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Universidade Federal de Ouro Preto

Escola de Farmácia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - CiPharma

NANOPARTICULAS BIOADESIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO

INTRAMAMÁRIA: DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FISICO-

QUÍMICA, CINÉTICA DE LIBERAÇÃO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA EX VIVO

Raquel Gomes Castanheira

Ouro Preto

2012

Universidade Federal de Ouro Preto

Escola de Farmácia

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - CiPharma

NANOPARTICULAS BIOADESIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO

INTRAMAMÁRIA: DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO FISICO-

QUÍMICA, CINÉTICA DE LIBERAÇÃO E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA EX VIVO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas da

Escola de Farmácia da Universidade Federal de

Ouro Preto, como requisito essencial à obtenção

do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientadora: Profa. Dra. Vanessa Carla F.

Mosqueira

Co-orientador: Dr. Humberto de Melo Brandão

Ouro Preto

2012

iii

Este trabalho contou com a colaboração de:

Dra. Margareth Spangler de Andrade

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC - MG

Dr. José Mario Carneiro Vilela

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC – MG

iv

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho aos meus pais e minhas irmãs, pelo amor, amizade e por orientarem

minhas decisões e sempre me apoiarem nos caminhos que decidi trilhar.

Ao Alan, pelo imenso amor, dedicação e apoio.

v

AGRADECIMENTOS

Agradeço à professora Vanessa pela orientação inteligente e consciente e por estar sempre

disposta e paciente para sanar minhas dúvidas. Obrigada pela confiança em meu trabalho e pela

amizade.

À Escola de Farmácia de Ouro Preto pelo ensino gratuito e de qualidade e aos professores

do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, pela contribuição em minha formação.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG pela bolsa

concedida para a realização deste trabalho e à Rede NANOBIOMG/FAPEMIG pelo apoio

financeiro.

Ao Humberto de Mello Brandão, da Embrapa-Gado de Leite, pela orientação, auxilio na

realização de experimentos e fornecimento de materiais para execução deste trabalho.

À Dra. Margareth Spangler, pela possibilidade de realização dos experimentos de

microscopia de força atômica (MFA) no Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC) e aos Dr.

José Mário Vilela, pela grande colaboração na execução e análise das imagens obtidas por MFA.

Ao laboratório de Farmacotécnica da UFMG, aos professores Lucas Antônio Miranda

Ferreira e Mônica Cristina de Oliveira e ao aluno de doutorado Guilherme Carneiro, pela permissão

e auxílio no uso do equipamento Zetasizer.

Aos professores Ieso e Rogélio e à Zezé do LBCM, que tiveram a gentileza de fornecer

parte do nitrogênio líquido deste trabalho.

Aos colegas do laboratório, Bruno, Renata, Carina e Alessandra com quem vivi muitos

momentos de alegria e amizade.

Em especial agradeço às amigas e colegas de laboratório Giani e Líliam, pela grande

amizade construída nesses dois anos e por me divertirem mesmo nos momentos mais difíceis,

fazendo tudo parecer possível. Agradeço também à Líliam pela constante orientação em meus

experimentos, sempre contribuindo significativamente em meus resultados – sem seu auxílio eu não

teria finalizado meu trabalho.

Às alunas de iniciação científica Larissa, Carol e Mari, pelo auxílio nos experimentos.

À Raquel Araújo, pela amizade a auxilio na orientação dos meus experimentos, me

auxiliando a dar continuidade ao trabalho iniciado por ela.

Aos funcionários do CiPharma, porteiros, moças da limpeza e à Mirela e Fátima,

secretárias muito importantes na nossa pós-graduação.

Agradeço às minhas grandes amigas, de muitos anos: Ana Flávia, Carlinha, Cacá, Fafá,

Neca e Nath, pelo carinho, amizade e momentos divertidos.

vi

Às minhas amigas da graduação Nilda, Monique e Marcela, pela grande amizade

construída, pelo apoio e carinho mesmo quando estão distantes.

À minha amiga de longa data Gersiane, por estar ao meu lado há tantos anos, tornando a

vida mais leve e bonita.

Aos amigos Luciene e Jaspion e aos seus lindos filhos Maria Clara e André, que deram um

novo sentido aos meus dias nesses últimos dois anos, me alegrando em muitos momentos difíceis.

Obrigada Lu pelo apoio e pelas conversas e por me permitir amar uma família tão especial.

Às minhas primas-irmãs Alice e Elisa, pela grande amizade e união.

Aos meus avós, Alarico, Selvita e Maria Sylvia, pelo amor e confiança. E ao meu avô

Paulo, a quem enxergo através do meu pai, por guiar meus passos e olhar por mim há tantos anos.

