJ
Faixa Etária Positivos Negativos P
3m – 1 ano 0 13 0,1244
1 ano 3anos 8 22 0,0909
3anos 6 anos 10 20 0,0082*
> 6 anos 2 28 0,1538
Total 20 (19,4%) 83 (80,6%)
Teste Exato de Fischer P<0,05*
No diagnóstico parasitológico por microscopia e molecular foi observado que em 16/20 (80%)
animais, todas as técnicas utilizadas detectaram positividade (Tabela 2). Em todas as amostras
positivas para PCR houve detecção de microfilárias pelas técnicas de microscopia. As técnicas
parasitológicas por microscopia associadas detectaram 19,4 % de positividade e a PCR 15,5%.
Tabela 2 – Resultado obtido por quatro técnicas parasitológicas por microscopia e PCR nos 20 cães
infectados por D. immitis em Cabo Frio, RJ
Faixa
Etária
Positivos Total
Exame
Direto
Distensão
Delgada
Distensão
Espessa
Técnica de
Knott
mod.
PCR
3 m 1a 0 0 0 0 0 0
1 a 3a 7 6 8 8 5 8
3 a 6a 10 10 10 10 9 10
>6a 2 2 2 2 2 2
Total 19(18,4%) 18(17,4%) 20 (19,4%) 20(19,4%) 16(15,5%) 20(19,4%)
m – meses, a – ano, Knott mod. – Knott modificado
52
As técnicas de distensão espessa (DE) e Knott modificada (KM) apresentaram índice de
concordância Kappa igual a 1, sendo considerado excelente. O valor de Kappa entre as técnicas de
exame direto (ED) e distensão delgada (DD) (K=0,96), exame direto (ED) e distensão espessa (DE)
(K=0,95), exame direto (ED) e Knott modificada (KM) (K=0,95), distensão delgada e Knott
modificada (K=0,89) e entre distensão delgada e distensão espessa (K=0,89) foram considerados como
excelente. O índice de concordância Kappa entre o resultado global obtido pelas técnicas
parasitológicas por microscopia e a técnica molecular foi igual a 0,79, sendo substancial. Pelo Teste
de McNemar obteve-se diferentes índices de concordância entre os resultados obtidos de todas as
técnicas parasitológicas por microscopia e pela PCR (Tabela 3).
Tabela 3 – Resultados do grau de concordância e dicordância pelo teste estatístico de McNemar entre
as técnicas parasitológicas por microscopia e molecular para pesquisas de D. immitis em 103 cães do
município de Cabo Frio, RJ.
Técnicas de Diagnóstico Teste estatístico de
McNemar
Exame Direto X Distensão Delgada 1,0
Exame Direto X Distensão Espessa 1,0
Exame Direto X Knott modificada 1,0
Distensão Delgada X Knott modificada 0,50
Distensão Delgada X Distensão Espessa 0,50
Distensão Espessa X Knott modificada 1,00
Exame Direto X PCR 0,250
Distensão Delgada X PCR 0,625
Distensão Espessa X PCR 0, 125
Knott modificada X PCR 0,125
P> 0,05 Ausência de discordância, P<0,05 discordância
Em um animal fêmea, com três anos, a positividade foi detectada somente pelas técnicas de
Knott modificada e distensão espessa e em outra fêmea com 2 anos e 7 meses pelas técnicas de exame
direto, distensão espessa, técnica de Knott modificada e PCR.
Dos 103 animais, 57 eram machos (55,3%) e 46 eram fêmeas (44,7%), havendo maior
positividade entre os machos, sem diferença estatística significativa na distribuição pelo sexo (Tabela
4).
53
Tabela 4 – Relação entre a positividade obtida por técnicas parasitológicas microscópicas e molecular
para pesquisa de microfilárias e o gênero em 103 cães do município de Cabo Frio, RJ
Sexo Positivos Total
Exame
Direto
Distensão
Delgada
Distensão
Espessa
Técnica de
Knott
mod.
PCR Positivos Negativos
Macho
N= 57
13 13 13 13 11 13 39
Fêmea
N=46
6 5 7 7 5 7 44
P 0,155 0,091 0,238 0,238 0,185 0,238
Teste Exato de Fischer P<0,05, Knott mod. – Knott modificado, PCR – Reação em Cadeia da
Polimerase
Dos animais participantes 56/102 (54,4%) permaneciam na área externa da residência e 46/102
(44,7%) na área interna da residência. Não foi possível recuperar a informação referente ao local de
permanência na residência de um animal. A maioria dos animais positivos ficavam na área externa,
havendo diferença estatística significativa com aqueles que permaneciam sempre dentro das
residências (P<0,0001). À risco de infecção (odds ratio) foi significativamente maior para cães que
habitavam áreas externas do que para cães que vivem dentro de casa (Tabela 5).
Tabela 5 - Resultados obtidos por técnicas parasitológicas por microscopia e PCR e relação com local
de permanência na residência de de 102 cães do município de Cabo Frio, RJ
Local de
permanência
na residência
Positivos Total positivo
Exame Direto Distensão
Delgada
Distensão
Espessa
Técnica de
Knott mod.
