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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE “TRÊS BAILARINAS” EM MODELOS EXPERIMENTAIS EM DIFERENTES NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO BIOLÓGICA. Natal, RN 2011

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Page 1: UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE ... · modelos experimentais em diferentes níveis de organização biológica / Nelson de Souza Pinto. - 2011. 57 f. Orientador

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE “TRÊS BAILARI NAS” EM

MODELOS EXPERIMENTAIS EM DIFERENTES NÍVEIS DE ORGAN IZAÇÃO

BIOLÓGICA.

Natal, RN

2011

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NELSON DE SOUZA PINTO

AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE “TRÊS BAILARI NAS” EM

MODELOS EXPERIMENTAIS EM DIFERENTES NÍVEIS DE ORGAN IZAÇÃO

BIOLÓGICA.

Dissertação apresentada à Universidade Federal do

Rio Grande do Norte - UFRN, para a obtenção do

título de Mestre em Ciências da Saúde pelo Programa

de Pós- graduação em Ciências da Saúde.

Orientador: PROF. DR. MARIO BERNARDO-FILHO

Colaborador: PROF. DR. SEBASTIÃO DAVID SANTOS-FILHO

Natal, RN

2011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenadora do Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde

Profa. Dra. Técia Maria de Oliveira Maranhão

Natal, RN

2011

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CATALOGAÇÃO NA FONTE

UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A

P659 Pinto, Nelson de Souza.

Avaliação de efeitos de um extrato de três bailarinas em modelos experimentais em diferentes níveis de organização biológica / Nelson de Souza Pinto. - 2011.

57 f.

Orientador : Mario Bernardo-Filho. Colaborador: Sebastião David Santos-Filho.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde.

1. Drogas vegetais - Dissertação. 2. Eritrócitos - Dissertação. 3. Tecnécio–99m - Dissertação. 4. Escherichia coli - Dissertação. I. Bernardo-Filho, Mario. II. Santos Filho, Sebastião David dos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. IV. Título.

CDU 615.32

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NELSON DE SOUZA PINTO

AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO DE “TRÊS BAILARINAS” EM

MODELOS EXPERIMENTAIS EM DIFERENTES NÍVEIS DE ORGAN IZAÇÃO

BIOLÓGICA.

PRESIDENTE DA BANCA: Prof. Dr. Mario Bernardo-Filho (UERJ)

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Técia Maria de Oliveira Maranhão

Profa. Dra. Aurimery Gomes Chermont

SUPLENTES

Prof. Dr Aldo da Cunha Medeiros

Prof. Dr. Sebastião David dos Santos Filho

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DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho:

A minha esposa, Alcy Batista da Costa, e aos meus filhos, Alan Costa de

Souza e Hugo Costa de Souza. Eles suportaram a minha ausência e vivenciaram

comigo todos os momentos de estresse e as dificuldades ocasionadas pela

sobrecarga de trabalho e das atividades pessoais acumuladas ao longo do período

de desenvolvimento do projeto de mestrado. Precisei muito da compreensão deles.

Os três são meus alicerces.

Aos meus seis irmãos, a todos os sobrinhos e sobrinhos netos. Juntos

formamos uma família maravilhosa.

In memoriam, de meu pai Nelson da Silva Pinto, minha mãe Odette de Souza

Pinto e minha irmã Neize Liliane de Souza Pinto, tenho certeza que estão

orgulhosos desse grande feito.

A meu orientador, Prof. Dr. Mario Bernardo Filho, por ter me acolhido.

A Deus por permitir que seu humilde servo tivesse alcançado mais essa

vitória.

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AGRADECIMENTOS

A Deus que com sua infinita misericórdia proporcionou a esse filho a

realização de um grande sonho, que até então parecia impossível de ser realizado.

Agradeço ao Pai todo poderoso, pela minha vida, pela minha família e pelos meus

amigos.

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Mario Bernardo-Filho, por me ensinar o

quão técnico, meticuloso, criterioso, dedicado e perseverante deve ser um

pesquisador.

Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte por me proporcionar conhecimentos na área da

saúde e da educação, fato que me torna um ser humano e profissional melhor. Com

essas novas ferramentas adquiri um olhar mais apurado nos diferentes grupos de

atuação do meu dia-a-dia: ser humano, alunos e meus pacientes.

Aos funcionários da Secretaria do Programa de Pós-graduação em Ciências

da Saúde, em especial a Alana, que sempre foi atenciosa, me orientando com

relação aos prazos e as normas a serem cumpridas.

Aos amigos do Laboratório de Radiofarmácia Experimental do Departamento

de Biofísica e Biometria do Instituto Roberto Alcântara Gomes da Universidade do

Estado do Rio de Janeiro, Márcia, Fernanda, Claudia e Daniele, molas mestras do

laboratório. Aos alunos de iniciação científica: Eric e Marcela por fazerem parte

dessa grande equipe.

Ao Tecnólogo em Radiologia, especialista em radiologia veterinária, Daniel

Teixeira de Menezes, com a minha ausência na clínica veterinária, conduziu de

forma brilhante todas as atividades internas e externas, dessa forma permitiu que eu

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assistisse às aulas de todas as disciplinas, participasse das reuniões do laboratório

de radiofarmácia e desenvolvesse o projeto de mestrado. Minha eterna gratidão.

Ao grande amigo Prof. Dr. Sebastião David dos Santos Filho, sem ele esse

projeto não teria sido realizado. Sua amizade, paciência, dedicação e vontade de

ajudar ao próximo fazem dele um ser humano impar, exemplo a ser seguido.

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SUMÁRIO

Sumário.............................................................................................................viii

Lista de abreviações siglas e símbolos...............................................................x

Resumo…………….…………………………………........……………...................xi

1. Introdução........................................................................................................1

2. Revisão de literatura........................................................................................3

3. Artigos anexados.............................................................................................7

3.1. Artigo publicado............................................................................................8

3.2. Artigo submetido ........................................................................................21

4. Comentários, críticas e conclusões...............................................................42

5.Anexos (comitê de ética, carta de aceite)......................................................46

6. Referências...................................................................................................48

7. Abstract..........................................................................................................57

viii

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LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS E SÍMBOLOS.

BC Blood Cell (célula sanguínea)

ber base excision repair

reb reparo de excisão de bases

C célula, celular

°C graus centigrados

cm centímetro

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

UFC unidades formadora de colônias

DNA Acido desoxirribonucléico

E. coli Escherichia coli

FAPERJ Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio de Janeiro

FI-C fração insolúvel da célula

FS-C fração solúvel da célula

FI-P fração insolúvel do plasma

FS-P fração solúvel do plasma

g grama

h hora

IBRAG Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes

kBq quilobecquerel

LB Luria Broth

LRE Laboratório de Radiofarmácia Experimental

ix

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µg micrograma

µl microlitro

mg miligrama

ml mililitro

min minutos

mo molibdênio

mSv miliSievert

NaCl cloreto de sódio

nm nanômetro

P plasma

PET tomografia por emissão de positron

% ATI porcentagem de radioatividade incorporada

PubMed base de dados da “U.S. National Library of Medicine”

RBC células vermelhas do sangue

RL radical livre

rpm rotações por minuto

SnCl2 cloreto estanoso

Sn2+

íon estanoso

SPECT tomografia computadorizada por emissão de fóton único

Na99mTcO4 pertecnetato de sódio

99mTc tecnécio-99m

TB Três bailarinas

TCA ácido tricloroacético

x

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RESUMO

Drogas naturais ou sintéticas podem ser capazes de alterar a sobrevivência de

culturas bacterianas, interferir na marcação de estruturas sanguíneas com tecnécio-