Aos meus pais e minhas irmãs pelo amor, paciência, dedicação, generosidade e apoio em

absolutamente tudo que eu já fiz e ainda quero fazer na vida. Ao minha mãe, pelo amor sem limites,

meu pai pelo exemplo de força e caráter. À minha irmã Laura, pelo exemplo profissional e pela

generosidade.

À minha irmã Luciana e meu querido cunhado Duavesso, pelo apoio, amizade, carinho e

pelos ótimos momentos vividos.

Ao Alan, uma bênção que recebi em minha vida, meu grande amor, pela amizade, carinho,

cumplicidade, dedicação e por estar ao meu lado em qualquer situação.

A toda minha família, pela grande união e amor que nos envolve e por saber que posso

contar sempre com vocês. Em especial aos tios João e Natércia, grandes amigos.

Aos meus padrinhos tio Ricardo e tia Fatinha, pelo amor, preocupação e amizade e por

acreditarem na minha capacidade e aos seus filhos, em especial à Carol, pela amizade. Em especial

agradeço à tia Fatinha pelo exemplo de garra, força, fé e superação.

A todas as demais pessoas que participaram dessa importante etapa da minha vida.

E acima de tudo, agradeço a Deus e a nossa senhora auxiliadora por terem me ajudado a

seguir em frente nos momentos mais difíceis.

vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................. X

LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. XIV

LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ XVI

RESUMO .............................................................................................................................. XVIII

ABSTRACT ................................................................................................................................. 22

INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 24

INTRODUÇÃO GERAL .............................................................................................................. 2

REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................................... 5

1 - SISTEMAS VETORIZADOS ...................................................................................................... 5

2 - POLÍMEROS UTILIZADOS NO PREPARO DE NANOPARTÍCULAS ............................................. 9

2.1 - Poli-ε-caprolactona..................................................................................................... 9

2.2 - Quitosana .................................................................................................................. 10

3 - MASTITE E APLICABILIDADE DE NANOPARTÍCULAS EM VETERINÁRIA ............................. 12

4 - CLOXACILINA BENZATINA .................................................................................................. 15

5 - LIOFILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ................................................................................ 17

6 - CRIOPROTETORES ............................................................................................................... 19

OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 21

OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................... 21

CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 22

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCÁPSULAS E

NANOESFERAS BIOADESIVAS ................................................................................................. 22

1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................... 23

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................ 23

3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 24

3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 24

3.2 PREPARO DAS NANOPARTÍCULAS ...................................................................................... 24

3.3 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE CLOXB EM DIFERENTES MEIOS .......................... 26

3.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS .......................................... 26

viii

3.4.1 Distribuição de tamanho .......................................................................................... 26

3.4.2 Potencial Zeta (ζ) ..................................................................................................... 28

3.4.3 Análise morfológica das nanopartículas .................................................................. 29

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS ................................................................................... 30

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 31

3.1 PREPARO DAS NANOPARTÍCULAS ...................................................................................... 31

3.2 DETERMINAÇÃO DA SOLUBILIDADE DE CLOXB EM DIFERENTES MEIOS .......................... 31

3.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS ............................................ 32

3.3.1 Distribuição de tamanho .......................................................................................... 32

3.3.2 Potencial Zeta (ζ) ..................................................................................................... 40

3.3.3 Análise morfológica das nanopartículas .................................................................. 41

CAPÍTULO II - PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCÁPSULAS E

NANOESFERAS CONTENDO CLOXACILINA BENZATINA E ESTUDO EM MODELO

DE PERFUSÃO DE ÚBERE BOVINO ISOLADO...................................................................... 48

1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 49

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 49


3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 50

3.2 PREPARO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS ......................... 50

3.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE FÁRMACO ENCAPSULADO .................................................. 51

3.3.1 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ............................................................ 51

3.4 ANÁLISE VISUAL E FOTOMICROGRAFIA DE NANOPARTÍCULAS .................................... 53

3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS NANOPARTÍCULAS .............................................................. 53

3.6 SOLUBILIDADE DA CLOXB EM PBS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE LEITE .............. 53

3.7 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE LIBERAÇÃO IN VITRO ................................................... 54

3.8 INTERAÇÃO DE NANOCÁPSULAS COM A GLÂNDULA MAMÁRIA EM MODELO DE PERFUSÃO

DE ÚBERE BOVINO ISOLADO .......................................................................................................... 56

