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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO
DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA
PETROLINA-PE
2014
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ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO
DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.
Linha de pesquisa: Fisiologia e Farmacologia.
ORIENTADORA: DRA. CHEILA NATALY
GALINDO BEDOR
CO-ORIENTADOR: DR. RICARDO SANTANA
DE LIMA
PETROLINA-PE
2014
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ANA CLÁUDIA TEIXEIRA MOREIRA
ESTUDO DO POTENCIAL ANTICARCINOGÊNICO DO EXTRATO DO BAGAÇO
DA UVA MOSCATO CANELLI EM RATOS EXPOSTOS À DIETILNITROSAMINA
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Vale do São Francisco, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Recursos Naturais do Semiárido.
APROVADA EM: 10 de Janeiro de 2014.
_________________________________________________
Prof. Dra. Cheila Nataly Galindo Bedor - UNIVASF
(Orientadora)
_________________________________________________
Profa. Dra. Gabriela Lemos de Azevedo Maia - UNIVASF
(Examinadora Externa)
_________________________________________________
Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro - UNIVASF
(Examinador Interno)
3
A minha mãe (Herlane), pelo
exemplo e apoio incondicional. E
ao meu noivo (Glauber), por estar
ao meu lado em todos os
momentos, acreditando em mim e
me conduzindo com muito amor ao
melhor caminho.
Dedico
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e a Nossa Senhora, que sempre me guarda
em seu Manto Materno.
À Universidade Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), através da
Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido, pela
oportunidade de realização do curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão de Bolsa de Estudos.
À Professora Cheila Nataly Galindo Bedor pela orientação, paciência e colaboração
no trabalho desenvolvido.
Ao Professor Ricardo Santana de Lima, pela disponibilidade em orientar e pelos
ensinamentos indispensáveis à realização e ao aperfeiçoamento deste trabalho.
À Paula e aos amigos do curso de Pós-graduação, em especial Raquel, Stefânia e
Roniere, pela amizade, incentivo, colaboração e solidariedade no decorrer do curso.
À Vanúzia e à professora Maria Helena, do Laboratório de Histologia, pelo papel-
chave na confecção das lâminas deste estudo.
Ao professor Roberto Jeferson e sua aluna Luana Dias, pelo preparo e fornecimento
do extrato do bagaço da uva Moscato canelli, objeto de estudo desta pesquisa.
A minha família, pelo amor, que foi e sempre será fundamental na minha caminhada.
E por estarem sempre ao meu lado, dando-me forças para a realização dos meus
sonhos.
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Localização da região vitivinícola do Vale do Submédio São Francisco, nos
Estados de Pernambuco e Bahia (Elaboração: Jorge Tonietto; Cartografia digital:
Naíssa Batista da Luz).................................................................................................15
Figura 2 - Cacho de ‘Moscato Canelli’ (Foto: Umberto Almeida Camargo).................22
Figura 3 - Material cortado e colocado no cassete para o processamento.................41
Figura 4 - Material em cassetes plásticos e mergulhados em formol a 10%...............41
Figura 5 - Bateria de álcool para desidratação............................................................42
Figura 6 - Bateria de frascos com xilol.........................................................................42
Figura 7 - Peças em fracos de vidro contendo parafina em estufa a 60º C.................43
Figura 8 - Material já incluído na parafina....................................................................43
Figura 9 - Corte do bloco em tiras de 6 micrômetros de espessura............................44
Figura 10 – a. Cortes do material prontos para serem distendidos em água aquecida.
b. Cortes sobre a água aquecida em "Banho-maria"...................................................44
Figura 11 – a. Corte sendo pescado sobre a lâmina de vidro. b. Lâminas de vidro com
os cortes já distendidos sobre a platina.......................................................................45
Figura 12 - Frascos de vidro com os principais corantes utilizados na confecção das
lâminas histológicas.....................................................................................................45
Figura 13 - Lâmina e lamínula limpas..........................................................................46
6
Figura 14 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos expostos a duas doses de
200mg/kg de DEN via intraperitoneal..........................................................................49
Figura 15 - Lesões macroscópicas em animal exposto ao DEN.................................50
Figura 16 – Análise histopatológica do fígado de ratos injetados com 100 ou
200mg/kg de DEN por via intraperitoneal....................................................................51
Figura 17 – Análise histopatológica dos órgãos de ratos injetados com DEN 200mg/kg
via intraperitoneal e tratados com EBU por 4 semanas...............................................55
Figura 18 – Análise histopatológica dos órgãos tratados com EBU por 4 semanas e
injetados com DEN 200mg/kg por via intraperitoneal..................................................57
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Quantidade de trabalhos experimentais sobre a atuação do extrato de uva
ou de seus subprodutos na carcinogenicidade, descritos na literatura até meados de
outubro do ano de 2012..............................................................................................59
8
RESUMO
Os alimentos funcionais, como a uva e o vinho, destacam-se pela presença de ingredientes que, além das funções nutricionais básicas, produzem efeitos metabólicos e fisiológicos benéficos a saúde. Os subprodutos do suco de uva e da produção de vinho também são fontes de várias combinações de fenólicos que despertam interesse, dentre esses, o bagaço da uva vem sendo estudado devido a sua função antioxidante. Antioxidantes naturais inibem a formação de radicais livres, relacionados ao envelhecimento precoce e desenvolvimento de doenças como o câncer. Este estudo avaliou o potencial anticarcinogênico do extrato do bagaço da uva (EBU) em animais expostos a carcinógenos. O agente carcinogênico utilizado neste estudo foi o dietilnitrosamina (DEN). Como a principio também havia o objetivo de avaliar esse efeito em animais exposto ao carcinogéno associado a agrotóxico, também foi utilizado nos experimentos o organofosforado metamidofós. O estudo constituiu de três etapas. Na primeira delas, ratos machos Wistar foram expostos a diferentes doses do DEN, via intraperitoneal (i.p), para padronização do melhor método de promoção das lesões teciduais a ser aplicado nas etapas seguintes, após os resultados, foi padronizado à dose única de 200mg/kg. No segundo momento, três grupos de animais receberam diferentes doses do metamidofós (1,0, 4,5 e 6,0 mg/Kg, i.p). Ao final de 4 e 8 semanas os animais foram eutanasiados e avaliados quanto ao aparecimento de lesão carcinogênicas. Os resultados com metamidofós nas doses 4,5 e 6,0 mg/kg demonstraram toxicidade aguda dessa substância. Nenhum efeito carcinogênico foi encontrado nas análises histopatológicas de nenhum dos animais, apesar desse agrotóxico ser descrito na literatura como genotóxico e mutagênico em experimentos com exposição oral. Assim o metamidofós não foi utilizado nas etapas seguintes desse estudo. Na última etapa, ratos foram expostos à dose única de 200 mg/kg de DEN (i.p) e após 48 horas passaram a ser tratados com o EBU (200 mg/Kg) via gavagem durante 4 semanas, outro grupo de animais receberam apenas o extrato pelo mesmo período. Simultaneamente, um grupo de animais recebeu EBU por 4 semanas, anteriormente à exposição a 200 mg/kg de DEN (i.p). A partir dos resultados preliminares obtidos, verificou-se que o extrato do bagaço da uva pode ser capaz de conferir efeito protetor à carcinogênese quando suplementado após a inoculação do carcinógeno. Entretanto, não demonstrou ação protetora quando consumido antes da indução das lesões teciduais pelo DEN na dose testada. Os dados referentes ao tratamento com o extrato após indução da lesão corroboram com inúmeros estudos na literatura, reforçando o potencial quimioterápico da uva e seus subprodutos. Palavras chave: extrato do bagaço da uva, lesão pré-neoplásica, metamidofós, dietilnitrosamina.
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ABSTRACT
Functional foods such as grapes and wine, distinguished by the presence of ingredients that , beyond basic nutritional functions , produce beneficial metabolic and physiological health effects . The byproducts of grape juice and wine production are also sources of various combinations of phenolic that arouse interest, among these, the grape pomace has been studied because of its antioxidant function. Natural Antioxidants inhibit free radical formation, related to premature aging and the development of diseases like cancer. This study evaluated the potential anticarcinogenic of grape pomace extract (EBU) in animals exposed to carcinogens. The carcinogen used in this study was the diethylnitrosamine (DEN). As the principle also had to evaluate this effect in exposed to carcinogen associated with pesticides, animals used in the experiments was also the organophosphate methamidophos. The study consisted of three steps. In the first, male Wistar rats were exposed to different doses of DEN, intraperitoneally (ip) to standardize best method of promoting tissue damage to be applied in the following steps, after the results were standardized to a single dose of 200mg / kg. In the second instance, three groups of animals received varying doses of methamidophos (1.0, 4.5 and 6.0 mg / kg, ip). At the end of 4 and 8 weeks, the animals were euthanized and evaluated to detect the carcinogenic lesion. The results of Methamidophos in doses 4.5 and 6.0 mg / kg showed acute toxicity of this substance. No carcinogenic effects were found in histopathological analysis of any of the animals, although this pesticide be described in the literature as genotoxic and mutagenic in experimental oral exposure. So methamidophos was not used in the following steps of this study. In the last step, rats were exposed to a single dose of 200 mg/kg DEN (ip) and after 48 hours were treated with the EBU (200 mg/Kg) by gavage for 4 weeks , another group of animals received only the extract by period. Simultaneously, one group of animals received EBU for 4 weeks prior to exposure to 200 mg/kg DEN (ip). Based on preliminary obtained, it was found that the extract of grape pomace maybe of conferring a protective effect on carcinogenesis when supplemented after inoculation of the carcinogen. However, showed no protective effect when consumed before induction of tissue lesions by DEN at the dose tested. The data relating to treatment with the extract after lesion induction corroborate numerous studies in the literature, reinforcing the chemotherapeutic potential of the grape and its byproducts. Keywords: grape pomace extract, pre-neoplastic lesion, methamidophos, diethylnitrosamine.
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SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.....................................................................................................5
LISTA DE TABELAS.....................................................................................................7
RESUMO.......................................................................................................................8
ABSTRACT...................................................................................................................9
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................12
2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................................13
2.1 Origem da videira e situação do cultivo de uva no Brasil......................................13
2.2 Composição química da uva..................................................................................16
2.2.1 Estresse oxidativo e substâncias antioxidantes..................................................17
2.3 Bagaço da uva.......................................................................................................20
2.4 Uva Moscato canelli...............................................................................................21
2.5 Câncer...................................................................................................................22
2.6 Substâncias carcinogênicas ou potencialmente carcinogênicas...........................26
2.6.1 Agrotóxicos.........................................................................................................26
2.6.1.1 Metamidofós....................................................................................................29
2.6.2 Dietilnitrosamina.................................................................................................32
2.8 Modelo de hepatocarcinogênese em ratos............................................................32
3. JUSTIFICATIVA......................................................................................................34
4. OBJETIVOS............................................................................................................36
4.1 Objetivo geral.........................................................................................................36
4.2 Objetivos específicos.............................................................................................36
5. METODOLOGIA......................................................................................................37
5.1 Animais de experimentação...................................................................................37
5.2 Produtos químicos.................................................................................................37
5.3 Protocolo experimental..........................................................................................38
5.3.1 Primeira etapa.....................................................................................................38
5.3.2 Segunda etapa....................................................................................................40
5.3.3 Terceira etapa.....................................................................................................40
5.4 Procedimento anestésico para ratos.....................................................................40
5.5 Análise histopatológica dos animais......................................................................41
5.6 Processo de confecção e coloração das lâminas histológicas..............................41
11
5.6.1 Fixação...............................................................................................................41
5.6.2 Desidratação.......................................................................................................42
5.6.3 Diafanização ou clareamento.............................................................................42
5.6.4 Impregnação.......................................................................................................42
5.6.5 Inclusão...............................................................................................................43
5.6.6 Microtomia..........................................................................................................43
5.6.7 Passagem em “Banho-maria”.............................................................................44
5.6.8 Pescagem...........................................................................................................44
5.6.9 Coloração............................................................................................................45
5.6.10 Montagem.........................................................................................................46
5.6.11 Secagem...........................................................................................................46
5.7 Análise das lâminas histopatológicas....................................................................46
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................48
7. CONCLUSÕES........................................................................................................60
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................61
12
1. INTRODUÇÃO
Estudos demonstram que existe uma relação muito próxima entre uma
alimentação equilibrada, rica em frutas e verduras, com uma menor incidência de
doenças crônicas e degenerativas. Segundo Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA, 2011), entre os principais responsáveis pelo efeito benéfico e “protetor” dos
alimentos estão os compostos antioxidantes, dentre os quais se destacam o
caroteno, a vitamina C, a vitamina E, e a maioria dos compostos fenólicos. Por este
motivo, uma nova categoria de alimentos foi estabelecida por esse órgão desde 1991,
os alimentos funcionais. A Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde
estabelece, por meio da Portaria nº 398 (30/04/99), as principais características dos
alimentos funcionais, destacando a presença de ingredientes que, além das funções
nutricionais básicas, produzam efeitos metabólicos e fisiológicos benéficos a saúde
(ANVISA, 2011).