PCR
Interna
n= 46
1 1 1 1 1 1
Externa
n= 56
18 17 19 19 15 19
P 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Odds ratio 21,3
(2,7 – 167,6)
19,6
(2,5-154,2)
23,1
(2,9 – 180,8)
23,1
(2,9-180,8)
16,5
(2,1 – 130,2)
23,1
(2,9 – 180,8)
Teste Exato de Fischer P<0,05 Knott mod. – Knott modificado PCR – Reação em Cadeia da
Polimerase
54
Com relação ao tratamento profilático, dos 102 animais que possuíam essa informação, 17
(16,5%) faziam tratamento. Desses, 4/17 apresentaram positividade para dirofilariose, sendo 2/17
detectados pelas técnicas parasitológicas por microscopia, 4/17 por ELISA e 1/17 por PCR. Obteve-se
resultados concordantes entre parasitológico por microscopia e ELISA em 1/17 animal, parasitológico
por microscopia, ELISA e PCR em 1/17 e somente pelo ELISA em 2/17 animais. Não houve relato em
relação ao nome do fármaco utilizado. Segundo os proprietários desses animais, 9/17 faziam uso
mensal e regular do tratamento profilático, sendo que dentre os animais positivos só 1/4 fazia
tratamento regular, porém havia começado há dois meses.
Dos 103 animais, 9 (8,7%) apresentaram sintomas compatíveis com dirofilariose, sendo que 2
(1,9%) foram positivos para a parasitose, com relato de tosse nos dois e de prostração em um, sendo
um positivo no diagnóstico todas as técnicas, apenas apresentava tosse.
Em 60 animais dos 103 coletados foram utilizadas técnicas parasitológicas por microscopia,
molecular e ELISA para captura de antígeno, sendo evidenciada positividade em 26/60 (43,3%)
animais. Em 8/26 (30,7%) o diagnóstico foi realizado exclusivamente pela técnica imunológica e em
1/26 (3,8%) somente pelas técnicas parasitológicas por microscopia de DE e KM. Das 25 amostras
positivas pelo ELISA, 11(48%) foram negativas pelo PCR. Em 14 amostras obteve-se positividade por
DE, KM, ELISA e PCR (Tabela 6).
Tabela 6 – Resultado de positividade pelas quatro técnicas parasitológicas por microscopia, PCR e
pelo ELISA (Snap™ 4Dx®) em 60 cães de Cabo Frio, RJ
Faixa
Etária
Técncias parasitológicas
Positivos
PCR ELISA Total
positivo
Exame
Direto
Distensão
Delgada
Distensão
Espessa
Técnica de
Knott mod.
Total
1a 3a 7 6 8 8 8 5 14 15
3a 6a 10 10 10 10 10 9 11 11
Total 17 16 18 18 18 14 25 26
m – meses, a – ano, Knott mod. – Knott modificado, PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
O índice de concordância Kappa entre o resultado global das técnicas parasitológicas por
microscopia e imunológica (ELISA) foi igual a 0,62 e entre a técnica imunológica e a PCR igual a
0,64, sendo considerados como substancial. A análise de concordância e discordância dos resultados
pelo teste de McNemar obtidos entre as técnicas parasitológicas, imunológica e molecular
apresentaram diferença estatística significativa (P<0,05) (Tabela 7). Dos 60 animais, 11/27 fêmeas e
15/33 machos foram positivos pelo ELISA, sem diferença estatística significativa (P=0,459).
55
Tabela 7 - Comparação do grau de concordância e dicordância (teste de McNemar) entre as técnicas
parasitológicas por microscopia, PCR e ELISA para pesquisas de D. immitis em 60 cães do município
de Cabo Frio, RJ
Técnicas de diagnóstico Teste estatístico de
McNemar
Exame Direto X ELISA 0, 008*
Distensão Delgada X ELISA 0, 004*
Distensão Espessa X ELISA 0, 039
Knott X ELISA 0,039
PCR X ELISA 0,001*
P< 0,05* ausência de concordância e P>0,05 ausência de discordância ELISA- Ensaio
Imunoenzimático, PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
Foi evidenciado que, nas amostras positivas, a contagem de microfilárias obteve valores médios
maiores nas técnicas de distensão espessa e Knott modificada (Tabela 8).
Tabela 8 - Resultados para contagem de microfilárias de filarídeos obtidos por técnicas parasitológicas
com leitura por microscopia em amostras de sangue de 20 cães do Município de Cabo Frio, RJ.
G Total
de
cães
Cães
positivo
s
Técnicas
Distensão delgada Distensão espessa Knott mod.
Total
cães
Média Total
cães
Média Total
cães
Média
1 13 0 0 0 0 0 0 0
2 30 8 6 16,7 ±
0,6
8 168,5 ±
16
8 213,6 ±
5,4
3 30 10 10 18 ±
0,6
10 217,5 ±
32,2
10 205,5 ±
3,7
4 30 2 2 7,2 ±
0,8
2 21,8 ±
5,7
2 65 ± 8
G – grupo de cães, Knott mod. – Knott modificado
Pela técnica de exame direto pôde-se evidenciar que a maioria das amostras analisadas foram
categorizadas como infecção moderada (Tabela 9). No exame direto, as microfilárias apresentaram
movimento serpentiforme. Nas técnicas parasitológicas por microscopia distensão delgada, distensão
espessa e Knott modificada, as microfilárias detectadas apresentaram região anterior cônica com cauda
afilada retilínea, e apresentaram mensuração média de 301,8 ± 14,4 µm (350 – 272,5 µm) X 5 ± 0,1
µm (6,25-5 µm), tendo sido mensuradas 175 microfilárias por técnica.