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 58

4.1 PREPARO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOPARTÍCULAS ......................... 58


4.2.1 Porcentagem e Eficiência de encapsulação ............................................................. 62

4.3 ANÁLISE VISUAL E DE MICROSCOPIA ÓPTICA DAS NANOPARTÍCULAS .............................. 65

ix

4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS NANOPARTÍCULAS .............................................................. 68

4.5 SOLUBILIDADE DA CLOXB EM PBS COM DIFERENTES QUANTIDADES DE LEITE .............. 74

4.6 DETERMINAÇÃO DA CINÉTICA DE LIBERAÇÃO IN VITRO ................................................... 75

CAPÍTULO III - LIOFILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ............................................. 83

1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................ 84

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 84


3.1 MATERIAIS ......................................................................................................................... 85

3.2 PREPARO DE NANOPARTÍCULAS ......................................................................................... 85


3.6 ANÁLISE MORFOLÓGICA DE FORMULAÇÕES LIOFILIZADAS ............................................. 87

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 88

4.1 LIOFILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ................................................................................ 88

4.1.1 Tamanho médio de nanopartículas liofilizadas ....................................................... 88

4.1.2 Determinação do teor de fármaco encapsulado ...................................................... 94

4.1.3 Análise morfológica de nanopartículas liofilizadas ................................................. 98

CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 107

ANEXO I .................................................................................................................................... 110

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 114

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática de nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) poliméricas: a)

fármaco dissolvido no núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c)

fármaco retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na

matriz polimérica das NS (adaptado de Schaffazick et al., 2003a). ... Erro! Indicador não definido.

Figura 2: Representação esquemática do polímero poli-ε-caprolactona (PCL)Erro! Indicador não

definido.

Figura 3: Representação esquemática do polímero quitosana (QUI) . Erro! Indicador não definido.

Figura 4: Representação esquemática das junções oclusivas .............. Erro! Indicador não definido.

Figura 5: Esquema da glândula mamária bovina (Sandholm et al., 1995)Erro! Indicador não

definido.

Figura 6: Estrutura química da Cloxacilina Benzatina (CloxB) ......... Erro! Indicador não definido.

Figura 7: Representação esquemática de um liofilizador e do processo de secagem (adaptado de

Araújo,2009). ...................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 8: Estrutura química da sacarose (a) e da glicose (b) .............. Erro! Indicador não definido.

Figura 9: Etapas do Preparo de Nanocápsulas e Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na

solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O solvente e o

excesso de água são evaporados.*No preparo de nanoesferas não são adicionados óleo e tensoativo

hidrofóbico. ......................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 10: Esquema representativo da dupla camada elétrica ............ Erro! Indicador não definido.

Figura 11: Representação esquemática da constituição de nanoesferas (a) e nanocápsulas

bioadesivas (b). ................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 12: Representação esquemática da organização do tween 80 entre as fases aquosa e orgânica

(a). Adaptado de Baldursdottir et al, 2011. Estrutura química do tween 80 (b).Erro! Indicador não

definido.

Figura 13: Estrutura química do Span 80 ............................................ Erro! Indicador não definido.

Figura 14: Estrutura química do Epikuron 170® ................................ Erro! Indicador não definido.

Figura 15: Imagens de MFA de nanoesferas brancas, altura (a) e fase (b). Escaneamento de 5 μm x

5 μm. Z range: 200nm. É demonstrada a estrutura esférica das nanoesferas, com superfície irregular.

............................................................................................................. Erro! Indicador não definido.

Figura 16: Imagens de fase de MFA de nanoesferas brancas. Escaneamento de 5 x 5 μm. É possível

visualizar a forma esférica das partículas e sua superfície irregular. .. Erro! Indicador não definido.

xi

Figura 17: Imagens de MFA de nanoesferas brancas em zoom, altura (a), fase (b) e amplitude (c).

Escaneamento de 1.2 μm x 1,2 μm. Z range: 200 nm. É destacada a superfície irregular da

nanoesfera. .......................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 18: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando altura

das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h= 4,9.Erro! Indicador não

definido.

Figura 19: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, altura (a) e imagem de fase (b).

Escaneamento de 3 μm x 3 μm. Z range: 200 nm. .............................. Erro! Indicador não definido.

Figura 20: Imagem em 3D de nanocápsulas brancas analisadas por MFA. Escaneamento de 5 x 5

μm. Z range: 200nm. ........................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 21: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, imagem de fase (a) e amplitude (b) de

amostras preparadas em superfície de parafilm. Escaneamento 5 μm x 5 μm.Erro! Indicador não

definido.

Figura 22: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando altura

das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h = 7,1.Erro! Indicador não

definido.

