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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
ÍZOLA MORAIS DE MEDEIROS RAMALHO
MICROEMULSÃO CONTENDO CRISINA COM POTENCIAL AÇÃO
ANTINOCICEPTIVA
NATAL-RN
2018
1
ÍZOLA MORAIS DE MEDEIROS RAMALHO
MICROEMULSÃO CONTENDO CRISINA COM POTENCIAL AÇÃO
ANTINOCICEPTIVA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, como
requisito à obtenção do título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: PROF. DR. ÁDLEY ANTONINI N. LIMA
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. BOLÍVAR P. GOULART DE L. DAMASCENO
NATAL-RN
2018
Ramalho, Ízola Morais de Medeiros. Microemulsão contendo Crisina com potencial açãoantinociceptiva / Ízola Morais de Medeiros Ramalho. - 2018. 115f.: il.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro deCiências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em CiênciasFarmacêuticas. Natal, RN, 2018. Orientador: Ádley Antonini N. Lima. Coorientador: Bolívar P. Goulart de L. Damasceno.
1. Favanóides - Dissertação. 2. Crisina - Dissertação. 3.Microemulsões - Dissertação. 4. Cinética de liberação in vitro -Dissertação. I. Lima, Ádley Antonini N. II. Damasceno, BolívarP. Goulart de L. III. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 547.972
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
3
Dedico esse trabalho aquela que é a minha maior
incentivadora, pois “todas as vezes minha mãe que
alguém me disse não, você disse sim para o meu
coração”.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus, “Tudo é do Pai, toda hora e toda glória, é Dele a vitória alcançada em minha vida.
” Muito obrigada por ser minha fortaleza, por aumentar minha fé, por me reerguer a cada
tropeço. “E assim eu compreendi, se de Ti eu fugir, noventa e nove ou mais, deixarás para
trás, e irás me buscar. ” Pois eu sou Tua, e Tu és meu.
A minha mãe, Risomar, obrigada por dá sentido à minha existência, obrigada por cada dia
da sua existência que você dedicou e dedica a mim, por acreditar mais em mim do que eu
mesma, por jamais hesitar em me incentivar, e ao mesmo tempo me ensinar a andar
sozinha. Todos os passos da minha vida serão sempre marcados pelo maior exemplo que
tenho de perseverança, força e alegria. A senhora, que tem os mais verdadeiros risos, e é
mais forte que as maiores ondas do mar.
Ao meu pai, Anchieta, por todo carinho dedicado, por cada canção, por cada assobio que
mostrou a direção e me ensinou a importância da obediência, respeito e atenção.
Ao meu irmão, Anchieta Junior, por me ensinar todos os dias que o amor tudo sofre, tudo
espera, tudo suporta. Obrigada por me ensinar a amar.
A minha família, meus irmãos, avós, tios, tias, primos, sobrinhos, padrinhos por
representarem a certeza do amor de Deus na minha vida, pois cada um de vocês foi
escolhido por Ele para estar ao meu lado e eu sou grata pela vida de cada um e por serem o
alicerce da minha vida.
Aos meus amigos, os quais sabem que o são, pelo conforto que me proporcionam ao saber
que tenho o amor incondicional de cada um de vocês, por serem meu “sim”, por serem
meu “na alegria e na tristeza, na saúde e na doença”, até que a morte nos eternize no
coração um do outro.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Ádley Lima, por me receber no seu grupo de pesquisa, por
acreditar no meu potencial e confiar no meu trabalho. Pelos ensinamentos, dedicação e
compromisso com o nosso trabalho, meu muito obrigada.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Bolívar Damasceno, por aceitar fazer parte desse trabalho,
pelos ensinamentos, dedicação e compromisso com minha formação profissional desde a
graduação.
Aos professores Lucindo Quintans e Jullyana Quintans, pela sua imensa ajuda para que eu
pudesse realizar os experimentos de atividade in vivo. Obrigada pela gentileza,
disponibilidade e receptibilidade em seus laboratórios.
5
Aos professores Elissa Ostrosky e Márcio Ferrari, pela recepção nos seus laboratórios, e
pela disponibilidade em contribuir na realização dos testes de liberação.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela
dedicação em compartilhar e fazer crescer os conhecimentos.
A CAPES, pela bolsa de estudos.
6
RESUMO
A Crisina (5,7-Dihidroxiflavona) pertence à classe flavona de flavonoides. É encontrada
naturalmente em mel, própolis, e várias espécies de plantas, incluindo espécies do gênero
Pelargonium, Passiflora e da família Pinaceae. A Crisina (CS) é atualmente
comercializada como suplemento dietético e, como outros flavonoides, também exibe
diversos efeitos farmacológicos, dentre os quais estão a atividade antinociceptiva e anti-
inflamatória. Entretanto, sua eficácia tem sido limitada devido à sua baixa
biodisponibilidade oral. As microemulsões (ME) são sistemas de liberação modificada
definidos como sistemas termodinamicamente estáveis e isotropicamente translúcidos de
dois líquidos imiscíveis, usualmente água e óleo, estabilizados por um filme interfacial de
tensoativo, e quando necessário um cotensoativo. Estes sistemas possuem a capacidade de
solubilizar compostos hidrofóbicos, melhorar absorção, biodisponibilidade e estabilidade,
incrementar a eficácia e reduzir a toxicidade de fármacos incorporados. O objetivo deste
trabalho foi a obtenção, caracterização de um sistema microemulsionado para incorporação
da CS e avaliação da atividade antinociceptiva desse. A formulação obtida através de um
diagrama de fase ternário foi caracterizada físico-quimicamente quanto ao pH,
condutividade e índice de refração. Suas características estruturais e morfológicas foram
analisadas através de espalhamento de luz dinâmica (DLS) e microscopia de luz polarizada
(MLP). Enquanto, a estabilidade da formulação foi avaliada através dos estudos de estresse
por centrifugação, aquecimento-resfriamento e congelamento-descongelamento. O perfil
de liberação in vitro foi determinado utilizando o modelo de células de Franz. A avaliação
analgésica foi realizada através de um teste comportamental que avalia o aumento do
limiar de força sobre a pata dos camundongos para analisar o reflexo de retirada através de
um analgesímetro. Além da determinação da capacidade de prevenção da formação de
citocinas inflamatórias avaliadas através de ELISA imunoensaio. Para isso foi
administrada 30 minutos após a indução por carragenina a dose de 25mg/kg de CS e
MECS. A ME desenvolvida é constituída por 5 % de miristato de isopropila, 55 % de água
e 40 % de LAS®, e apresentou pH compatível com a administração via oral, condutividade
condizente com sistemas óleo em água, além de comportamento isotrópico. A distribuição
de tamanho de gotículas foi do tipo monomodal e homogêneo, com tamanhos médios de
gotículas de 170,7 ± 5,3 e 158,9 ± 26,7 nm, e potencial zeta negativo de -16,1 ± 1,9 e -10 ±
2,1, para formulações com e sem CS, respectivamente. A ME mostrou-se estável frente aos
estresses térmicos e por centrifugação. A liberação in vitro da MECS obedeceu ao modelo
cinético de ordem zero e preveniu a formação de citocinas inflamatórias (redução de TNF
α e aumento de IL-10, p<0,01), além de apresentar atividade antinociceptiva no modelo de
hiperalgesia induzida por carragenina (p<0,001). Portanto, pôde-se concluir que a
veiculação da CS através de um sistema microemulsionado mostrou-se como uma
alternativa interessante para expandir o uso desse flavonoide como um fármaco no
tratamento da dor inflamatória.
Palavras-chaves: Flavonóides, crisina, microemulsões, cinética de liberação in vitro,
atividade antinociceptiva in vivo.
7
ABSTRACT
Chrysin (5,7-Dihydroxyflavone) belongs to the flavone class of flavonoids. It is found
naturally in honey, propolis and various plant species, including species of the gender
Pelargonium, Passiflora and the family Pinaceae. Chrysin (CS) is currently marketed as a
dietary supplement and, like other flavonoids, also exhibits several pharmacological
effects, among which are antinociceptive and anti-inflammatory activity. However, its
efficacy has been limited because of its low oral bioavailability. Microemulsions (ME) are
modified release systems defined as thermodynamically stable and isotropic translucent
systems of two immiscible liquids, usually water and oil, stabilized by an interfacial
surfactant film, and often a co-surfactant. ME systems have the ability to solubilize
hydrophobic compounds, enhance absorption, bioavailability and stability, enhance
efficacy, and reduce the toxicity of incorporated drugs. The aim of this work was the
development, characterization and evaluation of the antinociceptive activity of a ME
system containing CS. The formulation obtained through a ternary phase diagram was
physic-chemically characterized for pH, conductivity and refractive index. Its structural
and morphological characteristics were analyzed through dynamic light scattering (DLS)
and polarized light microscopy (MLP). Meanwhile, the stability of the formulation was
evaluated through centrifugal stress, heating-cooling and freeze-thaw studies. The in vitro
release profile was determined using the Franz cell model. The analgesic evaluation was
performed through a behavioral test that evaluates the increase of the force threshold on the
paw of the mice to analyze the withdrawal reflex through an analgesimeter. In addition, it
was determined the ability to prevent the formation of inflammatory cytokines evaluated
by ELISA immunoassay. A dose of 25 mg/kg of CS and MECS was administered 30
minutes after carrageenan-induced inflammation. The developed ME consists of 5%
isopropyl myristate, 55% water and 40% LAS®, and presented pH compatible with oral
administration, conductivity consistent with oil-in-water systems, as well as isotropic
behavior. The droplet size distribution was of the monomodal and homogeneous type, with
mean droplet sizes of 170.7 ± 5.3 and 158.9 ± 26.7 nm, and negative zeta potential of -16.1
± 1.9 and -10 ± 2.1, for formulations with and without CS, respectively. ME was stable
during the thermal stresses and centrifugation. The in vitro release of MECS followed the
zero order kinetic model and prevented the formation of inflammatory cytokines (reduction
of TNFα and increase of IL-10, p<0.01), as well as antinociceptive activity in carrageenan-
induced inflammation model (p<0.001). Therefore, CS delivery through a microemulsion
system proved to be an interesting alternative to expand the use of this flavonoid as a drug
in the treatment of inflammatory pain.
Keywords: Flavonoids, chrysin, microemulsions, release kinetics in vitro, antinociceptive
activity in vivo.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fórmula estrutural plana da Crisina .................................................................... 17
Figura 2 - Tipos de ME: fase oleosa (cinza), fase aquosa (branca) ..................................... 19
Figura 3 - Analgesímetro digital (a) e caixa de acondicionamento do Von Frey (b) .......... 32
Figura 4 - Miristato de isopropila (C17H34O2) ..................................................................... 34
Figura 5 - LAS® ................................................................................................................... 35
Figura 6 - Diagrama de fases pseudoternário para o sistema LAS®, miristato de isopropila e
água ...................................................................................................................................... 36
Figura 7 - Aspecto visual das formulações .......................................................................... 37
Figura 8 - Varredura espectrofotométrica da solução de Crisina (16 µg/ml) na faixa de
comprimento de onda de 200 a 350 nm ............................................................................... 43
Figura 9 - Varredura espectrofotométrica da ME na faixa de comprimento de onda de 200
a 350 nm .............................................................................................................................. 44
Figura 10 - Curva analítica obtida a partir de soluções de Crisina nas concentrações de 1 a
8 µg/ml para determinação do parâmetro linearidade ......................................................... 45
Figura 11 - Perfil de liberação da crisina (µg/cm2) em função do tempo (h) a partir da
MECS .................................................................................................................................. 52
Figura 12 - Perfil dos modelos cinéticos testados para a MECS em tampão fosfato pH 7,4.53
Figura 13 - Efeito da crisina isolada e em microemulsão na indução de hiperalgesia
mecânica por carragenina .................................................................................................... 56
Figura 14 - Efeito do tratamento com crisina isolada e em microemulsão na produção de
citocinas inflamatórias TNF α (A) e IL-10 (B) ................................................................... 57
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição percentual (p/p) da formulação selecionada ................................. 36
Tabela 2 - Análise das gotículas das formulações ............................................................... 41
Tabela 3 - Determinação do parâmetro precisão repetibilidade e precisão intercorrida (n=6)
para validação do método espectrofotométrico ................................................................... 46
Tabela 4 - Determinação do parâmetro exatidão (n=3) para validação do método
espectrofotométrico ............................................................................................................ 47
Tabela 5 - Determinação do parâmetro robustez (n=3) para validação do método
espectrofotométrico ............................................................................................................. 48
Tabela 6 - Determinação do doseamento (n=3) da crisina no sistema microemulsionado . 48
Tabela 7 - Determinação da eficiência de encapsulação (n=3) da crisina no sistema
microemulsionado ............................................................................................................... 49
Tabela 8 - Quantidades cumulativas liberadas (µg/cm2) e percentual de liberação (%) da
crisina em cada tempo no compartimento doador (n=3) ..................................................... 51
Tabela 9 - Determinação da ordem de liberação da crisina do sistema microemulsionado
utilizando-se como parâmetro o coeficiente de correlação (r) ............................................ 53
10
LISTA DE ABREVIATURAS
A/O Água em óleo
AINES Anti-inflamatórios não esteroidáis
ANOVA Análise de variância de uma única via
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CS Crisina
DFT Diagrama de fases ternário
DLS Espalhamento dinâmico de luz
DP Desvio padrão
EE Eficiência de encapsulação
EHL Equilíbrio hidrófilo-lipófílo
IL 10 Interleucina-10
IPD Índice de polidispersão
IR Índice de refração
ME Microemulsão
MEB Microemulsão branca
MECS Microemulsão de crisina
MLP Microscopia de luz polarizada
NSL Novos sistemas de liberação
O/A óleo em água
pH Potencial hidrogeniônico
TNF-α Fator de necrose tumoral
UV-Vis Ultravioleta visível
11
SUMÁRIO
1. INDROTUÇÃO ............................................................................................................. 13
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ................................................................................ 16
2.1 FLAVONÓIDES ........................................................................................................ 16
2.2 CRISINA .................................................................................................................... 16
2.3 MICROEMULSÕES ................................................................................................. 18
2.4 MECANISMO DA DOR INFLAMATÓRIA ........................................................... 20
3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 23
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..................................................................................... 23
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 24
4.1 MATERIAIS .............................................................................................................. 24
4.2 MÉTODOS ................................................................................................................ 24
4.2.1 Obtenção do diagrama de fase pseudoternário (DFT) ........................................ 24
4.2.2 Seleção da formulação e incorporação da crisina ............................................... 25
4.2.3 Avaliação macroscópica ..................................................................................... 25
4.2.4 Isotropia .............................................................................................................. 25
4.2.5 Estudos de estabilidade ....................................................................................... 26
4.2.6 Caracterização físico-química ............................................................................. 26
4.2.7 Desenvolvimento da metodologia analítica espectrofotométrica para doseamento
da Crisina na Microemulsão ........................................................................................ 27
4.2.8 Doseamento da Crisina na microemulsão ........................................................... 29
4.2.9 Eficiência de encapsulação ................................................................................. 29
4.2.10 Estudos de Liberação in vitro da crisina ........................................................... 30
4.2.11 Atividade antinociceptiva da MECS utilizando o modelo de indução de
inflamação e hiperalgesia por carragenina ................................................................... 31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 34
5.1 OBTENÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES TERNÁRIO (DFT) ............................ 34
5.2 SELEÇÃO DA FORMULAÇÃO E INCORPORAÇÃO DA CRISINA .................. 36
5.3 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA ........................................................................... 37
5.4 ISOTROPIA ............................................................................................................... 38
5.5 ESTUDOS DE ESTABILIDADE ............................................................................. 38
12
5.6 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA ............................................................... 39
5.6.1 Determinação do pH ........................................................................................... 39
5.6.2 Condutividade elétrica ........................................................................................ 39
5.6.3 Índice de refração ................................................................................................ 39
5.6.4 Tensão superficial ............................................................................................... 40
5.6.5 Tamanho de gotícula e potencial Zeta ................................................................ 41
5.7 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA ANALÍTICA
ESPECTROFOTOMÉTRICA PARA DOSEAMENTO DA CRISINA NA ME ........... 42
5.8 DOSEAMENTO DA CRISINA NA ME .................................................................. 48
5.9 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO ...................................................................... 49
5.10 LIBERAÇÃO IN VITRO DA CS DO SISTMA MICROEMULSIONADO .......... 50
5.11 ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DA MECS UTILIZANDO O MODELO
MECÂNICO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR INFLAMAÇÃO ....................... 55
6. CONCLUSÕES .............................................................................................................. 59
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 61
ANEXO A ........................................................................................................................... 71
ANEXO B ........................................................................................................................... 94
13
1. INTRODUÇÃO
Os flavonoides pertencem a um grupo de substâncias com grupos fenólicos
variáveis encontradas em diferentes plantas e produtos como frutas, vegetais, grãos e
flores. Na última década testemunhou-se um notável renascimento do interesse nesta área,
marcada por um crescimento da pesquisa envolvendo flavonoides bioativos. O grande
potencial terapêutico e a baixa toxicidade sistêmica destes compostos os tornam uma
alternativa viável aos medicamentos convencionais (CHAKRABORTY et al., 2010).
A Crisina (5,7-Dihidroxiflavona) pertence à classe flavona de flavonoides. É
encontrada naturalmente em mel, própolis, e várias espécies de plantas, incluindo espécies
do gênero Pelargonium, Passiflora e da família Pinaceae (MEDIC-SARIC, 2011;
PICHICHERO et al., 2010). A principal fonte natural de crisina é a planta Passiflora
coerulea da qual foi isolada em 1990 por Medina e colaboradores e apresentada como um
composto com propriedades anticonvulsivantes (MEDINA et al., 1990).
Embora, o efeito da crisina já tenha sido explorado em uma vasta gama de
atividades biológicas (anti-inflamatória, antinociceptiva, anticonvulsivante, antioxidante,
antineoplasica, anti-hipertensiva, etc.), estudos avaliando a atividade antinociceptiva e anti-
inflamatória deste composto ainda são consideravelmente escassos e a sua eficácia tem
sido limitada devido a sua baixa solubilidade aquosa e biodisponibilidade oral (BILIA et
al., 2014; CHAKRABORTY et al., 2010; VEDAGIRI e THANGARAJAN, 2016; ZHU et
al., 2016).
A inflamação refere-se a uma cascata de eventos iniciados e controlados
especificamente por mediadores químicos endógenos. Estas alterações produzem as
manifestações clínicas clássicas da inflamação como o calor, rubor, edema, dor e a perda
da função (YAGIELA et al., 2011). A dor é um sintoma geral e caracteriza inúmeras
doenças. Os fármacos atualmente utilizados para o tratamento da dor e inflamação tem
segurança e efetividade limitadas. Por exemplo, o uso de anti-inflamatórios não esteroidáis
(AINES) podem causar efeitos adversos que incluem falência renal e hepática e/ou lesões
gastrointestinais. Outras drogas analgésicas disponíveis, como os opóides, não conseguem
prevenir facilmente a dor em situações dolorosas como dor neuropática (FARKHONDEH
et al., 2015).
Neste contexto, a capacidade de inibir os estímulos pró-inflamatórios exibida por
flavonoides como a crisina pode ser muito útil no tratamento de inúmeras doenças
14
inflamatórias crônicas e agudas. Por esta razão o estudo de novos flavonoides com
potencial anti-inflamatório e/ou analgésico, veiculadas em novas formas farmacêuticas,
tem atraído a atenção de pesquisadores (RAUF et al., 2015).
Apesar dos benefícios que a crisina apresenta, seu uso terapêutico ainda depende da
melhoria de seu perfil farmacocinético após administração oral. A crisina apresenta uma
solubilidade aquosa limitada, baixa biodisponibilidade e pode ser facilmente modificada
por fatores ambientais como temperatura, pH e luminosidade (BILIA et al., 2014; WALLE
et al., 2001; ZHU et al., 2016). Desta maneira, há a necessidade de desenvolver um sistema
de liberação que veicule a molécula terapeuticamente ativa para o local de ação.
A via oral é considerada uma das vias mais atrativas e preferível para
administração de fármacos, uma vez que possui vantagens, tais como, controle total e fácil
da administração de fármaco pelo paciente além da possibilidade de flexibilidade nas doses
administradas. Entretanto, nesta via, o epitélio gastrointestinal impermeável comporta-se
como uma barreira física enquanto a degradação enzimática induzida pela peptidase atua
como uma barreira bioquímica para a absorção de fármacos resultando em uma baixa
biodisponibilidade e eficácia limitada de formulações administradas oralmente. Além
disso, os fármacos podem apresentar dificuldade em ser absorvidos para a circulação
sistêmica devido à problemas como, grande tamanho molecular, carga e solubilidade
(YANEZ et al., 2011; LAM; GAMBARI, 2014).
Desta forma, o desenvolvimento de novos sistemas de liberação (NSL) visando a
veiculação de moléculas com potencial farmacológico existente é um processo que
continua crescendo na pesquisa farmacêutica devido as diversas vantagens destes sistemas
como: proteção do fármaco contra possíveis instabilidades no organismo, redução da
toxicidade como consequência da vetorização de fármacos à alvos específicos e menor
exposição aos tecidos saudáveis, liberação controlada de fármacos, possibilidade de
incorporação de moléculas hidrofílicas e lipofílicas, diminuição da dose e número de
administrações e por fim, maior adesão do paciente à terapia (KOO; RUBINSTEIN;
ONYUKSEL, 2005; PIMENTEL et al., 2007).
Dentre os NSL, as microemulsões (ME) têm se destacado como um sistema
carreador de fármacos com grande potencial de aplicabilidade na área farmacêutica, pois
estas são capazes de melhorar a eficácia através de propriedades como o aumento na
solubilidade e proteção dos fármacos, tamanho nanométrico das gotículas, baixa tensão
interfacial, grande área de interface, melhora do perfil de dissolução, liberação controlada
15
de fármacos e aumento da biodisponibilidade (TENJARLA, 1999; SILVA et al., 2009;
HARRAR et al., 2011; CAVALCANTI et al., 2016) as quais são propriedades que
conferem condições às ME de incorporar moléculas insolúveis que dificilmente seriam
incorporadas em formulações convencionais, como a crisina.
Tendo em vista tais considerações, esse projeto se propõe a incorporar a crisina em
uma ME para obtenção de uma formulação que permita a veiculação adequada desta
visando explorar o seu potencial anti-inflamatório e antinociceptivo através da
administração oral.
16
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 FLAVONOIDES
Os polifenóis são compostos orgânicos sintetizados por plantas, incluindo taninos,
lignanas e flavonoides (MANN et al., 2007). Os flavonoides representam um dos grupos
fenólicos mais importantes e diversificados entre os produtos de origem natural. Essa
classe de compostos é amplamente distribuída no reino vegetal, sendo encontradas
principalmente em abundância em angiospermas, apresentando enorme diversidade
estrutural (SIMÔES et al., 2003).
Os flavonoides podem ser encontrados em diversas formas estruturais, sendo que
a maioria possui 15 átomos de carbono em seu núcleo fundamental, constituído de duas
fenilas ligadas por uma cadeia de três carbonos entre elas. Baseado na substituição em
diferentes posições e no status da oxidação do anel C os flavonoides podem ser
classificados em diversas subclasses, incluindo as flavonas, os flavonóis, as flavononas, os
flavanóis, as isoflavonas e os chalconas (SIMÔES et al., 2003).
Os flavonoides em geral são absorvidos como agliconas após a hidrólise dos
glicosídeos por todo o trato gastrointestinal, sendo esse mecanismo de absorção
gastrointestinal de flavonoides complexo, culminando com a pouca absorção destes em sua
forma natural no intestino (WALLE, 2004). A margem de segurança para o uso terapêutico
de flavonoides em humanos é muito grande e provavelmente não superada por nenhuma
outra droga de uso corrente (HAVSTEEN, 2002).
Quanto ao seu potencial terapêutico, flavonoides têm se mostrado
farmacologicamente ativos frente a diversas doenças como doenças mediadas por radicais
livres, aterosclerose, isquemia, câncer, alergias, inflamação, problemas cardíacos, AIDS,
etc (CHAKRABORTY et al., 2010). Muitos destes já estão sendo utilizados em
preparações farmacêuticas, cosméticas e alimentícias (CHEBIL et al., 2007).
2.2 CRISINA
A Crisina (5,7-Dihidroxiflavona, Figura 1) é um flavonoide pertencente à classe
flavonas, naturalmente encontrada em mel, própolis, e várias espécies de plantas,
principalmente nas espécies do gênero Pelargonium, Passiflora e da família Pinaceae.
Possui hidroxila livre nos carbonos 5 e 7 do anel A que desempenham uma função
17
significativa nas atividades farmacológicas e são responsáveis pela rápida metabolização
desse composto (PICHICHERO et al., 2010; MEDIC-SARIC, 2011).
Figura 1 - Fórmula estrutural plana da Crisina.
Fonte: ZHAI et al., 2008.
Inúmeras atividades farmacológicas vêm sendo atribuídas à crisina dentre as quais
pode-se citar o potencial anti-inflamatório (BAE et al., 2011), antinociceptivo
(FARKHONDEH et al., 2015; ZHAI et al., 2008; RAUF et al., 2015) anticonvulsivantes
(MEDINA et al., 1990), antioxidante (PUSHPAVALLI et al., 2010), anti-hipertensivo
(VILLAR et al., 2002), antineoplásico (PICHICHERO et al., 2011) e anti-hiperlipidêmico
(ZARZECKI et al., 2014). Também há relatos que sugerem que a crisina aumenta os níveis
de testosterona pela inibição da enzima aromatase (KAO et al., 1998), que converte a
testosterona em estradiol, e em decorrência disso, a crisina já está disponível no mercado
como um suplemento dietético (500 mg por cápsula) (iHerbInc., Monrovia, Califórnia;
VitaDigest, Walnut, Califórnia).
Como outros flavonoides, a crisina apresenta baixa biodisponibilidade oral e sofre
metabolismo e efluxo dos metabolitos de volta ao intestino para hidrolise e eliminação
fecal. Apenas 1 a 7 % da crisina administrada via oral é absorvida, devido a sulfatação e
glucorinidação, além da indução da enzima UGT1A1 das células intestinais. Seus dois
metabolitos, glucoronido e sulfonato de crisina tem eliminação dependente da bomba de
efluxo proteína resistente a múltiplos fármacos 2 (MRP2) (WALLE et al., 2001; WALLE,
T., 2004). Estudos demonstraram que o acumulo da crisina em peixes após 8 horas de
exposição se dá, em ordem decrescente, em maiores concentrações em fígado, intestino,
pele e cérebro. Sendo esta predominantemente excretada na bile após glucuronidação,
possivelmente nos carbonos 5 e 7 do anel A (TSUJI et al, 2006). Pesquisadores
monitoraram os níveis de crisina e dos metabólitos crisina sulfatada e crisina glucuronada
em sangue, urina e fezes de humanos saudáveis durante 48h após a administração de 400
mg de crisina via oral e seus resultados mostraram que houve uma taxa de eliminação de
18
crisina e metabólitos de cerca de até 98% da crisina administrada, com valores que
variaram entre 40 e 390 mg. Sendo também a forma glucuronada a forma predominante de
eliminação (WALLE et al., 2001).
Desta forma, sua baixa biodisponibilidade e susceptibilidade ao metabolismo de
primeira passagem são fatores limitantes ao uso do potencial terapêutico deste flavonoide.
Os quais podem ser superados através de pesquisa na área de tecnologia farmacêutica que
permitam o desenvolvimento de uma formulação capaz de imergir esse flavonoide bioativo
ao mercado farmacêutico.
2.3 MICROEMULSÕES
Hoar e Schulman (1943) foram os primeiros a introduzir o termo ME, como
definição de um sistema fluido e semitransparente obtido pela titulação até o ponto de
clarificação de uma emulsão simples com um álcool de cadeia média como o hexanol ou o
pentanol. No ponto de clarificação não foi necessária agitação e uma dispersão
transparente foi formada espontaneamente com tamanho das gotículas variando de 100 a
600 nm, significativamente menores que os da emulsão simples inicial, justificando seu
aspecto transparente e o termo ME. Estes pesquisadores observaram, através de
microscopia eletrônica, que as dispersões transparentes formadas eram constituídas de
microgotículas de óleo em água (O/A) ou água em óleo (A/O), cercadas por um filme
interfacial misto de tensoativo e cotensoativo (álcool).
Este termo foi revisado muitas vezes e a definição atualmente mais aceita
descreve as ME como sistemas coloidais formados por uma fase aquosa e uma fase oleosa
estabilizadas por um tensoativo e por um cotensoativo, quando necessário, que reduzem a
tensão interfacial entre os dois líquidos imiscíveis, sendo consideradas
termodinamicamente estáveis, transparentes e isotrópicas (DJEKIC et al., 2012; FANUN,
2012; ZHAO; 2014).
Uma amostra isotrópica sob um plano de luz polarizada possui as mesmas
propriedades ópticas em todas as direções, e, portanto, o raio de luz que parte do
polarizador atravessa o sistema sem modificar sua direção de vibração não sofrendo o
fenômeno da dupla refração, conhecido como birrefringência. Este material é caracterizado
pela presença de um campo escuro quando visto sob microscópio de luz polarizada
(CHORILLI et al., 2011). Enquanto que uma amostra anisotrópica possui propriedades
ópticas capazes de desviar o plano de luz incidente, fazendo com que o raio polarizado
19
sofra birrefringência, e produza raios de luzes distintos que vibram em planos
perpendiculares entre si, fazendo com que sejam apresentados diferentes índices de
refração dependentes da direção da propagação da luz através do sistema e da orientação
do eixo de vibração (CHORILLI et al., 2011).
Os tensoativos utilizados para obtenção de ME estão disponíveis em grande
número, mas o seu uso na formação de ME para aplicação farmacêutica é limitado devido
à sua toxicidade, irritação potencial e mecanismo de ação. A escolha adequada e as
concentrações destes componentes que foram as ME são, assim, muito importantes tendo
em vista a aplicação do sistema (FORMARIZ et al., 2005). Os óleos e os tensoativos
utilizados na formação de ME biocompatíveis devem ser biocompatíveis, não-tóxicos e
clinicamente aceitáveis (LAKSHMI et al., 2013; MEHTA et al., 2015).
A proporção destes componentes é capaz de formar diferentes estruturas
influenciadas pelas propriedades físico-químicas dos agentes utilizados (FANUN, 2012).
Assim, as ME podem ser classificadas em três tipos: óleo em água (O/A), água em óleo
(A/O) ou sistemas bicontínuos (DAMASCENO et al., 2011) (Figura 2). No primeiro tipo, a
fase interna ou descontínua é a substância lipossolúvel que se encontra dispersa sob a
forma de gotícula coloidal na fase externa, dispersante ou contínua, que é hidrofílica. Já
para as ME A/O, ocorre o inverso, possuindo como fase interna o componente aquoso
disperso sob forma de gotículas na fase externa oleosa. O último tipo não possui como
característica a presença de gotículas, pois os componentes lipofílicos e hidrofílicos se
caracterizam por canais adjacentes alongados com nanogotículas contendo volumes
semelhantes entre a fase aquosa e oleosa (FORMARIZ et al, 2005; DAMASCENO et al.,
2011; MEHTA et al, 2015).
Figura 2 - Tipos de ME: fase oleosa (cinza), fase aquosa (branca).
Fonte: DAMASCENO et al, 2011.
20
Uma das ferramentas mais utilizadas para a obtenção de sistemas
microemulsionados é o diagrama de fases ternário ou pseudoternário, que consiste em uma
representação gráfica composta pelas três fases que formam uma ME: fase aquosa, fase
oleosa e tensoativo (s) e, às vezes, um cotensoativo. Seu principal objetivo é caracterizar o
domínio de regiões de ME, tendo como vantagem a escolha da região cuja viscosidade –
entre outras características – são mais apropriadas para a incorporação do fármaco
(DAMASCENO et al., 2011).
Esse sistema é caracterizado por uma baixa tensão interfacial entre as fases
imiscíveis entre si e oferecem várias vantagens como a estabilidade termodinâmica, a
simplicidade em seu preparo, a capacidade de incorporar uma ampla gama de moléculas,
tanto hidrofílicas, lipofílicas quanto anfifílicas, aumentando sua solubilização e
biodisponibilidade, além de reduzir a toxicidade do fármaco (PESTANA et al., 2008;
FANUN, 2012). O tamanho das gotículas formadas geralmente está dentro da faixa de 10-
200 nm, sendo aproximadamente 100 vezes menor do que o tamanho médio das gotículas
formadas em uma emulsão (1-10 µm) (DAMASCENO et al., 2011; HOAR;
SCHULMAN,1943; SCHULMAN et al., 1959).
As ME aparecem, portanto, como formulações atrativas na área farmacêutica para
veiculação de fármacos, permitindo uma liberação controlada ou sustentada através de
diversas vias de administração como tópica, transdérmica, oral, nasal, ocular e parenteral
(GRAMPUROHIT et al., 2011; FANUN et al., 2012). Desta forma, o estudo e o
desenvolvimento de ME podem ser considerados como ampla área dentro dos sistemas de
liberação modificada de fármacos que irá permitir o desenvolvimento de diversas
aplicações terapêuticas, como neste caso, para uma utilização anti-inflamatória e
antinociceptiva do flavonoide crisina.
2.4 MECANISMO DA DOR INFLAMATÓRIA
A inflamação é uma reação do organismo a diferentes estímulos, como danos
mecânicos, físicos, químicos e biológicos, que ocorrem com o intuito de proteção contra os
agentes causadores dos danos e de retorno a homeostase. As características do processo
inflamatório incluem uma complexa cascata de eventos bioquímicos e celulares, que
envolve extravasamento de líquido, migração celular, produção de mediadores pró-
inflamatórios e sensibilização de nociceptores que culminam com sua sintomatologia
21
característica: calor, rubor, edema, dor e a perda da função (BECKER, 1983; COTRAN et
al., 2006; GREGORY et al., 2008; MEDZHITOV, 2008; SOUZA, 2014).
Entretanto, além de proteger o organismo contra os agentes causadores de danos,
o processo inflamatório pode causar danos aos tecidos, levando ao surgimento de sinais e
sintomas. Assim, quando o estímulo inflamatório persiste, a inflamação torna-se crônica,
causando sérios danos ao organismo (BASBAUM et al., 2009; FEGHALI e WRIGHT,
1997; MARKENSON, 1996; RODRIGUES et al., 2016).
O aumento da sensibilidade a estímulos dolorosos, conhecido como
hiperalgesia, é uma característica marcante da inflamação e ocorre devido a sensibilização
dos neurônios nociceptivos sensoriais primários. Após uma lesão tecidual ou inflamação,
os nociceptores são ativados pela ação de mediadores químicos que ativam cascatas de
segundos mensageiros, influenciando canais iônicos, enzimas e proteínas de sinalização
intracelular nestes. Desta forma, ocorre o aumento da excitabilidade do neurônio,
diminuindo o limiar de disparo e aumentando a frequência de potenciais de ação
produzidos durante uma estimulação supra limiar (BASBAUM e WOOLF, 1999; CUNHA
et al, 2005; SILVA, 2013; VERRI et al, 2006).
Os eventos básicos do processo inflamatório são vasculares e celulares,
mediadores derivados de células e da ativação plasmática. As alterações vasculares
iniciam-se em vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo, aumento da permeabilidade
vascular e exsudação de plasma (LANTZ et al., 2005; ROCHA, 2010; WILLIAMS, 1983).
A lesão tecidual inicial resulta na liberação de mediadores pelas células lesadas,
incluindo prótons, serotonina, bradicinina, histamina e óxido nítrico. Em seguida, a
ativação do processo inflamatório induz a via do ácido araquidônico, resultando na
produção de prostaglandinas (produtos da COX) e leucotrienos (produtos da
lipooxigenase), e, por fim, as células do sistema imune são recrutadas, liberando ainda
outros mediadores, incluindo fatores de crescimento e citocinas como interleucina-1 (IL 1)
e fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e causando as mudanças no tônus vascular e
fluxo sanguíneo (KIDD e URBAN, 2001; SAMPSON 2000; WILLIAMS, 1983).
A carragenina, um polissacarídeo linear sulfatado obtidos a partir de extratos de
algas marinhas vermelhas, tem sido usada no estudo da hiperalgesia inflamatória, pois
induz hiperalgesia mecânica através da cascata das citocinas (TNF-a, IL-6 and IL-1b)
liberadas por células residentes ou migratórias iniciadas pela produção de bradicinina, com
22
conseqüente síntese de prostaglandinas e liberação de aminas simpáticas (BRITO et al.,
2015).
Desta forma, diante das limitações impostas pela crisina que culminam com uma
baixa biodisponibilidade após administração via oral, em paralelo ao seu potencial uso
farmacêutico na inflamação e nocicepção, o desenvolvimento de uma microemulsão para
veiculação dessa mostrasse uma opção vantajosa para utilização farmacêutica.
23
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e caracterizar um sistema microemulsionado contendo a crisina para a
avaliação do seu potencial anti-inflamatório e antinociceptivo.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter a ME a partir do diagrama de fases;
Caracterizar físico-quimicamente e estruturalmente o sistema obtido;
Avaliar a estabilidade físico-química do sistema;
Desenvolver e validar uma metodologia de quantificação da crisina;
Avaliar o perfil de liberação in vitro da crisina incorporada à ME;
Avaliar in vivo a ação antinociceptiva da ME incorporada com a crisina.
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS:
Crisina 97% (Lote STBF6934V, Sigma-Aldrich, EUA);
Carragenina (Sigma, Brasil);
Miristato de isopropila (Farmos, Brasil);
PEG-8 cáprico/caprílico glicerídeo (LAS®-Brasquim, Brasil);
Água deionizada obtida através de osmose reversa (Permution, Brasil).
4.2 MÉTODOS:
4.2.1 Obtenção do diagrama de fase pseudoternário (DFT)
Para identificação das regiões de ME foi realizada a obtenção do diagrama de
fases pseudoternário através do método de titulação da fase aquosa a temperatura ambiente
(25 ºC) seguida de inspeção visual do resultado da mistura dos componentes. O miristato
de isopropila foi utilizado como fase oleosa, o LAS® como tensoativo e água deionizada
como fase aquosa.
O tensoativo foi adicionado à fase oleosa nas proporções 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5,
6:4, 7:3, 8:2 e 9:1, respectivamente. A fase aquosa foi titulada utilizando um pipetador
automático em cada uma das proporções de fase oleosa e tensoativo obtidas. Após cada
titulação, as misturas foram submetidas a homogeneização através de um desruptor de
células ultrassônico (VibracellTM 75041, sonda de 13mm, 750 W, 20 KHz, Bioblock
Scientific, França) por 1 minuto na amplitude de 40%, seguido de banho de ultrassom por
1 minuto para a retirada de possíveis bolhas e um período de repouso de 2 minutos para
observação do aspecto final do sistema (HU et al., 2011).
Ao fim do período de repouso, as mudanças no aspecto visual das misturas foram
analisadas contra um fundo escuro e classificadas de acordo com o seu aspecto. Os
resultados obtidos foram plotados em um triângulo equilátero com auxílio do software
Origin Pro® 8.0, no qual cada ponto da superfície corresponde a proporção definida dos
componentes da mistura.
25
4.2.2 Seleção da formulação e incorporação da crisina
A partir do diagrama obtido, foi selecionada uma proporção dos componentes na
região de formação de sistemas transparentes para obtenção da formulação para
incorporação da crisina. A formulação foi preparada através de 3 ciclos de
homogeneização ultrassônica por 1 minuto, com retirada do excesso de bolhas de ar em
banho de ultrassom por 1 minuto.
A crisina possui características lipofílicas, com solubilidade aquosa de 0.005
mg/ml (WALLE et al., 2001; WALLE et al., 2004) e, portanto, foi dissolvida na mistura da
fase oleosa e tensoativo, antes da adição da água e sua concentração final na formulação
foi de 0,1% (m/m). Todos os sistemas foram preparados 24h antes da realização dos testes
de caracterização e mantidos em temperatura ambiente para garantir sua estabilização
termodinâmica (SILVA et al., 2010).
4.2.3 Avaliação macroscópica
As características macroscópicas das formulações foram
analisadas através de observação visual. Aspectos como coloração,
homogeneidade, separação de fases, transição de sistema transparente para opaco
ou a presença de precipitados foram avaliados 48 horas após a obtenção do sistema
microemulsionado, o qual foi armazenado em frascos transparentes e mantidos em
temperatura ambiente (25 ºC).
4.2.4 Isotropia
A isotropia das formulações escolhidas, com e sem o fármaco, foi analisada por
meio de um microscópio de luz polarizada. Uma gota da amostra foi colocada sobre uma
lâmina de vidro, coberta com uma lamínula e examinada através de uma luz submetida a
um polarizador. As fotomicrografias foram obtidas para determinar se as amostras exibiam
ou não birrefringência óptica. Todas as análises foram realizadas no Laboratório de
Microscopia do Departamento de Geologia da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN).
26
4.2.5 Estudos de estabilidade
Os sistemas microemulsionados, com e sem crisina, foram submetidos aos testes
de estresse por centrifugação, ciclo de congelamento descongelamento e de aquecimento
resfriamento, de modo que ao final de cada teste as amostras foram analisadas quanto a
presença de turbidez, separação de fases e/ou precipitado. Os sistemas que persistirem
como sistemas transparentes e com única fase após o teste são considerados estáveis
(PREMARATHNE; KARUNARATNE; PERERA, 2016).
4.2.5.1 Teste de estresse por centrifugação
As formulações foram submetidas à centrifugação (15000g) por 30 minutos, e em
seguida tiveram sua estabilidade analisada.
4.2.5.2 Teste de estresse por congelamento descongelamento
As formulações foram submetidas a 3 ciclos de congelamento e descongelamento.
Estas foram congeladas em frízer à -20 ± 2 ºC por 24 horas, e em seguida foram retiradas e
mantidas em temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) para descongelamento, e em seguida
tiveram sua estabilidade analisada.
4.2.5.3 Teste de estresse por aquecimento resfriamento
As formulações foram submetidas a 3 ciclos de aquecimento e resfriamento. Estas
foram aquecidas em incubadora à 40 ± 2 ºC por 24 horas, e em seguida foram retiradas e
mantidas em temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) para resfriamento, e em seguida tiveram sua
estabilidade analisada.
4.2.6 Caracterização físico-química
4.2.6.1 Determinação do pH
O pH da formulação foi mensurado utilizando pHmetro digital (Modelo HI 221,
Hanna instruments, Brasil), com eletrodo e sensor de temperatura previamente calibrado
com solução tampão 4,0 e 7,0, à temperatura de 25±0,5°C. O eletrodo foi introduzido
diretamente em um volume de 10g da formulação. A análise foi realizada em triplicata
(CAVALCANTI et al., 2016).
27
4.2.6.2 Condutividade elétrica
A condutividade elétrica da formulação foi avaliada por meio de condutivímetro
digital (Logen, Brasil), previamente calibrado com solução de calibração apresentando
condutância de 146,9 µS cm-1 à temperatura de 25±0,5°C. O eletrodo foi introduzido
diretamente em um volume de 10 ml da formulação. A análise foi realizada em triplicata
(CAVALCANTI et al., 2016).
4.2.6.3 Índice de refração
O índice de refração foi mensurado utilizando refratômetro de Abbé (Analytik
Jena AG, Alemanha), aferido com águia deionizada (IR=1,333), à temperatura de
25±0,5°C. A análise foi realizada em triplicata (CAVALCANTI et al., 2016).
4.2.6.4 Tensão superficial
A análise de tensão superficial foi feita utilizando o tensiometro SensaDyne
(model QC-6000, Research Corp., USA) aplicando a técnica da máxima pressão da bolha,
usando o nitrogênio como fase gasosa. O tensiometro foi conectado a um computador e
controlado através do software SensaDyne Tensiometer, version 1.21 (WANDERLEY
NETO et al., 2012).
4.2.6.5 Tamanho de gotícula e potencial zeta
O diâmetro médio das gotículas, o índice de polidispersão e o potencial Zeta
foram obtidos através de análise por espalhamento dinâmico de luz (DLS – Dynamic Light
Scattering) usando o equipamento Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd,
France). As análises foram feitas sob temperatura constante de 25°C, com ângulo de
incidência de 90°, e com feixe de luz de comprimento de onda de 633nm. As amostras
foram diluídas (1:200) antes das análises e cada medida foi feita em triplicata, sendo a
média do diâmetro de gotícula e do índice de polidispersão determinados. O potencial zeta
das microemulsões também foi mensurado em triplicata, após diluição das amostras
(1:100) em NaCl (1mmol/L).
4.2.7 Validação da metodologia analítica espectrofotométrica para doseamento da
Crisina na Microemulsão
28
O processo de validação tem como objetivo ratificar que o método desenvolvido
atente às exigências analíticas para a finalidade pretendida, garantido a obtenção de
resultados confiáveis (BRASIL, 2003). A validação do método espectrofotométrico
desenvolvido foi realizada de acordo com as recomendações da Resolução da ANVISA RE
nº 899, de maio de 2003. O método possui a finalidade de quantificar o princípio ativo em
produtos farmacêuticos ou matérias-primas, portanto, os parâmetros especificidade e
seletividade, linearidade e faixa de aplicação (intervalo), precisão, exatidão e robustez
exigidos pela categoria I foram avaliados.
Inicialmente realizou-se uma varredura espectrofotométrica (200 a 350 nm) de
uma solução de Crisina em etanol PA, na concentração de 16µg/ml para confirmação do
comprimento de onda (λ) prenunciado na literatura no qual a Crisina apresentava valor
máximo de absorbância (CHAKRABORTY et al., 2010; WALLE et al., 2001; ZHANG,
2014; ZHU et al., 2016).
A especificidade e seletividade foram determinadas através da comparação entre
as curvas de absorbância em função do comprimento de onda da microemulsão branca
(MEB), sem adição da crisina em relação à curva gerada pela leitura espectral da
microemulsão contendo a crisina (MECS) na faixa de comprimento de onda de 200 a 350
nm.
A linearidade e a faixa de aplicação foram obtidas a partir do preparo de uma
solução padrão (n=3) de Crisina na concentração de 40 µg/ml em etanol. Em seguida
foram feitas sucessivas diluições para obtenção das soluções com concentrações de 8, 6, 4,
2 e 1 µg/ml de Crisina em etanol. Todas as concentrações foram lidas em
espectrofotômetro UV-Vis para verificar a absorbância de cada diluição permitindo a
obtenção da curva de calibração e a determinação do coeficiente de correlação linear (r)
através da análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. O critério
mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) é de = 0,99 (BRASIL, 2003).
A precisão foi determinada através da leitura em sextuplicata de soluções na
concentração do ponto médio da curva de calibração (4 µg/ml) no comprimento de onda de
269 nm. Este parâmetro foi avaliado em dois níveis: a repetitividade (precisão intra-
corrida) e a precisão intermediária (precisão intercorridas), por analistas distintos. A
precisão foi expressa como coeficiente de variação (CV%), obtido através da Equação (1):
(1)
29
Onde: DP é o desvio padrão e CDM é a concentração média determinada, não se admitindo
valores superiores a 5 %.
A exatidão foi determinada a partir de nove leituras contemplando o intervalo
linear do procedimento, sendo feito análise em triplicata de soluções da Crisina em
diferentes faixas de concentração, sendo elas em baixa (2 µg/ml), em média (4 µg/ml) e em
alta concentrações (8 µg/ml). O cálculo para este parâmetro foi feito através da Equação
(2):
(2)
A robustez do método foi realizada através da alteração de parâmetros como
mudança no solvente utilizado para a validação, em que foram utilizados como solventes
para a Crisina etanol PA de diferentes fabricantes. E a outra alteração foi a utilização de
espectrofotômetros de modelos diferentes. A análise foi feita em triplicata no comprimento
de onda de 269 nm. Os valores das absorbâncias foram analisados e verificados quanto ao
seu coeficiente de variação (%).
4.2.8 Doseamento da Crisina na microemulsão
A quantificação da Crisina na microemulsão foi realizada de acordo com a
metodologia analítica desenvolvida e validada por espectrofotometria UV-Vis. Foram
feitas diluições em etanol PA em triplicata da microemulsão contendo o fármaco para
obtenção de soluções com concentração teórica de 4 µg/ml. A partir destas soluções, foram
feitas as leituras no espectrofotômetro no comprimento de onda de 269 nm. As médias das
absorbâncias foram utilizadas para o cálculo da concentração real de Crisina na formulação
por meio da equação da reta obtida durante a determinação da linearidade do método.
4.2.9 Eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação da Crisina pela microemulsão foi determinada
utilizando 1ml da formulação, a qual foi submetida a centrifugação (15000 g) por 30
minutos. Em seguida, uma alíquota do sobrenadante da microemulsão foi cuidadosamente
retirada e diluída em etanol com a finalidade de se obter a concentração média observada
na curva de calibração obtida (4 µg/ml) (LI et al., 2015). A eficiência de encapsulação foi
calculada conforme Equação (3):
(3)
30
Onde, EE é a eficiência de encapsulação; ABSsob é a absorbância do sobrenadante da
formulação após a centrifugação no λ de 269 nm; e, ABSform é a absorbância da
formulação antes da centrifugação no λ de 269 nm.
4.2.10 Estudos de Liberação in vitro da crisina
4.2.10.1 Preparo da membrana sintética das células de difusão de Franz
As cinéticas de difusão in vitro foram conduzidas utilizando-se células de difusão
tipo Franz com área difusional de 0,785 cm2, volume de 12 ml e utilizando membrana
sintética de acetato de celulose 0,45 μm, sendo estas previamente hidratadas por 2 horas
em imersão numa solução de tampão fosfato (0,1 mol/L) pH 7,4. O compartimento
receptor foi preenchido com solução etanol/água (1:1), num sistema composto de três
células individuais, que estavam imersas em um banho termostatizado à 37 ± 0,5°C, sendo
mantidas sob agitação constante em agitador magnético por um período de 12 horas.
As membranas de acetato de celulose foram colocadas na parte superior do
compartimento receptor de uma maneira a evitar a formação de bolhas. O compartimento
doador foi preenchido com um volume de 300μL da MECS (0,1%) a ser testada. A difusão
do fármaco é determinada pela quantificação do mesmo no compartimento receptor. Para
tanto, foi coletada 1 ml da solução receptora nos seguintes intervalos de tempo: 0,25; 0,5;
1; 2; 4; 6; 8; 10 e 12 horas, e a determinação da quantidade de crisina liberada neste
compartimento foi feita através de leitura espectrofotométrica no comprimento de 269 nm.
O volume total da fase receptora foi reposto a cada amostragem com a solução etanol/água
(1:1) para manutenção das condições sink do sistema. Todo o estudo de liberação foi
conduzidos em triplicata e os resultados expressos através da média e desvio padrão
(CAVALCANTI et al., 2016).
4.2.10.2 Análise cinética do ensaio de liberação in vitro
Para a avaliação da cinética da crisina no sistema microemulsionado, os resultados
da liberação in vitro foram compilados em gráficos de dispersão xy, característicos de três
modelos cinéticos:
Ordem zero: quantidade liberada por área (μg/cm2) versus tempo (h);
Higuchi: quantidade liberada por área (μg/cm2) versus raiz do tempo (h);
Primeira ordem: log da quantidade liberada por área (μg/cm2) versus tempo (h).
31
A partir dos gráficos, realizou-se análise de regressão linear, determinando-se o
coeficiente linear (r) para cada modelo cinético proposto. O modelo que apresentou o
maior valor de r foi o selecionado. O valor de fluxo (J), velocidade de liberação, da crisina
foi calculado através de regressão linear e correspondeu a inclinação (a) na porção linear
dos pontos experimentais selecionados a partir do ponto onde o equilíbrio de difusão já
estaria alcançado, obtendo-se então o fluxo no estado estacionário (trecho constante do
gráfico) (PREMARATHNE; KARUNARATNE; PERERA, 2016).
O lag time (tlag) é calculado através da extrapolação da reta de regressão linear até
o eixo do tempo, portanto, é o valor de x quando y é substituído por zero na equação da
reta (CAVALCANTI et al., 2016). Assim, o tlag pode ser definido como o tempo necessário
para que a passagem de uma substância através de uma membrana atinja o equilíbrio
(AULTON, 2005).
O coeficiente de liberação, Kr, foi calculado através da relação entre o fluxo no
estado estacionário e a concentração inicial de crisina na microemulsão
(PREMARATHNE; KARUNARATNE; PERERA, 2016; ROTTKE; LUNTER;
DANIELS, 2014), como mostrado na Equação (4):
(4)
Onde, Kr é o coeficiente de liberação, Jss é o fluxo no estado estacionário através das
membranas de acetato de celulose (µg/cm2h) e Co é a concentração inicial de crisina na
formulação (µg/mg).
Além disso, realizou-se o cálculo do percentual de liberação da crisina da ME ao
longo do tempo através da Equação (5) (CAVALCANTI et al., 2016):
(5)
Onde Rt corresponde a quantidade de crisina liberada no tempo t e L representa a
quantidade inicial de crisina na ME.
4.2.11 Atividade antinociceptiva da MECS utilizando o modelo de indução de
inflamação e hiperalgesia por carragenina
4.2.11.1 Animais
Foram utilizados camundongo Swiss (Mus muculus var. albinus), machos,
pesando 25-30g, os quais foram fornecidos pelo biotério do departamento de fisiologia da
32
Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os animais foram aleatoriamente mantidos em
gaiolas apropriadas de polipropileno e mantidos a temperatura de 21 ± 2°C, sob ciclo
claro-escuro de 12 horas (luz de 6 às 18 horas), com acesso a água e comida ad libitum. Os
grupos experimentais de camundongos (n=8) foram aclimatizados pelo menos 2 horas
antes dos experimentos e utilizados apenas uma vez. Os testes foram realizados durante a
fase de luz do ciclo. Os protocolos experimentais para os experimentos com animais foram
submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa com Animais da Universidade Federal de
Sergipe e aprovados (CEPA 67/2016).
4.2.11.2 Hiperalgesia mecânica induzida por inflamação
Os animais foram divididos em cinco grupos. Para todos os grupos, com exceção
do grupo Sham, a inflamação aguda foi induzida com uma injeção de 50 µL de solução de
carragenina 1% dissolvida em salina na pata traseira direita, 30 minutos após a
administração via oral por gavagem dos tratamentos. O grupo Sham não foi tratado, o
grupo Crisina foi tratado com crisina 25mg/kg, e o controle negativo (grupo veículo)
apenas com o veículo (Tween 80 2% em água destilada), o grupo MECS foi tratado com
microemulsão contendo crisina (25mg/kg) e o seu grupo controle (grupo MEB) foi tratado
com ME branca.
4.2.11.3 Hiperalgesia mecânica induzida por carragenina
A hiperalgesia mecânica foi avaliada utilizando um analgesímetro digital Von
Frey (Insight®, Figura 3), que consiste em um transdutor de pressão adaptado a um
contador digital de força expressa em gramas (g). O contato do transdutor de pressão com a
pata é realizado através de uma ponta descartável de polipropileno. Os animais são
colocados em caixas de acrílico (Figura 3) para experimentação, a qual tem um assoalho
feito de arame não maleável na forma de rede (INSIGHTL, 2017).
Figura 3 – Analgesímetro digital (a) e caixa de acondicionamento do Von Frey (b).
Fonte: INSIGHTL, 2017.
33
As alterações nos limiares nociceptivos são avaliadas exercendo-se uma pressão
linearmente crescente no centro da planta da pata do animal até a produção de uma
resposta caracterizada pela retirada ou sacudida (flinches) da pata estimulada. As medidas
são repetidas por 4 vezes em cada animal (com intervalo de 5 minutos) para obter uma
média expressa em gramas. As medidas foram feitas antes da injeção de carragenina para
determinar a linha de base, como também 1, 2, 3 e 4 horas após a indução. Assim, a
intensidade de hipernocicepção foi quantificada como a variação na pressão obtida
subtraindo-se a média de quatro valores, expressos em gramas (força), observada antes da
injeção de carragenina (0 horas) da média de quatro valores, em gramas (força), após a
indução com carragenina (1, 2, 3 e 4 horas) (JENSEN et al., 1986).
4.2.11.4 Doseamento de citocinas
Os animais foram eutanásiados após 4 horas da injeção de carragenina e a pele da
pata traseira direita foi removida e armazenada a -80 °C. A pele foi homogeneizada em
200µL de tampão fosfato (PBS, pH 7.4) contendo EDTA, nonidet P 40 (0.5%) e inibidores
de proteases. As amostras foram centrifugadas a 8000 rpm, por 10 minutos, à 4 °C, e o
sobrenadante obtido foi diluído para dosagem de proteínas através do método de Bradford
(RABELO et al., 2016). Concentrações de TNF-α e IL-10 foram determinadas através de
ELISA (Enzyme Linked Immunonosorbent Assay) (Bioscience®), de acordo com as
instruções do protocolo do kit, e as medidas colorimétricas a 450 nm foram feitas
utilizando leitor de microplacas (ASYS®). A concentração foi obtida através de curva
padrão, e todos os resultados expressos em pictogramas de citocina por miligrama de
proteína total (pg/mg).
4.2.11.5 Análise estatística do estudo in vivo
A análise estatística foi feita utilizando o programa GraphPad Prism 6.0
(GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). Os dados foram submetidos à
análise de variância de uma única via (ANOVA) seguido do pós-teste de Tukey-Kramer
para atividade anti-inflamatória e antinociceptiva. As diferenças foram consideradas
significativas se p < 0.05.
34
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 OBTENÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES TERNÁRIO (DFT)
O estudo do DFT é uma ferramenta imprescindível para determinar em quais
proporções dos componentes existe o aparecimento de áreas de ME, e mostrar a região
mais adequada para a escolha da formulação na qual o fármaco será incorporado
(FORMARIZ et al., 2005).
Os componentes selecionados para obtenção do diagrama como tensoativo, fase
aquosa e fase oleosa foram o LAS® (PEG-8 cáprico/caprílico glicerídeo), a água e o
miristato de isopropila, respectivamente.
A maioria dos óleos usados em sistemas microemulsionados para uso
farmacêutico são volumosos e semi-polares, sendo os triglicerídos de cadeia média e longa,
como o Miglyol, e os ésteres de ácido graxo, como o palmitato e o miristato de isopropila
são farmaceuticamente aceitáveis e bastante utilizados na obtenção de ME (GOMES,
2010). Na Figura 4, podemos observar a estrutura química do miristato de isopropila
(MIP), fórmula molecular C17H34O2, também conhecido por éster isopropílico do ácido
mirístico ou tetradecanoato de isopropila. O MIP é obtido pela reação do cloreto de
miristila com 2-propanol e possui EHL11,5. É um líquido de baixa viscosidade, inodoro e
praticamente incolor (GENNARO, 2005).
Figura 4 - Miristato de isopropila (C17H34O2).
Fonte: Merck, 2017.
A seleção de emulsificantes adequados, capazes de formar mono ou multicamadas
em torno das gotículas oleosas, de forma a reduzir a tensão interfacial e/ou aumentar a
repulsão entre as gotículas, é um dos principais fatores relacionados à estabilidade do
sistema de liberação (BRUXEL et al., 2012). Recorre-se ao equilíbrio hidrofílico-lipofílico
(EHL) na seleção de tensoativos adequados para microemulsões. Assim, utilizam-se
tensoativos de EHL no intervalo 3-6 para se obter microemulsões água/óleo e no intervalo
de 8-18 para microemulsões óleo/água (SINGH et al, 2013)
35
Dentre os tensoativos, os não-iônicos mostram vantagens particulares para
aplicação farmacêutica devido a suas baixas toxicidade e irritabilidade, sendo alguns,
consequentemente, utilizados em preparações orais e parenterais. Possuem também maior
grau de compatibilidade com diversas substâncias, quando comparados aos tensoativos
catiônicos e aniônicos e são menos sensíveis às alterações de pH ou à adição de eletrólitos
(BILLANY, 2005).
O LAS® (PEG-8 cáprico/caprílico glicerídeo) é um destes tensoativos não-iônicos
que vem sendo vastamente utilizados para solubilização de drogas hidrofóbicas.
Recentemente, foi reportado sua de aumento da absorção intestinal de fármacos fracamente
absorvíveis, como a gentamicina, insulina e vancomicina, que tiveram sua absorção
aumentada na presença deste tensoativo. O LAS®, também chamado de Labrasol®, é a
mistura de mono, di e triglicerídeos e mono e di ésteres de ácidos graxos do PEG 400
(Figura 5). É sintetizado através de uma reação de esterificação alcoólica utilizando
triglicerídeos de cadeia media do óleo de coco e PEG 400, sendo os ácidos graxos
cáprico/caprílico os principais. Possui EHL entre 12-14, sendo ideal para obtenção de
microemulsão O/A, e apresenta baixa toxicidade, com uma LD50 de 22g/kg para ratos, o
que viabiliza sua utilização em preparações orais (LIN et al., 2007; STRICKLEY, 2004;
UJHELYI et al., 2012).
Figura 5 - LAS®.
Fonte: STRICKLEY, 2004.
Legenda: x = 8 e R = C8, C10.
A Figura 6 representa o DFT obtido neste estudo, o qual caracteriza o
comportamento das misturas de tensoativo, fases oleosa e aquosa. Foi observada uma
diversidade de estados, ressaltando-se a presença de áreas de formação de microemulsão,
destacado em cinza, que são regiões onde as proporções dos componentes foram
36
apropriadas para reduzir a tensão interfacial até a formação de um sistema homogêneo,
límpido e transparente (SILVA et al, 2009).
Figura 6 - Diagrama de fases pseudoternário para o sistema LAS®, miristato de isopropila e água.
Fonte: Próprio Autor.
Legenda: A área cinza representa a região de existência de microemulsão, e o ponto vermelho representa a
formulação selecionada.
5.2 SELEÇÃO DA FORMULAÇÃO E INCORPORAÇÃO DA CRISINA
Partindo do DFT obtido, selecionou-se uma formulação para incorporação da
crisina. A Tabela 1 apresenta as proporções dos componentes da formulação que foi
escolhida a partir do diagrama e que representasse uma ME do tipo óleo em água (O/A).
Essa composição encontra-se destacada na Figura 6.
Tabela 1 – Composição percentual (p/p) da formulação selecionada.
Componente Função Proporção (%)
LAS® Tensoativo 40
Miristato de isopropila Fase oleosa 5
Água Fase aquosa 55
Após a escolha da formulação, a crisina foi incorporada à microemulsão.
Damasceno e colaboradores (2011) afirmam que a encapsulação máxima de um fármaco
pode ser alcançada através da incorporação deste durante o processo de formação do
sistema microemulsionado. Neste contexto, a incorporação de fármacos lipofílicos, com a
crisina, em sistemas microemulsionados do tipo O/A, como o obtido neste trabalho, pode
37
ocorrer por meio da solubilização das moléculas do ativo no filme interfacial de
tensoativos ou no núcleo oleoso das gotículas, os quais apresentam propriedades distintas
das do meio aquoso externo.
Desta forma, a crisina foi adicionada à mistura da fase oleosa e tensoativo. Em
seguida, a fase aquosa foi adicionada e o sistema microemulsionado foi obtido utilizando a
técnica de emulsificação por ultrassom, conhecida como sonicação, na qual as ondas
sonoras produzidas pelo equipamento através da sonda provocam um processo de
cavitação acústica, gerando colapsos entre as gotículas que se tornam cada vez menores,
em detrimento também de outros fatores como a proporção entre óleo e tensoativo, a
viscosidade da fase externa, o tempo de emulsificação e a energia aplicada durante o
processo (GHOSH et al., 2013; NAKABAYASHI et al., 2011).
5.3 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
A avaliação macroscópica foi realizada 48 horas após o preparo da ME e está
apresentada na Figura 7.
Figura 7 - Aspecto visual das formulações.
Fonte: Próprio Autor.
Legenda: MEB, refere-se à formulação branca, ou seja, o sistema formado apenas pela fase oleosa, fase
aquosa e tensoativo. MECS, refere-se à microemulsão contendo a crisina incorporada a este.
A avaliação macroscópica da formulação permite observar se os sistemas obtidos
atendem a alguns dos requisitos que correspondem a uma ME propriamente dita e se a
incorporação do fármaco causou ou não alterações nas propriedades do sistema. Assim,
aspectos como limpidez, homogeneidade e estabilidade termodinâmica correspondem a
fatores indispensáveis a uma ME e que devem permanecer inalterados mesmo após a
adição de um princípio ativo (SILVEIRA, 2009).
MEB MECS
38
Constatou-se que, tanto as formulações brancas, sem a crisina, quanto as que
possuíam a crisina incorporada, apresentaram-se com sistemas límpidos, homogêneos,
transparentes, líquidos, sendo a MECS amarelada devido a cor da crisina, sem fenômeno
de separação de fases ou turbidez, dando indícios de uma boa estabilidade para ambas as
formulações.
5.4 ISOTROPIA
A microscopia de luz polarizada pode ser utilizada para a determinação da
isotropia de sistemas líquidos dispersos, permitindo assim sua classificação
(DAMASCENO et al., 2011). Desta forma, através da microscopia de luz polarizada pode-
se detectar e diferenciar os cristais líquidos dos sistemas microemulsionados, porque os
primeiros apresentam birrefringência, revelando texturas típicas pretas e brancas (“cruzes
de malta”), enquanto que as microemulsões relevam apenas um campo escuro (HATHOUT
et al., 2010; ALOISIO; LONGHI; OLIVEIRA, 2015).
As formulações sem e com a crisina foram analisadas por inspeção visual através
de microscopia de luz polarizada. Ambas se apresentaram com um campo completamente
escuro (dado não mostrado), não sendo capaz de desviar o plano da luz, sendo assim
consideradas sistemas opticamente isotrópicos, característico de comportamento de
microemulsões.
5.5 ESTUDOS DE ESTABILIDADE
A estabilidade das formulações escolhidas sem e com crisina (1 mg/ml – 0,1%)
foi investigada através dos testes de centrifugação, ciclo de congelamento
descongelamento, e ciclo aquecimento-resfriamento uma vez que a força gravitacional e a
temperatura são fatores importantes que estão envolvidos na estabilidade física, físico-
química e química de um produto farmacêutico (BABY et al.,2007; PREMARATHNE;
KARUNARATNE; PERERA, 2016). Neste contexto, os ensaios envolvem a submissão de
formulações a condições extremas de temperaturas e força gravitacional com o objetivo de
induzir alterações físico-químicas de maneira acelerada (VELASCO et al., 2008).
Ambas formulações, com e sem a crisina, foram capazes de suportar o teste de
estresse por centrifugação e os três ciclos de congelamento descongelamento, e
aquecimento-resfriamento sem nenhuma modificação. Ou seja, não ocorreu fenômenos de
turvação, separação de fases ou precipitação do fármaco, demonstrando que não houve
instabilidades físico-químicas. Desta maneira, as formulações foram consideradas com
39
uma boa estabilidade, permanecendo inalteradas sob as diferentes condições de estresse as
quais foram submetidas (PREMARATHNE; KARUNARATNE; PERERA, 2016).
5.6 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
5.6.1 Determinação do pH
O pH das formulações foi avaliado com o intuído de verificar se a ME possuía
compatibilidade para a administração oral, entretanto, ele é uma ferramenta que também
pode indicar alterações estruturais, ocorrência de reações químicas como processos de
degradação e oxidação de seus componentes, perda de estabilidade das ME ou crescimento
bacteriano, sendo um parâmetro sensível no controle de qualidade dessas formulações.
O pH encontrado para a MEB foi de 5,47 ± 0,52, enquanto para a MECS foi de
4,48 ± 0,10. O abaixamento de pH observado após a adição da crisina sugere que as
hidroxilas presentes na molécula podem ter provocado está variação, entretanto, segundo
Strickley e Oliyai (2007), a variação tolerada biologicamente pela via oral é de pH de entre
2 e 10. Neste contexto, tanto a MEB quanto a MECS obtiveram valor de pH compatível
com o uso via oral.
5.6.2 Condutividade elétrica
A determinação da condutividade elétrica de uma ME ajuda na elucidação do tipo
de fase externa (contínua ou dispersante), sendo um parâmetro diretamente relacionado
com o tipo de microestrutura apresentado pela formulação, revelando se os domínios
contínuos apresentam características isolantes ou condutoras.
Desta forma, através dos valores de condutividade elétrica, pode-se predizer se o
sistema se trata de uma ME do tipo O/A ou A/O. Isto se deve ao fato de que, uma ME do
tipo O/A tem efeito condutor, enquanto ME do tipo A/O tem efeito isolante. O valor de
condutividade encontrado para a MEB foi de 26,57 ± 0,30 µS.cm-1 e para a MECS foi de
24,66 ± 0,25 µS.cm-1, sendo estes valores sugestivos de um sistema que possua uma
microestrutura do tipo O/A (NAOUI, et al. 2011).
5.6.3 Índice de refração
A Farmacopeia Brasileira (2010) conceitua o índice de refração (n) de uma
substância como uma constante física definida pela a relação entre a velocidade da luz no
vácuo e sua velocidade no interior da substância. Seu princípio básico diz que quando um
40
raio de luz monocromática passa de um meio transparente para outro de densidade óptica
diferente, este é refletido ou refratado, exceto quando incide perpendicularmente à
superfície de contato entre as duas substâncias. Na prática, a relação é feita utilizando a
refração com referência ao ar e a substância investigada e não com referência ao vácuo.
Substâncias consideradas isotrópicas possuem índice de refração constante e
único em determinado comprimento de onda, temperatura e pressão, pois o raio de luz se
propaga pela substância com a mesma velocidade em todas as direções consideradas.
Portanto, este parâmetro é útil não só na identificação de uma substância, mas para detectar
a presença de impurezas e de natureza anisotrópica.
Desta forma, as ME devem apresentar apenas um único índice de refração e
nenhuma restrição no plano de vibração de luz que passa através deles, mantendo as
mesmas propriedades ópticas em todos os sentidos (BABOOTA et al., 2007).
Neste contexto, foi feita um acompanhamento desta variável por 7 dias, utilizando
como referência o ar e as ME. Os valores de n encontrados mantiveram-se em torno de
1,3892 ± 0,0001 para a MEB e 1,3894 ± 0,0001 para a MECS. Assim, pode-se confirmar a
natureza isotrópica da formulação, uma vez que a constante física analisada se mostrou
única e constante em todos os ensaios.
5.6.4 Tensão superficial
Dentre as propriedades das ME nas quais são propriedades que conferem
condições às ME de incorporar moléculas insolúveis que dificilmente seriam incorporadas
em formulações convencionais, como a crisina, temos a baixa tensão superficial dessas
formulações (TENJARLA, 1999; SILVA et al., 2009; HARRAR et al., 2011;
CAVALCANTI et al., 2016).
Visando comprovar essa característica, a formulação em estudo foi submetida a
análise de tensão superficial. O resultado obtido mostrou uma baixa tensão superficial de
40.53 ± 1.8 dynes/cm para a MECS, que pode ser alcançado devido ao uso de altas
concentrações de tensoativo não iônico para obtenção da formulação que reduz a tensão
superficial na interface óleo-água (RASTOGI et al., 2017; WANDERLEY NETO et al.,
2012). A baixa tensão superficial atingida pela formulação pode auxiliar no aumento da
biodisponibilidade de fármacos através da melhora na permeação pelas camadas
gastrointestinais hidratadas (KAUR; MEHTA, 2017), sendo esta característica vantajosa
para a formulação MECS.
41
5.6.5 Tamanho de gotícula e potencial Zeta
A análise da distribuição do tamanho de gotículas é considerada um dos
parâmetros mais importantes para a avaliação da estabilidade de sistemas dispersos, além
de ser um fator essencial capaz de indicar prováveis aspectos da taxa e extensão da
liberação e absorção de acordo a com presença ou ausência de um tamanho nanométrico
(WEI et al., 2012). A técnica de espalhamento de luz dinâmico tem sido considerada uma
ferramenta precisa e conveniente para os estudos das propriedades internas das ME, sendo
esta utilizada para a determinação do tamanho de gotículas do sistema através da flutuação
da intensidade da luz espalhada pelas gotículas em suspensão, agindo em movimento
Browniano, obtendo assim a distribuição hidrodinâmica do seu tamanho (LI et al., 2010;
XU, 2008).
Para a MEB, o tamanho médio das gotículas foi de 158,9 ± 10,5 nm e para a
MECS obteve-se valor de 170,7 ± 5,3 nm (Tabela 2). Os tamanhos similares no diâmetro
das gotículas da MECS quando comparada com a formulação branca indica que não houve
alterações significativas nas gotículas após a incorporação do fármaco na ME.
Tabela 2 – Análise das gotículas das formulações.
Componente MECS MEB
Tamanho de gotícula ± DP (nm) 170,7 ± 5,3 158,9 ± 10,5
Potencial Zeta ± DP (mV) −16,1 ± 1,9 −10 ± 2,1
Índice de polidispersão ± DP (IPD) 0,152 ± 0,04 0,154 ± 0,03
Além do diâmetro, foi determinado o índice de polidispersão (PDI) das
formulações. Esta medida leva em consideração o tamanho médio das gotículas, o índice
de refração do solvente, o ângulo de medida e a variação da distribuição. Apesar de não
existir uma correlação linear entre um valor de PDI e uma monodispersão da amostra
verdadeira, em uma escala de 0 a 1, PDI menor que 0,1 tem sido associado a um sistema
monodisperso, com alta homogeneidade na população de gotículas, sugerindo uma
distribuição de tamanho monomodal. Por outro lado, valores altos de PDI sugerem uma
distribuição de tamanho mais ampla ou polimodal (CALVO et al., 1996; GAUMET et al.,
2008; GOVENDER et al., 1999; SOARES, 2009).
Conforme exposto na Tabela 2, o IPD encontrado de 0,154 ± 0,03 para MEB e de
0,152 ± 0,04 para a MECS indica uma distribuição de tamanho de gotículas do tipo
42
monomodal e homogêneo, e de acordo com Gumiero e Rocha Filho (2012) valores de IPD
abaixo de 0,2 refletem na qualidade em relação à sua estabilidade. Assim, a incorporação
da crisina não interferiu na morfologia e tamanho das gotículas o que reflete em uma boa
estabilidade para formulação MECS.
O potencial elétrico em torno da gotícula no plano de cisalhamento é chamado de
potencial Zeta, e pode ser quantificado através da observação da mobilidade eletroforética
das gotículas submetidas a um campo elétrico (XU, 2008). O potencial Zeta tem um papel
importante na determinação da estabilidade de sistemas dispersos e nas interações entre as
gotículas presentes (KHAN et al., 2013). Sistemas mais estáveis apresentam valores de
potencial Zeta iguais ou superiores a 20 mV, uma vez que cargas superficiais elevadas
ocasionam o predomínio das forças de repulsão entre as gotículas, superando o caráter de
atração das forças de Van der Waals (BOSE et al., 2013). Esta maior repulsão é importante
no sentido de prevenir o contato e aglomeração das gotículas (BHANDARI; KAUR,
2013).
As formulações apresentaram valores negativos, sendo –10 mV para MEB e –16,1
mV para a MECS, sendo observado que com a adição do fármaco ocorreu aumento do
valor modular o que prediz uma melhor estabilidade para a MECS. Entretanto, os valores,
no geral, relativamente baixos de potencial Zeta encontrados para ambas formulações
poderiam indicar que as mesmas apresentem baixa estabilidade a longo prazo. Porém, a
estabilidade de MEs contendo em sua composição tensoativos não-iônicos, como as
formulações do presente estudo, não depende unicamente do potencial Zeta, visto que os
tensoativos não-iônicos tendem a diminuir o valor absoluto deste parâmetro. Deste modo,
apenas estudos posteriores de estabilidade a longo prazo podem esclarecer melhor o perfil
de estabilidade das formulações ME (AGGARWAL et al., 2013).
5.7 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA
ESPECTROFOTOMÉTRICA PARA DOSEAMENTO DA CRISINA NA ME
A validação de um processo analítico tem o objetivo de demonstrar, através de
estudos experimentais, que o método desenvolvido é apropriado para a aplicação desejada
e garantir que os resultados obtidos são confiáveis (BRASIL, 2003; ICH, 2005). Neste
contexto, os estudos de validação precisam ser representativos e os parâmetros a serem
avaliados devem ser escolhidos com base na finalidade de aplicação do método (ICH,
2005).
43
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) disponibilizou em 2003
um guia para o procedimento de validação de métodos analíticos, sendo este a Resolução
nº 899, de 29 de maio de 2003 (BRASIL, 2003). De acordo com o guia, para métodos
analíticos que envolvam a quantificação de fármacos em produtos farmacêuticos, os
parâmetros de seletividade, linearidade e faixa de aplicação (intervalo), precisão, exatidão
e robustez devem ser cuidadosamente avaliados (BRASIL, 2003).
O início do desenvolvimento do método se deu com a determinação do espectro
de absorção da Crisina, através de varredura no intervalo de 200 a 350 nm (Figura 8), a fim
de confirmar o seu pico máximo de absorbância, que já havia sido reportado na literatura
(CHAKRABORTY et al., 2010; WALLE et al., 2001; ZHANG, 2014; ZHU et al., 2016).
O gráfico gerado pela solução de Crisina em etanol se mostrou semelhante aos gráficos
obtidos pelos autores já citados, confirmando que o pico de absortividade máxima se dá em
269 nm.
Figura 8 - Varredura espectrofotométrica da solução de Crisina (16 µg/ml) na faixa de comprimento de onda
de 200 a 350 nm.
Fonte: Próprio autor.
Legenda: Espectro de absorção da Crisina a 16µg/ml em etanol PA.
Após determinação do comprimento de onda que a Crisina possui maior pico de
absorção, os parâmetros para validação determinados na resolução da ANVISA foram
avaliados. A seletividade foi avaliada com o objetivo de verificar a interferência de outros
componentes presentes na formulação como excipientes, impurezas e produtos de
degradação, que não poderiam ser confundidos com o composto de interesse, garantindo
44
que este pudesse ser visualizado de forma clara através de um pico de resposta exclusivo
do analito (ICH, 2005).
Para o método espectrofotométrico, este parâmetro foi determinado comparando-se
as curvas espectrais obtidas através das leituras de diluições individuais de cada sistema,
comparando o comportamento da matriz isenta de Crisina (MEB), e a matriz contendo o
fármaco (MECS). Pôde-se observar que na ME-CS houve a presença do pico de absorção
em 269 nm, característico da presença da Crisina na formulação o que não ocorreu na
curva da MEB (Figura 9). Dessa forma, a metodologia analítica proposta foi considerada
seletiva, pois foi constatado que os componentes da formulação não apresentaram
perspectivas de influir na detecção da Crisina no ponto específico de 269 nm.
Figura 9 - Varredura espectrofotométrica da ME na faixa de comprimento de onda de 200 a 350 nm.
Fonte: Próprio Autor.
Legenda: Espectro de absorção da ME-branca em etanol PA (linha preta) e espectro de absorção da ME-CS
em etanol PA (linha vermelha).
A linearidade de um processo analítico refere-se à capacidade do método de
fornecer resultados que sejam diretamente proporcionais a concentração da substância em
análise, dentro de uma faixa de aplicação específica. A relação matemática existente entre
os sinais de absorbância e a concentração deve ser expressa como uma equação de reta
conhecida como curva analítica, que pode ser calculada utilizando o modelo matemático da
MEB
MECS
45
regressão linear, permitindo que haja o cálculo dos coeficientes de regressão (a e b) e
também do coeficiente de correlação (r) (ICH, 2005; BRASIL, 2003).
Este último parâmetro fornece a avaliação da qualidade da curva obtida, pois
quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão entre os pontos experimentais e menor a
incerteza dos coeficientes de regressão estimados. A ANVISA recomenda um r igual ou
superior a 0,99 (BRASIL, 2003).
O método espectrofotométrico desenvolvido apresentou linearidade em uma faixa
de 1 a 8 µg/ml. A curva analítica desenvolvida (Figura 10) possuiu a equação da reta y =
0,1123x - 0,0049, obtida pelo método dos mínimos quadrados, apresentando um
coeficiente de correlação (r) igual a 0,9998. Percebe-se que a reta mostra a
proporcionalidade direta entre a absorbância e as diferentes concentrações, estando o r
(0,9998) dentro do critério exigido pela ANVISA.
Figura 10 - Curva analítica obtida a partir de soluções de Crisina nas concentrações de 1 a 8 µg/ml
para determinação do parâmetro linearidade.
Fonte: Próprio autor.
A precisão avalia a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas
de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra sob condições definidas, sendo esta
outra etapa necessária para a validação do método analítico. Este parâmetro pode ser
46
avaliado através da estimativa do desvio padrão relativo (RSD) também conhecido como
coeficiente de variação (CV) (ICH., 2005).
A precisão foi avaliada em relação a repetibilidade, sendo esta a concordância
entre os resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentação (BRASIL, 2003), usando sextuplicata de soluções de Crisina na
concentração de 4 µg/ml (ponto médio da curva analítica).
A precisão intermediária (precisão intercorrida) também foi avaliada. Esta
consiste na concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias
diferentes com analistas diferentes (BRASIL, 2003). Para este parâmetro foi utilizada a
sextuplicata da amostra na mesma concentração da repetibilidade, porém sendo feitas por
analistas diferentes. Este tipo de precisão é capaz de representar melhor a variabilidade dos
resultados em um único laboratório, pois verifica que no mesmo ambiente o método
fornecerá os mesmos resultados (BRASIL, 2003; ICH, 2005).
A Tabela 3 apresenta os dados obtidos durante a determinação do parâmetro
precisão. Nesta observam-se as medidas das concentrações obtidas de amostragens
múltiplas realizadas e as respectivas precisões. Percebeu-se então que, apesar de os dias de
análise e os analistas serem distintos, a precisão encontrou-se dentro do limite estabelecido
pela ANVISA (< 5 %), comprovando que o método analítico em questão foi preciso.
Tabela 3 - Determinação do parâmetro precisão repetibilidade e precisão intercorrida (n=6) para
validação do método espectrofotométrico.
Analistas Dia
Concentração
teórica
(µg/ml)
Concentração
real (µg/ml)
Média ± DP
Precisão (%)
1 1 4 3,98 ± 0,116 2,920
2 4 4,17 ± 0,032 0,769
2 1 4 4,08 ± 0,075 1,829
2 4 4,05 ± 0,113 2,794
Onde: DP = Desvio Padrão
A exatidão corresponde a proximidade dos resultados individuais obtidos pelo
método em estudo em relação ao valor de referência aceito como verdadeiro (teórico)
47
(BRASIL, 2003). A Tabela 4 mostra o valor da exatidão determinada a partir da leitura de
9 amostras em 3 níveis de concentração diferentes, sendo a triplicata de concentrações no
nível baixo (2 µg/ml), no nível médio (4 µg/ml) e no nível alto (6 µg/ml). A partir do
cálculo da exatidão, percebeu-se a proximidade entre as concentrações teóricas e as
concentrações que foram obtidas por meio do método utilizado, indicando que este foi
considerado exato.
Tabela 4 - Determinação do parâmetro exatidão (n=3) para validação do método espectrofotométrico.
Nível Concentração
teórica (µg/ml)
Concentração
real (µg/ml)
Média ± DP
CV (%) Exatidão (%)
Baixo 2 2,038 ± 0,0761 3,733 101,9
Médio 4 4,036 ± 0,1032 2,557 100,9
Alto 6 5,944 ± 0,1494 2,513 99,1
Onde: DP = Desvio Padrão; CV = Coeficiente de variação.
O último parâmetro avaliado foi a robustez, sendo esta a medida da capacidade do
método em resistir a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos, indicando
sua confiança durante o uso normal do método (BRASIL, 2003). As modificações devem
ser realizadas para simular as alterações que ocorrem no método quando este é transferido
para outros laboratórios, analistas ou equipamentos (ICH, 2005). A Tabela 5 mostra a
determinação da robustez utilizando uma solução do fármaco na concentração de 4 µg/ml
analisada a partir das alterações realizadas como as mudanças na marca do solvente (etanol
PA Isofar e etanol PA Qeel) e no modelo do equipamento espectrofotométrico (UV
Evolution 60 S, Thermo Scientific e UV evolution 300 Thermo Scientific, EUA).
48
Tabela 5 - Determinação do parâmetro robustez (n=3) para validação do método espectrofotométrico.
Modificação
Concentração
teórica
(µg/ml)
Concentração
real (µg/ml)
Média ± DP
Precisão
(%)
Exatidão
(%)
Solvente
Etanol PA
Isofar 4 3,9 ± 0,123 3,124 98,3
Etanol PA
Qeel 4 4,187 ± 0,059 1,416 104,7
Equipamento
Espectro 1 4 3,9 ± 0,123 3,124 98,3
Espectro 2 4 3,9 ± 0,152 3,621 99,6
Como observado nos dados da Tabela 5, o método espectrofotométrico
desenvolvido possuiu uma robustez intrínseca, pois analisando as amostras na
concentração de 4 µg/ml em diferentes condições (marca do solvente e modelo do
equipamento), os resultados mantiveram-se dentro das especificações exigidas pela RE n°
899/03. Dessa forma, este método pode ser utilizado em outros laboratórios e ser feito por
outros analistas e resultará em reprodutibilidade dos resultados obtidos na validação.
5.8 DOSEAMENTO DA CRISINA NA ME
A quantificação da crisina incorporada na ME foi feita através da leitura em
espectrofotômetro (269 nm) de diluições da MECS em etanol. A média da absorbância
obtida pela triplicata foi utilizada para gerar o valor médio da concentração real de fármaco
contida na formulação através do uso da equação da reta obtida no parâmetro linearidade.
A Tabela 6 mostra o valor da absorbância média utilizado para o cálculo do doseamento.
Tabela 6 - Determinação do doseamento (n=3) da crisina no sistema microemulsionado.
Amostra Absorbância
Média
Desvio
Padrão
Coeficiente de
Variação (%)
Doseamento
da Crisina
(mg/ml)
MECS 0,478 0,006 1,293 1,0750
49
Como observado, a concentração do fármaco na ME determinada através das
leituras das absorbâncias no espectrofotômetro (1,0750 mg/ml) foi muito próxima à
concentração de Crisina real incorporada ao sistema (1 mg/ml – 0,1%), demonstrando que
o método analítico utilizando espectrofotometria UV/Vis desenvolvido foi sensível e eficaz
para o doseamento da concentração real da crisina incorporada previamente na formulação.
5.9 EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO
Uma vez que o método analítico desenvolvido foi capaz de realizar o doseamento
da crisina, foi feita a investigação de quanto do fármaco doseado conseguiu realmente ser
incorporado na fase interna do sistema proposto. A eficiência de encapsulação é outro
ensaio de caracterização que pode ser realizado a partir de vários métodos, que dependerá
extensivamente do modo de preparo da formulação e das propriedades físico-químicas do
fármaco avaliado (DAMASCENO, 2011).
Para a determinação deste parâmetro utilizou-se uma metodologia baseada na
comparação entre os valores de absorbância da triplicata das soluções de MECS antes e
após o processo de centrifugação. Neste ensaio de maneira geral, a centrifugação auxiliou,
caso houvesse, na separação do fármaco que se encontrava incorporado na fase interna
daquele que se encontrava disperso na fase externa, sendo este último o responsável pela
formação de um possível precipitado.
Contudo, após o processo de centrifugação percebeu-se que não houve a formação
de um precipitado e a formulação encontrava-se límpida, com as mesmas características
organolépticas e sem separação de fases. Realizou-se o doseamento da crisina no
sobrenadante e as absorbâncias pós-centrifugação foram determinadas. Os dados para o
cálculo da eficiência de encapsulação estão na Tabela 7, sendo esta calculada através da
Equação 3.
Tabela 7 - Determinação da eficiência de encapsulação (n=3) da crisina no sistema microemulsionado.
Amostra
Absorbância
Média Pós-
centrifugação
Desvio
Padrão
Coeficiente de
Variação (%)
EE da Crisina
(%)
MECS 0,467 0,006 1,294 97,70
Onde: EE = Eficiência de encapsulação
50
Em concordância com Damasceno e colaboradores (2011), a eficiência de
encapsulação foi adequadamente alcançada quando a crisina foi incorporada durante a
formação da microemulsão proposta, tendo em vista que valores acima de 80% são
considerados significativos. Portanto, considera-se que a incorporação da crisina a fase
interna do sistema foi satisfatória.
5.10 LIBERAÇÃO IN VITRO DA CS DO SISTEMA MICROEMULSIONADO
O perfil de liberação in vitro de sistemas coloidais contendo fármacos é uma
caracterização físico-química muito importante, pois além de prever a performance in vivo,
pode ser correlacionada à microestrutura do veículo, descrevendo o comportamento
estrutural da formulação em escala microscópica e as possíveis interações entre o fármaco
e o veículo (MORAIS; BURGESS, 2014).
As quantidades de crisina liberadas no meio receptor a partir da MECS, bem
como os percentuais de liberação estão expostos na Tabela 8. A ME proposta liberou a
crisina lentamente ao longo do tempo, tendo em vista que o fármaco se encontra confinado
nas gotículas revestidas pelos tensoativos.
51
Tabela 8 - Quantidades cumulativas liberadas (µg/cm2) e percentual de liberação (%) da crisina em
cada tempo no compartimento doador (n=3).
Tempo
(h)
Quantidade liberada
(µg/cm2) ± DP
Percentual de liberação
(%)
0,25 9,7873 ± 0,39 2,5610
0,5 9,8347 ± 0,26 2,5734
1 10,9420 ± 0,78 2,8632
2 20,7077 ± 0,34 5,4185
4 38,9811 ± 1,03 10,2000
6 68,1784 ± 0,38 17,8400
8 87,5861 ± 1,80 22,9184
10 110,4991 ± 1,02 28,9139
12 119,2779 ± 0,83 31,2110
Onde: DP = Desvio padrão
O perfil de liberação da crisina pode ser observado na figura 11, que representa a
quantidade liberada (µg/cm2) em função do tempo para a MECS ao longo de 12 horas de
ensaio. Graficamente observou-se que a liberação da crisina do veículo microemulsionado
foi contínua-crescente, não havendo a formação de platô, até 12h, após esse período houve
formação de platô e, portanto, o ensaio se limitou a 12h.
52
Figura 11 - Perfil de liberação da crisina (µg/cm2) em função do tempo (h) a partir da MECS.
Fonte: Próprio autor
Análises de regressão linear para os dados de liberação da crisina da ME, foram
utilizadas para determinar a ordem de reação que representasse o melhor modelo cinético.
Inúmeros estudos de investigação sobre a liberação de drogas em ME já foram feitos,
entretanto houveram apenas algumas tentativas para estabelecer um modelo matemático
adequado descrevendo a cinética de liberação (GRASSI et al., 2000). Neste estudo os
principais modelos existentes foram aplicados para os resultados da liberação in vitro,
sendo estes de ordem zero, pseudo primeira ordem (Higuchi), e primeira ordem. A Figura
12 mostra o gráfico resultante da aplicação desses modelos cinéticos aos dados obtidos
pela liberação in vitro da crisina incorporada ao sistema microemulsionado. As equações
da reta e os coeficientes de correlação linear (r) obtidos após o mecanismo de regressão
linear de todos os modelos foram apresentados na Tabela 9. O modelo que possuísse o
maior valor de r foi o selecionado como a ordem de liberação para dar continuidade ao
estudo.
53
Figura 12 – Perfil dos modelos cinéticos testados para a MECS em tampão fosfato pH 7,4.
Fonte: Próprio autor.
Legenda: Os modelos cinéticos testados foram de Ordem Zero (µg/cm2 x tempo), Higuchi (µg/cm2 x raiz do
tempo) e Primeira Ordem (log µg/cm2 x tempo).
Tabela 9 - Determinação da ordem de liberação da crisina do sistema microemulsionado utilizando-se como
parâmetro o coeficiente de correlação (r).
Amostra Modelos
cinéticos Equação da reta
Coeficiente de
correlação linear
(r)
Ordem de
liberação
escolhida
MECS
Ordem zero y = 10,147x + 3,5399 0,9998
Ordem zero Higuchi y = 39,582x - 24,212 0,9748
Primeira ordem y = 0,1013x + 1,0436 0,9617
54
A liberação da crisina da ME seguiu modelo cinético de ordem zero, como visto
na Tabela 9 pelo maior valor de r. O modelo de ordem zero caracteriza um sistema de
liberação que não se desagrega, portanto, o fármaco é liberado lentamente independente da
concentração do fármaco (ALIREZA MORTAZAVI; PISHROCHI; JAFARI AZAR,
2013; COJOCARU et al., 2015; SHAIKH; KSHIRSAGAR; PATIL, 2015). Portanto, os
constituintes da ME, bem como a microestrutura formulada não foram desestruturadas e
permitiram uma liberação lenta da crisina através da matriz da ME, fazendo com que
houvesse ao longo do tempo o desenvolvimento de um perfil de liberação modificada. Este
modelo representa um perfil de liberação ideal para atingir a liberação prolongada de
fármacos, sendo importante principalmente para algumas classes de medicamentos como,
por exemplo, antibióticos, anti-hipertensivos, antidepressivos e analgésicos (PUNDIR;
BADOLA; SHARMA, 2013; SHAIKH; KSHIRSAGAR; PATIL, 2015).
Observado a ordem de reação da liberação da crisina do sistema
microemulsionado conforme demonstrado na Figura 20 e na Tabela 9, foi feita a
determinação matemática da velocidade de liberação do fármaco no estado estacionário, ou
seja, na porção linear (trecho constante do gráfico) dos pontos experimentais selecionados
a partir do tempo de 1 hora, assumindo-se que a partir deste ponto o equilíbrio de difusão
já estaria alcançado, obtendo-se então o fluxo no estado estacionário (Jss), lag time e o
coeficiente de liberação (Kr) (CAVALCANTI et al., 2016; PREMARATHNE;
KARUNARATNE; PERERA, 2016; ROTTKE; LUNTER; DANIELS, 2014).
Tabela 10 - Parâmetros cinéticos obtidos a partir da liberação in vitro da crisina incorporada a ME.
Parâmetros cinéticos MECS
Quantidade liberada após 12h (µg/cm2) 119,2779
% Liberação final 31,2110
Modelo cinético Ordem zero
Fluxo – Jss (µg/cm2 h) 11,218
Lag time (min) 9,78
Coeficiente de liberação – Kr (mg/cm2h) 11,218
55
Os resultados dos parâmetros cinéticos obtidos pela MECS (Tabela 10) mostram
que o valor de fluxo obtido pela crisina contido no veículo microemulsionado foi
considerado satisfatório para estudos in vitro. O lag time para a ME1 foi considerado
baixo, levando pouco tempo para alcançar uma velocidade constante de liberação e, o Kr
demonstrou que em cada tempo (h), 11,218 mg de crisina foi capaz de ser liberada em 1
cm2 da célula, sendo considerado também um resultado satisfatório. Apesar de o ensaio de
liberação in vitro ser apenas um indicativo de desempenho da ME, ele foi considerado
satisfatório, indispensável e esclarecedor para traçar o perfil de influência que os
componentes da ME, bem como a maneira que esta foi estruturada, são capazes de
influenciar na liberação da crisina em membranas artificiais, permitindo uma liberação
prolongada.
5.11 ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA DA MECS UTILIZANDO O
MODELO MECÂNICO DE HIPERALGESIA INDUZIDA POR INFLAMAÇÃO
O modelo de hiperalgesia induzida por carragenina que é um agente inflamatório
é usado para verificar a atividade antinociceptiva em nervos sensitivos (GARCIA et al.,
2004). Este modelo desenvolve uma resposta inflamatória cutânea bifásica no local onde
foi injetada a carragenina, causando um edema e hiperalgesia decorrente da migração
celular e liberação de alguns mediadores inflamatórios (DUTRA et al., 2012). A primeira
fase da resposta (até 2:30h após) envolve a liberação de serotonina e histamina, seguida
pela liberação de bradicinina, mais tardiamente. E a fase tardia (3-6h) decorre da produção
de citocinas e prostaglandinas tanto pelas células do local da inflamação quanto pelo
neutrófilos que infiltraram (WANG et al., 2014; HABIB, WAHEED, 2013).
Pode-se observar (Figura 11) que no teste de hiperalgesia mecânica ocorreram
diferenças significativas em relação ao grupo veículo em todo o período (até as 4h) após a
injeção da carragenina nos grupos tratados com CS e MECS como também em relação ao
grupo Sham (já que este não sofreu a indução por carragenina). O grupo MEB só
apresentou diferença significativa em relação ao veículo 1h após a injeção de carragenina.
56
Figura 13 - Efeito da crisina isolada e em microemulsão na indução de hiperalgesia mecânica por
carragenina.
Fonte: Próprio autor.
Legenda: A intensidade de estímulo (g) no analgesímetro digital necessária para a retirada da pata traseira
dos camundongos foi avaliada 1 h antes (basal) e 1, 2, 3 e 4h após a injeção de carragenina. Os valores de
estímulo para cada grupo foram obtidos de uma média de 8 animais ± desvio padrão. *** Significativamente
diferente do Control (p< 0,001) conforme determinado pela ANOVA seguida pelo pós teste de Tukey.
Os resultados demonstraram que o tratamento com a crisina isolada (CS) e em
microemulsão (MECS) causaram um efeito antinociceptivo após todo o período de 4h após
a injeção da carragenina. Estudos anteriores demonstraram a ação da crisina como
inibidora da Cox -2 tanto em modelos in vitro de inflamação (WOO et al., 2005) quanto
em modelos in silico (RAULF et al., 2015). Diante dos resultados, denota-se que a crisina
pode interagir também com outras vias envolvidas na sinalização da resposta inflamatória e
consequentemente redução da dor. Porém, na primeira hora após a injeção da carragenina,
os animais tratados somente com o MEB também apresentaram um efeito antinociceptivo
significativo, que não se manteve nas próximas horas. Ou seja, um dos componentes da
microemulsão pode estar também interagindo com alguns dos componentes envolvidos no
processo inflamatório. Com isso, de forma a descobrir o motivo pelo qual a crisina reduz a
nocicepção, foram realizadas as dosagens das citocinas inflamatórias.
A dosagem das citocinas (Figura 12) mostrou que o grupo veículo (controle) foi
significativamente diferente do grupo sham tanto na dosagem de TNFα quanto na dosagem
de IL-10. O pré tratamento com a crisina isolada (CS) e em microemulsão (MECS), como
também somente com a microemulsão (MEB) diminuíram significativamente os níveis de
57
TNF α em relação ao grupo veículo CS. O pré tratamento com crisina em microemulsão
aumentou significativamente os níveis de IL-10 quando comparado ao grupo veículo como
também em relação ao grupo MEB, não se observando diferenças significativas entre os
demais grupos.
Figura 14 - Efeito do tratamento com crisina isolada e em microemulsão na produção de citocinas
inflamatórias TNF α (A) e IL-10 (B).
Fonte: Próprio autor.
Legenda: Os dados estão expressos como média ± desvio padrão (n=8). ** Significativamente diferente do
grupo sham (p< 0,01). **** Significativamente diferente do grupo sham (p< 0,0001). # Significativamente
diferente do grupo controle (p< 0,05). ## Significativamente diferente do grupo controle (p< 0,01). a
Significativamente diferente do grupo controle MECS (p< 0,05). Conforme determinado pela ANOVA
seguida pelo pós teste de Tukey.
O TNFα é uma citocina pró inflamatória que é liberado rapidamente na inflamação
e é um dos mais potentes, estimulando a liberação de outros mediadores inflamatórios
(KHAN et al., 2017; LIKHITPANICHKUL et al., 2016). Os resultados demonstram que o
tratamento com a crisina diminui significativamente os níveis de TNF α na pata dos
camundongos após 4h da injeção da carragenina, o que poderia também justificar sua ação
nociceptiva demonstrada no resultado do teste de hiperalgesia mecânica. A crisina em
microemulsão, como também somente a microemulsão reduziram de forma significativa os
níveis de TNFα, o que corrobora com o argumento já apresentado neste trabalho de que a
microemulsão pode estar interagindo com alguns dos componentes da via de sinalização da
resposta inflamatória, neste caso o TNF α.
Por outo lado, somente o grupo tratado com a crisina em microemulsão (MECS)
apresentou um aumento significativo nos níveis de IL-10, tanto em relação ao controle
58
negativo quanto ao grupo tratado somente com a microemulsão (MEB). A IL-10 é uma
citocina anti-inflamatória que atua inibindo macrófagos e monócitos, como também a
produção de citocinas pró inflamatórias, como o TNF α (KHAN et al., 2017; OPAL,
DEPALO, 2000). Neste caso, o resultado demonstra que a microemulsão sozinha não
interagiu com a IL-10, porém quando associada à crisina melhorou o seu efeito anti-
inflamatório, já que a crisina administrada isoladamente não causou alterações
significativas. Então, o aumento da IL-10 pode ser outro mecanismo pelo qual a crisina
produz seu efeito antinociceptivo no modelo apresentado. Contudo, são necessários outros
experimentos para confirmação do mecanismo de ação da crisina na hiperalgesia, como
também da interação da microemulsão com as vias de resposta inflamatória.
59
6. CONCLUSÕES
Após a análise dos resultados, permitiu-se concluir que:
O diagrama de fases pseudoternário se mostrou um método simples, reprodutível e
útil para a escolha do ponto que continha as melhores proporções entre os
componentes utilizados para a formação do sistema microemulsionado;
A incorporação da CS no sistema microemulsionado através da técnica de
emulsificação por ultrassom (sonicação), mostrou-se eficaz, pois permitiu a
formação de um sistema homogêneo, límpido e transparente;
A análise de microscopia de luz polarizada e a determinação do índice de refração
confirmaram o caráter isotrópico da ME proposta;
A ME selecionada mostrou estabilidade adequada diante de estresses térmicos e de
centrifugação;
Os resultados de condutividade elétrica foram testes simples, rápidos e úteis para a
elucidação do tipo de microestrutura presente no sistema proposto, sendo este do
tipo O/A;
O pH da formulação proposta enquadrou-se dentro da faixa de pH ótimo para
permitir o uso por via oral;
Os valores de tensão superficial atingidos pela formulação podem auxiliar no
aumento da biodisponibilidade da CS, sendo esta característica vantajosa para a
formulação MECS;
O método analítico espectrofotométrico desenvolvido e validado demonstrou ser
seletivo, linear, preciso, exato e robusto para a análise do teor de CS presente no
sistema microemulsionado;
O ensaio de eficiência de encapsulação demonstrou que a taxa de CS incorporada a
ME foi satisfatória;
O mecanismo cinético que envolveu a liberação in vitro da CS do sistema
microemulsionado proposto seguiu o modelo cinético de ordem zero;
A MECS apresentou valores de fluxo (J), lag time e de coeficiente de liberação
(Kr) satisfatórios;
A MECS demostrou possuir atividade antinociceptiva no modelo de hiperalgesia
induzida por carragenina. Sendo esta atividade dada pelo aumento dos níveis de IL-
10 e pela prevenção do aumento dos níveis de TNF-α.
60
Deve-se ressaltar a relevância desse trabalho para a área da nanotecnologia farmacêutica
pelo ineditismo da formulação proposta contendo a CS, demonstrando apresentar
características físico-químicas, estruturais e farmacológicas satisfatórias para dar
continuidade a estudos que visem otimizar e valorizar a formulação para que esta possa ser
veiculada, oferecendo mais uma alternativa para o tratamento da nocicepção.
61
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71
ANEXO A - Artigo a ser submetido a revista: Biomedicine & Pharmacotherapy, QUALIS
B1, fator de impacto 2.759.
Development, characterization and anti-hyperalgesic activity of chrysin-loaded
microemulsion in mice
Ízola M. M. Ramalhoa; Elissa Ostroskya, Marcio Ferraria, Jullyana S.S. Quintansb; Fabiolla
R.S. Passosb, Luana Heimfarthb, Lucindo J. Quintans-Júniorb; Bolívar P. G. L.
Damascenoc; Ádley A. N. Limaa*
a Laboratory of Industrial Pharmacy (LEFI), Graduation Program in Pharmaceutical
Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Brazil.
bLaboratory of Neuroscience and Pharmacological Assays (LANEF), Department of
Physiology. Federal University of Sergipe (UFS), São Cristóvão, Brazil.
c Laboratory of Development and Characterization of Pharmaceutical Products (LDCPF),
Graduation Program in Pharmaceutical Sciences, State University of Paraíba (UEPB),
Paraíba, Brazil.
Corresponding author:
* Ádley A. N. Lima
Graduation Program in Pharmaceutical Sciences, Federal University of Rio Grande do
Norte (UFRN), Natal, Brazil, R. General Gustavo Cordeiro de Farias, 384 - Petrópolis,
Natal – RN, Brasil, ZIP CODE: 59012-570. Phone number: +55-84-3342-9845, cellphone
number: +55-84-999288864 *E-mail address: [email protected]
(Á. A. N. Lima).
72
Abstract
Microemulsion containing chrysin, a flavonoid from bee pollen, propolis and passion
flower, was developed and characterized for use as anti-hyperalgesic formulation. The
transparent formulation was developed through a ternary phase diagram. Chrysin-loaded
microemulsion (CS-ME) was composed of 40% Labrasol® as surfactant, 5% of isopropyl
myristate as the oil phase (O) and 55% of water as aqueous phase. It was classified as an
isotropic oil-in-water (O/W) system within nanosized range (74,4 ± 15 nm) and negative
zeta potential (-16,1 ± 1,9 mV) confirmed by polarized light microscopy, and dynamic
light scattering (DLS) analysis. In vitro studies using static diffusion Franz cells revealed
that the release of Chrysin from CS-ME followed the zero-order model. CS-ME oral
administration produced a significantly reduction (p < 0.05) of the mechanical hyperalgesia
induced by carrageenan when compared with control group (vehicle). The treatment with
CS-ME also demonstrated anti-inflammatory activity by significantly (p < 0.01) decreased
TNF-α and increased (p < 0.05) IL-10 paw levels, when compared with control group.
Moreover, the treatments did not produce motor abnormalities. Our results suggested that
this colloidal nanosystem is a promising agent for the delivery of chrysin, increasing its
ability to modulate the inflammatory and nociceptive responses.
Keywords: Microemulsion, drug delivery systems, flavonoid, inflammation, pain,
mechanical hyperalgesia.
Abbreviations:
ANOVA, analysis of variance; CS, chrysin; CS-ME, chrysin loaded microemulsion; DLS,
dynamic light scattering technique; IL, interleukin; IPM, isopropyl myristate; ME,
microemulsion; O/W, oil-in-water; TNF-α, tumor necrosis factor alpha.
73
1. Introduction
Defined as dispersions consisting of oil, surfactant, aqueous phase and, frequently,
cosurfactant, microemulsion systems were discovered in 1943 by Hoar and Schulman who
observed that an opaque emulsion stabilized by a surfactant became clear after titration
with a medium chain length alcohol [1]. According to the ratios of the components,
different microstructures can be formed and influenced by the physicochemical properties
of the used agents and can be classified into three types: oil-in-water, bicontinuos, and
water-in-oil microemulsions [2]. Several advantages are given by microemulsions,
including ease of manufacturing, improvement of drug solubilization, good
thermodynamic stability, protection against enzymatic hydrolysis, enhanced hydrophilic,
hydrophobic, and amphiphilic drug permeation compared to conventional formulations,
enhanced absorption due to surfactant induced permeability and improved bioavailability
of hydrophobic drugs (Kaur and Mehta, 2017; Mouri et al., 2016). Consequently,
microemulsion systems have been extensively investigated for nutraceutical, cosmetic and
pharmaceutical purposes as promising new drug delivery system for hydrophilic, lipophilic
and amphiphilic active molecules [4].
Chrysin (5,7-dihydroxyflavone) is one such flavonoid that forms the main active
component of the Indian trumpet tree (Oroxylum indicum) and passion flower (Passiflora
incarnata) [5]. It is one herbal medicine commonly used in China and other East Asian
countries, and has been officially listed in the Chinese Pharmacopoeia for a long time [6].
Chrysin is regarded as a “Generally Recognized As Safe” (GRAS) by Food and Drug
Administration (FDA) and is commonly used in the U.S. market as a nutraceutical
(WALLE et al., 2001).
Like other flavonoids, it exhibits broad-spectrum of pharmacological effects, including
antioxidant [6], anti-inflammatory [5], antihemolytic [7], anti-tumor [8], hypolipidemic [9],
anti-nociceptive [10] and antihypertension [11] effects. In addition, it is an aromatase
inhibitor (estrogen synthetase) used as a dietary supplement [12,13]. Due to its abundance
in plants, potential pharmacological, and nutritional effects along with low systemic
toxicity, chrysin presents considerable interest as alternatives to conventional therapeutic
drugs. Nevertheless, the use of chrysin as drug is often restricted by its low aqueous
solubility (0.005 mg/ml), which seriously limits its bioavailability [14–16]. Hence,
74
encapsulation into suitable delivery vehicles has been suggested as a method to overcome
this fault.
Inflammation is the response of the body to tissue injury triggered by endogenous
and/or exogenous stimuli. It is characterized by biochemical, vascular and cellular changes
that leads to the activation of cellular e and plasma components of the immune system, to
eliminate the offending agent and restore the homeostasis of the tissue [17]. Hyperalgesia
is one of the main consequences of the inflammatory process that happens through
activation of cytokine cascade resulting in the sensitization of nociceptive primary sensory
neurons [18–20]. The currently available pharmacological therapies act through different
mechanisms and are widely used to treat inflammatory symptoms. However, especially in
the long-term treatment, they cause relevant side effects. Therefore, new therapeutic
options to treat inflammatory pain are constantly under investigation [17,21]. In this
context, the ability of certain flavonoids to inhibit pro-inflammatory stimuli could be
useful in the treatment of several acute and chronic inflammatory diseases and nociceptive
sensitivity [10]. Thus, flavonoids, as chrysin, are potent inhibitors of oxidative stress, they
can act such as membrane stabilizers, inhibitors of inflammatory cytokines and ameliorate
anti-inflammatory cytokines, so they are promising pharmacological tools for the
management of inflammatory and neurogenic pain [22,23].
As far as systems for drug delivery are concerned, and pro-inflammatory responses and
regulation of nociceptive sensitivity share common pathways, the aims of the present study
were to develop a new chrysin-loaded microemulsion system (CS-ME), characterize the
physicochemical parameters and investigate the in vitro release and antihiperalgesic
activity of chrysin and CS-ME in mice.
2. Material and methods
2.1 Material
Chrysin (Sigma-Aldrich, São Paulo, Brazil), isopropyl myristate (IPM) (Farmos, Rio de
Janeiro, Brazil), Caprylocaproyl Polyoxyl-8 glycerides (LAS™) (Brasquim, São Paulo,
Brasil) and carrageenan (Sigma, St. Louis, USA).
2.2 Construction of ternary phase diagrams
In order to find out the ratio of components for the area of microemulsion existence,
ternary phase diagrams were constructed using water titration method at 25 ºC [24].
Isopropyl myristate was used as the oil phase, Caprylocaproyl Polyoxyl-8 glycerides
75
(LAS™) as the surfactants and osmosed water as the aqueous phase. Oil phase and
surfactant blends were mixed carefully in different weight ratios of 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5,
6:4, 7:3, 8:2 and 9:1 (%w/w). Each mixture was gradually titrated drop-wise with osmosed
water followed by a sonication cycle for 1 min using a Vibracell™ 75041 ultrasonifier
(750 W, 20 kHz, Fisher Bioblock Scientific, France) equipped with a 13 mm horn (CV33)
at 40% amplitude. After bubbles be removed in an Ultrasonic Cleaner™ (Unique, Brazil)
and the mixtures be equilibrated during two minutes, the appearances were assessed by
visual observation (naked eye) and determined as being microemulsions, crude emulsions
or phase separation. The results were plotted using Software Origin Pro 8.0. Based on this
diagram, appropriate ratio of oil, surfactant and water were selected for the preparation CS-
ME.
2.3 Preparation of CS-ME
CS-ME were prepared at desired component ratios. Due to chrysin lipophilic character,
it was added to the mixtures of oil and surfactant. Then water was added to the mixture
followed by three sonication cycle for 1 min using a Vibracell™ 75041 ultrasonifier
(750 W, 20 kHz, Fisher Bioblock Scientific, France) equipped with a 13 mm horn (CV33)
at 40% amplitude. After each cycle of ultrasonication bubbles were removed in an
Ultrasonic Cleaner™ (Unique, Brazil).
2.4 Characterization of ME
2.4.1 Macroscopic appearance
Aspects such as color, homogeneity, transition of clear system to opaque, and the
presence of precipitates or phase separation were evaluated 24 hours after obtaining the
microemulsion by visual observation.
2.4.2 Determination of chrysin content and encapsulation efficiency into
microemulsion
The chrysin concentrations were determined by UV spectrophotometric method using a
UV/VIS spectrophotometer (Evolution 60 S, Thermo Scientific, EUA) and the absorptions
were measured at 269 nm. CS-ME was diluted (1/250) in ethanol to determine the chrysin
total content (Ct) in the microemulsion and expressed in mg of chrysin/ml of
microemulsion [25]. To measure the encapsulation efficiency (EE, %), 1 g of CS-ME was
centrifuged at 15000 g for 30 min to remove the undissolved chrysin. A fixed amount of
supernatant was diluted (1/250) to a suitable concentration with ethanol and the content of
76
chrysin existed in supernatant was called the concentration of encapsulated drug (Ce). The
EE (%) was calculated using Eq. (1) (Li et al., 2015).
EE (%) = (Ce/Ct) x 100 (1)
Where EE (%) represents encapsulation efficiency, Ce represents concentration of
encapsulated drug and Ct represents chrysin total content.
2.4.3 Physico-chemical parameters
The measurements of prepared ME systems were carried out after 24 h of production.
Conductivity, pH and refractive indices averages were measured using a conductivity
meter (Logen, Brazil), a pH meter (model HI 221, Hanna instruments, Brazil) and an Abbe
refractometer (Analytik Jena AG, Germany), respectively. Surface tension assay was
carried out using a SensaDyne tensiometer (model QC-6000, Research Corp., USA)
employing the maximum pressure bubble technique, using nitrogen as gas phase. The
tensiometer was connected to a computer and controlled by the SensaDyne Tensiometer
software, version 1.21. All physico-chemical parameters were conducted at room
temperature (25 ºC) in triplicate.
2.4.4 Polarized light microscopy
The isotropic behavior of the system was evaluated using a cross-polarized light
microscopy (BX-50, Olympus Start, Tokyo, Japan). A drop of the sample was placed on a
glass slide, which was covered with a cover slip and then examined under a polarized light
microscope.
2.4.5 Droplet size and zeta potential
The mean droplet size, the zeta potential (ξ), and the polydispersity index (PDI) of the
prepared ME were determined using dynamic light scattering (DLS) with the Zetasizer
Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., France). The samples were diluted in NaCl (1 mM)
for the zeta potential. All measurements were made in triplicate, at room temperature
(25°C ± 1 °C) with a 633 nm standard laser using 90 degrees scattering optics.
2.4.6 Thermodynamic stability
To estimate the thermodynamic stability of ME systems, the following tests were
conducted. Stable ME systems should persist as a single phase isotropic transparent
system, have no cracking, no phase separation and absence of creaming, after the tests
[27,28].
2.4.6.1 Centrifuge stress test
77
The ME formulations were centrifuged at 15000 g for 30 min and the appearance of
turbidity or phase separation was observed.
2.4.6.2 Freeze thaw cycle stress test
The formulated ME systems were submitted to 3 cycles of freeze-thawing. They were
kept to frozen at -20 ºC in a deepfreeze and allowed to thaw to room temperature (25 ºC)
after 24 h.
2.4.6.3 Heating and cooling cycles
Formulations were subjected to three cycles of heating for 24 h at 37 ºC and then cooled
naturally to room temperature (25 ºC).
2.5 In vitro drug release assay
The in vitro release study was conducted with the aid of a Franz diffusion cell. The
effective diffusion surface area and receptor compartment mean volume was, respectively,
0.785 cm2 and 12 ml. Synthetic cellulose acetate membranes (0,45 µm, Millipore, Brazil)
were washed in phosphate buffer pH 7.4 for 2h before being mounted between the
compartments. Ethanol and water solution (1:1) was used as receptor fluid to assure sink
conditions (the concentration of drug in the medium represents ≤10% of the saturation
solubility). This medium was constantly stirred and maintained at 37 ± 0.5 ◦C in order to
ensure a body temperature on the surface of the membrane. After placement of the
cellulose acetate membranes on the Franz diffusion cell, 0. 3 ml of CS-ME formulation
was placed in the donor chamber and sealed with paraffin film to mitigate the
environmental disturbances. Successful sink conditions can be achieved by refilling the
receptor solution after withdrawing it in the receptor compartment at predefined periods of
time and stirring with a magnetic stirrer at a speed of 300 rpm. Therefore, 1 ml of the
receptor solution was withdrawn continuously in predefined time intervals of 0.25; 0.5; 1;
2; 4; 6; 8; 10 and 12 hours, and then refiled. The amount of drug penetrated through the
membrane was measured in a spectrophotometer under the same conditions described
previously. All release studies were conducted in triplicate and release rate parameters
were compared using a one-way ANOVA at a 95% confidence interval.
All release studies were conducted in triplicate and release rate parameters were
compared using a one-way ANOVA at a 95% confidence interval.
The cumulative amount of chrysin released was calculated using surface exposed area
(µg/cm2) and data were plotted as a function of time. Release drug percentage was
determined using Eq. (2) [29]:
78
Drug release (%) = Rt/L x 100 (2)
Where Rt represents the cumulative amount of chrysin released at time t, and L represents
the initial amount of chrysin in the ME.
2.5.1 CS-ME release kinetic model
The release data was fitted in XY plots to various kinetic release models including zero
order (µg/cm2 versus time), Higuchi (µg/cm2 versus square root of time) and first order
(log of µg/cm2 versus time). A linear regression analysis was done and the mathematical
model with the highest coefficient of linear correlation (r) was selected to better express
the release profile. The flux of chrysin across synthetic membranes (J) was calculated by
linear regression of the steady-state graphic (linear portion of the slope) (Cavalcanti et al.,
2016; Premarathne et al., 2016). The lag time corresponded to the intercept obtained when
the steady state line was extrapolated to the time axis. The release coefficient was
calculated by dividing the release rate (J) by the initial drug concentration in the vehicle
according to Eq. (3) [30]:
Kr = Jss/Co (3)
where Kr is the release coefficient, Jss is the steady state flux and Co is the initial drug
concentration in the formulation.
2.6 CS-ME anti-hyperalgesic activity
2.6.1 Animals
The experiments were performed with adult male albino Swiss mice (25-30 g) obtained
from the Animal Facilities of the Federal University of Sergipe (UFS). The mice were
randomly maintained in appropriated polypropylene cages at constant room temperature
(21 ± 2°) under a 12-hr light/dark cycle (lights on from 06:00 a.m. to 06:00 p.m.) with
access to food and tap water ad libitum. The experimental groups of mice (n=8) were
acclimatized for at least 2 h before and used only once. The tests were developed during
the light phase of the cycle. The experimental protocols were approved by the Animal Care
and Use Committee at the Federal University of Sergipe (CEPA/UFS # 67/16). All efforts
were made to minimize suffering of the animals and its number used. Behavioral protocols
were performed blindly.
2.6.2 Carrageenan-induced inflammation
79
The mice were divided into five groups. In all the groups, except in the sham group, the
acute inflammation was induced in the right hind paw by subcutaneous injection of 50µL
of 1% solution of carrageenan (dissolved in saline) 30 minutes after drugs oral
administration. The sham group was not treated, Chrysin group was treated with chrysin
25mg/kg, CS-ME group was treated with microemulsion chrysin (in the same dosage) and
the negative controls groups Control and Blank-ME were treated, respectively, with saline
solution and microemulsion without chrysin.
2.6.2.1 Carrageenan-induced mechanical hyperalgesia
Mechanical hyperalgesia was assessed using a digital analgesimeter (InsightTM).
Constantly increasing force was applied to the right hind paw until the mice withdrew their
hind paws or “flinch”. Behind the paw withdrawal, the intensity of the force (g) was
registered automatically. Four measurements were taken in each animal (with an interval
of 5 minutes) to obtain an average expressed in grams. The measures were made before the
carrageenan injection to characterize the baseline response as well at 1, 2, 3 and 4 h after
induction.
2.6.2.2 Cytokines assays
After four hours of carrageenan injection, the same animals were euthanized and the
right hind paw skin was removed and stored at -80 °C. The skin tissues were homogenized
in 200µL of phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) containing EDTA (0.3%), nonidete P
40 (0.5%) and protease inhibitors. The samples were centrifuged at 8000 rpm for 10 min at
4 °C, and the supernatant obtained was diluted for the protein dosage. The protein content
was measured using the Bradford method. Concentrations of TNF-α and IL-10 levels were
measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (eBioscienceTM)
according to protocol's instructions and colorimetric measurements at 450 nm were made
in a microplate reader (ASYSTM). The concentration was obtained by interpolation from a
standard curve. All results were expressed as picograms (pg) of cytokine per milligram
(mg) of total protein.
2.6.3 Statistical analysis
The statistical analyses were performed using GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Prism
Software Inc., San Diego, CA, USA). The obtained data were assessed by one-way
80
analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test for antinociceptive and anti-
inflammatory activities. Differences were considered significant if p < 0.05.
3. Results and discussion
3.1 Ternary phase diagram and preparation of chrysin loaded microemulsion
(CS-ME)
In order to obtain the most appropriate proportions of the components to form
microemulsion systems, ternary phase diagrams were constructed for the oil, surfactant and
aqueous phase as showed in Fig. 1. After visual observation, several types of systems were
formed and classified as being microemulsions, crude emulsions or phase separation.
Based on the results, the percentage composition (w/w) from the microemulsion region to
form our microemulsion system were 5 % for oil phase, 40% for the surfactant and 55%
for the aqueous phase. To ensure a maximum level of encapsulation, the drug should be
incorporated into the formulation before it is completely ready [31]. Therefore, chrysin was
initially incorporated in the blend of oil and surfactant phase during the microemulsion
system development process to obtain CS-ME.
3.2 Characterization of ME
3.2.1 Macroscopic appearance chrysin content and microemulsion encapsulation
efficiency
The obtained CS-ME presented itself as an optically clear, homogeneous and
transparent system, slightly yellow colored, without any precipitate or phase separation
phenomena. The chrysin content and the mean EE were 1 mg/ml and 97,7 %, respectively.
Regarding the chrysin solubility in water (0.005 mg/ml), the microemulsion allowed to
increase the drug concentration about 200-fold in an aqueous dispersion. Values of EE
above 80% are satisfactory for a ME system, meaning that the EE achieved for CS-ME by
incorporating it into the formulation before it is completely ready was an efficient method
of incorporation [31].
3.2.2 Physicochemical parameters and polarized light microscopy
The physicochemical parameters of CS-ME such as, conductance, pH and refractive
index were 24,66 ± 0,25 µS.cm-1, 4,48 ± 0,10 and 1,3894 ± 0,0001, respectively. The
electrical conductivities of the O/W ME systems exhibit much higher values than those of
W/O ME formulations. Therefore, the conductivity of CS-ME attest that it is a O/W ME
system. When water is in the continuous phase it shows more ionic conductivity in the
81
O/W ME whereas the W/O ME having oil as the continuous phase shows significantly less
values for conductivity [32]. The biologically accepted pH range for oral route is from 2 to
10, hence the measurement of pH shows that CS-ME pH is into the accepted range for oral
administration (Strickley and Oliyai, 2007). The refractive indices do not exhibit
significant difference after being measured repeatedly for consecutive times. A low surface
tension of 40.53 ± 1.8 dynes/cm was obtained for the CS-ME, which was mainly due to the
high concentration of non-ionic surfactants in the ME which lowers the surface tension at
the oil-water interface [33,34]. Such a low CS-ME surface tension can help to increase the
bioavailability of the drugs by improving the permeation through gastrointestinal hydration
layer [3]. In addition, when the CS-ME was observed under a polarized light microscope, it
appeared as a completely dark field (data not shown). Together, refractive indices and
polarized light microscope results implied CS-ME optically isotropic nature, typical of
microemulsions systems [29].
3.2.3 Droplet size and zeta potential
Dynamic light scattering analysis were carried out with blank-ME and CS-ME to
determine the apparent average size of the droplets, IPD and zeta potential (mean ±
standard deviation). Microemulsions were monodisperse, the mean value obtained for
drug-free ME the average diameter was 61,1 ± 10,3 nm with IPD of 0,378 ± 0,1, and for
the formulation with the drug was 74,4 ± 15,8 nm with IPD of 0,313 ± 0,09. The zeta
potentials of the ME solutions were - 10 ± 2,1 and - 16,1 ± 1,9 mV for blank-ME and CS-
ME, respectively. The addition of chrysin to the proposed system resulted in the increase
of the zeta potential when compared to zeta potential of blank-ME. This effect can indicate
that chrysin was interacting with the surfactant monolayer changing its potencial, therefore
it was probably not only confined into the aqueous droplets, but also present at the oil-
water interface [29].
3.2.4 Thermodynamic stability
The stability of ME formulation was initially evaluated from the appearance of the ME
as a homogeneous, transparent (translucent) liquid dispersion of single phase without
aggregation, precipitation, creaming or separation in to two phases for a reasonable time
period. Thermodynamic stability tests were performed and CS-ME was found to be
persistent as a stable transparent single phase for more than 3 months after subjecting to
the stability tests indicating that the selected formulation had good physical stability. This
82
might be attributed to formulation with very low interfacial tension between water and oil
phases, and small droplet size made the system thermodynamically stable [35].
3.3 In vitro drug release assay and MECS release kinetics
In vitro release profiles of colloidal drug delivery systems are one of the most important
physicochemical characterization, because besides predicting in vivo performance, the in
vitro release properties may be correlated to the carrier microstructure. Therefore, it can
describe both the structural behavior of the formulation on a microscopic scale and
possible drug/carrier interactions. This may enable a predictive approach to be made to
formulation design to achieve desired properties [36]. In this study, in vitro drug release
studies were used to evaluate the ability of the vehicle to release the drug and to find out
the speed at which this phenomenon occurs. The release of chrysin from ME was
continuous, slowly released and growing up to 12 h without burst effect and with plateau
formation after 12hours (Fig. 3). This release profile probably happened due to the
confinement of the drug in droplets coated by surfactant monolayer and/or by its
thermodynamic activity or partitional capacity between the oil and aqueous phases [37].
The amount of chrysin released from ME was 31,21%. Linear regression analysis was
done to determine the best kinetic model, which reflected the drug release. Three different
models, zero order (µg/cm2 versus time), Higuchi (µg/cm2 versus square root of time) and
first order (log of µg/cm2 versus time) were tested. The correlation coefficients obtained
were 0,9998, 0,9748 and 0,9617 for zero order, Higuchi and first order model, respectively.
Comparisons between these different correlation coefficients revealed that the chrysin
release profile from ME followed zero order model [29].
The zero-order model characterizes a drug delivery system that does not disaggregate,
the active substance being released slowly, independent of the initial drug concentration
[38–40]. This model represents an ideal release profile in order to achieve the prolonged
pharmacological action. Such models are important in certain classes of medicines
intended, example for antibiotic delivery, heart and blood pressure maintenance, pain
control and antidepressant [40,41].
The steady state flux of the selected release profile was 11.218 µg/cm2h. Lag time for
CS achieve a constant rate of release from the ME was 9.78 min, which is considered a
short time. Kr was calculated using flux and the initial drug concentration, reaching a value
of 11.218 mg/cm2h. The in vitro release test evaluated the ability of the vehicle to release
the drug incorporated into the system, although the in vitro release studies are just an
83
indication of the CS-ME behavior, it was considered a satisfactory and necessary method
to show the role of the ME components and the microstructure in the release of CS in
artificial membranes. Therefore, flux, lag time and Kr values obtained from CS-ME were
considered promising for further studies.
3.4 CS-ME antinociceptive activity
The hyperalgesia induced by intraplantar injection of CG (an irritant to induce a
transient inflammation) is widely used for evaluating of new anti-inflammatory and anti-
hyperalgesic compounds in pre-clinical models [42]. Thus, edema (swelling),
hypersensitivity to a noxious stimulus (hyperalgesia), or sensitivity to a nonnoxious
stimulus (allodynia) can be used to assess inflammation in an animal model after
administration of CG. Moreover, the CG administration induces the development of the
cardinal signs of inflammation, the result of the action of pro-inflammatory agents
(especially the increase of pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, IL-6, and TNFα),
complement and reactive oxygen and nitrogen species [43]. The inflammation occurs in a
biphasic cutaneous reaction on the injected area, the first phase (up to 2 h later) leads the
release of serotonin and histamine, followed by the later release of bradykinin. The second
phase (3-6 h) happens through the production of cytokines and prostaglandins by both the
local cells and infiltered neutrophils [44–46]. The release of prostanoids and
sympathomimetic amines, stimulate peripheral Aδ and C fiber sensory nerve terminals,
ergo, this neurogenic inflammation contributes for the resultant peripheral and central
hyperalgesia [44].
Administration of CS-ME and chrysin (25mg/kg dose) produced a significantly
reduction (p < 0.05) in the mechanical hyperalgesia induced by CG when compared with
control, and the sham group over all time (up to 4 h), (Fig. 3). The blank-ME group
showed significant difference from the control group only after 1 hour of CG induction.
Previous reports have demonstrated that chrysin inhibits COX-2 by both in vitro and in
silico inflammation models [10,47]. The results of this study denote that chrysin might be
involved in others paths of the inflammatory cascade, consequently reducing the
mechanical hyperalgesia. However, after 1 hour of carrageenan induction, the animals
treated with blank-ME also showed a significant (p < 0.05) antinociceptive effect. In other
words, one of the ME constituents could also be interacting with any components involved
in the inflammatory process.
84
Additionally, recent finds shown that chrysin was able to effectively alleviate oxidative
insults and apoptosis in primary rat mesencephalic cultures and also produced a protective
effect against brain damage induced by chronic cerebral hypoperfusion in rodents [48].
These neuroprotective and anti-inflammatory effects appear to be associated with the
antioxidant profile of chrysin, as well as to ability to reduce inflammatory mediators (such
as NF-κB p65 unit, TNF-α, IL-1β and IL-6) [49].
Anti-hyperalgesic effect effects of CS-ME and chrysin on the tested inflammatory pain
model induced by CG may be associated with the regulation of inflammatory cytokine
levels. Here, we measured TNF-α and IL-10 measures to help the understanding of the
chrysin activity mechanism.
The pro-inflammatory and anti-inflammatry cytokines (TNF-α and IL-10, respectively)
mensuration showed that the control group was significantly (p < 0.05) different from
sham group (Fig. 4). The treatment with CS-ME and chrysin, as also with blank-ME,
reduced significantly (p < 0.05) the TNF α levels in the mouse paw in relation to the
control group after 4 hours of CG injection (Fig. 4). TNF-α is one of the key cytokines in
the control of inflammation and is responsible for important effects of the repair process
[50]. It is the first to be released after an inflammatory stimulus, such as the carrageenan
injection, leading the increase of the COX and PGE2 expression, which is mediated by the
TNFR1 and TNFR2 receptors. TNF-α also induces the neutrophils migration to the injury
site by indirect mechanisms, such as the induction of the chemotactic factors release
through the resident macrophages and the leukotriene pathway stimulation [51,52]. Thus,
the TNF-α reduction can help to explain the anti-hyperalgesic activity showed in the
mechanical hiperalgesia test. Interestingly, once not only chrysin and CS-ME, but also
blank-ME were able to reduce TNF-α levels significantly, this corroborates with our
hypothesis that the microemulsion itself may be interacting with the components of
inflammatory responses, here suggested through of TNF-α levels inhibition [53].
Moreover, chrysin significantly (p < 0.05) improves levels of IL-10 when compared to
the control group, this has been curiously demonstrated for group treated with CS-ME, so
there were no significant differences between the other groups (Fig. 4). IL-10 is one of the
most intriguing anti-inflammatory cytokines because inhibits not only macrophages and
monocytes, but also the production of pro-inflammatory cytokines, such as TNF-α [51,54].
Thereby, IL-10 levels results demonstrate that neither chrysin alone, nor blank-ME had
significant effects on IL-10 reduction. Nevertheless, the CS-ME was able to improve
85
chrysin anti-inflammatory activity and IL-10 enhancement seems to have a pivotal role.
Thus, the increase of IL-10 is another factor contributing to chrysin produces its anti-
hyperalgesic effect showed in CG-induced inflammatory pain model. Moreover, further
experiments are required to confirm the mechanism of action of chrysin in management of
hyperalgesia, as well as the interaction of the microemulsions with the inflammatory
response pathways.
4. Conclusions
Together, the results presented in this paper have demonstrated that ME systems can be
obtained from a simple procedure, herein was developed a microemulsion containing
chrysin. The formulation was able to incorporate the very poor water-soluble flavonoid
into the oil droplets of the O/W ME type and release it from this nanocarrier following a
zero-order kinetic model, thus highlighting the potential of the new systems mainly as
carriers for the prolonged and controlled delivery of hydrophobic drugs. In addition, CS-
ME could improve chrysin (a usual nutraceutical) anti-hyperalgesic and anti-inflammatory
activities. These effects might be mediated, at least in part, through inhibition of TNF-α
and also by upregulation of IL-10. These findings to the potential therapeutic value of
chrysin on inflammatory pain suggest in-depth assessment of the therapeutic value of
chrysin as a newsworthy analgesic for a broad spectrum of inflammatory painful
conditions. Therefore, CS-ME could be a promising nanoscale agent for the treatment of
inflammatory painful clinical conditions due to be noninvasive, painless and easy to apply,
controlled released, enhancing the patient compliance for the treatment which can even act
by reducing side-effects.
Disclosure
The authors report no conflicts of interest in this work.
Acknowledgments
The authors would like to acknowledge the financial support from the CAPES, CNPq and
FAPITEC/SE.
86
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91
Legends
Fig 1. Ternary phase diagrams formed by a mixture of IPM as the oil phase, LASMT as
surfactant and water as aqueous phase. Gray area represents the microemulsion (ME)
systems region. The red dot represents the selected formulation.
Fig 2. In vitro chrysin release profiles from microemulsion through synthetic cellulose
acetate membranes.
92
Fig. 3 The effect of chrysin and CS-ME (25 mg/kg) and blank-ME on the mechanical
hyperalgesia induced by carrageenan. All treatments were done 30 min before carrageenan
injection. The intensity of the force (g) registered using a digital analgesimeter needed to
the mice withdrew their hind paws or “flinch” was determined 1 hour before (baseline),
and 1, 2, 3, and 4 hours after carrageenan injection. These results are expressed as mean ±
SEM of (n=8): *** p< 0.001 vs. the control (one-way ANOVA followed by Tukey’s test).
93
Fig. 4 The effect of chrysin and CS-ME (25 mg/kg) and blank-ME on the inflammatory
cytokines TNF α (A) and IL-10 (B) production. These results are expressed as mean ±
SEM (n=8): ** p< 0.01 vs. the sham group; **** p< 0.0001 vs. the sham group; # p< 0.05
vs. control group; ## p< 0.01 vs. control group; a p< 0.05 vs. blank-ME (one-way ANOVA
followed by Tukey’s test).
94
ANEXO B - Patente depositada no Instituto Nacional de Propriedade Intelectual (INPI) -
BR 10 2017 002920 4: Desenvolvimento de microemulsão com crisina para aplicação
antinociceptiva.
Pedido nacional de Invenção, Modelo de Utilidade, Certificado deAdição de Invenção e entrada na fase nacional do PCT
00.000.2.2.16.0846414.2
14/02/201787017000971812:16
Número do Processo: BR 10 2017 002920 4
Dados do Depositante (71)
Depositante 1 de 3
Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica
CPF/CNPJ: 24365710000183
Nacionalidade: Brasileira
Endereço: CAMPUS UNIVERSITÁRIO S/N
Cidade: Natal
Estado: RN
CEP: 59072-970
País: Brasil
Telefone:
Fax:
Email: [email protected]
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Petição 870170009718, de 14/02/2017, pág. 1/20
Depositante 2 de 3
Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica
CPF/CNPJ: 13031547000104
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa
Endereço: Cidade Universitária, Rua Professor José A. Campos, s/n, JardimRosa Elze
Cidade: São Cristóvão
Estado: SE
CEP: 49100-000
País: BRASIL
Telefone:
Fax:
Email:
Depositante 3 de 3
Nome ou Razão Social: UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA
Tipo de Pessoa: Pessoa Jurídica
CPF/CNPJ: 12671814000137
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Jurídica: Instituição de Ensino e Pesquisa
Endereço: Rua Baraúnas, nº 351, Bairro Universitário
Cidade: Campina Grande
Estado: PB
CEP: 58429-500
País: BRASIL
Telefone:
Fax:
Email:
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Petição 870170009718, de 14/02/2017, pág. 2/20
Dados do Pedido
Natureza Patente: 10 - Patente de Invenção (PI)
Título da Invenção ou Modelo deUtilidade (54):
DESENVOLVIMENTO DE MICROEMULSÃO COM CRISINA PARAAPLICAÇÃO ANTINOCICEPTIVA
Resumo: A presente patente de invenção refere-se ao processo de obtençãode microemulsões com a crisina para aplicação na áreafarmacêutica. A crisina destaca-se por seu potencial farmacológico,entretanto seu uso é limitado pela sua baixa absorção ebiodisponibilidade. Assim, esta patente propõe a utilização da crisina,com óleo e tensoativo para a formação de uma microemulsão, paraaplicação antinociceptiva, de uso humano e veterinário.
Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 14/02/2017 às12:16, Petição 870170009718
Petição 870170009718, de 14/02/2017, pág. 3/20
Inventor 1 de 4
Nome: ÁDLEY ANTONINI NEVES DE LIMA
CPF: 99328976472
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Rua da Campina, nº 140, Condomínio Verano Ponta Negra, Apto.2004, Ponta Negra
Cidade: Natal
Estado: RN
CEP: 59090-480
País: BRASIL
Telefone: (84) 999 288864
Fax:
Email: [email protected]
Inventor 2 de 4
Nome: LUCINDO JOSÉ QUINTANS JÚNIOR
CPF: 93096143404
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Avenida Murilo Dantas, nº 1409, Edifício Elias Santos, Apto. 401,Farolândia
Cidade: Aracaju
Estado: SE
CEP: 49032-490
País: BRASIL
Telefone: (79) 988 015026
Fax:
Email: [email protected]
Inventor 3 de 4
Dados do Inventor (72)
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Petição 870170009718, de 14/02/2017, pág. 4/20
Nome: BOLÍVAR PONCIANO GOULART DE LIMA DAMASCENO
CPF: 91616751487
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Professor do ensino superior
Endereço: Avenida Marechal Floriano Peixoto, nº 5255, Condomínio Serraville -P-12
Cidade: Campina Grande
Estado: PB
CEP: 58434-500
País: BRASIL
Telefone: (83) 991 370168
Fax:
Email: [email protected]
Inventor 4 de 4
Nome: ÍZOLA MORAIS DE MEDEIROS RAMALHO
CPF: 06961036481
Nacionalidade: Brasileira
Qualificação Física: Mestrando
Endereço: Rua João Joviano Medeiros, nº 350 C, Distrito Industrial
Cidade: Campina Grande
Estado: PB
CEP: 58411-235
País: BRASIL
Telefone: (83) 998 568818
Fax:
Email: [email protected]
NomeTipo Anexo
Relatório Descritivo Relato´rio Descritivo.pdf
Reivindicação Reivindicac¸o~es.pdf
Resumo Resumo.pdf
Documento de Cessão Termo de Cessa~o.pdf
Comprovante de pagamento de GRU 200 Comprovante de pagamento.pdf
Documentos anexados
Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 14/02/2017 às12:16, Petição 870170009718
Petição 870170009718, de 14/02/2017, pág. 5/20
Acesso ao Patrimônio Genético
Declaração Negativa de Acesso - Declaro que o objeto do presente pedido de patente de invençãonão foi obtido em decorrência de acesso à amostra de componente do Patrimônio GenéticoBrasileiro, o acesso foi realizado antes de 30 de junho de 2000, ou não se aplica.
Declaro, sob as penas da lei, que todas as informações acima prestadas são completas everdadeiras.
Declaração de veracidade
Esta solicitação foi enviada pelo sistema Peticionamento Eletrônico em 14/02/2017 às12:16, Petição 870170009718
Petição 870170009718, de 14/02/2017, pág. 6/20
1/6
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “Desenvolvimento de Microemulsão com Crisina para Aplicação Antinociceptiva”. [001] A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de
microemulsão contendo crisina para aplicação farmacológica. Em particular,
refere-se à utilização do flavonoide crisina (5, 7-dihidroxiflavona) encontrado
em várias espécies de plantas, incluindo espécies do gênero Pelargonium,
Passiflora e da família Pinaceae, incorporado em microemulsão, a fim de se
obter uma alternativa farmacológica para aplicação antinociceptiva, anti-
inflamatória, antitumoral, antiestrogênica, ansiolítica e antioxidante.
[002] A dor é um sintoma geral e característico de várias doenças, as quais,
usualmente, envolvem mais de um tipo de dor. Entretanto, o controle da dor
permanece como um importante problema clínico, uma vez que os
mecanismos envolvidos no processo que gera a dor ainda não são bem
elucidados, o que culmina com a dificuldade de descoberta e escassez de
tratamentos efetivos e seguros. Portanto, há a necessidade de pesquisa sobre
um novo, seguro e efetivo tratamento utilizando, por exemplo, produtos
naturais derivados de metabólitos secundários como a crisina.
[003] O estudo e a utilização de diversos metabólitos secundários de plantas,
veiculados em novas formas farmacêuticas, têm se tornado alvo de estudos
devido à descoberta de suas propriedades farmacológicas com mecanismos
de ação não convencionais. Embora estas moléculas, geralmente, apresentem
problemas de baixa absorção e biodisponibilidade, sua utilização é justificada
devido à grande variedade de atividades farmacológicas desempenhadas por
estas, dentre elas a antinociceptiva.
[004] A Organização Mundial da Saúde (OMS) incentiva a utilização de
produtos naturais cientificamente validados, evidenciando a importância de
estudos de desenvolvimentos tecnológicos para que haja o alargamento no
arsenal terapêutico e uma maior eficácia.
[005] Neste contexto, novas formas farmacêuticas capazes de otimizar a
farmacoterapia têm se tornado alvo de estudos. As microemulsões são um
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exemplo de novos sistemas carreadores de fármacos com grande potencial de
aplicabilidade na área farmacêutica, sendo as mesmas definidas como uma
monodispersão de gotículas esféricas constituída por óleo, tensoativo,
cotensoativo e fase aquosa, opticamente isotrópicas e termodinamicamente
estáveis. Apresentam tamanho médio de gotícula de 100 nm a 200 nm,
conforme medido através de técnicas de espalhamento de luz dinâmica.
[006] As microemulsões oferecem maior facilidade de preparação devido à
formação espontânea, estabilidade termodinâmica, aparência transparente e
elegante, carregamento de fármaco aumentado, penetração aumentada
através das membranas biológicas e biodisponibilidade aumentada. Uma das
propriedades mais importantes das microemulsões é a capacidade de
formação de um filme interfacial, o qual tem a potencialidade de baixar a
tensão interfacial entre a água e o óleo de maneira a estabilizar esta dispersão
com tamanho de gotícula de fase interna extremamente pequeno. Esta
estabilização favorece o aumento da solubilidade e a incorporação de
substâncias pouco solúveis, justificando a incorporação destes compostos,
que, como a crisina, são dificilmente incorporadas a formulações convencionais
e favorecem o surgimento do efeito farmacológico almejado, neste caso o
efeito antinociceptivo.
[007] Em relação ao estado da técnica, a utilização deste sistema promissor
para a veiculação da crisina e a sua aplicação para o tratamento da dor, não é
conhecido, pois ainda não há estudos publicados demonstrando o seu grande
potencial e utilização. [008] Algumas patentes trazem o uso da crisina para diversos fins
farmacológicos e cosméticos. A patente brasileira PI 0400669-0 traz um
produto para uso via parenteral, preferencialmente via intradérmica, para
tratamento de estrias, tanto em homens como mulheres, o qual compreende
formulações à base de inibidores da aromatase P450 e/ou bloqueadores total
ou parcial de receptor de estrógeno, particularmente Luteolina e a Crisina.
[009] Já na patente KR 20160013226 (A) a crisina é veiculada em formulação
cosmética para alívio dos processos inflamatórios, rejuvenescimento da pele e
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hidratação. Enquanto que na patente aqui referida a crisina é veiculada em
uma microemulsão para o tratamento da dor.
[010] Na patente CN 105055401 (A), a crisina e seus derivados são utilizados
com ação antiparasitária contra o cryptosporidium parvum causador da
criptosporidíase, para a qual a crisina apresentou bom potencial de inibição da
reprodução do parasito.
[011] A patente CN 103405408 (A) traz a aplicação da crisina em
medicamentos para o tratamento da trombose cerebral. A crisina apresentou
um bom potencial de proteção do nervo em injúrias cerebrais de
isquemia/reperfusão.
[012] Já a patente CN 102793712 (A) traz a aplicação da crisina em
medicamentos para o tratamento de doenças autoimunes, sendo estes
capazes de inibir o sistema imune e passíveis de serem utilizados para o
tratamento de doenças como a esclerose múltipla.
[013] O artigo de AISHWARYA, V. et. al (2015) “Preparation, characterization
and in-vitro cell viability assay of chrysin loaded solid lipid nanoparticles as drug
delivery system”, traz a encapsulação da crisina em nanopartículas lipídicas
sólidas (NLS), obtidas através da técnica de temperatura de inversão de fases,
a qual também pode ser utilizada para obtenção de emulsões, microemulsões
ou nanoemulsões, contudo os autores objetivaram a produção de NLS. As
NLS diferem das microemulsões tratadas na patente em questão no que diz
respeito ao método de obtenção (aqui obtidos através de diagrama de fases
pseudo-ternário; lá através da técnica de temperatura de inversão de fases), a
composição da formulação (aqui composta por água deionizada, miristato de
isopropila, e o tensoativo não-iônico PEG-8 glicerídeos cáprico/caprílico; lá
ácido esteárico, lecitina, taurocolato, tensoativos, e água destilada), as
proporções dos componentes, ao tamanho de gotículas (aqui 100-200 nm; lá
>200 nm), ao estado físico (aqui líquido, lá sólido) e, principalmente na
aplicação do produto final. No artigo de AISHWARYA, V. et. al (2015) foi
analisada a citotoxicidade das nanopartículas, sugerindo através de seus
resultados a continuidade de estudos para sua aplicação na doença de
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Alzheimer. Na patente em questão, os estudos de atividade in vivo são
voltados ao potencial antinociceptivo da crisina e do produto final, a
microemulsão.
[014] Também há artigos publicados que relatam o potencial antinociceptivo
da crisina através de testes, como o de formalina, o das contrações abdominais
induzidas por ácido acético e o de imersão de cauda, os quais obtiveram
resultados positivos para o alívio da dor em ratos (FARKHONDEH et al., 2015;
K. ZHAI, L. HU, J. CHEN, C. FU, 2008; RAUF et al., 2015). A diferença
primordial entre os artigos e a patente em questão é que nos artigos foi testada
a atividade antinociceptiva da crisina, enquanto que, na presente invenção, foi
testada a atividade e desenvolvida uma forma farmacêutica inovadora para sua
utilização e veiculação, conforme esclarecido anteriormente.
[015] Contudo, até o presente momento, não há nenhum sistema, em especial
os sistemas microemulsionados, com o agente de interesse da presente
invenção, em particular para explorar a sua atividade antinociceptiva, com a
capacidade de aumentar a solubilidade, biodisponibilidade, estabilidade e
eficácia na utilização para fins terapêuticos e/ou cosméticos.
[016] A utilização de microemulsões para veiculação de compostos com
potencial ação antinociceptiva é apresentada pela patente PI 0609023-0 A2, a
qual traz um derivado de naftaleno incorporado a uma microemulsão a ser
administrada, preferencialmente, por via oral para tratamento ou prevenção de
dor crônica; e pela patente BR 10 2013 010984-3 A2, a qual traz uma
microemulsão do extrato de Angico Branco para administração oral e
tratamento da dor orofacial.
[017] Ambas invenções supracitadas auxiliaram no aumento da dissolução,
na liberação modificada e no aumento da biodisponibilidade dos princípios
ativos, com a consequente melhora da atividade farmacológica antinociceptiva.
Desta forma, apresenta-se viável a incorporação da crisina em microemulsão
para tratamento da dor.
[018] Desta forma, o objeto da presente invenção refere-se ao processo de
obtenção de microemulsão contendo crisina a fim de conferir maior
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permeabilidade, biodisponibilidade, estabilidade e eficácia na utilização
farmacológica, facilitando, assim, seu emprego no ramo farmacêutico para o
uso antinociceptivo produzida através de tecnologias simples e de baixo custo.
[019] Com relação à forma de obtenção das microemulsões contendo crisina,
estão compreendidas as seguintes etapas:
a) Os sistemas microemulsionados (do tipo óleo-em-água) serão obtidos
através de diagrama de fases pseudo-ternário a partir da mistura dos
componentes (água deionizada, óleo sintético e tensoativo);
b) Na preparação da microemulsão o tensoativo não-iônico PEG-8
glicerídeos cáprico/caprílico ou outros tensoativos não iônicos com EHL
na faixa 8-16 (30% a 40%), a fase oleosa, o miristato de isopropila (3% a
10%), e a crisina (0,05% a 1%) são misturados por agitação em
sonicador ou agitação magnética por um período de 1 minuto a 5
minutos, seguido de banho de ultrassom;
c) Posteriormente, adiciona-se água (50% a 60%) à mistura de óleo,
tensoativos e princípio ativo; por fim, submete-se à agitação em
sonicador ou à agitação magnética por um período de 1 minuto a 5
minutos, seguido de banho de ultrassom.
[020] Uma variável do procedimento é a concentração ou a substituição dos
componentes da microemulsão. No que diz respeito aos constituintes da
microemulsão é possível o uso de tensoativos catiônicos, aniônicos, anfóteros
ou não-iônicos (sendo preferencialmente os não-iônicos), óleo (de origem
sintética ou natural). Quanto ao método de obtenção, esta pode ser obtida
através do método de formação espontânea, porém, não se limitando o uso de
demais métodos para a formação da microemulsão. Para a verificação de
estabilidade, as microemulsões são submetidas a teste de centrifugação,
estresse térmico e ciclo gelo-degelo.
[021] A caracterização físico-química desse sistema é de extrema importância,
pois quanto maior o número de informações sobre o produto obtido, tais como
propriedades físico-químicas, propriedades termodinâmicas e padrões de
cristalinidade, melhor é a compreensão dos mecanismos envolvidos na
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compatibilidade entre os componentes da formulação e estabilidade do produto
formado. A microemulsão é caracterizada físico-quimicamente por Calorimetria
Exploratória Diferencial, condutividade, pH, índice de refração, Microscopia de
luz polarizada, reologia, tamanho de gotícula e análise morfológica por
Microscopia Eletrônica de Varredura. Já os ensaios in vitro são bastante úteis
na predição do desempenho do sistema, como a quantidade do fármaco
liberada ou que permeia as membranas biológicas. Por fim, através dos testes
in vivo como o teste de formalina, teste das contrações abdominais induzidas
por ácido acético e do teste de imersão de cauda, é possível atestar o potencial
antinociceptivo da formulação.
[022] As microemulsões com a crisina possuem conjectura satisfatória, pois
através destes sistemas é possível conferir à crisina maior permeabilidade,
biodisponibilidade, estabilidade e eficácia, além de poder melhorar as
atividades de inibição da aromatase P450, anti-inflamatória, antiparasitária,
antitrombótica, imunossupressora e antinociceptiva. Assim, as microemulsões
podem ser utilizadas em formulações farmacêuticas com ação antinociceptiva,
com aplicação humana e veterinária por via oral ou parenteral.
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REIVINDICAÇÕES
1. Desenvolvimento de Microemulsão com Crisina para Aplicação Antinociceptiva, caracterizado por um novo modelo para sistema de
veiculação de compostos com atividade farmacológica, do flavonoide
crisina (5, 7-dihidroxiflavona) encontrado em várias espécies de plantas,
incluindo espécies do gênero Pelargonium, Passiflora e da família
Pinaceae, contudo não limitando o uso de outras espécies, sendo a
microemulsão obtida através das seguintes etapas:
a) Os sistemas microemulsionados (do tipo óleo-em-água) serão
obtidos através de diagrama de fases pseudo-ternário a partir da
mistura dos componentes (água deionizada, óleo sintético e
tensoativo);
b) Na preparação da microemulsão o tensoativo não iônico PEG-8
glicerídeos cáprico/caprílico ou outros tensoativos não iônicos
com EHL na faixa 8-16 (30% a 40%), a fase oleosa, o miristato
de isopropila (3% a 10%) e a crisina (0,05% a 1%) são
misturados por agitação em sonicador ou agitação magnética
por um período de 1 minuto a 5 minutos, seguido de banho de
ultrassom;
c) Posteriormente, adiciona-se água (50% a 60%) à mistura de
óleo, tensoativos e princípio ativo; por fim, submete-se à
agitação em sonicador ou à agitação magnética por um período
de 1 minuto a 5 minutos, seguido de banho de ultrassom.
2. Desenvolvimento de Microemulsão com Crisina para Aplicação Antinociceptiva, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por
apresentar, dentre outros constituintes da microemulsão, tensoativos
catiônicos, aniônicos, anfóteros ou não-iônicos (sendo preferencialmente
os não-iônicos), óleo (de origem sintética ou natural) obtido através do
método de formação espontânea, porém, não se limitando o uso de
demais métodos para a formação da microemulsão.
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3. Desenvolvimento de Microemulsão com Crisina para Aplicação Antinociceptiva, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado
por ser utilizada em formulações farmacêuticas com ação
antinociceptiva, com aplicação humana e veterinária por via oral ou
parenteral.
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RESUMO
Patente de invenção para “Desenvolvimento de Microemulsão com Crisina para Aplicação Antinociceptiva”.
A presente patente de invenção refere-se ao processo de obtenção de
microemulsões com a crisina para aplicação na área farmacêutica. A crisina
destaca-se por seu potencial farmacológico, entretanto seu uso é limitado pela
sua baixa absorção e biodisponibilidade. Assim, esta patente propõe a
utilização da crisina, com óleo e tensoativo para a formação de uma
microemulsão, para aplicação antinociceptiva, de uso humano e veterinário.
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