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I
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Caracterização molecular do Trypanosoma cruzi isolado de pacientes
chagásicos, triatomíneos e reservatórios silvestres procedentes do semiárido
do Estado do Rio Grande do Norte
Kiev Martins
Natal, RN
Maio/2014
II
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Caracterização molecular do Trypanosoma cruzi isolado de pacientes
chagásicos, triatomíneos e reservatórios silvestres procedentes do semiárido
do Estado do Rio Grande do Norte
Orientadora: Profª. Dra. Antonia Cláudia Jácome da Câmara
Coorientadora: Profa. Dra. Lúcia Maria da Cunha Galvão
Natal, RN
Maio/2014
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte, como requisito parcial à obtenção do
grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas/Parasitologia.
III
IV
Catalogação da Publicação na Fonte Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Martins, Kiev.
Caracterização molecular do Trypanosoma cruzi isolado de pacientes chagásicos, triatomíneos e reservatórios silvestres procedentes do semiárido do Estado do Rio Grande do Norte / Kiev Martins. - Natal, 2014. 55f: il. Coorientadora: Profª. Drª. Lúcia Maria da Cunha Galvão. Orientadora: Profª. Drª. Antonia Cláudia Jácome da Câmara. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Diversidade genética - Dissertação. 2. Doença de Chagas - Dissertação. 3. Trypanosoma cruzi - Dissertação. I. Câmara, Antonia Cláudia Jácome da. II. Título.
RN/UF/BSA01 CDU 616.937
V
Dedico esta dissertação aos meus pais,
Ronaldo e Francilene, que investiram parte
de suas vidas no meu aprendizado sem
nunca perder a paciência ou a ternura
perante minhas dificuldades.
Aos meus irmãos Igor e Reno, que caminham
comigo nesse mundo desde o meu primeiro
dia, cujas pegadas sigo sem medo.
VI
AGRADECIMENTOS
À Profa. Antônia Cláudia, pela oportunidade de trabalhar com algo construtivo e pelos
anos de treinamento e orientação, que me tornaram capaz de cumprir minhas tarefas;
À Profa. Lúcia Galvão, pela confiança e orientação, sempre visando formar pessoas
críticas e competentes;
Ao Prof. Egler Chiari, por ter sido mentor e orientador desse e de tantos outros projetos
em sua carreira, sem nunca perder a humildade, o bom humor e a visão além do momento
presente;
Ao Prof. Paulo Guedes, pelos conselhos, conversas e entusiasmo científico, que são para
mim fonte de inspiração e ânimo;
Ao Prof. Guilherme por presidir minha banca de qualificação e me aconselhar sempre
com sinceridade e zelo quanto a minha postura profissional;
Ao Prof. Adalberto Varela Freire, in memorian;
À Andressa Noronha, pela amizade e apoio em todas as etapas até aqui;
À Daniela Nunes por mostrar que a culpa pode ser minha, mesmo quando eu não percebo
ou não estou presente;
Aos amigos Rafael, Andreya, Kley, Vicente, Victor, Pedro Igor, Vinicius, Anderson,
Pamela, Carlinhos e Sidney, pelo companheirismo;
Aos Professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas e aos colegas de laboratório que dividiram a experiência dessa jornada;
Aos demais colaboradores em diversos municípios do Rio Grande do Norte, que
emprestaram parte de seu tempo para que esse trabalho fosse realizado;
VII
INSTITUIÇÕES ENVOLVIDAS
Laboratório de Biologia de Parasitos e Doença de Chagas, Departamento de
Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia 2º Andar, Rua Gal.
Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis 59012-570 Natal, RN, Telefone: 84
3342-9827
Laboratório de Biologia do Trypanosoma cruzi e doença de Chagas,
Departamento de Parasitologia, Av. Antonio Carlos, 6627, Bloco L4,
Sala 179, Campus Pampulha, 31270-901, Belo Horizonte, MG,
Telefone: 31 3409-2847.
APOIO FINANCEIRO
Edital MCT/CNPq Universal No 472251/2010-4
Programa de Incentivo a Parasitologia Básica Proc. Nº 23038.005288/2011-48
Chamada MCTI/CNPq/MS-SCTIE-Decit 40/2012 Pesquisa em Doenças
Negligenciadas N° 404056/2012-1
VIII
RESUMO
Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, é subdividido em seis unidades de
tipagem distintas (DTUs) e a DTU II é a mais comum em indivíduos infectados no Brasil. Este
trabalho teve como objetivo a caracterização genética de populações do T. cruzi que circulam em
diferentes hospedeiros procedentes de vários municípios do semiárido do Estado do Rio Grande
do Norte e verificar a sua associação aos ciclos de transmissão do parasito e as formas clínicas
dos pacientes infectados. Dezeseis isolados do T. cruzi foram obtidos por hemocultura de
pacientes chagásicos com diferentes formas clínicas; dois isolados de Panstrongylus lutzi, um de
Galea spixii e um de Euphractus sexcinctus obtidos por xenocultura. Estes isolados foram
caracterizados usando os marcadores genéticos: domínio divergente D7 do gene 24S do DNA
ribosomal (rRNA), a subunidade 2 do gene mitocondrial citocromo oxidase (COII), e a região do
espaçador intergênico (SL-IRac). As DTU I e III do T. cruzi foram identificadas
respectivamente, em 37,5% (6/16) e 18,7% (3/16) dos pacientes e a DTU II em 43,8% (7/16)
deles. No total, 40,0% (2/5) dos pacientes infectados por TcI apresentaram forma clínica
indeterminada, 40,0% (2/5) cardíaca, e 20,0% (1/5) digestiva. Dos pacientes infectados por TcII,
66,6% (4/6) são portadores da forma clínica cardíaca, 16,7% (1/6) digestiva e 16,7% (1/6)
indeterminada. Todos os pacientes infectados por TcIII apresentaram forma clínica
indeterminada. A DTU III também foi identificada em P. lutzi, G. spixii e E. sexcinctus. TcI e
TcII foram isolados de pacientes com formas clínicas cardíaca, digestiva e indeterminada,
enquanto o TcIII foi identificado apenas em pacientes com a forma clínica indeterminada. A
identificação do TcIII em P. lutzi, animais silvestres humanos indica a sobreposição dos ciclos
de transmissão peridomiciliar e silvestre do parasito no Estado. A ocorrência dessas DTUs
revelou notável diversidade filogenética entre os isolados do T. cruzi e o TcIII foi identificado
em humanos pela primeira vez no nordeste brasileiro.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi I, II e III, doença de Chagas crônica, formas clínicas,
diversidade genética
IX
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, is subdivided into six distinct units
typing (DTUs) and DTU II is the most common infected individuals in Brazil. This study aimed
to characterize the genetic populations of T. cruzi circulating in different hosts from the several
municipalities in the semiarid of Rio Grande do Norte and verify their association with the
transmission cycles of the parasite and the clinical forms of infected patients . Sixteen isolates of
T. cruzi were obtained by blood cultures from chagasic patients with different clinical forms; two
isolates of Panstrongylus lutzi, one of Galea spixii and one of Euphractus sexcinctus were
obtained by xenoculture. These isolates were characterized using genetic markers: D7divergent
domain 24S ribosomal DNA gene (rRNA), mitochondrial cytochrome oxidase subunit 2 gene
(COII) gene and spliced leader intergenic region (SL-IRac) gene. The DTU I and III of T. cruzi
were identified respectively in 37.5% (6/16) and 18.7% (3/16) of patients and the DTU II in
43.8% (7/16) of them . In total, 40.0% (2/5) of infected patients with TcI presented clinical
indeterminate form, 40.0% (2/5) cardiac and 20.0% (1/5) digestive form. Of patients infected
with TcII, 66.6% (4/6) presented cardiac clinical form, 16.7% (1/6) digestive and 16.7% (1/6)
indeterminate. All infected patients with TcIII presented indeterminate clinical form. The DTU
III was also identified in P. lutzi, G. spixii and E. sexcinctus. TcI and TcII were isolated from
patients with cardiac, digestive and indeterminate clinical form, while the TcIII was identified
only in patients with indeterminate clinical form. The identification of TcIII in P. lutzi, wild
animals and human beings indicates overlapping of the peridomestic and sylvatic transmission
cycles of the parasite in the state. The occurrence of these DTUs revealed remarkable
phylogenetic diversity among isolates of T. cruzi and the TcIII was identified in human beings
for the first time in the Brazilian northeast.
Keywords: Trypanosoma cruzi I, II e III, chronic Chagas disease, clinical forms, genetic
diversity
X
LISTA DE FIGURAS
Figuhra 1 Mapa do Estado do Rio Grande do Norte com os limites das
mesorregiões leste, agreste, central e oeste. 24
Figura 2 Captura de triatomíneos em ambiente domiciliar, peridomiciliar e
silvestre nos diferentes municípios.
26
Figura 3 Animais capturados nos diferentes municípios. Galea spixii (A) e
Euphractus sexcinctus (B) anestesiados, (C) Xenodiagnóstico em E.
sexcinctus e (D) frascos com ninfas de T. brasiliensis.
27
Figura 4 Gel representativo da amplificação do gene rDNA 24Sα de isolados
do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos e animais silvestres. 35
Figura 5
Gel representativo da amplificação dos fragmentos do gene
mitocondrial COII do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos e
animais silvestres, após a digestão com a enzima Alu I (RFLP -
Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
38
Figura 6 Gel representativo da amplificação da amplificação do espaçador
intergênico dos genes de miniexon dos isolados do T. cruzi obtidos
de pacientes chagásicos e animais silvestres.
39
Figura 7
Mapa do Estado do Rio Grande do Norte mostrando a distribuição
das DTUs do T. cruzi nos municípios estudados das mesorregiões
Oeste e Central.
41
XI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características das cepas e clones de referência do Trypanosoma cruzi
e dos marcadores genéticos 30
Tabela 2 Características e referências dos iniciadores utilizados nas reações da
PCR para caracterização molecular do T. cruzi 33
Tabela 3 Infecção natural de mamíferos pelo T. cruzi detectado por
xenodiagnóstico e xenocultura 34
Tabela 4 Origem, localidade, características epidemiológicas e genotipagem de
isolados do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos, Panstrongylus
lutzi, Euphractus sexcinctus e Galea spixii.