99m (99mTc) e alterar a morfologia das hemácias. De acordo com as instruções do

fabricante, a formula denominada de Três Bailarinas (TB) é sugerida para ser usada,

como bebida, por pessoas que desejam ajustar o peso sem dieta. Os ingredientes

dessa fórmula são a Cassia angustifolia e a Malva verticellate. Informações

cientificas sobre TB não foram encontradas no indexador PubMed, e esse fato tem

estimulado nossas investigações sobre seus efeitos biológicos. O objetivo deste

estudo foi avaliar, em diferentes modelos experimentais, o efeito de um extrato

aquoso de Três Bailarinas: (i) na sobrevivência de culturas de E. coli AB1157, ii)

efeito do SnCl2 em culturas bacterianas, iii) na marcação das hemácias e proteínas

plasmáticas e celulares com 99mTc e iv) na morfologia de hemácias de sangue de

ratos Wistar. Os resultados encontrados demonstram que o extrato de TB não

alterou a sobrevivência de cultura de E. coli AB1157 e aboliu o efeito letal do SnCl2

na sobrevivência dessa cultura bacteriana. Na marcação de estruturas sangüíneas

com 99mTc o extrato de TB reduziu a percentagem de atividade (%ATI) referente ao

99mTc no compartimento celular e nas proteínas plasmáticas, mas não alterou a

%ATI nas proteínas celulares. O extrato de TB não foi capaz de alterar a morfologia

das hemácias. Os modelos experimentais realizados mostram a importância dos

mesmos na avaliação de efeitos biológicos de agentes químicos, e contribui para um

melhor entendimento das propriedades do extrato de Três Bailarinas. Esse trabalho

abrange varias áreas do conhecimento, tais como: radiobiologia, botânica, fitoterapia

e hematologia.

Palavras-chaves: hemácias, tecnécio-99m, cloreto estanoso, Escherichia coli.

xi

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1

1 INTRODUÇÃO

O consumo e o uso de plantas medicinais vêm crescendo em todo mundo ao

longo dos anos (1, 2, 3). Essas plantas são empregadas no tratamento de diversas

alterações metabólicas (4).

Em relação ao produto denominado “Três Bailarinas” (TB), composto por

Cassia angustifolia, da família Fabaceae e Malva verticellata, da família Malvaceae,

segundo as instruções do fabricante (Truong Giang Corp., South El Monte, CA

91733, USA), é sugerido que extrato desse produto ajuda a perder peso sem

necessidade de dieta .

Apesar da importância e uso das plantas medicinais, determinados efeitos

biológicos, que poderiam acarretar reações adversas e mesmo tóxicas, são

relatados o que estimula o uso de modelos experimentais que permitam uma melhor

compreensão dos mecanismos de ação desses produtos naturais (5, 6, 7).

Modelos experimentais empregando culturas bacterianas são utilizados para

avaliar a citotoxicidade e genotoxicidade de extratos vegetais (8, 9).

Estudos sobre o efeito de plantas medicinais na marcação de constituintes

sanguíneos com tecnécio-99m (99mTc) (10, 11, 12, 13 ) e na morfologia de hemácias

também têm sido realizados (14).

Na medicina nuclear, o cloreto estanoso (SnCl2) é freqüentemente usado

como um agente redutor na marcação de estruturas moleculares e celulares com

99mTc para obtenção de radiofármacos. Apesar de seu uso, diversos autores relatam

que o cloreto estanoso apresenta efeitos citotóxicos e genotóxicos (8, 15, 16).

Estudos com culturas bacterianas com diferentes capacidades do reparo

de lesões no DNA revelaram que essas lesões causadas pelo SnCl2 acarretavam

um efeito letal que parece ser mediado pela geração de radicais livres (17, 18, 19).

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O efeito do SnCl2 também dependeria da presença de mecanismo de restauração

(18). Determinados extratos vegetais diminuem ou abolem essa ação do cloreto

estanoso (20, 21). Esse agente redutor também é capaz de promover a quebra de

DNA plasmidial (22, 23, 24, 25, 26).

Os mecanismos de ação de TB ainda não estão bem esclarecidos, e até essa

data não foi possível encontrar na literatura publicações de possíveis efeitos em

culturas bacterianas e na radiomarcação de constituintes sangüíneos empregado-se

o indexador PubMed (www.pubmed.com). Esse fato tem estimulado nossas

investigações sobre os efeitos biológicos de um extrato de TB em modelos

experimentais em diferentes níveis de organização biológica.

A hipótese dessa investigação é avaliar se o extrato de TB apresenta

propriedades redoxi. O presente trabalho tem como objetivo avaliar, em modelos

experimentais, o efeito de um extrato aquoso de Três Bailarinas (i) na sobrevivência

de culturas de E.coli AB1157 (selvagem), (ii) efeito do SnCl2 em culturas bacterianas,

(iii) na marcação dos constituintes sanguíneos com 99mTc, e (iv) na morfologia de

hemácias isoladas de ratos Wistar.

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Radiofarmácia

Experimental do Departamento de Biofísica e Biometria do Instituto de Biologia

Roberto Alcantara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ) no

período de agosto de 2009 a julho de 2011 e teve aprovação da Comissão de Ética

para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais (CEA/024/2009). O projeto foi

possível através de convênio firmado entre a UERJ e a Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, sob a orientação do Professor Doutor Mario Bernardo Filho e na

vigência de auxílios concedidos pelo CNPq, CAPES, FAPERJ e UERJ.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

O consumo de produtos naturais vem aumentando ao longo dos tempos. É

desejável que plantas medicinais possam curar muitas doenças e que não tenham

toxicidade para o organismo (7, 27, 28, 30). A avaliação de forma mais cientifica dos

efeitos biológicos dos produtos de origem vegetal foi progressivamente realizada

através de diversas investigações ao longo dos anos (27, 28, 29).

Apesar da importância e uso de plantas medicinais, determinados efeitos

biológicos que podem acarretar reações adversas e mesmo tóxicas têm sido

descritos, o que estimula o desenvolvimento e implementação de estudos adicionais

(7, 30). Modelos experimentais de fácil utilização e baixo custo que permitem a

avaliação do efeito de extratos de produtos naturais ou drogas sintéticas têm sido

propostos e importantes resultados vêm sendo obtidos.

A determinação da sobrevivência de culturas bacterianas na presença de

extratos de plantas medicinais tem sido útil para a avaliação da possível

citotoxicidade de produtos naturais (8, 17, 26).

A ação de extratos de plantas medicinais no efeito de agente lesivo para

avaliar possível proteção de culturas bacterianas ou potencialização de danos

biológicos de agente agressor tem sido empregada (37). A avaliação de efeitos de

extratos vegetais na ação (potencializando, abolindo ou não alterando) do cloreto

estanoso (SnCl2) (18, 21, 37, 38) tem demonstrado a relevância desses estudos.

Autores têm descrito a ação tóxica e mesmo genotóxica associada com esse agente

redutor (9, 26, 29, 30, 39). O mecanismo de ação do cloreto estanoso parece

também estar associado com a geração de radicais livres (17), embora uma ação

direta sobre o sistema biológico não possa ser eliminada (30).

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4

Com relação aos estudos com culturas bacterianas, pesquisadores relatam

potencial citotóxico e genotóxico do SnCl2 em culturas bacterianas de diferentes

cepas de Escherichia coli. Cepas bacterianas com mutação em único gene, cujo

produto, esteja envolvido com sistema de reparo do DNA são mais resistentes ao

tratamento com cloreto estanoso do que cepas com mais de uma mutação (8, 9, 19,

54, 55, 60).

Uma das características do íon estanoso é o seu possível transporte através

da membrana (41), isso poderia justificar seus efeitos tóxicos no interior da célula.

