universidade federal do triângulo mineiro instituto de ciências...
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Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Instituto de Ciências Tecnológicas e Exatas
Programa de Mestrado Profissional em Inovação Tecnológica
Willian Cardoso Gonçalves da Rocha
Purificação da Cefalosporina C por cromatografia de troca iônica em coluna
de leito fixo
Uberaba
2014
Willian Cardoso Gonçalves da Rocha
Purificação da Cefalosporina C por cromatografia de troca iônica em coluna de leito
fixo
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado Profissional em Inovação
Tecnológica da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro, como parte dos
requisitos necessários para obtenção do
título de mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Ana Claudia
Granato Malpass
Co-orientador: Prof. Dr. Marlei Barboza
Passoto
Uberaba
2014
Dedicatória
Primeiramente a Deus, que na sua infinita bondade me deu forças para poder
superar mais esse desafio em minha trajetória.
Aos meus pais, que sempre com muito amor me ensinaram a maior lição da vida
que é ser um homem de caráter e estão comigo sempre.
Aos meus amigos, da “Galera do abadá”, André, Fernanda, Franco, Gustavo, Wilian,
Anderson, André, Bruno, Naidel e Daniel, aos meus amigos de Uberaba, André,
Solon, Johnny, Tiago, Rogério, Alexandre, Cadu e João, pela amizade, por
compartilharem os momentos bons e ruins, pelo apoio e confiança.
Agradecimentos
Aos meus orientadores, professora Ana Claudia pela enorme compreensão, apoio,
dedicação, motivação, ensinamentos e amizade demonstradas nos momentos mais
críticos e ao longo de todo este período de trabalho. E ao professor Marlei pela
oportunidade concedida, pelos ensinamentos, por confiar em mim para executar
este projeto e pela amizade dedicada. Tenho certeza que, em breve, Deus lhe dará
forças para superar essa batalha e o colocará em condições de estar conosco
novamente.
Ao professor Geoffrey, pelo apoio ao emprestar seus equipamentos e ajuda na
interpretação de dados do trabalho, à professora Mônica pelo apoio quando foi
necessário e por participar com sugestões na qualificação. Ao professor Marcelo por
também participar com sugestões na qualificação.
À Thaíla minha companheira de mestrado por me ajudar diversas vezes durante
este trabalho e por compartilhar sua amizade comigo.
A toda equipe de funcionários do ICTE da UFTM pela ajuda prestada em vários
momentos.
Ao pessoal da UFSCar, pelo auxílio em me emprestar materiais e realizar as
análises de HPLC necessárias para a conclusão do trabalho.
Aos meus companheiros de trabalho do time de laboratório da FMC, pelos
ensinamentos e amizade. Em especial ao Luis Borges pela oportunidade dada e
confiança demonstrada.
“Mil cairão ao teu lado, e dez mil à tua direita, mas não chegará a ti.”
(Salmos 91:7, A Sagrada Bíblia.)
SUMÁRIO
RESUMO.......................................................................................................................I
ABSTRACT..................................................................................................................II LISTA DE ILUSTRAÇÕES.........................................................................................III LISTA DE TABELAS...................................................................................................V LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS...............................................................VI
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................4
2.1 CEFALOSPORINA C (CPC)..............................................................................4
a) Descoberta.....................................................................................................4
b) Estrutura química..........................................................................................4 c) Mecanismos de atuação e inibição..............................................................5 d) Via metabólica biossintética........................................................................6 e) Produção......................................................................................................10
2.2 PROCESSO DE DOWNSTREAM: OPERAÇÕES UNITÁRIAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS ORIUNDOS DE BIOPROCESSOS........................................................................13 2.3 PROCESSO DE ADSORÇÃO.........................................................................16
2.3.1 Mecanismos de separação....................................................................17 2.3.2 Propriedades dos adsorventes.............................................................19 2.3.3 Relações de equilíbrio no processo de adsorção...............................20 2.3.4 Modos de operação................................................................................24
2.3.5 Adsorção por troca iônica.....................................................................28
2.3.6 Purificação da CPC através de processos de adsorção.....................30
3. MATERIAIS E METODOLOGIA............................................................................33
3.1 PREPARO DAS COLUNAS E CORRIDAS CROMATOGRÁFICAS................33
3.2 CÁLCULOS DOS PARÂMETROS DA COLUNA.............................................37 3.3 CINÉTICA E ISOTERMA DE ADSORÇÃO......................................................40 3.4 SEPARAÇÃO CPC E METIONINA..................................................................41
4. RESULTADOS.......................................................................................................43
4.1 PERFIS DE ELUIÇÃO DA CPC.......................................................................43 4.2 CURVAS DE RUPTURA DA CPC...................................................................48 4.3 CINÉTICA E ISOTERMA DE ADSORÇÃO......................................................57
4.3.1 Cinética de adsorção da CPC na resina IRA410................................57
4.3.2 Isoterma de adsorção da CPC na resina IRA410 a 30°C...................59
4.4 SEPARAÇÃO CPC METIONINA.....................................................................61
5. CONCLUSÕES......................................................................................................65 6. TRABALHOS FUTUROS.......................................................................................67
7. REFERÊNCIAS......................................................................................................68 ANEXO.......................................................................................................................72
I
RESUMO
Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a viabilidade do processo de
purificação do antibiótico Cefalosporina C (CPC) através da cromatografia de troca-
iônica em coluna usando como fase estacionária a resina de troca aniônica
Amberlite IRA 410. Apesar do uso da cromatografia por troca iônica ser conhecida
no processo de purificação da CPC, a maioria da literatura disponível encontra-se na
forma de patentes, isso restringe o acesso ao conhecimento do processo como um
todo. Para avaliar a viabilidade do uso da resina de troca aniônica amberlite IRA 410
no processo de purificação da CPC foram realizados experimentos usando uma
coluna cromatográfica empacotada com a resina. Na primeira etapa estudou-se a
interação da CPC com a resina. Estes experimentos mostraram que a resina é
capaz de adsorver bem a CPC, com pico bem definido e perfil de adsorção e eluição
similar nas concentrações estudadas. Foram obtidas também as curvas de ruptura
da CPC, em três diferentes vazões. E através das mesmas alguns parâmetros que
são importantes, como eficiência do uso do leito, eficiência de recuperação do
produto e produtividade foram calculados. Os resultados mostraram que o processo
em coluna tem eficiências de remoção de CPC acima de 90% para todas as vazões
estudadas. Também foi estudado o processo de adsorção da CPC na resina através
curva de cinética e da isoterma de adsorção a 30°C, mostrando que o processo
atinge o equilíbrio rapidamente e para concentrações estudadas obteve-se dados
que foram melhores ajustados ao modelo linear de isoterma. Por fim, testou-se a
possibilidade de purificar um caldo simulado contendo a CPC e o aminoácido
metionina, a estratégia usada para separação dos componentes foi satisfatória e foi
possível promover a separação da CPC e a metionina nas condições estudadas.
Palavras-chave: Cefalosporinas, Cromatografia, Troca iônica.
II
ABSTRACT
This work was to evaluate the feasibility of the process of purification of the antibiotic
cephalosporin C (CPC) by ion-exchange chromatography column as stationary
phase using the anion exchange resin Amberlite IRA 410. Spite of the use of
chromatography be known in ion exchange purification of the CPC process, most of
the available literature is in the form of patents, that restricts access to the knowledge
of the process as a whole. To evaluate the feasibility of using anion exchange resin
Amberlite IRA 410 in the purification process of the CPC experiments were
performed using a chromatographic column packed with the resin. In the first step we
studied the interaction of CPC with the resin. These experiments showed that the
resin is able to adsorb much CPC with well-defined peak and similar adsorption and
elution profile at the concentrations studied. The breakthrough curves of CPC were
also obtained at three different flow rates. And through some of the same parameters
that are important, such as efficient use of the bed, recovery efficiency and product
yield were calculated. The results showed that the process has column CPC removal
efficiencies above 90% for all flow rates studied. The adsorption of CPC was studied
using the resin kinetics and adsorption isotherm at 30°C curve showing the process
rapidly reaches equilibrium concentrations studied and obtained data were best fi tted
to a linear isotherm model. Finally, we tested the possibility to purify a simulated
broth containing the CPC and the amino acid methionine, the strategy used for the
separation of components was satisfactory and it was possible to promote the
separation of CPC and methionine under the conditions studied.
Keywords: Cephalosporins, Chromatography, Ion Exchange.
III
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 - MOLÉCULA DA CEFALOSPORINA C (CPC)..........................................5
FIGURA 2 - PERFIL DE CONCENTRAÇÃO DE GLICOSE, CRESCIMENTO
CELULAR E DE PRODUÇÃO DE CPC DURANTE UMA FERMENTAÇÃO EM BATELADA ALIMENTADA...........................................................................................7 FIGURA 3 - ROTA BIOSSINTÉTICA DA CPC.............................................................8
FIGURA 4 - MECANISMOS CROMATOGRÁFICOS.................................................18
FIGURA 5 - MODELOS DE ISOTERMAS COMUNS: LINEAR, FREUNDLICH E LANGMUIR.................................................................................................................22
FIGURA 6 - PERFIS CINÉTICOS DA ADSORÇÃO DA CPC NA RESINA NEUTRA
XAD2..........................................................................................................................23
FIGURA 7 - PERFIS DE CONCENTRAÇÃO DO ADSORBATO NA COLUNA.........26 FIGURA 8 - ESQUEMA DE MONTAGEM DE COLUNA CROMATOGRÁFICA........27 FIGURA 9 - MECANISMO DE TROCA IÔNICA........................................................29 FIGURA 10 - COLUNAS USADAS NO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...........33 FIGURA 11 - ESPECTRO DE ABSORBÂNCIA DA CPC NA REGIÃO DO ULTRAVIOLETA.........................................................................................................35
FIGURA 12 - ARRANJO EXPERIMENTAL COM CONTROLE DE TEMPERATURA E VAZÃO.......................................................................................................................36 FIGURA 13 - REPRESENTAÇÃO DA CURVA DE RUPTURA COM A DIVISÃO EM ÁREAS.......................................................................................................................39 FIGURA 14 – COMPARATIVO DOS CROMATOGRAMAS DA CPC NAS DIFERENTES CONCENTRAÇÕES ESTUDADAS....................................................45
FIGURA 15 - PERFIL DE ELUIÇÃO DA CPC APÓS TENTATIVA DE OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO.........................................................................................................47 FIGURA 16 – COMPARATIVO DAS CURVAS DE RUPTURA DA CPC NAS VAZÕES DE 2,8, 4,0 E 5,3 mL.min-1.........................................................................49 FIGURA 17 – COMPARATIVO DAS CURVAS DE RUPTURA COM CONTROLE DE TEMPERATURA E VAZÃO.......................................................................................53
III
IV
FIGURA 18 – CINÉTICA DE ADSORÇÃO DA CPC NA RESINA IRA410 A 30°C...57 FIGURA 19 – AJUSTE DA CINÉTICA DE ADSORÇÃO DA CPC NA RESINA IRA410 AOS MODELOS DE REAÇÃO DE PRIMEIRA E SEGUNDA ORDEM......................58 FIGURA 20 ISOTERMA DE ADSORÇÃO DA CPC NA RESINA IRA410 A TEMPERATURA DE 30°C.........................................................................................60 FIGURA 21 CROMATOGRAMA OBTIDO DA SEPARAÇÃO ENTRE CPC E
METIONINA................................................................................................................62
FIGURA 22 ESTADOS DA MOLÉCULA DA METIONINA DE ACORDO COM SEU
pK...............................................................................................................................63
V
LISTA DE TABELAS TABELA 1 - EXEMPLOS DE CEFALOSPORINAS SEMISSINTÉTICAS....................5 TABELA 2 - PRINCIPAIS OPERAÇÕES UNITÁRIAS ENVOLVIDAS EM CADA ETAPA DO PROCESSO DE DOWNSTREAM...........................................................15
TABELA 3 - PRINCIPAIS MATERIAIS USADOS COMO ADSORVENTES EM PROCESSOS DE ADSORÇÃO.................................................................................19 TABELA 4 - CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS USADAS PARA OBTENÇÃO DAS CURVAS DE RUPTURA DA CPC EM COLUNA EMPACOTADA COM A RESINA IRA 410 EXP. 1, 2, 3..................................................................................................35 TABELA 5 - CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS USADAS PARA OBTENÇÃO DAS CURVAS DE RUPTURA DA CPC EM COLUNA EMPACOTADA COM A RESINA IRA 410 EXP. 4, 5, 6..................................................................................................36 TABELA 6 - PARÂMETROS EXPERIMENTAIS PARA OTIMIZAÇÃO DA ELUIÇÃO DA CPC......................................................................................................................37 TABELA 7 - CONDIÇÕES USADAS PARA A OBTENÇÃO DAS CURVAS DE RUPTURA COM CONTROLE DE VAZÃO E TEMPERATURA.................................37 TABELA 8 - PARÂMETROS DA COLUNA NAS TRÊS VAZÕES ESTUDADAS.......50
TABELA 9 - PARÂMETROS DA COLUNA PARA OS EXPERIMENTOS REALIZADOS COM CONTROLE DE TEMPERATURA E VAZÃO............................55
VI
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
CPC - Cefalosporina C
Cef C - Cefamicina C
DAC - Deacetilcefalosporina C
DAOC - Deacetoxicefalosporina C
Co - Concentração inicial
C - Concentração na saída da coluna
Cf* - Concentração final na fase líquida
q* - Concentração final na fase sólida
t - tempo
tb - Tempo de ruptura
tu - Capacidade usada do leito
tt - Tempo total
te - Capacidade estequiométrica do leito
εf - Eficiência de uso do leito
εr - Eficiência de remoção do soluto
P- Produtividade da coluna
A1 - Área referente à região de uso eficiente do leito da curva de ruptura
A2 - Área referente à região de capacidade do leito da curva ruptura
A3 - Área referente à região de uso ineficiente do leito da curva de ruptura
K - Constante dos modelos de isotermas
R2 - Coeficiente de correlação do ajuste dos dados
1
1. INTRODUÇÃO
A descoberta dos antibióticos β-lactâmicos se deu por acaso em 1929,
quando A. Flemming notou que o crescimento de colônias bacterianas havia sido
inibido por alguma contaminação presente no meio de cultura. Sua investigação
levou-o a descobrir que sua cultura havia sofrido uma contaminação pelo fungo
Penicillium chrysogenum. A substância responsável pela inibição do crescimento
das colônias bacterianas produzida pelo fungo foi descoberta, caracterizada e
recebeu o nome de penicilina (MUNIZ et al, 2007).
O sucesso da penicilina para fins terapêuticos alavancou a indústria de
produtos biotecnológicos. Esse sucesso também fez com que surgissem novas
linhas de pesquisa, tanto no desenvolvimento de novas moléculas quanto também
no melhoramento de processos produtivos e de purificação de compostos
antimicrobianos.
Em 1945 uma nova classe de β-lactâmicos foi descoberta por G. Brotzu ao
pesquisar sobre a febre tifoide na Itália. Após alguns anos, essa nova classe foi
caracterizada e nomeada como cefalosporinas (MUNIZ et al, 2007). O mecanismo
de atuação das cefalosporinas é semelhante ao das penicilinas inibindo a síntese da
parede celular das bactérias, porém é mais resistente às β-lactamases bacterianas.
Seu amplo espectro de ação possibilita o combate a patógenos Gram-positivos e
Gram-negativos (PAGE e LAWS, 2000).
Além das penicilinas e cefalosporinas, existem também os carbafens, as
clavamas e as monobactanas. Todas essas classes de compostos β-lactâmicos tem
em comum a presença do anel β-lactâmico que é diretamente responsável pela
atividade antimicrobiana. As diferenças entre as classes se baseiam no segundo
anel ligado ao anel β-lactâmico, e na posição onde são inseridos alguns ligantes
(DEMAIN e ELANDER, 1999).
Os compostos β-lactâmicos respondem por uma importante fatia do
mercado de antimicrobianos. No ano de 2009 as vendas das cefalosporinas
atingiram um total de US$ 11,9 bilhões, representando 28% do total de antibióticos
vendidos no mundo todo, o maior percentual dentre todas as classes de β-
lactâmicos (HAMAD, 2010). Os grandes valores econômicos aliados aos bons
resultados terapêuticos demonstram a importância desses compostos, e dessa
forma, o interesse no desenvolvimento de novas moléculas e também o
2
melhoramento dos processos produtivos e de purificação se tornaram áreas de
extensa investigação.
A literatura existente referente aos compostos β-lactâmicos é extensa e
nota-se também a existência de diversas patentes ligadas à produção e purificação
destes compostos. Dentro do grupo das cefalosporinas, a cefalosporina C (CPC) se
destaca, apesar de não ser usada diretamente como medicamento, é precursora de
diversas cefalosporinas semissintéticas, excelentes antimicrobianos de amplo
espectro contra patógenos Gram-negativos (DEMAIN e ELANDER, 1999).