Figura 23: Representação esquemática das dosagens de CloxB nas formulações de NC e NS para

determinação de porcentagem e eficiência de encapsulação. ............. Erro! Indicador não definido.

Figura 24: Representação esquemática da extração de CloxB em amostras de leite.Erro! Indicador

não definido.

Figura 25: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NS recém-preparadas e

após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2

meses (p<0,05) utilizando teste ANOVA............................................. Erro! Indicador não definido.

Figura 26: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NC recém-preparadas e

após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2

meses (p<0,05) utilizando teste ANOVA............................................. Erro! Indicador não definido.

Figura 27: Fotografia de nanoesferas, com destaque para a formação de precipitado provocado pelo

aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NsC (1,0 mg/mL de CloxB) e (b) NsG (7,0

mg/mL de CloxB). .............................................................................. Erro! Indicador não definido.

Figura 28: Fotografia de duas nanoesferas, comparando duas formulações com a mesma

composição, mas com diferentes concentrações de fármaco. (a) NsC contendo 1,0 mg/mL de

CloxB, sem precipitado aparente e (b) NsF contendo 5,0 mg/mL de CloxB, com precipitado

aparente. .............................................................................................. Erro! Indicador não definido.

xii

Figura 29: Fotografia de nanocápsulas, com destaque para a formação de precipitado provocado

pelo aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NcC (1,0 mg/mL de CloxB), (b) NcG

(7,0 mg/mL de CloxB) e (c) NcI (10,0 mg/mL de CloxB). ................ Erro! Indicador não definido.

Figura 30: Fotomicrografia de nanoesferas, em que é possível comparar uma NsC em que não há

formação de precipitado (a) e uma NsG em que há formação de precipitado (b). Destaca-se a

visualização de agregados, atribuídos às nanopartículas e ao fármaco, na imagem b. ................ Erro!

Indicador não definido.

Figura 31: Fotomicrografia de nanocápsulas, em que é possível observar cristais, atribuídos à

precipitação da CloxB. (a) NcG e (b) NcI. ......................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 32: Imagem de MFA de nanoesferas, altura (a) e imagem de fase (b). Escaneamento 10 μm x

10 μm. Z range: 200 nm. Observa-se grande número de partículas com tamanhos variados. ..... Erro!


Figura 33: Imagem de altura de MFA de nanoesferas contendo 0,5 mg/mL de CloxB (a) e perfil

topográfico (b) demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e

verdes).Relação d/h = 5,1. ................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 34: Imagem tridimensional de nanocápsulas contendo 0,5 mg/mL de CloxB analisadas por

MFA. Escaneamento de 5 x 5 μm. Z range: 200nm. .......................... Erro! Indicador não definido.

Figura 35: Imagens de MFA de fase de NS destacando escurecimento das NP com a passagem

sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10 μm. Z range: 341 nm.Erro! Indicador não

definido.

Figura 36: Imagem MFA de NS, fase, destacando a superfície irregulares da NS com 0,5 mg/mL de

CloxB e seu escurecimento pela passagem sucessiva da sonda (a, b, c). Escaneamento 1,5 μm x 1,5

μm. Z range: 341 nm. .......................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 37: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB, destacando

escurecimento das NP com a passagem sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10

μm. Z range: 400 nm. .......................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 38: Imagem de MFA de NC contendo 1,0 mg/mL de CloxB (a) e perfil topográfico (b)

demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e verdes). Relação

d/h = 7,5. ............................................................................................. Erro! Indicador não definido.

Figura 39: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS em

condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS). Gráfico maior = tempos de 0 a

2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos. ............... Erro! Indicador não definido.

Figura 40: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS+ 70%

leite em condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS+leite). Gráfico maior =

xiii

tempos de 0 a 2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos.Erro! Indicador não

definido.

Figura 41: Interação de NC em modelo de perfusão de úbere bovino. Glândula mamária fixada em

suporte de metal para experimento ex vivo (a), cortes histológicos representativos de tecido

mamário em microscopia de campo brilhante (b1 e c1) e de fluorescência (b2 e c2). Corte de tecido

controle (sem NC) (b1 e b2) e cortes de tecido da glândula mamária a 5, 10 e 15 cm da base do teto

após 6 horas de administração intramamária de NC de quitosana contendo CloxB (c1 e c2). As setas

vermelhas indicam os ductos galactóforos. Destaca-se a fluorescência visualizada em todos os

cortes de 5, 10 e 15 cm, demonstrando presença de NC nas regiões tanto proximais quanto distais

da base do teto. Barra = 0,15mm. ....................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 42: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NS com 1,0 mg/mL de CloxB.