Aceptores de radicais livres (como a tiouréia, benzoato de sódio e dipiridil) ou

fitoterápicos (Cymbopogon citratus, Baccharis genistelloides, Maytenus ilicifolia e

Peumus boldus) aumentam a sobrevivência de culturas bacterianas, proficientes e

deficientes nos mecanismos de reparo de lesões induzidas no DNA, ao tratamento

com SnCl2. O efeito protetor destes fitoterápicos ocorreria devido à presença de

substâncias presentes nos extratos que atuariam como: (i) quelantes do íon

estanoso, protegendo as células bacterianas contra a oxidação e diminuindo a

geração de radicais livres, (ii) aceptores de radicais livres gerados pela oxidação do

SnCl2, e/ou (iii) substâncias que oxidariam o íon estanoso, reduzindo os efeitos do

SnCl2 (18).

A marcação de estruturas celulares ou moleculares de interesse biológico com

tecnécio-99m (99mTc), empregadas como radiofármacos (radiobiocomplexos) (28)

envolve a utilização do agente redutor cloreto estanoso (56). Constituintes

sanguíneos, como hemácias, leucócitos, plaquetas e proteínas plasmáticas podem

ser marcados com 99mTc (44, 62). Entre as aplicações das hemácias marcadas com

99mTc na medicina nuclear pode ser citada a avaliação do sistema cardiovascular

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5

(45, 59), medida do fluxo sangüíneo em artérias periféricas (46), localização de

hemorragias gastrintestinais (47, 48) e avaliação da função excretora (49).

Um método de marcação de constituintes sangüíneos com 99mTc é utilizado

também como modelo experimental (27, 28, 29). Esse modelo foi proposto e

utilizado com sucesso para avaliação de efeitos biológicos de extratos de plantas

medicinais (10,11, 12, 13, 27,31, 32, 33, 34, 35, 36,). Um dos métodos de marcação

comumente empregado é a marcação in vitro. O sangue é isolado com

anticoagulante, incubado com o extrato de planta medicinal, posteriormente com o

íon estanoso e, após com íon pertecnetato.

Estudos sugerem que na marcação de hemácias com 99mTc, o ânion

pertecnetato difundi-se para o espaço intracelular através da proteína da banda-3

por troca com os íons cloreto e/ou bicarbonato (20, 40). A proteína da banda-3 é

uma proteína integral que constitui a principal molécula relacionada com o transporte

de anions das hemácias. Estes fatos indicam que o processo de marcação ocorre

em nível intracelular. O agente redutor, SnCl2, também parece ser transportado para

o interior da hemácia por um sistema de transporte específico, o canal de cálcio (41,

42).

O mecanismo que envolve a ligação 99mTc-hemácias não é completamente

entendido. Ainda assim, alguns autores sugerem que: (i) o íon estanho difunde-se

para o interior das células, ligando-se ao componente celular, (ii) o íon pertecnetato

se difunde livremente dentro e fora da célula, (iii) o íon pertecnetato, dentro da célula

na presença do Sn+2 é reduzido e se liga principalmente à cadeia-beta da

hemoglobina (43, 44).

As proteínas plasmáticas e celulares podem ser marcadas com 99mTc. Ao

administrar-se um radiofármaco a um paciente, uma fração do mesmo é sempre

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encontrada ligada às proteínas plasmáticas (50, 51, 52). A marcação das proteínas

plasmáticas e celulares no procedimento de marcação de hemácias com 99mTc pode

ser avaliada através da precipitação das proteínas plasmáticas e celulares com

ácido tricloroacético (53).

Estudos da alteração qualitativa da forma das hemácias de sangue de ratos

Wistar realizados através de esfregaços de sangue sobre uma lâmina para

microscopia de luz, também têm relevância na avaliação do efeito de extratos de

plantas medicinais (57). As hemácias são células que sofreram o processo de

extrusão de seu núcleo durante a diferenciação celular, o que facilita sua

visualização na microscopia óptica (análise qualitativa), visto que não apresenta

sistemas intracelulares de membranas (58).

O produto “Três Bailarinas” (TB), composto por Cassia angustifolia, da família

Fabaceae e Malva verticellata, da família Malvaceae, segundo as instruções do

fabricante (Truong Giang Corp., South El Monte, CA 91733, USA), ajuda a perder

peso sem necessidade de dieta. No entanto, os Efeitos biológicos do TB ainda não

estão bem definidos. No indexador PubMed (www.pubmed.com) não foram

encontradas informações cientificas sobre TB, e esse fato tem estimulado a presente

investigação sobre seus efeitos biológicos.

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3 ARTIGOS ANEXADOS

3.1 ARTIGO PUBLICADO

a - Effects of an aqueous extract of Three Ballerina on the survival of

Escherichia coli AB1157 cultures and in the action of stannous chlor ide. Aceito

para publicação em 2011, no periódico “The Journal of Medicinal Plants Research”,

fator de impacto 0,879. Qualis internacional B.

3.2 MANUSCRITO SUBMETIDO

a- Evaluation of the in vitro effect of a Three Ballerina extract on the

labeling of blood constituents of rats with technet ium-99m and on the

morpohology of the red blood cell. Submetido ao periódico “Russian

Journal of Plant Physiology”, fator de impacto 0,500. Qualis internacional B

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8

3.1 ARTIGO PUBLICADO

Separata

Journal of Medicinal Plants Research

v. 5, suplemento 14, pp. 3256-3259, 2011.

Effects of an aqueous extract of Three Ballerina on the survival of

Escherichia coli AB1157 cultures and in the action of stannous chlor ide.

Pinto NS, Carmo FS, Diniz CL, Almeida DS, Pereira MO, Santos-Filho SD,

Medeiros AC, Bernardo-Filho M

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Journal of Medicinal Plants Research Vol. 5(14), pp. 3256-3259, 18 July, 2011 Available online at http://www.academicjournals.org/JMPR ISSN 1996-0875 ©2011 Academic Journals

Full Length Research Paper

Effects of an aqueous extract of Three Ballerina on the survival of Escherichia coli AB1157 cultures and in the

action of stannous chloride

Pinto N. S.1, Carmo F. S.2, Diniz C. L.3, Almeida D. S.3, Pereira M. O.1, Santos-Filho S. D.3*, Medeiros A. C.1 and Bernardo-Filho M.3,4

1Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,

Brasil. 2Programa de Pós-Graduação de Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,

Brasil. 3Laboratório de Radiofarmácia Experimental, Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto Roberto Alcantara

Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. 4Controladoria de Pesquisa, Instituto Nacional do Câncer, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Accepted 1 April, 2011

The global interest in natural substances has increased. Three Ballerina (TB) is a natural formula that has medicinal properties. Scientific information about this formula is not found in the PubMed and this fact has stimulated investigations about its biological effects. An experimental model using a reducing agent, stannous chloride (SnCl2), was carried out. Although, SnCl2 is used in nuclear medicine to obtain technetium-99 m radiopharmaceuticals, it is capable to generate free radicals. The aim of this work was to evaluate the biological effects of an aqueous extract of TB on the survival of Escherichia coli (E. coli) AB1157 (wild type) cultures and to verify if this extract protect a E. coli culture against the action of SnCl2. E. coli AB1157 cultures (exponential growth phase) were incubated with TB extract (23.4 mg/ml) or 0.9% NaCl solution as a control. E. coli cultures were also incubated with SnCl2 (25 µg/ml) + TB extract (23.4 mg/ml) or SnCl2 (25 µg/ml) alone. Aliquots from these treatments were spread onto Petri dishes containing solidified LB medium. The colony-forming units (CFU) were counted after overnight and the survival fractions calculated. Data reveal that the TB did not alter the survival of the E. coli culture, however, it has protected the cells against the lethal effect of the SnCl2. In conclusion, the TB extract did not present cytotoxic effects, but it appears to have redox action. Key words: Escherichia coli, three ballerina, stannous chloride, cytotoxic effect.