36
Tabela 5 Discrete typing units (DTU) do T. cruzi isoladas de pacientes
chagásicos com diferentes formas clínicas
40
XII
LISTA DE ABREVIATURAS
dNTP - Deoxinucleotídeos trifosfato
DTU - Unidades discretas de tipagem
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetracético
ESEC - Estação Ecológica do Seridó
FNS/FUNASA - Fundação Nacional de Saúde
HCl - Ácido clorídrico
IBAMA - Instituto Brasileiro do Meio Ambiente
IDEMA-RN - Instituto de Desenvolvimento Econômico e Meio Ambiente do Rio Grande do
Norte
KCl - Cloreto de Potássio
kDNA - DNA do cinetoplasto
Km – Kilometro
Km2 - Kilometro quadrado
LIT - Liver Infusion Tryptose
m – metro
M – Molar
MgCl2 - Cloreto de magnésio
mL – Mililitro
mg - Miligrama
Kg – Quilograma
mM – Milimolar
NaOH - Hidróxido de sódio
pb - Pares de bases
pH - Potencial hidrogeniônico
rpm - Rotação por minuto
SUCAM – Superintendência de Campanhas de Saúde Pública
v/v - Volume por volume
U – Unidade
µg – Micrograma
µL – Microlitros
XIII
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÂO
1.1 Aspectos gerais da infecção por T. cruzi 15
1.2 Revisão bibliográfica
1.2.1 O gênero Trypanosoma e a espécie Trypanosoma cruzi 16
1.2.2 Triatomíneos 17
1.2.3 Mamíferos silvestres 17
1.2.4 Ciclos de transmissão do T. cruzi 19
1.2.5 Caracterização genética do T. cruzi 20
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral 22
2.2 Objetivos específicos 22
3 METODOLOGIA
3.1 Delineamento experimental 23
3.2 Área de estudo 24
3.3 Amostras do Trypanosoma cruzi 25
3.4 Captura de triatomíneos 25
3.5 Captura de mamíferos 26
3.6 Métodos de detecção do T. cruzi 27
3.6.1 Xenodiagnóstico 27
3.6.2 Exame do conteúdo intestinal e xenocultura 28
3.6.3 Hemocultura 28
3.7 Cultura acelular e obtenção de massa úmida do T. cruzi 29
3.8 Extração e preparação do DNA genômico do T. cruzi 29
3.9 Caracterização molecular do T. cruzi 29
3.9.1 PCR do domínio divergente do gene 24S do DNA ribosomal 31
3.9.2 PCR da subunidade II do citocromo oxidase-gene mitocondrial 31
3.9.3 Amplificação do espaçador intergênico dos genes miniexon 31
4 RESULTADOS
4.1 Infecção natural de mamíferos pelo T. cruzi 34
4.2 Infecção natural dos triatomíneos pelo T. cruzi 34
4.3 Genotipagem dos isolados do Trypanosoma cruzi 35
4.4 Distribuição geográfica das DTUs 40
XIV
5 DISCUSSÃO 41
6 CONCLUSÕES 45
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 46
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais da infecção por Trypanosoma cruzi
A infecção humana por Trypanosoma cruzi está atualmente estimada entre 7 e 8 milhões
de indivíduos em 21 países endêmicos da América Latina, com altos custos anuais investidos em
tratamento e prevenção (WHO, 2014), incluindo o Brasil com cerca de 2 milhões de infectados
(SALVATELLA, 2007). Entretanto, como enzootia, a tripanossomíase americana é mais
amplamente distribuída do que a infecção humana, ocorrendo em diversos biomas, desde regiões
semiáridas até florestas úmidas. Esse ciclo enzoótico, de natureza silvestre, estende-se do Sul dos
Estados Unidos ao Sul da Argentina (MILES et al., 2003; COURA et al., 2002; AGUILAR et
al., 2007; COURA, 2007). A relação atual do T. cruzi com os hospedeiros silvestres parece ser
um estado de equilíbrio desenvolvido por meio de longa adaptação caracterizada pela baixíssima
ou nenhuma ação patogênica do protozoário sobre esses animais (BARRETO, 1979;
FORATTINI, 1980; SCHOFIELD, 2000). Com a ancestralidade dessa relação, o T. cruzi vem se
adaptando a novos hospedeiros a medida que estes chegaram à América do Sul, inicialmente os
roedores e primatas, depois os morcegos e carnívoros e, por último, o homem. Assim, o T. cruzi
foi e ainda é mantido há milhões de anos no ciclo silvestre, de modo que a infecção no homem
sendo considerada recente na história evolutiva do T. cruzi (GUHL et al., 2000). Essa
diversidade de hospedeiros fez com que esse táxon sofresse diferentes pressões seletivas que
resultaram na grande diversidade genética observada hoje (MACEDO et al., 2004, FREITAS et
al., 2006). A heterogeneidade do T. cruzi foi notada desde sua descoberta (CHAGAS, 1909) e,
desde então, várias ferramentas metodológicas tem sido empregadas para determinar marcadores
bioquímicos, biológicos e moleculares que possam auxiliar na compreensão da epidemiologia da
doença de Chagas (ZINGALES et al., 2009). O advento de técnicas moleculares mais precisas
permitiu também o mapeamento geográfico das diferentes subpopulações do T. cruzi, associando
cada grupo com os ciclos silvestre e doméstico, compreendendo como esses ciclos interagem
(revisado por ZINGALES et al., 2012).
O uso de abordagens moleculares também pode elucidar o papel da variabilidade genética
do parasito no decorrer da infecção chagásica, cujas consequências podem variar desde quadros
sub-clínicos até síndromes cardíacas e digestivas ou morte prematura (MACEDO et al., 2002,
2004; CAMPBELL et al., 2004). Até hoje permanece inexplicável porque alguns pacientes
desenvolvem as formas clínicas determinadas da doença e outros não. Essas formas clínicas são
características da fase crônica e são categorizadas como: forma indeterminada, cardíaca,
digestiva e cardiodigestiva. A forma indeterminada surge no início da fase crônica, onde apesar
da sorologia reativa e/ou demonstração do parasito no sangue, não há sintomatologia,
comprovada por resultados normais de eletrocardiogama e RX do tórax, esôfago e cólon. Estima-
16
se que metade dos indivíduos infectados encontra-se nessa forma da doença, podendo
permanecer durante toda a vida (PRATA, 2001). No entanto, cerca de 2 a 5% dos indivíduos, em
um período de 10 a 30 anos, passam a apresentar alterações sistêmicas típicas das formas
determinadas (RIBEIRO & ROCHA, 1998). Dados epidemiológicos mostram que no Brasil 20 a
30% dos indivíduos desenvolvem a forma cardíaca, 5 a 8% a forma esofagiana e 4 a 6% a forma
intestinal (REZENDE, 1956; ROCHA et al., 2003). Além da variabilidade genética do parasito
envolvida nessa variedade de formas clínicas, não se pode descartar, dentro deste panorama, um
possível papel dos aspectos ambientais, nutricionais e imunológicos do hospedeiro (revisado por
MACEDO et al., 2004).
Um inquérito realizado em moradores da zona rural na mesorregião Oeste do Estado do
Rio Grande do Norte estimou a soroprevalência em 6,5% e 14.151 pessoas infectadas (BRITO et
al., 2012) e, a presença de DTUs do T. cruzi tem sido recentemente demonstrada circulando
entre humanos e triatomíneos (CÂMARA et al., 2010, 2013) No entanto, para a compreensão do
ciclo silvestre na região ainda é necessário a investigação dos reservatórios silvestres e os
mecanismos que levam as populações silvestres do T. cruzi a alcançarem o ambiente domiciliar.
Nesse contexto, o presente trabalho foi proposto para estudar a epidemiologia da tripanossomíase
americana no semiárido do Estado, utilizando marcadores genéticos para determinar a DTU do
parasito isolado de diferentes hospedeiros tais como, pacientes na fase crônica da doença de
Chagas, mamíferos e triatomíneos silvestres.
1.2 Revisão bibliográfica
1.2.1 O gênero Trypanosoma e a espécie Trypanosoma cruzi
O gênero Trypanosoma possui espécies capazes de infectar animais vertebrados de todas as
classes, incluindo peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. A transmissão geralmente ocorre
por intermédio de insetos hematófagos ou pela via oral, inerente à cadeia alimentar. No ciclo
biológico dos tripanossomatídeos são encontradas as formas evolutivas amastigota, epimastigota
ou tripomastigota. A identificação correta dessas formas se dá pela observação da posição do
cinetoplasto em relação ao núcleo e da presença ou ausência do flagelo livre e membrana
ondulante (HOARE, 1972).
O ciclo evolutivo do T. cruzi é heteroxênico, necessitando de passagem em hospedeiros
invertebrados e vertebrados. Os hospedeiros invertebrados são insetos triatomíneos enquanto os
hospedeiros vertebrados são mamíferos que geralmente entram em contato com os insetos. O
clado T. cruzi compreende populações altamente heterogêneas que diferem em características
morfológicas, biológicas, patológicas, clínicas, imunológicas e bioquímicas (BRENER, 1973;
1992; MILES et al., 2003; GAUNT et al., 2003; TIBAYRENC, 2003; TEIXEIRA et al., 2006;
COURA et al., 2007).
17
1.2.2 Triatomíneos
A subfamília Triatominae é atualmente composta por 140 espécies, porém, apenas algumas
estão adaptadas às moradias humanas, apresentando importância epidemiológica (CARANHA et
al., 2006). No Brasil, os triatomíneos são conhecidos como barbeiros, fincões, chupões, bicudos
e procotós. Em condições normais esses insetos apresentam hábitos noturnos, fotofobia,
termotropismo positivo e asas na fase adulta, características que favorecem a entrada sorrateira
em domicílios. A presença de anticoagulante e anestésico na saliva os torna capazes de se
alimentar com eficiência sem chamar a atenção pelo tato (SCHOFIELD, 1979). A dispersão
ativa durante o voo dos adultos é de grande importância epidemiológica, pois está relacionada à
invasão das casas a partir de exemplares procedentes do ciclo silvestre. Obedecendo a um ritmo
natural para cada espécie, existe uma tendência de migração dos adultos para o ambiente
artificial, ou seja, a casa e os esconderijos peridomiciliares, resultando na formação de colônias
identificadas pela presença de ninfas próximas ao homem (FORATTINI et al., 1979;
FORATTINI, 1980; DIOTAIUTI & PINTO, 1991).
As espécies mais importantes relacionadas à transmissão do parasito ao homem são
Triatoma brasiliensis, Triatoma infestans, Triatoma dimidiata, Triatoma sordida, Rhodnius
prolixus e Panstrongylus megistus (LENT H. & WYGODZINSKY, 1979), na região Nordeste
predominam as espécies autóctones T. brasiliensis e Triatoma pseudomaculata, ambas capazes
de colonizar o peridomicílio (SILVEIRA & VINHAES, 1998). Nos estados do Ceará, da Paraíba
e do Rio Grande do Norte, essas espécies estão associadas aos municípios não litorâneos,
demonstrando a afinidade das mesmas pelo bioma caatinga (LUCENA & COSTA, 1954;
ALENCAR, 1965; CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; CÂMARA et al., 2003). No Estado
do Rio Grande do Norte (RN), a fauna triatomínica é bastante variada, tendo sido encontradas as
seguintes espécies: P. megistus, Panstrongylus lutzi, Rhodnius nasutus, T. brasiliensis, T.
pseudomaculata e Triatoma petrochiae (CASTRO-FILHO & SILVEIRA, 1979; SILVEIRA &
VINHAES, 1998; DIAS et al., 2000; SILVEIRA, 2011). Especificamente no semiárido, foram
examinadas mais de 800 espécimes de triatomíneos distribuídos entre T. brasiliensis, T.
pseudomaculata, P. lutzi e R. nasutus. A detecção do parasito foi positiva em 9,1% desses
insetos pelo exame direto, destacando-se a elevada infecção observada em P. lutzi (25,3%),
seguidas pelo T. brasiliensis (4,9%) e R.nasutus (0,6%), atestando o papel importante que essas
espécies endêmicas têm desempenhado nos ciclos de transmissão do T. cruzi (BARBOSA-
SILVA, 2013).
1.2.3 Mamíferos silvestres
Mais de 200 espécies de mamíferos silvestres já foram relatadas como hospedeiros do T.
cruzi. Entre as ordens mais importantes estão os artiodátilos, carnívoros, marsupiais, primatas,
18
quirópteros, rodentia e xenarthros (GALVÃO, 2003; SIQUEIRA-BATISTA, 2007). Em geral,
marsupiais do gênero Didelphis e os tatus do gênero Dasypus são considerados hospedeiros
ancestrais (COURA & BORGES, 2010; TEIXEIRA, 2006), podendo se afirmar que o habitat
natural desses gêneros se sobrepõe a distribuição geográfica da doença de Chagas (DIAS, 2000).
A importância de cada mamífero silvestre como hospedeiro do T. cruzi pode variar muito
de espécie para espécie, do espaço geográfico ocupado, do tempo e da interação com os vetores
(ASHFORD, 1997). Os mamíferos que conseguem se locomover por áreas maiores, as dietas são
mais variadas, capacidade de manter a infecção aguda por mais tempo e uma população mais
numerosa, provavelmente estão mais capacitados a cumprir o papel de reservatório, ou seja, de
hospedeiros que são mais relevantes na dinâmica populacional do T. cruzi. Nesse contexto,
animais que incluem insetos na sua dieta apresentam infecção por T. cruzi com mais frequência
do que aqueles estritamente carnívoros, fazendo com que esses ocupem uma posição diferencial
como hospedeiros do T. cruzi (ROCHA et al., 2013).
Dentro do bioma caatinga, Herrera et al., (2005), observaram que mamíferos na reserva
ecológica Serra da Capivara, Estado do Piauí, demonstraram 12% de positividade para T. cruzi
em animais de dentro da reserva e seus arredores. A infecção pelo T. cruzi foi detectada em D.
albiventris, Monodelphis domestica, Gracilinanus agilis, Galea spixii, Trichomis apereoides e
Rhiphidomys macrurus. A positividade da espécie Didelphis albiventris foi 41%, enquanto o
Trichomys apereoides foi de 4%, todavia, esta espécie foi encontrada mais dispersa e mais
capturada (HERRERA et al., 2005). Com o uso de mapas para geovisualização tem sido
verificado que o Thrichomys laurentius estava mais disperso e infectado, considerada a espécie
mais eclética e competente como reservatório, enquanto o D. albiventris um importante
reservatório em áreas com presença humana (XAVIER et al., 2007).
No Estado do Ceará, 217 exemplares de Didelphis paraguayensis foram capturados e
28,6% deles apresentaram infecção pelo T. cruzi, demonstrando o potencial desse mamífero
como reservatório na caatinga (DEANE & DEANE, 1957). A infecção do T. aperoides, Bolomys
lasiurus, Rattus rattus frugivorus (rato doméstico), Rattus rattus alexandrinus (rato doméstico) e
D. paraguayensis (cossaca) revelaram que esses animais estariam envolvidos na manutenção do
ciclo domiciliar e peridomiciliar de transmissão do T. cruzi (ALENCAR, 1965). Os achados
desses autores servem de base para se compreender a variedade do ciclo silvestre no semiárido
nordestino, envolvendo grande número de espécies de mamíferos de médio e pequeno porte. Os
animais citados anteriormente podem ser encontrados no Rio Grande do Norte, não tendo sido
registrado, contudo, trabalhos sobre o papel de mamíferos como reservatórios do T. cruzi no
Estado até o momento.
19
1.2.4 Ciclos de transmissão do T. cruzi
Os principais mecanismos de transmissão do T. cruzi no ambiente doméstico são o
vetorial, a transfusional e a congênita. A transmissão vetorial é a que apresenta elevada
importância epidemiológica para o ser humano e ocorre no momento da hematofagia do
triatomíneo pela penetração das formas tripomastigotas nas fezes dos triatomíneos na mucosa
íntegra ou pele lesada. A transmissão transfusional é acidental e controlada pela triagem
sorológica nos bancos de sangue, podendo ser um mecanismo importante em países sem essa
prática. A transmissão congênita tem causado maior interesse na Argentina e Bolívia pela
constatação de neonatais infectados (SILVEIRA, 2000; SILVEIRA et al., 2002; COURA, 2007;
DIAS et al., 2008). Já no ambiente silvestre, a via oral é a mais antiga e provavelmente a mais
eficiente na transmissão do T. cruzi (NOIREAU et al., 2009). A infecção de mamíferos por esta
via pode ocorrer de diversas maneiras, envolvendo a ingestão de fezes contaminadas de
triatomíneos depositadas na pele ou no alimento, pela excreção da glândula de cheiro de
Didelphis spp., que pode eliminar formas infectantes do parasito (DEANE et al., 1984), pela
ingestão de triatomíneos infectados ou por interações predatórias com mamíferos infectados
(JANSEN & ROQUE, 2010).
Esses mecanismos, juntos, formam dois ciclos epidemiológicos do T. cruzi na natureza: o
silvestre e o domiciliar. O ciclo domiciliar envolve o ser humano, animais domésticos e poucas
espécies de triatomíneos que são capazes de colonizar as habitações. Esse ciclo está associado às
moradias rurais e de baixa qualidade que favorecem a colonização. No Brasil, o ciclo domiciliar
passou a ser combatido inicialmente por “Campanhas contra a doença de Chagas” pelo Serviço
Nacional de Malária, na década de 50, e posteriormente pelo Programa Nacional de Controle da
Doença de Chagas (PCDCh) iniciado em 1975, tornando as ações sistematizadas para o controle
vetorial e transfusional em todo o país. No início do programa a prevalência da infecção no Rio
Grande do Norte foi verificada no primeiro inquérito sorológico realizado entre 1975-1980 o
qual revelou 1,8% de infectados com estimativa de 34.164 de indivíduos sororreativos
(CAMARGO et al., 1984). Posteriormente a eficiência do PCDCh pôde ser avaliada no segundo
inquérito realizado em crianças entre sete e quatorze anos de idade, no período de 1989-1997 que
mostrou reatividade sorológica de 0,20% no total de 12.583 amostras examinadas em 116
municípios do Estado (SILVEIRA & VINHAES, 1999). O terceiro inquérito nacional foi
realizado entre 2001 e 2008, examinando 1750 crianças até os cinco anos de idade em 65
municípios do RN. Esse inquérito revelou 0,01% de infecção, correspondendo apenas uma
criança infectada (LUQUETTI et al., 2011).
O ciclo silvestre envolve o intercâmbio do parasito entre vetores e mamíferos silvestres de
pequeno e médio porte no continente americano (BARRETO, 1979; FORATTINI, 1980). Nesse
20
ciclo, o parasito pode ser transmitido oralmente quando os animais susceptíveis são predadores
de reservatórios infectados ou por transmissão clássica, contaminação com fezes e/ou urina do
vetor com formas tripomastigotas. O período que o mamífero silvestre alberga o T. cruzi
influencia muito a manutenção do ciclo, pois animais que convivem por longos períodos com o
parasito possibilitam um elevado número de vetores infectados e, também aumentam as chances
dos predadores adquirirem o parasito. A descoberta de um animal infectado, contudo, não é o
suficiente para considerá-lo reservatório, isto esta relacionada à habilidade do parasito em
persistir nesse hospedeiro e às interrelações do hospedeiro na comunidade que favoreçam a
transmissão do parasito (JANSEN & ROQUE, 2010).
1.2.5 Caracterização genética do T. cruzi
O T. cruzi é uma espécie heterogênea, composta de várias sub-populações que circulam
entre os ciclos silvestre e domiciliar (ANDRADE, 1974; ANDRADE 1985). A variabilidade das
características biológicas e comportamentais do T. cruzi tem sido observada desde os relatos de
Chagas (1909), assinalando as diferenças marcantes na morfologia das formas tripomastigotas
sanguíneas do parasito. Nas décadas seguintes a descoberta da doença, estudos utilizando
animais infectados com diferentes cepas do T. cruzi revelaram a presença de formas
tripomastigotas delgadas, largas e muito largas (PEREIRA DA SILVA, 1959; BRENER &
CHIARI, 1963; BRENER, 1965), além de tropismos preferenciais de cepas por determinados
tecidos (GALLIARD, 1965; ANDRADE, 1974), por células do sistema fagocitário ou por
células musculares (MELO & BRENER, 1978). Existem evidências que durante a fase aguda de
pacientes chagásicos, as populações do T. cruzi parecem ser geneticamente mais complexas do
que aquelas isoladas durante a fase crônica, sugerindo uma seleção de populações com
especificidade diferenciada para a invasão tecidual (ANDRADE, 1985; MARQUES DE
ARAÚJO & CHIARI, 1988). Esta variabilidade pode ser resultante tanto da heterogeneidade
entre isolados do T. cruzi como da resposta imune do hospedeiro (MILES et al., 1981;
TIBAYRENC & AYALA, 1999).
As cepas do T. cruzi isoladas de vários hospedeiros (humanos, animais domésticos e
silvestres e vetores) foram inicialmente agrupadas de acordo com as diferenças e semelhanças
dos diversos perfis eletroforéticos de isoenzimas, e classificadas em três zimodemas (Z1, Z2, Z3)
(MILES et al., 1977). O Z2 estaria associado ao ciclo domiciliar, enquanto o Z1 seria encontrado
principalmente em animais e vetores do ciclo silvestre e em chagásicos na fase aguda da
infecção. Um terceiro zimodema (Z3) foi demonstrado e também associado ao ambiente silvestre
(MILES et al., 1977, 1980). Em 1999, uma nova divisão do T. cruzi foi sugerida em dois grupos
denominados de T. cruzi I (cepas e clones classificados como zimodema Z1, rRNA e mini-exon
21
da Linhagem 2) e T. cruzi II (cepas e clones classificados como zimodema Z2, rRNA e mini-
exon da Linhagem 1) associados com os ciclos de transmissão silvestre e doméstico,
respectivamente (ANONYMOUS, 1999). Trabalhos sub-sequentes sugeriram que as populações
do T. cruzi II eram mais complexas e usando isoenzimas, RAPD e rDNA permitiram a
subdivisão dessas populações em cinco subgrupos denominados de unidades discretas de
tipagem DTU IIa, IIb, IIc, IId e IIe. As cepas do T. cruzi I permaneceram como linhagem única
ou DTU I. Os aspectos epidemiológicos desta classificação revelam que o T. cruzi IIb, IId e IIe
estão mais relacionados aos ambientes antrópicos e indivíduos infectados, os subgrupos IIa and
IIc com ambiente silvestre e o DTU I com ambos (BARNABÉ et al., 2000; BRISSE et al., 2000,
2001; YEO et al., 2005).
Uma terceira linhagem ancestral denominada de T. cruzi III foi demonstrada e revelou que
esta é constituída por cepas pertencentes ao zimodema 3 (FREITAS et al., 2006), as quais são
correspondentes a subgrupos IIa e IIc (BRISSE et al., 2000, 2001). O parasito passou a ser
classificado então em três linhagens: T. cruzi I, II e III. Por meio da análise da constituição
genética, propuseram ainda que, no mínimo, dois eventos de hibridização entre as linhagens
parentais T. cruzi II e T. cruzi III ocorreram e produziram progênies viáveis evolucionariamente,
levando a formação das cepas híbridas. Em ambos os eventos, o doador citoplasmático para a
geração resultante foi o T. cruzi III (FREITAS et al., 2006). Entretanto, os avanços na
compreensão da estrutura da população do T. cruzi indicaram nova revisão na nomenclatura. Na
recente reunião satélite, um novo consenso foi reconhecido para que nomenclatura das cepas do
T. cruzi fosse adaptada usando a equivalência com as diferentes metodologias estudadas e
classificadas em seis DTUs, T. cruzi I-VI (ZINGALES et al., 2009).
A caracterização molecular de isolados do parasito obtidos de diferentes hospedeiros dos
ciclos domiciliar e silvestre no Brasil tem demonstrado que estes ciclos podem ocorrer de
maneira independente, podendo algumas vezes se sobrepor (MILES et al., 1977; SOUTO et al.,
1996; ZINGALES et al., 1998; MILES et al., 2003). Os marsupiais da família Didelphidae são
animais bem adaptados ao novo mundo e já foram identificados infectados com o TcI (LISBOA
et al., 2004). O TcII tem sido observado em Cingulata, Rodentia e Primata, distribuídos em
vários territórios americanos, ocasionalmente apresentando também o TcIII (LISBOA et al.,
2004; ZINGALES et al., 2009).
No semiárido do Rio Grande do Norte foi demonstrada uma grande diversidade natural na
população do T. cruzi envolvendo TcI e TcII em humanos e TcI, TcII e TcIII em T. brasiliensis e
P. lutzi sugerindo a introdução de DTUs silvestres no ambiente domiciliar com implicações
clínicas desconhecidas (MARCILI et al., 2009; CÂMARA et al., 2010, 2013).
22
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Caracterizar geneticamente as populações do Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes
chagásicos, triatomíneos e mamíferos silvestres naturalmente infectados do semiárido do Estado
do Rio Grande do Norte, associando os grupos encontrados aos ciclos de transmissão do parasito
e as diferentes formas clínicas dos pacientes.
2.2 Objetivos específicos
Isolar as populações do Trypanosoma cruzi de diferentes hospedeiros por métodos
parasitológicos e cultivo em meio acelular;
Identificar a frequência das DTUs (discrete typing units) do Trypanosoma cruzi em
indivíduos e vetores naturalmente infectados e animais de ambiente silvestre;
Avaliar a importância de mamíferos capturados como reservatórios do Trypanosoma cruzi;
Determinar a frequência das DTUs em pacientes chagásicos associando-as com as diferentes
formas clínicas;
23
3 METODOLOGIA
3.1 Delineamento Experimental
Identificação
taxonômica
Captura dos
triatomíneos
Marcadores genéticos
gene 24S do DNA ribosomal (rRNA)
gene mitocondrial citocromo oxidase
subunidade II (CO II)
espaçador intergênico dos genes miniexon
do T. cruzi (SL-IRac)
Exame direto e xenocultura
Captura dos mamíferos
silvestres
Xenodiagnóstico e xenocultura
Esfregaço corado - Giemsa
Positivo
Cultura acelular e obtenção de massa úmida do
T. cruzi
Extração do DNA e quantificação
Pacientes chagásicos
Exames clínicos e
complementares
Hemocultura
Área endêmica
Mesoregiões Central e
Oeste
M Exames sorológicos
24
3.2 Área de estudo
O Estado do Rio Grande do Norte (RN), localizado na parte oriental do nordeste brasileiro,
possui 53.077,3km2 e aproximadamente três milhões de habitantes distribuídos em 167
municípios. O clima semiárido, árido ou subúmido seco ocupa aproximadamente 90% do
território estadual, abrangendo a partir da mesorregião Agreste até o litoral setentrional com
chuvas concentradas nos meses de março e abril (IDEMA, 2010). O Estado é dividido em quatro
mesorregiões: Oeste, Central, Agreste e Leste potiguar (Figura 1). Neste trabalho, os diferentes
isolados do T. cruzi foram obtidos de seres humanos, animais e triatomíneos naturalmente
infectados. A mesorregião Oeste, segunda mais populosa do Estado, apresenta 62 municípios
tendo sido estudados 14 municípios: Alexandria, Assú, Apodi, Caraúbas, Governador Dix Sept
Rosado, Lucrécia, Mossoró, Pendências, Riacho de Santana, Rodolfo Fernandes, São Miguel,
Severiano Melo, Serra do Mel e Upanema. A mesorregião Central, a menos populosa, apresenta
32 municípios e três foram incluídos: Acarí, Caicó e Serra Negra do Norte. Em todos os
municípios citados existem áreas rurais com atividade pecuária, animais silvestres, registros de
casos da doença de Chagas e a presença de triatomíneos nos ambientes domiciliar e silvestre. No
ambiente silvestre, a Estação Ecológica do Seridó (ESEC–Seridó), unidade de preservação criada
pelo Decreto 87.222 (31/05/1982), localizada no município de Serra Negra do Norte, foram
realizadas capturas de triatomíneos e do Thrichomys apereoides.
Figura 1 - Mapa do Estado do Rio Grande do Norte destacando as mesorregiões Leste,
Agreste, Central e Oeste. Em verde, os municípios investigados.
Fonte: Modificado pelo autor a partir da base cartográfica do IBGE Disponível em
<http://www.ibge.gov.br/cidadesat/ufs/download/mapa_e_municipios.php?uf=rn> Acesso em jun de 2012.
25
3.3 Amostras do Trypanosoma cruzi
As amostras do T. cruzi foram isoladas de triatomíneos e animais naturalmente infectados e
de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas procedentes das mesorregiões
oeste e central. Esses pacientes foram examinados e acompanhados clinicamente pelos médicos
cardiologistas membros do grupo de pesquisa. O termo de consentimento livre e esclarecido
(TCLE) foi obtido individualmente e o protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética
da Universidade Estadual do Rio Grande do Norte (COEP/UERN) sob o Nº 027.2011 e de
acordo com a Resolução 196/96-CNS/MS. A amostragem dos pacientes foi obtida por
conveniência, utilizando três métodos sorológicos para identificar os pacientes infectados por T.
cruzi: ELISA (Chagatest® recombinant ELISA v. 3.0 kit); HAI – Hemaglutinação Indireta
(Chagatest® hemmaglutination inhibition, A-V kit, Wiener Lab®, Rosário, Argentina); e a RIFI
- Reação de Imunofluorescência Indireta, usando como antígeno formas epimastigotas de T.
cruzi Y mantidas em cultura e fixadas com 20% de formolaldeído. Imunoglobulina IgG Anti-
humana marcadas com Isotiocianato de fluoresceína (Sigma Chemical Company®, Missouri,
USA) foi usada como conjugado. O resultado foi considerado positivo para a infecção por T.
cruzi quando dois métodos com diferentes princípios foram reativos (BRASIL, 2005; WHO,
2014). Após a confirmação sorológica, todos os pacientes foram submetidos à coleta sangue para
hemocultura conforme item 3.6.3.
3.4 Captura de triatomíneos
As capturas dos triatomíneos foram realizadas manualmente com auxílio de pinça nas duas
mesorregiões endêmicas em ambientes intradomiciliar, peridomiciliar e silvestre (Figura 2). O
ambiente intradomiciliar é definido como a área interna das residências, comumente frequentada
pelos moradores em suas diversas dependências. O ambiente peridomiciliar foi considerado
como espaço adjacente às casas incluindo abrigos de animais sinantrópicos, telhas, tijolos,
madeira seca, depósitos e cercas até 100m do domicílio (OLIVEIRA et al., 2000). O ambiente
silvestre foi considerado como a área além dos cem metros do peridomicílio, tipicamente não
habitada, com vegetação original da região e animais silvestres em livre movimentação.
No peridomicílio foram pesquisados criadouros animais tais como, chiqueiros, currais,
galinheiros e outros abrigos de animais domésticos. Nos ecótopos naturais foram pesquisados
afloramentos metamórficos, tocas de roedores, tocas de Dasypodidae, ninhos de aves e outros
locais que poderiam servir de abrigo para animais silvestres.
Os triatomíneos coletados foram colocados em frascos etiquetados e a identificação foi
realizada de acordo com os parâmetros da chave de identificação (CARCAVALLO et al., 1998).
Todos os procedimentos de identificação e exame do conteúdo intestinal foram realizados no
26
Laboratório de Biologia de Parasitos e doença de Chagas, Departamento de Análises Clínicas e
Toxicológicas–DACT/CCS/UFRN.
Figura 2 – Captura de triatomíneos em diferentes ambientes dos municípios investigados. A:
domiciliar; B: peridomiciliar e C: silvestre.
Fonte: Martins, K.
3.5 Captura de mamíferos
A captura de mamíferos foi realizada usando armadilhas tipo “gaiola” de capacidade
variando entre 25cm×8cm×9cm para pequenos animais e 45cm×17,5cm×15cm para animais de
médio porte. As armadilhas foram colocadas no ambiente silvestre entre o anoitecer e o
amanhecer, em ecótopos variados tais como, afloramentos rochosos, troncos de árvores, buracos
cavados por animais, matas ciliares de riachos, trilhas naturais ou artificiais, extensões de cerca
de pedra, depósitos de madeira ou ferramentas, zonas com excesso de alimento disponível ou
proximidades de resquícios de mata virgem, visando minimizar a captura de animais domésticos.
As armadilhas colocadas na ESEC-Seridó seguiram precauções adicionais como, a vigília a
cada duas horas e a ausência de iscas que pudessem perturbar o habitat natural, segundo
orientações dadas pela instituição. Após a captura, os animais foram imobilizados com o auxilio
de luvas de couro, fotografados, identificados taxonomicamente e anestesiados com 60 a 80mg
27
de ketamina (Cloridrato de cetamina, Vetnil) + 8 a 15mg de xilazina (Dopaser, Vetnil) por kg de
massa corporal do animal (Figura 3). Em cada animal, o xenodignóstico foi realizado segundo
Bronfen et al. (1989) e o sangue coletado preferencialmente da artéria femoral para a confecção
do esfregaço em camada delgada e corado pelo Giemsa.
Figura 3 – Animais capturados nos diferentes municípios. Galea spixii (A) e Euphractus
sexcinctus (B) anestesiados, (C) Xenodiagnóstico em E. sexcinctus e (D) frascos com ninfas de
T. brasiliensis. Fonte: Martins, K.
3.6 Métodos de detecção do T. cruzi
3.6.1 Xenodiagnóstico
O xenodiagnóstico foi inicialmente descrito por Brumpt (1914) e modificado por Dias
(1940) que consiste no uso de ninfas de triatomíneos a partir do 3º estádio. As ninfas foram
colocadas em um recipiente de plástico protegido por uma tela de filó e aplicadas sobre o animal
anestesiado por aproximadamente 30min. Para cada animal foram utilizadas cinco ou seis ninfas
de T. brasiliensis ou T. pseudomaculata. Cada caixa contendo as ninfas foi etiquetada com a
data, local de captura e dados do animal. Em seguida, os recipientes foram mantidos em biotério
e após 15 dias, alimentadas com camundongos (Mus musculus) livres de tripanossomastídeos
28
sanguíneos. Aos 30 dias, as ninfas foram submetidas ao exame direto do conteúdo intestinal por
dissecação e xenocultura (BRONFEN et al., 1989).
3.6.2 Exame do conteúdo intestinal e xenocultura
Os insetos foram colocados em solução White por 30min, para esterilização externa dos
insetos, e lavados rapidamente em água destilada estéril. Em seguida, em ambiente asséptico,
foram removidas as asas e a cutícula em torno do abdome do inseto com o auxílio de pinça e
tesoura sobre gaze. O conteúdo intestinal de cada triatomíneo foi colocado em um poço de placa
plástica de 24 poços (Corning Incorporated, NY, USA) contendo 500µL de solução salina estéril.
O material foi macerado e dessa mistura uma pequena alíquota foi colocada entre lâmina e
lamínula, seguindo-se o exame ao microscópio óptico com aumento de 100 e 400× para
observação de formas móveis ou imóveis do parasito (BRONFEN et al., 1989) Após o exame
direto do conteúdo intestinal, 200-300µL da mistura foram semeados em um tubo de ensaio com
meio McNeal Novy e Niccole (NNN) ou Agar sangue + 2,5mL de Liver Infusion Tryptose-LIT
(CAMARGO, 1964), incubada a 28ºC e examinados após 30, 60 e 90 dias. As culturas positivas
foram semeadas em meio LIT para o cultivo do parasito por um período curto e criopreservadas
em Nitrogênio líquido (N2) a −196ºC.
3.6.3 Hemocultura
A hemocultura foi realizada conforme descrita por Chiari et al. (1989) coletando de cada
paciente 30mL de sangue venoso utilizando tubos a vácuo heparinizado (Brasmed, Brasil) e
transportados em banho de gelo para o Laboratório de Biologia de Parasitos e doença de
Chagas/CCS/UFRN. A seguir, o sangue foi transferido para um tubo plástico cônico de 50mL
(Falcon®, USA) e centrifugado a 300 × g por 10min à temperatura ambiente, seguido da
remoção do sobrenadante (plasma). Ao sedimento de hemácia foram adicionados 10mL de meio
LIT e centrifugado a 900 × g por 20min a 4°C. Descartado o sobrenadante, ao sedimento de
hemácias foram adicionados 6mL de meio LIT, homogeneizado e 3mL distribuídos em seis
tubos de 15mL, cada um deles contendo 3mL de LIT. Todos os tubos foram incubados a 28°C,
sendo agitados levemente duas vezes por semana e alíquotas de 10µL da suspensão de cada tubo
foram examinadas ao microscópio entre lâmina e lamínula, com aumento de 400×, mensalmente
até 120 dias. A partir das hemoculturas positivas foram realizados cultivos em meio LIT para o
isolamento do parasito, criopreservação das amostras em nitrogênio líquido (N2) a -196º C e
obtenção de massa úmida ou sedimento do parasito. No total, foram realizadas 266 hemoculturas
e a positividade foi 7,52% (20/266). Dessas 266 hemoculturas, 100 foram obtidas de pacientes
residentes na cidade de Caraúbas, 47 na cidade de Caicó e as restantes distribuídas entre as
cidades de Acarí (1/266), Alexandria (1/266), Apodi (16/266), Assú (2/266), Gov. Dix. Sept
Rosado (12/266), Lucrécia (3/266), Mossoró (17/266), Pendências (1/266), Riacho de Santana
29
(9/266), Rodolfo Fernandes (1/266), São Miguel (5/266), Serra do Mel (2/266), Serra Negra do
Norte (20/266), Severiano Melo (27/266) e Upanema (2/266).
3.7 Cultura acelular e obtenção de massa úmida do T. cruzi
Os isolados do T. cruzi foram cultivados em meio LIT o tempo mínimo necessário para a
obtenção de 107/mL de epimastigotas. As culturas foram lavadas três vezes em tampão KRT
(Krebs-Ringer-Tris) pH 7,2 e concentradas por centrifugação a 2.500rpm (Eppendorf 5450R
Hamburg, Germany) durante 15min a 4oC. O sedimento (massa úmida) de cada isolado foi
armazenado em triplicata a temperatura de 20oC até o momento da extração do DNA.
3.8 Extração e preparação do DNA genômico do T. cruzi
O sedimento de cada isolado do T. cruzi foi resuspendido em 1mL de tampão de lise
contendo 0,1mg/mL de proteinase K (Promega, Madison, WI, USA) e incubado a 37oC durante
12h. A extração do DNA foi realizada por desproteinização com fenol (v/v), a fase aquosa
recuperada e submetida a extrações com igual volume (v/v), fenol:clorofórmio:álcool isoamílico
(25:24:1) seguida de agitação e centrifugação. Após esta etapa foi adicionado clorofórmio:álcool
isoamílico na proporção de 24:1 e a precipitação do DNA foi realizada com dois volumes de
etanol absoluto a 4ºC adicionado de 0,3M de acetato de sódio a -70oC por 2h. Após
centrifugação e volatilização do etanol, o precipitado foi tratado em 1mL de tampão da
ribonuclease A (Promega) (NaCl 80mM/ EDTA 5mM, pH 8,0, 10U de ribonuclease) e incubado
a 37ºC por 2h, seguida de nova extração e precipitação do DNA. O DNA foi resuspendido em
300µL de tampão Low TE (10mM Tris-HCl e 0,1mM EDTA pH 8,0) e armazenado a 4oC
(MACEDO et al., 1992). As amostras de DNA foram quantificadas em um fluorômetro (Qubit®
2.0 Fluorometer - Life Technologies) e a concentração final de cada amostra de DNA ajustada
para 3ng/L, sendo novamente estocadas a 4ºC até o momento do uso.
3.9 Caracterização molecular do T. cruzi
A caracterização molecular foi realizada usando diferentes marcadores genéticos descritos
que têm como alvos genes que apresentam taxas de evolução lenta e estão relacionados com o
DNA genômico e, como controles foram utilizados cepas e clones do parasito como referência
(Tabela 1).
30
Tabela 1- Características das cepas e clones de referência do Trypanosoma cruzi e dos marcadores genéticos
aSouto and Zingales (1993); bFreitas et al. (2006); bD’Ávila et al. (2009); cBurgos et al. (2007); pb: pares de bases; DTU: discrete
typing units
Cepas e clones
referência do T.
cruzi
Marcadores genéticos
DTU do
T. cruzi
Referência
24Sα rRNAa
(pb)
COIIb
(haplotype/pb)
SL-IRacc
(pb)
Col1.7G2 110 A/30, 81, 264 150 TcI Frederici et al. (1964)
JG 125 C/81, 212 150 TcII Lages-Silva et al. (2001)
RN19 110 B/81, 294 200 TcIII Câmara et al. (2010)
AM64 117/119 B/81, 294 200 TcIV Monteiro et al. (2010)
3253 110 + 125 B/81, 294 150 TcV Lages-Silva et al. (dados
não publicados)
CL-Brener 125 B/81, 294 150 TcVI Zingales et al. (1997)
31
3.9.1 PCR do domínio divergente do gene 24S do DNA ribosomal (rRNA)
A amplificação deste gene foi realizada com 2μL do DNA total de cada amostra (na
concentração de 3ng/L) em um volume final de 12,5μL da reação, contendo 0,625 unidades de
Taq DNA polimerase, 3,5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl pH 9,0, 50mM KCl, 0,1% Triton C-100
Buffer B 200μM de cada dNTP (Promega), e 0,25μM dos iniciadores D71 e D72 (Tabela 3). Os
30 ciclos de amplificação variaram entre as temperaturas de 94°C, 60°C e 72°C (SOUTO &
ZINGALES, 1993; SOUTO et al., 1996). Os produtos da amplificação foram revelados por
eletroforese em géis de poliacrilamida a 6% corados pela prata (SANTOS et al., 1993) e a
visualização de fragmentos de 110pb, 117/119 e 125 ou de ambos foram comparados com os
controles. Como controles das amplificações, foram utilizados DNA de cepas e clones que
representam as DTUs do T. cruzi na visualização dos fragmentos de ~110pb, 117/119 e/ou
~125pb (Tabela 1).
3.9.2 PCR da subunidade II do citocromo oxidase-gene mitocondrial (CO II)
A amplificação da região gênica que compreende a subunidade II da enzima mitoncondrial
citocromo oxidase do T. cruzi foi realizada usando 1-10ng de DNA de cada amostra em um
volume final de 20µL da reação, contendo 2,5 U de Taq DNA polimerase, 1,5mM MgCl2, 2,0µL
tampão I0 10 (Phoneutria, Minas Gerais, Brasil) 50mM KCl e 10nM TrisHCl, 0,25µ de cada
dNTP (Sigma Chemical Company, Missouri, USA) e 0,25µM de cada iniciador (Tabela 3). As
condições da PCR foram de 30 ciclos: 30 segundos de desnaturação a 94°C, anelamento a 48°C
por 2min e uma extensão a 72C durante 2min. Após amplificação pela PCR, os produtos foram
digeridos com a enzima de restrição AluI (16h) e os fragmentos gerados analisados em gel de
poliacrilamida a 6% (SANTOS et al., 1993). Os fragmentos amplificados foram comparados
com o DNA de cepas e clones correspondentes as DTUs do T. cruzi usados como referência
(Tabela 1). A interpretação do gel foi realizada de acordo com os haplótipos encontrados A, B ou
C. Este marcador não diferencia as cepas TcIII das TcIV e TcVI já que apresentam o mesmo
perfil de restrição para o gene COII (fragmentos: 81 e 294pb) haplótipo B (FREITAS et al.,
2006).
3.9.3 Amplificação do espaçador intergênico dos genes miniexon do T. cruzi (SL-
IRac)
A amplificação da região intergênica dos genes miniexon foi realizada com o DNA das
amostras do T. cruzi submetido a uma PCR contendo 20mM Tris-HCl pH 8,4; 50mM KCl; 3mM
MgCl2; 250mM de cada dNTP e 3µM de cada iniciador TcIII e UTCC (IDT, San Diego, CA,
USA) descritos na tabela 3, 1U de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen, Carlsbad,CA,
USA); 1,0µL de DNA total (na concentração de 3ng/L) e quantidade de H2O Milli-Q estéril
suficiente para 15L. Estes iniciadores reconhecem as posições entre 368-386pb e 546-570pb da
32
unidade repetitiva do miniexon do T. cruzi (BURGOS et al., 2007). Os ciclos de amplificação da
PCR consistiram de uma etapa inicial de desnaturação (94ºC, 3min), anelamento (68ºC, 1 min),
extensão dos iniciadores (72ºC, 1 min) e desnaturação (94ºC, 1 min). A cada três ciclos, a
temperatura de anelamento foi diminuída para 66, 64, 62 e 60ºC. Na última temperatura o
número de ciclos foi aumentado para 35, seguida de uma extensão final (72ºC, 10 min). Os
produtos amplificados foram revelados em gel de poliacrilamida 6% corado pela prata
(SANTOS et al., 1993) que permitiu distinguir TcIII e TcVI (que amplificam um fragmento de
~200pb) das cepas pertencentes ao TcI, TcII, TcV e TcVI que amplificam um fragmento de
~150pb (BURGOS et al., 2007). O DNA de cepas e/ou clones do T. cruzi referência foram
usados como padrão de comparação (Tabela 2).
33
Tabela 2 - Características e referências dos iniciadores utilizados nas reações da PCR para caracterização molecular do T. cruzi
PCR DNA alvo Iniciador Sequência (5’ - 3’) Referência Fragmento
amplificado
(pares de base)
DTUs
24Sα rDNA
Domínio D7
D71
AAGGTGCGTCGACAGTGTGG
Souto & Zingales
(1993)
110
TcI, TcIII, TcV
D72
TTTTCAGAATGGCCGAACAGT
125
117/119
TcII, TcVI, TcV
TcIV
CO II (RFLP)
Mitocondrial
TcMit-21
TTGTAATAGGAGTCATGTT*
Freitas et al.
(2006)
30, 81 e 264** TcI
TcMit-10
CCATATATTGTTGCATTATT*
81 e 294** TcIII, TcIV, TcV,
TcVI
81 e 212** TcII
SL-IRac
Miniexon
UTCC
CGTACCAATATAGTACAGAAACTG
Burgos et al.
(2007)
~150-157
TcI, TcII, TcV,
TcVI
TcIII
CTCCCCAGTGTGGCCTGGG
200
TcIII, TcIV
*Amplifica um fragmento de 375pb com três sítios de restrição para a enzima AluI; **Fragmentos obtidos após a digestão com a enzima AluI.
34
4 RESULTADOS
4.1 Infecção natural pelo T. cruzi em mamíferos
Do total de 42 mamíferos capturados, o índice de infecção por T. cruzi foi 9,5% (4/42)
detectado por xenodiagnóstico e/ou xenocultura. O índice de infecção de Galea spixii foi 25%
(1/4), Euphractus sexcinctus 8,5% (3/35) e entre as espécies Oryctolagus cuniculus e
Trichomys apereoides, nenhum animal foi encontrado infectado. A espécie O. cuniculus foi
capturada em criadouros peridomiciliares e T. apereoides em ambiente silvestre (Tabela 3).
Tabela 3 – Origem e infecção natural pelo T. cruzi em mamíferos por xenodiagnóstico e
xenocultura
Espécie Número de
animais
Origem XD
P/T
XC
P/T
%
(P/T)
Galea spixii 4 Caraúbas 0/4 1/4 25,0% (1/4)
Euphractus sexcinctus 35 Caraúbas
Caicó
S. Melo
3/35 2/35 8,6% (3/35)
Oryctolagus cuniculus 2 Caraúbas 0/2 0/2 0,0% (0/2)
Thrichomys apereoides 1 S. Melo 0/1 0/1 0,0 (0/1)
S. Melo: Severiano Melo; XD: xenodiganostico; XC: xenocultura; P: positivo; T:total; %: Percentagem de
amostras positivas
4.2 Infecção natural dos triatomíneos pelo T. cruzi
As capturas dos triatomíneos foram realizadas em seis municípios, com 160 espécimes
capturados e identificados, sendo 141 da espécie T. brasiliensis, dez da T. pseudomaculata e
nove da P. lutzi. O exame do conteúdo intestinal foi realizado por dissecção do abdome
seguido de exame direto e xenocultura. Apenas dois exemplares da espécie P. lutzi (Pl0812 e
Pl0213) foram encontrados infectados pelo T. cruzi, e o parasito foi cultivado para a
caracterização molecular. As espécies T. brasiliensis e T. pseudomaculata foram capturadas
em ambientes peridomiciliares e silvestres, principalmente em telhas e tijolos amontoados
(peridoméstico) e afloramentos rochosos (silvestre), e todos não infectados.
35
4.3 Genotipagem dos isolados do Trypanosoma cruzi
O T. cruzi foi isolado de 16 pacientes chagásicos, de dois exemplares do P. lutzi e de
dois mamíferos das espécies G. spixii e E. sexcinctus, totalizando 20 amostras (Tabela 4). O
T. cruzi foi isolado por hemocultura de 16 indivíduos e cultivado para caracterização
molecular. Desses, oito foram classificados como portadores da forma indeterminada (1150,
1317, 1816, 2549, 2934, 105, CBS 195, SM76); seis da forma clínica cardíaca (2137, 240,
3973a, CBS202, RN79 e SM73) e dois da forma digestiva (3188 e RN26). A análise do perfil
genético utilizando o marcador rDNA 24Sα identificou o fragmento de 125pb correspondente
ao rDNA 1 em 43,8% (7/16) das amostras obtidas de humanos e o fragmento de 110pb
correspondente ao rDNA 2 em 56,2% (9/16). As amostras do parasito isoladas de mamíferos
silvestres e P. lutzi mostraram o perfil de rDNA 2 em 100,0% (4/4) delas (Figura 4).
Figura 4 – Gel de poliacrilamida a 6%, revelado pela prata, representativo da amplificação do gene
rDNA 24Sα de isolados do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos e animais silvestres. Canaleta 1:
PM, peso molecular (Ladder 100 pares de bases-pb); Canaletas 2 a 7: TcI-VI (controles
correspondentes às diferentes DTUs do T. cruzi); Canaletas 8 a 10: DNA de amostras obtidas dos
pacientes 105, CBS 195 e SM76; Canaletas 11 a 14: DNA de amostras obtidas de Panstrongylus
lutzi (Pl0812 e Pl0213), Euphractus sexcinctus (Es18) e Galea spixii (Gs3); CN: mistura de
reagentes sem DNA.
36
Tabela 4 – Origem, localidade, características epidemiológicas e genotipagem de isolados do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos, Panstrongylus
lutzi, Euphractus sexcinctus e Galea spixii. (continua)
Isolados
do T.
cruzi
Hospedeiro Forma clínica
Município Idade Sexo 24Sα
rDNAa
(pb)
COIIb
(haplótipo/pb)
SL-IRc
(pb) DTU
1150 Humano Indeterminada Caicó 44 Masculino 110 A/30, 81, 264 150 TcI
1816 Humano Indeterminada Caicó 45 Feminino 110 A/30, 81, 264 150 TcI
2137 Humano Cardíaca S. Melo 32 Feminino 110 A/30, 81, 264 150 TcI
2549 Humano Indeterminada Apodi 27 Feminino 110 A/30, 81, 264 150 TcI
3188 Humano Digestiva Assú 62 Masculino 110 A/30, 81, 264 150 TcI
CBS 202 Humano Cardíaca Caraúbas 88 Masculino 110 A/30, 81, 264 150 TcI
240 Humano Cardíaca Caicó 29 Masculino 125 C/81, 212 150 TcII
1317 Humano Indeterminada DSR 58 Masculino 125 C/81, 212 150 TcII
2934 Humano Indeterminada Caicó 44 Masculino 125 C/81, 212 150 TcII
3973a Humano Cardíaca Acari 72 Masculino 125 C/81, 212 150 TcII
RN26 Humano Digestiva SNN 56 Masculino 125 C/81, 212 150 TcII
37
Tabela 4 – Origem, localidade, características epidemiológicas e genotipagem de 20 isolados do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos, Panstrongylus
lutzi, Euphractus sexcinctus e Galea spixii. (conclusão)
Isolado
s do T.
cruzi
Hospedeiro Forma clínica
Município Idade Sexo 24Sα
rDNAa
(pb)
COIIb
(haplótipo/pb)
SL-IRc
(pb) DTU
RN79 Humano Cardíaca SNN 43 Feminino 125 C/81, 212 150 TcII
SM73 Humano Cardíaca S. Melo 64 Feminino 125 C/81, 212 150 TcII
105 Humano Indeterminada Caicó 39 Feminino 110 B/81, 294 200 TcIII
CBS195 Humano Indeterminada Caraúbas 40 Feminino 110 B/81, 294 200 TcIII
SM76 Humano Indeterminada S. Melo 67 Feminino 110 B/81, 294 200 TcIII
Gs3 G. spixii - Caraúbas Adulto Macho 110 B/81, 294 200 TcIII
Es18 E. sexcinctus - Caraúbas Adulto Macho 110 B/81, 294 200 TcIII
Pl0213 P. lutzi - SNN Adulto Macho 110 B/81, 294 200 TcIII
Pl0812 P. lutzi - SNN Adulto Fêmea 110 B/81, 294 200 TcIII
DSP: Dix Sept Rosado; S. Melo: Severiano Melo; SNN: Serra Negra do Norte; Pl082 e Pl0213: Panstrongylus lutzi; Es18: E. sexcinctus; Gs3: Galea
spixii
38
A análise do perfil genético utilizando o marcador COII revelou os três haplótipos em
seres humanos e apenas o haplótipo B em animais silvestres (Figura 5). Das 16 amostras
isoladas de humanos, 37,5% (6/16) mostraram fragmentos de 31, 81 e 264pb correspondentes
ao haplótipo A; 18,7% (3/16) fragmentos de 81 e 294pb correspondentes ao haplótipo B e
43,8% (7/16) fragmentos de 81/82 e 212pb que correspondem ao haplótipo C. Os isolados
obtidos de hospedeiros silvestres apresentaram perfis correspondentes ao háplotipo B em
100,0% (4/4) das amostras. Comparando-os com as cepas controle, todos os isolados com
perfil de rDNA 2 e haplótipo A correspondem a DTU I (TcI) e os isolados rDNA 1 e
haplótipo C a DTU II (TcII). Das amostras isoladas de pacientes chagásicos 37,5% (6/16)
correspondem ao TcI e 43,8% (7/16) ao TcII.
Figura 5 – Gel de poliacrilamida a 6% revelado pela prata, representativo da amplificação dos
fragmentos do gene mitocondrial COII do T. cruzi obtidos de pacientes chagásicos e animais
silvestres, após a digestão com a enzima Alu I (RFLP-Restriction Fragment Lenght
Polymorphism). Canaleta 1: PM, peso molecular (Ladder 100 pares de bases-pb); Canaletas 2 a
7: Controles correspondentes às diferentes DTUs do T. cruzi (Col1.7G2, amplificação dos
fragmentos de 81 e 264pb, perfil correspondente ao haplótipo A; JG, fragmentos de 81 e 212pb,
referentes ao haplótipo C; RN19, AM64, 3253 e CL-Brener, amplificação dos fragmentos de 81
e 294pb, correspondentes ao haplótipo B); Canaletas 8 a 10: DNA de amostras obtidas dos
pacientes 105, CBS 195 e SM76; Canaletas 11 a 14: DNA de amostras obtidas de Panstrongylus
lutzi, (Pl0812 e Pl0213), Euphractus sexcinctus (Es18) e Galea spixii (Gs3); CN: mistura de
reagentes sem DNA.
39
Os isolados correspondentes ao haplótipo B foram diferenciados entre T. cruzi III
(TcIII) e TcIV-TcVI usando como marcador o espaçador intergênico dos genes de miniexon
(Figura 6). As três amostras obtidas de humanos e as quatro amostras de animais silvestres
que mostraram um perfil de rDNA 2, haplótipo B e SL-IRac de ~150pb correspondem a DTU
III (TcIII). Essas amostras totalizam 18,7% (3/16) das amostras humanas e 100% (4/4) das
amostras animais (Tabela 4).
A infecção por TcI foi detectada em 37,5% (6/16) dos pacientes e 50,0% (3/6) deles são
portadores da forma clínica indeterminada, 33,3% (2/6) da forma cardíaca, e 16,6% (1/6) da
forma digestiva. O TcII foi isolado de 43,8% (6/16) dos pacientes e 57,0% (4/7) desses são
portadores da forma clínica cardíaca, 14,5% (1/7) da forma digestiva e 28,5% (2/7) da forma
indeterminada. O TcIII foi identificado em 18,7% (3/14) dos pacientes e todos com a forma
clínica indeterminada (Tabela 5).
Figura 6 – Gel de poliacrilamida a 6%, revelado pela prata, representativo da amplificação
da amplificação do espaçador intergênico dos genes de miniexon dos isolados do T. cruzi
obtidos de pacientes chagásicos e animais silvestres. Canaleta 1: PM, peso molecular
(Ladder 100 pares de bases-pb); Canaletas 2 a 7: Controles correspondentes às diferentes
DTUs do T. cruzi (Col 1.7G2, JG, RN19, AM64, 3253 e CL-Brener); Canaletas 8 a 10:
DNA de amostras obtidas dos pacientes 105, CBS 195 e SM76; Canaletas 11 a 14: DNA
de amostras obtidas de Panstrongylus lutzi (Pl0812 e Pl0213), Euphractus sexcinctus
(Es18) e Galea spixii (Gs3); CN: mistura de reagentes sem DNA.
40
Tabela 5 – Discrete typing units (DTU) do T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos com
diferentes formas clínicas
DTU: discrete typing units; %: percentage
4.4 Distribuição geográfica das DTUs
A distribuição das DTUs dos pacientes chagásicos mostrou diversidade nos municípios
de Caicó e Severiano Melo, onde foram isoladas as DTUs I, II e III, enquanto em outras
localidades foram identificadas apenas uma ou duas DTUs diferentes. No município de
Caraúbas, as DTUs I e III foram isoladas de seres humanos e, apenas a DTU III foi
identificada nos mamíferos G. spixii e E. sexcinctus. No município de Serra Negra do Norte,
as DTUs II e III correspondem aos pacientes chagásicos e P. lutzi, respectivamente (Figura 7).
DTU do
T. cruzi
Formas clínicas dos pacientes
Indeterminada (%) Cardíaca (%) Digestiva (%) %
TcI 50,0 (3/6) 33,3 (2/6) 16,6 (1/6) 37,5 (6/16)
TcII 28,5 (2/7) 57,0 (4/7) 14,5 (1/7) 43,8 (6/16)
TcIII 100,0 0,0 0,0 18,7 (3/14)
41
Figura 7 – Mapa do Estado do Rio Grande do Norte mostrando a distribuição das
DTUs do T. cruzi nos municípios estudados das mesorregiões Oeste e Central.
5 Discussão
A caracterização molecular de isolados do T. cruzi obtidos de pacientes crônicos,
mamíferos silvestres e P. lutzi procedentes da zona rural do semiárido do Rio Grande do
Norte revelou uma marcante diversidade genética do parasito. A análise dos isolados do T.
cruzi usando marcadores do polimorfimo do gene 24S do DNA ribosomal (SOUTO &
ZINGALES, 1993), do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade II (FREITAS et al.,
2006) e do espaçador intergênico dos genes miniexon (BURGOS et al., 2007) demonstrou
que foi possível identificar as DTUs I, II e III (ZINGALES et al., 2009) em humanos e TcIII
em insetos e animais silvestres.