56
Tabela 9 – Resultado da contagem de microfilárias de filarídeos por estimativa considerando a técnica
de exame direto em amostras de 20 cães de Cabo Frio, RJ.
Grupo Total de cães Cães
positivos
Categoria
Leve Moderado Intenso
1 13 0 0 0 0
2 30 7/8 2 3 2
3 30 10/10 1 5 4
4 30 2/2 0 2 0
Leve - menos de uma microfilária/ campo; Moderada - 1 a 2 microfilárias/ campo; Intenso - 5
microfilárias/campo. Total de 96 campos em lamínula 24X32mm.
A amplificação da região mitocondrial do gene COI utilizando o primer COIR e COIF resultou
em uma banda única de 203bp em 16/103 (15,5%) amostras (Figura 9 e 10). Nenhuma das amostras
negativas para pesquisa de microfilárias apresentaram amplificação de fragmento de DNA. Em oito
amostras que foram positivas nas técnicas parasitológicas, não se obteve resultado positivo na primeira
PCR, com presença apenas da amostra (1 µl). Na PCR 2, com presença de solução com DNA do
parasito adulto (1 µl) e da amostra (1 µl), as oito amostras apresentaram positividade indicando
ausência de inibidores de amplificação de DNA. Na PCR3, com o dobro de volume de amostra (2 µl),
4/8 amostras apresentaram resultados positivos e 4/8 mantiveram-se negativas. Após essa tentativa
realizou-se nova extração de DNA das quatro amostras negativas, sendo repetida a PCR3 que não
apresentou amplificação.
Figura 9: Produto da PCR submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5% usando primers COI R e
COI F. 1) DNA Ladder (50bp); C+) Controle positivo com DNA de parasito adulto; PV) Poço vazio; 1
Fonte: do autor
57
Figura 10: Produto da PCR submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5% usando primers COI R
e COI F. 1) DNA Ladder (50bp); C+) Controle positivo com DNA de parasito adulto. Fonte: do autor
O sequenciamento dos fragmentos amplificados do parasito adulto e de uma amostra positiva
na PCR (amostra 13) foi realizado e comparado com a sequências gênica de Dirofilaria immitis
(KC985239 – Vichova et al., 2104) depositada no Genbank, havendo homologia total (100%) (Figura
11).
Figura 11: Alinhamento de sequências de fragmento do gene COI de Dirofilaria immitis. Legenda:
KC985239. Número de acesso de sequência de D. immitis depositada no Genbank usada para
comparação; Adulto: Parasito adulto de D. immitis usado como controle positivo nas reações de PCR.
Amostra 13: amostra de sangue positiva para D. immitis no exame parasitológico e imunológico. Obs:
os primers não foram removidos da análise. Fonte: do autor
58
10. DISCUSSÃO
A frequência de positividade por técnicas parasitológicas por microscopia e PCR evidenciada
entre os 103 cães de Cabo Frio- RJ foi de 19,4%, sendo menor que as relatadas nessa mesma cidade
por Labarthe et al. (2014) que evidenciaram 27,5% (11/40) e Labarthe et al. (1997a) que relataram
prevalência de 33,3% (5/15) na região costeira que englobou Maricá a Cabo Frio. Labarthe et al.
(1997a) realizaram estudo em algumas áreas do Estado do Rio de Janeiro em duas etapas, sendo que na
primeira utilizaram só a técnica de Knott modificada e na segunda Knott modificada e imunológico
(Citeâ Semi-QuantO Test Idexx) para pesquisa de antígenos e observaram aumento na frequência de
positividade, fato relacionado a dirofilariose oculta. A menor freqüência evidenciada frente aos demais
autores pode estar relacionada a menor quantidade de animais estudados anteriormente, ao período em
que foi realizado a coleta de amostras de sangue, associados a maior sensibilização de proprietários e
profilaxia ou ao uso de técnicas imunológicas que são capazes de detectar infecção oculta. Portanto,
nesse estudo a taxa de positividade real para dirofilariose possivelmente é superior a relatada, pois não
foi utilizada o teste de ELISA em todas as amostras coletadas.
Considerando o cenário nacional da prevalência de dirofilariose observou-se ampla variação nas
taxas das diversas localidades, onde há relato de ausência da infecção, como em Florianópolis com 0%
(MACHADO et al., 2005) a elevadas taxas como em Armação de Búzios-RJ com 62,2%
(LABARTHE et al., 2014). A frequência obtida nesse estudo aproxima-se das relatadas por Labarthe
et al. (1997a e 1997b) em Niterói-RJ. Esse fato pode estar associado à similaridade das condições
climáticas e geográficas entre a região litorânea de Niterói (clima tropical onde chove muito menos no
inverno que no verão segundo a classificação climática de Köppen-Geiger: Aw) e de Cabo Frio (clima
tropical com estação seca - classificação climática de Köppen-Geiger: Aw) (CLIMATE-DATA.ORG,
2016), estando ambas no Estado do Rio de Janeiro.
No grupo estudado a faixa etária com maior frequencia de positividade foi a de 3 a 6 anos, com
diferença estatística significativa com relação as demais. Esse fato também foi evidenciado nos estudos
de Montaño et al. (2002), Byeon et al. (2007), Bolio-Gonzales et al. (2007) e Morchon et al. (2008).