Diversos estudos relatam que o estresse oxidativo está associado a inúmeras
doenças, entre elas: diabetes, doença de Parkinson e de Alzheimer, esclerose
múltipla, distrofia muscular, catarata e retinopatias, aterosclerose, infarto do
miocárdio, cirrose hepática e vários tipos de câncer (FRANZONI, 2005; HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2007).
A produção contínua de radicais livres durante os processos metabólicos leva
ao desenvolvimento de muitos mecanismos de defesa antioxidante para limitar os
níveis intracelulares e impedir a indução de danos (SIES, 1993). Os antioxidantes
presentes nas plantas podem atuar como agentes redutores, sequestradores de
radicais livres, inibidores de enzimas e como quelantes de metais (WANG; LIN, 2000)
e a maioria de seus efeitos biológicos estão correlacionados à atividade antioxidante
(VELIOGLU et al., 1998).
Os antioxidantes naturalmente presentes nos alimentos têm sido cada vez
mais estudados quanto a sua eficácia e emprego (SHAHIDI, 1997). A ingestão
desses compostos que tenham atividade antioxidante, é importante para combater os
radicais livres. Vários métodos químicos, biológicos e eletroquímicos, têm sido
propostos para avaliar a atividade antioxidante de compostos como os polifenóis
(BRENNA; PAGLIARINI, 2001).
13
Assim, como os alimentos in natura, inúmeros estudos sinalizam que os
subprodutos obtidos a partir de resíduos de indústrias alimentícias apresentam uma
quantidade significativa de compostos com características antioxidantes (PELIZER et
al. 2007). Por sua vez, os resíduos têm sido motivo de maiores preocupações para a
indústria, pois, quando não são conduzidos para a alimentação animal ou utilizados
como adubos, são descartados, poluindo o meio ambiente (CHEREMISINOFF, 1995;
EVANGELISTA, 2001).
Dentre os alimentos funcionais, é possível destacar a uva e o vinho, produtos
que se caracterizam por apresentar nutrientes indispensáveis para o bom
funcionamento do organismo humano, tais como vitaminas (B1, B2 e B12),
aminoácidos (lisina, fenilalanina, triptofano e ácido glutâmico) e espécies
antioxidantes. Alguns compostos fenólicos encontrados nesses alimentos são
antioxidantes e contribuem para a prevenção de doenças cardiovasculares. Outros,
tais como o t-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbeno), vem sendo estudados nos
últimos anos, em razão da sua ação preventiva em relação a doenças como câncer,
arteriosclerose, reumatismo e doenças degenerativas, como mal de Parkinson
(SAIKO et al., 2008).
Os subprodutos do suco de uva e da produção de vinho também são fontes de
várias combinações de fenólicos que despertam muito interesse devido a suas
propriedades antioxidantes e seus efeitos benéficos para a saúde humana
(SHRIKHANDE, 2000; TORRES; BOBET, 2001).
O Submédio do Vale do São Francisco possui sete empresas vinícolas
instaladas em municípios dos estados de Pernambuco e Bahia (ANUÁRIO
BRASILEIRO DA UVA E DE VINHO, 2007). A elaboração de vinhos na região é uma
atividade recente, mas em total expansão, devido ao panorama atual da vitinicultura
brasileira e às potencialidades naturais existentes no local (GUERRA et al, 2006).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Origem da videira e situação do cultivo de uva no Brasil
A Groelândia é o provável centro de origem paleontológico das videiras, onde
são encontrados os fósseis mais antigos de suas ancestrais (GIOVANNINI, 2008). O
14
gênero Vitis parece ter surgido na era Terciária, no período Paleocênico, podendo
assim admitir que a passagem da vinha selvagem para vinha cultivada tenha ocorrido
cerca de 6000 a.C. (AMARAL, 2000).
Tal presença milenar da videira possibilitou uma enorme variabilidade de
espécies, adaptadas às mais diversas situações de clima e solo, assim como
resistentes a pragas e doenças (GIOVANNINI, 2008). Dessa forma, a videira
propagou-se por inúmeras regiões da Terra. No período Quaternário, acredita-se que
as plantas do gênero Vitis encontravam-se em grande abundância, com dois
subgêneros diferenciados: Euvitis e Muscadinia. Durante o período de glaciação do
globo terrestre, apenas em alguns locais foi possível a sobrevivência de videiras,
constituindo os três principais centros de refúgio: um americano, um europeu e outro
asiático-ocidental (SOUSA, 1996).
A família Vitaceae é classificada em 10 gêneros, sendo Vitis o único que
apresenta importância econômica, social e histórica, uma vez que a ele pertencem
todas as videiras terrestres, sejam elas selvagens ou cultivadas (ALVARENGA et al.,
1998).
O gênero Vitis é formado por cerca de 60 espécies, que são encontradas
principalmente em zonas temperadas do Hemisfério Norte e são distribuídas entre a
América e a Ásia. Vale ressaltar que a espécie V. vifinera L., originária na Eurásia, foi
distribuída no mundo pelo homem (ALVARENGA et al., 1998).
A introdução do cultivo da videira no Brasil ocorreu em 1535, a partir daí
muitas regiões brasileiras em diferentes Estados experimentaram e desenvolveram o
cultivo da uva e a produção de vinhos. Entretanto, a vitivinicultura somente ganhou
impulso e se tornou atividade de importância sócio-econômica no final do século XIX
(GUERRA et al, 2009).
O Brasil é o 16º produtor mundial de vinho. As diferentes regiões do país, com
distintas características de clima, solo, variedades de uvas, sistemas de produção e
de vinificação e envelhecimento possibilitam a produção de vinhos com ampla
diversidade de características de sabor e aroma, o que constitui uma das qualidades
da atual vitivinicultura brasileira (TONIETTO, 2009).
No Nordeste do Brasil, junto aos Estados de Pernambuco e da Bahia,
encontra-se a região vitivinícola do Vale do Submédio São Francisco (Figura 1). Está
situada em zona de clima tropical semi-árido, entre 09º e 10º de latitude Sul. O clima
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vitícola da região apresenta variabilidade intra-anual, o que possibilita a produção de
uvas e de vinhos ao longo de todos os meses do ano. Representa uma das regiões
emergentes, com início entre os anos de 1980, e atualmente experimenta um período
de expansão da produção de vinhos finos, com uma tipicidade notável em relação às
tradicionais regiões produtoras da viticultura mundial (TONIETTO, 2009).
Figura 1 - Localização da região vitivinícola do Vale do Submédio São Francisco, nos
Estados de Pernambuco e Bahia.
Fonte: Guerra et al, 2009
Essa região destaca-se no cenário nacional pelo cultivo de uvas frescas; o que
a diferencia das demais regiões é o direcionamento da produção para o mercado
externo, já que mais de 90% da uva de mesa produzida é exportada (IBRAF, 2009).
Somando-se a isso, o Submédio do Vale do São Francisco vem despontando na
produção de uvas para vinho, e ainda, de uvas para suco, produzindo produtos de
alta qualidade com destaque nacional.
16
2.2 Composição química da uva
Do ponto de vista nutricional, a uva assemelha-se com o leite materno e, por
isso, é chamada de sangue vegetal ou seiva viva. Seu açúcar é composto de glicose
e frutose diretamente assimilável, não exigindo esforço dos órgãos digestivos. A uva
contém ácidos orgânicos, substâncias nitrogenadas, compostos fenólicos, pectina,
vitaminas e sais minerais, entre eles potássio e ferro em abundância. É alimento-
fonte de cálcio, manganês, cobre, fósforo, zinco, sódio e lítio. Também possui
vitaminas A, B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B3 (niacina), B5 (ácido pantotênico), B6
(piridoxina), B9 (ácido fólico) e C (ácido ascórbico), além de aminoácidos como o
ácido glutâmico, alanina, arginina e L-Glutamina (BRANDT, 1973).
Os compostos fenólicos presentes na uva constituem umas das principais
classes de metabólitos secundários, possuindo funções e estruturas diversas. Sendo
seus principais representantes os ácidos cinâmicos e seus derivados, dos quais se
destacam o ácido clogênico, flavanas, as antocianidinas e antocianinas, os flavonóis
e suas formas glicosídicas, os polifenóis condensados e outros menos comuns, como
flavonas, flavononas e isoflavonas (FERNÁNDEZ-LÓPEZ et al., 1999; LIMA, 2009).
Esta classe de compostos tem participação no ”flavor”, na coloração, na vida
útil e na ação do produto como alimento funcional, notadamente como antioxidante.
Por exemplo, a adstringência se relaciona às propriedades que algumas substâncias
fenólicas (principalmente os taninos) apresentam ao se complexarem com as
proteínas do epitélio mucoso, precipitando-se e causando a sensação de travo
(CHITARRA; CHITARRA, 2005).
As uvas contêm derivados do ácido hidroxinâmico, como os ácidos cafeico e
cumárico; flavonóides (como as antocianinas); flavonóis e as protocianidinas (também
conhecidas como taninos). As uvas vermelhas são especialmente ricas em
resveratrol (3,5,4-trihidroxiestilbeno), um composto fenólico sintetizado na casca, com
importantes funções antioxidantes, antiinflamatórias e estrogênicas e que atua na
prevenção de doenças cardiovasculares e cânceres (LIMA; CHOUDHURY, 2007).
O resveratrol tem sido destacado como modulador no metabolismo dos lipídios
e inibidor na oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e da agregação de
plaquetas. Além disso, como fitoestrógenos, o resveratrol pode fornecer a proteção
cardiovascular. Tal substância possui ainda propriedades antiinflamatórias e
17
anticancerígenas. Contudo, a biodisponibilidade e vias metabólicas ainda devem ser
profundamente estudadas e conhecidas antes de tirar qualquer conclusão sobre os
benefícios do resveratrol na dieta para a saúde (FRÉMONT, 2000; KRISHNA et al.,
2004).
A casca e a semente são as principais áreas de acumulação de compostos
fenólicos da baga. As antocianinas e as flavonas concentram-se nos vacúolos das
células da casca e, no caso das uvas tintas, podem também concentrar-se nos
vacúolos das células da polpa. Os taninos são mais abundantes nas sementes do
que na casca. Na mudança de cor da baga, os taninos estão presentes em cerca de
50% do seu peso total e pouco antes da maturação atingem seu máximo, uma vez
que vão sendo hidrolisados durante o amadurecimento das uvas. Já as antocianinas,
apresentam-se com maior intensidade durante a fase final da maturação
(GIOVANNINI, 2008).
A evolução dos compostos fenólicos é fundamental para a qualidade da uva.
Quanto mais intensa a coloração da uva, mais interessante se torna do ponto de vista
funcional, já que as uvas de coloração escura apresentaram maior conteúdo de
compostos fenólicos e atividade antioxidante (ABE et al., 2007).
2.2.1 Estresse oxidativo e substâncias antioxidantes
Os antioxidantes comportam-se no organismo retardando ou prevenindo a
oxidação de substratos, uma vez que se envolvem nos processos oxidativos
impedindo a formação de radicais livres (HALLIWEL et al., 1995). Estes substratos
podem ser lipídios, proteínas, DNA (ácido desoxirribonucléico) e carboidratos, que, ao
oxidarem, sofrem rupturas nas membranas, liberando conteúdos celulares e levando
à degeneração não programada (HU et al., 2004).