A produção da CPC é realizada via fermentação submersa pelos fungos
Cephalosporium acremonium e Acremonium chrisogenum. Devido à complexidade
do caldo fermentativo, de onde se extrai o antibiótico, são necessárias diversas
etapas de purificação, sendo que as mesmas são responsáveis por cerca de 50% do
custo total de produção do antibiótico. Dentre as operações envolvidas no processo
de recuperação da CPC, podem ser citadas: Moagem para o rompimento das
células, centrifugação, filtração em diversas escalas, purificação de baixa resolução
por extração e ultrafiltração, e purificação de alta resolução normalmente realizada
por cromatografia (ELANDER, 2003).
As etapas de purificação da CPC devem proporcionar alta pureza do produto
recuperado, devido à finalidade de uso que é produzir fármacos. Dessa forma, a
técnica mais comumente usada para atingir esse objetivo é a cromatografia de
adsorção em colunas de leito fixo. Na literatura encontram-se diversos estudos a
cerca da purificação da CPC usando cromatografia por adsorção com resinas
neutras. Através desta técnica é possível obter a molécula com alto grau de pureza,
porém, a capacidade de adsorção dessas resinas é baixa (BARBOZA, ALMEIDA e
HOKKA, 2003). Esse fato motiva a investigação de alternativas para se purificar o
caldo fermentativo de produção da CPC.
A técnica de cromatografia por troca-iônica apresenta-se como uma
possibilidade para purificar a CPC, haja vista o emprego desta técnica na purificação
de outros antibióticos β-lactâmicos como a cefamicina C (OLIVEIRA et al, 2011) e o
ácido clavulânico (BARBOZA, HOKKA e MAUGERI, 2002). Apesar desta técnica já
ter sido investigada na purificação de outros antibióticos, na literatura pouco se
encontra sobre a aplicação da mesma na purificação da CPC. Encontram-se apenas
patentes a cerca do tema (Mc CORNICK e MACK, 1969; VOSER, 1973).
3
O objetivo principal do presente trabalho foi verificar a viabilidade do uso da
técnica de cromatografia de troca iônica no processo de purificação da CPC
empregando-se a resina amberlite IRA410 de troca aniônica como recheio da
coluna.
Os objetivos específicos foram: Obter o perfil de eluição da CPC após a
passagem da mesma através de uma coluna recheada com a resina. Obter as
curvas de ruptura da CPC na coluna e os parâmetros operacionais do sistema. E por
último, promover a separação da CPC do aminoácido metionina tido como
contaminante a partir de um caldo simulado contendo a CPC e o aminoácido.
Primeiramente estudou-se a interação da resina com uma solução contendo
apenas a CPC. Esta etapa foi abordada de duas formas. Na primeira foram
realizados experimentos que permitissem a obtenção do perfil de adsorção e
dessorção da CPC na resina IRA 410 usando solução de NaCl 4,0% m/V na etapa
de eluição. Os resultados mostraram que a resina é capaz de adsorver a CPC em
diferentes concentrações e a solução de NaCl consegue deslocar a CPC da resina
fazendo com que ela seja eluída da coluna. Na segunda etapa foram obtidas as
curvas de ruptura da CPC na coluna em diferentes vazões. Através da curva de
ruptura é possível obter parâmetros importantes, como a eficiência de uso do leito e
a produtividade do processo. Por fim, testou-se a tentativa de separação da mistura
de CPC com o aminoácido metionina, presente no caldo fermentado e tido como
contaminante.
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 CEFALOSPORINA C (CPC):
A) Descoberta: A cefalosporina C (CPC) pertence à classe das
Cefalosporinas e leva essa nomenclatura pelo fato de ter sido a primeira molécula
deste grupo a ser descoberta. Esse composto foi descoberto em 1945, quando o
Professor G. Brotzu investigava casos de febre tifoide na ilha da Sardenha, durante
suas observações ele notou que um grupo de pessoas que se banhava em águas
residuais não contraia a doença. Seus estudos mostraram que a água continha o
fungo Cephalosporium acremonium, e que o mesmo era capaz de produzir uma
substância que inibia o crescimento da Salmonella typhii, bactéria que causa a febre
tifoide. Brotzu então enviou amostras desse fungo para Newton e Abraham em
Oxford. Em 1955, esses pesquisadores descobriram que essa cepa produzia uma
substância capaz de inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas, além de ser estável em pH ácido e também resistente às β-lactamases
bacterianas. Essa substância foi isolada, caracterizada e nomeada como
Cefalosporina C (CPC) (MUNIZ et al, 2007; DEMAIN e ELANDER, 1999).
B) Estrutura Química: As cefalosporinas apresentam como característica
marcante a presença de uma parte da molécula formada pelo anel β-lactâmico
ligado a outro anel de 6 membros denominado de di-hidrotiazina. Esse núcleo
bicíclico é denominado núcleo Cefem e esse núcleo é comum a todas as classes de
cefalosporinas. No caso da CPC o esqueleto principal da molécula é constituído pelo
ácido 7-aminocefalosporânico (7-ACA), composto pelo núcleo cefem mais a cadeia
lateral D-α-ácido aminoadípico, todos esses grupos podem ser observados na figura
1.
5
Figura 1 - A molécula da cefalosporina C, em detalhe as principais regiões da molécula.
N
SNO
NH2
OO
OHO
O O
CH3
OH
Anel lactâmico
Anel di-hidrotiazina
Núcleo Cefem
Ácido 7-ACA
H
Fonte: O AUTOR, 2014 (Desenho no programa ChemWindow).
C) Mecanismos de atuação e inibição: A CPC não é um antibiótico potente
quando usado diretamente, e por isso, não é comercializada para fins terapêuticos,
seu uso principal é como precursor de cefalosporinas semissintéticas, que são
antibióticos mais potentes e de amplo espectro, capazes de combater patógenos
gram-positivos e negativos, além de apresentarem maior resistência às β-
lactamases bacterianas. As cefalosporinas semissintéticas são produzidas a partir
de modificações estruturais na molécula da CPC e são classificadas em gerações,
de acordo com seu espectro de ação e sua resistência às β-lactamases (ELANDER,
2003). Na tabela 1 são citadas algumas moléculas e suas respectivas gerações.
Tabela 1 - Exemplos de Cefalosporinas semissintéticas.
Geração Cefalosporinas semissintéticas
1ª Geração Cefalotin, cefradina, cefadroxila, cefazolin, cefalexina.
2ª Geração Cefuroxina, cefaclor, cefotetam, cefmetazola, cefonicida.
3ª Geração Cefixima, ceftibutena, cefizoxima, ceftriaxona, cefamandol
Cefoperazona, cefotaxima, proxetil,
Cefprozil, ceftazidima, cefuroxima, cefpodexima.
4ª Geração Cefepima.
Fonte: (Adaptado de ELANDER, 2003).
Existem diversas classes de antibióticos β-lactâmicos, como as pencilinas,
as cefalosporinas, as clavamas e os carbapenens. Esses antibióticos apresentam
mecanismo de atuação semelhante, atuando na inibição das enzimas
transpeptidases bacterianas, responsáveis pela catálise da reação de formação das
6
ligações cruzadas da parede celular. O efeito da inibição dessa reação gera uma
parede celular fraca e de fácil rompimento. A ação antibacteriana dos compostos β-
lactâmicos está intimamente ligada ao anel -lactâmico. A reação se baseia na
acilação de sítios nucleofílicos da enzima, modificando seu sítio ativo e fazendo com
que a mesma perca sua atividade (PAGE e LAWS, 2000). A inibição da atividade
dos compostos β-lactâmicos é realizada pela enzima bacteriana β-lactamase, essa
enzima cliva o anel β-lactâmico e gera como produto um composto sem atividade
antibacteriana (FISHER, MEROUEH e MOBASHERY, 2005).
D) Via metabólica biossintética: Segundo Demain, a molécula da CPC é
resultado do metabolismo secundário do microrganismo (DEMAIN, 1971).
Inicialmente, durante a fase de crescimento ou fase log, o fungo realiza o
metabolismo primário, sintetizando as proteínas, carboidratos e outras moléculas
que darão origem às organelas necessárias para sobrevivência e reprodução. A
CPC começa a ser observada no meio quando termina a fase de crescimento do
fungo e o mesmo entra na idiofase ou fase lag. Nessa fase observa-se pouco
aumento de biomassa do microrganismo e aumento da concentração de antibiótico
no meio, fruto de reações do metabolismo secundário (CALAM, 1987). Este
comportamento descrito pode ser observado na figura 2, que mostra os perfis de
quantidade de biomassa, de concentração de glicose para alimentação e de
concentração de CPC durante um processo de fermentação.
O metabolismo secundário é composto de reações paralelas às que estão
dedicadas a suprir as necessidades essenciais do organismo e, aparentemente, não
tem importância direta para o crescimento e reprodução dos mesmos, porém, seus
metabólitos se mostram importantes para os mecanismos de defesa da célula
(CUNHA, 1975). E mesmo desempenhando funções bem distintas, as rotas primária
e secundária do metabolismo exibem um complexo mecanismo de regulação,
competindo por moléculas que são intermediárias chaves para ambas.
7
Figura 2 - Perfil de concentração de glicose, crescimento celular e de produção de CPC
durante uma fermentação em batelada alimentada com taxa de alimentação de 10,3 ml/h.
(Fonte: Adaptado de SILVA, 1998).
A rota biossintética da CPC começa com a síntese de três aminoácidos, a
valina, a cisteína e o ácido α-aminoadípico. O primeiro passo da via é a reação da
cisteína com o ácido α-aminoadípico, posteriormente, o produto reage com a valina,
originando o tripeptídeo LLD-ACV (δ-(L-α-aminoadipil)-L-cistenil-D-valina). A primeira
e a segunda reações são catalisadas pela enzima aminoadipil-cistenil-valina sintase
(ACV-sintase). Esse intermediário sofre uma reação de ciclização e dá origem à
isopenicilina N, catalisada pela enzima ciclase. Através de uma epimerização a
isopenicilina N é convertida em penicilina. No próximo passo, a penicilina é
convertida pela enzima expandase em Deacetoxicefalosporina C (DAOC) através de
uma expansão no anel, a mesma enzima converte o DAOC em
Deacetilcefalosporina C (DAC), e por fim, o DAC reage com uma acetil-coenzima
catalisada pela enzima Deacetilcefalosporina C acetiltransferase dando origem à
CPC (DEMAIN e ELANDER, 1999).
Durante as últimas décadas com as principais enzimas envolvidas na via
sintética identificadas, bem como os intermediários da via, os estudos mostraram
que a via biossintética das cefalosporinas está intimamente ligada à via das
Penicilinas e também das cefamicinas. Alguns pontos críticos da via se diferem e
levam a formação de um ou outro desses compostos. Outro ponto descoberto é que
nenhum microrganismo é capaz de realizar todas as vias e produzir todos os
8
compostos (DEMAIN e ELANDER, 1999). A figura 3 mostra o fluxograma da via
biossintética da CPC.
Figura 3 - Rota sintética da CPC.
(Adaptado de DEMAIN e ELANDER, 1999).
H2N
COOH
COOH
H2N
COOH
SH H2N
COOH
Ácdio-L-a-aminoadípico L-Cisteína L-Valina
ACV Sintase
H2N N
N
SH
COOH O
COOHO
H
H
IPN Sintase
H2N N
NCOOH O
O
S
COOH
H
N
NO
O
S
COOH
H
Penicilina G
DAOC Sintase
H2N N
NCOOH O
O
S
COOH
H
DAC Sintase
HH2N N
NCOOH O
O
S
COOH
OH
DAC-Acetiltransferase
H2N N
NCOOH O
O
S
OCONH2
COOH
H
Cefalosporina C
O-Carbamoil-DAC (OCDAC)
7-a-Hidroxi-OCDAC
Cefamicina C
HH2N N
NCOOH O
O
S
OCOCH3
COOH
OCH3
9
Com os processos metabólicos de produção da CPC elucidados, os
pesquisadores passaram então a investigar as possíveis regulações metabólicas
que poderiam resultar em aumento da produção da CPC. Vários estudos reportam
importantes descobertas a cerca do tema. Demain, Newkirk e Hendlin (1963)
demonstraram que através do atraso do metabolismo secundário poderia obter-se
um maior rendimento na produção de CPC. Isso acontece porque no inicio da fase
de crescimento, o microrganismo é sensível ao seu próprio antibiótico. Porém, após
o crescimento, o mesmo torna-se resistente. Os autores testaram o efeito da
manipulação do meio externo, variando a composição da fonte de carboidratos
presente no meio em glicose e sacarose. Como resultado foi observado o consumo
preferencial da glicose na fase de crescimento, resultando em alta taxa de
crescimento do fungo, e quando o microrganismo passou a usar a sacarose como
fonte de carbono observou-se o surgimento do antibiótico no meio. À opção de usar
primeiramente a glicose na fase de crescimento atribuiu-se ao fato deste carboidrato
ser mais facilmente metabolizado, disponibilizando energia rapidamente ao
microrganismo. Outro fato observado mais tarde é o efeito repressor que a glicose
causa em algumas enzimas da via de produção do antibiótico (BEHMER e DEMAIN,
1983).
O fenômeno de consumir preferencialmente um substrato a outro é
denominado diauxia, segundo Schelegel (1990), com Cephalosporium acremonium
acontece com a glicose em relação à sacarose durante a fase de crescimento. A
composição do meio em sacarose e glicose 2,7 e 3,6%, respectivamente, mostrou-
se uma maneira viável de atrasar o metabolismo secundário de produção do
antibiótico em relação ao metabolismo primário, resultando em altas taxas de
crescimento celular e de produção de CPC.
Procurando estabelecer a relação entre a concentração de glicose no meio e
a produção de antibiótico, Zanca e Martin (1983) adicionaram diferentes
concentrações deste carboidrato no momento da inoculação do microrganismo e os
resultados deste experimento mostraram que o crescimento celular era proporcional
a quantidade de carboidrato adicionada. Porém a quantidade de antibiótico
produzido era máxima a uma concentração de cerca de 20 g.L-1 de glicose. Acima
dessa concentração a produtividade caía, indicando o efeito repressor da glicose, e
abaixo deste valor, a produtividade foi prejudicada devido ao baixo crescimento
celular do microrganismo.
10
Demain, Newkirk e Hendlin (1963) também mostraram o papel da metiotina
como promotor da produção da CPC. Esse estudo mostrou que a ausência deste
aminoácido durante o processo resulta em uma baixa na produção do antibiótico.
Esse efeito foi creditado ao fato de que a metionina seria a molécula que fornece o
átomo de enxofre para a CPC, sendo convertida na cisteína que entra na via. Mais
tarde, Drew e Demain (1977) descobriram que além de fonte de enxofre, a metionina
estimula algumas enzimas da via metabólica. O estudo de Matsumara (1981), onde
linhagens do C. acremonium são comparadas, mostrou que a capacidade de
acumular a metionina dentro da célula após o período de crescimento celular leva a
melhores níveis de produção de antibiótico pelo microrganismo.
As fontes de nitrogênio também são alvo de estudos visando aumentar a
produtividade de CPC. Shen e colaboradores (1984) estudaram a influência de
fontes orgânicas e inorgânicas de nitrogênio adicionadas ao meio de fermentação,
os resultados mostraram que fontes inorgânicas como o nitrato de potássio levam a
baixos rendimentos na produção de CPC, ao contrário de fontes orgânicas como a
arginina e a asparagina. Os resultados apontaram também que o íon amônio é
capaz de exercer uma influência negativa sobre a atividade de algumas enzimas da
via sintética da CPC, proporcionando decréscimo na produção do antibiótico. Além
dos estudos citando a importância das fontes de carbono, enxofre e nitrogênio
encontram-se ainda na literatura pesquisas que também relatam a influência do
fósforo (ZHANG, WOLFE e DEMAIN, 1988) e da presença de outros compostos
inorgânicos nas culturas que visam produzir a CPC (BAILEY e OLLIS, 1986).
E) Produção: A produção industrial da CPC é realizada atualmente pelo
processo de fermentação em batelada alimentada, em que a matriz energética pode
ser tanto carboidratos simples, complexos ou até mesmo óleos ricos, como o óleo de
soja. Como fonte de nitrogênio no processo são usados semente de algodão e soja,
e também amônia e sulfato de amônia, que contribuem com a regulação do pH. A
água de maceração do milho também é adicionada, contribuindo como fonte de
aminoácidos, vitaminas e elementos traço. A disponibilidade de oxigênio dissolvido é
um fator de extrema importância durante o processo fermentativo, pois, as
expressões máximas das enzimas ciclase e expandase estão intimamente ligadas a
esse fator e essa disponibilidade resulta em rápida produção de CPC. A metionina
também é adicionada no processo e sua função, além de fonte de enxofre, é ajudar
11
no aumento da eficiência da transformação do micélio em atrosporo e é na forma de
atrosporo que o microrganismo produz a CPC. O pH e a temperatura do processo
também são controlados e mantidos nas faixas de 6,2 a 7,0 e 24 a 28°C,
respectivamente (ELANDER, 2003).