Por outro lado, Guilarte et al. (2011) em cães da Venezuela não observaram diferença de positividade
entre as diversas faixas etárias. Essa maior frequência nessa faixa etária pode estar associada,
concordando com estudos prévios, ao tempo de desenvolvimento dos filarídeos, como também ao
maior tempo de exposição dos cães ao repasto sanguíneo do vetor.
59
Foi evidenciada concordância entre os resultados obtidos pelas quatro técnicas parasitológicas
por microscopia e a PCR. Fato similar foi relatado por Garcez et al. (2006) avaliando amostras de cães
para diagnóstico parasitológico por microscopia de dirofilariose na Ilha de Marajó, sendo a
concordância entre os resultados associada a elevada carga parasitária. Também nas amostras dos cães
de Cabo Frio, foi observada elevada quantidade de microfilárias, o que pode ter favorecido a detecção
do parasito pelas diferentes técnicas parasitológicas por microscopia e PCR. Essa proposta é reforçada
pelo índice de concordância total dos resultados obtidos por Knott modificada e distensão espessa e
pela concordância substancial entre as demais técnicas parasitológicas por microscopia e a PCR, bem
como pelos resultados do Teste de Mcnemar.
Pelo exame direto obteve-se positividade para microfilárias em 19/20 (95%) amostras, havendo
discordância da positividade de um animal quando comparado com Knott modificada e distensão
espessa. Guilarte et al. (2011) pelo exame direto obtiveram positividade de 8,7% (12/138), tendo
obtido concordância em todas as amostras com a técnica de Knott modificada, o que discorda dos
achados desse estudo. Ng et al. (2012) em amostras de 150 cães da Malásia não obtiveram positividade
pelo exame direto, embora a infecção tenha sido detectada em 1,33% dos animais, fato que foi
relacionado a baixa incidência da parasitose. Resultados similares a desse estudo foi obtido por Vieira
et al. (2014) em cães de Portugal, que também obtiveram menor frequência de amostras positivas pelo
exame direto (19,4%) quando comparados com os resultados de Knott modificada (20,1%) e por Souza
(1992) que evidenciaram 10,8% de positividade pelo exame direto e 15,96% pela Knott modificada.
Apesar de numericamente, a técnica de exame direto ter gerado resultados em menor número de
amostras quando comparado com a técnica de Knott modificada e a distensão espessa, essa é de
procedimento simples e de rápida execução podendo ser realizada durante a consulta clínica. Além
disso, por detectar o movimento das hemácias pelas microfilárias viva, o diagnóstico torna-se mais
fácil.
A distensão delgada apresentou positividade em 90% (18/20) das amostras, sendo a técnica que
numericamente obteve menor eficácia, quando comparada as demais. Nos estudos recuperados que
abordavam comparação de técnicas de diagnóstico para dirofilariose nenhum utilizou essa técnica para
esse fim. Guilarte et al. (2011) utilizaram essa técnica somente para avaliação morfológica das
microfilárias. O não uso da distensão delgada nos estudos pode estar relacionado a pequena quantidade
de sangue que é utilizada em sua confecção, o que em áreas de baixa carga parasitária pode determinar
resultados falso negativos. Nas amostras em que a distensão delgada apresentou resultados negativos
observou-se menores contagens de microfilárias nas outras técnicas.
A distensão espessa e a técnica de Knott modificada, nesse estudo, apresentaram concordância
de resultados em todas as amostras. Essas técnicas têm sido utilizadas amplamente nos estudos de
dirofilariose, sendo a de Knott modificada a de uso mais frequente, considerada por Guilarte et al.
60
(2011) como padrão ouro. Em alguns estudos, como nos de Larsson (1990), Araújo et al. (2003) e
Garcez et al. (2006) essas técncias têm sido utilizadas associadas para obtenção do diagnóstico
parasitológico por microscopia com resultados similares ou menores para distensão espessa, sendo que
Araújo et al. (2003) não descartaram o uso da distensão espessa no diagnóstico da dirofilariose, pois
em seu estudo 2/15 animais foram diagnosticados exclusivamente por essa técnica. Brito et al. (2001)
em 12/239 (5%) cães positivos, verificaram que a distensão espessa diagnosticou nove desses animais.
Ogawa et al. (2013) não conseguiram obter positividade por essa técnica em 93 cães positivos por
técnica de imunogromatográfia. Apesar da elevada concordância entre as técnicas parasitológicas por
microscopia, a distensão espessa e a técnica de Knott modificada, recuperaram o maior número de cães
positivos. Esse fato pode estar relacionado ao maior volume de sangue utilizado no procedimento
técnico, bem como a concentração de formas evolutivas dos parasitos, associado a fixação e coloração
o que favorece a identificação do parasito.
Nesse estudo obteve-se diferença entre as contagens de microfilárias nas diferentes técnicas. Não
foi realizada a contagem de formas evolutivas no exame direto para não atrapalhar a rotina de
diagnostico na clínica, uma vez que essa técncia foi realizada imeditamente após a coleta de sangue de
cada animal, para evitar perdas no diganóstico por morte das microfilárias. A diferença entre as
contagens pode estar diretamente relacionada a quantidade de sangue utilizada em cada procedimento
técnico, considerando a distensão delgada, a distensão espessa e a Knott modificada. A distensão
espessa e a técnica de Knott modificada apresentaram contagens com valores mais próximos e com
números elevados, o que permite um fácil diagnóstico pelo microscopista, assim como o exame direto.