INTRODUCTION The global interest in natural substances has increased over the world (Rotblatt and Ziment, 2002; Li et al., 2008; Monbaliu et al., 2010) and, there is a growing interest in the studies about various properties of medicinal and dietary plants (Bahramikia and Yazdanparast, 2008). The prevalence of obesity is growing worldwide and in the United States, it is estimated that this prevalence has reached almost 30% (Flegal et al., 2010). Due to the lack *Corresponding author. E-mail: [email protected] Tel: +55-21-28688332.

and limitation of weight loss medicines, herbal teas and functional food ingredients have become important tools in improving obesity-related parameters. Tea has been consumed as a popular beverage worldwide for the last thousands of years because of its health benefits and pleasant aroma (Watson and Preedy, 2008). Green tea is one of the most extensively studied plants for the prevention of metabolic syndrome by stimulating fat oxidation and increasing energy expenditure (Dulloo et al., 1999). “3 Ballerina” Tea Dieters' drink is blended with the premium natural herbs. Cassia angustifolia and Malva verticellate are the vegetables of this formula. Following the instructions of the manufacturer (Truong Giang Corp.),

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“this special formula Dieters’ drink is all natural tea, soothing and relaxing especially delightful for those desiring to adjust weight, although this statement has not been evaluated by the Food and Drug Administration” (Soyuncu et al., 2008).

Different experimental models have been used to try to get scientific information about the natural products (Bahramikia and Yazdanparast, 2008; Li et al., 2008; Lima et al., 2002). Investigations to evaluate the citotoxicity of medicinal plants (Raphael et al., 2009; Almeida et al., 2007) have been performed. The effects of extracts of Baccharis genistellodes (Scheila et al., 2002) in the action of a reducing agent, the stannous chloride (SnCl2), have been assessed using Escherichia coil (E. coli) cultures.

SnCl2 is used in nuclear medicine to obtain technetium-99m (

99mTc) radiopharmaceuticals (Saha, 2010; Guedes

et al., 2006). However, some deleterious effects of this substance have been described. In humans, it has been reported that it is highly irritant to the mucous membrane and skin, although it presents low systemic toxicity. In animals, it can produce stimulation or depression of the central nervous system. As for bacterial assays, SnCl2 appears to be capable of inducing and/or producing injuries in deoxyribonucleic acid (DNA), being considered as a potential genotoxic agent (Soares et al., 2004; Guedes et al., 2006). These effects may be, at least in part, attributed to free radicals (FR), generated during SnCl2 treatment (Bernardo-Filho et al., 1994; Dantas et al., 1999; Mattos et al., 1999).

As the scientific publications about “3 Ballerina” was not found in the PubMed databank, (TB), we have investigated the effects of an aqueous extract of TB on the survival of E. coli AB1157 (wild type) cultures and if this extract protect a E. coli culture against the action of SnCl2. MATERIALS AND METHODS

Strategy in the PubMed

A search using the key words “Three Ballerina “or “3 Ballerina” was performed in the PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) on March 15th 2011. Preparation of TB extract As the commercial extract of Three Ballerina (dried powder), (Truong Giang Corp. South El Monte, CA 91733) has only small solubility, a solution with 2.34 g of Three Ballerina extract was prepared with 100 ml of a hot (ebullition) 0.9% NaCl solution (saline). The preparation was centrifuged (clinical centrifuge, 2000 rpm, 15 min) and the supernatant was isolated. Then, the obtained solution was considered 23.4 mg/ml. Saline was used in all the dilutions. All experiments were carried out during the period of validity of this product. The quality control of the preparation of this extract was controlled by the optical density of 0.93 ± 0.01 obtained at 490 nm that was used as a marker and the quality control of each preparation of TB in the all experiments.

Pinto et al. 3257 Preparation of the E. coli culture to be used The E. coli AB1157, a wild-type strain, proficient to repair damage in the DNA, was used in this work and its characteristics are reported in Howard-Flanders et al. (1964). From stock (in glycerol 50% v/v) a sample (50 �l) of the culture was grown on liquid LB medium (5 ml, Luria and Burrous, 1957) at 37°C overnight on a shaking water bath (reciprocal water bath shaker, model R76, New Brunswick, USA) up to the stationary growth phase. A sample (200 �l) was taken from this culture and further incubated (20 ml, liquid LB medium) under the same conditions, for 2 h to obtain an exponential growth phase (exponential growth culture with approximately 10

8 cells/ml). The cells were collected by

centrifugation, washed with 10 ml of saline and suspended again in the same solution until they reached 10

8 cells/ml.

Effect of the TB extract on the survival of E. coli culture Samples (0.8 ml) of the washed cultures (10

8 cells/ml) were

incubated on the shaking water bath with (1) 0.2 ml of saline, or (2) 0.1 ml of saline and 0.1 ml of the 3TB extract 23.4 mg/ml up to 60 min, at 37°C. During the assay, at 0 and 60 min, aliquots (0.1 ml) were taken and diluted with saline and spread onto Petri dishes containing solidified LB medium (1.5% agar). Colony-forming units (CFU) formed after overnight incubation at 37°C were counted and the survival fraction was calculated as described previously (Dantas et al., 1996). The survival fraction was calculated dividing the number of viable cells obtained per ml in each time of the treatment (N) by the number of viable cells obtained per ml in zero time (No). Effect of the TB extract on the action of the stannous chloride in E. coli culture Samples (0.8 ml) of the washed cultures (10

8 cells/ml) were

incubated on the shaking water bath with (1) 0.1 ml of SnCl2 (25 µg/ml) and 0.1 ml of saline, or (2) 0.1 ml of the TB extract 23.4 mg/ml and 0.1 ml of saline, or (3) 0.2 ml of saline as control, on initial time and after 60 min, at 37°C. During the assay, at 0 and 60 min, aliquots (0.1 ml) were taken and diluted with saline and spread onto Petri dishes containing solidified LB medium (1.5% agar). CFU formed after overnight incubation at 37°C were counted and the survival fraction was calculated as described previously (Dantas et al., 1996). The survival fraction was calculated dividing the number of viable cells obtained per ml in each time of the treatment (N) by the number of viable cells obtained per ml in zero time (No).

RESULTS The search that has been done in the PubMed has revealed that no items were found with the key words “Three Ballerina” or “3 Ballerina”.

Results shown in Figure 1 reveal that the TB was not capable to interfere on survival of the E. coli AB1157 culture up to 60 min with the treatment using a concentration of 23.4 mg/ml.

Figure 2 shows that the strong lethal effect of the stannous chloride has already described for different authors (Bernardo-Filho et al., 1994; Almeida et al., 2007). In addition, it is shown that the TB extract has a protective effect against the treatment with the SnCl2, abolishing the effect of the reducing agent in the concentration used in the assay.

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3258 J. Med. Plant. Res.

Time (min)

Survival fractions of E. coli AB1157 treated with 3 Ballerina extract

Figure 1. Absence of an effect of the TB extract on E. coli AB1157. Cells suspended in 0.9% NaCl were treated with TB extract. Survival fractions of E. coli AB1157 strain treated for different time of incubation in the presence or absence of the extract. The survival fractions were determined. �, 0.9% NaCl; �, extract. N, number of viable cells obtained per ml in each time of the treatment; No, number of viable cells obtained per ml in zero time.

Survival fractions of E. coli AB1157 treated with 3 Ballerina extract and SnCl2

Time (min)

SnCl2

SnCl2 + Extract

Control

Figure 2. Effect of the extract from TB on the inactivation induced by SnCl2 on E. coli AB1157. Cells suspended in 0.9% NaCl were treated with SnCl. Survival fractions of E. coli AB1157 strain treated with SnCl2 for different time of incubation in the presence or absence of the extract and with the extract alone. The survival fractions were determined. �, 0.9% NaCl; �, SnCl2; �, SnCl2 + extract. N, number of viable cells obtained per ml in each time of the treatment; No, number of viable cells obtained per ml in zero time.

DISCUSSION Due to the use of the medicinal plants, it is increasing around the world, and given the limited scientific information about the effect of many of them, it is highly relevant to try to assess biological properties of extract of

natural products. Concerning to the Three Ballerina, there are no publications in the PubMed. This fact stimulates scientific investigations about this formula.