Apesar da produção em larga escala realizada por batelada alimentada ser
um processo eficiente e de alta produtividade (ELANDER, 2003), encontram-se na
literatura diversos estudos a cerca de variações em parâmetros operacionais
visando reduzir custos e aumentar a produtividade. As fermentações em batelada
alimentada permitem a variação da composição do meio durante o processo. Dessa
forma, é possível realizar fermentações onde os nutrientes necessários para a fase
de crescimento do microrganismo são diferentes daqueles necessários para a
produção do produto de interesse. Em geral os processos em batelada são os mais
usados para a produção de CPC, os estudos envolvendo essa técnica de
fermentação tanto no modo contínuo quanto no modo semi-contínuo mostram
tentativas de testar variações nas condições operacionais que possibilitem controlar
a quantidade de nutrientes, a quantidade de oxigênio, a taxa de crescimento celular
e a presença de inibidores no meio fermentativo para regular o metabolismo do
fungo, a fim de se atingir o máximo de produtividade do antibiótico.
Zhou e colaboradores (1992a) estudaram a influência da concentração de
oxigênio dissolvido na biossíntese da CPC. Usando uma cepa de Cephalosporium
acremonium de alta produtividade e o modo de batelada alimentada em tanque
agitado para a fermentação, os autores monitoraram a concentração de CPC e de
seus precursores penicilina N, DAC e DAOC além de algumas outras moléculas
como a valina, a cisteína, o ácido α-aminoadípico, α-aminoadipil-cisteína e a α-
aminoadipilcistenil-valina, enquanto variavam a concentração de oxigênio dissolvido
no meio entre 5 a 40% do seu valor de saturação. Os resultados quando o oxigênio
dissolvido estava a 5% mostraram que a concentração de CPC diminuiu de 7,2 para
1,1 g.L-1, e a penicilina N aumenta de 2,57 para 7,65 g.L-1. Quanto aos precursores
da CPC, o DAC mostrou grande queda e o DAOC não foi influenciado e os
peptídeos consumidos normalmente. Os autores atribuem o baixo rendimento da
produção de CPC à inibição da enzima expandase devido ao baixo teor de oxigênio
dissolvido no meio. Quando a taxa de oxigênio dissolvido foi para 20% foram
encontradas as melhores taxas de produção da CPC, e rendimento de consumo dos
nutrientes, mostrando que abaixo desta concentração a síntese de CPC é reprimida.
12
Acima do valor de 20% de saturação os autores concluíram que a síntese da CPC
não foi afetada.
Os mesmos autores (ZHOU et al, 1992b) estudaram também a influência do
meio de cultura na produção de CPC, monitorando as mesmas moléculas
anteriormente citadas e avaliando a variação da quantidade de nutrientes como:
farinha de amendoim, glicose, fosfato e metionina. Os resultados obtidos mostraram
que o ótimo rendimento ocorre em concentrações de glicose abaixo de 0,5 g.L-1, de
fosfato entre 260 a 270 mg.L-1, 100 g.L-1 de farinha de amendoim, onde a
performance do processos atingiu produtividade máxima de 118 mg.L-1h-1 de CPC,
gerando 11,84 g.L-1 de CPC ao fim do processo, 17,34 g.L-1 de antibióticos totais.
Fatores como pH e temperatura também influenciam diretamente no
processo de crescimento do microrganismo e de produção da CPC. Chu e
Constantinides (1988) reportaram o uso de faixas controladas de pH e temperatura
durante um processo de fermentação em batelada. As faixas usadas nos
experimentos foram de 6,2 a 7,4 para o pH e 24 a 32°C para a temperatura. Os
resultados obtidos mostraram a relação ideal entre os parâmetros e quando os
mesmos foram aplicados, os autores conseguiram uma concentração máxima de
550 mg.L-1 de CPC em uma fermentação de 100 horas.
Observa-se também a tentativa de aumento da produtividade através da
imobilização das células do microrganismo em diferentes materiais. Araújo et al
(1996) reportam o uso desta técnica imobilizando o fungo em partículas de alginato
de cálcio e realizando a fermentação em reator tipo torre. Os resultados mostraram
que a produtividade de CPC por hora foi maior em relação a fermentação realizada
com as células livres, cerca de 1,3 vezes maior, mesmo com o crescimento celular
maior no meio onde as células estavam livres. Porém, a técnica de imobilização
celular apresenta alguns problemas, como, a resistência à transferência de oxigênio
necessária para o microrganismo realizar seu metabolismo.
Outro fator investigado é o uso de outros tipos de modalidade de
fermentação para a produção da CPC. Em um desses estudos, Adinarayana et al
(2003) investigaram o uso da fermentação em fase sólida para produção da CPC.
Os autores sugeriram esse método por ele ser mais barato em vista da fermentação
em meio submerso, pois utiliza-se de matérias-primas não industrializadas como
resíduos de biomassa e também pelo baixo custo de operação. No estudo, os
autores usaram uma cepa de A. chrysogenum e testaram farelo de trigo, de arroz e
13
cevada como substratos do meio de cultura sólido. Além disso, os autores
estudaram alguns fatores que poderiam afetar a fermentação, como: umidade inicial,
concentração salina, temperatura, pH, entre outros. Como resultado, obtiveram as
condições ótimas dos fatores propostos. A seguir aplicaram essas condições no
processo de fermentação e obtiveram o máximo de produção de CPC, da ordem de
22,3 mg de CPC/g de CPC, reportando assim, uma diferente possibilidade para o
processo produtivo da CPC.
Outra linha de pesquisa que se destaca na busca por aumentar a
produtividade da CPC é a engenharia genética das cepas dos fungos produtores.
Nessa linha o objetivo é descobrir os genes que estão ligados à produção da CPC e
buscar formas de aumentar a expressão dos mesmos. Com o desenvolvimento da
biologia molecular encontram-se na literatura trabalhos que reportam a identificação
dos genes e também de uma variedade de cepas geneticamente modificadas.
Skatrud et al, (1989) citado por Elander (2003) realizaram um trabalho onde o gene
cef EF foi clonado, resultando em aumento da produção da CPC pelo
microoganismo e reduzindo a produção de penicilina N. Em escala laboratorial a
produtividade subiu em 47% e em escala piloto em 15%. Basch e Chiang (1998)
também citados por Elander (2003) trabalharam com cepas de A. chrisogenum
modificadas geneticamente com aumento no número de gene cefEF e mostraram
que os níveis do contaminante Deacetilcefalosporina C caíram quando o caldo
fermentado produzido pelas cepas modificadas em fermentadores de grande porte
foi submetido ao processo de recuperação.
2.2 PROCESSO DE DOWNSTREAM: Operações unitárias envolvidas no
processo de recuperação e purificação de produtos oriundos de bioprocessos.
Geralmente os caldos fermentados de bioprocessos são extremamente
complexos, podendo conter uma variedade de componentes, como substratos não
convertidos em produtos, células mortas, nutrientes diversos do meio de cultivo e o
produto de interesse que pode se encontrar no meio extra ou intracelular. Devido a
essa complexidade, várias operações são necessárias para promover a separação e
purificação do produto de interesse de maneira eficiente. Dentre as operações mais
utilizadas para recuperação de produtos oriundos de bioprocessos podemos citar:
Filtração, centrifugação, separação por membranas, resfriamento, aquecimento,
14
secagem, extração por solvente, cromatografia de adsorção, de troca iônica,
precipitação, cristalização, entre outras. Os passos necessários para realizar esse
processo estão intimamente ligados à natureza e propriedades do composto de
interesse a ser recuperado e também de propriedades do caldo fermentado, a
pureza necessária do produto por sua vez está ligada à sua finalidade de aplicação.
(NAJAFPOUR, 2007).
Kilikian e Pessoa Jr. (2005) dividem em quatro grandes passos o processo
de downstream: clarificação do caldo ou separação de insolúveis, nesta etapa os
sólidos presentes são removidos do meio, assim como células e fragmentos
celulares. Esta etapa é realizada através de operações como centrifugação e
filtração. A segunda etapa é a purificação de baixa resolução ou isolamento do
produto, normalmente realizada através de adsorção, precipitação ou extração por
solvente. Nesta etapa o produto é separado de outros componentes que apresentam
características físico-químicas diferentes das suas. Na terceira etapa é realizada a
purificação de alta resolução onde serão separados do produto principal os
componentes que exibem propriedades físico-químicas similares a dele. Essa etapa
é por operações de seletividade alta como a precipitação fracionada e a
cromatografia. Por fim, quando possível e/ou necessário, realiza-se a quarta etapa,
que é a obtenção do produto na forma de cristal. Para esse objetivo usam-se
principalmente as operações de cristalização e secagem. Caso o produto de
interesse seja um metabólito intracelular, os autores destacam que o passo de
rompimento celular deve ser acrescentado no processo. As principais operações
usadas em cada etapa do processo de downstream podem ser observadas na
tabela 2.
A realização do processo de downstream pode representar 50% do custo
total do processo produtivo de uma determinada molécula de interesse, por isso, as
operações envolvidas devem ser planejadas de forma a otimizar a aplicação, para
que se possível usar a mesma operação para a realização de mais de uma etapa do
processo. O número de operações também depende da finalidade do produto.
Produtos de aplicação farmacêutica, por exemplo, requerem alto grau de pureza
devido a sua aplicação, e isso é um fator que torna o processo de downstream mais
oneroso ainda. Por outro lado, a obtenção desses produtos com elevado grau de
pureza torna alto o valor agregado do mesmo. Esse fato faz com que o mercado
15
pague um grande valor pelo produto, tornando compensáveis os custos gerados
pelo processo de downstream (KEIM e LADISCH, 2000).
Tabela 2- Principais operações unitárias envolvidas nas etapas de Downstream
Etapa Operações envolvidas
Clarificação Filtração, centrifugação
Rompimento celular Ultrassom, moagem com moinho de bolas, rompimento químico ou enzimático
Purificação de baixa resolução
Precipitação, ultrafiltração, extração por solventes
Purificação de alta resolução Métodos cromatográficos, membranas adsortivas
Refinamento Cristalização, lioflização
Fonte: Adaptado de KILIKIAN e PESSOA Jr., 2005.
Elander (2003) descreve em sua revisão sobre produção de antibióticos β-
lactâmicos as principais rotas adotadas pela indústria para realização do processo
de downstream destes compostos. No geral, pencilinas, cefalosporinas, cefamicinas
e carbapenens seguem um roteiro parecido de operações para purificação do
produto. Primeiramente passando por operações de separação de sólidos e
clarificação do caldo, seguidos por processos de purificação baseados em
processos adsortivos, de troca-iônica e também de extração por solventes. Por fim,
passam por etapas de cristalização.
Detalhadamente, o processo de purificação industrial da CPC descrito por
Elander (2003) é realizado através dos seguintes passos: O caldo fermentado é
resfriado rapidamente até uma temperatura entre 3 a 5°C, depois disso é submetido
ou a filtração ou centrifugação para promover a remoção dos sólidos presentes,
principalmente os micélios do fungo produtor. O processo segue para etapa de
purificação, nesta etapa o caldo contém além da CPC, os compostos DAC, DAOC,
Isopenicilina N além dos precursores biossintéticos. Para realização desta etapa,
são usadas duas estratégias diferentes, algumas companhias usam a adsorção em
carbono ativado ou outro adsorvente, seguido de cromatografia de troca-iônica, o
que resulta em CPC de alta pureza, que é convertida posteriormente em Ácido 7-
aminocefalosporânico (7-ACA). A segunda estratégia consiste em gerar derivados
substituídos, onde o grupo amino da cadeia lateral α-aminoadipil é substituída no C-
16
7, gerando dois derivados: o N-2,4-Diclorobenzoil cefalosporina C e o
tetrabromocarboxybenzoil cefalosporina C. Esses derivados podem ser cristalizados
a partir de soluções ácidas. Esses derivados substituídos também podem formar
sais a partir da reação com bases como diciclohexilamina ou a dimetilbenzilamina.
Esses sais podem ser extraídos por solventes, porém o processo de extração deve
ser repetido várias vezes até a obtenção do produto com elevada pureza.
Dentre as estratégias de purificação para produtos de biotecnologia, o
processo de adsorção se destaca por propiciar a pureza necessária, com bons
fatores de concentração, além de ser um processo não destrutivo e energeticamente
eficiente.
2.3 PROCESSO DE ADSORÇÃO
O processo de adsorção consiste em uma operação unitária onde uma
corrente de um fluído, seja gás ou líquido, interage com uma fase estacionária
sólida, e esta fase sólida é capaz de interagir de diferentes formas com os
componentes desta corrente fluida. Normalmente, a fase estacionária é composta
por pequenas partículas do sólido alocadas em um leito fixo, que pode ser uma
coluna ou um reator. O fluído é então passado através deste leito onde ocorre o
processo de adsorção, quando o leito é totalmente saturado com as moléculas do
fluído, o fluxo do mesmo é interrompido e então o leito pode ser regenerado através
de temperatura ou através de outro método de dessorção. Nesta operação o
material adsorvido é chamado de adsorbato e é este que é recuperado após o
processo de dessorção (GEANKOPLIS, 2003). A troca iônica é considerada como
um processo de adsorção por alguns autores e é possível encontrar termos como
adsorção de íons na literatura (BARBOZA, ALMEIDA E HOKKA, 2003).
Os processos de adsorção são usados para a purificação desde a
antiguidade, onde, por exemplo, os povos usavam carvão e areia para purificação de
água e obtenção de água potável. Apesar do uso desta técnica no dia-a-dia, uma
abordagem teórica a cerca do processo não era desenvolvida e o mesmo era usado
apenas com base em observações e tentativas. O primeiro registro teórico
desenvolvido data de 1773 e após este desenvolvimento o processo se difundiu
rapidamente e é usado em diversos ramos, como indústrias farmacêuticas,
17
alimentícia, de saneamento e petrolífera (KAMMERER, KAMMERER e KARLER
2011).
2.3.1. Mecanismos de separação
Como mencionado anteriormente, o processo de adsorção se baseia na
interação entre as moléculas do fluído e o adsorvente. Existem diversas maneiras de
ocorrerem essas interações, sendo que as mesmas estão diretamente ligadas ao
mecanismo de separação envolvido no processo, esses podem ser do tipo: Físico,
químico ou mecânico (COLLINS, 2006).
Os processos físicos conhecidos como de sorção – adsorção e absorção -
se baseiam em atrações dipolares como, forças de Van der Waals, atrações
Coulômbicas e também por formação de ligações de Hidrogênio. Quando a fase
estacionária é um sólido a adsorção ocorre na interface entre o sólido e o fluído
onde se encontram os sítios ativos do sólido. Quando a fase estacionária trata-se de
um líquido espalhado sobre a superfície do sólido inerte, o processo de separação é
realizado por absorção ou partição e é baseado na solubilidade dos compostos
nesta fase estacionária (COLLINS, 2006).
Outro processo é o químico, os grandes representantes desta modalidade
são os processos por troca-iônica e os processos baseados em afinidade biológica.
No processo por troca-iônica, uma matriz ou um suporte contém em sua superfície
grupos que podem ser ionizáveis, dessa forma são obtidos trocadores de íons. Para
o processo ocorrer, uma fase móvel tipo solução iônica é passada através do leito
contendo o trocador. O composto de interesse deve estar ionizado nessa solução,
dessa forma, o mesmo será capaz de competir pelos sítios carregados do trocador e
então ser retido. Caso a matriz seja carregada negativamente ela é classificada
como trocadora de cátions, pois libera os grupos carregados positivamente para a
fase móvel e retém os cátions presentes na mesma. Caso contrário a fase
estacionária sendo carregada positivamente, ela será capaz de reter os ânions da
fase móvel e liberar os ânions previamente ligados a ela para essa fase, e é
classificada como trocadora de ânions. A fase móvel empregada neste processo
deve exibir propriedades compatíveis com o trocador escolhido e normalmente é
tamponada (COLLINS, 2006). A eluição dos íons retidos é realizada através da
passagem de íons competidores que possuam maior afinidade com a matriz e tem
18
capacidade de deslocar novamente o íon retido para a fase móvel. Outro processo
químico usado é conhecido por bioafinidade.Nesta modalidade a fase estacionária
contém grupos biológicos ligados ao suporte que são complementares aos
presentes na fase móvel, por exemplo, fase estacionária contendo antígenos ligados
e fase móvel contendo anticorpos. Neste modo, a eluição é realizada através de
alterações na fase móvel, como aumento da acidez que modifica propriedades da
molécula ligada ao suporte ou até mesmo da molécula retida (Collins et al, 2006).
O processo mecânico é encontrado na modalidade de cromatografia por
exclusão. O mecanismo de separação neste método consiste na diferença de
tamanho das moléculas a serem separadas. Uma matriz inerte com partículas de
tamanho, forma e porosidade uniformes serve como fase estacionária, desse modo,
moléculas menores penetram os poros ficam em equilíbrio com a fase móvel intra e
intersticial, as moléculas maiores são excluídas totalmente dos poros equilibrando-
se com a fase móvel intersticial apenas e moléculas de tamanho médio penetram
seletivamente nos poros de acordo com sua compatibilidade de tamanho. A saída da
coluna é dada então em função do tamanho da molécula. Os mecanismos descritos
podem ser observados na figura 4.