Frente a essa similaridade dos resultados da contagem e a infra-estrutura em material de consumo e
material permanente, pensa-se que em áreas de alta incidência, o exame direto ou a distensão espessa
sejam técnicas adequadas. O exame direto seria a técnica dentre as duas de menor custo, porém precisa
ser realizada o mais rápido possível para evitar falso negativos devido a morte de microfilárias. Já a
distensão espessa não apresentaria essa limitação, embora tenha um custo maior que o exame direto.
Na literatura não foram recuperadas informações relacionadas ao custo benefício de técnicas
parasitológicas por microscopia no diagnóstico da dirofilariose canina.
Pela mensuração e morfologia das microfilárias sugere-se que as microfilárias evidenciadas em
todas as amostras sejam de Dirofilaria immitis, baseado nos padrões de mensurações relatados por
McCall et al. (2008) e López et al. (2012). Observou-se na literatura variações nas mensurações
apresentadas e superposição de alguns valores de referência no que se refere a D. repens. Alguns
estudos utilizam a coloração pela fosfatase ácida para diagnóstico diferencial das espécies (ROTH et
al., 1993), imunológico (DURAN-STRUUCK et al., 2005) ou uso de técncias moleculares
(PANTCHEV et al., 2009; MITERPÁKOVÁ et al., 2010; GIOIA et al., 2010; BORTHAKUR et al.,
2015; ROJAS et al., 2015).
61
Pela PCR foi obtida positividade de 15,5% (16/103) das amostras, sendo esse resultado inferior
ao obtido pelas técnicas parasitológicas por microscopia. Esses resultados diferem dos relatados por
Hou et al. (2011) que em estudo realizado na China relataram positividade de 16,6% (213/886) com a
técnica de exame direto e 24% (147/886) com a PCR e dos de Simsek et al. (2011) que detectaram
positividade em 8,1% de 123 cães errantes da Turquia e 4,8% pelo exame direto. Ogawa et al. (2013)
em estudo realizado em Porto Velho-RO, evidenciaram 12,8% (93/727) de amostras positivas pelo
teste imunocromatográfico para pesquisa de antígenos (Heartworm Antigen Bionote), 0% (0/727) de
positividade para microfilaremia com distensão espessa e 10% (73/727) por PCR e concluíram que a
PCR e imunocromatografia foram mais eficazes que a distensão espessa. Da mesma forma, Borthakur
et al. (2015) em um estudo na Índia obtiveram maior eficácia da PCR (13,93%) quando comparada as
técnicas parasitológicas por microscopia (11,38% - 89/782), porém com resultados inferiores aos
obtidos pelo ELISA (18,03% - 141/782). A menor positividade pelo PCR foi associada, por esses
autores, a algum erro na extração ou por infecção oculta. Os autores destacaram que o benefício para
utilização da PCR seria a diferenciação de espécies, sendo que nesse estudo houve a identificação de
quatro animais parasitados por D. repens (BORTHAKUR et al. 2015). Em todas as amostras
microscopicamente negativas não houve amplificação de DNA parasitário, fato que segundo Gioia et
al. (2010) confirma a especificidade do procedimento técnico da PCR.
Nesse estudo não houve diferença significativa entre as técnicas parasitológicas por microscopia
e a molecular, sendo que todas as amostras positivas pela PCR também foram positivas por pelo
menos uma das técnicas parasitológicas por microscopia. Esses resultados sugerem que a positividade
da PCR pode estar diretamente relacionada a presença de microfilárias circulantes, mesmo que em
baixa quantidade.
A negatividade de quatro amostras pela PCR pode estar relacionada, em algumas amostras
(amostra 106 n=4 e amostra 70 n=16), a menor quantidade de microfilárias, o que durante a confecção
das alíquotas, aleatoriamente, pode ter determinado ausência ou quantidade ínfima de formas
evolutivas e consequentemente de DNA, impossibilitando sua detecção. Já nas amostras com elevada
contagem de microfilárias (amostra 32 n=158 e amostras 127 n=240), apesar de na morfologia não
terem sido evidenciadas larvas com características que sugerissem outra espécie de filarídeo, essa
questão não pode ser descartada, sendo necessário o uso de PCR com primers panfilariais ou
específicos para outras espécies, seguido de sequenciamento para elucidação dessa proposta. Outra
alternativa, uma vez que nesse estudo três amostras negativas pelo PCR (32, 127 e 70) foram positivas
pelo ELISA, seria o uso de PCR multiplex de passo único, como proposto por Gioia et al. (2010), o
qual apresentou equivalência à técnica parasitológica microscópica de Knott modificada, sendo válida
62
em áreas onde existe co-infecção entre D. repens e D. immitis, uma vez que o diagnóstico morfológico
precisa de microscopistas experientes e por vezes pode ocasionar imprecisão.
Essa negatividade também pode ter ocorrido devido a dificuldade de amplificação do primer
COI. O uso de primers para outros alvos gênicos poderiam ser utilizados para resolver essa questão, já
que Silva (2015) obtiveram melhores resultados em PCR para D. immitis utilizando primer para o gene
12S rDNA e Ferri et al. (2009) tenham relatado que primers para o gene 12S rDNA amplificam com
mais facilidade, embora o primer para o gene COI demonstre mais consistência. Além disso, não pode
ser desconsiderada, apesar do procedimento de extração ter sido repetido, falha na extração do DNA
parasitário como foi relatado no estudo de Borthakur et al (2015).