The extract of Three Ballerina was not capable in interfering in the survival of an E. coli culture AB1157 (Figure 1), demonstrating an absence of cytotoxic effect

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in the conditions used in the experiments. This fact has already been demonstrated to another extracts, as cauliflower (Lima et al., 2002).

Although the stannous chloride has been used in the nuclear medicine (Saha, 2010), important deleterious effects associated to this reducing agent has been reported (Melo et al., 2001; Guedes et al., 2006; Souza et al., 2009). Another important finding of our work was demonstrated that the extract of Three Ballerina abolished the lethal effect of the stannous chloride (Figure 2). As the action of this reducing agent is related with the generation of free radicals, we can suggest that the TB extract has redox properties. The protective effect in E. coli AB1157 induced by the extract of TB against the inactivation produced by the treatment with SnCl2 was also observed with Peumu boldus (Reiniger et al., 1999) and with Cymbbopogon citratus, Maytenus ilicifolia and Baccharis genistelloides (Melo et al., 2001).

In conclusion, the findings in this work show that the chemical products present in extracts of TB, in the concentration used, are not toxic to the E. coli AB1157 culture. Moreover, as the TB extract has probably redox properties, it can prevent the generation of free radicals or act as a scavenger. Additional studies should be performed to try to elucidate the action mechanisms involved in the effects of TB extract obtained in this work. ACKNOWLEDGEMENTS The authors are grateful to the following CNPq, CAPES and UERJ for supporting this work. REFERENCES Almeida MC, Soares SF, Abreu PR, Jesus LM, Brito LC, Bernardo FM

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Pinto et al. 3259 Dantas FJS, Moraes MO, Mattos JCP, Bezerra RJAC, Carvalho EF,

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3.2 MANUSCRITO SUBMETIDO

Russian Journal of Plant Physiology, fator de impacto 0,5. Qualis Internacional B EVALUATION OF THE IN VITRO EFFECT OF A THREE BAILLERINA EXTRACT

ON THE LABELING OF BLOOD CONSTITUENTS OF RATS WITH

TECHNETIUM-99M AND ON THE MORPHOLOGY OF THE RED BLOOD CELL

Pinto NS1, Oliveira MP1, Carmo FS2, Diniz CL2, Missailidis S3, Santos-Filho SD2,

Medeiros AC1, Bernardo-Filho M2,4

1-Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, Natal, RN, Brasil; 2-Departamento de Biofísica e Biometria, Instituto

Roberto Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,

RJ, Brasil; 3- The Open University, UK; 4-Coordenadoria de Pesquisa, Instituto

Nacional do Câncer, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Corresponding author:

Sebastião David Santos-Filho

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes

Departamento de Biofísica e Biometria

Laboratório de Radiofarmácia Experimental

Av. 28 de setembro, 87, fundos, 4º andar

20551-030, Vila Isabel, Rio de Janeiro, RJ, Brasil

Phone/Fax: 55-21-2568-8332; Mobile: 55-21-8715-1371

E-mail: [email protected] or [email protected]

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Abstract

The aim of this work is to verify the effect of a TB extract on the labeling of blood

constituents with 99mTc and on the morphology of the red blood cells (RBC). Some

physical characteristics, as visible absorbance spectrum, electric conductivity, and

refractive index of this extract were also determined. Plasma (P) and blood cells (BC)

were labeling with 99mTc, and also isolated and precipitated with trichloroacetic acid

and soluble (SF) and insoluble fractions (IF) were separated. The %ATI in these

samples was calculated. The morphology of the treated RBC showed no shape’s

qualitative alterations. The TB extract was characterized with an absorbance peak at

490nm (0.93±0.01), electric conductivity of 1.35±0.04mSv/cm and refractive index of

2.21±0.15%BRIX. TB extract also decreased significantly (p<0.05) the radioactivity

distribution in cellular compartment of 96.97±1.30% to 88.48±7.13%, and in IF-P from

74.29±4.12 to 14.26±5.73%. In conclusion, some physical chemical parameters could

be suitable to characterize an extract of TB. Moreover, substances present in the TB

extract should probably have an effect on transport of the ions through the RBC

membrane and/or should have redoxi properties justifying the effect on the fixation of

the radioactivity on the plasma proteins.

Keywords: blood constituents, technetium-99m, red blood cell, Three Baillerina,

characterization of the extract

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Introduction

Technetium-99m (99mTc) has been the most utilized radionuclide in the single

photon emission computed tomography (SPECT) (Harbert et al, 1996; Prech et al, 2006;

Rasilla et al, 2009; Schinkel et al, 2010) and it has also been used in basic research

(Burke et al, 2005; Pettersson et al, 2005; O'Connor et al, 2009; Gropler et al, 2010).

Chemical compounds or cellular structures (red blood cells-RBC, platelets and white

blood cells) have been labeled with this radionuclide and used as radiopharmaceutical

(radiobiocomplex) (Bernardo-Filho et al, 2005, Rasilla et al, 2009; Schinkel et al, 2010).

99mTc-labeled RBC scan is the nuclear study best suited for identifying slow-

bleeding sources as gastrointestinal bleeding (Karacalioglu et al, 2003; Manning-

Dimmitt et al, 2005; Kiratli et al, 2009), as well as (i) in the determination of the left

ventricular function by measuring the ejection fractions (Leitha et al, 2001; Gropler et

al, 2010) and (ii) in the evaluation of wall motion abnormalities (Sampson, 1999; Prech

et al, 2006; Schinkel et al, 2010), in cardiovascular nuclear medicine. The RBC has

been labeled with 99mTc for in vitro, in vivo or in vivo/in vitro techniques. The labeled

process with 99mTc, as sodium pertechnetate, depends on a reducing agent and

stannous ion (Sn2+

) is usually used for this purpose (Harbert et al, 1996; Oliveira et al,

2003; Moreno et al, 2005; Prech et al, 2006). When whole blood is used for the labeling

of RBC with 99mTc, radioactivity is mainly found on RBC, however it is also bound on

plasma proteins (Saha, 2004, Bernardo-Filho et al, 1990). Authors have reported that

some herbal medicines are capable to alter the labeling of blood constituents with

technetium99m (O’Neill et al, 1998; Oliveira et al, 2000; Lima et al, 2002; Moreno et

al, 2002; Oliveira et al, 2002; Diré et al, 2004; Santos-Filho et al, 2004; Santos-Filho et

al, 2005; Misra et al, 2007).

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Qualitative morphological analysis has been used as a method to evaluate if the

effects of drugs on this radiolabeling process could be related to changes of shape of

RBC (Benarroz et al, 2007).

The use of medicinal plants has grown in world (Rotblatt and Ziment, 2002;

Gullett et al, 2010), and the development and implementation of experimental models

(Júnior et al., 2005; Nakhai et al, 2007) are important to permit a better comprehension

of the action mechanisms of these natural products.

Three Baillerina (TB) is a formulae and experimental data suggest a great

pharmacologic potentiality of the substances that there are on it. The activities described

are laxative and against complement activity (Soyuncu et al., 2008; Tomoda et al.,

1992).

A useful physical chemical property to aid to characterize and to estimate the

purity or to determine the concentration of a substance or solution is the refractive index

(Castilho et al, 2006). Electric conductivity and the absorbance spectrum profile are

other physical parameters that could be measured and also used to characterize a

preparation of unknown composition, such as an extract of a medicinal plant (Néhémie

et al, 2007).

Publications about physical properties of TB extract were not found yet in

PubMed (www.pubmed.com). Moreover, since that the extract of TB can be used also

humans and several effects of this natural product are not well understood, the aim of

this work was to characterize some physical-chemical properties and to evaluate the

effect of TB aqueous extract on the labeling of blood constituents with 99mTc using an

in vitro experimental model, as well as to verify the consequences of this extract on the

morphology of the RBC.

Materials and Methods

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Animals

The experiments were performed with rats maintained in a controlled

environment. The animals had free access to water and food and the ambient

temperature was kept at 25±2 °C. The experiments were carried out without sacrificing

the animals. Heparinized whole blood was withdrawn by cardiac puncture from adult

male Wistar rats (9 animals, 3 months of age, 250±15 g of weight). All the experimental

procedures have followed the Ethical Guidelines of the Instituto de Biologia Roberto

Alcantara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro (Protocol

CEA/024/2009).

Preparation of TB extract

As the commercial extract of Three Baillerina (dried powder, Astron Comercial

LTDA, São Paulo, Brasil, Lot 1563) has only small solubility, a solution with 2.34 g

of Three Baillerina extract was prepared with 100 ml of a hot (ebullition) 0.9% NaCl

(saline). The preparation was centrifuged (clinical centrifuge, 2000 rpm, 15 min) and

the supernatant was isolated. Then, the obtained solution was considered 23.4 mg/ml

(100%). Saline was used in all the dilutions. All experiments were carried out during the

period of validity of this product.

Spectrophotometry of TB extract

Absorbance spectrum (Spectrophotometer, 800M, Analyser Comércio e

Indústria Ltda., São Paulo, Brazil) was determined with the TB extract (23.4 mg/ml)

prepared as described above in the range of 400–700 nm. Saline solution was used as

the blank. The absorbance was measured at each interval of 10 nm. This value was

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considered as the marker of the reproducibility of the conditions used to prepare all the

extracts utilized in the assays.

Electric conductivity of TB extract

Electric conductivity (mS/cm) of the TB extract was performed with a

conductivimeter (Marte Balanças e Aparelhos de Precisão Ltda., São Paulo). Saline

solution was used as the control.

Refractive index of TB extract

The refractive index (%BRIX) of TB extract was measured with a refractometer

(Ningbo Utech International Co. Ltd., Ningbo, People’s Republic of China) at room

temperature. Saline solution was also used as the control.

In vitro radiolabeling of blood constituents

Samples of 0.5 ml of whole blood were incubated with 100 µl of different

concentrations of diluted (0.9% NaCl) TB extract (6.25, 12.5, 25, 50 and 100%) for 1

hour at room temperature. A sample of heparinized whole blood was incubated with

saline solution (NaCl 0.9%) as control. All the tubes used in this experiment were

previously closed with a rubber cap and a syringe was used to reduce the air atmosphere

(vacuum) inside the vials. Then, 0.5 ml of a freshly prepared stannous chloride solution

(1.2 µg/ml), as SnCl2 (Sigma, USA) was added and the incubation continued for another

1 hour. After this period of time, 99mTc (0.1 ml with 370kBq), as sodium pertechnetate,

recently milked from a 99Mo/99mTc generator (Instituto de Pesquisas Energéticas e

Nucleares, Comissão Nacional de Energia Nuclear, Brasil), was added and the

incubation continued for another 10 min. These samples were centrifuged and plasma

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(P) and BC cells were separated. Samples (20 µl) of P and BC were also precipitated

with 1 ml of trichloroacetic acid 5% and soluble (SF) and insoluble fractions (IF) were

separated. The radioactivity in P, BC, IF-P, SF-P, IF-BC and SF-BC were determined in

a well counter (Automatic Gamma Counter, Packard Instrument Co, USA). After that,

the % of radioactivity (%ATI) was calculated as described elsewhere (Oliveira et al,

2002; Oliveira et al, 2003).

Morphological evaluation of RBC

Preparations for morphological (microscopic) analyses were carried out with

blood samples treated in vitro with TB extract at different concentrations for 60 minutes

at room temperature or with saline solution as the control group. Blood smears were

prepared, dried, fixed, and staining by the May-Grünwald-Giemsa method (Barcia,

2007). After that, images of the RBCs were acquired (CANON, model Power Shot

SX200 IS) from blood smears to analyze the qualitative morphology by optical

microscopy (NIKON, model E 200, x 1000). Three independent researches with

expertise in analysis of blood smears have done a qualitative analysis of the RBC.

Analysis of the results

The data were analyzed using the GraphPad InStat (version 3.01 for Windows

95/NT, GraphPad Software, San Diego Ca, USA). Data from the analyses were tested

for any differences between treatments using one-way analysis of variance (ANOVA).

The means and standard errors of the means (mean ± SE) are also reported. Test with

the significance level being p<0.05.

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Results

Physical chemical determinations, as, spectrum of absorbance, electric

conductivity and refractive index of the extract of TB were performed. Figure 1 shows

the spectrum of absorbance of the TB extract at higher concentration used (23.4mg/ml)

in the range of 400–700 nm. The data show an absorption peak of the extract

(0.93±0.01) at 490 nm. This value was considered as the marker of the reproducibility

of the conditions used to prepare the extracts used in the assays. The value of electric

conductivity (1.35±0.04mS/cm) of the extract at higher concentration was used as a

second marker of the reproducibility of the conditions used to prepare the extract. The

value of the refractive index (2.21±0.15%BRIX) of the extract at higher concentration

was used as a third marker of the reproducibility of the conditions used to prepare the

extract.

Table I shows the distribution of the radioactivity in the cellular and plasma

compartments isolated from whole blood treated with different concentrations of the TB

extract. The results indicate that there is a significant decrease (p<0.05) in the

distribution of the 99mTc in the cellular compartment from 96.97±1.30% to

88.48±7.13% in presence of TB extract.

Table II shows the distribution of the radioactivity on the soluble and insoluble

fractions of the cellular compartment isolated from whole blood treated with different

concentrations of the TB extract. There is no alteration in the 99mTc fixation by the

cellular proteins (IF-BC) in presence of TB extract.

Table III shows the distribution of the radioactivity in the soluble and insoluble

fractions of the plasma compartment isolated from whole blood treated with different

concentrations of the TB extract. There is a significant (P<0.05) decrease in the

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radioactivity fixation in the plasma proteins (IF-P) in presence of TB extract from

74.29±4.12 to 14.26±5.73%.

Figures 2 and 3 show photomicrographs of smears from blood treated with

saline solution (control) and with TB extract at the higher concentration used

(23.4mg/ml), respectively. The qualitative morphological analysis suggests that the

treatment with TB extract does not induce important changes in the shape of RBC

observed under optical microscopy.

Discussion

To our knowledge, there is no description about physical chemical properties of

TB extracts. This fact has also stimulated this investigation, and a commercial TB was

used. This study shows that TB extract could be characterized by an absorbance

spectrum at 490 nm (Figure 1), an electric conductivity of 1.35±0.04mSv/ml and a

refraction index of 2.21±0.15%BRIX. These physical parameters could be used in other

studies to characterize the preparation conditions of an aqueous TB extract.

Nuclear medicine procedures as SPECT and PET have proven increasingly

effective imaging modalities in the study of several clinical disorders (Kumakura et al,

2004; Lodge et al, 2005; Palestro et al, 2005; Kiratli et al, 2009; Gropler et al, 2010).

Besides the disease, some authors have reported that these procedures could be altered

by medications that the patient is undergoing (Hesslewood and Leung, 1994). Natural

products could alter the biodistribution of radiobiocomplexes in a specific target or the

fixation of the radionuclide 99mTc to blood constituents (Sampson, 1999; Caprilles et

al, 2002; Moreno et al, 2002; Oliveira et al, 2002; Oliveira et al, 2003; Diré et al, 2004;

Fonseca et al, 2005). Other products are not capable to interfere with this labeling

process (Frydman et al, 2004; Fernandes et al, 2005). This procedure has been proposed

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30

as an in vitro assay to verify some important properties, as chelating/redox activities or

interactions on cellular membrane, of products used daily by humans (Benarroz et al,

2007; Fonseca et al, 2007).

Although, there are data concerning to the interaction of diagnostic agents,

including radiobiocomplexes, with therapeutic drugs (synthetic and natural),

investigations about these interactions are worthwhile. Knowledge about drug–

radiopharmaceutical interactions could contribute to reduce the risk of misdiagnosis

and/or repetition of the examinations (Saha, 2004) that could contribute to increase the

radiation dose to patients and staff in nuclear medicine. The development and use of in

vitro assays may provide important information about possible drug–

radiopharmaceutical interactions (Fonseca et al, 2007).

The analysis of the data presented in Tables 1 and 3 indicates that the TB extract

could alter the distribution of 99mTc between P and cellular compartments or the

fixation of this radionuclide on plasma proteins. In general, the labeling of blood

constituents could decrease because of action of drugs by (a) alteration of the plasma

membrane structure or modifying the transport systems of stannous and pertechnetate

ions into cells, (b) direct oxidation or generation of free radicals that could oxidize the

stannous ion, (c) direct inhibition (chelating action) of the stannous and pertechnetate

ions, or (d) binding at same sites on the blood constituents.

Interactions involved with the ion transport systems could alter the transport of

stannous and pertechnetate ions, decreasing the labeling of RBC with 99mTc and

explain, in part, the data obtained (Table 1). In fact, other researchers have

demonstrated that drugs that interact with calcium channels (Gutfilen et al, 1992) and

band-3 protein (Callahan and Rabito, 1990) to alter the labeling of RBC with 99mTc.

Moreover, no modifications, at least under optical microscopy, of the shape of RBC

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31

were not found when blood samples were incubated with TB extract (Figures 2 and 3),

suggesting that other mechanisms could be involved in the decrease of the labeling

efficiency of RBC with 99mTc (Table 1).

The redox properties of phenolic compounds present in medicinal plants have

been related to various mechanisms: free radical scavenging activity, transition metal

chelating, and singlet oxygen-quenching capacity (Shan et al, 2005). These substances

could act as chelators on stannous ions, decreasing the distribution of radioactivity in

blood cell compartment (Table 1) and the fixation of 99mTc on Plasma proteins (Table

3). In fact, experimental data have suggested antioxidant and pro-oxidant actions of

caffeine and its metabolites (Azam et al, 2003). Other data have suggested that caffeine

could alter the labeling of blood constituent at higher concentrations (Frydman et al,

2004). These findings and our morphological data from RBC could indicate that TB

extract could alter the labeling of blood constituents with 99mTc due to chelating/redox

properties of chemical compounds at the highest concentration of TB.

Although scientific information about the pharmacokinetics and

pharmacodynamics of the products present in TB is scarce, in general, the actions of

drugs has been shown to be depend on the plasma protein binding (Musteata et al,

2006). Despite previous data indicating that caffeine at low concentrations does not alter

the radiolabeling of plasma and cellular proteins (Frydman et al, 2004), other chemical

compounds in TB extract could decrease the fixation of 99mTc on these proteins (Table

3).

An unexpected finding is the no alteration of the labeling of the blood cell

proteins in presence of extract of TB (Table 2). Probably, the quantity of the TB that is

inside the RBC is not capable to interfere also on the fixation of the 99mTc on the blood

cell proteins.

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32

Conclusion

In conclusion, our data show some physical chemical parameters that could be

suitable to characterize an extract of TB. Moreover, substances present in the TB extract

should probably have an effect on transport of the ions through the RBC membrane

and/or should have redoxi properties and the stannous ion would decrease and could

justify the effect on the fixation of the radioactivity on the plasma proteins. Moreover,

although our experiments were carried out with animals, it is suggested precaution in

the interpretation of the examinations that use labeled blood constituents in patients who

are using TB extract.

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39

Tables

Table I: Effect of TB extract on the distribution of the radioactivity in the cellular and plasmatic compartments

TB concentrations (%) Cellular compartment

Plasma compartment

0.00 (control) 96.97±1.30 3.03±1.30 6.25 96.56±0.39 3.43±0.39 12.50 98.73±0.22 1.26±0.22 25.00 97.14±0.67 2.85±0.67 50.00 98.24±1.28 1.75±1.28 100.00 88.48±7.13 11.51±7.13

Samples of heparinized blood were incubated with different concentrations of TB extract. A sample of heparinized whole blood was incubated with saline solution (NaCl 0.9%) as control. Then, stannous chloride (1.2µg/ml) and 99mTc, as sodium pertechnetate were added. The % ATI in plasma and cellular compartments were determined in a well counter and the percent of radioactivity was calculated. Table II: Effect of TB extract in the labeling of soluble (SF) and insoluble (IF) fractions of the BC with 99mTc

TB concentrations (%) IF-BC SF-BC 0.00 (control) 93.45±7.64 6.54±7.64 6.25 96.49±1.69 3.50±1.69 12.50 98.26±0.72 1.73±0.72 25.00 95.45±4.67 4.54±4.67 50.00 97.66±0.99 2.33±0.99 100.00 96.43±1.95 3.56±1.95

Samples of heparinized blood were incubated with different concentrations of TB extract. A sample of heparinized whole blood was incubated with saline solution (NaCl, 0.9%) as control. Then, stannous chloride (1.2µg/ml) and 99mTc, as sodium pertechnetate were added. ATI% in IF-BC and SF-BC were determined in a well counter and the % of radioactivity was calculated. Table III: Effect of TB extract in the labeling of soluble (SF) and insoluble (IF) fractions of the plasma (P) with 99mTc

TB concentrations (%) IF-P SF-P 0.00 (control) 74.29±4.12 25.70±4.12 6.25 72.11±0.84 27.88±0.84 12.50 71.38±0.23 28.61±0.23 25.00 8.64±7.59 91.35±7.59 50.00 9.58±8.95 90.41±8.95 100.00 14.26±5.73 85.73±5.73

Samples of heparinized blood were incubated with different concentrations of TB extract. Sample of heparinized whole blood was incubated with saline solution (NaCl, 0.9%) as control. Then, stannous chloride (1.2µg/ml) and 99mTc, as sodium pertechnetate were added. The %ATI in IF-P and SF-P were determined in a well counter and the percent of radioactivity was calculated.

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Figures

Figure 1: Absorbance spectrum of TB extract. To prepare the extract, 2.34 g of dust was dissolved with 100ml of hot saline (0.9% NaCl). After 20 minutes, this preparation was centrifuged at 2000rpm for 15 minutes, and the extract obtained was considered to be 23.4mg/ml. The absorbance spectrum was determined with the TB extract (23.4mg/ml) in the range of 400–700 nm at intervals of 10 nm. Saline solution (0.9% NaCl) was used as the blank.

Figure 2: Photomicrograph of blood smear from blood samples treated with saline (control). Blood samples from Wistar rats were incubated with saline (0.9% NaCl) for 1 hour. After that, blood smears were prepared, dried, and stained by the May-Grünwald-Giemsa method. The slides were analyzed by optical microscopy (X 1,000).

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Figure 3: Photomicrograph of blood smear from blood samples treated with TB extract. Blood samples from Wistar rats were incubated with TB extract (23.4mg/ml) for 1 hour. After that, blood smears were prepared, dried, and stained by the May-Grünwald-Giemsa method. The slides were analyzed by optical microscopy (X 1,000).

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42

4 - COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES

A vivência e a paixão como médico veterinário e o interesse em clínica

radiológica estimulou a realização de uma dissertação de mestrado que envolvesse

o uso de fonte de radiação.

Com o objetivo de aprimorar os conhecimentos dos efeitos produzidos pelas

plantas medicinais em diferentes modelos experimentais apresentamos junto ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde o projeto de dissertação

intitulado “Avaliação de efeitos de um extrato de Três Bailarinas em modelos

experimentais em diferentes níveis de organização biológica”. Além disso,

informações cientificas sobre as Três Bailarinas não foram encontradas no banco de

dados PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/).

Para o desenvolvimento do projeto usamos um extrato aquoso de Três Bailarinas

em modelos experimentais em diferentes níveis de organização biológica para

avaliação dos efeitos: (i) na sobrevivência de culturas de E.coli AB1157 (selvagem),

(ii) na avaliação de efeitos do extrato na ação do agente lesivo SnCl2 em culturas

bacterianas, (iii) na marcação dos constituintes sanguíneos com 99mTc, e (iv) na

morfologia de hemácias isoladas de ratos Wistar.

No inicio do projeto tivemos dificuldades em desenvolver e executar as diversas

técnicas empregadas no laboratório visto não estar familiarizado com instrumentos

de precisão. Porém, com persistência, vontade de aprender e a ajuda do orientador

e demais colegas do laboratório, conseguimos resultados preliminares que foram

apresentados no projeto de mestrado e encaminhados ao programa de Pós-

Graduação em Ciências da Saúde, sendo então aprovado o meu ingresso no

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mestrado. Os experimentos foram realizados de acordo com o estabelecido no

cronograma do projeto.

Os resultados obtidos com o modelo avaliando a sobrevivência de Escherichia

coli na presença ou ausência de cloreto estanoso propiciaram a elaboração de um

artigo intitulado “Effects of an aqueous extract of Three Ballerina on the survival of

Escherichia coli AB1157 cultures and in the action of stannous chloride”, que foi

aceito para publicação no periódico “The Journal of Medicinal Plants Research”, fator

de impacto 0,879. Qualis Internacional B.

Estudos em modelos experimentais que envolviam o efeito dos extratos na

marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m, e na morfologia das

hemácias foram realizados. Essas investigações feitas também com esfregaços

sanguíneos seguidos de captura das imagens, e a análise morfológica qualitativa

das imagens obtidas por microscópio óptico originaram mais um manuscrito

intitulado “Evaluation of the in vitro effect of a Three Ballerina extract on the labeling

of blood constituents of rats with technetium-99m and on the morpohology of the red

blood cell”, submetido ao periódico “Russian Journal of Plant Physiology”, fator de

impacto 0,500.

Ao concluirmos nosso estudo, verificamos que o extrato de Três Bailarinas não

apresentou citotoxicidade em cultura bacteriana e também não modificou a

morfologia da membrana eritrocitária. Mais ainda, os compostos químicos existentes

nesse extrato parecem ter um importante efeito protetor redoxi contra a ação de

agente lesivo (cloreto estanoso). Além disso, o extrato de Três Bailarinas alterou a

fixação do tecnécio-99m em determinados constituintes sanguíneos. Embora esses

resultados de marcação tenham sido obtidos com sangue de animais, esse fato

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poderia justificar possíveis comprometimentos em exames de medicina nuclear

envolvendo a marcação desses constituintes sanguíneos.

O conhecimento dessa alteração de marcação de hemácias com tecnécio-99m

em ensaios com o extrato de Três Bailarinas é de importância para profissionais de

saúde que utilizam os exames da medicina nuclear para o diagnóstico e o

acompanhamento de diversas desordens, assim como os médicos veterinários em

seu campo de atuação. O médico veterinário é profissional de nível superior que

prescreve, ministra e supervisiona o tratamento com o objetivo de presenciar,

manter, desenvolver ou restaurar a integridade de um órgão, sistema ou função do

corpo de um animal, através de condutas clínicas determinadas. Para um bom êxito

do tratamento utilizado o médico veterinário necessita de exames complementares

que forneçam informações precisas para diagnóstico e acompanhamento da

evolução do tratamento de um paciente como os exames da medicina nuclear

utilizados na avaliação por imagem.

Através deste estudo acreditamos haver contribuído para que os profissionais da

área da saúde, e entre eles o médico veterinário, tenham novos parâmetros sobre os

efeitos das plantas medicinais estudadas sobre o organismo humano.

Esperamos que as informações levantadas por esta pesquisa possam servir de

ponto de partida para novos estudos sobre a avaliação de outros mecanismos de

ação no organismo vivo, favorecendo modos de ação em pacientes que estejam

utilizando produtos naturais e venham realizar exames de medicina nuclear.

Além disso, a vivência e experiência adquirida durante o Curso de Mestrado

propiciaram amadurecimento científico e profissional, e como educador,

principalmente na busca do conhecimento comprovado cientificamente e digno de

crédito. Entretanto, a experiência vivenciada no Curso de Mestrado e a aquisição de

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novos conhecimentos poderão ser relevantes para ações em projetos futuros junto a

grupos de pesquisa da Universidade do Estado do Rio de Janeiro, e no ingresso

futuro em programas de pós-graduação para o doutorado.

Por fim, os nossos objetivos em aprimorar os conhecimentos dos efeitos

produzidos pelo extrato de Três Bailarinas em modelos experimentais em diferentes

níveis de organização biológica apresentados junto ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências da Saúde foram atingidos graças ao intercambio entre a Universidade

Federal do Rio Grande do Norte e a Universidade do Estado do Rio de Janeiro.

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5 ANEXOS

ANEXO 1 Comitê de ética

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ANEXO 2

Carta de aceite do manuscrito ---------- Forwarded message ---------- From: JMPR Medicinal Plants Research <[email protected]> Date: Fri, 1 Apr 2011 09:52:34 +0100 Subject: Accepted for publication (JMPR-11-337 Pinto et al) To: [email protected] Dear Sebastiao David Santos Filho , I am pleased to inform you that your manuscript; JMPR-11-337 Pinto et al has been accepted for publication in the Journal of Medicinal Plants Research. There are some corrections which we will make before the proof is sent to you. Please note that the Official Acceptance Letter will be sent to your after you have effected payments for your article. The email address of our accounts department is given below: [email protected] Best regards, Adedeji Gabriel Editoral Assistant, Journal of Medicinal Plants Research E-mail: [email protected] http://www.academicjournals.org/JMPR ISSN 1996-0875 (ISI INDEXED JOURNAL; IMPACT FACTOR 0.590)Accounts Unit Academic Journals Email: [email protected] [email protected] Web: www.academicjournals.org

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blood elements with technetium-99m and on the survival of Escherichia coli AB1157

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1991; Livro de Resumos, p.29.

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58 – Junqueira LC, Carneiro José. Histologia Básica Atlas. 10ª Edição, Guanabara

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60 – de Mattos JC, Dantas FJ, Bezerra RJ, Bernardo-Filho M, Cabral-Neto JB, Lage C,

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57

ABSTRACT

Natural and synthetic drugs can modify the survival of bacterial cultures, interfere on

the labeling of blood constituents with technetium-99m (99mTc) and alter the

morphology of red blood cells (RBC). Following the instructions of the manufacturer,

the formula Three Ballerina (TB) is suggested to be used, as drink, for people

desiring to adjust weight without dietary. The ingredients of this formula are Cassia

angustifolia and Malva verticellate. As in the PubMed databank scientific publications

about TB were not found, we have investigated the effect of an aqueous extract of

TB (i) on the survival of Escherichia coli (E. coli) AB1157 (wild type) cultures, (ii) on

the protection of a E.coli culture against the action of stannous chloride (SnCl2), (iii)

on the labeling of the RBC, and plasma and blood cells proteins with 99mTc and iv) on

RBC morphology of Wistar rats. Data reveal that the TB did not alter the survival of

the E. coli culture, however, it has protected the cells against the lethal effect of the

SnCl2. TB extract also decreased the percentage of radioactivity (%ATI) in cellular

compartment and on the plasma proteins, but not altered the %ATI on the cells

proteins. The extract not was capable to alter the shape of the RBC. The performed

experimental models show the importance of them in the evaluation of biological

effects due to chemical agents, and these investigations were also useful to a better

understanding of the TB properties. This work included some knowledge areas, as

radiobiology, botany, phytotherapy and hematology.

Keywords: Red blood cells, technetium-99m, stannous chloride, Escherichia coli.