O T. cruzi I (TcI) foi identificado em quatro municípios da mesorregião oeste e um da
central, sugerindo uma ampla distribuição desta DTU pelo semiárido do Estado. No Brasil,
42
essa DTU tem sido associada às infecções em áreas rurais e a maioria dos casos agudos na
Amazônia (COURA et al., 2002; AGUILAR et al., 2007), sendo que no Rio Grande do Norte
e na Paraíba, têm sido relatados casos de infecção crônica humana sem associação com a
forma clínica (BARNABÉ et al., 2005; TEIXEIRA et al., 2006; CÂMARA et al., 2010). A
notificação de complicações graves associadas à DTU I é considerada rara no país (MILES et
al., 1981; ZINGALES et al., 1999; COURA et al., 2002; BUSCAGLIA & DI NOIA, 2003),
todavia neste trabalho foi identificada em pacientes com formas clínicas cardíaca, digestiva e
indeterminada. Uma possível explicação para essa diversidade de formas clínicas seria a
existência de variabilidade das populações do TcI nesta área endêmica. Algumas
características genéticas dessa DTU foram estudadas usando os genes do miniexon
(HERRERA et al., 2007; O’CONNOR et al., 2007; FALLA et al., 2009; CURA et al., 2010)
e a análise do citocromo b (RAMIREZ et al., 2011), mostrando heterogeneidade entre
isolados de regiões diferentes,correlacionando com estudos que sugerem que a DTU I pode
sofrer seleção dependendo dos hospedeiros, vetores e ambiente (FERNANDES et al., 1999).
Se for esse o caso, testes adicionais entre os isolados do TcI poderão ajudar a associar clones
específicos dessa DTU com as manifestações clínicas cardíaca, digestiva e indeterminada.
O T. cruzi II (TcII) foi identificado em dois municípios da mesorregião oeste e três
municípios da central, corroborando com dados de que a DTU II foi expressiva no semiárido
potiguar (CÂMARA et al., 2010, 2013). Existem evidências de que as populações do TcII são
mais patogênicas do que TcI (TOLEDO et al., 2003) e que é a principal DTU associada as
complicações cardíacas e digestivas no Brasil (FREITAS et al., 2005; YEO et al., 2005;
LAGES-SILVA et al., 2006). Estudos anteriores no Rio Grande do Norte mostraram que essa
DTU possui elevada homologia pela análise de microssatélites e RAPD entre os isolados
obtidos de seres humanos e vetores de diferentes localidades (CÂMARA et al., 2010, 2013).
Neste trabalho, a DTU II foi isolada de pacientes com formas clínicas cardíaca, digestiva e
indeterminada, sugerindo que mesmo com grande homologia genética, essa DTU pode causar
diferentes manifestações clínicas.
O T. cruzi III (TcIII) foi isolado de três pacientes na fase crônica da doença em dois
municípios da mesorregião oeste e um da central. Esta é a primeira vez que essa DTU é
isolada de seres humanos do Estado do Rio Grande do Norte. A DTU III tem sido considerada
como predominante em ambientes silvestres, associada a algumas espécies de tatus e poucos
relatos em humanos (LLEWELLYN et al., 2009; MARCILI et al., 2009; MILES et al., 2009;
43
ZINGALES et al., 2012). Os três pacientes infectados por TcIII com a forma clínica
indeterminada, a faixa etária está de 39 e 67 anos de idade, e mesmo identificada em baixo
número, esse dado sugere que essa DTU seja menos nociva do que as DTUs I e II.
O TcIII também foi identificado em E. sexcinctus (Linnaeus, 1758), conhecido como
peba, e G. spixii (WAGLER, 1831), conhecido como preá, e no vetor silvestre P. lutzi. As
espécies G. spixii e E. sexcinctus foram capturadas em Caraubas, Caicó e Severiano Melo e
próximas às residências, confirmando o hábito sinantrópico desses animais. A infecção pelo
T. cruzi nesses mamíferos foi evidenciada a parasitemia pelo xenodiagnóstico e, a
possibilidade de ocorrer infecção humana devido à prática da caça com risco mais elevado
para aqueles indivíduos que manejam e preparam os animais para o consumo. A identificação
do TcIII em humanos, mamíferos silvestres e P. lutzi, chama a atenção para a possibilidade de
as DTUs silvestres poderão alcançar os ambientes peridomiciliar e domiciliar na área
endêmica estudada.
O papel dos mamíferos silvestres como hospedeiros do T. cruzi cruzi tem sido relatado
em algumas regiões das Américas. No semiárido do Chaco paraguaio, o E. sexcinctus foi
identificado em quatro de 23 animais investigados, ressaltando sua importância como
reservatório por ser animal apreciado na culinária (YEO et al., 2005). Essa espécie também
tem sido relatada como hospedeira na região úmida do Chaco argentino (OROZCO et al.,
2013) e em amostras de sangue desses animais no semiárido do Rio Grande do Norte
(MARCILI et al., 2009). A espécie G. spixii foi estudada na Serra da Capivara, reserva que
possui biomas do tipo caatinga e floresta tropical, mostrando soroprevalência e parasitemia
baixa, sendo considerada nesse ambiente como hospedeiro acidental (HERRERA et al.,
2005). As grandes áreas de dispersão geográfica dessas espécies na América do Sul sugerem
que esses animais possam funcionar como transporte do parasito entre o ambiente silvestre e
peridomiciliar ou entre biomas adjacentes, visto que ambas as espécies podem viver por
alguns anos e que possuem grande capacidade locomotora.
No entanto, outros reservatórios e vetores podem estar associados com a manutenção do
ciclo, uma vez que o TcIII tem sido relatado em outras espécies de tatus, carnívoros,
marsupiais, roedores e animais domésticos de diferentes regiões (BRISSE et al., 2003; YEO
et al., 2005; FREITAS et al., 2006; LLEWELLYN et al., 2009; MARCILI et al., 2009;
MONTEIRO et al., 2010). Entretanto, outros fatores parecem contribuir para que estes
animais desempenhem papel importante na epidemiologia do parasito como, o hábito dos
44
moradores rurais em manter esses animais em cativeiro por longos períodos de engorda,
oferecendo oportunidade de alimentação para os triatomíneos e, possível infecção com as
DTUs silvestres. Além disso, a sazonalidade climática do semiárido com severo período de
seca torna o peridomicílio local atrativo para a busca de alimentos como, legumes, raízes,
tubérculos e restos alimentares, atraindo os animais silvestres para o peridomicilio. A espécie
G. spixii foi encontrada com facilidade nos anexos do peridomícílio como, armazéns para
ferramentas, lavanderias abandonadas, garagens e amontoados de madeira ou construção civil,
e nesses locais também foram encontrados T. brasiliensis e T. pseudomaculata sugerindo que
esse mamífero pode ser um reservatório mais importante para estabelecer o ciclo domiciliar
de transmissão do que o E. sexcinctus.
A dispersão das DTUs I, II e III nas duas mesorregiões cobre uma área equivalente a
mais de 50% do Estado, sugerindo que não existe predominância geográfica de determinada
DTU em alguns muncípios. As três DTUs podem ser encontradas em seres humanos das duas
mesorregiões ou mesmo em cidades distantes mais de 150km como no caso dos municípios
de Caicó e Severiano Melo. A distribuição geográfica e a diversidade das DTUs estudadas
aqui sugerem uma sobreposição dos ciclos silvestre e peridomiciliar, uma vez que a DTU III,
considerada silvestre, foi encontrada em seres humanos de diferentes municípios, sem
qualquer evidência epidemiológica de transmissão oral ou transfusional. Essa sobreposição
seria caracterizada pela proximidade do peridomicílio e o ambiente silvestre, pois as
residências rurais se encontram literalmente inseridas no bioma caatinga e expostas a presença
de vetores e reservatórios silvestres. O risco da exposição humana as DTUs silvestres se
associa com o uso da vegetação como recurso natural para o pasto de caprinos, como fonte de
madeira para construção civil e como combustível, visto que a destruição do ambiente natural
pode forçar a proximidade de triatomíneos às moradias humanas (MILES et al., 1981;
COURA et al., 2002) reduzindo assim a eficácia dos programas de vigilância entomológica.
Estudos com as DTUs I e II do T. cruzi isoladas especificamente de pacientes com
diferentes formas clínicas poderão contribuir na identificação de genes ou clones dentro
desses grupos que podem estar envolvidos no desenvolvimento das manifestações cardíacas
ou digestivas. As amostras de TcIII obtidas de seres humanos também poderão ser
comparadas com as de animais silvestres e vetores de uma mesma região, permitindo observar
se existe algum tipo de seleção de clones mais adaptados a cada um desses hospedeiros. Além
disso, a identificação de E. sexcinctus e G. spixii como reservatórios do parasito será
45
notificada aos órgãos de vigilância em saúde do Estado, ajudando as equipes municipais a
identificar áreas de risco mais elevado e informar a população sobre o risco em lidar com
essas espécies de mamíferos.
6 Conclusões
As DTUs I, II e III foram detectadas em pacientes na fase crônica da doença de
Chagas procedentes das mesorregiões central e oeste potiguar;
A DTU III foi identificada pela primeira vez em pacientes na fase crônica da doença
de Chagas no semiárido brasileiro e associada à forma clínica indeterminada;
As DTUs I e II foram isoladas de pacientes portadores das diferentes formas clínicas,
sem associação evidente entre DTUs e manifestações clínicas específicas;
A DTU III foi isolada dos mamíferos E. sexcinctus e G. spixii procedentes das
mesorregiões central e oeste potiguar e do vetor P. lutzi na mesorregião central;
A distribuição geográfica das DTUs do T. cruzi em diferentes localidades e
hospedeiros sugere um novo cenário epidemiológico no semiárido do Estado Rio
Grande do Norte mostrando a sobreposição dos ciclos silvestre e peridomiciliar.
46
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