A maior positividade para dirofilariose foi evidenciada entre cães machos, porém sem diferença
significativa. Essa informação também tem sido relatada fora do Brasil por Duran-Struuck et al. (2005)
e Guilarte et al. (2011), Ugochukwu et al. (2016) e no Brasil por Souza (1992) e Brito et al. (2001).
Detectou-se nesse estudo diferença estatística significativa quanto ao local de permanência do
cão na residência e maior risco de infecção para animais que ficavam na área externa, fato já esperado
pela maior exposição dos animais aos vetores. Iglódyová et al. (2012) relataram que a função do cão,
assim como a idade parecem ser importantes fatores associados a transmissão da dirofilariose, uma vez
que cães de trabalho apresentam maiores frequências de infecção quando comparados com animais de
companhia, o que foi relacionado a serem mantidos fora da residência e ficarem mais expostos a
insetos.
O tratamento profilático foi relatado em 17/102 (16,5%) animais, dos quais 4/17 apresentaram
positividade para Dirofilaria immitis, considerando as diferentes técnicas diagnósticas microscópicas,
moleculares e imunológicas. Não houve relato, nos questionários, do nome do fármaco utilizado,
porém normalmente são utilizados microfilaricidas, uma vez que não há registro de adulticidas no
Brasil (PEREIRA, 2012). Silva & Langoni (2009) em revisão sobre a dirofilairose apontaram que os
principais fármacos preventivos utilizados nos cães são a dietilcarbamazina e as lactonas
macrocíclicas. Dentre as lactonas macrocíclicas, as ivermectinas orais foram os primeiros fármacos
aprovadas pelo United States Food and Drug Administration (FDA). Ainda são utilizadas a oxime
milbemicina, a selamectina topicamente e a moxidectina, com benefícios similares às ivermectinas. A
positividade encontrada nos animais, onde houve relato de quimioprofilaxia, pode ter ocorrido devido
ao uso irregular dos fármacos e/ou do não seguimento do protocolo profilático que preconiza
diagnóstico prévio dos animais com mais de seis meses por detecção de antígeno e Knott modificada
(MCCALL et al., 2008). Além disso, como proposto por Drake et al. (2015), o não aquecimento do
soro ou plasma na pesquisa de antígenos de animais tratados com lactonas macrocíclicas e doxiciclina
pode induzir a resultados falso-negativos, confundindo médicos veterinários e proprietários quanto a
eficiência do procedimento profilático. Os autores também sugerem que o encontro de microfilária em
63
pelo menos um dos animais tratados implica na seleção de resistência. Esse fato também pode estar
associado a positividade evidenciada nos cães desse estudo.
Quadros clínicos compatíveis com dirofilariose foram evidenciados em 2/103 (1,9%) animais
positivos, sendo um positivo por todas as técnicas, no qual a manifestação clínica relatada foi tosse.
Diferindo desse resultado, Ugochukwu et al. (2016) evidenciaram manifestações clínicas em todos os
animais positivos para D. immitis (4/119) em um estudo na Nigéria, caracterizadas por intolerância ao
exercício, dispneia, anorexia, tosse e mucosas hipocoradas. A presença de sintomatologia com
ausência de positividade para dirofilariose pode ser associada a outras infecções, uma vez que as
manifestações clínicas são inespecíficas ou mais dificilmente a erro técnico no diagnóstico, uma vez
que foram utilizadas várias técnicas com fundamentos diferentes. Por outro lado, a positividade sem
presença de clínica já foi relatada anteriormente (LABARTHE et al, 2014; SOUZA, 1992), fato que
pode estar associado a intensidade de infecção, idade do animal e a relação parasito-hospedeiro
individual.
Em 60 cães foi realizado diagnóstico parasitológico microscópico, por quatro técnicas, PCR e
diagnóstico imunológico para captura de antígeno (Snap™ 4Dx® – IDEXX), sendo detectados 26
(43,3%) animais positivos, dos quais 8 (30,7%) estavam negativos pelas técnicas parasitológicas. A
detecção de dirofilariose oculta por meio de técnicas imunológicas tem sido relatada por diversos
estudos (LARSSON et al., 1992; SOUZA, 1992; ROTH et al., 1993; LABARTHE et al., 1997a;
ALVES et al., 1999; MONTANO et al, 2002; GARCEZ et al., 2006; GUILARTE et al., 2011;
VENCO et al., 2011; OGAWA et al., 2013; VIEIRA et al., 2014; BORTHAKUR et al., 2015).
Segundo Roth et al. (1993) a negatividade de técnicas parasitológicas e positividade de técnicas
imunológicas têm sido relacionadas a esterilidade temporária de adultos devido a terapêutica contínua,
uso de medicação microfilaricida ou infecções monosexuais. Obteve-se índice de concordância
substancial entre todas as técnicas utilizadas, fato também evidenciado no estudo de Guilarte et al.
(2011) que obtiveram K=0,71 ente ED e Imunológico e K=0,6494 entre Knott modificada e
imunológico.
Em um animal positivo para microfilárias, o ELISA apresentou resultados negativos. Resultados
similares foram observados por Montaño et al. (2002), sendo esse fato associado a baixa concentração
de antígenos livres devido a formação de imunocomplexos, imaturidade dos parasitos adultos ou morte
dos adultos com persistência de microfilárias, sendo essa última proposta também apontada por Vieira
et al. (2014) para positividade em 6% de amostras positivas pela Knott e negativas pelo ELISA.