Figura 4 - Mecanismos cromatográficos a) Adsorção, b) Partição, c) Troca iônica, d)
Bioafinidade e e) Exclusão.
Fonte: Adaptado de COLLINS, 2006.
19
2.3.2 Propriedades dos adsorventes
Existem diversos materiais disponíveis no mercado para a realização do
processo de adsorção. Collins (2006) cita que as faixas de tamanho das partículas
dos adsorventes variam de 63 até 200 μm. Já Geankoplis (2003) cita que o tamanho
das partículas pode variar de 0,1 a 12 mm, além disso, esse autor relata que as
partículas podem vir na forma de pequenos pellets ou grânulos. Geralmente, a
partícula do adsorvente é altamente porosa, sendo que essa porosidade pode
chegar até a 50% do volume total da partícula. A área dessas partículas também é
outro fator de extrema importância já que o processo de adsorção ocorre na
interface entre a partícula e o fluído, as áreas dos adsorventes podem variar de 100
a 2000 m2/g de adsorvente. Os materiais mais usados para obtenção dos
adsorventes são listados na tabela 3.
Tabela 3 - Principais materiais usados como adsorventes em processos de adsorção.
Material Características
Carbono ativado (carvão
ativado)
Material microcristalino, obtido por decomposição térmica da madeira, usado principalmente na adsorção de orgânicos.
Silica Gel Obtido por tratamento ácido do silicato de sódio, usado em desidratação de gases e fracionamento de hidrocarbonetos.
Alumina ativada Obtenção através de tratamento térmico do óxido de alumínio hidratado, usado em secagem de gases e líquidos.
Zeólitas Aluminosilicatos com porosidade uniforme que é definida de acordo com a aplicação. Usada para diversos processos.
Polímeros sintéticos e resinas
Sintetizados a partir de polimerização. Para uso em substâncias apolares, polímero de estireno e Divinilbenzeno, para moléculas polares, principalmente feitos de ésteres acrílicos.
Fonte: Adaptado de GEANKOPLIS, 2003.
20
2.3.3 Relações de equilíbrio no processo de adsorção e cinética do
processo
O equilíbrio entre a concentração de soluto no fluído e a concentração de
soluto no sólido tem comportamento parecido com as relações de equilíbrio de
concentração de gases solubilizados em líquidos. Essas relações são representadas
através de parâmetros relacionados com a quantidade de adsorbato em relação
quantidade de adsorvente (q) (massa de adsorbato/ massa de adsorvente) e a
quantidade de adsorbato em relação à quantidade de fluido (c) (massa de
adsorbato/ volume de fluido) (GEANKOPLIS, 2003). Essas relações são obtidas à
temperatura constante e são denominadas isotermas de adsorção. Existem alguns
modelos desenvolvidos de isotermas usados para explicar o comportamento dos
processos de adsorção. A seguir serão descritos brevemente os modelos de
isoterma usados em processos de adsorção.
a) Modelo linear:
É expresso através de uma expressão similar à lei de Henry, onde K é uma
constante determinada experimentalmente. Essa relação não é comumente
encontrada nos processos de adsorção, porém, na região de concentrações diluídas
pode ser usada para a aproximação de muitos sistemas. A equação 1 descreve o
modelo linear (GEANKOPLIS, 2003). Onde q é a concentração do adsorbato na fase
sólida no equilíbrio, c é a concentração do adsorbato na fase líquida. K é a constante
do modelo e dá indicações sobre a afinidade do processo de adsorção, sendo que
maiores valores mostram que o processo de adsorção é favorecido. Essa relação
tem a vantagem de ser simples para o tratamento de dados, já que é expressa em
função de apenas um parâmetro. Porém, seu uso para o ajuste de isotermas é
indicado apenas em faixas onde a solução está diluída, fato que restringe o uso
desta relação.
(1)
21
b) Modelo de Freundlich:
A equação 2 descreve o modelo de isoterma de Freundlich. Esse modelo
aproxima-se bem de diversos processos de adsorção física, principalmente para
líquidos. O parâmetro K e o parâmetro n são determinados experimentalmente e são
características intrínsecas do processo (GEANKOPLIS, 2003). Os parâmetros K e n
dão indicações da energia e da intensidade da adsorção, apesar disso, estes
parâmetros não possuem significado físico exato.
A relação de Freundlich já foi utilizada por Lee, Park e Moon (1997) para a
modelagem do processo de adsorção da CPC nas resinas XAD2, SP207 e SP850.
(2)
c) Modelo de Langmuir:
O modelo desenvolvido por Langmuir tem embasamento teórico e surge
assumindo que somente determinado número de sítios ativos do adsorvente estão
disponíveis para a adsorção, somente uma monocamada é formada sobre a
superfície e a adsorção é um processo reversível e que atinge um estado de
equilíbrio. Onde qo e K são constantes, determinadas empiricamente, e q é definido
como massa de adsorbato por massa de adsorvente (GEANKOPLIS, 2003).
Segundo Weber (1985) a máxima adsorção ocorre quando uma monocamada de
adsorbato recobre a superfície da resina, além disso, neste modelo assume-se que
não existe interação entre as moléculas de adsorbato e que a energia de adsorção é
constante. A equação 3 descreve este modelo.
(3)
Esta relação de Langmuir foi usada por Ramos, Otero e Rodrigues (2004)
para modelar o processo de adsorção da CPC nas resinas XAD4 e XAD16.
Os modelos de Isoterma auxiliam na determinação do tipo de adsorvente,
na quantidade utilizada do mesmo e na interpretação de dados termodinâmicos,
22
como entalpias de adsorção. A figura 5 descreve o comportamento gráfico dos
modelos descritos anteriormente.
Figura 5 - Modelos de Isotermas comuns Linear, Freundlich e Langmuir.
Fonte: Adaptado de GEANKOPLIS, 2003.
Estudos sobre a cinética também podem fornecer diversas informações
sobre os fenômenos envolvidos no processo de adsorção. Diversos autores
abordam o processo de adsorção de forma que este seja tratado como uma reação
química, onde o adsorbato “reage” com o adsorvente formando um complexo. Essa
pseudo-reação pode ser vista como reação de primeira ordem, de pseudo-primeira
ordem e de segunda ordem. Desta forma, é possível a modelagem do processo
através de constantes de velocidade e dados obtidos das isotermas. Esses dados
podem indicar se o processo é favorável e, além disso, é possível obter estimativas
de alguns parâmetros termodinâmicos do processo.
Barboza, Hokka e Maugeri (2002) estudaram a adsorção da CPC na resina
neutra XAD2, para a modelagem do processo os autores partiram da suposição que
a adsorção da CPC na resina XAD2 é uma reação onde o antibiótico e a resina dão
origem a um complexo CPC+resina mais energia e a dessorção é a reação inversa
onde o complexo dá origem a resina livre, CPC e energia.
23
Neste modelo os autores ainda assumiram que mais de uma molécula de
CPC é adsorvida por sítio ativo da resina. Os autores obtiveram os perfis cinéticos
do processo monitorando a variação de C/Co em função do tempo, partindo de
soluções de diferentes concentrações a temperatura constante de 25°C. Os perfis
obtidos são mostrados na figura 6, a seguir.
Figura 6 - Perfis cinéticos da adsorção da CPC na resina neutra XAD2.
Fonte: Adaptado de BARBOZA, HOKKA e MAUGERI, 2002.
Além dos perfis cinéticos, os autores obtiveram também as isotermas de
adsorção. Por fim, eles concluíram que é possível realizar o processo de adsorção
da CPC na resina XAD2, e que a temperatura e a concentração da solução de CPC
afetam o processo.
Baseado na proposta de mecanismo descrita anteriormente, a resina IRA410
também pode se comportar como um reagente da “reação” de adsorção, onde nos
sítios da resina o íon cloreto é trocado pela CPC carregada negativamente,
originando o “produto” da reação que é o complexo CPC+Resina.
24
2.3.4 Modos de operação
Existem dois principais modos de operação de sistemas de adsorção
destinados à purificação de produtos. São os sistemas por reator alimentado e por
colunas de leito fixo. A seguir os modos serão descritos, em especial o modo em
colunas de leito fixo por ser tema de interesse do presente trabalho.
Adsorção em reatores alimentados.
Esse modo de operação é aplicado principalmente quando as quantidades
do produto a ser adsorvido são pequenas. As relações de equilíbrio do sistema
podem ser obtidas através dos modelos de Isotermas descritos anteriormente e o
balanço de massas do sistema é obtido através da equação 4 (GEANKOPLIS,
2003). Onde a concentração da alimentação inicial é dada por cf e no equilíbrio por
c, a concentração inicial do soluto adsorvido no sólido é qf e no equilíbrio q, M é a
quantidade de adsorvente em kg e S o volume de alimentação em m3.
(4)
No ponto onde a isoterma de adsorção e o gráfico de q contra c do balanço
se encontram são encontrados os valores de q e c no equilíbrio (GEANKOPLIS,
2003).
Para a realização da operação, um reator é alimentado em forma de
batelada ou em forma continua com a solução contendo a substância a ser
adsorvida e também com o material adsorvente. Em seguida promove-se agitação
no interior do sistema e, com o passar do tempo ocorre adsorção do componente de
interesse no adsorvente. Após o período necessário a solução de alimentação é
retirada do reator e o adsorvente contendo o adsorbato é então submetido a uma
etapa de lavagem, posteriormente alimenta-se o sistema com a solução que
promoverá a eluição do componente adsorvido e então será gerada uma solução
concentrada do componente de interesse. O adsorvente passa por um ciclo de
regeneração caso seja necessário e a operação pode ser repetida (ALMEIDA,
BARBOZA e HOKKA, 2003).
25
Colunas de leito fixo
O processo de adsorção realizado em colunas de leito fixo é mais complexo
do que o realizado através de reatores. O fluído a ser tratado percorre a coluna com
um fluxo constante, o processo depende da resistência à transferência de massa e
também de outros fatores dinâmicos do sistema. O perfil de concentração do soluto
na solução de alimentação varia conforme o tempo e a posição dentro da coluna,
decaindo rapidamente conforme a solução avança pela coluna, sendo que esse
passo se repete várias vezes até o fim da coluna. Esse perfil de concentração do
adsorbato no interior da coluna é mostrado na figura 7a, e é obtido através do
gráfico de C/C0 contra H, onde C é a concentração do adsorbato em determinado
ponto da coluna, C0 a concentração inicial do adsorbato no fluido e H o comprimento
da coluna.
Conforme ocorre a passagem do tempo, as partículas do adsorvente
próximas à entrada da coluna são saturadas pelo asdorbato e a adsorção começa
então a ocorrer em um ponto imediatamente posterior ao ponto saturado. A
diferença de concentração durante o caminho é a força motriz do processo.
Enquanto o processo de transferência de massa ocorre no interior da coluna,
na saída dela a concentração do soluto é aproximadamente igual à zero, e continua
com este valor até que a zona de transferência de massa atinja o fim da coluna em
um determinado tempo. Quando chega este momento, a concentração do soluto na
saída da coluna aumenta até atingir um ponto conhecido como ponto de ruptura.
Depois do mesmo a concentração aumenta rapidamente até atingir um ponto onde o
leito da coluna não é mais efetivo para promover a adsorção. O ponto de ruptura é
definido como sendo o ponto onde C/C0 é igual aos valores de 0,01 a 0,05. O ponto
em que o leito não é mais efetivo é igual a Cd sendo que este é aproximadamente
igual a C0. Esse comportamento é visualizado através das curvas de ruptura geradas
por gráficos de C/C0 em função do tempo decorrido. Na figura 7b é possível observar
uma curva de ruptura representativa.
26
Figura 7 - Perfis de concentração do adsorbato. a) Em várias posições no interior da coluna,
b) Curva de ruptura ao fim da coluna.
Fonte: Adaptado de GEANKOPLIS, 2003.
As curvas de ruptura são ferramentas extremamente importantes, pois a
partir delas é possível calcular uma série de parâmetros que ajudam a realizar o
aumento de escala da coluna, bem como obter a eficiência do leito em diversas
condições, promovendo redução de custos. Os cálculos a cerca das curvas de
ruptura serão apresentados posteriormente na seção de materiais e métodos.
Em escala industrial o processo é operado de duas formas principais: A
primeira e mais usada, o modo em batelada e também o modo em fluxo contínuo,
onde várias colunas se revezam nos ciclos. No modo batelada alimentação é
injetada na coluna até que ocorra a saturação do leito, após isso a alimentação é
interrompida e a coluna é lavada com água ou outra solução para remoção de
materiais não adsorvidos dos espaços restantes. Com a coluna lavada, inicia-se
então o passo de dessorção dos materiais, que pode ser realizado através de
soluções eluentes adequadas ou também através de variação de condições como,
variações de pH ou de temperatura, nesta etapa a variação da condições de forma
adequada é que possibilita a separação dos compostos, por promover a dessorção
diferenciada dos mesmos levando a separação. Após a dessorção é realizado
novamente um processo de lavagem e posteriormente a coluna é submetida ao
processo de recondicionamento para restaurar os sítios ativos do material
27
adsorvente e preparar a coluna para um novo ciclo de uso. No modo de fluxo
contínuo várias colunas se revezam nos passos descritos para o processo em
batelada, sendo que enquanto uma está sendo alimentada, a outra está passando
pelo processo de lavagem e a próxima pelo processo de adsorção e assim por
diante, sem que haja interrupção dos fluxos durante o processo (GEANKOPLIS,
2003).
Em escala laboratorial, a coluna cromatográfica é geralmente feita de vidro,
na forma de tubo e colocada na posição vertical, para que o fluxo siga por força da
gravidade, sua extremidade superior é aberta e a inferior termina em uma torneira
que permite a regulagem da vazão. O recheio deve ser colocado uniformemente na
coluna de forma a evitar a presença de bolhas de ar no seu interior, pois esses
espaços podem gerar alargamentos nas bandas cromatográficas. Para isso
normalmente o recheio é agitado em um frasco contento a fase móvel até que se
obtenha uma pasta que é adicionada na coluna já com um terço do seu volume
preenchido pela fase móvel, esse recheio é suportado por um pedaço de algodão no
início da coluna. A figura 8 mostra um exemplo de coluna cromatográfica. Após a
montagem da coluna a amostra é injetada no topo da coluna, e a fase móvel é
adicionada cuidadosamente de forma que se obtenha uma camada acima do
recheio. Os compostos vão eluindo pela coluna, sendo que aqueles que têm maior
afinidade pelo adsorvente demoram mais para percorrer o caminho do que os de
menor afinidade.
Figura 8 - Esquema de montagem de uma coluna cromatográfica.
Fonte: Adaptado do site www.qnint.sbq.org.br, visitado em 06/03/2014.
28
A solução eluente também influência na retenção dos compostos, variações
nas suas características podem acarretar em melhores separações e diminuição do
tempo de corrida. Essas alterações podem ser obtidas por aumento de polaridade
da fase, por exemplo, colunas operando em fase normal, onde a fase estacionaria é
mais polar que a fase móvel, os compostos serão eluídos mais rapidamente com
aumento na polaridade da fase móvel. E na situação contrária, coluna operando em
fase reversa, onde a fase estacionária é menos polar que a fase móvel, a diminuição
da polaridade da fase móvel gerará a diminuição da retenção dos compostos. Os
modos em que a eluição é realizada durante o processo cromatográfico são o
isocrático, onde a constituição da fase móvel é a mesma durante todo o processo ou
o modo gradiente, onde a composição da fase móvel é alterada durante o processo.
O modo gradiente pode ser realizado de duas formas, continuamente durante a
corrida ou em etapas graduais.
Ao fim da eluição as frações podem ser coletadas manualmente ou por
coletor automatizado. A quantificação é realizada através de alguma técnica
conveniente a natureza do composto de interesse. Para se reutilizar o leito da
coluna em uma nova corrida, assim como no processo industrial, a mesma deve ser
submetida ao processo de lavagem e recondicionamento. (COLLINS, 2006).
2.3.5 Adsorção por troca iônica
Os primeiros registros a cerca do uso de materiais trocadores de íons
aplicados a processos de separação e purificação remonta ao ano de 1850. Onde os
químicos daquela época descobriram a capacidade do solo em remover íons amônio
e potássio de soluções que o atravessam. Daí em diante, a técnica despertou
enorme interesse e foi desenvolvida, atualmente existem diversos materiais
trocadores de íons disponíveis e também uma série de aplicações da troca iônica na
resolução de problemas de separação e purificação (COLLINS, 2006).
Alguns autores consideram a troca iônica como sendo um caso específico
de adsorção. Geankoplis (2003) descreve o processo de adsorção por troca iônica
como sendo um processo de adsorção química onde ocorrem reações entre íons
presentes na solução e íons da fase sólida insolúvel. Sendo que os íons presentes
na solução que reagem com a matriz são repostos pelos íons que estavam ligados à
mesma anteriormente, mantendo assim a eletroneutralidade.
29
Collins e Braga (2006) citam que o mecanismo de troca iônica é governado
basicamente por interações eletrostáticas e, dessa forma, o controle do processo
pode ser realizado através da manipulação de fatores como força iônica da fase
móvel e também através do pH.