Destaque para as estruturas esféricas tanto antes (a e b) quanto após a liofilização (c e d).

Escaneamento 20 μm x 20 μm (a e b) e 10 μm x 10μm (c e d). Z range: 500 nm (a e b) e 1000nm (c

e d)....................................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Figura 43: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NS liofilizadas e ressuspendidas em água,

destacando manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose, sobre as quais estão depositadas

algumas NS . Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm. ............ Erro! Indicador não definido.

Figura 44: Imagens de MFA de altura de NS liofilizadas, após ressupensão em água, destacando

manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose. Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm.


Figura 45: Imagem tridimensional de NS analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).

Destaque para a diferença de topografia das NS, com essas “mergulhadas” em crioprotetor (b),

sendo possível visualizar somente as pontas das NS. Escaneamento de 10 x 10 μm. Z range: 200nm.


Figura 46: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB.


Escaneamento 15 μm x 15 μm (a e b) e 10 μm x 10 μm (b e c). Z range: 500 nm (a e b) e 2000nm (c

e d). Destaca-se a formação de nuvem de crioprotetor sob as NC (d). Erro! Indicador não definido.

Figura 47: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).

Destaque para a diferença de topografia das NC, com aparente achatamento de algumas das

partículas após liofilização (b). Escaneamento de 15 x 15 μm. Z range: 500nm.Erro! Indicador

não definido.

Figura 48: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC liofilizadas e ressuspendidas em água,

destacando aproximação das partículas, sem agregação/fusão. Escaneamento 3 x 3 μm. Z range:

1500 nm............................................................................................... Erro! Indicador não definido.

xiv

Figura 49: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA após a liofilização. Não ocorre

agregação das NC devido ao recobrimento pela sacarose. Escaneamento de 3 x 3 μm. Z range:

1500nm................................................................................................ Erro! Indicador não definido.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de Kanwar et

al., 2011) ............................................................................................. Erro! Indicador não definido.

Tabela 2: Efeito das concentrações de polímeros no tamanho médio de nanoesferasErro! Indicador

não definido.

Tabela 3: Efeito da presença de Tween 80 no tamanho médio de nanoesferasErro! Indicador não

definido.

Tabela 4: Efeito do Volume final de solvente no preparo das NP no tamanho médio de NS ..... Erro!


Tabela 5: Comparação do tamanho médio de nanocápsulas em relação à variação na concentração

de polímeros PCL e Quitosana............................................................ Erro! Indicador não definido.

Tabela 6: Efeito do tipo de surfactante hidrofílico no tamanho médio de nanocápsulas ............. Erro!


Tabela 7: Efeito do tipo de óleo e concentração do surfactante hidrofóbico no tamanho médio de

NC ....................................................................................................... Erro! Indicador não definido.

Tabela 8: Comparação das propriedades de tamanho de nanocápsulas em relação à variação do tipo

de óleo e variação da concentração de surfactante hidrofóbico .......... Erro! Indicador não definido.

Tabela 9: Potencial zeta de formulações estáveis de NC e NS brancasErro! Indicador não

definido.

Tabela 10: Tamanho médio de NS e NC brancas analisadas por ECF e MFAErro! Indicador não

definido.

xv

Tabela 11: Efeito das variações de concentrações de Cloxacilina Benzatina no tamanho das NS


Tabela 12: Efeito da concentração de Cloxacilina Benzatina no tamanho de NCErro! Indicador

não definido.

Tabela 13: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NS com variadas

concentrações de CloxB ...................................................................... Erro! Indicador não definido.

Tabela 14: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NC com variadas

concentrações de CloxB ...................................................................... Erro! Indicador não definido.

Tabela 15: Tamanho médio de NS e NC com 1,0 mg/mL de CloxB analisadas por ECF e MFA


Tabela 16: Solubilidade da CloxB em diferentes meios ..................... Erro! Indicador não definido.

Tabela 17: Modelização dos mecanismos de liberação de fármacos a partir de sistemas poliméricos

de liberação controlada considerando as diferentes geometrias ......... Erro! Indicador não definido.

Tabela 18: Parâmetros cinéticos de liberação resultantes da aplicação dos modelos matemáticos de

Higuchi e Korsmeyer-Peppas aos dados de liberação da CloxB a partir de NC e NS. ............... Erro!


Tabela 19: Formulações liofilizadas com variadas concentrações de crioprotetoresErro! Indicador

não definido.

Tabela 20: Variação do tamanho médio e índice de polidispersão de nanoesferas congeladas a -80ºC

ou a -196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.Erro! Indicador

não definido.

Tabela 21: Tamanho médio e índice de polidispersão de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou a -

196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetoresErro! Indicador não

definido.

Tabela 22: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanoesferas congeladas a -80ºC ou a -

196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetoresErro! Indicador não

definido.

Tabela 23: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou a

-196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetoresErro! Indicador não

definido.

Tabela 24: Medida de potencial zeta de nanopartículas antes e após a liofilizaçãoErro! Indicador

não definido.

xvi

LISTA DE ABREVIATURAS

ζ – Potencial zeta

% D – Porcentagem dissociada

% NL – Porcentagem não liberada

CaCl2 – Cloreto de Cálcio

xvii

CO2 – Dióxido de Carbono

H2O - Água

KCl – Cloreto de potássio

MgCl2 – Cloreto de Magnésio

NaCl – Cloreto de sódio

NaH2PO4 – Diidrogenofosfato de sódio

NaHCO3 – Hidrogenocarbonato de sódio (Bicarbonato de sódio)

O2 – Gás oxigênio

ANOVA – Análise de Variância

ALD – Anemometria do Laser Doppler

CETEC-MG - Centro Tecnológico de Minas Gerais

CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência

CLOXB - Cloxacilina benzatina

DAD – Detector de Arranjo de Diodos

D/h – Relação diâmetro/altura

DL50 – Dose letal para 50% do grupo estudado

DNA – Ácido desoxirribonucléico

DP – Desvio padrão

ECF – Espectroscopia de correlação de fótons

EE – Eficiência de encapsulação

FITC – Fluoresceína isotiocianato

HPLC – “High Performance Liquid Chromatography” ou cromatografia líquida de alta

eficiência

IP – índice de polidispersão

LDH – Lactato desidrogenase

MFA – Microscopia de Força Atômica

mV - millivolts

MM – Massa molar

NC – Nanocápsulas

NP - Nanopartícula

Nc G – Nanocápsulas contendo glicose como crioprotetor

Nc S – Nanocápsulas contendo sacarose como crioprotetor

NS – Nanoesferas

Ns G – Nanoesfera contendo glicose como crioprotetor

xviii

Ns S – Nanoesfera contendo sacarose como crioprotetor

QUI – Quitosana

PBS – Tampão fosfato salino

PCL – Poli-e-caprolactona

PCL-NP – Nanopartícula de poli-ε-caprolactona convencional

PCL-QUIT-NP – Nanopartícula de poli-ε-caprolactona revestida com quitosana

PLGA – Ácido poli-lático-co-glicólico

pH – Potencial hidrogeniônico

PI – Índice de polidispersão

PLA – Ácido polilático

p/v – Porcentagem peso por volume

PVA – Ácido polivinílico

rpm – Rotações por minuto

xix

RESUMO

xix

Este trabalho trata do desenvolvimento farmacotécnico e da caracterização físico-química de

formulações nanoestruturadas destinadas ao encapsulamento de cloxacilina benzatina, um

antimicrobiano de uso veterinário. Objetivou-se a otimização de formulações estáveis de

nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) contendo o polímero poli-ε-caprolactona (PCL) e revestidas

com quitosana (QUI), um polímero com carga positiva, a fim de se obter uma formulação com

capacidade bioadesiva de administração intramamária da cloxacilina benzatina (CloxB). A

distribuição de tamanho médio das nanopartículas (NP) e o índice de polidispersão foram

determinados por espectroscopia de correlação de fótons e a morfologia por microscopia de força

atômica. A carga superficial foi determinada por anemometria de laser Doppler associada à

microeletroforese. A associação do fármaco às nanoestruturas e a cinética de liberação in vitro

foram determinados por duas diferentes técnicas de diálise e o fármaco quantificado por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As suspensões de nanocápsulas e de nanoesferas

foram preparadas pelo método de deposição interfacial de polímeros pré-formados seguido de

evaporação do solvente, conhecido como nanoprecipitação. Foram avaliadas as influências de

polímeros (quitosana e poli-ε-caprolactona), de tensoativos (lecitina e tween 80), do tipo de óleo e

do volume final sobre as características físico-químicas das suspensões coloidais. Foram obtidas

formulações de nanopartículas estáveis e monodispersas no encapsulamento da CloxB. A variação

na proporção de polímeros (0,5-2,0% de PCL e 0,05-1,0% de QUI) e a ausência de surfactantes

conduziram a uma alteração significativa no tamanho das partículas. Para as NP otimizadas foi

observado que o aumento na concentração do fármaco influencia significativamente (p<0,05) sua

carga superficial (variação de +52 a -3,5 mV para NS e de +41,3 a -28,2 mV para NC) e leva a uma

redução na estabilidade da partícula e aumento do tamanho médio (variação de 230,8 a 897,2 nm

para NS e de 263,7 a 429,1nm para NC). Essa alteração na carga superficial compromete a

estabilidade da suspensão coloidal e induz a agregação. A encapsulação máxima de CloxB nas NP

foi de 3 mg/mL sem causar efeitos de redução da eficiência de encapsulação e instabilidade do

colóide. O estudo de solubilidade da CloxB em diferentes meios mostrou elevada solubilidade em

tampão fosfato salino (PBS) (0,713 mg/mL) e em meio PBS contendo 70% de leite (1,071 mg/mL).

A liberação do fármaco a partir das nanoestruturas em 6h foi de 80% no meio PBS, entretanto em

48h somente 70% foi liberado na presença de 70% de leite no meio.. Os melhores resultados no

processo de liofilização das NP de CloxB ocorreram na condição de congelamento a -196ºC com o

uso de 25% (p/p) de sacarose. Foi feito um estudo de distribuição de NC em glândula mamária

bovina, utilizando QUI marcada com fluoresceína. As imagens mostraram ampla distribuição da

NC na glândula, indicando que as nanoparticulas podem apresentar propriedades de bioadesividade,

mesmo nas regiões proximais do úbere (15 cm da base do teto). Foi também realizado o

desenvolvimento e a validação da metodologia analítica para doseamento do estolato de

xix

eritromicina por CLAE, outro antibiótico utilizado no tratamento da mastite bovina, com objetivo

de encapsulamento. O método validado foi preciso (CV intradia de 013-1,56% e CV interdia de

0,37-2,16%) e exato (98,85-104,06%). O estudo de porcentagem e eficiência de encapsulação do

estolato de eritromicina foi realizado na concentração de 1,0 mg/mL de fármaco em NS e NC,

conforme formulação otimizada. Os resultados mostraram uma porcentagem de encapsulação de

43,30% nas NS e 44,25% nas NC e uma eficiência de encapsulação de 38,83% e 43,07%,

respectivamente. Este estudo demonstrou a viabilidade e o potencial interesse no uso de sistemas

nanométricos para encapsulação de antibióticos de administração intramamária no tratamento da

mastite bovina.

xxii

ABSTRACT

The present work describes pharmaceutical and physico-chemical characterization of

nanostructured formulations, intending to the encapsulation of cloxacillin benzathine, an antibiotic

used in veterinary. Stable formulations of nanocapsules (NC) and nanospheres (NS) were developed

with poly-ε-caprolactone (PCL) coated with chitosan (QUI).The average size distribution of

nanoparticles (NP) and their polydispersity were determined by photon correlation spectroscopy.

Morphology was determined by Atomic Force Microscopy and surface charge were determined by

Microeletrophoresis associated to Laser Doppler Anemometry. The drug quantification was

performed by high performance liquid chromatography (HPLC) and release kinetics in vitro studies

were done by two dialysis methods Suspensions of NC and NS were prepared by interfacial

deposition of preformed polymers followed by solvent displacement, also called nanoprecipitation.

The influence of polymers (PCL and QUI), surfactants types (lecithin and tween 80), the type of oil

used and the final volume, on the physic-chemical properties of colloidal suspensions were

evaluated. The results showed development of stable and monodispersed formulations of NP, which

were used for the encapsulation of CloxB. The variation in polymer proportion (0.5-2.0% of PCL

and 0.05-1.0% of QUI) and the % of surfactants resulted in significant changes in particle size. It

was observed that increases in drug concentration leads to reduction in particle stability with PCL-

QUI NP, which also influences significantly (P<0.05) their surface charges (+52 to -3.5 mV for NS

and +41.3 to -28.2 mV for NC), and particle hydrodynamic diameter (from 230.8 to 897.2 nm for

NS and from 263.7 to 429.1 nm for NC). These changes in surface charges compromises the

stability of the colloidal suspensions and induces aggregation. Maximum CloxB encapsulation in

NP was 3 mh/ml, and an increase in this concentration induces colloidal instability. CloxB present

high solubility in PBS (7,13 mg/ml) and in medium with 70% of whole milk (1,07 mg/ml). In vitro

release kinetics in PBS show a release higher than 80% in 6 hours and higher than 70% in PBS

media with milk after 48 hours. PCL-QUI NP containing CloxB were lyophilized using two

cryoprotectants (glucose and sucrose) and two freezing conditions (-80oC and -196

oC). The best

results were obtained with sucrose for both NP freezing at -196oC. A study of NC interaction in

perfused bovine isolated udder were conducted, with NC coated with QUI covalently linked to

phthalocyanine isothiocyanate (FITC). The images showed the distribution of NC up to proximal

udder regions (15 cm from teat canal base), indicating that NC were able to go against mammary

gland flow achieving higher sites of the udder, where conventional formulations usually do not

reach adequate concentrations for mastitis treatment. These findings indicate the viability of

nanoparticulate dosage form to treat mastitis in catle.