Duran-Struuck et al. (2005) também evidenciaram amostras negativas no imunológico e positivo na
microscopia e sugeriram a possibilidade de infecção por outra espécie de filarídeo, que não D. immitis.
Todas essas situações podem ter interferido nos resultados imunológicos obtidos no presente estudo. A
64
evidência de dirofilariose oculta torna importante o uso de técnicas imunológicas para pesquisa de
antígenos no diagnóstico da dirofilariose.
Em casos de amostras negativas pelo ELISA para captura de antígenos, estudos realizados
recentemente relataram que um prévio aquecimento do soro dos animais promove aumento na
positividade, embora o mecanismo ainda não tenha sido totalmente elucidado (LITTLE et al., 2014).
Os autores sugeriram que esse aumento estaria associado à ruptura do complexo imune após o
aquecimento, fato que foi relacionado ao aumento da densidade óptica em amostras positivas após o
aquecimento (LITTLE et al., 2014). Velasquéz et al (2014) sugeriram que o aquecimento de amostras
antes do diagnóstico imunológico para pesquisa de antígenos é particularmento importante para uma
maior acurácia diagnóstica, porém requer um grande volume de soro, não sendo viável em algumas
situações. Drake et al (2015) após o tratamento térmico de amostras de soro de 15 cães negativos na
sorologia usando o Kit DiroCheck®, obtiveram uma positividade de 53,3% (8/15). Em um estudo
realizado na Romênia, em área endêmica de co-infecção de D. immitis e D. repens obteve-se detecção
de infecção oculta por D. immitis em animais co-infectados somente após o aquecimento das amostras
(CIUCÃ et al., 2016). No presente estudo, optou-se pela realização do ELISA (Snap™ 4DX® Idexx)
seguindo as orientações do fabricante, sem aquecimento prévio da amostra, apesar do preconizado na
literatura, uma vez que a quantidade de amostra (soro) não seria suficiente. O procedimento de
aquecimento foi executado preliminarmente e experimentalmente em 10 amostras, mas o volume
recuperado foi pequeno, sendo insuficiente para a execução do ELISA, sendo, portanto, a estratégia
descartada.
Observou-se que essas 60 amostras, a PCR (23,3%) apresentou menor positividade do que o
ELISA (41,7%). Esse fato também foi observado por Borthakur et al. (2015) que obtiveram por
ELISA 18,03% de positividade e por PCR 13,93%, o que foi relacionada aos autores a infecção oculta
ou falha na extração do DNA.
A utilização do primer para o gen COI determinou a formação de uma banda única com 203 bp,
estando de acordo com os resultados relatados por Simsek et al. (2011) e Rinshiw et al. (2006), porém
diferiram dos resultados obtidos por Silva (2015) que obtiveram amplificações não específicas. A
obtenção de banda única, pode ter sido devido ao protocolo utilizado nessa PCR que seguiram o
preconizado por Simsek et al. (2011), havendo somente alteração na concentração do primer.
Apesar de Simsek et al. (2011) afirmarem que o uso de PCR com primer para o gen COI ser
consistente para a diferenciação intra e interespecífica de filarídeos, foi realizado sequenciamento de
material amplificado do parasito adulto e de uma amostra positiva sendo confirmado homologia total
com sequência de D. immitis depositada no GenBank, siugerindo que todos os resultados positivos na
PCR equivalem a esse parasito.
65
As técnicas parasitológicas de Knott modificada e a distensão espessa utilizadas apresentaram
resultados iguais, detectando o maior número de animais positivos, considerando como parâmetro a
detecção de microfilárias. Levando em conta o procedimento técnico e o custo dessas técnicas, em
áreas de elevada frequência, a distensão espessa demonstrou ser uma técnica apropriada e com menor
custo, embora não tenha sido explicitado o custo de cada técnica. A técnica de Knott modificada
necessita de centrifuga, sendo que a literatura preconiza sua realização em um (LEITE et al., 2007) até
três dias (FERNANDES et al., 1999) após a coleta. Já a distensão espessa, além de utilizar menor
quantidade de amostra, pode ser feita diretamente no campo, gerando uma lâmina permanente, o que
permite leitura posterior e até releitura, sem risco de perda de material, bem como avaliação
morfológica.
Nesse estudo, a PCR com gene COI não apresentou aplicabilidade para diagnóstico da
dirofilariose canina de rotina em comparação com as demais técnicas utilizadas, apesar do pequeno
painel de amostras positivas. Além disso, seu custo elevado, tempo de processamento, infraestrutura e
mãos de obra especializada limitam sua utilização, podendo a mesma ser realizada como etapa
preliminar no diagnóstico de espécie em casos de estudos de epidemiologia molecular ou como
ferramenta auxiliar ao ELISA em áreas de baixa frequencia parasitária. Torna-se necessário a
ampliação de estudos com maior número de amostras, abrangendo diferentes localidades, como
também a utilização de diferentes alvos moleculares.
O ELISA permitiu a detecção de infecções ocultas, o que ressalta a importância de seu uso em
procedimentos de diagnóstico dessa parasitose na clínica e em estudos epidemiológicos. Cabe
considerar que apesar da maior eficicácia da técnica imunológica, torna-se importante, sempre que
possível, associar a essa, uma técnica parasitológica por microscopia, seja distensão espessa ou Knott
modificada, para aumento da acurácia diagnóstica, já que em uma amostra nesse estudo, o diagnostico
foi realizado exclusivamente pelas técnicas parasitológicas por microscopia de distensão espessa ou
Knott modificada.