Na figura 9 observa-se uma matriz trocadora de cátions onde o processo
começa com a matriz em equilíbrio com seu contra íon X+. Então uma amostra
contendo íons B+ e C++ é aplicada na coluna, esses íons deslocam o íon X+ e são
adsorvidos na matriz. Após a adsorção um eluente Z+ que tem maior afinidade com
a matriz do que B+ desloca essa espécie que é então eluída, o processo se repete
agora com o íon C++ sendo deslocado por uma segunda espécie C++ com maior
afinidade pela matriz ou por uma solução do íon Z+ de maior força iônica capaz de
gerar o deslocamento. Dessa maneira, ocorre a separação dos componentes B e C
da amostra inicial. Para que o leito possa ser reutilizado a matriz deve ser
regenerada com o íon X+, para que isso ocorra, uma solução contendo os íons X+
deve ser passada em um volume de 5 a 10 vezes maior que o volume da coluna,
dessa forma os íons X+ que são fracamente adsorvidos na matriz irão superar a
maior afinidade dos outros íons devido à sua maior concentração. (COLLINS, 2006)
Figura 9 - Mecanismo de troca iônica, B e C são íons a ser separados, Z, W e X são
eluentes usados.
Fonte: Adaptado de COLLINS, 2006.
As matrizes usadas em cromatografia de troca iônica são porosas, inertes,
insolúveis e formam ligações covalentes com os grupos trocadores de íons. Elas são
classificadas quanto à natureza podendo ser orgânicas ou inorgânicas e de origem
natural ou sintética. Devido à alta eficiência, as matrizes orgânicas sintéticas são as
mais usadas. Essas matrizes são obtidas através de reações que geram polímeros
30
com alto grau de ligações cruzadas. As resinas ácidas, trocadoras de cátions, são
obtidas através de reação entre o Poliestireno e o Divinilbenzeno, seguida de
sulfonação do anel benzênico. As resinas básicas, trocadoras de ânions seguem o
mesmo mecanismo, porém, após a polimerização a matriz é submetida a uma
clorometilação e uma reação com uma amina terciária (COLLINS, 2006).
Alguns fatores influenciam a cromatografia por troca iônica, o trocador deve
ser escolhido conforme a aplicação, para aplicações preparativas e analíticas
existem diferentes tipos de resinas que variam de porosidade. A fase móvel
escolhida pode ser ácida, básica ou um tampão, adicionado ou não de algum
solvente orgânico ou sal neutro, visando aumentar a seletividade para um
determinado composto ou alterar a afinidade do trocador. A eluição em
cromatografia por troca iônica pode ser realizada com a própria fase móvel, modo
denominado isocrático, ou ainda modificando a força iônica ou pH durante a corrida
cromatográfica, modo conhecido como eluição por gradiente (COLLINS, 2006).
2.3.6 Purificação da CPC através de processos de adsorção
Na literatura é possível encontrar diversos trabalhos relacionados à
purificação da CPC, em sua maioria esses trabalhos abordam o processo de
adsorção da CPC em resinas neutras com as resinas XAD2, 4, 16, resinas do tipo
estireno divinilbenzeno. Os resultados desses estudos mostram que essa técnica é
possível de ser aplicada na purificação do caldo de cultivo contendo a CPC.
Hicktier e Buchholz (1990) estudaram o perfil de adsorção da CPC em um
reator de tanque agitado usando como adsorventes as resinas neutras XAD 4, XAD
1180 e a resina de troca iônica IRA 68. As isotermas foram obtidas através
experimentos onde a CPC foi em dissolvida soluções de pH 2,5 a 3,0 em tampão
glicina/HCl para as resinas neutras e pH 3,6 em tampão ácido acético para a resina
de troca iônica. Os dados foram analisados on line via espectrofotometria em
UV/Visível a comprimento de onda de 258 nm. O processo de adsorção da resina foi
modelado usando considerações a cerca da cinética do processo. Seus resultados
mostraram que o processo de adsorção da CPC nas resinas neutras pôde ser bem
descrito por isotermas do tipo BET e o processo em resina de troca iônica é mais
31
bem ajustado à isoterma do tipo Langmuir. O autor ainda ressalta a maior
contribuição dos fatores cinéticos para a modelagem do processo.
Lee, Jung e Moon (1997a) usou as resinas neutras SP280, SP850 e XAD 2
para determinar os parâmetros de equilíbrio e cinéticos no processo de adsorção da
CPC. Para determinar as isotermas de adsorção, os autores realizaram
experimentos em reatores de tanque agitado e também em colunas de leito fixo. Os
autores conseguiram prever o processo de adsorção usando o modelo de Freundlich
e o processo de dessorção foi explicado através de um modelo competitivo entre o
antibiótico e o álcool isopropílico usado para realizar a eluição. Os modelos foram
aplicados com sucesso quando o processo foi realizado em colunas de leito fixo,
mostrado pela correlação entre o modelo e as curvas de ruptura obtidas em várias
condições de operação.
Lee, Park e Moon, (1997b) reportam em outro trabalho os efeitos de diversas
condições de operação sobre o processo de adsorção da CPC em resina SP850. Os
parâmetros verificados foram pH, fluxo, temperatura e concentração. Os autores
mostram que a adsorção é favorecida pelo aumento do pH e da temperatura. Eles
ainda simularam o processo através de modelos de isotermas e constataram que o
modelo de Freundlich é o que melhor prevê o mesmo, porém, quando as soluções
estão a baixos valores de pH o modelo apresenta desvios consideráveis dos
resultados obtidos experimentalmente. Esse fato é atribuído a possíveis espécies
iônicas diferentes existentes no meio quando o pH é mantido a baixos valores.
Ramos, Otero e Rodrigues (2004) estudaram o processo de recuperação da
CPC usando resina XAD 16. Primeiramente, os autores obtiveram a isoterma de
equilíbrio do sistema através de experimentos usando reatores de tanque agitado, a
partir daí modelaram as curvas de ruptura para o processo em coluna. Os resultados
do processo realizado em coluna foram compatíveis com os resultados previstos
pelo modelo desenvolvido. Os autores obtiveram as isotermas de adsorção pelos
modelos de Freundlich para concentrações abaixo de 1 g.L-1 e pelo modelo de
Langmuir para concentrações acima deste valor. A eluição foi realizada com solução
de metanol, e o mecanismo atribuído ao processo de dessorção foi a capacidade do
metanol deslocar a CPC dos sítios ativos da resina.
Barboza, Hokka e Maugeri, (2002) estudaram o processo de adsorção e
dessorção da CPC em resina XAD 2. Os autores mostram que o processo de
adsorção pode ser representado pelos modelos de Langmuir, Freundlich e até
32
mesmo pelo modelo linear. Eles reportam também que a presença de metanol na
solução de alimentação afeta negativamente a capacidade da resina de adsorver o
antibiótico, além disso, o modelo cinético obtido foi compatível com os dados
experimentais obtidos. Os autores ainda mostraram um processo de purificação
contínuo da CPC usando dois reatores de tanques agitados interligados, onde no
primeiro acontece o ciclo de adsorção e no segundo a dessorção com solução de
metanol. Por fim, os autores concluíram que o processo de purificação da CPC em
resinas XAD 2 é viável e que fatores como concentração de CPC e temperatura
influenciam diretamente no processo de adsorção.
Além da adsorção da CPC em resinas neutras, pode-se realizar o processo
através de cromatografia por troca iônica. Na literatura encontram-se citações sobre
o uso do processo (SACCO e DELACHERIER, 1981; BAUTISTA et al, 2006), porém,
as condições nas quais ele é realizado e as informações como um todo estão em
sua maioria sobre a forma de patentes (Mc CORNICK e MACK, 1969; VOSER,
1973), esse fato limita acesso ao conhecimento a cerca do tema, além de restringir o
acesso ao uso do processo. Isso faz gerar a necessidade de se estudar o processo
de adsorção da CPC em resina de troca iônica.
33
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 PREPARO DAS COLUNAS E ENSAIOS CROMATOGRÁFICAS
Para o empacotamento da coluna adicionou-se uma quantidade da resina
Amberlite IRA 410 em um béquer, no qual também se adicionou uma quantidade de
água deionizada. Em seguida, transferiu-se essa solução para uma bureta de 25 mL
com o auxílio de um funil. Durante a transferência usou-se um bastão de vidro para
compactação da resina dentro da coluna, de forma que a resina se assentasse
homogeneamente, evitando a formação de vazios ou bolhas no interior da coluna.
Após esse processo obteve-se uma coluna com leito de 16,5 cm comprimento. A
Figura 10 mostra as colunas empacotadas obtidas.
Figura 10 - Colunas usadas no procedimento experimental inicial.
Fonte: O AUTOR, 2013.
Para realizar o condicionamento da resina passou-se pela coluna cerca de
200 mL de água deionizada a fim de realizar a limpeza da mesma, seguido de 200
mL de solução 4,0% m/V de NaCl para garantir a renovação dos sítios ativos da
34
resina no ciclo do Cloreto e novamente mais 400 mL de água deionizada para
remover o excesso de solução salina no leito.
As características da resina Amberlite IRA 410 podem ser consultadas na
sessão anexo do presente texto.
Para a preparação das soluções de CPC utilizadas como alimentação, usou-
se solução tampão ácido succínico/KOH, (pH 3,6 e força iônica 0,01 M) como
diluente. A preparação deste tampão seguiu a metodologia proposta por Perrin
(1963), para preparações de tampões para uso em determinações
espectrofotométricas. Os valores de pH e força iônica deste tampão foram definidos
baseando-se na metodologia experimental proposta por Hicktier e Bucholz (1990)
em seu estudo usando a resina de troca aniônica IRA 68 para adsorção de CPC.
A CPC usada nos ensaios foi o sal de zinco da cefalosporina C, grau prático,
obtida junto a Sigma Aldrich. Usando-se a solução tampão previamente preparada
como diluente, foram preparadas as soluções de CPC dissolvendo-se a massa de
CPC pesada referente à concentração desejada em balão volumétrico. As soluções
resultantes foram estocadas em geladeira à temperatura de 5°C. As concentrações
foram definidas nestes valores devido à escala de leitura do equipamento de
espectrofotometria Ultravioleta/Visível.
Partindo-se então para a realização das corridas cromatográficas para
obtenção dos perfis de eluição da CPC na coluna empacotada com a resina,
primeiramente, foi passada uma alíquota de água deionizada através da coluna para
remoção de algum excesso de sal que ainda poderia estar presente na coluna após
a etapa de pré-tratamento da resina. Terminada essa etapa, injetou-se a solução de
CPC na coluna, o monitoramento foi realizado coletando-se frações de 4 ml em
frascos eppendorfs em intervalos de 5 ou 3 minutos. Ao fim da injeção do volume da
solução de CPC, outra alíquota de água deionizada foi passada na coluna a fim de
retirar a CPC não adsorvida da coluna. Após esse processo prosseguiu-se com a
etapa de eluição, com solução de NaCl 4,0% m/V como eluente. Os detalhes dos
experimentos são mostrados na tabela 4.
35
Tabela 4 - Condições adotadas nos experimentos para obtenção dos perfis de eluição da
CPC em coluna recheada com a resina IRA 410 exp. 1,2,3.
Experimento Altura do
leito Alimentação Vazão Eluição
1 16,5 cm 150 mL de CPC 3,7.10-2 g/L 4 mL/min Modo isocrático com solução de NaCl 4,0% m/V.
2 16,5 cm 150 mL de CPC 4,4.10-2 g/L 4 mL/min
3 16,5 cm 150 mL de CPC 5,5.10-2 g/L 4 mL/min
Fonte: O AUTOR, 2013.
Após o término do ensaio cromatográfico, a resina passou novamente pelo
processo de pré-condicionamento para ser reutilizada.
As frações coletadas foram analisadas via espectrofotometria no UV-Visível
em λ= 260 nm. O comprimento de onda foi escolhido com base nas observações de
Abraham e Newton (1961) durante seus estudos a cerca da elucidação estrutural da
CPC. O espectro de absorção da CPC na região do ultravioleta mostrado na Figura
11 evidencia a forte absorção da molécula neste comprimento de onda. A partir dos
valores resultantes registrou-se o gráfico da absorbância em função do tempo de
coleta e obteve-se o cromatograma da CPC.
Figura 11 - Espectro de absorbância na região do Ultravioleta da CPC.
Fonte: Adapatado de PIZZANO e VELOZZI, (1974).
36
Além dos cromatogramas mostrando o perfil de eluição da CPC, foram
realizados também experimentos para gerar as curvas de ruptura da CPC na resina.
Esses experimentos foram realizados usando-se iguais volumes de solução de CPC
de mesma concentração enquanto variava-se a vazão do processo em 3 diferentes
valores. Os procedimentos de condicionamento da coluna, injeção da amostra,
eluição, coleta das frações e análise dos coletados no UV/Vis foram realizados da
mesma forma descrita anteriormente nos experimentos para obtenção do perfil de
eluição da CPC. Os detalhes experimentais são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5 - Condições experimentais usadas para obtenção das curvas de ruptura da CPC
em coluna empacotada com a resina IRA 410 exp. 4,5,6.
Experimento Altura do
leito Alimentação Vazão Eluição
4 16,5 cm 150 mL de CPC 3,7.10-2 g/L 2,8 mL/min Modo isocrático com solução de NaCl 4,0% m/V.
5 16,5 cm 150 mL de CPC 3,7.10-2 g/L 4,0 mL/min
6 16,5 cm 150 mL de CPC 3,7.10-2 g/L 5,3 mL/min
Fonte: O AUTOR, 2013.
Para realizar o experimento de melhoramento do perfil de eluição da CPC, e
os experimentos de avaliação da influência do controle de temperatura e de vazão
sobre as curvas de ruptura, o arranjo mostrado na Figura 12 foi utilizado. Foi usada
uma coluna encamisada acoplada a um banho termostatizado e a uma bomba
peristáltica.
Figura 12- Arranjo experimental com controle de temperatura e vazão.
Fonte: O AUTOR, 2014.
37
Para o experimento de melhoramento de eluição da CPC foi escolhida a
concentração de 4,0.10-2 g.L-1. Já que o perfil obtido nesta concentração se mostrou
o melhor nos ensaios anteriores. Em um leito de 10,0 cm de altura com temperatura
de 25°C e vazão do sistema de 4,0 mL.min-1. A resina foi pré-condicionada seguindo
o processo descrito anteriormente. As condições usadas são apresentadas na
Tabela 6.
Tabela 6 - Parâmetros experimentais para melhoramento da eluição da CPC.
Parâmetros Valor
Solução de CPC 200 mL, Co=4,0.10-2 g.L-1
Temperatura 25°C
Vazão 4,0 mL.min-1
Altura do leito 10,0 cm
Solução de lavagem 200 mL Água destilada
Solução de eluição 200 mL de NaCl 4% m/V
Fonte: O AUTOR, 2014.
As condições usadas nos experimentos de ruptura com controle de
temperatura e vazão podem ser observadas na Tabela 7. Nessa série de
experimentos novamente foram avaliados os valores de vazão usados
anteriormente, 3,0, 4,0 e 5,0 mL.min-1, mantendo a temperatura constante a 25°C. O
valor de concentração de CPC foi escolhido com base nos resultados do
experimento de melhoramento do perfil de eluição.
Tabela 7 – Condições usadas para a obtenção das curvas de ruptura com controle de vazão
e temperatura.
Experimento Altura do leito Alimentação Vazão Eluição
7 10 cm 200 mL de CPC 4,0.10-2 g/L 3,0 mL/min Modo isocrático com solução de NaCl 4,0% m/V.
8 10 cm 200 mL de CPC 4,0.10-2 g/L 4,0 mL/min
9 10 cm 200 mL de CPC 4,0.10-2 g/L 5,0 mL/min
Fonte: O AUTOR, 2014.
3.2 CÁLCULOS DOS PARÂMETROS DO PROCESSO EM COLUNA
Os cálculos utilizados para obtenção dos parâmetros da coluna foram feitos
seguindo as metodologias propostas por Geankoplis (2003) e Cren et al (2009).
38
A capacidade total do leito é obtida através da equação 5, em que tt é o
tempo referente à capacidade total ou estequiométrica do leito e te é o primeiro
instante em que C/C0 é igual a 1.
(5)
A capacidade usada do leito é obtida no ponto de ruptura quando C/C0= 0,05
a 0,1, neste trabalho o valor do ponto de ruptura será adotado quando C/C0=0,1. E
pode ser calculada a partir da equação 6. Sendo tu é o tempo correspondente ao
ponto de ruptura. Idealmente tu é muito próximo de tb que é o tempo onde surge o
ponto de ruptura.
(6)
A fração utilizada do leito durante o processo é dada pela razão tu/tt. A altura
total do leito é dada por Ht. Então a altura do leito utilizada Hu, pode ser obtida
através da equação 7.
(7)
A altura não utilizada Hun, é dada por:
(8)
A partir dos valores obtidos da curva de ruptura, podem-se calcular os
fatores εf, εr e P, que são respectivamente, eficiência de uso do leito, eficiência de
recuperação do produto e produtividade da coluna. Segundo a metodologia proposta
por Cren et al (2009), esses parâmetros estão relacionados com a eficiência do
processo de recuperação como um todo, para a realização destes cálculos a área da
curva de ruptura é divida em três regiões, sendo que a região A1 é referente a
capacidade do leito utilizada até o ponto de ruptura, e é definida do ponto de entrada
da coluna até o ponto de ruptura. A região A2 é referente à quantidade de soluto que
39
deixa a coluna sem ser adsorvido até o ponto de ruptura, e por último, A3 está
relacionada à capacidade do leito usada após o ponto de ruptura e é definida do
ponto de ruptura até o ponto onde C/C0 ~ 1. A eficiência εr está relacionada à
remoção de soluto, e εf a eficiência de utilização da resina. A figura 13 mostra a
representação gráfica das áreas mencionadas na metodologia anterior.
Figura 13 - Representação da curva de ruptura com a divisão em áreas segundo metodologia proposta por Cren.
Fonte: Adaptado de CREN et al, 2009.
As equações 9 a 11 mostram a obtenção das eficiências relacionadas ao
processo de coluna.
ε
(9)
ε
(10)
(11)
Onde Q é a vazão volumétrica do soluto durante a corrida cromatográfica e
C0 é a concentração inicial do soluto.
40
3.3. CINÉTICA E ISOTERMA DE ADSORÇÃO
Para a obtenção da curva de cinética de adsorção da CPC na resina IRA
410, usou-se uma metodologia baseada no estudo de Barboza e Hokka (2003), em
que usou-se uma quantidade de 8,026 g de resina pré-condicionada e 100 mL de
uma solução de CPC 4,06.10-2 g.L-1 com pH ajustado em 3,6, o sistema foi vedado e
mantido em agitação constante, a uma temperatura de 30°C. Em intervalos de
tempo de 2 minutos foram coletadas alíquotas da solução para análise quantitativa
através de espectroscopia no Uv/Vís. O experimento foi conduzido até que o sistema
entrasse em equilíbrio e não fosse evidenciada variação no valor da concentração
da CPC. Para análise do resultado foi traçado um gráfico de C/Co em função do
tempo, onde C é a concentração de CPC em um determinado tempo e Co a
concentração inicial de CPC. Depois disso, com o auxílio do programa Origin 8®, os
dados foram ajustados a modelos cinéticos de primeira e segunda ordem a fim de
saber qual modelo representa melhor a cinética de adsorção da CPC na resina IRA
410. Sendo que as equações usadas como base para a modelagem de primeira
ordem (12) e de segunda ordem (13) são mostradas a seguir.
(12)
(13)
Para a obtenção da isoterma de adsorção da CPC na resina IRA 410 foram
pesadas massas constantes de resina da ordem de 0,5 g em béqueres e quatro
soluções de diferentes concentrações de CPC (10,4, 30,2, 44,1 e 58,1mg.L-1) foram
colocadas em contato com a resina. O sistema resultante foi vedado, mantido em
agitação constante e temperatura de 30°C durante uma hora, tempo necessário para
o sistema entrar em equilíbrio. Após este período foram retiradas alíquotas para
análise da concentração de equilíbrio na fase líquida, que foram quantificadas por
espectroscopia no Uv/Vís. Os experimentos de isoterma cada concentração foi
avaliada em triplicata.
41
O resultado do experimento de isoterma foi analisado através de um gráfico
de q* (Concentração de equilíbrio na fase sólida) em função de Cf* (concentração de
equilíbrio na fase líquida). O Cf* pode ser obtido diretamente através da leitura em
UV/Vís das frações coletadas ao fim do experimento. Já q* é determinado através da
equação 5, mostrada a seguir, sendo Co é a concentração inicial de CPC na fase
líquida, m é a massa de resina e Vs é o volume de solução de CPC.
(14)
Após a obtenção da curva, a mesma foi ajustada ao modelo linear de
isoterma com o auxílio do programa Origin 8® e para a obtenção do parâmetro k,
importante para descrever o processo de adsorção da CPC na resina, o modelo
linear foi escolhido pelo fato de se ter trabalhado com soluções de CPC diluídas.
3.4. SEPARAÇÃO DA CPC E METIONINA
Com o objetivo de separar a CPC de uma solução contendo metionina como
contaminante o seguinte experimento foi realizado. Para tanto utilizou-se uma
solução de concentração 4,9.10-2 g.L-1 de CPC e de mesma concentração para a
metionina, para simular uma condição extrema em que o contaminante possui
concentração igual a da substância de interesse. O caldo teve o pH ajustado em 3,6
com o auxílio do tampão Ác. Succínico/KOH. A coluna cromatográfica foi recheada
com a resina IRA410 e pré-condicionada como já descrito anteriormente. O
experimento foi realizado a vazão constante de 4,0 mL.min-1 e temperatura de 25°C.
O ensaio cromatográfico foi realizado injetando-se 100 mL de solução
contendo a CPC com a metionina, seguida de 15 minutos de lavagem com água. A
eluição neste experimento foi realizada no modo gradiente degrau com soluções a
0,1, 0,5, 1,0 e 4,0% m/V de cloreto de sódio. Na literatura (SACCO,
DELLACHERIER, 1981) os autores empregam essa metodologia para promover a
separação de aminoácidos da CPC em colunas recheadas com resinas neutras
modificadas.
42
A obtenção dos cromatogramas foi realizada de duas formas diferentes.
Para a CPC foi realizada a leitura em UV/Visível em comprimento de onda de 260
nm. Os resultados foram lançados em uma curva de calibração previamente obtida e
a concentração obtida foi graficada em função do tempo. Nesta metodologia
observa-se que a metionina não apresenta absorção significativa neste comprimento
de onda e, portanto, não influencia nos valores de concentração de CPC obtidos.
O aminoácido metionina é considerado um contaminante na separação da
CPC do caldo fermentativo por isso foi feita a quantificação desse aminoácido por
HPLC. As análises foram feitas pelo Grupo de Bioquímica do Departamento de
Engenharia Química da UFSCar. Utilizou-se um cromatógrafo com detector de
arranjo de diodos (Waters 996 – PDA), uma coluna de fase reversa (µ-Bondapak
C18 - 3,9 x 300 mm) e o equipamento foi operado dentro das seguintes condições:
vazão de 2,5 mL.min-1, temperatura de 28C e os picos foram detectados em 220
nm. Cada fração coletada no ensaio em coluna foi injetada no HPLC separadamente
e cada cromatograma obtido foi usado para a obtenção do gráfico correspondente
ao ensaio completo, lançando os resultados individuais das amostras em função do
tempo de coleta.
43
4. RESULTADOS
4.1 PERFIS DE ELUIÇÃO DA CPC
O objetivo dos experimentos realizados nesta etapa obter o perfil de eluição
da CPC na coluna de leito fixo recheada com a resina IRA 410. Essa etapa é
necessária para observar as interações entre a CPC e a resina IRA 410. As etapas
realizadas durante esse experimento foram:
A saturação do leito devido à adsorção da CPC;
A etapa de lavagem do leito onde o excesso de CPC não adsorvida é retirado
do leito;
A etapa de eluição do antibiótico, sendo que é durante essa etapa que a CPC
é recuperada e concentrada a partir das frações eluídas onde ela está
presente.
A realização do perfil de eluição também é importante pelo fato da
necessidade de se aperfeiçoar as etapas descritas anteriormente. Alguns pontos
que podem ser ajustados nesta etapa são:
A quantidade de alimentação usada;
O tempo de lavagem necessário para eliminação satisfatória de substâncias
não adsorvidas no interior do leito;
As condições de eluição do componente de interesse, onde podem ser feitos
testes variando as condições do eluente, como seu pH e/ou concentração de
uma corrida para outra, no método de eluição isocrática, ou mesmo variar a
concentração durante uma mesma corrida, no método conhecido como
eluição por gradiente.
Nos experimentos iniciais os perfis de eluição da CPC foram obtidos em três
diferentes valores de concentração, 3,7, 4,4 e 5,5.10-2 g.L-1, respectivamente. A
variação da concentração da CPC foi realizada a fim de verificar se essa variável
exerce alguma influência no perfil de eluição da molécula no leito recheado com a
resina IRA 410. Os cromatogramas obtidos podem ser observados na figura 14. As
medidas de absorbância foram realizadas em λ= 260 nm.
44
A eluição realizada com solução de NaCl a 4,0% m/V mostrou-se
satisfatória, indicando que esta solução pode ser usada com eficiência nesta
situação, sem a necessidade do uso da eluição por gradiente que é uma maneira
mais trabalhosa de se realizar esta etapa do processo. A escolha deste eletrólito
como eluente foi feita com base nas observações de Stables e Briggs (1980) e
também no trabalho de Oliveira (2013), neste último a autora utiliza soluções de
cloreto de sódio para eluir a Cefamicina C, molécula estruturalmente parecida com a
CPC, de uma coluna recheada com resina de troca iônica.
É importante ressaltar que nesta etapa experimental a solução de
alimentação era composta somente da CPC e o tampão utilizado, sendo que na
presença de outras substâncias contidas no caldo talvez seja necessária a variação
das condições de eluição, a fim de obter a separação eficiente entre a CPC e as
outras substâncias contidas. A CPC eluiu da mesma forma nas três concentrações
estudadas. A concentração da CPC durante os experimentos foi obtida através de
uma curva de calibração. A partir dela foi possível determinar a concentração da
CPC no ponto máximo de cada pico durante a eluição. Os valores encontrados
foram: 3,5, 4,0 e 4,5.10-2 g.L-1 para as concentrações iniciais de 3,7, 4,4 e 5,5.10-2
g.L-1, respectivamente. Os máximos valores de absorção encontrados geraram
valores de concentração de CPC um pouco abaixo daquela inicialmente injetada.
Isso pode ter ocorrido por não ter sido possível coletar uma fração que
representasse o máximo de absorção devido ao tempo de coleta das frações
previamente definido, ou ainda por parte da CPC ficar fortemente adsorvida à resina
mesmo após a aplicação da solução eluente. Pode ser observado também que com
o aumento da concentração da solução de alimentação os picos eluídos
aumentaram de intensidade como era de se esperar, devido à proporcionalidade
entre esses parâmetros quando a quantidade de solução de alimentação injetada é
a mesma.
Os cromatogramas mostraram também, em todas as concentrações
estudadas, um alargamento da cauda do pico da CPC. Segundo Collins (2006), esse
comportamento pode ocorrer devido à uma alta afinidade entre a CPC e a resina,
fazendo com que o processo de dessorção não ocorra idealmente. A solução
eluente também afeta nessa situação e a modificação de sua força pode melhorar os
picos.
45
Outro ponto que pôde ser observado nos cromatogramas é que a etapa de
lavagem após a saturação do leito não foi realizada de forma satisfatória quando a
concentração de CPC na solução de alimentação aumentou, visto que houve
absorção significativa nas frações coletadas nesta etapa para as concentrações de
4,4 e 5,5.10-2.g.L-1 de CPC. Apenas na concentração mais baixa aplicada, a etapa
de lavagem foi realizada de forma eficiente, pois a absorbância atingiu praticamente
zero, mostrando que o material não adsorvido que se encontrava na coluna foi
totalmente retirado. Esses resultados mostram que é necessário aumentar o tempo
de limpeza da coluna após a saturação do leito antes de promover a eluição do
composto.
Na Figura 14 é possível observar o comparativo dos cromatogramas da CPC
nas três diferentes concentrações estudadas.
Figura 14 – Comparativo dos cromatogramas da CPC nas diferentes concentrações
estudadas.
Fonte: O AUTOR, 2013.
Tomando-se por base o máximo de absorbância do pico como referência
para se determinar o tempo de retenção, houve variação máxima de cerca de 20
minutos entre as três concentrações estudadas. A existência desta diferença de
tempo de retenção não pode ser atribuída à variação da concentração já que se
observa que não há relação entre o aumento da concentração e aumento de tempo
ou aumento de concentração e diminuição de tempo. O comportamento se mostra
46
aleatório e pode, talvez, ser atribuído às condições operacionais que não puderam
ser controladas, como a temperatura, (Que influencia diretamente no processo de
adsorção/dessorção do composto) e a vazão do sistema. A falta de controle dessas
variáveis ocorreu, pois, nesta etapa o arranjo experimental usado foi bastante
simples, composto apenas por uma bureta usada como leito, sendo a vazão
ajustada na torneira da mesma e a temperatura seguindo a temperatura do
ambiente, já que a bureta não possuía sistema de controle de temperatura.
Com base nos resultados obtidos partiu-se para realização de modificações
no processo a fim de se obter um melhor perfil de eluição da CPC. Nesta etapa, o
arranjo experimental usado foi mais complexo, a coluna usada era encamisada e
acoplada a um banho termostatizado com controlador eletrônico de temperatura e a
vazão do sistema foi controlada com uma bomba peristáltica. As medidas de
absorbância foram realizadas em espectrofotômetro UV/Visível em λ= 260 nm.
Os pontos de interesse dessa etapa foram:
Obter uma lavagem efetiva do leito após a etapa de alimentação e adsorção
do antibiótico;
Um estreitamento do pico de eluido da CPC e também fazer com que a cauda
do pico não fosse alargada.
A fim de atingir os objetivos descritos anteriormente, as ações tomadas
foram:
Aumento da quantidade e consequentemente do tempo de passagem de
água na etapa de lavagem do leito;
Controle da vazão do sistema com a bomba peristáltica.
Uso do controle de temperatura para tentar evitar o alargamento do pico.
E diminuição do tamanho do leito para tentar o estreitamento do pico.
O resultado dessas ações pode ser observado na Figura 15. O perfil de
eluição da CPC obtido mostra a região de adsorção atingindo a concentração de
alimentação inicial de 4,0.10-2 g.L-1, seguido de uma etapa de lavagem realizada de
forma eficiente devido ao aumento da quantidade de água injetada após a
alimentação. O aumento do tempo de lavagem fez com que a concentração de CPC
atingisse zero, mostrando que todo o material não adsorvido foi eliminado do interior
47
do leito. A eliminação de todo material não adsorvido é necessária, pois, o mesmo
pode influenciar na etapa posterior de eluição, podendo causar desvios nos
resultados de concentração do pico de interesse. A eluição realizada novamente
com a solução de cloreto de sódio a 4,0% m/V, mostrou-se satisfatória, sendo que,
assim que aplicada já fez com que a CPC fosse dessorvida do leito.
A diminuição do tamanho do leito fez com que o pico se tornasse mais
estreito, já que inicialmente a CPC era coletada em um intervalo inicial de cerca de
mais de 30 minutos e depois dessa ação o pico foi coletado em um intervalo de
frações de 20 minutos.
O máximo do pico de CPC eluído teve concentração um pouco abaixo da
concentração inicialmente injetada, mostrando que os intervalos de coleta podem ter
influenciado novamente, deixando o ponto máximo passar sem ter sido coletado em
nenhuma fração, fazendo ocorrer este resultado. Porém, observou-se que o controle
de temperatura não fez com que a cauda do pico desaparecesse. Outra maneira de
tentar fazer com que o pico tenha melhor aparência seria alterar as características
da solução de eluição sendo que os parâmetros que podem ser alterados são o pH e
a concentração da mesma.
Figura 15 – Perfil de eluição da CPC após tentativa de melhoria do processo.
48
4.2 CURVAS DE RUPTURA
Após obter o perfil de eluição da CPC na coluna recheada com a resina IRA
410 e verificar que houve boa interação entre o antibiótico e a resina, partiu-se para
a etapa de levantamento das curvas de ruptura. Através das curvas de ruptura é
possível se obter uma série de informações acerca do processo, como descrito na
seção de metodologia. Além disso, as curvas de ruptura servem também como base
para se realizar o aumento de escala do mesmo.
A obtenção das curvas de ruptura para a CPC na coluna recheada com a
resina IRA 410 foi feita seguindo o procedimento apresentado anteriormente na
seção de metodologia, variando-se a vazão do sistema A concentração da solução
de alimentação foi mantida constante e a eluição após a saturação do leito feita com
uma solução de NaCl 4,0% m/V. As frações coletadas foram analisadas por
espectrofotometria no UV em λ=260 nm. As curvas de ruptura foram obtidas com
base na metodologia de Geankoplis (2003) onde a razão entre a concentração final
sobre a inicial é registrada em função do tempo de corrida.
As curvas de ruptura da CPC foram obtidas com sucesso de acordo com a
metodologia proposta. O tempo necessário para se atingir o ponto de ruptura onde
C/C0= 0,1 foi rápido variando entre 1 a 6 minutos para as vazões utilizadas,
significando que a vazão não exerceu influência significativa sobre esse ponto. Para
as vazões de 2,8 e 5,3 mL.min-1 o ponto de ruptura ocorreu praticamente ao mesmo
tempo entre 1,5 a 2,5 minutos. Já para a vazão de 4,0 mL.min-1, o ponto demorou
um pouco mais para ocorrer em cerca de 6 minutos.