Geralmente, os radicais livres podem ser gerados no citoplasma, nas
mitocôndrias ou na membrana e o seu alvo celular está correlacionado com o seu
sítio de formação. São classificados como moléculas orgânicas, inorgânicas ou
átomos que contêm um ou mais elétrons não pareados. Esse tipo de estrutura faz
com que os radicais livres sejam moléculas de alta instabilidade, tendo meia-vida
curta e sendo muito reativos (YOUNGSON, 1995). Entre as principais formas reativas
de oxigênio, o O2 (radical superóxido) mostra baixa atividade de oxidação, enquanto
18
o OH (radical hidroxila) é o mais reativo em relação às lesões celulares, apesar da
pequena atividade de difusão (ANDERSON, 1996).
O estresse oxidativo representa a proteção celular contra os efeitos deletérios
dos oxidantes gerados no metabolismo aeróbico e pode ser organizado em vários
níveis. Estas estratégias de defesa incluem três níveis de proteção: prevenção,
interceptação e reparação. Entretanto, a atividade antioxidante inclui a manutenção
adequada desses compostos, sendo estes enzimáticos ou não enzimáticos. O
controle da atividade das enzimas pró-oxidantes, como nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase) e óxido nítrico sintase (NO sintase) é
extremamente importante. Porém, apesar de auxiliar na proteção de tecidos dos
resultados de processo oxidativo, as enzimas por si não tem função quando ingerida
como alimento (SIES, 1993).
Diversos fatores influenciam a atividade antioxidante, incluindo as
propriedades coloidais dos substratos, as condições e etapas de oxidação, a
formação e estabilidade dos radicais, assim com possível localização dos
antioxidantes e estabilidade em distintas fases do processamento nos alimentos
(ROCKENBACH et al., 2008).
O incentivo à população para o consumo de alimentos com alto valor
nutricional a partir da divulgação das propriedades químicas de frutos é
compreendido pela possibilidade de prevenção de algumas doenças. Antioxidantes
naturais inibem a formação de radicais livres, que também estão relacionados ao
envelhecimento precoce (ASOLINI et al., 2006).
Atualmente, tem se dado ênfase à identificação e purificação de novos
compostos com atividade antioxidante oriundos de fontes naturais, como frutas,
vegetais e cereais, de forma a prevenir a deterioração oxidativa e restringir a
utilização dos antioxidantes sintéticos. Estas fontes naturais contêm substâncias
antioxidantes distintas, cujas atividades têm sido comprovadas nos últimos anos. A
presença de compostos fenólicos, tais como flavonóides, ácidos fenólicos e
antocianinas, além das vitaminas C e E e de carotenóides contribuem para os efeitos
benéficos destes alimentos (SHAHIDI et al., 2007).
A substituição de antioxidantes sintéticos por naturais pode apresentar
vantagens devido a implicações na área de saúde e na funcionalidade. Nota-se, por
exemplo, que a maior solubilidade dos antioxidantes naturais tanto em água como em
19
óleo é útil na preparação de emulsões e outras formulações, como os hidrogéis. Na
utilização de antioxidantes naturais, há vantagem também no nível preservacionista,
na medida em que as indústrias alimentícias produzem resíduos que poderiam ter um
destino muito mais benéfico, favorecendo o homem e o meio ambiente (OLIVEIRA et
al., 2009).
Segundo HU et al (2004), no estudo in vitro e in vivo, a soja fermentada tanto
possui atividade antioxidante quanto tem um efeito sobre a atividade de algumas
enzimas antioxidantes no fígado, como as enzimas catalase, superóxido dismutase
total e glutationa peroxidase.
Outros estudos sugerem que os subprodutos de avelã podem potencialmente
ser considerados como uma excelente fonte de antioxidantes naturais, além de serem
facilmente disponíveis (SHAHIDI et al., 2007). Para o pedúnculo do caju, foram
identificados os ácidos gálico, ferrúlico, caféico, protocatecuico, quínico, cinâmico,
gentíssico, p-cumárico e salicílico, os quais lhe conferem um bom potencial
antioxidante, sugerindo um melhor aproveitamento dos resíduos resultantes do
processamento do pedúnculo de caju (BROINIZI et al., 2007).
Os derivados e subprodutos de uva estão entre os produtos com maior apelo
funcional. Entre os principais compostos que lhe atribuem esta propriedade estão os
fenólicos, tanto do grupo dos flavonóides (como antocianinas, flavonóis e
proantocianidinas) quanto dos não flavonóides, como o resveratrol (CHITARRA;
CHITARRA, 2005).
Sua atividade antioxidante está relacionada com o conteúdo de polifenóis
totais e antocianinas nas cascas de uva (SOARES et al., 2008). As antocianinas são
consideradas como excelentes antioxidantes por doarem hidrogênio aos radicais
livres altamente reativos, prevenindo a formação de novos radicais (CHITARRA;
CHITARRA, 2005).
O vinho é composto por aproximadamente 200 diferentes polifenóis. Os tintos
têm cerca de 10 vezes mais polifenóis (1000-4000 mg L-1) que os vinhos brancos
(200-300 mg L-1). Os polifenóis existentes nos vinhos brancos são em menor número,
porém as propriedades biológicas dos polifenóis dependem também da sua
biodisponibilidade, e está determinada através da concentração no plasma e na urina
após a ingestão destes compostos (SCALBERT; WILLIAMSON, 2000).
20
2.3 Bagaço da uva
Segundo Oliveira et al (2009), diversas pesquisas estão sendo desenvolvidas
com produtos alimentícios obtidos de resíduos da agroindústria que representam
antioxidantes naturais. Entre estes, a farinha e a barra de cereal produzidas a partir
de cascas de cenoura, fibras dietéticas de biscoitos enriquecidos com farinha de
casca de manga, além de extratos adicionados de casca de batata como antioxidante
natural em óleos de sementes de soja. Ressalta-se, ainda, que no bagaço da uva
encontra-se 17 tipos de compostos fenólicos diferentes, entre eles, ácido gálico,
catequina, epicatequina e quercetina, representando um ótimo produto para a
agroindústria.
O bagaço da uva é o mais importante subproduto da vinificação, não só pela
sua riqueza alcoólica e tartárica, mas também pelo interesse econômico de alguns
dos seus componentes físicos (SILVA, 2010).
O bagaço, como é denominado, é o produto resultante da prensagem das
massas vínicas, constituídas pelas partes sólidas das uvas e pelo mosto ou pelo
conjunto mosto/vinho que as embebe. O Regulamento (CE) 1493/99 define-o como
sendo o resíduo da prensagem das uvas frescas, fermentado ou não, sendo
composto pelos engaços e folhelhos (pedúnculos das uvas) (JORNAL OFICIAL DAS
COMUNIDADES EUROPÉIAS, 1999).
Para a indústria vitivinícola o bagaço da uva é um abundante subproduto, com
cerca de 200.000 toneladas/ano. É constituído principalmente por água,
aproximadamente 60-70% (RICE, 1976; FAMUYIWA; OUGH, 1982; SASTRE et al.,
1994), vinho e borras, sendo estes dependentes a prensagem; álcoois,
principalmente o etanol, e também o metanol, glicerol e álcoois superiores; aldeídos,
ésteres, ácidos voláteis, polifenóis e taninos, proteínas, celulose, pectinas, sais
minerais e resíduos de açúcar (ORRIOLS, 1994).
Na produção de suco de uva e vinho, grandes quantidades de bagaço são
geradas, sendo este resíduo rico em polifenóis, presentes tanto na casca quanto na
semente (SILVA, 2010).
21
2.4 Uva Moscato canelli
Moscato canelli (figura 2) é variedade de uva procedente da Itália, introduzida
no Vale do Submédio São Francisco no início da década de 1980, quando se iniciou
no local o cultivo de uvas para vinho. Apresentou ótima adaptação às condições do
semi-árido nordestino, sendo a principal uva branca cultivada atualmente nessa
região. Além de empregada na elaboração de vinhos de mesa varietais, também tem
sido usada, com sucesso, na elaboração de vinhos espumantes do tipo moscatel
(GUERRA, 2009).
Dentre as variedades de uva, as moscatéis são as que mais apresentam
compostos terpênicos, dentre eles monoterpenos, alcoóis terpênicos e terpenos
glicosilados (CAINELLI, 2009).
Os terpenos apresentam uma importante função ecológica atuando como um
mensageiro interno e externo, funcionando como agentes alelopáticos, repelente
contra insetos ou atrativos para os insetos polinizarem as plantas (HARREWIJAN et
al, 2001). Podendo, dessa forma, concluir que a sua biossíntese é induzida pela
alimentação dos insetos, provavelmente através da secreção oral do inseto (PARÉ;
TUMLINSON, 1997).
As plantas em locais extremos frequentemente têm que tolerar temperaturas
elevadas. A correlação direta entre a concentração do isopreno e a tolerância térmica
conduziu a uma especulação que estes compostos aumentam a termo-tolerância,
interagindo com as membranas das plantas (SHARKEY; SINGSAAS, 1995). Tal
interação da membrana é suposta também para funções fisiológicas e farmacológicas
no homem.
Não está bem elucidada a ação dos terpenóides em tarefas antioxidativas nas
plantas (LORETO et al, 2001). Os terpenóides representam a base de inúmeras
drogas herbais usadas no tratamento da dor, bronquite e doenças gastrointestinais
(KOHLER et al, 2000). Os terpenos apresentam, ainda, características lipofílicas e
possuem uma importante atividade antioxidante em sistemas lipofílicos, podendo
atuar, inclusive, na inibição da oxidação da LDL, evitando o desenvolvimento da
ateosclerose (GRABMANN et al., 2001, 2005).
Em resumo, sabe-se que terpenos com aroma agradável são extraídos de
essências de plantas; outros são a base de medicamentos convencionais ou as
22
plantas que os contém são fitoterápicos; alguns, ainda, são precursores de vitaminas;
e outros inseticidas (SIMÕES, 1999).
Figura 2 - Cacho de Moscato Canelli.
Fonte: Guerra et al, 2009
2.5 Câncer
O câncer é conhecido desde as primeiras civilizações humanas. Todavia, pelo
fato dessa doença se manifestar principalmente durante as últimas décadas de vida,
até haver um aumento significativo da expectativa de vida, fato que ocorreu apenas
na segunda metade do século XIX, o número de pessoas que alcançavam essa idade
e, consequentemente, desenvolviam o câncer, era muito reduzido. Contudo,
atualmente, com a incidência das doenças infecto-parasitárias controladas pela
melhoria do sistema de tratamento de água e esgoto, a proporção da população com
potencial para desenvolver essa doença aumentou drasticamente (FRANKS;
KNOWLES, 2005).
Apesar das doenças cardiovasculares ainda serem a principal causa de
mortes, o câncer é considerado um importante problema de saúde pública em
diversos países (JEMAL et al., 2006, THUN et al., 2010). Nesse sentido, a Agência
23
Internacional de Pesquisa do Câncer (International Agency for Research on Cancer
(IARC); órgão da Organização Mundial da Saúde (OMS)) estimou para o ano 2000
mais de 10.000.000 novos casos e cerca de 6.000.000 mortes por câncer no mundo
(IARC, 2003). Já em 2005, o câncer foi responsável pela morte de 7.600.000
pessoas, cerca de 13% do total de mortes no mundo, sendo os tipos com maior
mortalidade o de pulmão (1.300.000), estômago (1.000.000), fígado (662.000), cólon
(655.000) e mama (502.000). Vale a pena aqui ressaltar que desse número
extremamente relevante de mortes por câncer em 2005, cerca de 70% dessas
ocorreram em países de média ou baixa renda (WHO, 2007). Dados mais recentes
estimaram para a população americana cerca de 1.500.000 novos casos e 560.000
mortes em decorrência do câncer somente em 2009 (JEMAL et al., 2009).
Apesar do cenário atual já ser bastante desanimador, estima-se que até 2020
ocorrerá um aumento de 50% na incidência de cânceres, sendo que desses, 1/3
poderá ser prevenido e 1/3 curável, desde que instituídas medidas para a educação
da população quanto à mudança de seus hábitos comportamentais (WILKINSON,
2003). Além disso, 60% desses novos casos ocorrerão em países em
desenvolvimento (THUN et al., 2010).
No Brasil, a incidência de câncer acompanha a tendência mundial. Nesse
sentido, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima para os anos de 2010 e 2011
cerca de 489.270 novos casos de câncer, sendo os tipos mais incidentes, exceção
feita ao câncer de pele do tipo não-melanoma, os de próstata e pulmão em homens e
mama e colo de útero em mulheres (INCA, 2010). De uma forma geral, as regiões Sul
e Sudeste apresentam maior incidência, enquanto as Norte e Nordeste, as menores.
Estados da região Centro-Oeste apresentam incidência intermediária (INCA, 2010).
O câncer é caracterizado pelo conjunto de manifestações clínicas patológicas
caracterizadas pela perda do controle do crescimento celular e o ganho de
capacidade de invadir tecidos adjacentes ou de espalhar-se (metástase) para outras
regiões do corpo (RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003). Tal doença é
classificada geneticamente como multicausal ou multifatorial, pois sua determinação
depende tanto de condicionantes biológicos quanto psíco-sócio-ambientais.
Carcinogênese é um termo geral utilizado para se denotar o desenvolvimento
de neoplasias (PITOT, 2001). Essas podem ser benignas ou malignas. As primeiras
24
se referem às que apresentam uma proliferação celular localizada e circunscrita,
exercendo pressão nos tecidos adjacentes, mas que não ultrapassam suas divisas.
Em contraste, neoplasias malignas ou cânceres têm a capacidade de invadir e
se multiplicar em diferentes partes do organismo (HANAHAN; WEINBERG, 2000). Já
a definição de uma pré-neoplasia leva em conta etapas prévias do desenvolvimento
de neoplasias tanto benignas quanto malignas. Dessa forma, uma pré-neoplasia não
é idêntica a um pré-câncer, podendo ser descrita em nível histológico, como
populações de células fenotipicamente alteradas e que não apresentam natureza
neoplásica óbvia, mas que têm o potencial de progredir para neoplasias benignas ou
malignas (BANNASCH et al., 2003; FRANKS; KNOWLES, 2005).
A mutação no DNA é a alteração genuína do processo carcinogênico e que
pode ser induzida externa ou internamente ao organismo. Os indutores externos
podem ser carcinógenos químicos (solventes aromáticos; clorados; agrotóxicos),
físicos (radiações ionizantes e não ionizantes; campos eletromagnéticos) ou, ainda,
biológicos (vírus, microorganismos). Já os indutores internos são, entre outros,
hormonais, imunológicos e enzimáticos que podem promover mutações genéticas na
estrutura do DNA. Esses condicionantes estão, de modo geral, presentes de forma
interativa na promoção do processo de carcinogênese (RIBEIRO; SALVADORI;
MARQUES, 2003).
Os carcinógenos, em sua maioria, apresentam uma propriedade em comum:
são eletrofílicos altamente reativos que reagem com locais nucleofílicos na célula.
Essas reações, chamadas de eletrofílicas, podem atacar diversos locais nas células
alvos, porém muitas evidências apontam o DNA como alvo primário. A ligação entre o
carcinógeno e o DNA forma os adutos, os quais podem levar a mutações em proto-
oncogenes ou em genes supressores de tumor e iniciar o processo de
carcinogênese. Sendo que a base do DNA mais suscetível a esse tipo de ataque é a
guanina (LOUREIRO; MASCIO; MEDEIROS, 2002).
Após a mutação ocorrem alterações no processo de divisão celular,
especialmente relacionados com seu controle e alterações na sua diferenciação,
resultando na perda de características funcionais e na formação de tumores
(CUNNINGHAM; MATTHEWS, 1995).
Os agrotóxicos estão entre os carcinógenos químicos, podendo induzir o
câncer por mecanismos variados como genotoxicidade e promoção de tumores
25
envolvendo mediadores hormonais; imunológicos e a produção de moléculas
oxidantes (peróxidos) (RODVALL; DICH; WIKLUND, 2003). As evidências científicas
relacionadas com esses mecanismos carcinogênicos ainda requerem maiores
estudos na sua elucidação. Uma série de substâncias químicas apresenta esses
desafios, entre elas, os agrotóxicos (POTTI et al., 2003).
Pela grande disseminação de agrotóxicos no modelo de produção de
alimentos, estima-se uma associação entre exposição e o desenvolvimento de
câncer. Anualmente, nos Estados Unidos, são estimadas cerca de 6.000 a 10.000
casos de câncer associados com agrotóxicos. Tal associação está mais bem
caracterizada nos cânceres de pulmão, de mama, dos testículos, da tireóide, da
próstata, do ovário, e do sistema hematopoiético (linfomas não-Hodgkin, leucemias e
mieloma múltiplo) (PIMENTEL, 1996).
Segundo Meyer et al. (2003), o Brasil já mostrou uma alta taxa de mortalidade
para câncer de estômago, esôfago, laringe, câncer oral e leucemias em agricultores
expostos a agrotóxicos na região Serrana do Rio de Janeiro. O mesmo resultado,
porém nas neoplasias malignas de mama, ovário e próstata, em amostra de grupos
populacionais expostos a agrotóxicos no período de 1985 a 1990, foi descrito por
Koifman, Koifman e Meyer (2002) .
Cada vez mais casos de pessoas contaminadas diretamente por agrotóxicos
no meio rural são relatados. Entretanto, moradores de áreas próximas e,
eventualmente, pessoas do meio urbano também se encontram sob risco, devido à
contaminação dos alimentos como carne, peixe, laticínios, frutas e vegetais, tornando
assim a exposição crônica (RITTER, 1997). Desta forma, os riscos à saúde humana
associados ao uso e à exposição crônica a agrotóxicos têm sido objeto de grande
interesse científico.
Em termos populacionais, os efeitos crônicos podem ser tão prejudiciais
quanto os agudos, uma vez que existem sugestões fortemente apoiadas por
evidências que apontam consequências deletérias na fertilidade, na etiologia de
danos neurológicos e possivelmente no aumento da suscetibilidade a neoplasias
(SHARP et al, 1986). Assim, indivíduos que participam da produção industrial ou
aplicação em larga escala destes compostos podem estar sujeitos a uma maior
contaminação do que a população em geral.
26
O efeito crônico ocorre principalmente porque existem três principais vias de
absorção de agrotóxicos (dérmica, digestiva e respiratória), o que aumenta a área
biológica de exposição a estes agentes químicos. Adicionalmente, alguns pesticidas
permanecem armazenados nos tecidos de organismos vegetais e animais, incluindo
o homem, como é o caso dos agrotóxicos que usam organoclorados. Tais pesticidas
são lipossolúveis e têm grande estabilidade, o que os torna geralmente resistentes à
degradação biótica ou abiótica (HASHIMOTO, 2010).
Alguns estudos vêm demonstrando que tais agentes podem realmente estar
relacionados com o desenvolvimento de morbidades crônico não-transmissíveis,
como as neoplasias (SHARP et al, 1986; PÁLDY et al, 1987; YODER et al, 1973).
Entretanto, sob o ponto de vista epidemiológico, a avaliação do potencial
carcinogênico dos agrotóxicos com organoclorados e demais agrotóxicos com o
câncer é extremamente complexa. As dificuldades são inúmeras, face à
heterogeneidade dos compostos utilizados, à diversidade de métodos de aplicação e
à ausência de dados adequados sobre a natureza da exposição. Além do que, o nível
de exposição a agrotóxicos estimados em estudos epidemiológicos nem sempre
representa a sua intensidade real. Como a abordagem quantitativa precisa é difícil de
ser realizada, acabam sendo utilizadas medidas subjetivas como, por exemplo, tempo
de exposição, área geográfica ou frequência de uso (BROUWER et al, 1994).
Alguns estudos que buscaram essa associação entre o uso de agrotóxico e
câncer não são conclusivos; os autores referem, em suas discussões e conclusões,
que há limitações metodológicas nos desenhos de estudos adotados (ACQUAVELLA
et al., 1998; ALAVANJA; HOPPIN; KAMEL, 2004; GUTTES et al., 1998; MILLIKAN et
al., 2000; RITTER, 1997; RUSIECKI et al., 2004). Segundo Bassil et al. (2007),
quando associa-se neoplasia maligna e agrotóxico, em alguns tipos de câncer em
humanos essa associação está bem demonstrada, no entanto, para outros ainda há
carência de estudos com desenhos epidemiológicos adequados.
2.6 Substâncias carcinogênicas ou potencialmente carcinogênicas
2.6.1 Agrotóxicos
Segundo a Lei Federal nº7. 802 de 11/07/1989 (BRASIL, 1989), agrotóxicos
são:
27
Produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao
uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos
agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de
outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja
finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las
da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias
e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e
inibidores de crescimento.
O uso indiscriminado de agrotóxicos vem causando preocupação em todo o
mundo devido aos efeitos adversos que pode causar à saúde humana e ao meio
ambiente. Esses efeitos são, na maioria das vezes, condicionados por fatores como
alta toxicidade dos produtos, uso inadequado e falta de utilização de equipamentos
de proteção coletiva e individual. Esta situação é agravada pelas precárias condições
socioeconômicas e culturais da grande maioria dos trabalhadores rurais, o que amplia
sua vulnerabilidade frente à toxicidade dos agrotóxicos (SILVA et al, 1999;
SOBREIRA; ADISSI, 2003).
No Brasil, o termo “agrotóxico” é usado para denominar as substâncias tóxicas
utilizadas para matar, controlar ou afastar organismos indesejados da lavoura e, ou,
da área urbana, tais como: fungicidas, herbicidas, inseticidas, acaricidas,
bactericidas, entre outros (VAZ, 2006). É comum a defesa do termo “defensivo
agrícola” em vários segmentos acadêmicos e empresariais. O termo “agrotóxico” ao
invés de “defensivo agrícola” passou a ser utilizado, no Brasil, para denominar os
venenos agrícolas, após grande mobilização da sociedade civil organizada. Mais do
que uma simples mudança da terminologia, esse termo coloca em evidência a
toxicidade desses produtos para o meio ambiente e a saúde humana. São ainda
genericamente denominados praguicidas ou pesticidas (OPAS, 1997).
Apenas entre 2000 e 2010 o uso de agrotóxicos cresceu 93% em todo o
mundo. No Brasil esse percentual foi muito superior, chegando a 190%. São cerca de
130 empresas produtoras instaladas fabricando aproximadamente 2.400 produtos
diferentes (JÚNIA, 2013).
O Brasil é, na atualidade, o maior consumidor de agrotóxicos, sendo
responsável por 1/5 do consumo mundial (ANVISA, 2012).
28
Isto significa dizer que 19% de todos os agrotóxicos produzidos no mundo são
utilizados no Brasil. Em 2010, foram vendidas 936 mil toneladas de agrotóxicos, o
que movimentou 7,3 bilhões de dólares (ANVISA, 2010).
Os agravos causados pelos agrotóxicos determinam um problema muito sério
de saúde pública, principalmente no que diz respeito à saúde dos agricultores e, é
claro, a saúde dos consumidores. Por isso, no Brasil, o registro de um agrotóxico
necessita de análise e concordância de três órgãos: o Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (MAPA), a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) e o Instituto Brasileiro de Meio Ambiente (IBAMA) (ANVISA, 2005).
Essas substâncias são classificados, pelo Ministério da Saúde, de acordo com
sua toxicidade. Podendo ser Extremamente, Altamente, Medianamente e Pouco
tóxico. Essa classificação baseia-se na Dose Letal 50 (DL50) que se trata de um
indicador de efeito a morte e não de saúde, além do que não diz respeito a efeito
crônico, mas sim a efeito agudo. Faz-se uma extrapolação comparando com a
quantidade que seria suficiente para matar uma pessoa, embora outros indicadores
relacionados a danos na córnea, lesões na pele e CL50 (dose que leva à morte cerca
de 50% de organismos expostos, a alguma substância, por imersão) também possam
determinar a classificação do produto (GRISOLIA, 2005).
Os agrotóxicos podem penetrar no corpo humano através das vias, em ordem
crescente, de: ingestão, respiração e absorção dérmica. Esta última varia de acordo
com a formulação empregada, temperatura, umidade relativa do ar, regiões do corpo
(verso das mãos, pulsos, nuca, pés, axilas e virilhas absorvem mais), tempo de
contato, existência de feridas (GARCIA, 2001).
O Ministério da Saúde afirma que, no Brasil, mais de 400.000 pessoas são
contaminadas por agrotóxicos ao ano, embora haja uma grande subnotificação, tanto
que esse cálculo foi feito em cima do número de 8.000 casos notificados pelo
Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX) em 2002
multiplicado por 50, fator de correção utilizado pelo Ministério para dimensionar
números de casos não notificados (PERES, et al., 2005). Segundo Moreira et al
(2002), há cerca de 4.000 mortes por ano causadas por estes agentes. De cada oito
trabalhadores agrícolas examinados no Brasil, há pelo menos um caso de intoxicação
aguda (ARAÚJO; NOGUEIRA; AUGUSTO, 2000).
29
2.6.1.1 Metamidofós
A ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), no âmbito do Ministério
da Saúde, é o órgão responsável pela avaliação da toxicidade dos agrotóxicos e seus
impactos à saúde humana, emitindo um parecer toxicológico favorável ou
desfavorável à concessão do registro pelo Ministério da Agricultura. A partir do ano
de 2000 a ANVISA deu inicio aos processos de reavaliações toxicológicas de alguns
agrotóxicos que já estavam registrados para comercialização no Brasil por
apresentarem alterações de risco à saúde humana (DELDUQUE, 2010).
A avaliação do risco de um agrotóxico constitui um processo que envolve
equipe multidisciplinar visando organização e análise de informações cientificas
disponíveis relacionadas aos efeitos adversos, a fim de estabelecer suas
probabilidades e magnitude e permitir ao gestor, principalmente, promover a redução
da frequência dos eventos adversos identificados (OLIVEIRA, 2005).
No ano de 2001 a ANVISA elaborou o Programa de Análise de Resíduos de
Agrotóxicos em Alimentos (PARA). Sendo seu principal objetivo avaliar os níveis de
resíduos de agrotóxicos nos alimentos in natura que chegam aos consumidores
(ANVISA, 2010).
Dentre os diversos resultados do PARA, constatou-se a utilização do
Metamidofós em culturas para as quais o seu uso não era autorizado, como
exemplos: alface, arroz, cenoura, mamão, morango, pimentão, repolho e uva.
Resíduos deste agrotóxico foram encontrados também em tomate de mesa, cuja
cultura estava restrita pela ANVISA para o recebimento de tal agrotóxico, o que já
demonstrava o agravo da situação (ANVISA, 2010). Os resultados obtidos com o
PARA confirmam que o uso de agrotóxicos não autorizados, como o metamidofós, e
a presença de resíduos acima do limite máximo permitido continuam frequentes.
Surgindo, dessa forma, a necessidade de adoção de medidas mais eficazes de
controle e fiscalização, o que levou a decisão da ANVISA de implementar a
reavaliação de uma série de agrotóxicos, proposta da RDC nº 10 de 22/02/2008
(ANVISA, 2009). Tal decisão teve amparo legal na Lei 7.802/1989 e no Decreto
4.074/2002. Essa medida fez com que representantes de diversas empresas
fabricantes de agrotóxicos movessem ações judiciais para o impedimento da
reavaliação proposta (DELDUQUE, 2010).
30
Pesquisas nacionais e internacionais, assim como condenações judiciais de
empresas fabricantes de agrotóxicos pelos agravos causados à saúde de pessoas,
influenciaram a ANVISA a tomar tal decisão, visando à prevenção de riscos à vida e à
saúde da população brasileira consumidora de alimentos tratados com estes
produtos, bem como trabalhadores rurais que os manipulam (DELDUQUE, 2010).
Entre os grupos de agrotóxicos mais combatidos, destacam-se os
organoclorados, atualmente proibidos em todo o mundo, os carbamatos e mais
recentemente, os organofosforados. O metamidofós é um dos organofosforados que
tem causado inúmeros problemas à saúde pública no Brasil; envolvido, inclusive, em
diversas ações judiciais. Empresas que fabricam, transportam e comercializam este
produto no Brasil, por meio de seu poder econômico, tentaram impedir o
cancelamento do registro do metamidofós, entrando com demandas judiciais contra a
agência regulatória. A reavaliação e cancelamento do metamidofós é um exemplo
das dificuldades de realização do controle sanitário dos agrotóxicos, mesmo com os
problemas que podem causar a saúde humana (DELDUQUE, 2010).
A aplicação e manuseio do metamidofós expõem trabalhadores ao risco de
morte na atividade agrícola. As intoxicações e óbitos relacionam-se às características
de toxicidade desse princípio ativo. Além disso, inúmeras questões de ordem social
(baixa escolaridade, baixa renda) e biológica (idade e gênero) são fatores que
aumentam a vulnerabilidade e a gravidade das intoxicações por esse
organofosforado (SILVA et al, 1999; SOBREIRA; ADISSI, 2003).
A ANVISA, diante de alertas ou suspeitas de efeitos adversos que se
configuram dentre os proibitivos de registro, publicou a reavaliação do metamidofós,
que possui vários efeitos adversos para a saúde humana, além de ser extremamente
tóxico (Classe I) (ANVISA, 2012). De acordo com a Lei 7.802/89 um agrotóxico se
enquadra nas proibições de registro quando há ausência de métodos para
desativação do produto, na ausência de antídoto ou tratamento eficaz, quando
provoca distúrbios hormonais ou danos ao aparelho reprodutor e, quando são
teratogênicos, carcinogênicos ou mutagênicos. Além disso, também quando se
apresenta mais perigoso para o homem do que em animais (BRASIL, 1989).
O metamidofós age em insetos e mamíferos diminuindo a atividade da enzima
acetilcolinesterase, essencial na transmissão normal de impulsos nervosos
31
(EDWARDS; TCHOUNWOU, 2005). Seu efeito nocivo é prolongado, pois apresenta
efeito residual de 10 a 12 dias.
Durante a década de 1990, seu uso na agricultura brasileira foi crescente,
sendo registrados casos de uso abusivo e indiscriminado e de contaminação em
culturas de hortaliças (MOREIRA, 1995; ARAÚJO, 2000).
Além de altamente tóxico aos mamíferos, aves e insetos, o metamidofós
produz desgaste nos equipamentos de proteção individual (EPI), como respiradores,
óculos de proteção para químicos, luvas de borracha e roupas protetoras
impermeáveis (KIDD, 1991).
Na saúde, o efeito nocivo do metamidofós tem sido encontrado no fígado,
baço, rins, órgãos genitais e pulmões. Para os efeitos subagudos ou subcrônicos foi
observada alteração do peso absoluto dos órgãos dos animais testados. A
desregulação endócrina causada pelo metamidofós é um efeito adverso muito
preocupante do ponto de vista da saúde pública e ambiental, pois pode desencadear
efeitos seriamente debilitantes e até a morte. Por serem capazes de interferir na
reprodução, já que os eixos de regulação hormonal estão integrados, os
desreguladores endócrinos podem alterar, entre outros, o número de indivíduos de
uma determinada população. Esses efeitos podem repercutir nos ecossistemas e, por
conseguinte, nas populações humanas. A intoxicação aguda por metamidofós induz
uma série de efeitos deletérios sobre a saúde de humanos e animais (PIRES, 2005).
Podem ocorrer manifestações menos graves como vômito, diarréia, sudorese
excessiva, salivação, lacrimejamento, miose, broncoconstrição, cólicas abdominais,
bradicardia, taquicardia, dor de cabeça, tontura, cansaço, ansiedade, confusão
mental e visão turva. Entretanto, em casos mais graves pode ocorrer convulsão,
depressão do centro respiratório, fasciculação dos músculos respiratórios com
paralisia muscular, parada respiratória, coma e morte (ANVISA, 2012).
A contaminação do meio ambiente pode ocorrer de diversas formas: poluindo
o ar, através de pulverizações, o solo, quando produtos são usados diretamente e de
forma incorreta nas lavouras, e a água, quando em períodos de chuvas esses
compostos químicos penetram o solo e alcançam lençóis freáticos e leitos de rios.
Ainda considera-se que mesmo de forma indireta, agrotóxicos afetam também a vida
animal (MOREIRA, 2002).
32
Pela somatória dos efeitos nocivos do metamidofós à saúde humana,
principalmente, relacionado à neurotoxicidade, imunotoxicidade e sobre o sistema
endócrino, reprodutor e desenvolvimento embrio-fetal, recomendou-se a proibição do
metamidofós na atividade agrícola e em outras que possibilite a exposição humana
(ANVISA, 2012).
2.6.2 Dietinitrosamina
O carcinógeno dietilnitrosamina (DEN) é encontrado em nosso meio ambiente
e também na cadeia alimentar, mas é bastante utilizado experimentalmente na
iniciação de câncer em estudos in vitro e in vivo (MITTAL et al., 2002). Em dose alta e
única é necrogênico e exerce sua toxicidade pela geração de radicais livres após a
ativação do sistema enzimático dependente da P-450, um caminho alternativo às
ligações covalentes com vários constituintes celulares, criando injúria celular
(SWENBERG et al., 1991).
Li et al. (2005) demonstraram em ratos que o DEN induz lesões muito
semelhantes aos diferentes tipos de tumores benignos e malignos em humanos. Um
mecanismo pelo qual a DEN inicia a carcinogênese é a geração de radicais livres, os
quais levam ao ataque de ácidos graxos ou cadeia lateral acil seguida de extração de
um átomo de hidrogênio de um carbono metileno de uma cadeia lateral.
A geração de um ambiente oxidativo parece ser um caminho bastante
plausível para a indução de carcinogênese, mesmo com a utilização de doses
subnecrogênicas de DEN (MUZIO et al., 1999)
2.8 Modelo de hepatocarcinogênese em ratos
Modelos de hepatocarcinogênese em ratos estão bem estabelecidos para o
estudo da carcinogênese (SU; BANNASCH, 2003), uma vez que o desenvolvimento
do hepatocarcinoma (HCC) em ratos é semelhante ao observado em humanos
(BANNACH et al., 2003). O modelo do “Hepatócito Resistente” (HR) tem como
principal característica a produção de lesões pré-neoplásicas (LPN) e neoplásicas de
forma sincronizada, o que o torna uma ótima ferramenta para o estudo de
substâncias com potencial de modular a carcinogênese durante as etapas iniciais
33
pré-neoplásicas (RIZZI et al., 1997). O DEN possui potencial ação no que se refere
às LPN induzidas por esse modelo, sendo observadas cerca de seis semanas após a
iniciação com tal carcinógeno.
Descreve-se que a prevenção, destacando-se no caso, a quimioprevenção,
seria o método mais apropriado para se eliminar o impacto do câncer em seres
humanos (HONG; SPORN, 1997). Definida pela primeira vez por Sporn e
colaboradores em 1976 (SPORN et al., 1976) a quimioprevenção do câncer consiste
na forma de se prevenir a doença por meio da administração de um ou mais
compostos químicos, sejam eles naturais ou sintéticos, durante as etapas iniciais pré-
neoplásicas da carcinogênese, ou seja, antes do estabelecimento da fase de
progressão (SPORN; SUH, 2002).
Utilizando o modelo de hepatocarcinogênese do HR, foram observados
previamente efeitos protetores de diversos nutrientes e compostos bioativos de
alimentos (CBA) em diferentes fases da carcinogênese. Nesse sentido, dentre
diversos outros exemplos, observou-se efeito protetor por parte do β-caroteno
quando administrado especificamente durante a iniciação (MORENO et al., 1991),
promoção inicial (RIZZI et al., 1997) ou progressão (MORENO et al., 2002). Já
quando administrado continuamente durante a iniciação e promoção, observou-se
ação quimiopreventiva digna de nota por parte do β-caroteno (MORENO et al., 1991;
1995; FONSECA et al., 2005; SAMPAIO et al., 2007), vitamina A, ácidos retinóicos 9-
cis e todo trans (FONSECA et al., 2005; SAMPAIO et al., 2007), β-ionona e
geranilgeraniol (ESPÍNDOLA et al., 2005), farnesol e geraniol (ONG et al., 2006) e
mais recentemente tributirina (KUROIWA-TRZMIELINA et al., 2009).
34
3 JUSTIFICATIVA
A viticultura na região semiárida, em particular no Submédio do Vale do São
Francisco, destaca-se no cenário nacional, não apenas pela expansão da área
cultivada e do volume de produção, mas principalmente pelos altos rendimentos
alcançados e na qualidade da uva produzida. Ainda segundo a EMBRAPA (2010), a
cultura da videira reveste-se de especial importância econômica e social na região na
medida em que envolve um grande volume anual de negócios voltados para os
mercados interno e externo, e se destaca entre as culturas irrigadas da região, como
a que apresenta o maior coeficiente de geração de empregos diretos e indiretos.
Pelas condições tanto climáticas quanto dos solos presentes no semi-árido, é
necessária a utilização dos agrotóxicos para a melhoria da lavoura e o aumento da
produtividade. O aparecimento de pragas é também favorecido pelo tipo de
agricultura, as monoculturas. (FERRACINI et al., 2001). Esse intenso uso de
agrotóxicos nessa região coloca a sua população expostas aos fatores negativos
causados a saúde por essas substâncias.
Segundo Bedor (2008), os principais grupos químicos utilizados no submédio
do Vale do São Francisco são os organofosforados (25%), os piretróide (9%), os
benzimidazol e triazol com (6%) e os neocotinóides (5%). Os organofosforados são
substâncias que são absorvidas pela pele, por ingestão ou por inalação, e têm sua
ação associada à inibição especialmente da acetilcolinesterase. Esse grupo químico
é responsável pelo maior número de intoxicações agudas e mortes no Brasil
(BRASIL, 1997). A exposição crônica a este tipo de produto está relacionada, entre
outros, ao câncer, efeitos teratogênicos, neuropatias periféricas tardias e toxicidade
reprodutiva (CALDAS; SOUZA, 2000).
Uma vez que a população do submédio do Vale do São Francisco vive em
constante exposição a diversos tipos de agrotóxicos como os organofosforados, e
suas inúmeras complicações, entre elas o desenvolvimento de neoplasias malignas é
de grande interesse clínico e científico verificar o possível efeito do extrato do bagaço
da uva no desenvolvimento de câncer em ratos expostos a agrotóxico, com o intuito
de investigar o seu potencial anticarcinogênico. Além disso, em outro contexto,
visando à redução da geração de resíduos pela indústria e a obtenção de preparados
ricos em compostos bioativos a partir de uma fonte barata, que usualmente é
35
considerada descarte da indústria, os efeitos de tal produto na saúde é uma
interessante opção a ser estudada.
Dessa forma, o presente estudo foi conduzido para se avaliar o efeito da
suplementação do extrato do bagaço da uva Moscato canelli quando administrado
continuamente durante as etapas de iniciação e seleção/promoção em ratos
submetidos ao modelo de hepatocarcinogênese do HR. Considerando as evidências
já citadas no texto, o presente estudo baseia-se na hipótese de que o extrato do
bagaço da uva (EBU), quando administrado continuamente durante as etapas iniciais
pré-neoplásicas, apresenta atividade quimiopreventiva.
Além disso, uma vez utilizando modelo sincronizado e bem estabelecido para
o estudo da quimioprevenção do câncer, também se objetivou fornecer informações a
respeito da ação desse extrato quando fornecido anteriormente à exposição ao
carcinógeno.
Considerando, ainda, as inúmeras pesquisas priorizando estudos com uvas
vermelhas, roxas e pretas; buscou-se aprofundamento sobre possíveis ações
farmacológicas de uma variedade de uva verde, baseando-se no seu alto valor
biológico-nutricional.
36
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
O objetivo geral deste estudo é avaliar o potencial anticarcinogênico do extrato
do bagaço da uva em lesões causadas pela dietilnitrosamina em ratos Wistar.
4.2 Objetivos específicos
• Determinar o possível papel anticarcinogênico do extrato do bagaço da uva;
• Determinar possíveis lesões causadas pelo metamidofós em ratos expostos
via intraperitoneal;
• Determinar o possível papel anticarcinogênico do extrato do bagaço da uva
frente à exposição ao agrotóxico metamidofós;
5 METODOLOGIA
5.1 Animais de experimentação
O estudo consistiu na análise anticarcinogênica do extrato do bagaço da uva
em ratos Wistar (Rattus novergicus)- total de 33 ratos -, de 90 dias de vida, pesando
em torno de 300g. Os animais foram fornecidos pelo Biotério da Universidade Federal
do Vale do São Francisco (UNIVASF), e ficaram alojados em gaiolas de polipropileno,
mantidas em sala com temperatura controlada (25 ± 1°C) e com ciclo de luz
controlado (12h claro/12h escuro). Esses animais foram submetidos a uma dieta
diária de ração balanceada e água filtrada, sem restrição nem interrupção. Esse
estudo seguiu os princípios éticos que regem estudos em animais tendo a aprovação
do Comitê de Ética de Humanos e Animais da Universidade Federal do Vale do São
Francisco (Protocolo nº 0002/261011).
5.2 Produtos químicos
Nos experimentos foram utilizados:
• Dietilnitrosamina (DEN). Indutor de hepatocarcinoma bem descrito na
literatura (DIAS et al., 2008; CHIARELLO et al., 2010; SCHMITZ et al., 2011) em dose
única (100 ou 200 mg/Kg) via intraperitoneal. O DEN utilizado nesta pesquisa foi o
comercializado pela empresa Sigma®.
• Organofosforado metamidofós. Optou-se por este agente pelo mesmo ser
largamente utilizado em uma grande variedade de culturas, mesmo sendo
considerado altamente tóxico (classe toxicológica II) (RAMOS, 2006), ser de ação
sistêmica e ter potencial carcinogênico e mutagênico (BEDOR et al, 2011). A DL50
desse agrotóxico é de 23 mg/Kg por via oral para ratos machos Wistar (GUO et al,
1986 apud IPCS, 2002). Tal produto foi adquirido da empresa Sigma®, na sua forma
isolada. A solução estoque e de uso foram preparadas em solução salina (NaCl
0,9%).
• Extrato do bagaço da uva Moscato canelli dissolvido em solução salina;
armazenado em frasco de vidro fechado, conservado sob refrigeração e protegido
contra luminosidade. O bagaço para a confecção do extrato foi fornecido pela
EMBRAPA Semiárido e o extrato cedido pelo Prof. Dr. Roberto Jefferson Bezerra do
Nascimento, docente da UNIVASF, sendo produzido como objeto da dissertação da
mestranda do Programa de Pós–Graduação em Ciências dos materiais da UNIVASF,
Luana Dias. Após ter sido recolhido, o material passou por um processo de secagem
em uma estufa de circulação de ar a 55°C. O material seco foi macerado em EtOH
puro absoluto, e a solução extrativa foi concentrada em evaporador rotatório sob
pressão reduzida a 60°C. Na análise do extrato, constatou-se um teor razoável de
fenólicos totais (10,413mg EAG/grama de extrato, sendo EAG – equivalência por
ácido gálico). Em consequência disso, o produto obtido apresentou atividade anti-
radicalar.
Na manipulação dos produtos químicos utilizados foram tomadas as medidas
para proteção do manipulador como o uso de luvas, óculos, máscaras, e de capela
para a diluição, uma vez que a manipulação do agrotóxico metamidofós oferece
riscos de intoxicação se for absorvido pelas vias digestiva, respiratória e dérmica
(IPCS, 1993); assim como o DEN.
5.3 Protocolo experimental
Os experimentos deste estudo foram divididos em três etapas.
5.3.1 Primeira etapa
A etapa inicial da pesquisa objetivou determinar as dosagens de DEN e
metamidofós que melhor induzissem as lesões teciduais e será explicado em três
momentos, os quais foram denominados protocolos:
Protocolo 1: O experimento foi realizado com 2 grupos de animais:
• Grupo 1.2A: ratos expostos a 200mg/kg de peso do animal de DEN, via i.p.
uma vez por semana, durante três semanas (n=5)
• Grupo 1.2B: controle - ratos expostos a 0.9% NaCl, via i.p (n=2)
Após 4 e 6 dias do recebimento da segunda dose do DEN (200 mg/kg), dois
animais do grupo 1.2.A morreram. Todos os animais sobreviventes (n=3) desses
grupos foram então eutanasiados após a 2º dose, através de deslocamento cervical,
previamente anestesiados; e avaliados segundo os critérios adotados neste estudo.
Protocolo 2: Outro experimento foi iniciado com 3 grupos de animais:
• Grupo 1.3A: rato exposto ao DEN, via i.p, em única dose de 100 mg/kg de
peso de animal (n=1)
• Grupo 1.3B: rato exposto ao DEN, via i.p, em dose única de 200 mg/kg de
DEN por peso de animal (n=1)
• Grupo 1.3C: controle - ratos expostos a 0.9% NaCl, via i.p. (n=2)
Após 24 horas, o animal exposto à dose de 100 mg/kg do DEN foi sacrificado,
bem como um dos animais que recebeu solução salina. Após 48 horas, o animal
exposto à dose de 200 mg/kg do DEN e o segundo animal exposto à solução salina
foram sacrificados e avaliados histopatologicamente.
Protocolo 3: O agrotóxico metamidofós foi testado em 14 animais distribuídos
três grupos.
• Grupo 1.4A: ratos expostos a dose de 1,0 mg/kg, por peso do animal, do
Metamidofós (n=3)
• Grupo 1.4.B: ratos expostos a dose de 4,5 mg/kg, por peso do animal, do
Metamidofós (n=3)
• Grupo 1.4C: 04 animais receberam a dose de 6,0 mg/kg, por peso do
animal, do Metamidofós (n=4)
• Grupo 1.4D: ratos expostos a 0.9% NaCl, via i.p. (n=4)
A aplicação do metamidofós foi feita semanalmente e as doses foram
administradas pela via intraperitoneal, uma vez por semana durante 4 e 8 semanas.
Um (01) animal de cada grupo foi eutanasiado após 4 semanas de exposição. Da
mesma forma, o restante dos animais foi sacrificado ao final de 8 semanas..
As doses foram determinadas a partir de pesquisas realizadas na literatura e
optou-se por distribuir um número maior de animais recebendo a maior dose do
metamidofós (6 mg/kg) devido à toxicidade e os possíveis efeitos desse agrotóxico.
5.3.2 Segunda etapa
Na segunda etapa da pesquisa, ocorreram os experimentos para identificação
do efeito do extrato do bagaço da uva (EBU) em animais previamente expostos ao
agente carcinogênico.
Primeiramente, 5 animais foram expostos ao DEN, via i.p, em dose única de
200 mg/kg, por peso do animal. Após 48 horas esses animais passaram a ser
tratados com 200 mg/Kg, por peso do animal, de EBU, por gavagem, durante 4
semanas. Os animais receberam um total de 20 (vinte) doses de EBU, divididas em 5
doses por semana. Um animal recebeu apenas EBU nas mesmas condições do grupo
que recebeu o extrato.
Os animais foram eutanasiados após 48 horas da vigésima dose do tratamento
com o EBU por meio de dose supra-anestésica letal e deslocamento cervical, e
avaliados quanto ao surgimento de lesões teciduais através da análise
histopatológica.
5.3.3 Terceira etapa
Na última etapa da pesquisa, ocorreram os experimentos para identificação do
efeito do tratamento com o extrato do bagaço da uva anteriormente à exposição ao
agente carcinogênico.
Uma quantidade de 5 animais receberam o extrato por 4 semanas. Os ratos
recebiam um total de 5 doses por semana de 200 mg/kg de EBU, por peso de animal,
por gavagem, totalizando 20 doses no final da quarta semana. Após 48 horas da
última administração do extrato os animais foram expostos a uma única dose de 200
mg/Kg de DEN, por peso de animal, via intraperitoneal. Um animal recebeu apenas
EBU em 200 mg/Kg de peso de animal, por gavagem, durante o mesmo período.
Após 48 horas da inoculação do agente carcinogênico, todos os animais foram
eutanasiados e avaliados quanto ao aparecimento e evolução de lesões teciduais.
5.4 Procedimento anestésico para ratos
A conhecida associação das drogas xilazina e quetamina nas dosagens de 5
mg/Kg de peso do animal e 50 mg/Kg de peso do animal, respectivamente, foi
utilizada em todos os ratos desta pesquisa, porém numa dose de 3 a 5 vezes maior
que a descrita, com o objetivo de causar a morte dos mesmos.
5.5 Análise histopatológica dos animais
Para a análise tecidual, foram removidos dos animais fígado, baço, rim,
coração e pulmão. Também foi realizada uma inspeção em todo o animal para a
busca de possíveis alterações macroscópicas em outros órgãos. Os órgãos retirados
passaram pelo processo de confecção e coloração de lâminas histopatológicas.
5.6 Processo de confecção e coloração das lâminas histológicas
Foram retirados pequenos e diferentes cortes dos órgãos estudados e
colocados em cassetes identificados (Figura 3).
Figura 3 - Material cortado e colocado no cassete para o processamento
5.6.1 Fixação:
Para a fixação foi utilizado formol a 10% (Figura 4), com a finalidade de evitar o
processo de autólise da célula, impedir a destruição do tecido por procariontes,
endurecer o material para melhor tratamento posterior e aumentar a capacidade de
coloração do material. O tempo de fixação durou em média 48 horas.
Figura 4 - Material em cassetes plásticos e mergulhados em formol a 10%.
5.6.2 Desidratação:
Para a desidratração, o material foi mergulhado em frascos contendo
concentrações crescentes de álcool a 80%, 95%, Absoluto I e Absoluto II. O álcool
absoluto corresponde a 99% de pureza (Figura 5).
Figura 5 - Bateria de álcool para desidratação
.
5.6.3 Diafanização ou clareamento:
Para o clareamento das lâminas, foram realizados 3 banhos de xilol para
permitir melhor penetração de parafina na peça (Figura 6).
Figura 6 - Bateria de frascos com xilol
.
5.6.4 Impregnação:
Em recipientes contendo parafina líquida a 60º C, o material foi colocado em
estufa na mesma temperatura; e recebeu 2 banhos de parafina, cada um com
duração de 1 hora e 30 minutos (Figura 7).
Figura 7 - Peças em fracos de vidro contendo parafina em estufa a 60º C.
5.6.5 Inclusão:
A inclusão foi realizada derramando a parafina em caixinhas feitas com papel,
e em seguida colocando o tecido no interior das embalagens. A Figura 8 mostra o
material incluído na parafina, na figura o bloco da direita foi processado para ser
cortado no micrótomo.
Figura 8 - Material já incluído na parafina.
5.6.6 Microtomia:
Os blocos de parafina foram cortados, em um micrótomo (Figura 9), para a
obtenção de cortes do material, com espessura de 5 a 6 micrômetros.
Figura 9 - Corte do bloco em tiras de 6 micrômetros de espessura.
5.6.7 Passagem em “banho-maria”:
Os cortes, observados na figura 10a, foram distendidos em água aquecida a
56º C para evitar microdobras no material (Figura 1b).
Figura 10 – a. cortes do material prontos para serem distendidos em água aquecida, b. cortes sobre a água aquecida.
5.6.8 Pescagem:
A lâmina foi mergulhada na água e o material foi coletado esticado sobre a
lâmina (Figura 11a). Em seguida, a lâmina foi colocada sobre uma platina aquecedora
para que fosse feita a secagem e a fusão da parafina impregnada no tecido, evitando
o aparecimento de microdobras (Figura 11b).
a b
a b
Figura 11 - a corte sendo pescado sobre a lâmina de vidro. b lâminas de vidro com os cortes já distendidos sobre a platina
5.6.9 Coloração:
Para a coloração foram realizados os seguintes passos:
� Desparafinação em xilol durante 10 minutos
� Hidratação em álcool:
o Imersão em álcool absoluto
o Imersão em álcool absoluto
o Imersão em álcool 95%
o Imersão em álcool 95%
� Lavagem da lâmina em água corrente durante 3 minutos
� Coração pela hematoxilina (corante básico) durante 5 minutos
� Lavagem da lâmina em água corrente durante 5 minutos
� Coração pela eosina (corante ácido) durante 30 segundos
A Figura 12 mostra os frascos de vidro com os corantes hematoxilia e eosina.
Figura 12 - Frascos de vidro com os principais corantes utilizados na confecção das lâminas histológicas.
� Desidratação do corte em álcool:
o Imersão em álcool 95%
o Imersão em álcool 95%
o Imersão em álcool absoluto
o Imersão em álcool absoluto
� Diafanização ou clareamento:
o Imersão em xilol
o Imersão em xilol
o Imersão em xilol
5.6.10 Montagem:
Para a montagem da lâmina foi colocada uma gota de resina sintética sobre a
lamínula. Sendo esta colocada e comprimida sobre o corte, espalhando a resina em
fina camada entre a lâmina e lamínula (Figura 13).
Figura 13 - Lâmina e lamínula limpas
.
5.6.11 Secagem:
Para a secagem da resina, o material foi deixado em temperatura ambiente.
5.7 Análise das lâminas histopatológicas
A leitura das lâminas foi realizada por um observador às cegas, o qual foi
descrevendo as alterações encontradas, e um outro pesquisador anotando as
informações descritas.
Para a avaliação morfológica, as imagens foram digitalizadas usando uma
câmera acoplada ao microscópio óptico e ao computador, sendo então processada a
análise. Realizou-se uma descrição dos cortes teciduais a fim de se constatar se há
ou não lesão e o grau de lesão nos animais dos diferentes grupos do estudo.
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A etapa inicial dos experimentos foi constituída de três protocolos, que
objetivaram determinar as dosagens de DEN e metamidofós que induzissem lesões
teciduais. No primeiro deles, no qual cinco animais receberiam três doses de 200
mg/kg de DEN, uma vez por semana, via intraperitoneal; dois animais morreram após
quatro e seis dias da segunda administração, respectivamente. Optou-se, então, por
não aplicar a terceira dose da substância nos animais sobreviventes. Eles foram
eutanasiados e avaliados histopatologicamente, sendo encontradas alterações como:
desorganização tecidual, acúmulo de células inflamatórias, hemorragia e necrose
(Figura 14). As lesões foram observadas em maior intensidade no fígado, em menor
intensidade no baço, rim e pulmão, e não observadas no coração. As lesões
macroscópicas podem ser observadas na Figura 15.
Segundo Velho et al (2008), o DEN (C4H10N2O) é uma substância do grupo das
nitrosaminas e em alta dose (200 mg/kg) pode induzir a carcinogênese química,
sendo considerado um carcinógeno completo por produzir a indução e a promoção
tumoral em fígado de ratos. Ao ser metabolizado no fígado, este gera um composto
intermediário reativo (radical livre), que induz ao processo de carcinogênese, que é
um processo com múltiplos estágios e que tem início com os focos de necrose no
fígado destes animais, os focos dão origem a hepatócitos alterados e nódulos de
hepatócitos hiperplásicos, sendo considerados como lesões pré-neoplásicas (LPN).
BA
DC
FE
Figura 14 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos expostos a duas doses de 200mg/kg de DEN via intraperitoneal. (A) Fígado normal (animal controle). Demais órgãos de animais inoculados com DEN, evidenciando lesões: (B e C) Fígado com intenso infiltrado inflamatório e necrose tecidual; (D) Pulmão com paredes alveolares espessadas (pulmão normal no destaque); (E) Baço com evidência de desorganização estrutural, folículos aumentados e necrose; (F) Rim com foco de infiltrado inflamatório discreto no tecido. (A, B, E e F) aumento de 40X, (C e D) aumento de 100X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
Figura 15 - Lesões macroscópicas em animal exposto ao DEN.
Com relação aos experimentos do segundo protocolo, nas doses únicas de
100 mg/kg de DEN e eutanásia após 24 horas, assim como na dose única de 200
mg/kg e eutanásia após 48 horas, também foram encontradas alterações como:
desorganização tecidual, acúmulo de células inflamatórias, hemorragia e necrose, e
mais uma vez as lesões foram mais evidentes no fígado, bem menos evidentes no
baço, rim e pulmão, e ausentes no coração. Macroscopicamente, o fígado dos dois
animais expostos ao carcinógeno apresentou manchas esbranquiçadas, sendo estas
ausentes nos animais-controle. Já microscopicamente, como mostra a Figura 16, o
fígado do rato que recebeu a maior dose mostrou-se mais comprometido, já que
continha uma maior quantidade de áreas lesionadas.
BA
DC
FE
Figura 16 - Análise histopatológica do fígado de ratos injetados com 100 ou 200mg/kg de DEN via intraperitoneal. (A e B) Fígado normal (animais injetados com NaCl 0,9%). Animais injetados com 100mg/kg de DEN evidenciando lesões: (C e E) Fígado com infiltrado inflamatório e necrose tecidual moderados. Animais injetados com 200mg/kg de DEN: (D e F) Fígado com intenso infiltrado inflamatório e necrose tecidual. Todos os aumentos são de 100X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
No terceiro protocolo, no qual foram avaliados os efeitos do metamidofós,
alguns animais que receberam a dose de 4,5 mg/kg apresentaram sangramento pelos
olhos e nariz e um apresentou contorções abdominais (indicativo de dor),
aproximadamente 30 minutos após a administração. Após esse mesmo intervalo de
tempo, tais sintomas começaram a diminuir e na manhã seguinte os animais estavam
aparentemente normais. Já no grupo que recebeu a dose de 6,0 mg/kg do agrotóxico,
todos os ratos apresentaram sangramento pelos olhos e nariz e alguns, contorções
abdominais 20 a 30 minutos depois da exposição, diminuindo a intensidade após
meia hora. Todos os animais expostos às duas maiores doses apresentaram tremor
de corpo inteiro em todas as aplicações semanais do agrotóxico, assim como
taquipnéia, e ainda, salivação excessiva, formando espuma ao redor da boca e nariz.
Esses efeitos fazem parte da chamada síndrome colinérgica aguda (RIO DE
JANEIRO, 2000) que incluem convulsões, taquicardia, taquipnéia, sangramento
através dos olhos e nariz, salivação excessiva e contorções abdominais,
demonstrando a toxicidade causada por esse agrotóxico. Os animais expostos ao
metamidofós na dose de 1,0 mg/kg visualmente não sofreram nenhum dos sintomas
dessa síndrome; verificando apenas tremor de corpo inteiro em alguns deles, porém
em intensidade muito menor que os demais grupos.
De acordo com Maretto et al (2012), a exposição aguda (24 horas) a uma dose
sub-letal de 8 mg/kg (via intraperitoneal) do agrotóxico metamidofós altera a função
de dois importantes reflexos cardiovasculares envolvidos na manutenção da pressão
arterial. Esse efeito pode ser um dos mecanismos que contribuem para a toxicidade
cardiovascular relacionada à exposição aos organofosforados.
Nas análises histológicas dos órgãos de todos os animais expostos ao
Metamidofós, sacrificados após 4 semanas e 8 semanas, nenhuma alteração
significativa foi observada, independente da dose do agrotóxico utilizada (1,0, 4,5 e
6,0 mg/kg). Entretanto, estudos utilizando a via oral (ração contaminada) por meio de
doses de 2,5 mg/kg e 5,0 mg/kg do agrotóxico (durante 90 dias) o consideraram
genotóxico e mutagênico a partir dos resultados de três testes utilizados: teste de
Ames nas cepas Salmonella typhimurium, TA98 e TA100 (KARABAY; OGUZ, 2005).
Além disso, pesquisas relatam um possível efeito do metamidofós como
desregulador endócrino; correlacionando-o, por exemplo, ao retardo no
desenvolvimento de ratos (CASTRO, CHIORATO e PINTO 2000 apud ARAÚJO,
2005), e outros artigos que o correlacionam com problemas de fertilidade em
camundongos (BURRUEL et al, 2000 apud ARAÚJO, 2005). Evidenciando, dessa
forma, que os diversos efeitos deste agrotóxico, inclusive o carcinogênico, ainda
necessitam ser mais estudados.
Com os resultados da exposição ao DEN obtidos no primeiro e segundo
momentos da primeira etapa dos experimentos padronizou-se uma única dose de 200
mg/kg de DEN via intraperitoneal. Visando-se um menor tempo de experimento e,
principalmente, menor toxicidade da exposição ao agente carcinógeno e ausência de
óbito nos animais estudados.