66
9. CONCLUSÃO
Houve detecção de infecção por D. immitis em cães de Cabo Frio por meio das técnicas
parasitológicas por microscopia, por técnica imunológica para pesquisa de antígeno e pela técnica
molecular através da reação da polimerase em cadeia.
Obteve-se concordância excelente entre as quatro técnicas parasitológicas por microscopia.
Obteve-se concordância substancial entre as técnicas parasitológicas por microscopia, ELISA e
PCR entre si.
O ELISA apresentou maior eficácia no diagnóstico da dirofilariose.
A distensão espessa e Knott modificada demonstraram ser as técnicas parasitológicas de maior
eficácia numérica, comparativamente as demais técnicas parasitológicas.
O local de permanecia do cão na residência foi um fator de risco para a infecção, ao contrário do
gênero e do uso de profilaxia.
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10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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80
11. Anexos
Anexo 1 – Termo de Aprovação pelo CEUA-UFF
81
12. Apêndices
Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PROPRIETÁRIOS
Projeto:. Diagnóstico de Dirofilariose em cães da cidade de Cabo Frio, RJ
Responsável: Claudia Maria Antunes Uchôa Souto Maior
Endereço: Disciplina de Parasitologia/UFF Rua Prof Hernani de Melo, 101 – 2 andar. São Domingos Niterói,
RJ. Cep 24210-130. tel (21) 26292426
Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense
Nome do Proprietário: ____________________________________________. Idade: _______
RG: nº_________________________ Órgão Emissor: _______________.
Endereço: ____________________________________________________________________.
Nome do Animal: _________________________________________________. Idade: _______
Raça:________________________ Sexo: _______________.
O(A) Sr. (ª) está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa Diagnóstico de Dirofilariose em cães da
cidade de Cabo Frio, RJ de responsabilidade da pesquisadora Claudia Maria Antunes Uchôa Souto Maior.
Declaro ter pleno conhecimento que:
O projeto tem como objetivo: identificar a dirofilariose em cães de Cabo Frio, RJ e comparar técnicas
de diagnóstico.
Será solicitada a coleta de amostras de sangue do animal participante por punção de veia braquio-
cefálica. Será realizado o registro da situação por fotografia ou filmagem que serão utilizadas apenas
no contexto do projeto, sem divulgar nomes.
Autorizo a participação do animal acima qualificado no presente projeto de pesquisa;
Este estudo não fará nenhum mal a saúde do animal;
Esta pesquisa tem por objetivos identificar a frequência de dirofilariose em cães de Cabo Frio, RJ e
comparar técnicas de diagnóstico para dirofilariose;
Os benefícios esperados serão o resultado de exames para dirofilariose e conhecimento da frequência da
parasitose;
Autorizo a realização de exames parasitológicos, imunológicos e moleculares, necessários para a
coleta de informações/dados para realização do estudo, as quais só poderão ser utilizadas no contexto do
projeto ou em artigos relacionados ao mesmo.
Não gastarei nada para participar dessa pesquisa;
O material coletado será descartado após o processamento;
Terei a liberdade de retirar meu consentimento e deixar de participar do estudo a qualquer momento;
Nenhum nome será divulgado durante as etapas desse estudo ou ao seu término;
Poderei obter informações gerais sobre o estudo quando desejar. Os pesquisadores poderão ser
contatados por meio do telefone (21)26292426.
Eu, acima caracterizado, responsável legal pelo canino __________________ declaro ter sido informado e
concordo com a sua participação, como voluntário, no projeto de pesquisa acima descrito.
, de 20___.
Local dia mês
Assinatura do responsavel Assinatura do resp. pelo projeto
Assinatura 1ª testemunha Assinatura 2ª testemunha
82
Apêndice 2 – Ficha de avaliação dos cães
Universidade Federal Fluminense n registro projeto: ______
Instituto Biomédico
Ficha de dados dos Cães
Projeto: Diagnóstico de Dirofilariose em cães da cidade de Cabo Frio, RJ
Pesquisadores responsáveis: Taíssa Angelica Lemos Trancoso, Alynne da Silva Barbosa, Otilio
Machado Pereira Bastos, Claudia Maria Antunes Uchoa Souto Maior
Nome: Propietário: _________________________________________________________
Endereço: _______________________________________________________________
Tel: _____________________
Nome do Animal: _____________________ Idade: ________ Sexo: ____ Raça: _____________
Pêso: _______________
Estado Nutricional: ( ) obeso ( ) normal ( )magro ( )caquético
Vacinação : ( ) sim ( ) não
Vermifigação ( ) não ( )sim data da última: ________________ medicamento: _________
Profilaxia dirofilariose: ( ) sim ( ) não medicamento: _______________________
Tipo de residência: ( ) casa ( ) apartamento ( )outro _____________
Hábito do cão: ( ) dentro de casa ( ) fora de casa
Numero cães na casa _________________________________
Função do cão: ( ) guarda ( )companhia
Clínica
Motivo da Consulta:
Suspeita clínica
Manifestações clínicas
( ) sem sintomas específicos
( ) vômito ( ) dificuldade respiratória ( ) ascite ( ) alterações cardíacas
( ) outro
Especificar: