universidade federal do rio grande do norte centro de ... · de insetos pragas de armazenamento no...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
RAYANA VANESSA DA COSTA LIMA
POTENCIAL BIOINSETICIDA DE SEMENTES DE Ziziphus joazeiro MART. CONTRA A PRAGA DE ARMAZENAMENTO Callosobruchus maculatus
NATAL - RN 2017
2
RAYANA VANESSA DA COSTA LIMA
POTENCIAL BIOINSETICIDA DE SEMENTES DE Ziziphus joazeiro MART. CONTRA A PRAGA DE ARMAZENAMENTO Callosobruchus maculatus
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Adriana Ferreira Uchôa
NATAL - RN 2017
3
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de
Biociências - CB
Lima, Rayana Vanessa da Costa.
Potencial bioinseticida de sementes de Ziziphus joazeiro MART. contra
a praga de armazenamento Callosobruchus maculatus / Rayana Vanessa da
Costa Lima. - Natal, 2017.
68 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em Bioquímica.
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa.
1. Insetos praga - Dissertação. 2. Inseticidas botânicos - Dissertação.
3. Proteínas bioativas - Dissertação. 4. Larvicida - Dissertação. 5.
Juazeiro - Dissertação. 6. Inibidor de proteases - Dissertação. I. Uchôa, Adriana Ferreira. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III.
Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 565.7
4
5
Dedico este trabalho a meus pais: Rossana e Raniere Mazilli pelo apoio
desde o momento do meu nascimento.
6
AGRADECIMENTOS
Á Deus, por todas as coisas que me aconteceram, por todas as pessoas que Ele colocou em meu caminho, pois algumas delas me desafiaram, ajudaram e me encorajaram na execução desse trabalho.
Á meus pais, Raniere e Rossana, minha irmã Rafaela e familiares pelo apoio e amor de sempre.
Á Profª Doutora Adriana Ferreira Uchôa, orientadora, pelos ensinamentos e auxilio que tanto me ajudaram na execução desse trabalho e me fizeram crescer, pessoalmente e profissionalmente.
Ao Profº Dr. Elizeu Antunes dos Santos, por me receber e “acolher” tão bem no Laboratório LQFPB. Agradeço também ao prof. Dr. Jose Luiz de Attayde do Departamento de Ecologia da UFRN, e prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha do Departamento de Bioquímica por nos permitir o uso de equipamentos importantes para o desenvolvimento desse trabalho, ao professor Dr. João Maria Gomes Alencar de Souza, chefe do Departamento de Biologia Celular e Genética da UFRN, Prof. Dr Francisco Pepino de Macedo, professor aposentado da UFRN pela criação do Setor de Insetos Pragas de Armazenamento no Laboratório de Moscas-das-Frutas do Departamento de Biologia Celular e Genética.
As Professoras Ana Heloneida, Kátia Castanho e Dayanne Gomes pelas valiosas contribuições na minha qualificação de mestrado.
A todos os professores do Programa de Pós Graduação em Bioquímica.
Aos colegas do Laboratório LQFPB, pelo convívio e contribuições.
Aos amigos Igor e Geovanna, pelas caronas, almoços, auxilio em experimentos, convívio diário e principalmente pelos memes e vídeos compartilhados, sem vocês teria sido muito mais difícil passar por tudo.
As minhas amigas Jaci, Iana e Genilsa, pela amizade, ensinamentos e apoio.
A minha Amiga Tatiana Oliveira, por me apoiar e ajudar a superar todas as minhas dificuldades, obrigada por sempre me oferecer seu ombro amigo, por todo cuidado que tem comigo e não posso deixar de agradecer por todas as comidinhas gostosas e principalmente por ter me feito aprender a comer verduras (rsrs).
Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro para realização desse trabalho.
7
“Ninguém vence sozinho, nem no campo, nem na vida! “
Papa Francisco
8
RESUMO
POTENCIAL BIOINSETICIDA DE SEMENTES DE Ziziphus joazeiro MART.
CONTRA A PRAGA DE ARMAZENAMENTO
Callosobruchus maculatus
O bruquídeo Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) é uma das principais pragas do feijão caupi (Vigna unguiculata). O controle de pragas é baseado na utilização de agroquímicos e expõe trabalhadores rurais diariamente a intoxicações e outras doenças. Devido a isso é importante direcionar estudos á detecção e caracterização de moléculas de fontes naturais com potencial para o controle de pragas que sejam mais seguras para saúde humana e ambiental. Diversos extratos de origem vegetal ricos em moléculas bioativas destacam-se por sua ação bioinseticida. Ziziphus joazeiro (Rhamnaceae) é uma árvore nativa brasileira altamente resistente a ambientes secos e amplamente utilizada como planta medicinal. No entanto, não há estudos do potencial bioinseticida de suas sementes. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades da farinha das sementes de Z. joazeiro, do extrato proteico e de frações proteicas F2 e F3 obtidas por precipitação sequencial com sulfato de amônio sobre o desenvolvimento do bruquídeo C. maculatus. Foram realizados bioensaios em sistema de sementes artificiais incorporando a farinha, o extrato total e as frações proteicas das sementes de Z. joazeiro em crescentes concentrações, para monitorar parâmetros de desenvolvimento como: oviposição, peso, sobrevivência das larvas e tempo e número de adultos emergidos. A farinha da semente de Z. Joazeiro promoveu uma diminuição na oviposição das fêmeas a partir da concentração de 2%, não ocorrendo mais oviposição a 5% e 10 %. As sementes contendo as frações F2 e F3 não apresentaram diminuição significativa na oviposição. Quanto ao parâmetro peso da larva ocorreu uma redução de 50% já na concentração de 0,1%, nas sementes com a farinha, EB e F3 e na concentração 0,4% da fração F2. Uma diminuição na sobrevivência das larvas foi significativamente maior a partir de 1,6% em todas as amostras testadas, não sendo mais detectadas larvas vivas nas concentrações seguintes da farinha, além de aumentarem o tempo para emergência e reduzir o número de insetos adultos. Avaliou-se a presença de inibidores de proteases digestivas no EB e frações e foi encontrado inibição para proteases serínicas e cisteínicas que podem estar relacionados às alterações no desenvolvimento do bruquideo. Estes resultados demonstram que a semente de Z. Joazeiro é promissora como estratégia para aplicação biotecnológica no manejo de insetos pragas.
Palavras chaves: Insetos praga, inseticidas botânicos, proteínas bioativas, larvicida, Juazeiro, inibidor de proteases.
9
ABSTRACT
BIOINSETICIDE POTENTIAL OF SEED EXTRACT OF Ziziphus joazeiro MART.
AGAINST STORED-BEAN PEST Callosobruchus maculatus The Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) is the most destructive pest of
the cowpea beans (Vigna unguiculata). The conventional pest control is based on the
use of insecticides and pesticides, however, the exposure of rural workers to pesticides
are reported to cause various diseases and are also not environmentally friendly. Due
to this, is important studies for the detection and characterization of new bioactive
molecules safer for human and environmental health. Bioactive molecules from plants,
including bioactive proteins, can be considered possible alternatives to the use of
pesticides to control insect pests. Ziziphus joazeiro (Rhamnaceae) is a tropical tree,
usually found in the caatinga northeastern part of Brazil, resistant to dry conditions and
widely used as a medicinal plant. This study aimed to evaluate the bioactive
compounds properties of meal, protein extract and fractions obtained by sequential
precipitation of proteins with ammonium sulfate from the seeds of Z.joazeiro on the
development of the bruchid. We performed bioassays in a system of artificial seeds
incorporating the flour, total extract and the protein fractions of the seeds of Z. joazeiro
for monitoring development parameters such as: oviposition, weight, larval survival and
adult emergence of insect C. maculatus. Incorporation of the seed extracts into the
insect diet showed Z. Joazeiro seed meal promoted a decrease in oviposition of
females from the 2% concentration, where no oviposition occurred in 5% and 10%, the
seeds containing the F2 and F3 fractions showed no significant decrease in
oviposition. As for the weight parameter of the larva, a reduction of 50% was observed
at the concentration of 0.1% in the seeds with the flour, EB and F3 and in the
concentration 0.4% of the F2 fraction. A reduce in larval survival was considerably
higher from 1.6% in all samples tested, with no live larvae being detected in the
following concentrations of flour, in addition to increasing the development time of adult
insects. We evaluated the presence of inhibitors of digestive proteases in EB and
fractions and found inhibition for serine and cysteine proteases that may be related to
alterations in the development of bruquídeo. These results demonstrate that Z.
Joazeiro is a promising source of bioactive proteins with potential for biotechnology in
the control of insect pests.
Keywords:
Insect pests, Botanical insecticides, bioactive proteins, Larvicide, Juazeiro, Protease
inhibitor
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ciclo de vida do Callosobruchus maculatus em sementes de Vigna
unguiculata .............................................................................................................. 26
Figura 2 - Ziziphus joazeiro ..................................................................................... 30
Figura 3 - Sementes de Z. joazeiro com e sem tegumento. .................................... 32
Figura 4 - Esquema da extração e fracionamento das proteínas de Z. joazeiro. .... 35
Figura 5 - Sistema de bioensaio em sementes artificiais. ....................................... 37
Figura 6 - Efeito sobre oviposição. .......................................................................... 43
Figura 7 - Sobrevivência das larvas do bruquídeos C. maculatus .......................... 44
Figura 8 - Imagem representativa das larvas de C. maculatus crescidas em sementes
artificiais.. ................................................................................................................. 45
Figura 9 - Avaliação do efeito da incorporação da farinha, EB, F2 e F3 sobre a massa
das larvas de C. maculatus. ..................................................................................... 46
Figura 10 - Cromatografia de afinidade em Tripsina-sepharose 4B da fração F2 de
Ziziphus joazeiro ...................................................................................................... 49
Figura 11 - SDS-PAGE (15%) do extrato bruto e frações proteicas de Z. Joazeiro. 51
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação das proteases. ................................................................. 19
Tabela 2 - Efeito da farinha e frações proteicas (EB, F2 e F3) sobre a emergência e
período de desenvolvimento do bruquideo C. maculatus em sementes artificias. ... 48
Tabela 3 - Atividade inibitória do extrato bruto, frações F2, F3, Zjrt e Zjnrt de Z.
Joazeiro em relação a proteases serínicas, cisteínicas ........................................... 50
12
LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS
BSA Albumina Sérica Bovina (Em tradução livre do inglês, Bovine Soro Albumin)
EB Extrato Bruto.das sementes de Ziziphus joazeiro
ED 50 Dose necessária para reduzir o peso em 50%
F1 Fração 1, obtida por precipitação na faixa de 0-30% de (NH4)2SO4
F2 Fração 2, obtida por precipitação na faixa de 30-60% de (NH4)2SO4
F3 Fração 3, obtida por precipitação na faixa de 60-90% de (NH4)2SO4
ZJnrt Fração proteica de Z. joazeiro não retida por cromatografia de afinidade em
tripsina-Sepharose
ZJrt Fração proteica de Z. joazeiro retida por cromatografia de afinidade em tripsina-Sepharose
SDS Dodecil sulfato de sódio
TCA Ácido Tricloroacético
LD 50 Dose necessária para causar 50% de mortalidade
TEMED N,N,N',N-Tetramethylethylenediamine
kDa KiloDalton
pH Potencial Hidrogeniônico
IP Inibidor de protease
13
SÚMARIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 15
1.1. MOLÉCULAS DE DEFESA DE PLANTAS ............................................ 16
1.2. PROTEASES INTESTINAIS DE INSETOS FITÓFAGOS ...................... 18
1.2.1. INIBIDORES DE PROTEÍNAS DIGESTÓRIAS DERIVADOS DE
SEMENTES COM ATIVIDADE BIOINSETICIDA ...................................... 20
1.3. BRUQUÍDEO Callosobruchus maculatus ........................................... 24
1.4. Ziziphus joazeiro .................................................................................. 28
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 31
2.1. GERAL ................................................................................................... 31
2.2. ESPECIFICOS ....................................................................................... 31
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 32
3.1. MATERIAL ............................................................................................. 32
3.1.1. Ziziphus joazeiro Mart. ................................................................. 32
3.1.2. Callosobruchus maculatus .......................................................... 32
3.1.3. EQUIPAMENTOS............................................................................ 33
3.2. MÉTODOS ............................................................................................. 33
3.2.1. MANUTENÇÃO DA COLÔNIA DOS BRUQUÍDEOS ..................... 33
3.2.2. OBTENÇÃO DA FARINHA ............................................................ 34
3.2.3. EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS E FRACIONAMENTO ..... 34
3.2.4- DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS ................................................ 35
3.2.5- BIOENSAIO EM SEMENTES ARTIFICIAIS .................................... 36
3.2.6- ENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA
PROTEASES SERINICAS E CISTEINICAS ............................................ 37
A) ATIVIDADE ANTI-TRIPSÍNICA ...................................................... 37
B) ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA QUIMOTRIPSINA ........................ 38
C) ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA PAPAÍNA ................................... 38
14
D) ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA O HOMOGENATO INTESTINAL ... 39
3.2.7. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM TRIPSINA-SEPHAROSE 4B
PARA ENRIQUECIMENTO DE INIBIDORES DE TRIPSINA E PAPAÍNA DA
F2 .............................................................................................................. 39
3.2.7. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ...................... 40
3.2.8. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ........................................................... 40
4. RESULTADOS .................................................................................................... 41
4.1. EFEITOS DA FARINHA E FRAÇÕES PROTEICAS F2 E F3 DA
SEMENTE DE Ziziphus joazeiro SOBRE A FECUNDIDADE E
DESENVOLVIMENTO DO INSETO C. maculatus ....................................... 41
4.1.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE Z. joazeiro SOBRE A OVIPOSIÇÃO
.................................................................................................................. 43
4.1.2. SOBREVIVÊNCIA E DESENVOLVIMENTO DAS LARVAS .......... 43
4.1.3. EMERGÊNCIA DOS INSETOS ADULTOS NAS SEMENTES
ARTIFICIAIS ............................................................................................ 46
4.2. AVALIAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE DEFESA DAS SEMENTES DE
Ziziphus joazeiro. ........................................................................................ 48
4.2.1. ENRIQUECIMENTO DE INIBIDORES DE TRIPSINA E PAPAÍNA
POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE ............................................... 48
4.2.2. AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA PROTEASES
SERINICAS E CISTEINICAS .................................................................... 49
4.2.3. ANÁLISE DAS FRAÇÕES PROTEICAS DE Ziziphus joazeiro POR
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ................................ 50
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 52
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 59
7. REFERENCIAS ................................................................................................... 60
15
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é um dos maiores produtores de leguminosas da família das Fabaceas
e um grande produtor de feijão-caupi ou feijão macassar (Vigna unguiculata), sendo
cultivado principalmente no sertão semiárido da região nordeste e em regiões pontuais
da Amazônia, utilizando-se ainda de práticas tradicionais de cultivo que envolvem
pouco uso de tecnologia, com plantio em pequenas áreas, agricultura familiar, e baixa
produtividade de grãos (ROCHA, et al., 2017). O feijão caupi é um alimento básico
para as populações rurais e urbanas principalmente no nordeste do Brasil, sendo
considerada a mais importante leguminosa consumida, suprindo grande parte das
necessidades proteicas da população dessa região (VILA NOVA et al. 2014). A
produção do feijão-caupi pode ser afetada por diversos insetos pragas e doenças
podendo gerar perdas econômicas severas.
No mundo, as perdas agrícolas dos produtos armazenados causadas por
pragas chegam a 37% da produção (CHANNALE et al, 2016). Para reduzir possíveis
perdas da produção durante o armazenamento, inúmeras técnicas foram e ainda
estão sendo desenvolvidas, incluindo a utilização de inseticidas e defensivos
químicos. Entretanto, grupos de agricultores na África fazem uso de produtos naturais
vegetais, como extratos botânicos, para o controle de pragas em seus produtos
agrícolas (TIROESELE et al., 2015).
O bruquídeo Callosobruchus maculatus é uma das principais pragas pós-
colheita do feijão V. unguiculata causando danos às propriedades nutricionais e ao
potencial de germinação das sementes (SÁ et al., 2014). O controle de bruquídeos
envolve o uso de pesticidas químicos, porém métodos alternativos menos danosos
como uso de terra de diatomáceas, variedades e cultivares mais resistentes ao C.
maculatus (CRUZ et al., 2015) e o emprego de extratos derivados de plantas não
cultivadas vem sendo utilizados.
Segundo Veiga 2007, a produção agrícola brasileira possui um modelo
historicamente baseado na utilização de agrotóxicos para contornar e compensar
problemas do processo produtivo. Nessa perspectiva, os agrotóxicos foram
introduzidos na agricultura brasileira na tentativa de corrigir as necessidades do solo
e prevenir/eliminar as pragas e doenças que prejudicariam a produtividade.
16
Possivelmente essa é a razão pela qual a venda de agrotóxicos no Brasil venha
crescendo tanto nos últimos anos, tornando o país um dos maiores consumidores de
agrotóxicos do mundo (CARNEIRO et al., 2012). No setor agrícola, cerca de 12
milhões de trabalhadores rurais estão expostos diariamente aos agrotóxicos que são
relatados como causadores de diversas doenças respiratórias, de pele e até câncer
(INCA, 2010). Além disso, os agrotóxicos químicos comprometem o meio ambiente
poluindo mananciais, solos, eliminando polinizadores e insetos e outros organismos
não alvos, e muitos dos agrotóxicos ainda permitidos no Brasil são proibidos em outras
partes do mundo, podendo acarretar em situações de embargos dos produtos
brasileiros, como já ocorreu em 2012, com o suco de laranja brasileiro que foi
devolvido pelos Estados Unidos por causa da contaminação com o fungicida
carbendazin proibido naquele país (CARNEIRO et al., 2015).
A pesquisa e o desenvolvimento de pesticidas derivados de produtos naturais,
principalmente inseticidas botânicos ou biopesticidas, tem atraído bastante interesse
por serem produtos ecologicamente melhores, podendo ser uma alternativa aos
pesticidas sintéticos utilizados (ISMAM, 2015). A produção de biopesticidas tem
aumentado globalmente, alguns biopesticidas são comercializados nos EUA, União
Europeia, América Latina e América do Sul, Ásia e África, principalmente pela
crescente demanda de alimentos orgânicos (ISMAM, 2015; MOSHI & MATOJU,
2017).
Devido a esse quadro nota-se a importância de estudos direcionados a
detecção e caracterização química de novas componentes bioativas para serem
utilizadas na agricultura como uma alternativa para minimizar o uso de agroquímicos
sintéticos e por consequência diminuição dos contaminantes no ambiente, visando
também à preocupação com os consumidores, a segurança dos trabalhadores e o
controle do desenvolvimento de insetos resistentes.
1.1. MOLÉCULAS DE DEFESA DE PLANTAS
Há mais de 350 milhões de anos plantas e insetos interagem e coevoluem
sofrendo em conjunto o processo de pressão seletiva baseada no confronto de
estratégias de defesa e herbivoria, no qual tanto plantas quanto insetos dispõem de
17
um arsenal de moléculas e estruturas que lhes garantam a sobrevivência e
reprodução, permitindo seu prosseguimento na escalada evolutiva (WAR et al., 2012).
As plantas respondem ao ataque de insetos, controlando e/ou compensando
seus efeitos por meio de várias características morfológicas, bioquímicas e
mecanismos moleculares, bastante dinâmicos, mediados por defesas na forma direta
e/ou indireta (BARAH & BONES, 2014). Apesar de sésseis, as plantas têm a
capacidade de reconhecer moléculas ou sinais de células danificadas, assim
conseguem escapar ao ataque de insetos herbívoros por meio de barreiras
estruturais, produção de moléculas entomotóxicas e atração de inimigos naturais das
pragas alvo, utilizando os seus mecanismos de defesa induzidos (MELO & SILVA-
FILHO, 2002; WAR et al., 2012).
As estratégias de defesas de plantas contra insetos aprimoradas ao longo do
processo co-evolutivo podem ser subdivididas em defesas físicas e químicas: as
defesas físicas (morfológicas-estruturais) atuam como uma barreira a predação,
podendo ser exemplificadas por: tricomas, espinhos, cera, cutícula espessa,
lignificação, dentre outras características estruturais. Já dentre as estratégias de
defesas químicas, destacam-se a síntese e acumulo de moléculas entomotóxicas de
forma constitutiva ou induzida pelo dano, como por exemplo: metabólitos secundários
(aminoácidos não proteicos, alcaloides, terpenóides, fenóis, quinonas, flavonoides,
glicosídios cianogênicos) e proteínas. Estes componentes agem afetando a
alimentação, o desenvolvimento, a reprodução e sobrevivência dos insetos (WAR et
al., 2012; WANG, 2009).
Em sementes, uma grande parte dos processos de resposta a herbivoria é
desempenhada por proteínas tóxicas que fazem parte do mecanismo constitutivo de
defesa de plantas. As proteínas de defesa de plantas são uma classe de moléculas
bioativas de grande destaque quanto ao seu potencial contra pragas, pois atuam
principalmente diminuindo a palatibilidade, digestibilidade e potencial nutricional dos
tecidos das plantas para os herbívoros. Essas proteínas antidigestivas e
antinutricionais são agrupadas geralmente em cinco classes principais de proteínas
de defesa: lectinas, quitinases, glucanases, proteínas inativadoras de ribossomas
(RIPs) e inibidores enzimas digestórias (inibidores de α-amilase e inibidores de
proteases) (FÜRSTENBERG-HÄGG et al., 2013).
18
Os tecidos das sementes por sua vez, podem acumular inúmeras proteínas que
conferem resistência contra predadores fitófagos e infecção por vírus, bactérias,
fungos e nematoides. As proteínas vegetais de defesas em sementes mais
abundantes são: lectinas, proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs),
glicohidrolases e inibidores de enzimas proteolíticas (CARLINI & GROSSI-DE-SÁ,
2002).
A detecção e caracterização de novas moléculas bioativas, bem como a
compreensão de seus mecanismos de ação podem gerar estratégias para utilização
de cultivares mais resistentes ou plantas transgênicas que expressem proteínas
inseticidas, capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e por consequência a
reprodução de insetos pragas, assim as variedades resistentes e as plantas
transgênicas são métodos propostos para garantir o controle de pragas (COSTA et
al., 2011).
1.2. PROTEASES INTESTINAIS DE INSETOS FITÓFAGOS
As proteases digestivas intestinais são responsáveis pela degradação de
proteínas para obtenção de aminoácidos essenciais para a biossíntese de proteínas
estruturais e funcionais importantes ao desenvolvimento dos insetos (KUWAR et al.,
2015). As proteases de insetos atraem bastante interesse devido ao seu importante
papel nas relações planta-inseto, devido a isto, tem se observado um grande avanço
na caracterização das proteases digestivas dos mais importantes insetos pragas de
grãos de armazenamento (OSUNA-AMARILLAS et al., 2012). As principais proteases
encontradas no sistema digestório de insetos fitófagos são das classes serínica e
cisteínica.
As proteases serínicas têm ampla distribuição dentro das duas principais
ordens que concentram a maioria dos insetos-pragas, sendo predominante na ordem
lepidóptera, enquanto as proteases cisteínicas são as principais enzimas digestivas
encontradas em grande parte dos coleópteros, no entanto os coleópteros possuem
uma diversidade bastante ampla de proteinases (ABD EL-LATIF, 2015; ZHU-
SALSMAN et al., 2003). As proteases serínicas são encontradas como enzimas
19
digestivas predominantes em insetos de diferentes ordens, até mesmo em coleópteras
que têm um fluido intestinal mais ácido já foram encontradas proteases da família das
tripsinas (SANTOS et al., 2012).
As proteases podem ainda ser divididas em dois grupos: exopeptidases, que
possuem a capacidade de hidrolisar os aminoácidos nas porções N ou C terminais
das cadeias polipeptídicas, e as endopeptidases, que clivam as ligações peptídicas
internas da cadeia, as endopeptidases ainda são classificadas quanto ao seu
mecanismo catalítico e sua especificidade em quatro famílias: aspártico, serino,
cisteino e metalo proteases (FAN & WU, 2005), como visto na tabela 1.
Tabela 1: classificação das proteases. (Adaptado de SANTOS et al., 2012).
Como as proteases são encontradas em organismos como vírus, bactérias,
fungos, plantas e animais, seus mecanismos de ação e inibição são muito importantes
para o desenvolvimento de estratégias de controle de pragas e patógenos, sendo
essas, portanto, potenciais candidatas a utilização como alvo de agentes inseticidas,
CLASSES REPRESENTANTES SÍTIO ATIVO
Serino peptidases Quimotripsina
Ser, Asp, His
Tripsina
Elastase
Catepsinas A e G
Cisteíno peptidases
Papaína Actinidina Caspases
Cys Catepsinas B, C, H, K, L, O, S e W
Aspártico
Peptidases
Pepsina Catepsinas D e E Asp, Try
Renina
Metalopeptidases
Carboxipeptidase A e B Aminopeptidases
Termolisina Íons metálicos
20
que poderiam agir no intestino médio, cavidade corporal e na cutícula dos insetos
(HARRISON & BONNING 2010).
1.2.1. INIBIDORES DE PROTEÍNAS DIGESTÓRIAS DERIVADOS DE
SEMENTES COM ATIVIDADE BIOINSETICIDA
As plantas sintetizam proteínas antinutricionais que atuam reduzindo a
capacidade de digestão dos insetos, nesses grupos de moléculas, estão as lectinas,
quitinases, inibidores de alfa-amilase e inibidores de proteases (WIELKOPOLAN &
STE˛PLOWSKA, 2016). Inibidores de proteases foram relacionados à defesa de
plantas quando se observou que suas concentrações em tecidos de reserva eram
superiores as necessárias para o controle da proteólise intracelular (WESTFALL &
HAUGE, 1948) e que em folhas seus níveis eram aumentados em resposta a uma
injúria por herbivoria (GREEN e RYAN, 1972; JONGSMAN e BOLTER, 1997).
A abundância de inibidores de proteases em leguminosas relatada na literatura
suporta a hipótese de Applebaum (1964) de que esses atuem como parte dos
mecanismos de defesa de plantas contra insetos e que sua digestão poderia ser um
fator na seleção do hospedeiro. Considerando que grande parte dos insetos
apresentam proteases digestivas similares às da família das tripsinas e quimotripsinas
de vertebrados, e que inibidores de proteases correspondem de 6 % a 10 % das
proteínas solúveis totais de muitos órgãos de reserva ou, ainda, 1 % em folhas de
batata e de tomate é provável que sejam um dos fatores antinutricionais mais
importantes na linha de frente contra pragas (KAFATOS et al., 1967).
Inibidores de proteases (IP) são proteínas antagonistas das proteases e sendo
universalmente distribuídos nas diversas formas de vida, em plantas desempenhando
uma ampla variedade de atividades, como: defesa contra herbívoros e patógenos,
regulação de proteínas endógenas durante importantes processos fisiológicos, como
germinação e crescimento e podem também funcionar como proteínas de
armazenamento (RYAN, 1990; FAN & WU, 2005; SWATHI et al. 2016).
Inibidores de proteases podem ser encontrados em diversos tecidos de plantas
como: sementes, tubérculos, folhas e frutos, sendo especialmente encontrados nos
21
tecidos mais susceptíveis a herbivoria, ou seja, em sementes e folhas, o que suporta
sua importância como moléculas de defesa de plantas (BEZERRA et al., 2016). Os
inibidores de proteases são uma das classes mais abundantes de proteínas em
plantas, esses são geralmente proteínas de baixo peso molecular, entre 8 e 20 kDa,
com uma alta estabilidade enquanto a variação de temperatura, mudanças de pHs e
proteólise (ASHOURI et al., 2017).
Kunitz (1947) caracterizou um dos primeiros inibidores de proteases de plantas,
um inibidor de tripsina de soja, que serviu como modelo metodológico para estudos
da bioquímica dos inibidores de proteases de várias outras espécies. O inibidor de
tripsina de soja é uma proteína do tipo globulina de 198 aminoácidos, peso molecular
de cerca de 21,5 kDa e centro reativo contendo o aminoácido arginina na posição 64.
Esse inibidor contêm resíduos de carboidratos, é estável em uma ampla faixa de pH,
1,0-12,0, e em temperatura abaixo dos 40 °C (VALUEVA & MOSOLOV, 2002).
A maioria dos IPs interage com suas proteases alvo por contato com o sítio
ativo (catalítico) da protease, resultando na formação de um complexo do inibidor com
a enzima, que impede a atividade enzimática por bloquear o acesso do substrato ao
sítio catalítico (FAN & WU, 2005). Os inibidores podem ser classificados de acordo
com a classe de enzimas proteolíticas que atuam: em inibidores de proteases
serínicas, inibidores de proteases cisteínicas, inibidores de proteases aspárticas e
inibidores de metaloproteases (DANG & VAN DAMME, 2015).
Os inibidores de proteases mais abundantes e extensivamente estudados são
os inibidores de proteases serínicas de leguminosas do tipo Kunitz, que apresentam
um domínio inibitório para tripsina, e inibidores do tipo Bowman-Birk que inibem
proteases da família das tripsinas e quimotripsinas (EE et al., 2009;
BHATTACHARYYA et al., 2006). Baseado nesse fato, a presença de proteases
cisteínicas no trato digestório de algumas ordens de insetos pode ser o resultado de
uma adaptação evolutiva que permitiu aos insetos alimentarem-se de sementes e
outros tecidos de plantas que são naturalmente ricos em inibidores de proteases
serínicas, como as leguminosas (RYAN, 1990).
Os inibidores de proteases de plantas mostram grande espectro de ação contra
proteases de patógenos e pragas, como fungos, nematoide, bactérias e insetos de
diversas ordens. O papel defensivo dos IPs baseia-se em suas atividades inibitórias
22
para as enzimas digestivas das proteases dos insetos e outros agentes patogênicos,
resultando em uma escassez crítica de aminoácidos essenciais ou interferindo com
importantes processos bioquímicos desses organismos, como a ativação proteolítica
de enzimas, muda de insetos, reduzindo a invasividade nos tecidos por fungos e
bactérias ou no processo de replicação de vírus (FAN & WU, 2005).
Nas últimas décadas, diversos estudos investigam o papel defensivo dos IPs
de plantas contra insetos. Estes trabalhos baseiam-se em bioensaios com
incorporação de inibidores de proteases em dietas artificiais e ensaios de inibição in
vitro de proteases intestinais de insetos com IPs purificados de várias fontes de
plantas. Os resultados desses estudos implicam fortemente os IPs da planta em
mecanismos que interferem com o crescimento e o desenvolvimento de muitos insetos
fitófagos podendo ser candidatos para melhorar a resistência de plantas contra pragas
e patógenos (KIM et al., 2009; VALUEVA & MOSOLOV, 2004).
As plantas apresentam inibidores de proteases com inúmeras propriedades,
além das já descritas, como: resistência à proteólise e tolerância a diversas condições
de pH e temperatura, além de apresentar em alguns casos a capacidade de inibir mais
de uma classe de proteases (CHRISTELLER at al., 1994). Porém, é importante
considerar que ao longo da batalha evolutiva entre insetos e plantas a maioria das
pragas tem encontrado também alternativas para reverter os efeitos negativos dos
inibidores vegetais. Dentre essas possibilidades podem ser incluídas a produção de
mais proteases ou de novas proteases refratárias à ação do inibidor específico, ou
ainda a degradação proteolítica de inibidores (MOSOLOV & VALUEVA, 2008).
Guo et al. 2012 avaliaram um inibidor de protease cisteínica purificado de soja
quanto a seu potencial inseticida contra o bruquídeo C. maculatus através de
bioensaio em semente artificial. Os resultados encontrados demonstram um atraso no
desenvolvimento larval nos estágios iniciais, acompanhado pela inibição das
proteases digestivas dos insetos testados, sugerindo uma correlação da inibição
enzimática com a toxicidade e comprometimento larval.
Cruz et al. 2013, investigaram in vitro a ação de um inibidor de tripsina
purificado da semente de Piptadenia moniliformis (Catanduva), PmTKI, sobre enzimas
digestivas de insetos de diferentes ordens. PmTKI demonstrou atividade notável
contra enzimas de Anthonomus grandis (90%), Plodia interpuncptella (60%) e Ceratitis
23
capitata (70%) e quando incorporado em dieta artificial para C. capitata em ensaios
bioinseticidas in vivo observou-se que a concentração de PmTKI (p / p) a LD50 e ED50
das larvas foi de 0,37 e 0,3%, respectivamente.
Um inibidor de tripsina purificado de sementes de Clitoria fairchildiana mostrou
ampla atividade inibitória para proteases intestinais de insetos, dentre eles Anagaster
kuehniella (76%), Diatraea saccharalis (59%) e H. virescens (49%) (DANTZGER et
al., 2015). Recentemente, um inibidor do tipo Kunitz purificado de sementes de Inga
vera por Bezerra e colaboradores 2016, mostrou alta atividade inibitória contra
proteases intestinais de insetos da ordem Lepidoptera como: Anagasta kuehniella
(89%), Spodoptera frugiperda (83%), Corcyra cephalonica (80%), Heliothis virescens
(70%) e Helicoverpa zea (60%).
Inibidores de tripsina têm apresentado um grande potencial também para o
controle de insetos vetores como o Aedes aegypti. Em 2014, Barbosa e
colaboradores, mostraram que extratos de sementes ricos em inibidores de proteases
de mais de 20 espécies de leguminosas apresentaram atividade contra larvas do
mosquito A. aegypti. Inibidores de tripsina isolados de outros tecidos como as flores
de Moringa oleífera também foram efetivos contra as larvas A. aegypti, retardando seu
desenvolvimento (PONTUAL et al., 2014). Um inibidor de tripsina purificado de
sementes de Adenanthera pavonina mostrou elevada atividade contra as proteases
intestinais do inseto e causado redução de peso e da sobrevivência das larvas do A.
aegypti, sendo esses efeitos correlacionados com degeneração da microvilosidades
das células epiteliais do intestino posterior e alterações no espaço ectoperitrófico
(SASAKI et al., 2015).
A inibição das proteases intestinais dos insetos pode interferir nas fases de
desenvolvimento, causar aumento da mortalidade, deformações e redução da
fecundidade e fertilidade (PANDEY & JAMAL, 2014; EL-LATIF, 2014; DANTZGER et
al., 2015). Esses efeitos parecem estar diretamente relacionados com a redução de
aminoácidos essenciais, porém estes efeitos têm também relacionados possível ação
de outros domínios funcionais das moléculas do inibidor ou de sua ação inibitória em
outros eventos fisiológicos controlados por proteases que promoveriam sinais
capazes de induzir a morte nos insetos (SUMIKAWA et al., 2010; ZHU-SALZMAN &
ZENG, 2015).
24
Portanto, há muitos fatores a serem considerados quanto ao emprego, de
inibidores de proteases para controlar o desenvolvimento, reprodução e sobrevivência
de insetos, como por exemplo, a especificidade (interação com a protease alvo),
concentração, Ki (constante de inibição), estabilidade estrutural do inibidor no intestino
do inseto, resistência do inibidor a outras proteases expressas no intestino do inseto,
considerando que esse pode apresentar a expressão de novas proteases moduladas
pela presença de inibidores. Sendo, esses aspectos fundamentais para a candidatura
de inibidores como ferramenta de manejo e controle de insetos pragas e vetores por
meio de biotecnologia.
1.3. BRUQUÍDEO Callosobruchus maculatus
O bruquídeo Callosobruchus maculatus, pertence ao Reino: Animalia, Filo:
Arthropoda, Classe: insecta, Ordem: Coleoptera, Família: Chrysomelidae, Género:
Callosobruchus, Espécie: C. maculatus segundo classificação de Fabricius 1775, é
uma praga de sementes armazenadas, sendo uma das principaispragas do feijão
fradinho (Vigna unguiculata). Pelo menos 20 espécies compõem o gênero
Callosobruchus, que é originário principalmente da África e Ásia, ocorrem
principalmente em regiões tropicais e subtropicais, podendo causar também danos a
grãos de bico e outros tipos de feijões.
O comercio desses grãos é considerado um dos principais responsáveis pela
introdução e distribuição dos bruquideos (KEDIA et al., 2013; BAWA et al., 2017).
Infestações pelo C. maculatus levam a perdas graves de grãos armazenados em um
curto espaço de tempo e causa significativa queda da viabilidade das sementes. Já
foi observado que perdas podem chegar a 100% dos grãos após apenas 4 meses de
infestação (KOSINI & NUKENINE, 2017)
Os insetos na fase adulta não se alimentam nem ingerem água, porém, as
fêmeas maduras são capazes de colocar ovos durante um período de 12-14 dias após
sua emergência, fertilização e naturalmente morrem (AJAYI et al, 2015). Uma fêmea
pode pôr até 100 ovos ao longo de sua vida Os ovos do C. maculatus são depositados
25
na superfície das sementes, o tempo de incubação e desenvolvimento do embrião é
de cerca de 6 dias, ocorrendo a eclosão das larvas, essas atravessam o tegumento
das sementes penetram nos cotilédones, alimentando-se e sofrendo uma série de
mudas (4 estágios larvais), no primeiro estágio larval, as larvas começam a se
desenvolver antes de penetrar na semente, no ovo, após a formação de uma capsula
na cabeça as larvas penetram o tegumento da semente e entram no endosperma do
feijão, esse estágio dura entre 8-9 dias. No 2º instar as larvas começam a se alimentar
do endosperma do feijão, esse estágio dura entre 3-4 dias. No 3º instar são larvas são
bastante ativas, esse período dura entre 3-4 dias, já no 4º instar as larvas são maiores,
em formato de “C”, a duração desse estagio é de 4-5 dias. Após a passagem dos 4
estágios larvais, seguido de pupa, ao fim de aproximadamente 4 semanas emergem
por meio de uma janela pupal os insetos adultos alados que estarão aptos para cópula
e oviposição entre 24 e 72 h (DEVI & DEVI, 2014) (Figura 1).
As larvas durante os quatro estágios de desenvolvimento formam galerias no
interior das sementes que ocasionam grande perda de peso e as tornam impróprias
para a comercialização e inviável para replantio (OWOLABI et al., 2014; SOUZA et al.,
2011; SÁ et al., 2014).
26
Figura 1 – Ciclo de vida do Callosobruchus maculatus em sementes de Vigna unguiculata. A – Ovos na superfície do tegumento da semente, o ovo mais translúcido é recém posto (seta) e o ovo mais opaco a larva já eclodiu para o interior da semente; B – Larva em posição lateral, onde a parte marrom corresponde a cápsula encefálica e boca, a seta aponta a larva no interior do cotilédone; C – Janela pupal; D –Pupa e metamorfose do inseto adulto; E – Fêmea na superfície da semente; F – Janela pupal aberta após emergência de inseto adulto alado com detalhe das galerias no interior das sementes; G – Macho; H- Fêmea. Adaptado de http://www.beanbeetles.org/handbook/#CT. (Acesso em 02 de agosto de 2017).
As principais enzimas digestórias do trato intestinal das larvas de C. maculatus
são as proteases do tipo cisteínica, serínicas e aspárticas proteases, e α-amilases,
sendo as proteases cisteínicas as principais enzimas envolvidas com a digestão de
proteínas (CAMPOS et al., 1989; ABD EL-LATIF, 2015). Sendo essas consideradas
27
importantes alvos para moléculas de defesa de plantas. Há evidencias na literatura de
estudos com inibidores de proteases cisteínicas de soja incorporadas em dietas
artificiais promoveram retardo no crescimento e interferiram no desenvolvimento das
larvas de 1°, 2° e 3° estágios (KOIWA et al., 1998). Trabalhos posteriores
demonstraram que a adição desse inibidor induzia a expressão de proteases não
cisteínicas insensíveis (proteases aspárticas, cerca de 10% e serínicas), que
permitiam aos insetos do 4° estádio larval sobrepujar a inibição da proteólise intestinal
N (AHN et al., 2004; ZHU-SALZMAN, et al., 2003b; AMIRHUSIN, et al., 2007).
Posteriormente, um trabalho explorando a interação sinérgica de três inibidores
contra o bruquídeo foi avaliada em dieta artificial contendo o inibidor de proteases
cisteínica de soja (recombinante), um inibidor de protease aspártica (pepstatina) e um
inibidor de proteases serínica de soja do tipo Kunitz. Os inibidores combinados
inibiram significativamente as proteases digestivas das larvas de C. maculatus,
aumentando o tempo de desenvolvimento larval, apresentando marcante toxicidade.
Porém o inibidor de protease serínica de soja (Kunitz) individualmente não afetou o
desenvolvimento larval e em ensaios in vitro foi parcialmente digerido pelas enzimas
do homogenato intestinal do inseto (AMIRHUSIN, et al., 2007).
Estudos de Li-Byarlay e colaboradores 2012, avaliando a incorporação de
inibidores de alfa-amilase de sementes de feijão-fradinho em dietas artificiais,
mostraram que essas moléculas tem ação inseticida causando mudanças nas células
epiteliais do intestino médio no C. maculatus, sugerindo que a ação destes inibidores
associados a lectinas presentes no mesmo feijão podem comprometer a absorção de
nutrientes e consequentemente pode interferir no desenvolvimento larval. Outro
inibidor de alfa amilase encontrado no feijão Phaseolus vulgaris, e algumas isoformas
deste inibidor encontradas em outros tipos de feijões já foram caracterizadas como
moléculas que protegem os feijões contra predação de algumas espécies de
bruquídeos como o C.maculatus, Callosobruchus chinensis e o gorgulho de feijão
Zabrotes subfasciatus (ISHIMOTO et al., 1996).
O desafio com inibidores de proteases e amilases individualmente podem
resultar em uma série de mudanças adaptativas, que permitem ao inseto uma
recuperação de seu crescimento e desenvolvimento normais. Essas adaptações
incluem a superexpressão de enzimas digestivas insensíveis ao inibidor isolado.
28
Essas adaptações são um obstáculo para o desenvolvimento de ferramentas
biotecnológicas para o controle de insetos baseado em inibidores isolados
recombinantes. Porém pesquisas promissoras baseadas na combinação de múltiplos
inibidores e outras proteínas tóxicas como lectinas têm reforçado a ideia de que
complexos de proteínas anti-insetos com atividade sinérgica podem resultar em maior
proteção em relação a moléculas isoladas. Dentre esses trabalhos podemos destacar
o emprego da combinação de inibidores de amilases combinados com inibidores de
proteases, que impedem a degradação do inibidor de amilase, impedindo sua
degradação por proteases intestinais de bruquídeos, potencializando seus efeitos
(SHADE et al., 1994; AMIRHUSIN et al., 2004). Estes achados suportam que
estratégias para obtenção de plantas transgênicas resistentes a insetos devem
envolver a piramidalização, empregando múltiplos genes de resistência que poderiam
garantir maior eficácia e durabilidade por atrasar a adaptação e desenvolvimento de
resistência dos insetos (CHRISTOU et al., 2006).
Vários estudos que analisando a infestação de sementes de leguminosas não
hospedeiras ou cultivares de Vigna unguiculata resistentes a C. maculatus,
demonstraram que esses promoveram modificações bioquímicas marcantes nas
enzimas chaves da digestão, indicando a participação de moléculas inibidoras dessas
enzimas nos processos danosos ao desenvolvimento da praga (Sá et al., 2014). Esses
achados contribuem para a identificação de componentes bioativos, com potencial
efeito sobre o bruquídeo C. maculatus para a proteção do feijão V. unguiculata. Muitos
desses estudos têm sido desenvolvidos na África pelo Instituto Internacional de
Agricultura Tropical (IITA), buscando a integração de compostos vegetais e
variedades melhoradas do feijão como alternativa ao uso de inseticidas sintéticos
(OYENIYI et al., 2015).
1.4. Ziziphus joazeiro
Ziziphus joazeiro Martius (Rhamnaceae) é uma árvore nativa brasileira
altamente resistente a ambientes secos, típica de vegetação dos sertões nordestinos
e é uma das espécies de maior ocorrência na caatinga (sertão e agreste), podendo
29
ser encontrada nos nove estados que compõem a região Nordeste e também no norte
de Minas Gerais (DIÓGENES et al., 2010; DANTAS et al., 2014). Suas folhas são
utilizadas como alimento para caprinos, suínos e bovinos em épocas de seca e seus
frutos quando maduros são bastante consumidos pelas comunidades da caatinga
como alimento (CARVALHO, 2007). Também é amplamente utilizada como planta
medicinal para diversos fins, como: anticaspa, reumatismo, gripe, febre, bronquite
crónica, úlceras gástricas, indigestão, azia e dores de cabeça, devido essas
propriedades possui uma grande importância biológica e econômica (CARTAXO et
al., 2010). Por ano, Z. joazeiro produz inúmeras sementes que são distribuídas
principalmente pela fauna nativa (DANTAS et al, 2014).
Há poucos estudos sobre bioatividade de moléculas extraídas dessa planta,
sendo a maioria envolvendo folhas e cascas com aplicação com potencial atividade
medicinal. Luna e colaboradores (2005)
investigaram a atividade larvicida e moluscicida de extratos do caule sobre larvas de
4° estágio de Aedes aegypti e Arthemia salina, respectivamente. Outra pesquisa com
extratos de folhas e caules de Z. joazeiro avaliou sua atividade antioxidante e
antimicrobiana contra Micrococcus luteus e Mycobacterium smegmatis (SILVA et al.,
2011). Brito et al., 2015 avaliou bioatividade e composição química do extrato
hidroalcoólico de folhas de Z. joazeiro, encontrando moléculas que agem
sinergicamente com antibióticos, identificando tal extrato como uma fonte promissora
de moléculas que podem atuar em infecções causadas por bactérias resistentes.
Apesar de Z. joazeiro ser uma planta altamente resistente a estresses bióticos
e abióticos, não existem trabalhos relacionados a extratos e compostos derivados
desta planta e seu potencial contra pragas, e tão pouco estudos sobre a atividade de
moléculas extraídas de suas sementes. Portanto esse trabalho visa avaliar o potencial
bioinseticida da farinha, extratos e frações de sementes de Z. joazeiro contra a praga
do feijão de corda, C. maculatus através de bioensaios em sementes artificiais.
A B C
30
Figura 2 - Ziziphus joazeiro. A- Árvore Z. joazeiro; B- Fruto; C- Fruto aberto com semente. Adaptado
de: http://www.naturezabela.com.br/2011/04/juazeiro-ziziphus-joazeiro.html (acesso em 06 de
Setembro de 2017)
2. OBJETIVOS
31
2.1. GERAL
Prospectar o potencial bioinseticida das sementes de Z. Joazeiro utilizando
como modelo o bruquídeo Callosobruchus maculatus.
2.2 ESPECÍFICOS
1. Obter farinha da semente de Z. joazeiro;
2. Extrair e fracionar proteínas solúveis totais das sementes de Z. joazeiro;
3. Investigar o potencial bioiseticida da farinha e das proteínas solúveis das
sementes de Z. joazeiro sobre o desenvolvimento do bruquídeo C. maculatus por meio
de ensaios com sementes artificiais;
4. Avaliar a presença de inibidores de proteases nos extratos;
5. Determinar a atividade dos inibidores sobre as proteases do homogenato
intestinal das larvas de 4° instar de C. maculatus.
3. MATERIAL E MÉTODOS
32
3.1. MATERIAL
3.1.1- Ziziphus joazeiro Mart.
As sementes de Z. joazeiro Mart. foram identificas e fornecidas pelo banco de
sementes da caatinga (UNIVASF / CRAD / MINISTÉRIO DA INTEGRAÇÃO
NACIONAL), coletadas no estado do Pernambuco, sendo armazenadas em saco
plástico a temperatura ambiente.
Figura 3- Sementes de Z. joazeiro com e sem tegumento (Fonte: arquivo pessoal).
3.1.2. Callosobruchus maculatus
Os bruquídeos foram provenientes da colônia estabelecida no Laboratório de
Química e Função de Proteínas Bioativas e mantidas no Laboratório de Moscas das
Frutas no Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
3.2. EQUIPAMENTOS
33
✓ Moinho multiuso TE-631/3;
✓ Balança eletrônica- Tecnal (mod. B-tec. 2200);
✓ Prensa mecânica manual
✓ Lupa estereoscópica
✓ Centrifuga refrigerada
✓ Microcentrifuga para eppendorf
✓ Liofilizador
✓ Incubadora refrigerada – B.O.D
✓ pHmetro analyser (pH 300)
✓ Leitor de microplaca BIOTECK
✓ Aparelhos usuais de laboratório
3.3. MÉTODOS
3.3.1. MANUTENÇÃO DA COLÔNIA DOS BRUQUÍDEOS
Diariamente sementes do feijão macassar ou feijão-de-corda (Vigna
unguiculata) foram infestadas com fêmeas de C. maculatus para ovoposição durante
um período de 24 h, após este período as fêmeas foram retiradas e as sementes
infestadas mantidas em frascos plásticos em incubadora a 28 C e 70% de umidade
relativa durante um período aproximado de 29 ± 3 dias, a medida que os insetos
emergiram eles foram retirados destes frascos e colocados em novos frascos sem
sementes de feijão, para fertilização das fêmeas por 2 dias. Passado este período de
cópula as fêmeas foram utilizadas para infestar novas sementes.
34
3.3.2. OBTENÇÃO DA FARINHA
As sementes de Ziziphus joazeiro foram descascadas e os cotilédones foram
triturados em moinho multiuso TE-631/3 refrigerado até a obtenção de uma farinha
fina.
3.3.3. EXTRAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS E FRACIONAMENTO
A farinha foi extraída em tampão bicarbonato de sódio 20 mM, pH 8,4 na
proporção (1:10) durante 3 horas sob agitação a 4 ºC. O extrato foi centrifugado a
8.000×g a 4 ºC durante 30 min. O sobrenadante foi filtrado e armazenado a frio e ao
sedimentado adicionou-se novamente 200 mL do tampão de extração para uma ré-
extração. O procedimento foi o mesmo descrito acima e ao final o extrato foi somado
a primeira extração e este conjunto foi denominado extrato bruto (EB).
O fracionamento proteico foi feito em três faixas de concentração de sulfato de
amônio, no qual o extrato bruto foi submetido a saturação de 0-30%, 30-60% e 60-
90% de sulfato de amônio. A cada etapa do fracionamento a suspensão foi deixada
precipitando sob refrigeração a 4 ºC, durante 16 h, em seguida foi centrifugada a
8.000×g a 4 ºC por 30 min. As frações foram ressuspendidas e dialisadas contra água
destilada por 48 h em membrana para dialise com poro de “cut off” de 12.000. Ao final
foram obtidas três frações nas diferentes faixas de saturação, denominadas: F1, F2 e
F3. As frações foram liofilizadas e armazenadas para os testes posteriores.
35
Figura 4. Esquema da extração e fracionamento das proteínas de Z. joazeiro
3.3.4. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
As quantificações de proteínas foram feitas pelo método de BRADFORD
(1976), utilizando como padrão a albumina sérica bovina (BSA), as leituras de
absorbâncias foram realizadas a 595 nm.
Farinha de sementes de Z.
joazeiro
Fração F1 (0-30%)
Extração: bicarbonato de sódio 20 mM, pH 8,4 – 3h, centrifugação a 8.000 ×g a 4 ºC, 30 min.
Precipitação proteica com sulfato de amônio 30-60%, centrifugação a 8.000 ×g a 4 ºC 30 min, dialise contra água destilada.
Sedimentado Extrato Bruto
(EB)
Precipitação proteica com sulfato de amônio 0-30%, centrifugação a 8.000 ×g a 4 ºC, 30 min, dialise contra água destilada.
Sobrenadante
Sobrenadante
Fração F2 (30-60%)
Fração F3 (60-90%) Sobrenadante
Precipitação proteica com sulfato de amônio 60-90%, centrifugação a 12.000 ×g a 4 ºC, 30 min, dialise contra
água destilada.
36
3.3.5. BIOENSAIO EM SEMENTES ARTIFICIAIS
A dieta artificial utilizada neste trabalho foi desenvolvida segundo metodologia
de Macedo et al (1993), na qual sementes artificiais contendo farinha do feijão Vigna
unguiculata incorporada com diferentes concentrações (0,1/0,4/0,8/1,6/2,0%) de
farinha, extrato bruto e as frações proteicas: F2 e F3 de Z. joazeiro, A fração F1
apresenta baixo rendimento, não sendo possível produzir sementes artificiais com
esta fração. As sementes foram confeccionadas em prensa mecânica manual de
maneira a ficar o mais compactada possível, semelhante a compactação da semente
de feijão natural.
A farinha, EB, F2 e F3 de Z. joazeiro foram incorporadas as sementes artificiais
em uma curva de concentração crescente variando de 0 a 2 % do peso total da
semente (400 mg) (Figura 5). Após serem prensadas, as sementes ficaram
acondicionadas em tubos de ensaio, três sementes por frascos, por um período de 16
horas em incubadora (28 C, 70% umidade relativa, 12 horas de fotoperíodo) para
aclimatação. Para melhor observação dos efeitos da farinha fez-se sementes com
farinha de Z. joazeiro em concentrações adicionais de 0,2, 5 e 10%.
As sementes foram em seguida infestadas por fêmeas adultas de C. maculatus
fertilizadas, duas fêmeas/semente. Após 24 horas de oviposição as fêmeas foram
removidas e o número de ovos contados com o auxílio de lupa estereoscópica para
obtenção do parâmetro relacionado à oviposição. Em seguida os ovos excedentes
foram retirados deixando somente três ovos/semente, dispostos de maneira
equidistante em cada semente. Vinte dias depois observou-se o desenvolvimento da
larva em relação aos parâmetros de sobrevivência e massa, para isso foi contado e
pesado as larvas para avaliação da ocorrência ou não de um efeito dose dependente.
Outro grupo de sementes foi infestado para observar possíveis mudanças nos
estágios de desenvolvimento do inseto até sua emergência na fase adulta, para isso
contabilizamos a cada 24 h a emergência dos insetos, durante um período de 50 dias.
Os parâmetros observados para determinação do potencial bioinseticida foram
à oviposição, que permite identificar atratibilidade ou repelência, o número e a massa
das larvas para avaliação do efeito no desenvolvimento larval e tempo emergência e
número de adultos.
37
Figura 5. Sistema de bioensaio em sementes artificiais. A: Prensa manual, B: Molde para prensa, C: Semente artificial e D: Ensaio com sementes artificiais em andamento, tubos de ensaios contendo 3 sementes em cada.
3.3.6. ENSAIOS PARA AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA
PROTEASES SERINICAS E CISTEINICAS
A) ATIVIDADE ANTI-TRIPSÍNICA
Concentração final das proteínas que foram colocadas
Para determinação da atividade anti-tripsínica do EB, F1, F2, F3, ZJnrt e ZJrt
utilizamos alíquotas de 20 µL de solução de tripsina bovina (0,3 mg.mL-1 em tampão
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) pré-incubada por 15 min a 37 ºC, com 120 µL de HCl 25 mM,
360 µL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e 50 µL de cada amostra, após este
período, para iniciar a reação enzimática foi adicionado 200 µL do substrato
C
A B
D
38
(azocaseína 1% em Tris-HCl 50 mM). A reação foi interrompida após 30min, pela
adição de 300 µL de ácido tricloroacético (TCA 20%) e centrifugada a 10.000×g a 4
ºC durante 5 min. Após a centrifugação foi adicionado NaOH na proporção 1:1 e a
reação foi monitorada em espectrofotômetro a 440 nm. Os ensaios foram feitos em
triplicatas utilizando provas em branco como controle.
B) ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA QUIMOTRIPSINA
Para determinação da atividade inibitória para quimotripsina do EB, F1, F2, F3,
ZJnrt e ZJrt utilizamos alíquotas de 30 µL de solução quimotripsina (0,2 mg.mL-1 em
tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 contendo 20 mM de CaCl2) pré-incubada por 10min a
37ºC, com 470 µL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 contendo 20 mM de CaCl2, e
50 µL de cada amostra, EB, F1, F2, F3 e ZJrt, após este período, para iniciar a reação
enzimática foi adicionado 200 µL do substrato (azocaseína 1% em Tris-HCl 50 mM).
A reação foi interrompida após 20 min, pela adição de 300 µL de ácido tricloroacético
(TCA 20%) e centrifugada a 10.000×g a 4 ºC durante 5 min. Após a centrifugação foi
adicionado NaOH na proporção 1:1 e a reação foi monitorada em espectrofotômetro
a 440 nm. Os ensaios foram feitos em triplicatas utilizando provas em branco como
controle.
C) ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA PAPAÍNA
Para determinação da atividade inibitória para papaína, 30 L de solução de
papaína (0,1 mg/mL em Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foi pré-incubada com, 40 L de
solução ativadora (2 mM EDTA+3 mM DTT em Tris-HCl 50 mM, pH7,5), 370 L de
tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e 50 L de cada amostra EB, F1, F2, F3, ZJnrt e ZJrt
por um período de 15 min a 37 ºC. Após esse período a reação foi iniciada
acrescentando-se 200 L do substrato (azocaseína 1% em Tris-HCl 50 mM) nos tubos
teste. A reação foi interrompida após 20min, pela adição de 300 µL de ácido
tricloroacético (TCA 20%) e centrifugada a 10.000×g a 4 ºC durante 5 min. Após a
centrifugação foi adicionado NaOH na proporção 1:1 e a reação foi monitorada em
39
espectrofotômetro a 440 nm. Os ensaios foram feitos em triplicatas utilizando provas
em branco como controle.
D) ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA O HOMOGENATO INTESTINAL
Foram removidos com o auxílio de pinças e lupa estereoscópica, cerca de 100
intestinos de larvas de C. maculatus com 16 dias. Os intestinos foram acondicionados
em solução salina 0,15 M, macerados e logo após centrifugados a 12000 RPM por 20
min a 4ºC. O sobrenadante foi recolhido e denominado homogenato intestinal. Para
determinação da atividade inibitória do EB, F1, F2, F3, ZJnrt e ZJrt sobre o
homogenato intestina, utilizamos alíquotas de 30 µL do homogenato pré-incubado por
15 min a 37 ºC, com 470 µL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e 50 µL de cada
amostra, após este período, para iniciar a reação enzimática foi adicionado 200 µL do
substrato (azocaseína 1% em Tris-HCl 50 mM). A reação foi interrompida após 30min,
pela adição de 300 µL de ácido tricloroacético (TCA 20%) e centrifugada a 10.000×g
a 4 ºC durante 5 min. Após a centrifugação foi adicionado NaOH na proporção 1:1 e a
reação foi monitorada em espectrofotômetro a 440 nm. Os ensaios foram feitos em
triplicatas utilizando provas em branco como controle.
3.3.7. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM TRIPSINA-SEPHAROSE 4B PARA
ENRIQUECIMENTO DE INIBIDORES DE TRIPSINA E PAPAÍNA DA FRAÇÃO F2
A fração F2 obtida a partir do fracionamento com sulfato de amônio na faixa de
saturação 30-60% do extrato bruto da semente de Z. Joazeiro, foi submetida a
cromatografia de afinidade em Tripsina-Sepharose 4B (Sigma-co). A coluna (5 mL de
volume) foi equilibrada com tampão Tris HCl 50 mM, pH 7,5. A fração F2 liofilizada foi
solubilizada (200 mg/20 mL Tris HCl 50 mM, pH 7,5) e aplicada na coluna, a eluição
para a retirada das proteínas não ligadas foi feita com tampão Tris HCL 50 mM, pH
7,5, até que o eluato estivesse livre de proteínas. Para liberar as proteínas adicionadas
a coluna utilizou-se HCl, 100 mM. O fluxo foi mantido a 2 mL/min com coleta padrão
de 2 mL por tubo, o perfil proteico foi monitorado a 280 nm em espectrofotômetro. A
amostra foi recromatocrafada cerca de 15 vezes, até que a retenção de proteínas na
40
coluna fosse mínima. As frações obtidas na cromatografia foram dialisadas e usadas
para os ensaios subsequentes.
3.3.8. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
Para avaliar o perfil proteico do extrato bruto e frações F1, F2, F3, ZJnrt e ZJrt
10 µg de cada amostra foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida,
SDS-PAGE a 15% em presença de SDS, seguindo a metodologia descrita por
Laemmli (1970). Para a preparação do gel de separação utilizou-se acrilamida-
bisacrilamida 30%; tampão Tris-HCl 1,5 M pH 8,8; água destilada, SDS 10%;
persulfato de amônio 30% e TEMED concentrado. O gel de concentração foi
preparado com acrilamida-bisacrilamida 30%; tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; água
destilada SDS 10%; persulfato de amônio e TEMED. O tampão de corrida utilizado foi
Tris-HCl 25 mM; glicina 192 mM e SDS 10%. As amostras foram diluídas em tampão
de amostra, Tris-HCl 62,5 mM, SDS 2%, glicerol 10% v/v, 0,01% de azul de
bromofenol num volume de 20 µL e aplicada no gel (10 x 14 cm, com espaçadores de
0,75 mm), foi utilizado marcador molecular Amersham ECL High-Range Rainbow
Molecular Weight Markers, o sistema de eletroforese foi submetido a uma corrente de
16 mA durante 2 horas, posteriormente as proteínas separadas no gel, foram coradas
coradas em solução de Coomasie Blue R 250 a 1%, metanol 40% e ácido acético 10%
em água destilada. As bandas proteicas foram descoradas em solução descorante
(etanol 30% e ácido acético 10%).
3.3.9. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As análises estatísticas foram realizadas usando Graph Pad Prism 6. As
análises foram realizadas pelo menos em triplicados com desvios padrão
demonstrados. Para detectar diferenças significativas, os dados foram submetidos
teste-t e os dados comparados com o controle de cada experimento. O nível de
aceitação de significância estatística foi P <0,05.
41
4. RESULTADOS
4.1. EFEITOS DA FARINHA, F2 E F3 DA SEMENTE DE Z. joazeiro SOBRE A
FECUNDIDADE E DESENVOLVIMENTO DO INSETO C. maculatus
Avaliou-se por meio de bioensaios em sementes artificiais contendo
concentrações crescentes (0,1/ 0,4/ 0,8/ 1,6/ 2,0%) da farinha, EB e F2 e F3 o efeito
das sementes de Z. joazeiro no desenvolvimento do inseto C. maculatus.
4.1.1. AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE Z. joazeiro SOBRE A OVIPOSIÇÃO
Verificar a contagem com os ovos viáveis
Os bioensaios com sementes artificiais mostraram que a farinha da semente de
Z. joazeiro promoveu uma diminuição na oviposição, de maneira dose dependente,
reduzindo de 23 ovos no controle para 10 ovos a 2%. Nas sementes com farinha de
Z. joazeiro em concentrações adicionais de 5 e 10% observou-se ação inibitória de
100% da oviposição a partir da concentração de 5% (Figura 6B). No entanto, é
possível observar um efeito repelente a oviposição a partir da concentração 0,8%.
Embora as frações F2 e F3 não tenham apresentado uma diminuição significativa na
oviposição, pode-se observar na figura 6 que na concentração de 2%, houve um efeito
repelente a oviposição diminuindo para 20 e 16 ovos, respectivamente. O EB não
promoveu efeito significativo em nenhuma das concentrações (Figura 6A).
42
C o n c e n tra ç ã o d a fra ç ã o (% )
Nú
me
ro
de
ov
os
/se
me
nte
00,1
0,4
0,8
1,6 2
0
1 0
2 0
3 0
4 0
F a r in h a
E B
F 2
F 3
*
A
C o n c e n tra ç ã o d e F a r in h a (% )
Nú
me
ro d
e o
vo
s/s
em
en
te
00 ,1 0 ,2 0 ,4 0 ,8 1 ,6 2 5 1 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
*
* *
B
Figura 6- Efeito sobre oviposição. A- Efeito da incorporação de concentrações crescentes de farinha, EB: extrato bruto, F2: fração 30-60%, F3: fração 60-90% de cotilédones de sementes de Z. joazeiro em bioensaio de sementes artificiais sobre a oviposição de C. maculatus após 24h da infestação. B- Efeito da incorporação de concentrações adicionais entre 0,1 e 10% de cotilédones de sementes de Z. joazeiro em bioensaio de sementes artificiais sobre a oviposição de C. maculatus após 24h da infestação. Os experimentos foram realizados em triplicatas e os dados mostrados são médias ± desvio padrão destes resultados. * P<0,05 comparado com o controle de cada experimento (teste-t).
43
4.1.2. SOBREVIVÊNCIA E DESENVOLVIMENTO DAS LARVAS
Para avaliar o efeito das amostras testadas sobre a sobrevivência das larvas,
o número de larvas vivas por semente após os 20 dias da oviposição foi contabilizado,
considerando o número inicial de três ovos/semente. Podemos identificar na figura 7
uma taxa de mortalidade das larvas maior que 50% a partir de 1,6%, tanto nas
sementes artificiais com farinha quanto nas sementes contendo EB. As frações F2 e
F3 apresentaram maior mortalidade apenas a 2%. Não foram detectadas larvas vivas
nas sementes com farinha a 2%. A figura 8 mostra as imagens das larvas após serem
retiradas das sementes artificias.
C o n c e n tra ç ã o d a F ra ç ã o (% )
Nú
me
ro d
e l
arv
as
/se
me
nte
00,1
0,4
0,8
1,6 2
0
1
2
3
4
F a r in h a
E B
F 2
F 3
**
*
*
**
*
*
*
** *
*
Figura 7 - Sobrevivência das larvas do bruquídeos C. maculatus. Número de larvas mantidas em
sementes artificiais a 28 °C a 70% de umidade contendo farinha, EB: extrato bruto, F2: fração 30-60%,
F3: fração 60-90% de cotilédones de sementes de Z. joazeiro por 20 dias após oviposição. Os
experimentos foram feitos em triplicatas e os dados mostrados representam as médias e desvio padrão
destes resultados. * P<0,05 comparado com o controle de cada experimento (teste-t).
44
Figura 8 - Imagem representativa das larvas de C. maculatus crescidas em sementes artificiais. Larvas crescidas em sementes contendo farinha, contendo farinha, EB: extrato bruto, F2: fração 30-60%, F3: fração 60-90% de cotilédones de sementes de Z. joazeiro com 20 dias de desenvolvimento.
Quanto ao parâmetro peso da larva a figura 9 mostra uma redução acima de
de 50%, já na concentração de 0,1%, nas sementes com a farinha, e 0,4% no EB e
fração F3 quando comparadas as larvas mantidas em dieta controle que
Fração proteica 2 (F2)
0% 0,1% 0,4%
1,6% 0,8% 2,0%
0% 0,1% 0,4%
0,8% 1,6% 2,0%
Fração proteica 3 (F3)
Farinha Extrato Bruto (EB)
0%
0,1%%
0,2%
0,4% 0,8%
0% 0,1% 0,4%
1,6% 0,8% 2,0% 1,6%
45
apresentavam massa média de 11,5 mg. Para o EB e F2 é possível observar que o
efeito sobre a massa das larvas ocorre de maneira dose dependente a partir da
concentração 0,4%. Na maior concentração testada, 2%, as larvas sofreram
diminuição de 85% de seu peso nas sementes com as frações F2 e F3, e 95% nas
sementes com EB. Nessa concentração as larvas não se desenvolveram nas
sementes com farinha.
C o n c e n tra ç ã o d a F ra ç ã o (% )
Ma
ss
a d
a L
arv
a(m
g)
00,1
0,4
0,8
1,6 2
0
5
1 0
1 5
F a r in h a
E B
F 2
F 3
*
*
*
*
*
** * *
*
*
*
*
*
*
*
**
*
Figura 9- Avaliação do efeito da incorporação da farinha, EB, F2 e F3 sobre a massa das larvas de C. maculatus. Larvas crescidas em sementes com concentrações crescentes de farinha, EB: extrato bruto, F2: fração 30-60%, F3: fração 60-90% de cotilédones de sementes de Z. joazeiro sobre a massa das larvas de C. maculatus após 20 dias de crescimento em bioensaio de sementes artificiais a 28 °C a 70% de umidade. Os experimentos foram feitos em triplicatas e os dados mostrados representam as médias e desvio padrão destes resultados. * P<0,05 comparado com o controle de cada experimento (teste-t).
46
4.1.3. EMERGÊNCIA DOS INSETOS ADULTOS NAS SEMENTES ARTIFICIAIS
Para avaliar o potencial de Z. joazeiro sobre a emergência de adultos de C.
maculatus, utilizou-se sementes artificiais contendo concentrações crescentes (0,1/
0,4/ 0,8/ 1,6/2,0%) da farinha e das frações proteicas (EB, F2 e F3) de Z. joazeiro.
Observa-se na tabela 2, que em todas as concentrações das estudadas incorporadas
a dieta artificial do C. maculatus sua taxa de emergência foi menor que 50%, a partir
da concentração 0,4 %, não houve emergência de insetos nas sementes contendo EB
a partir dessa concentração. Também não houve emergência de adultos a 0,8% de
farinha e 2% de F2. Além disso, houve interferência no tempo de desenvolvimento e
emergência de insetos adultos nas sementes com 0,1% de farinha e EB, e 2% de F3
em aproximadamente 10 dias. A F2 e F3 a 0,8% induziram um aumento no tempo de
emergência de adultos em aproximadamente 20% (28 para 33 dias) e 25% (28 para
35 dias).
47
Tabela 2 - Efeito da farinha e frações proteicas (EB, F2 e F3) sobre a emergência e período de desenvolvimento do bruquideo C. maculatus em sementes artificias a 28 °C a 70% de umidade. Avaliação da emergência e período de desenvolvimento dos insetos crescidos em semente artificial a 28 °C a 70% de umidade contendo farinha, EB: extrato bruto, F2: fração 30-60%, F3: fração 60-90% de cotilédones de sementes de Z. joazeiro. Os experimentos foram feitos em triplicatas e os dados mostrados representam as médias e desvio padrão destes resultados. A emergência foi monitorada a cada 24 h por 50 dias. NE: Não Emergiram, ± D.P: Desvio padrão.
Frações
Concentração
(%)
Emergência
de adultos (%)
Período de
desenvolvimento (dias)
+ D.P
Farinha
0,0 (Controle)
0,1 0,4 0,8 1,6 2,0
95
12,5 12,5 NE NE NE
27 ± 0,5 37± 0,9 37± 0,8
- - -
EB
0,0 (Controle)
0,1 0,4 0,8 1,6 2,0
95
29,6 NE NE NE NE
27 ± 0,6
37 ± 1,5 - - - -
F2
0,0 (Controle)
0,1 0,4 0,8 1,6 2,0
96
16,6 8,3 8,3 8,3 NE
28 ± 0,6 29 ± 0,5
29 ± 1,1
33 ± 1,3
34 ± 0,5 -
F3
0,0 (Controle)
0,1 0,4 0,8 1,6 2,0
95
33,3 6,2 2,5
41,6 41,6
28 ± 0,9 29 ± 1,6 33 ± 0,8 35 ± 0,6 35 ± 1,2 37 ± 0,7
48
4.2. AVALIAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE DEFESA DAS SEMENTES DE Ziziphus
joazeiro.
4.2.1. ENRIQUECIMENTO DE INIBIDORES DE TRIPSINA E PAPAÍNA POR
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Cromatografia de afinidade em coluna Tripsina-Sepharose 4B
As proteínas provenientes da extração das sementes de Z. joazeiro foram
fracionadas com sulfato de amônio resultando em três frações (F1 0-30%, F2 30-60%
e F3 60-90%), a fração F2 que apresenta uma inibição para tripsina de 90,34% e
inibição de 64% para papaína, que é uma enzima da classe das proteases cisteínicas,
classe majoritária no trato digestório de C. maculatus, foi submetida a cromatografia
de afinidade em Tripsina-Sepharose 4B (Sigma-co). O perfil cromatográfico
apresentado na figura 10, tem um pico proteico não retido eluído com tampão de
equilíbrio da coluna, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, e um pico retido eluído com HCl 0,1M.
A fração proteico não retida na coluna de tripsina foi denominado Zjnrt (Z. joazeiro não
retido por afinidade em tripisna), e a fração retida foi chamada de Zjrt (Z. joazeiro
afinidade em tripsina). As duas frações foram dialisadas contra água destilada,
liofilizadas e usadas para os ensaios subsequentes.
49
Figura 10. Cromatografia de afinidade em Tripsina-sepharose 4B da fração F2 de Ziziphus
joazeiro. O material não retido (NR) foi eluído com tampão Tris HCL 50 mM e os picos retidos (R) com
HCl 0,1M. Foram coletadas frações de 2mLtubo.
4.2.2 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE INIBITÓRIA PARA PROTEASES SERÍNICAS E
CISTEÍNICAS
O EB e as F2, F3, ZJrt e ZJnrt foram avaliadas quanto as suas atividades
inibitórias para proteases serínicas e cisteínicas. A atividade catalítica da tripsina foi
inibida em mais de 90% pelo EB, F1, F2, F3 e ZJrt, não sendo detectado inibição para
tripsina no ZJnrt. O EB e a fração F2 diminuíram em ± 36% a atividade da
quimotripsina, não sendo detectada inibição na fração F3, ZJrt e ZJnrt. A enzima
papaína foi inibida 19% e 64% pelo EB e F2 respectivamente, enquanto F3 inibiu
fracamente. A fração ZJnrt inibiu 72,43% da atividade da papaína, e ZJrt não
apresentou atividade inibitória para essa enzima (Tabela 3).
Tabela 3. Atividade inibitória do extrato bruto, frações, F2 e F3, ZJrt e ZJnrt de Z. Joazeiro em relação
a proteases serínicas, cisteínicas Nd: não detectado, ± DP: Desvio Padrão.
Enzima
Fonte
EB % de
inibição/ ±
DP
F2 % de inibição/ ±
DP
F3% de inibição/ ±
DP
ZJrt % de inibição/ ±
DP
ZJnrt% de inibição/ ±
DP
Tripsina
Pâncreas
bovino
96±2.0
90±1.6
93±1.6
100
Nd
Quimotripsina
Pâncreas
bovino
36±5.0
36±3.0
Nd
Nd
Nd
Papaína
Latex de papaía
19±1.5
64±3.1
6±1.3
Nd
72,5±1.8
Homogenato
intestinal
Intestino
de C. maculatus
43,3±1.1
44±1.0
40±3.2
55±1.9
66,6±1.4
50
4.2.3. ANÁLISE DAS FRAÇÕES PROTEICAS DE Ziziphus joazeiro POR
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
As frações proteicas obtidas de Z. joazeiro foram analisadas por SDS-PAGE o
EB, F1, F2, F3, ZJrt e ZJnrt para avaliar o perfil proteico dessas frações. A SDS-PAGE
revelou que as frações obtidas são constituídas por proteínas com diferentes pesos
moleculares variando entre 225 kDa e 17 kDa. A fração F2 apresenta bandas proteicas
majoritárias com massa molecular de aproximadamente 225, 38, 31 e 17 kDa. Após
fracionamento em coluna de tripsina-sepharose foi possível observar que as bandas
proteicas de 225, 38 e 31 kDa são abundantes no Zjnrt e a banda de 17 kDa fracionou
no pico retido na coluna (Zjrt).
Figura 11 - SDS-PAGE (15%) do extrato bruto e frações proteicas de Z. Joazeiro. M: marcador de peso molecular, EB: extrato bruto, F1: fração 0-30%, F2: fração 30-60%, F3: fração 60-90%, ZJrt: retido em coluna de afinidade, ZJnrt: não retido em coluna de afinidade. Caixa tracejada corresponde a bandas proteicas com massa molecular de aproximadamente 34 kDa que são abundantes na fração F2 e no Zjnrt.
51
5. DISCUSSÃO
O uso de inseticidas químicos para o controle de insetos pragas representa um
alto risco ambiental, para saúde humana e animal, principalmente pelo risco de
acúmulo ao longo da cadeia alimentar, toxicidade para insetos e outros animais não
alvo e por poluir recursos hídricos e o solo (MENDONÇA et al. 2011). A busca por
novas maneiras eficazes para o controle de pragas tem despertado o interesse pela
investigação de inseticidas botânicos (bioinseticidas), principalmente para controle de
insetos que desenvolveram resistência aos inseticidas convencionais (AMOABENG et
al. 2013).
As indústrias agrícolas precisam também atender a demanda de países mais
exigentes quanto à contaminação com agroquímicos, por isso, seu grande interesse
em inseticidas biodegradáveis e alternativas de manejo de pragas mais sustentáveis
e “eco amigável” que inseticidas sintéticos. Atualmente, pesticidas a base de plantas
já têm sido formulados e aplicados na indústria (KEDIA et al., 2015).
Proteínas de defesa são candidatas a formulações bioinseticidas, sendo os
inibidores de enzimas digestivas as proteínas de defesa de plantas melhor estudadas
quando ao seu potencial em interferir no crescimento e interferir no desenvolvimento
de insetos devido a sua capacidade de inibir a digestão e absorção de nutrientes (ABD
EL-LATIF, 2015). Dentro desta perspectiva os inibidores de proteases de plantas, que
são proteínas que compõe o grupo de moléculas de defesa antinutricionais, são
importantes alvos de estudos para o controle de pragas agrícolas.
A longa história coevolutiva das interações dos insetos com suas plantas
hospedeiras desencadeou no desenvolvimento de mecanismos sofisticados para
contornar os efeitos de compostos químicos antinutricionais produzidos pelas plantas.
Essas respostas podem envolver mudanças na expressão gênica e no repertório
proteico em células que compõem o trato digestivo, a primeira região de contato com
essas moléculas antinutricionais. A pesquisa com proteases digestivas de insetos vêm
revelando seu papel fundamental na adaptação de insetos aos inibidores de proteases
de planta e trouxe uma nova avaliação de como os insetos fitófagos empregam esse
grupo de moléculas tanto na digestão proteica quanto na contra-defesa ao arsenal de
proteínas inibidoras produzidas pelas plantas (ZHU-SALZMAN & ZENG, 2015).
52
O bruquídeo C. maculatus é uma das principais pragas de sementes de feijão
caupi (V. unguiculata) (LÜ et al., 2017). O feijão caupi ou macassar é uma das
leguminosas mais utilizadas como alimentos em áreas tropicais e subtropicais como:
África, Ásia, América Central e do Sul. C. maculatus ataca as sementes de caupi
armazenadas promovendo perdas de 30% do peso das sementes com uma infestação
de até 70% das sementes após um período de seis meses de armazenamento
(JACKAI & ADALLA, 1997).
Há trabalhos relatando que a oviposição, eclosão das larvas e emergência de
adultos é fortemente inibida em C. maculatus quando infestando sementes não
hospedeiras (OLIVEIRA et al., 2009; SOUZA et al., 2011). Estes trabalhos em conjunto
com ensaios empregando sementes artificiais contendo, farinhas, extratos e
moléculas isoladas de plantas não hospedeiras têm sugerido que essas apresentam
componentes bioativos que promovem toxicidade em processos biológicos
fundamentais do inseto, como a digestão, muda e reprodução (SOUZA et al., 2012).
Neste trabalho, extratos proteicos das sementes de Z. joazeiro foram
fracionados e investigados quanto ao seu potencial bioinseticida sobre o
desenvolvimento do bruquídeo C. maculatus por meio de ensaios com sementes
artificiais. Hudaib et al. 2013, observaram que os ensaios com sementes artificiais são
mais eficazes que outros ensaios, como por exemplo, os ensaios que envolvem a
embebição de feijões com a amostra a serem testadas, quanto a presença de novas
moléculas bioativas com atividade contra o inseto C. maculatus.
O fracionamento das proteínas totais das sementes de Z. joazeiro por
precipitação com sulfato de amônio resultou em três frações, F1, F2 e F3. A fração F1
apresenta baixo rendimento, não sendo possível produzir sementes artificiais, com
isso os ensaios com sementes artificiais foram realizados apenas empregando a
farinha, o extrato bruto e as frações F2 e F3. No entanto, a F1 foi testada in vitro quanto
a sua atividade inibitória para enzimas digestivas. E mostrou alta atividade inibitória
para tripsina.
Para avaliar o potencial de componentes das sementes de Z. Joazeiro sobre
C. maculatus primeiramente a oviposição foi analisada como um parâmetro importante
para o desenvolvimento dos insetos. A redução da oviposição pode indicar a presença
de componentes tóxicos e antinutricionais para as larvas dos insetos, pois as fêmeas
conseguem discriminar a cor, tamanho, textura e composição das sementes por
53
receptores sensoriais, dessa forma escolhendo sementes que possam garantir a
sobrevivência da prole. Alguns trabalhos sugerem que esses parâmetros afetam a
oviposição das fêmeas de C. maculatus (BHATTACHARYA & BANERJEE, 2001; SÁ
et al.,2014, MAINANI et al., 2015).
Nos bioensaios em sementes artificiais pôde-se observar que a incorporação
de farinha da semente de Z. joazeiro promoveu uma diminuição na oviposição das
fêmeas a partir da concentração 2%, em ensaios nas concentrações 5% e 10 % não
ocorreu oviposição. As sementes artificiais contendo o EB e F2 e F3 não apresentaram
diminuição significativa na oviposição. Muitos trabalhos já demonstraram que as
plantas produzem constitutivamente compostos orgânicos voláteis relacionas a
defesa contra herbívoros (BARAH & BONES, 2014). As fêmeas selecionam os
melhores locais para oviposição, visto que suas larvas irão se alimentar das sementes,
sendo fundamental para a sobrevivência de sua prole. Ajayi et al., 2015 observaram
que a preferência de oviposição das fêmeas de C. maculatus é mediada por
compostos semioquímicos voláteis. Dessa forma, a presença destes compostos
voláteis em maior quantidade pode estar associada à ação inibitória marcante na
oviposição observada nas sementes incorporadas com a farinha de Z. joazeiro com 5
e 10%.
Outros parâmetros fundamentais para avaliação do desempenho de insetos
pragas frente a dietas artificiais contendo potenciais bioinseticidas derivados de
extratos vegetais é o peso e a sobrevivência larval (JABER, HAUBRUGE & FRANCIS,
2010; MACEDO et al., 2015). Nas sementes artificiais contendo farinha e EB, o peso
das larvas sofreu uma redução de 50% já na concentração de 0,1%. Nas sementes
com F2 e F3 as larvas apresentaram diminuição em 50% do seu peso na concentração
0,4%. Nas sementes com as concentrações maiores das frações, as larvas sofreram
uma redução ainda mais brusca do peso, também visto nas larvas crescidas nas
sementes com farinha e EB (FIGURA 8).
A diminuição na sobrevivência das larvas após 20 dias de ensaio foi
significativamente maior na farinha, que promoveu redução significativa do número de
larvas já na concentração 0,1% e chegando a 100% de mortalidade na concentração
de 2%. O extrato bruto promoveu redução acima de 50% no número de larvas a partir
de 0,8%, chegando a promover 96% de mortalidade na concentração de 2%. As
54
sementes artificiais contendo F2 e F3 afetaram significativamente a sobrevivência das
larvas a partir da concentração 1,6%.
Essa alta mortalidade das larvas observadas na farinha e extrato bruto pode
estar associada à ingestão de compostos tóxicos, presentes nas sementes de Z.
joazeiro que podem estar interferindo em processos digestórios imprescindíveis para
o desenvolvimento larval. Souza et al., 2012 avaliaram o efeito da farinha e frações
proteicas das sementes de Albizia lebbeck, utilizando também bioensaios com dieta
artificial, e observaram que as sementes artificiais incorporadas com diferentes
concentrações da farinha de sementes de Albizia lebbeck provocaram perda de peso
grave e redução da sobrevivência do bruquídeo C. maculatus, com resultados que se
assemelham aos observados neste trabalho.
O tempo de desenvolvimento dos insetos foi avaliado pelo tempo de
emergência de adultos nas sementes artificiais incorporadas com Farinha, EB, F2 e
F3. Em todas as sementes ocorreu aumento significativo no tempo de emergência já
a partir das menores concentrações testadas. O tempo de emergência foi prolongado
em 9 dias (de 28 para 37 dias) nas sementes contendo farinha e EB de Z. joazeiro.
Esta ampliação no período de desenvolvimento também foi observado quando C.
maculatus foi mantido em sementes de leguminosas não hospedeiras que
prolongaram esse tempo de 28 para 31 dias (MAINAILI et al., 2015). Nas sementes
contendo as frações F2 e F3 o tempo de emergência de 28 dias foi prolongado para
34 dias na concentração de 1,6% e 37 dias a 2%, respectivamente.
O número de insetos adultos que emergiram das sementes artificiais também
foi significativamente reduzido, ocorrendo uma redução na emergência para menos
de 50% em todas as amostras testadas na menor concentração, 0,1%. Não ocorreu
emergência de adultos nas sementes com farinha a partir da concentração 0,8% e nas
sementes com EB a partir da concentração 0,4% durante o período de 50 dias de
observação, sugerindo um efeito dose-dependente. Um dado intrigante foi à
emergência de adultos nas sementes artificiais contendo F3 que apresentaram um
aumento de emergência a partir da concentração 1,6%, revertendo o efeito das
concentrações menores, isto pode estar atribuído a modulação nas enzimas
digestórias produzidas pelas larvas, no entanto é necessário outros estudos para
análise do trato intestinal dessas lavas.
55
Em conjunto os dados obtidos quanto aos parâmetros de desenvolvimento de
C. maculatus em sementes artificiais contendo farinha, extrato e frações proteicas de
Z. joazeiro demonstram que estas sementes apresentam componentes bioativos com
potencial atividade bioinseticida. Como o intestino corresponde à região de maior
contato com as moléculas incorporadas nas dietas artificiais contra insetos pragas, e
as proteases intestinais são geralmente alvo de moléculas de defesa de plantas foi
avaliado o efeito do EB, F2, F3, Zjnrt e Zjrt sobre proteases digestivas do tipo
proteases serínicas e cisteínicas e homogenato intestinal das larvas de C. maculatus.
A presença de atividade inibitória para proteases digestivas no EB, F2, F3, Zjnrt
e Zjrt das sementes de Z. joazeiro foi verificada por ensaios in vitro com as enzimas:
tripsina, quimotripsina e papaína. Pôde-se observar redução na atividade catalítica
das enzimas quimitripsina e papaína somente pelo EB e F2, a atividade enzimática de
papaína foi inibida 20% pelo EB e 64% pela F2, já para a enzima quimotripsina tanto
o EB quanto F2 inibiu 36%. Já a atividade catalítica da tripsina foi inibida em todos os
testes, tendo como porcentagem de inibição 96,92% pelo EB, 100%, 90,34% e
93,05% pelas frações F1, F2, F3, respectivamente. A F1 embora tenha a melhor
atividade de inibição para tripsina não apresentou um bom rendimento de extração,
por isso, somente as frações F2 e F3 foram avaliadas por bioensaios.
A F2 que apresentou atividade para as três enzimas e melhor atividade para
papaína, enzima da classe das proteases cisteínicas, classe majoritária no trato
digestório de C. maculatus, foi submetida a cromatografia de afinidade em Tripsina-
Sepharose 4B. A cromatografia permitiu separar a F2 em dois picos proteicos, sendo
um não retido em tripsina e outro retido em tripsina, denominadas Zjnrt e Zjrt,
respectivamente.
A SDS-PAGE revelou que o extrato bruto apresenta proteínas em um amplo
intervalo de massa molecular, entre 225 kDa e 17 kDa. A fração F2 apresenta bandas
proteicas majoritárias com massa molecular de aproximadamente 225, 38, 31 e 17
kDa. Após fracionamento em coluna de tripsina-sepharose foi possível observar que
as bandas proteicas de 225, 38 e 31 kDa são abundantes no Zjnrt e a banda de 17
kDa fracionou no pico retido na coluna (Zjrt). A massa molecular de inibidores de
papaína varia entre 5 e 80 kDa, o que explicaria as bandas de aproximadamente 30
kDa (SHAMSI et al. 2016). A banda correspondente abundante no pico retido tem
56
massa molecular próxima de 18 kDa, está dentro da massa estimada para inibidores
de proteases do tipo Kunitz, 18 e 22 kDa (DIAS et al., 2017).
ZJnrt apresentou atividade para papaína de 72,5% e não teve atividade
inibitória para quimotripsina e tripsina, demonstrando que a fração não retida na
coluna de tripsina apresenta atividade inibitória específica para proteases cisteínicas,
já a fração retida em tripsina (ZJrt) foi específica para tripsina, com IC50 para tripsina
bovina de 0,007 mg/mL. Os efeitos sobre o crescimento, desenvolvimento e
mortalidade das larvas submetidas à dieta artificial com a farinha e os extratos
proteicos testados, podem estar associados à presença de inibidores de proteases,
mesmo que não de modo exclusivo, que ao inibir as enzimas digestivas das larvas
diminuem a proteólise/digestão de proteínas e por consequência uma menor
disponibilidade de aminoácidos essenciais para o desenvolvimento do inseto.
Inibidores de tripsina isolados de plantas já têm sido relatados como moléculas
com potencial bioinseticida. As enzimas digestivas de C. maculatus foram fortemente
susceptíveis ao inibidor de tripsina de sementes de Crotalaria pallida (CapTI 74%)
purificado e testado por Gomes et al., (2005) e pelo inibidor de tripsina do tipo Kunitz
de Pithecellobium dumosum (PdKI-4, 66%) purificado por Rufino et al., 2013. Macedo
et al. 2002 observaram que a incorporação em dieta artificial do inibidor de tripsina de
sementes de Dimorphandra mollis (DMTI-II) a concentração de 1% causou 67% de
mortalidade para larvas de C. maculatus, com LD50 e ED50 de 0,50% e 0,60%,
respectivamente. Abd El-latif (2015) observou ao incorporar em dieta artificial um
inibidor de papaína de semente de cevada que o tempo de desenvolvimento e a
mortalidade do bruquídeo foi consideravelmente aumentada.
Esses achados são sugestivos de que inibidores específicos para tripsina com
potencial bioinseticida presentes na farinha e frações proteicas de Z. joazeiro podem
estar contribuindo em ação conjunta com inibidores de proteases cisteínicas sobre as
enzimas digestivas do bruquideo. A ação de inibidores de proteases de diferentes
classes atuando sinergicamente contra o C. maculatus, já foi relatada por Armhusin et
al. (2007), mostrando que as ações conjuntas desses inibidores podem ter um efeito
no desenvolvimento do bruquídeo muito maior do que os inibidores utilizados
separadamente. Além disso, os inibidores podem ter outras funções defensivas além
da inibição, podendo conter domínios não relacionados à inibição interferindo em
57
outros processos fisiológicos além da digestão intestinal, que podem contribuir com o
seu papel tóxico contra C. maculatus (SUMIKAWA et al. 2009). Devido a isso, outros
estudos são necessários para identificação do mecanismo de ação dos inibidores
encontrados.
Com os resultados obtidos por meio dos bioensaios com sementes artificiais,
pôde-se apontar que um efeito sinérgico entre as proteínas e outros compostos
encontrados na farinha e frações testadas podem estar contribuindo para o potencial
de Z. joazeiro contra o bruquídeo C. maculatus.
Extratos de casca e folhas da planta de Z. joazeiro são amplamente
empregadas para diversos fins, tendo cerca de 12 artigos científicos listados no
PUBMED, até esta data, relacionados a avaliação farmacológica de compostos
derivados desses extratos. Porém ainda não há pesquisas relacionadas a atividades
de extratos e frações proteicas de suas sementes contra insetos pragas.
A busca por biopesticidas de origem natural para o controle de pragas tem
despertado muito interesse por oferecer uma solução mais sustentável. No Brasil,
principalmente no Nordeste a produção de feijão caupi é feita predominantemente por
pequenos agricultores com poucos recursos tecnológicos (ROCHA, et al., 2017).
Esses agricultores com poucos recursos precisam de estratégias para manter sua
produção armazenada livres de perdas causadas por pragas, estas estratégias devem
ser preferencialmente de fácil obtenção e aplicação, nessa perspectiva, a aplicação
da farinha e possivelmente de extratos e proteínas derivados de sementes de Z.
joazeiro como defensivo contra pragas que atacam o feijão caupi, seria mais uma
forma sustentável de aplicação dessa planta tão importante para o semiárido
nordestino. Portanto, nossos dados são um indicativo de que há um grande potencial
de moléculas bioativas proteicas e não proteicas em extratos e na própria farinha de
sementes de Z. joazeiro com atividade bioinseticida que devem ser investigadas para
melhor conhecimento de suas propriedades antinutricionais e características
bioquímicas.
58
6. CONCLUSÃO
A farinha das sementes de Z. Joazeiro, o extrato bruto e frações proteicas
obtidas por precipitação sequencial com sulfato de amônio incorporadas em dietas
artificiais em concentrações crescentes interferiram significativamente no
desempenho de C. maculatus reduziram o peso larval dos insetos acima de 50% já
nas primeiras concentrações testadas (0,1 a 0,4%), de Farinha, EB e F3, além de
reduzirem consideravelmente a sobrevivência das larvas a partir da concentração 1,6
%, e causarem 100% de mortalidade a 2,0% de Farinha e 96% de mortalidade na
concentração 2,0% do EB. Outros parâmetros de desenvolvimento afetados foram o
tempo de emergência e número de insetos adultos que emergiram das sementes. A
inibição para proteases serínicas e cisteínicas detectada pode estar relacionada às
alterações no desenvolvimento do bruquideo. Este estudo demonstra que as
sementes de Z. Joazeiro são promissoras como estratégia altenativa para o controle
de insetos praga como o C. maculatus.
59
7. REFERÊNCIAS
ABD EL-LATIF, A.O. Isolation and purification of a papain inhibitor from Egyptian genotypes of barley seeds and its in vitro and in vivo effects on the cowpea bruchid, Callosobruchus maculatus (F.). Pesticide Biochemistry and Physiology. v. 118. p. 26–32, 2015. AJAYI, O.E.; BALUSU, R.; MORAWO T.O.; et al. Semiochemical modulation of host preference of Callosobruchus maculatus on legume seeds. Journal of Stored Products Research. v.63.p. 31–37, 2015.
AMIRHUSIN, B.; SHADE, R.E.; KOIWA, H.; et al. Soyacystatin N inhibits proteolysis of wheat alpha-amylase inhibitor and potentiates toxicity against cowpea weevil. J Econ Entomol. v. 97. p.2095-2100, 2004
AMIRHUSIN, B.; SHADE, R.E.; KOIWA, H.; et al. Protease inhibitors from several classes work synergistically against Callosobruchus maculatus. Journal of Insect Physiology. v.53. p. 734-740, 2007.
AMOABENG, B.W.; GURR, G.M.; GITAU, C.W.; NICOL HI, MUNYAKAZI, L.; et al. Tri-Trophic Insecticidal Effects of African Plants against Cabbage Pests. Plos one. 2013.
ASHOURI, S.; ABAD, R.F.P.; ZIHNIOGLU, F.; KOCADAG, E. Extraction and purification of protease inhibitor(s) from seeds of Helianthus annuus with effects on Leptinotarsa decemlineata digestive cysteine protease. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. v.9 .p. 103–119, 2017.
BABU, S.R.; SUBRAHMANYAM, B. Bio-potency of serine proteinase inhibitors from Acacia senegal seeds on digestive proteinases, larval growth and development of Helicoverpa armigera (Hübner). Pesticide Biochemistry and Physiology. v. 98. p. 349-358, 2010. CHRISTOU et al., 2006.
BARBOSA, P.B.B.M.; DE OLIVEIRA, J.M.; CHAGAS, J.M; et al. Evaluation of seed
extracts from plants found in the Caatinga biome for the control of Aedes aegypti.
Parasitology Research (1987. Print). v. 113, p. 3565-3580, 2014.
BARAH, P.; BONES, A.M. Multidimensional approaches for studying plant defence against insects: from ecology to omics and synthetic biology. Journal of Experimental Botany.v. 66.p. 479–493, 2015.
60
BARROS, F.C.; SAGATA, E.; FERREIRA, L.C.C.; JULIATTI, F.C. Induction of resistance in plants against phytopathogens. Biosci. J. v. 26 p.231-239, 2010.
BAWA, S.A.; OFORI, E.K.S.; OSAE, M. Species diversity and relative abundance of Callosobruchus (Coleoptera: Chrysomelidae) in stored cowpea in four major agricultural produce markets in the central region, Ghana. Journal of Stored Products Research.v.72. p. 117-120, 2017.
BEZERRA, C.S.; OLIVEIRA, C.F.R.; MACHADO, O.L.T.; et al. Exploiting the biological roles of the trypsin inhibitor from Inga vera seeds: A multifunctional Kunitz inhibitor. Process Biochemistry.v. 51.p. 792–803, 2016.
BHATTACHARYYA, A.; MAZUMDAR, S.; LEIGHTON, S.M.; BABU, C.R.A. Kunitz proteinase inhibitor from Archidendron ellipticum seeds: purification, characterization and kinetic properties. Phytochamistry. v. 67. p 232-241, 2006.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding. Analytical Biochemistry.v. 72.p. 248-254, 1976.
BRITO, S.M.; COUTINHO, H.D.; TALVANI, A.; et al. Analysis of bioactivities and chemical composition of Ziziphus joazeiro Mart. using HPLC-DAD. Food Chemistry. p 185-192, 2014.
CAMPOS, F.A.P.; XAVIER-FILHO, J.; SILVA, C.P.; ARY, M.B. Resolution and partial characterization of proteinases and ~-amylases from midguts of larvae of the bruchid beetle callosobruchus maculatus (f.) Comp Biochem. Physiol. v.92 p. 51–57, 1989.
CARNEIRO, F.F.; PIGNATI, W.; RIGOTTO, R.M.; AUGUSTO, L.G.S.; RIZZOLO, A.;
FARIA, N.M.X.; ALEXANDRE, V.P.; FRIEDRICH, K.; MELLO, M.S.C. Dossiê
ABRASCO – Um alerta sobre os impactos dos agrotóxicos na saúde. Parte 1 -
Agrotóxicos, Segurança Alimentar e Nutricional e Saúde. Rio de Janeiro: ABRASCO ,
2012.
CARNEIRO, F. F.; AUGUSTO, L. G. S.; RIGOTTO, R. M., FRIEDRICH, K.; BÚRIGO,
A. C. Dossiê ABRASCO: um alerta sobre os impactos dos agrotóxico na saúde /. - Rio
de Janeiro: EPSJV; São Paulo: Expressão Popular, 2015.
61
CARTAXO, S.L.; SOUSA, M.M.A.; ALBUQUERQUE, U.P. Medicinal plants with bioprospecting potential used in semi-arid northeastern Brazil. J Ethnopharmacol. v.13 p. 326–342, 2010.
CARLINI, C. R.; GROSSI-DE-SÁ, M.F. Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon. v. 40, p. 1515–1539, 2002.
CARVALHO, P. E. R. Espécies arbóreas brasileiras. Ed 1. Embrapa informações tecnológicas, 2007.
CHANNALE, S.M., BHIDE, A.J., YADAV, Y. et al. Characterization of two coleopteran α-amylases and molecular insights into their differential inhibition by synthetic α-amylase inhibitor, acarbose. Insect Biochemistry and Molecular Biology. v. 74. p. 1-11, 2016.
COSTA, A.S.; DIAS, A.B.; DELLAMANO, M.; et al. Digestive physiology and characterization of digestive cathepsin L-like proteinase from the sugarcane weevil Sphenophorus levi. J Insect Physiol. v. 57. p. 462-468, 2011.
CRUZ, A.C.B.; MASSENA, F.S.; MIGLIOLO, L. et al. Actividade bioinsecticida de um novo inibidor de tripsina de Kunitz de sementes de Catanduva (Piptadenia moniliformis). Fisiologia e Bioquímica de Plantas. v.70. p. 61-68, 2013.
CRUZ, L. P.; SÁ. L F. R. de; SANTOS, L. A.; et al. A. Evaluation of resistance in different cowpea cultivars to Callosobruchus maculatus infestation. Journal of Pest Science, v. 89, n. 1, p. 117-128, 2015.
DANG, L.; VAN DAMME E.J.M. Toxic proteins in plants. Phytochemistry. v. 117. p. 51-64, 2015.
DANTAS, F.C.P.; TAVARES M.L.R.; TARGINO, M.S.; et al. Ziziphus joazeiro Mart. - Rhamnaceae: características biogeoquímicas e importância no bioma Caatinga. Principia. v. 25. 2014.
DANTZGER, M.; VASCONCELOS, I.M.; SCORSATO, V. et al. Bowman-Birk proteinase inhibitor from Clitoria fairchildiana seeds: Isolation, biochemical properties and insecticidal potential, Phytochemistry. v. 118. p. 224-235, 2015.
62
DEVI, M. B. AND DEVI, N. V. Biology and morphometric measurement of cowpea weevil, Callosobruchus maculatus fabr. (Coleoptera: Chrysomelidae) in green gram. Journal of Entomology and Zoology Studies.v. 2. p.74-76, 2014.
DIAS, L.P., OLIVEIRA, J.T.A., ROCHA-BEZERRA, L.C.B. A trypsin inhibitor purified
from Cassia leiandra seeds has insecticidal activity against Aedes aegypti. Process
Biochemistry. v. 57. p. 228-238, 2017.
DIÓGENES, F. E. P. et al. Pré-tratamento com ácido sulfúrico na germinação de sementes de Ziziphus joazeiro Mart. - Rhamnaceae. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 12, n. 2, p. 188-194, 2010.
EE, K.Y.; ZHAO, J.; REHMAN, A.; AGBOOLA, S. Glycosylation, amino acid analysis and kinetic properties of a major Kunitz-type trypsin inhibitor from Acacia victoriae Bentham seeds. Food Chem. v. 129. p.1224-1227, 2010.
EL-LATIFF A.O.A. In vivo and in vitro inhibition of Spodoptera littoralis gut-serine protease by protease inhibitors isolated from maize and sorghum seeds. Pestic Biochem Physiol. v. 116.p .40-48, 2014.
FAN, S. & WU, G. Characteristics of plant proteinase inhibitors and their applications in combating phytophagous insects. Botanical Bulletin of Academia Sinica. v. 46. p. 273-292, 2005.
FRANCO, O.L. Review-Peptide promiscuity: An evolutionary concept for plant defense. Febs Journal. v. 585 p. 995–1000, 2011.
FÜRSTENBERG-HÄGG, J.; ZAGROBELNY, M.; BAK, S. Plant defense against insect herbivores. Int J Mol Sci. p.10242-10297, 2013.
GOMES, C.E.; BARBOSA, A.E.; MACEDO L.L.; et al. Effect of trypsin inhibitor from Crotalaria pallida seeds on Callosobruchus maculatus (cowpea weevil) and Ceratitis capitata (fruit fly). Plant Physiol Biochem. p. 1095-1102, 2005.
GUERRA, Y.; VALIENTE, P.A.; PONS, T.; BERRY, C. Structures of a bi-functional Kunitz-type STI family inhibitor of serine and aspartic proteases: Could the aspartic protease inhibition have evolved from a canonical serine protease-binding loop? Journal of Structural Biology. v. 195.p. 259-271, 2016.
63
GUO, F.; LEI, J.; SUN, Y.; et al. Antagonistic regulation, yet synergistic defense: effect of bergapten and protease inhibitor on development of cowpea bruchid Callosobruchus maculatus. Plos one. 2012.
GREEN, T.R.; RYAN, C.A. Wound-Induced Proteinase Inhibitor in Plant Leaves: A Possible Defense Mechanism against Insects. Science. v. 175.p. 776- 777, 1972.
HARRISON R.L.; BONNING B.C. Proteases as Insecticidal Agents. Toxins. p. 935-953, 2010.
INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER (BRASIL). Coordenação de Prevenção e Vigilância. Vigilância do cancer relacionado ao trabalho e ao ambiente. 2. ed. rev. atual. Rio de Janeiro: INCA, 2010. p. 14.
ISHIMOTO, M.; CHRISPEELS, M.J.; Protective mechanism of the Mexican bean weevil against high levels of alpha-amylase inhibitor in the common bean. Plant Physiol. p. 393-401, 1996.
ISLAM, M.B. A renaissance for botanical insecticides? Pest Manag Sci. v. 71. p.
1587-1590, 2015.
JABER, K.; HAUBRUGE, É.; FRANCIS, F. Development of entomotoxic molecules as
control agents: illustration of some protein potential uses and limits of lectins (Review).
Biotechnol Agron Soc Environ. v. 14. p. 225–241, 2010.
JACKAI, L.E.N. C.B. ADALLA. Pest management practices in cowpea. Pages 240agemein Advances in cowpea research, edited by B.B. Singh, D.R. Mohan Raj, K.E. Dashiell and L.E.N. Jackai. Copublication of International Institute of Tropical Agriculture (IITA) and Japan International Research for Agricultural Sciences (JIRCAS). IITA, Ibadan, Nigeria. 1997.
JONGSMAN, M.A.; BOLTER, C.J. The adaptation of insects to plant protease inhibitors. J. Insect Physiol. v. 43. p. 885-895, 1997.
KAFATOS, F.C.; TARTAKOFF, A. M.; LAW, J.H. Cocoonase I. Preliminary characterization of a proteolytic enzyme from silk moths. J. Biol. Chem. v. 242. p. 1477-1487, 1967.
64
KEDIA, A.; PRAKASH, B.; MISHRA, P.K.; et al. Botanicals as ecofriendly biorational alternatives of synthetic pesticides against Callosobruchus spp. (Coleoptera: Bruchidae)—a review. J Food Science Technology. v. 52. p.1239–1257, 2015.
KOSINI, D.; NUKENINE, E.N. Bioactivity of Novel Botanical Insecticide From Gnidia kaussiana (Thymeleaceae) Against Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae) in Stored Vigna subterranea (Fabaceae) Grains. J Insect Sci. 2017.
KOIWA K, SHADE RE, ZHU-SALZMAN K, et al. Phage display selection can differentiate insecticidal activity of soybean cystatins. Plant J. v. 14. p. 371-379, 1998.
KUNITZ, M. Crystalline soybean trypsin inhibitor. II. general properties. Journal of Genetic and Physiology. v. 30, p. 291-310, 1947. KUWAR, S.S.; PAUCHET, Y.; VOGEL, H.; HECKEL, D.G. Adaptive regulation of digestive serine proteases in the larval midgut of Helicoverpa armigera in response to a plant protease inhibitor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. v. 59.p. 18-29, 2015.
LI-BYARLAY, H.; PITTENDRIGH, B.R.; MURDOCK, L.L.; Plant Defense Inhibitors Affect the Structures of Midgut Cells in Drosophila melanogaster and Callosobruchus maculatus. Int J Insect Sci. p. 71-79, 2016.
LÜ, J.; SEHGAL, B;, SUBRAMANYAM, B. Insecticidal potential of a synthetic zeolite against the cowpea weevil, Callosobruchus maculatus (Fabricius) (Coleoptera: Bruchidae). Journal of Stored Products Research. v. 72. p. 28-34, 2017.
LUNA, J.S. Estudo de plantas bioativas. Tese de doutorado, UFPE, Recife, 2006.
MACEDO, M.L.R.; ANDRADE, L.B.S.; MORAES, R.A.; XAVIER-FILHO, J. Vicilin variants and the resistance of cowpea (Vigna unguiculata) seeds to the cowpea weevil (Callosobruchus maculatus), Comp. Biochem. Physiol. p.89–94, 1993.
MACEDO, M.L.R.; MELLO, G.C.; FREIRE, M.G.M.; et al. Effect of a trypsin inhibitor from Dimorphandra mollis seeds on the development of Callosobruchus maculatus. Plant Physiology and Biochemistry. v. 40. p. 891-898, 2002.
65
MACEDO, M.L.; DE OLIVEIRA, C.F.; COSTA, P.M. et al. Adaptive mechanisms of insect pests against plant protease inhibitors and future prospects related to crop protection: a review. Protein Pept Lett. v. 22. p. 149-163, 2015.
MAINALI, B.P., KIM, H.J., PARK, C.G., KIM, J., YOON, Y.N., OH, I.S., BAE, S.D.
Oviposition preference and development of azuki bean weevil, Callosobruchus
chinensis, on five different leguminous seeds. J. Stored Prod. v. 61.p. 97–101, 2015
MELO, M.O.; SILVA-FILHO, M.C. Plant-insect interactions: an evolutionary arms race between two distinct defense mechanisms. Braz. J. Plant Physiol. v.14. p.71-81, 2002.
MENDONÇA, M.G.; LIMA, L.R.M.; ALBUQUERQUE, M.G.; CARVALHO, M.M.C. QUERIOZ. Effects of latex from “Amapazeiro” Parahancornia amapa (Apocynaceae) on blowfly Chrysomya megacephala (Diptera: Calliphoridae) post-embryonic development. Vet. Parasitol. v.178 p. 379–382, 2011.
MOSHI, A.P.; MATOJU, I. The status of research on and application of biopesticides in Tanzania. Review. Crop Protection. v. 92. p. 18-28, 2017.
MOSOLOV, V.V.; VALUEVA, T.A. Proteinase inhibitors in plant biotechnology: a review. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia. v. 44. p. 261-269, 2008.
OLIVEIRA, A.E.A., FERNANDES, K.V.S., SOUZA, A.J., SANTOS, P.O. Influence of
the soybean seed coat upon seed infestation and development of Callosobruchus
maculatus larvae (in press). In:Soybean and Wheat Crops: Growth, Fertilization, and
Yield: Soybean crops: growth, fertilization and yield. Nova Science Publishers. p.
335–372, 2009.
OLIVEIRA, A.S.; MIGLIOLO, L.; AQUINO, R.O.; et al. Purification and characterization of a trypsin–papain inhibitor from Pithecelobium dumosum seeds and its in vitro effects towards digestive enzymes from insect pests. Plant Physiology and Biochemistry. v. 45.p. 858-865, 2007.
OSUNA-AMARILLAS, P.S.; CINCO-MOROYOQUI, F.J.; CÁRDENAS-LÓPEZ, J.L. et al. Biochemical and kinetic characterization of the digestive trypsin-like activity of the lesser grain borer Rhyzopertha dominica (F.) (Coleoptera: Bostrichidae). Journal of Stored Products Research. v. 51. p. 41-48, 2012.
66
OWOLABI, M.S.; PADILLA, C.E.; OGUNDAJO, A. L. et al. Insecticidal activity and chemical composition of the Morinda lucida essential oil against pulse beetle Callosobruchus maculatus. Scientific World Journal, 2014.
OYENIYI, E.A.; GBAYE, O.A.; HOLLOWAY, G.J. The influence of geographic origin and food type on the susceptibility of Callosobruchus maculatus (Fabricius) to Piper guineense (Schum and Thonn). Journal of Stored Products Research. v.63, p. 15-21, 2015.
PANDEY, P.K; JAMAL, F. Bio-potency of a 21 kDa Kunitz-type trypsin inhibitor from Tamarindus indica seeds on the developmental physiology of H. armigera. Pestic Biochem Physiol. v. 116. p. 94-102, 2014.
PONTUAL, E.V.; SANTOS, N. D. L.; MOURA, M. C.; COELHO, L. C. B. B. ; NAVARRO, D. M. A. F. ; NAPOLEÃO, T. H. ; PAIVA, P. M. G. . Trypsin inhibitor from Moringa oleifera flowers interferes with survival and development of Aedes aegypti larvae and kills bacteria inhabitant of larvae midgut. Parasitology Research, v. 113. p. 727-733, 2014.
POWERS, J.C.; ASGIAN, J.L.; EKICI, O.D.; JAMES K.E. Irreversible inhibitors of serine, cysteine, and threonine proteases. Chem Rev. p.4.639-4.750, 2002.
ROCHA, M. M.; SILVA, K. J. D.; MENEZES JUNIOR, J. A. Cultivo de Feijão-Caupi
Sistema de produções embrapa. Versão Eletrônica. 2ª edição, 2017.
RYAN, C.A. Protease inhibitors in plant: Genes for improving defenses against insects and pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. v. 28. p. 425-449, 1990.
RUFINO, F.P.S.; PEDROSO, V.M.A.; ARAUJO, J.N. et al. Inhibitory effects of a Kunitz-type inhibitor from Pithecellobium dumosum (Benth) seeds against insect-pests' digestive proteinases. Plant Physiol. Biochem. v.63. p. 70-76, 2013.
SÁ, L.F.; WERMELINGER, T.T.; RIBEIRO EDA, S.; et al. Effects of Phaseolus vulgaris (Fabaceae) seed coat on the embryonic and larval development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae). J Insect Physiol. p 50-57, 2014.
SHAMSI, T.N.; PARVEEN, R.; FATIMA, S. Characterization, biomedical and agricultural applications of protease inhibitors: A review. Int J Biol Macromol. v.91. p.1120-1233, 2016.
67
SANTOS E. A. et al. Affinity Chromatography as a Key Tool to Purify Protein Protease Inhibitors from Plants. (2012). Affinity Chromatography. Disponível em: <https://www.intechopen.com/books/affinity-chromatography/affinity-chromatography-as-a-key-tool-to-purify-protease-inhibitors-from-plants> Acesso em: 25 de abril de 2017.
SHADE, R.E., SCHROEDER, H.E.; PUEYO, J.J. et al. Transgenic peas expressing the a-amylase inhibitor of the common bean are resistant to bruchid beetles. Bio/Technology. v. 12. p. 793-796, 1994.
SIKLOS, M.; BENAISSA, M.; THATCHER, G.RJ. Cysteine proteases as therapeutic targets: does selectivity matter? A systematic review of calpain and cathepsin inhibitors. Acta Pharmaceutica Sinica. v. 5. p. 566-519, 2015.
SILVA, T.C.L; ALMEIDA, C.C.B.R.; VERAS FILHO, J. et al. Atividades antioxidante e antimicrobiana de Ziziphus joazeiro mart. (Rhamnaceae): avaliação comparativa entre cascas e folhas. Rev Ciênc Farm Básica. v.32. p.193-199, 2011.
SOUZA , A.J; A.TS FERREIRA,A.TS.; PERALES J.; Identification of Albizia lebbeck seed coat chitin-binding vicilins (7S globulins) with high toxicity to the larvae of the bruchid Callosobruchus maculatus. Braz J Med Biol Res. p. 118–124, 2012.
SOUZA, A.J., SANTOS, P.O., PINTO, M.S.T.; et al. Natural seed coats provide protection against penetration by Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae) larvae. Crop Protection, v. 30, p. 651-657 ,2011.
SWATHI, M.; MISHRA, P.K.; LOKYA, V.; et al. Purification and Partial Characterization of Trypsin-Specific Proteinase Inhibitors from Pigeonpea Wild Relative Cajanus platycarpus L. (Fabaceae) Active against Gut Proteases of Lepidopteran Pest Helicoverpa armigera. Front Physiol. 2016.
SUMIKAWA, J.T.; BRITO, M.V.; MACEDO, M.L.R.; et al. The defensive functions of plant inhibitors are not restricted to insect enzyme inhibition. Phytochemistry. v. 71. p. 214-220, 2010.
TIROESELE, B.; THOMAS, K.; SEKETEME, S. Control of Cowpea Weevil, Callosobruchus Maculatus (F.) (Coleoptera: Bruchidae), Using Natural Plant Products. Insects. v.6 p. 77-84, 2014.
68
VALUEVA, T.A.; MOSOLOV, V.V. Role of inhibitors of proteolytic enzymes in plant defense against phytopathogenic microorganisms. Biochemistry (Mosc). v. 69. p. 1305-1309, 2004
VEIGA, M.M. Pesticides: economic efficiency and social and environmental injustice. Ciência & Saúde Coletiva, v.12 p.145-152, 2007.
VIEIRA, P.D.B.; SILVA, N.L.F.; DA SILVA, G.N.S.; et al. Caatinga plants: Natural and semi-synthetic compounds potentially active against Trichomonas vaginalis. Bioorg Med Chem Lett. v.26. p. 2229–2236, 2016.
VILA NOVA, M.X.; LEITE, N.G.A.; HOULLOU, L.M.; et al. Genetic variability and resistance of cultivars of cowpea [Vigna unguiculata (L.) Walp] to cowpea weevil (Callosobruchus maculatus Fabr.). Genet. Mol. Res. v.13 p. 2323 – 2332, 2014.
WAR, A. R.; PAULRAJ M. G.; AHMAD T.; et al. Mechanisms of plant defense against insect herbivores. Plant Signal Behav. P.1306-1320,2012.
WANG, X. Structure, mechanism and engineering of plant natural product glycosyltransferases. Febs jornal. v. 583 p. 3303–3309, 2009.
WESTFALL, R.J.; HAUGE, S.M.; The nutritive quality and the trypsin inhibitor content of soybean flour heated at various temperatures. J Nutr. v. 35. p. 379-389, 1948.
WIELKOPOLAN, B.; STE˛PLOWSKA, A.O. Three-way interaction among plants, bacteria, and coleopteran insects. Planta. p.313–332, 2016.
ZHU-SALZMAN, K.; KOIWA, H.; SALZMAN, R. A.; et al. Cowpea bruchid Callosobruchus maculatus uses a three-component strategy to overcome a plant defensive cysteine protease inhibitor. Insect Molecular Biology. p. 135-145, 2003. ZHU-SALZMAN K, ZENG R. Insect response to plant defensive protease inhibitors. Annu Rev Entomol. v.60. p. 233-252, 2015.