Na segunda etapa da pesquisa, na qual os animais depois de expostos ao
DEN passaram a ser tratados com o extrato do bagaço da uva (EBU) por 4 semanas,
o resultado do nível de lesão tecidual do grupo tratado com o extrato durante 4
semanas após o DEN foi menor quando comparado com o grupo exposto ao DEN,
porém não tratado com EBU e eutanasiados após 48 horas. Os valores de
intensidade de necrose indicam que ocorreu menor lesão no grupo DEN/EBU em
comparação ao animal exposto somente ao DEN.
A regeneração hepática deve ser considerada uma resposta natural do fígado
às agressões, mas há certas limitações nesse processo, que depende das áreas
afetadas possuírem adequado suprimento sangüíneo, drenagem livre de bile e
arquitetura hepática normal, possuindo colunas de células em regeneração com
orientação do arcabouço original de reticulina. Os hepatócitos proliferantes podem
diferir dos hepatócitos normais em algumas de suas reações enzimáticas, mas há
evidências de que eles sofram diferenciação e, dessa forma, podem substituir
aqueles hepatócitos residuais danificados e restaurar o fígado normal se a agressão
cessar (KELLY, 1993).
Quando a inflamação crônica ocorre em todo o fígado, há perda do
parênquima hepático com distorção da arquitetura hepática que resulta em fibrose e
regeneração nodular do parênquima (Kelly, 1993). Após a destruição do parênquima
hepático, pode ocorrer regeneração do parênquima, substituição por fibrose e
hiperplasia biliar (CULLEN; MACLACHLAN, 2001).
Necrose hepática extensa geralmente é seguida por regeneração do
parênquima sem fibrose, desde que o arcabouço de reticulina da porção afetada
permaneça intacto e que não haja colapso como na necrose hepática massiva
(CULLEN; MACLACHLAN, 2001). Esta é uma reação fundamental do fígado à
agressão e significa que a perda de grande quantidade de hepatócitos pode ser
completamente recuperada e o fígado poderá retornar inteiramente ao normal
(WIGHT, 1994).
No entanto, na necrose massiva ou quando a lesão for repetitiva, as áreas
afetadas irão colapsar após a remoção dos hepatócitos necróticos, resultando numa
cicatriz (cicatrização pós-necrótica ou cirrose pós-necrótica) (CULLEN;
MACLACHLAN, 2001).
Se a integridade estrutural do fígado for danificada durante a agressão celular,
a regeneração poderá ser desordenada e embora a massa hepática possa retornar
ao seu tamanho normal, as relações estruturais da arquitetura hepática não serão
restauradas e a regeneração será nodular (WIGHT, 1994), isto é, quando a necrose
hepática é contínua, o fígado tentará regenerar sua massa funcional, mas o esforço
regenerativo prolongado e a presença de dano na matriz extracelular normal do
fígado frequentemente resultam em proliferação nodular do parênquima com
distorção da arquitetura normal do fígado (CULLEN; MACLACHLAN, 2001). Essa
nodularidade pode ser causada pela constrição das faixas de tecido fibroso (KELLY,
1993).
Como não foi encontrado nenhum dos indícios de regeneração hepática nos
cortes teciduais analisados, a ação do EBU pode ser considerada quimioprotetora ou
quimiopreventiva, quando suplementado continuamente durante as etapas de
iniciação e promoção da hepatocarcinogênese.
As lesões teciduais no fígado dos ratos tratados com EBU após a exposição ao
DEN podem ser observadas na Figura 17.
BA
DC
FE
Figura 17 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos injetados com DEN 200mg/kg via intraperitoneal e tratados com EBU por 4 semanas. (A) Fígado normal (animal controle). (B) Animal tratado apenas com EBU, demonstrando aspecto normal do órgão. Demais lâminas de dois animais do grupo exposto ao DEN e tratado com EBU: (C e D) Animal 1 com foco de infiltrado inflamatório discreto no tecido. (E e F) Animal 4, sem evidência de lesão hepática. (A, B, D e F) aumento de 100X, (C e E) aumento de 40X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
As propriedades biológicas da uva têm sido estudadas mundialmente. A
avaliação de sua atividade quimioprotetora tem sido investigada em diferentes
protocolos experimentais frente ao DEN, que depende de ativação pelo sistema
metabolizador de drogas do fígado para exercer sua ação carcinogênica e tóxica. A
participação da necrose na hepatocarcinogênese, estimulando a proliferação celular e
o desenvolvimento de lesões pré-neoplásicas, é necessária na etapa de iniciação da
carcinogênese hepática (HAW et al., 2000, ESTEVÃO et al., 2002).
De acordo com Dinicola et al (2010), em estudo com linha de células humanas
de câncer de cólon (Caco-2), doses elevadas de extrato de semente de três tipos de
uva induziram uma inibição significativa no crescimento de células Caco-2. Além
disso, apontou mecanismos que conduziram a uma indução de apoptose.
No estudo de Raina e colaboradores (2007), ratos com adenocarcinoma de
próstata foram alimentados com extrato de semente de uva por sonda oral em dose
de 200 mg/kg de peso corporal, durante 4 a 28 semanas de idade. Os resultados
mostraram uma redução significativa no peso dos órgãos do trato geniturinário nos
ratos que consumiram o extrato, assim como a inibição do crescimento do câncer,
explicada pela forte supressão da progressão do ciclo celular e aumento da apoptose.
Efeitos do extrato de uva na dose de 200mg/kg foram examinados em ratos
com xenoenxerto de câncer colorretal, e sem qualquer toxicidade, tal dosagem
provocou diminuição de até 44% no volume de tumores após 8 semanas de
tratamento. O extrato inibiu a proliferação de células e aumentou a morte celular por
apoptose nos tumores (KAUR et al, 2006).
Já na terceira etapa do presente estudo, na qual os animais foram tratados
com o extrato do bagaço da uva antes da indução da lesão pelo DEN, os resultados
obtidos mostraram que não houve diferença na intensidade e grau das lesões
encontradas nestes animais quando comparados ao grupo exposto somente ao
agente carcinógeno, como demonstrado na Figura 18.
BA
DC
FE
Figura 18 - Análise histopatológica dos órgãos de ratos tratados com EBU por 4 semanas e injetados com DEN 200mg/kg via intraperitoneal. (A) Fígado normal (animal injetado com NaCl 0,9%). (B) Animal tratado apenas com o EBU, demonstrando aspecto normal do órgão. Demais lâminas de dois animais do grupo tratados com EBU e injetados com DEN: (C e D) Animal 1; e (E e F) Animal 4, ambos com infiltrado inflamatório e necrose tecidual intensa no parênquima hepático. (A, B, D e F) aumento de 100X, (C e E) aumento de 40X. Lâminas coradas com hematoxilina e eosina.
No que diz respeito à ação de subprodutos da uva na fase anterior à indução
do câncer, os dados são escassos. Em contrapartida, estudos apontam resultados
positivos do extrato de uva e/ou subprodutos como promissor agente hipolipemiante,
anti-inflamatório e anti-aterosclerótico.
Uma pesquisa avaliou o potencial quimiopreventivo da variedade de uva Vitis
vinifera em lesões de pele em ratos iniciadas pelo 7,12-dimetil-benz [a] antraceno
(DMBA) em dose única; e duas semanas após a iniciação, houve a promoção da
carcinogênese reaplicando o agente duas vezes por semana durante vinte semanas.
O tratamento tópico prévio (1 hora antes de cada aplicação) com o extrato da uva
resultou na proteção contra a tumorogênese cutânea, com a redução do número de
animais com tumor e o número de tumores por rato. Sugerindo, assim, que tal fruta
pode ser usada como um agente quimiopreventivo contra o estresse oxidativo e a
carcinogênese (ALAM et al, 2002).
Em base de dados da literatura científica, buscaram-se todos os trabalhos
experimentais, tanto in vivo quanto in vitro, que associavam a uva ou algum
subproduto da fruta à prevenção ou tratamento de carcinogenicidade. Foram
encontrados 36 trabalhos sobre o assunto, dentre estes, 12 artigos envolvendo
somente experimentos in vivo, 21 artigos contendo apenas experimentos in vitro e 3
artigos englobando ambos os métodos de pesquisa. A utilização da uva ou de seus
subprodutos se deu sempre na forma de extrato, variando sua composição em: uva
inteira, uva inteira sem semente, apenas semente, apenas casca e semente, suco da
fruta e vinho. Dos 36 artigos revisados, todos mostraram em seus resultados ao
menos um efeito benéfico do extrato direta ou indiretamente ligado ao processo de
carcinogenicidade. Na Tabela 1, encontram-se os efeitos gerais da atuação do
extrato, sendo os efeitos mais relatados o de indução de apoptose e atividade
antiproliferativa. Essa revisão mostrou que o extrato da uva, seja da própria fruta ou
seus subprodutos, tem um efeito benéfico quando relacionado ao câncer. Indicando
que tais produtos são promissores, podendo exercer uma ação quimiopreventiva e/ou
quimioterápica.
Tabela 1 – Quantidade de trabalhos experimentais sobre a atuação do extrato de uva ou de
seus subprodutos na carcinogenicidade, descritos na literatura até meados de outubro do ano
de 2012.
Tipo de trabalho Resultado encontrado
In vivo In vitro Apoptose 06 15
Inibição do estresse oxidativo 02 -
Proteção do sistema imunitário 01 -
Redução do crescimento de células cancerosas
04 12
Diminuição da proliferação celular 06 04
Aumento do dano ao DNA 01 02
Atividade antimetastática 02 01
Atraso na formação de tumor 01 -
Diminuição na incidência de tumores 01 -
Supressão da progressão do ciclo celular
02 01
Redução no percentual de implante 01 -
Redução do índice de invasão 02 -
Prevenção dos danos induzidos por UV 01 -
Fonte: ALAM et al., 2002; AGARWAL et al., 2002; CHATELAIN et al, 2011; CHEN et al., 2009; DHANALAKSHMI et al., 2003; DINICOLA et al., 2010; DINICOLA et al.,, 2012; FILIP et al., 2011; GAO, 2009; HANAUSEK et al., 2011; HUANG et al., 2008; HUDSON et al.,2007; KAUR et al., 2006; KAUR et al., 2008; KAUR et al., 2011; KIM et al., 2004; LAZZÈ et al, 2009; LEIFERT et al., 2008; MARTÍNEZ et al., 2005a; MARTÍNEZ, 2005b; MENIN et al., 2011; MORRÉ et al., 2006; PARK et al., 2011; RAINA, 2007; RAMCHANDANI, 2008; SHANG et al., 2008; SHARMA et al., 2004; SHROTRIYA et al., 2012; SINGH, 2004; SINGLETARY et al., 2003; TYAGI et al., 2003; VELIOGLU; et al., 1998; VELMURUGAN et al., 2010a; VELMURUGAN et al., 2010b; WEN et al., 2008; UCHINO et al., 2010
7 CONCLUSÕES
Baseando-se no fato de que no grupo de animais tratados com o extrato do
bagaço da uva após a exposição ao carcinógeno não houve achados de regeneração
hepática - como perda do parênquima hepático com distorção da arquitetura hepática
que resulta em fibrose, e regeneração nodular do parênquima por meio da
substituição por fibrose e hiperplasia biliar; assim como cicatrização pós-necrótica -
pode-se considerar um possível efeito protetor do extrato do bagaço da uva Moscato
canelli na carcinogênese química experimental pela inibição da iniciação e promoção
de lesões pré-neoplásicas em ratos. Esse possível efeito foi observado apenas
quando a suplementação foi empregada durante os estágios iniciais da
carcinogênese.
Animais tratados com o extrato anteriormente à exposição ao DEN não tiveram
proteção contra as lesões hepáticas provocadas pelo carcinógeno, na dose e tempo
utilizado nesse estudo, necessitando de mais estudos para identificar um possível
potencial quimiopreventivo da uva Moscato canelli.
Apesar dos resultados obtidos colaborarem com a utilização do bagaço da uva
como um possível agente protetor, maiores estudos são necessários para
compreender os mecanismos envolvidos nesses processos e para um promissor
emprego do bagaço como adjuvante no tratamento do câncer.
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