O tempo necessário para se obter valores de C/C0 próximos da unidade foi
menor quando a vazão do sistema foi mantida em 4,0 mL.min-1, nas outras vazões o
tempo decorrido para que isso ocorresse foi maior, portanto, não houve evidência de
uma relação entre vazão de operação do sistema e o tempo de saturação do leito.
Outro fato observado é que em nenhuma das vazões foi possível obter C/C0 = 1. Os
valores mais próximos encontrados foram, 0,932, 0,984 e 0,868 para os valores de
vazão de 5,3, 4,0 e 2,8 mL.min-1, respectivamente. Na vazão de 2,8 mL.min-1, os
valores de C/C0 ficaram bem abaixo da unidade apesar do longo tempo de
saturação. Já nas vazões de 5,3 e 4,0 mL.min-1, os valores obtidos foram próximos a
1, sendo que o maior valor de 0,984 foi encontrado para este último valor de vazão,
49
apesar de que neste valor de vazão o tempo gasto para atingir o ponto de ruptura foi
maior do que nos outros ensaios.
Na Figura 16 está ilustrado comparativo entre as curvas de ruptura obtidas
nas vazões citadas anteriormente é mostrado.
Figura 16 – Comparativo das curvas de ruptura da CPC nas vazões de 2,8, 4,0 e 5,3
mL.min-1.
As curvas obtidas não seguiram um padrão de formato e também não
apresentaram relação entre a variação de vazão e o surgimento do ponto de ruptura,
ou relação da vazão com o tempo onde C/C0~1. Alguns fatores podem ter
influenciado neste comportamento aleatório apresentado. Devido a questões de
ordem técnica, a temperatura do ambiente em torno da coluna não pôde ser
controlada, além disso, os ensaios para cada vazão foram realizados em dias
diferentes. A falta de controle da temperatura aliada à variação climática de um dia
para o outro e até mesmo a variação ocorrida durante cada experimento pode ter
influenciado no comportamento do processo já que a temperatura é um fator
determinante em processos de adsorção. Segundo Collins (2006) a variação da
temperatura pode influenciar nas interações entre a molécula alvo e o adsorvente e
assim alterar o processo de adsorção. Nos trabalhos encontrados na literatura onde
são realizados experimentos para observar o comportamento de processos de
50
adsorção (BARBOZA, HOKKA e MAUGERI, 2002 e BARBOZA, ALMEIDA e
HOKKA, 2003) nota-se que a temperatura é sempre controlada durante o
experimento. O controle de temperatura durante a cromatografia em coluna pode
ser realizada usando colunas encamisadas que permitem a passagem de água com
temperatura controlada através de banhos termostatizados, como observado no
trabalho de Oliveira (2013). Neste, a autora estuda o processo de purificação da
Cefamicina C e busca avaliar o processo de adsorção deste antibiótico em colunas
de leito fixo. Barboza, Almeida e Hokka (2003) estudaram o efeito da temperatura no
processo de adsorção do ácido clavulânico na resina IRA 400 e mostram que esse
fator influencia no processo de dessorção da molécula, que é facilitado pelo
aumento da temperatura.
Apesar da não uniformidade apresentada pelas curvas de ruptura obtidas foi
possível calcular os parâmetros do processo em coluna para cada vazão segundo a
metodologia proposta por Cren et al (2009) e por Geankoplis (2003). Os resultados
são vistos na Tabela 8.
Tabela 8 – Parâmetros da coluna nas três vazões estudadas.
Parâmetro/Vazão 2,8 mL/min 4,0 mL/min 5,3 mL/min
Tt (min) 25,612 14,812 18,698
Te (min) 61 36 72
Tu (min) 2,3746 6,4757 1,62485
Tb (min) 2,44 6,72 1,65
εr (%) 97,3 96,4 98,5
εf (%) 9,3 43,7 8,7
P (mg/min) 0,043 0,061 0,051
Ht (cm) 16,5 16,5 16,5
Hb (cm) 1,53 7,21 1,43
Hu (cm) 14,97 9,29 15,07
Fonte: O AUTOR, 2013.
As eficiências de remoção do soluto (εr) calculadas atingiram níveis
satisfatórios para todas as vazões estudadas. Foram obridos valores de eficiência
acima de 95%, mostrando que a resina foi capaz de reter a CPC da solução de
alimentação. Já as eficiências (εf) relacionadas ao uso da capacidade do leito
apresentaram valores baixos. Essas eficiências apresentaram os valores de 9,3,
43,7 e 8,7% para os valores de vazão de 2,8, 4,0 e 5,3 mL.min-1, respectivamente.
51
Notou-se durante os cálculos que o fator A3, obtido segundo a metodologia proposta
por Cren et al (2009), e usado no cálculo da eficiência de uso do leito, apresentou
altos valores para todas as vazões. Esse fator, segundo a autora, está relacionado
com a parte do leito que não é usada de forma eficiente, já que parte da adsorção
ocorre entre o ponto de ruptura e o ponto onde C/C0~1. Segundo Geankoplis (2003),
essa região da curva, conhecida como zona de transferência de massa, quanto mais
estreita e íngreme gera melhor uso do leito. Dessa forma, algum processo paralelo
pode estar ocorrendo, como a formação de canais preferenciais, que impedem o uso
do leito seja mais eficiente durante o processo.
Comparando com o trabalho de Oliveira (2013) onde a autora usa a mesma
metodologia para obter os parâmetros da coluna recheada com a resina Sepharose
QXL na purificação da Cefamicina C, molécula bem parecida com a CPC, os
resultados mostram tanto a remoção eficiente do soluto, quanto o uso eficiente do
leito. Todos os valores obtidos foram acima dos 95%. Nota-se que as curvas de
ruptura obtidas pela autora em diferentes vazões mostram perfis semelhantes entre
si, e também se mostram bem íngremes e estreitas na região que vai do ponto de
ruptura ao valor de C/C0~1 (zona de transferência de massa). A região referente a A3
nas curvas da autora exibem baixos valores, refletindo em altas eficiências de uso
do leito.
Quanto à altura do leito usado nesse trabalho, observaram-se valores bem
baixos em relação à altura total do leito para as três vazões estudadas, e por
consequência, os valores de altura não usada do leito foram bem próximos ao valor
de altura total do leito. O fato de grande parte da altura do leito não ter sido usado
pode indicar que a coluna suporta maior quantidade de CPC. Esses resultados vão
de encontro aos baixos valores de eficiência de uso do leito obtidos a partir das
áreas das curvas de ruptura.
Apenas na vazão de 4,0 mL.min-1 nota-se o uso de 7,21 cm da altura do
leito, eficiência de uso de 43,7% porém, como a forma da curva de ruptura nesta
vazão apresentou considerável diferença das demais não é possível concluir se o
valor de eficiência de uso do leito e altura de leito usada são devido ao valor da
vazão ser o ideal para operação nas condições usadas ou se ocorreu algum erro
que levou aos resultados obtidos.
Os tempos tt e te se mostraram muito diferentes para todas as vazões, sendo
que a literatura indica que em situações favoráveis tt e te devem exibir valores
52
próximos. Por outro lado os tempos tu e tb, apresentaram valores próximos. Esse
comportamento é o encontrado na literatura, que diz que tu e tb devem exibir valores
próximos (GEANKOPLIS, 2003; OLIVEIRA, 2013).
Os valores das produtividades foram baixos para todas as vazões
estudadas. O valor deste parâmetro é diretamente proporcional à relação entre tt e te,
como nos experimentos os valores de te foram altos em relação aos de tt, devido a
grande zona de transferência de massa exibida nas curvas, as relações entre os
tempos para cada vazão foram baixos, acarretando em baixos valores obtidos para
as produtividades.
Os valores de eficiência de uso do leito, tamanho usado do leito e o formato
da curva obtidos a vazão de 4,0 mL.min-1 foram muito diferentes dos valores obtidos
para outras vazões. Isso pode ter sido causado pela falta de controle na temperatura
e na vazão dos experimentos, causando diferenças nos resultados obtidos.
A fim de verificar se a temperatura e a vazão influenciaram de alguma forma
o processo de adsorção na coluna, os experimentos de obtenção das curvas de
ruptura foram repetidos. A temperatura do sistema pode influenciar os processos de
adsorção e dessorção da molécula na resina, acelerando ou desacelerando alguma
dessas etapas e assim alterar a forma das curvas de ruptura. Barboza, Almeida e
Hokka (2003) trabalhando com a adsorção do ácido clavulânico em resinas tipo
XAD, observaram que o aumento da temperatura favoreceu a dessorção da
molécula da resina. Como no presente trabalho a vazão era controlada
manualmente usando uma bureta, pode ter ocorrido algum erro associado a este
parâmetro durante a execução do experimento, podendo causar erros
principalmente quanto ao surgimento do ponto de ruptura. Os baixos valores de
eficiência de uso do leito e altura usada podem estar associados ao uso de um leito
muito grande para a concentração de CPC usada.
Nesta nova etapa, a temperatura foi controlada com o auxílio de uma coluna
encamisada acoplada a um banho termostatizado. A vazão foi controlada através de
uma bomba peristáltica conectada à entrada da coluna. Os experimentos foram
realizados nas mesmas condições iniciais, variando a vazão em 3,0, 4,0 e 5,0
mL.min-1 e mantendo a concentração de CPC a 4,0.10-2 g.L-1 e a temperatura
constante 25°C. Outra modificação feita foi diminuir o tamanho do leito, visando
aumentar a eficiência de uso do leito e a altura usada de forma eficiente.
53
Na figura 17, as curvas de ruptura obtidas com o controle de temperatura e
vazão podem ser observadas.
Figura 17: Comparativo das curvas de ruptura com controle de temperatura e vazão.
De início pôde ser observado que mesmo com o controle da temperatura e
da vazão, as curvas não apresentaram um formato ideal como o visto na literatura
(GEANKOPLIS, 2003). Novamente a zona de transferência de massa, região que se
estende do ponto de ruptura até C/Co, se mostrou muito extensa e a região
associada ao fator A3 novamente teve altos valores, diferentemente do
comportamento ideal. Esse fato indica que os parâmetros não controlados
inicialmente não influenciaram no formato não ideal das curvas e que esses
formatos obtidos representam realmente o processo de adsorção da CPC na resina
IRA 410 nas condições de operação adotadas.
No trabalho de Lee e Moon (1999) os autores trabalham com o efeito do pH
na adsorção da CPC na resina neutra SP850. Os autores relatam que adsorção da
CPC nesta resina depende fortemente do pH, já que a mudança do mesmo faz com
que CPC se apresente de diferentes formas devido a sua natureza anfótera e essas
diferentes formas fazem com que a CPC tenha sua afinidade com a resina alterada.
Um dos efeitos que chamaram a atenção dos autores é que quando pH é colocado
em baixos valores as curvas de ruptura têm suas formas alteradas, se mostrando em
formas características de sistemas multicomponentes. Nas curvas obtidas para pH
54
em torno 3,5 os autores obtiveram curvas de ruptura onde o formato apresenta
desvios do formato ideal. Nessas curvas também nota-se que C/Co não atinge valor
de 1. Os autores atribuem esses comportamentos ao fato de que nem todas as
moléculas estão na forma iônica, forma essa favorável para que haja interação com
a resina. Este fato também pode explicar o formato das curvas obtidas no presente
trabalho e também o fato de nem todas as curvas atingirem o valor de C/Co=1, já
que no pH de 3,6 nem toda a CPC está na forma aniônica, o que seria o necessário
para ocorrer a adsorção por troca aniônica com a resina IRA410.
Os pontos de ruptura surgiram mais rapidamente de acordo com o aumento
da vazão. Este tipo de comportamento é o esperado, já que o aumento da vazão faz
com que o mesmo tamanho de leito receba maior volume de solução de alimentação
em um mesmo tempo sendo saturado mais rapidamente. Na etapa anterior, o ponto
de ruptura referente à vazão de 4,0 mL.min-1 havia saído por último, nesta nova
etapa os pontos de ruptura seguiram a tendência normal. No trabalho de Oliveira
(2013) em que a autora obtém as curvas de ruptura da Cefamicina C em colunas
recheadas com a resina de troca iônica Sephadex QLX, o comportamento do
surgimento dos pontos de ruptura também se deu dessa forma, aparecendo em
menores tempos com o aumento da vazão.
É possível observar também que apesar do surgimento do ponto de ruptura
acontecer mais rapidamente em maiores valores de vazões, as diferenças entre os
tempos de surgimento nas três vazões não foram significativos, isso indica que o
sistema pode ser operado em qualquer dos três valores sem que haja perdas
significativas em termos econômicos, os valores de surgimento dos tempos de
ruptura variaram entre 2,5 a 5 minutos. Este comportamento pode ser atribuído ao
uso do controle de vazão, já que anteriormente, sem o uso do controle, não foi
observada a relação correta entre o aumento da vazão e o surgimento do ponto de
ruptura.
Outro ponto observado é que nas vazões de 4,0 mL.min-1 e 5,0 mL.min-1 foi
possível atingir C/Co=1, enquanto na vazão de 3,0 mL.min-1 o máximo atingido foi de
C/Co=0,935. Esse comportamento também foi observado nas curvas de ruptura
obtidas inicialmente, onde nas maiores vazões foi possível obter C/Co bem próximos
à unidade e na vazão mais baixa C/Co atingiu o valor máximo de 0,868. Nesta
etapa, os controles de temperatura e vazão possibilitaram que fossem atingidos
maiores valores de C/Co, já que anteriormente apesar da proximidade dos valores à
55
unidade, nenhum atingiu o valor de C/Co=1, como ocorreu quando os experimentos
foram realizados com esses controles.
A fim de comparação foram calculados também os parâmetros da coluna
para os experimentos realizados com os controles de temperatura e vazão. Os
resultados são mostrados na Tabela 9.
Tabela 9- Parâmetros da coluna para os experimentos realizados com controle de
temperatura e vazão.
Parâmetro/Vazão 3,0 mL/min 4,0 mL/min 5,0 mL/min
Tt (min) 16,424 9,733 12,907
Te (min) 45 30 33
Tu (min) 4,235 3,5167 2,625
Tb (min) 4,30 3,56 2,71
εr (%) 98,5 98,8 96,9
εf (%) 25,8 36,1 20,3
P (mg/min) 0,044 0,052 0,078
Ht (cm) 10,0 10,0 10,0
Hb (cm) 2,58 3,61 2,03
Hu (cm) 7,42 6,39 7,97
Fonte: O AUTOR, 2014.
Os cálculos dos parâmetros do processo em coluna para os experimentos
com controle de temperatura e vazão mostraram primeiramente que os pares de
tempos tt e te novamente apresentaram diferenças significativas em seus valores,
mesmo com a diminuição do leito de 16,5 para 10,0 cm. Porém, essa diferença do
par de tempos foi menor do que aquela apresentada entre o mesmo par de tempos
dos ensaios iniciais. Ou seja, a diminuição do tamanho do leito mostra que há uma
tendência na aproximação dos tempos tt e te. O par tu e tb manteve o comportamento
anterior, de valores bem próximos.
A eficiência εr relacionada à capacidade do leito de remover o soluto
continuou apresentando valores acima de 95%, como anteriormente, sendo que o
maior valor atingido foi de 98,8%, quando a vazão do sistema foi de 4,0 mL.min-1. Os
valores obtidos foram satisfatórios, mostrando que a resina IRA 410 interage bem
com CPC.
Já a eficiência εf relacionada ao uso eficiente do leito, continuou
apresentando valores considerados baixos. Porém, em comparação aos valores
anteriormente obtidos, nota-se que houve um aumento significativo principalmente
56
entre as vazões de 2,8 mL.min-1 inicial e 3,0 mL.min-1 neste experimento, saltando
de 9,3 para 25,8%, e entre as vazões 5,3 mL.min-1 inicial e 5,0 mL.min-1 neste
experimento, saltando de 8,7 para 20,3%. Para vazão de 4,0 mL.min-1 inicial para 4,0
mL.min-1 deste experimento, houve a redução de valor de 43,7% para 36,1%. Os
relativos aumentos podem devem estar associados ao menor tamanho de leito
utilizado, já que essa eficiência está diretamente relacionada aos parâmetros de
tempos e áreas que foram melhores com a diminuição do leito. O decaimento da
eficiência para vazão de 4,0 mL.min-1 mostra que pode realmente ter ocorrido erro
no experimento inicial, porém, observa-se também que apesar da suspeita do erro
inicial, novamente nesta vazão foi obtido o maior valor de eficiência do uso do leito,
indicando também que esta pode ser vazão ideal para trabalhar nas condições deste
trabalho.
As alturas usadas dos leitos também foram maiores do que as apresentadas
inicialmente quando comparadas aos respectivos pares. Esse fato mostra que a
diminuição do tamanho leito surtiu um leve efeito e se mostra como possível
caminho para aumentar a eficiência de uso do leito. Observa-se também que o
maior valor de uso do leito foi obtido para a vazão de 4,0 mL.min-1, reforçando a
ideia de que este valor de vazão pode ser o melhor para operar o sistema.
As produtividades obtidas não foram significativamente maiores do que as
obtidas inicialmente, isso se deve ao fato da dependência deste parâmetro da
relação entre tt e te, que continuou baixa devido a grande diferença entre esse par de
tempos. Observou-se também o aumento proporcional da produtividade de acordo
com o aumento da vazão do sistema.
Os resultados obtidos indicam que para os trabalhos futuros a escala da
coluna pode ser projetada para diminuir ainda mais o tamanho do leito e quantidade
de resina, ou ainda, aumentar a concentração da CPC na solução de alimentação
mantendo-se o tamanho do leito, a temperatura constante. E assim identificar se de
fato o tamanho do leito é o principal influente nos valores de eficiência de uso do
leito e altura usada. Outro ponto que pode ser abordado é se variação de
temperatura pode alterar a forma das curvas de ruptura, melhorando-as.
Portanto neste estudo, as ações tomadas a fim de melhorar os parâmetros
da coluna foram direcionadas de maneira correta, já que o controle de vazão trouxe
uniformidade e comportamento esperado aos tempos de ruptura, e o controle de
57
temperatura associado à diminuição do tamanho do leito trouxe aumento no valor de
eficiência de uso do leito e altura usada.
4.3. CINÉTICA E ISOTERMA DE ADSORÇÃO
4.3.1 Cinética de adsorção
A fim de estudar o comportamento da CPC na resina IRA410 foram
realizados experimentos a cerca da cinética e da isoterma de adsorção.
Primeiramente para se obter indicações de como ocorre a variação da concentração
de CPC ao longo do tempo e também de possíveis mecanismos foi realizado o
experimento de cinética. O resultado obtido é mostrado na Figura 18.
Figura 18 – Cinética de adsorção da CPC na resina IRA410 a 30°C.
Nota-se primeiramente que o processo entra em equilíbrio em curto período
de tempo, já que em cerca de 5,5 minutos já não é possível notar mais variação na
relação entre as concentrações inicial e final. Até o fim do experimento em 60
minutos a relação entre as concentrações manteve-se constante, indicando que
58
realmente o sistema atingiu o equilíbrio. Nota-se também que a resina foi capaz de
adsorver aproximadamente 45% da CPC da alimentação inicial, já que no equilíbrio
C/Co atingiu o valor de 0,55.
Para obter parâmetros quantitativos e propor algum mecanismo para o
processo de adsorção da CPC na resina IRA410 a curva de cinética foi ajustada a
modelos de reação de primeira e segunda ordem. Para obtenção do modelo de
primeira ordem foi traçado um gráfico do logaritmo natural da concentração final
(Ln(Cf)) em função do tempo (t), sendo que, o intervalo de tempo usado foi do inicio
do processo até o tempo onde o sistema atinge o equilíbrio em 5,5 minutos. Já para
o ajuste de segunda ordem, traçou-se um gráfico de um sobre a concentração final
de CPC (1/Cf) em função do mesmo intervalo de tempo (t) descrito no ajuste de
primeira ordem. A figura 19 a seguir mostra o comportamento cinético ajustado aos
dois modelos.
Figura 19 – Ajuste da cinética de adsorção da CPC na resina IRA410 aos modelos de
reação de primeira e segunda ordem.
Através do ajuste aos modelos de primeira e segunda ordem pode-se
observar que o processo de adsorção da CPC na resina ficou mais bem ajustado ao
modelo de segunda ordem, já que o R2=0,99 do modelo de segunda ordem foi maior
que o R2=0,94 do modelo de primeira ordem. Este resultado vai de acordo com a
59
suposição da existência de uma possível “reação” entre a CPC e a resina formando
um complexo no sítio ativo da mesma. É possível inferir também que tanto a
concentração da CPC quanto a concentração (quantidade) de resina são
importantes para o processo de adsorção. A constante K encontrada para o
processo de segunda ordem apresentou o valor de 3,011L.g-1.s-1.
Barboza, Hokka e Maugeri (2002) estudaram o mecanismo de adsorção da
CPC na resina XAD2, e apesar das características desta resina serem distintas das
características da resina IRA410, os autores também trabalham com a possibilidade
do mecanismo de adsorção se basear em uma reação entre a CPC e o sítio ativo da
resina, sendo que suas suposições são corroboradas por simulações que se
aproximam com bastante fidelidade aos resultados experimentais.
No caso do processo de adsorção da CPC na resina IRA410 pode-se propor
então um mecanismo, baseado no mecanismo geral proposto por Barboza, Hokka e
Maugeri (2002), também com base nos resultados obtidos nos ajustes cinéticos e
levando-se em conta a troca iônica e a dependência das concentrações de CPC e
de resina, como mostrado a seguir.
4.3.2. Isoterma de adsorção
Outro ponto investigado no processo de adsorção da CPC na resina IRA410
foi o comportamento da isoterma de adsorção. As isotermas de adsorção da CPC já
foram bastante exploradas na literatura, porém, todos os estudos encontrados
abordam os processos realizados em resinas neutras como adsorvente. Nesta etapa
obteve-se uma isoterma a 30°C do processo de adsorção da CPC na resina IRA410,
onde q* é a concentração de CPC na fase sólida (resina) e Cf* a concentração de
CPC na fase líquida. O resultado é observado na figura 20.
60
Figura 20 - Isoterma de adsorção da CPC na resina IRA410 a temperatura de 30°C.
Inicialmente é possível observar que a isoterma tem uma tendência linear
bastante acentuada, visto que o ajuste linear realizado levou a um R2= 0,99. Este
resultado vai de encontro ao comportamento visto na literatura, já que vários autores
destacam que ao se trabalhar em regiões de soluções diluídas o comportamento das
isotermas tende a ser descrito pela lei de Henry que é uma relação linear
(GEANKOPLIS, 2003, CHAUBAU, 1995). Neste caso as soluções de alimentação
usadas foram de concentração 10,4, 30,2, 44,1 e 58,1 mg.L-1, respectivamente, ou
seja, soluções de baixa concentração. O valor de K encontrado para o modelo foi de
8,71.10-3 L.g-1, como não foram encontrados dados sobre o processo de adsorção
em resinas trocadoras de íons o K encontrado não pode ser comparado com outros
K de mesma natureza. Os valores descritos para outras resinas que adsorvem a
CPC, como as neutras XAD2, XAD4 e XAD16 têm isotermas ajustadas por outras
relações como Langmuir e Freundlich, fato que dificulta a comparação com o
resultado obtido para a IRA410.
Como o R2 para o ajuste foi igual a 0,99 pode-se concluir que o sistema
operado a 30°C e pH de 3,6 na faixa de concentração estudada de 10,4 a 58,1 mg.L-
1 é bem representado pelo modelo linear. Em trabalhos futuros, as isotermas serão
61
obtidas em diferentes valores de temperatura e também em diferentes valores de pH
a fim de coletar mais dados a cerca do processo de adsorção da CPC na resina
IRA410 e também em termos de comparação entre os parâmetros.
4.4. SEPARAÇÃO DA CPC E METIONINA
O aminoácido metionina é considerado um potencial contaminante do caldo
fermentado de onde a CPC é obtida, já que o mesmo é adicionado na alimentação
do sistema e pode não ser totalmente consumido. A fim de verificar a possibilidade
de separar a CPC do aminoácido metionina que é um potencial contaminante do
caldo fermentado usando a resina IRA410 foi realizado um experimento simulando
um caldo contendo a CPC e a metionina. A solução mimética foi preparada a uma
concentração de 4,9.10-2 g.L-1 de CPC e também de metionina e o pH ajustado para
3,6. A solução foi injetada na coluna cromatográfica recheada com a resina IRA410,
até que o sistema atingisse o ponto de ruptura. Essa alimentação foi planejada a
partir dos dados obtidos anteriormente através das curvas de ruptura. A eluição foi
realizada com soluções de cloreto de sódio nas concentrações de 0,1, 0,5, 1,0 e
4,0% m/V, em modo gradiente degrau. A análise das frações coletadas foi realizada
através de espectrofotometria no UV/Visível em comprimento de onda de 260 nm. A
quantificação da metionina foi realizada através de cromatografia líquida de alta
eficiência utilizando-se um Cromatógrafo com detector de arranjo de diodos (Waters
996 – PDA), uma coluna de fase reversa (µ-Bondapak C18 - 3,9 x 300 mm) e o
equipamento foi operado dentro das seguintes condições: vazão de 2,5 mL.min-1,
temperatura de 28C e os picos foram detectados em 220 nm.
O cromatograma da separação entre CPC e a metionina é observado na
figura 21.
62
Figura 21- Cromatograma obtido da separação entre CPC e metionina.
Observa-se no cromatograma que na região de alimentação do sistema o
planejamento foi executado com sucesso, com a concentração de CPC
ultrapassando um pouco o ponto de ruptura da coluna. Este planejamento faz com
que a alimentação seja realizada de forma a evitar o desperdício da solução que
alimenta o sistema, e que o mesmo seja usado com eficiência.
Na etapa de lavagem também é observado um resultado satisfatório, já que
praticamente todo material não adsorvido é lavado da coluna visto que as
concentrações das substâncias neste período são iguais a zero para metionina e
igual a 0,09.10-2 g.L-1 para a CPC no momento anterior ao que a eluição é iniciada.
A eluição foi iniciada com a solução de cloreto de sódio a 0,1%, durante o
período que essa solução foi aplicada na coluna. Notou-se que a CPC começou a
ser removida, atingindo um valor máximo de 1,2.10.10-2 g.L-1. Em seguida, a
concentração da solução de eluição foi aumentada para 0,5%, neste período a CPC
continuou sendo dessorvida da coluna, apresentando um máximo de concentração
de 0,89.10-2 g.L-1. A concentração da solução de eluição foi aumentada mais duas
63
vezes, para 1,0 e 4,0%, respectivamente, porém não foram observados mais picos
referentes à CPC durante o restante da corrida cromatográfica.
O pico referente à CPC obtido mostrou-se largo sem formato definido e
saindo durante um grande período de tempo. Esse comportamento se deve ao modo
de eluição aplicado que começou com soluções de NaCl diluídas, fazendo com que
a CPC fosse se dessorvendo da resina aos poucos e de forma lenta, causando o
alargamento do pico. Esse modo de eluição se mostrou menos eficiente do que o
modo isocrático aplicado nos experimentos de ruptura. O alargamento do pico causa
desvantagens econômicas já que o produto de interesse sairá da coluna menos
concentrado e distribuído em maior volume de solvente.
Com relação à metionina observou-se que a mesma foi detectada apenas
durante a alimentação do sistema e durante a etapa de lavagem. A metionina não foi
detectada durante a etapa de eluição. Esse resultado indica que a mesma não foi
adsorvida na resina. Este fato pode ser atribuído ao efeito do pH de 3,6 da solução.
A metionina possui valores de pK iguais a 2,28 e 9,21 (NELSON, COX, 2000).
Abaixo do valor de 2,28 a molécula deste aminoácido encontra-se totalmente
protonada (carregada positivamente). Acima do valor de 9,21 a metionina encontra-
se totalmente desprotonada (carregada negativamente). Por fim, em valores ao
longo do intervalo de 2,28 e 9,21 a metionina encontra-se em um estado onde seu
grupamento amino está protonado e o grupo ácido carboxílico desprotonado, desta
forma, a molécula apresenta uma carga líquida igual zero. A figura 22, mostra os
estados da molécula da metionina de acordo com os valores de pH.
Figura 22: Estados da molécula da metionina de acordo com seu pK.
Fonte: O AUTOR (Desenho no programa Chemsketch®, 2014).
Este fato faz com que, provavelmente, a metionina comporte-se como uma
molécula neutra não sendo adsorvida na resina IRA410, passando diretamente pela
coluna.
64
65
5. CONCLUSÕES
A primeira etapa experimental mostrou que a CPC interagiu bem com a
resina. Foi possível obter o perfil de eluição do antibiótico em diferentes
concentrações. Os perfis obtidos não mostraram diferenças significativas, mostrando
que a resina é capaz de adsorver a CPC em diferentes condições de concentração.
O melhoramento do perfil de eluição foi realizada com sucesso, a CPC
adsorveu na resina IRA 410, a etapa de lavagem realizada com maior quantidade de
água possibilitou a completa remoção de CPC não adsorvida do leito. A eluição do
antibiótico realizada com a solução de cloreto de sódio a 4% m/v se mostrou
eficiente, o pico obtido não é largo e elui em um tempo pequeno a partir da aplicação
da solução de eluição, sendo assim, viável economicamente. A diminuição do
tamanho do leito fez com a CPC fosse recuperada em um menor intervalo de tempo.
Das curvas de ruptura em diferentes vazões foi possível obter os parâmetros
relacionados à coluna. Os parâmetros da coluna que foram inicialmente obtidos
mostraram altos valores de eficiências com relação à remoção do soluto da solução,
porém, as eficiências de uso do leito, as alturas usadas do leito e a produtividade do
processo apresentaram valores baixos. Outro fato observado foi que as curvas de
ruptura não apresentaram formatos parecidos, sendo que em todas houve a
presença de uma área grande entre o ponto de ruptura e o ponto onde a
concentração de produto na saída da coluna é próxima a concentração da solução
de alimentação inicial, contrariando dessa maneira o perfil dito desejável pela
literatura, que diz que a curva deve exibir nessa região um perfil íngreme e estreito
que gera o uso eficiente do leito.
Por não ter havido o controle de temperatura e vazão durante a obtenção
das primeiras curvas de ruptura, os experimentos foram repetidos controlando a
vazão e a temperatura, além de diminuir o tamanho do leito. As ações tomadas
fizeram com que os pontos de ruptura seguissem a tendência descrita na literatura
onde processos com vazão maior tendem a apresentar o ponto de ruptura em
tempos menores daqueles operados com vazões mais baixas, promoveram a
aproximação dos tempos tt e te, aumentaram a eficiência de uso do leito, porém os
resultados ainda foram baixos. Essas ações levaram também a obtenção de perfis
semelhantes para as curvas em todas as vazões estudadas, porém, esses formatos
ainda desviaram consideravelmente daqueles descritos na literatura.
66
Quanto à cinética pode-se concluir que foi o processo foi bem ajustado ao
modelo de reação de segunda ordem e, além disso, foi possível atribuir um possível
mecanismo de adsorção baseado em suposições descritas na literatura e nos
resultados obtidos. A isoterma obtida a 30°C, pH 3,6 e faixa de concentração de
10,4 a 58,1 mg.L-1 de CPC foi bem ajustada ao modelo linear. Este resultado é
apoiado pelos resultados descritos na literatura, onde para soluções diluídas as
isotermas tendem a seguir a lei de Henry que possui forma linear.
A estratégia usada para separar a CPC do contaminante metionina mostrou-
se satisfatória, já que a metionina não interagiu com a resina e saiu da coluna logo
que injetada, já a CPC foi adsorvida como previsto anteriormente e, em seguida
recuperada através da eluição com soluções de cloreto de sódio. Neste ponto notou-
se também que a forma de eluição por gradiente não proporcionou melhorias e o
modo de eluição isocrático usado nos ensaios de ruptura mostrou-se mais eficiente
já que faz com a CPC seja recuperada em menor tempo e em menos frações,
gerando economia de tempo e também de consumíveis para o processo.
Por fim, conclui-se que é viável o uso resina IRA410 como recheio da coluna
e o emprego da técnica de cromatografia de troca iônica para purificação da CPC
nas condições avaliadas no presente trabalho.
67
6. TRABALHOS FUTUROS
Futuramente existe a possibilidade de aumentar a complexidade do caldo
mimético para verificar as interações entre a resina IRA 410 e os aminoácidos
metionina, cisteína e valina, sendo que estes dois últimos também são
contaminantes do caldo. Ou ainda, trabalhar com um caldo fermentado original
oriundo da produção do antibiótico. Estudar as curvas de ruptura dos compostos a
fim de se obter as melhores condições de trabalho para o processo em coluna.
Existe também a possibilidade de estudar o efeito da variação do pH do
meio onde a CPC é solubilizada sobre os parâmetros do processo, já que o pH é de
extrema importância devido a natureza anfótera da molécula de CPC. Os efeitos do
pH sobre o processo cinético e também sobre as isotermas de adsorção da CPC na
resina IRA410 também poderão ser estudados.
Por fim, nota-se a possibilidade da aplicação de diferentes resinas para a
realização do processo o que seria importante para fins de comparação entre as
resinas e poder escolher aquela que melhor atende as condições de trabalho.
Obtendo curvas de ruptura e isotermas em diferentes temperaturas e também com
maiores concentrações de CPC.
68
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72
ANEXO
Propriedades da resina IRA 410.
Propriedade Especificação
Forma física Esferas amarelas pálidas
Matriz Copolímero Estireno Divinilbenzeno
Grupo funcional Dimetiletanol amômio
Forma iônica trocadora Cloreto
Capacidade total de troca ˃ 1,25 eq/L (Forma Cloreto)
Capacidade de retenção de umidade 40 a 51% (Forma Cloreto)
Tamanho de partícula médio 0,6 a 0,75 mm
Inchaço reversível ˂ 20%
FONTE: SITE SIGMA-ALDRICH, 2013.