INTRODUÇÃO

RAQUEL, GC

2

INTRODUÇÃO GERAL

A utilização de vetores com o objetivo de controlar a liberação de fármacos em sítios

de ação específicos, otimizando o regime de dosagem e a velocidade de cedência de substâncias,

tem sido alvo de intensas pesquisas na área farmacêutica nos últimos anos (Espuelas et al., 1997;

Legrand et al., 2007; Bilensoy et al., 2008). Dentre esses vetores, incluem-se as micropartículas e

os sistemas coloidais, como lipossomas e nanopartículas poliméricas (Schaffazik et al., 2003).

As nanopartículas poliméricas são sistemas carreadores de fármacos com diâmetro

inferior a 1μm. Dentre os principais sistemas nanoestruturados encontram-se os lipossomas e as

nanopartículas (nanocápsulas e nanoesferas) (Schaffazik et al., 2003). As nanocápsulas (NC) e as

nanoesferas (NS) diferem entre si quanto à composição e organização estrutural. As NC são

sistemas do tipo reservatório, constituídos por núcleo revestido por uma camada externa polimérica,

com surfactantes lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface. Inicialmente o núcleo das NC era

oleoso, permitindo a encapsulação de substâncias lipossolúveis. Mais recentemente foram

desenvolvidas NC com núcleo aquoso, para encapsulamento de substâncias hidrossolúveis

(Vauthier et al., 2008). As NC podem carrear o fármaco dissolvido no núcleo e/ou adsorvido à

membrana polimérica. Por outro lado, as NS são sistemas constituídos por uma matriz polimérica

na qual o fármaco pode estar retido e/ou adsorvido (Mora-Huertas et al., 2010; Rao et al., 2011).

Vários requisitos devem ser levados em consideração no desenvolvimento de

nanopartículas (NP) como carreador de fármacos. Dentre tais requisitos podemos citar: o tamanho

de partículas, as suas propriedades de superfície e a liberação das substâncias farmacologicamente

ativas, a fim de se obter a ação do fármaco no local específico desejado, com um aprimoramento da

terapêutica e da posologia e diminuição dos efeitos tóxicos (Mohanraj et al., 2006).

A vetorização de fármacos antimicrobianos para humanos e, mais recentemente, para

uso animal é uma área promissora dentro da nanotecnologia. Uma das vantagens da vetorização de

antimicrobianos em nanopartículas poliméricas é a possibilidade de aumentar a dose máxima

tolerada e o índice terapêutico (Pinto-Alphandary et al., 2000; Schiffelers et al., 2001), devido à

liberação e disposição modificadas do antimicrobiano quando encapsulado, bem como por uma

modificação na sua biodistribuição (Irache et al., 2011). Há relatos na literatura sobre

encapsulamento de antibióticos de uso humano e veterinário como ampicilina em nanopartículas

para tratamento de infecção por Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes, cujos

experimentos foram realizados em camundongos (Fattal et al., 1991). A gentamicina foi

encapsulada em nanopartículas de PLGA para tratamento da brucelose, causada por Brucella spp

(Prior et al., 2002 e 2006; Lecaroz et al. 2006). Rifampicina, isoniazida e pirazinamida foram

RAQUEL, GC

3

encapsuladas em nanopartículas de PLGA, apresentando liberação sustentada e considerável

melhora na eficácia após administração oral (Pandey et al. 2003).

Uma afecção que poderia se beneficiar dessa tecnologia é a mastite bovina, uma

inflamação da glândula mamária causada principalmente por bactérias. Esta doença provoca uma

redução na produção e qualidade do leite, resultando em perdas econômicas consideráveis em todo

mundo, o que favorece o desenvolvimento de estratégias de controle da doença (Gehring et al.,

2006). Diferentes classes de antibióticos e suas combinações são utilizadas para o tratamento de

mastite (Gruet et al., 2001) e a permanência de resíduos desses no leite está associada ao número de

doses administradas, do veículo utilizado, da via de aplicação e da concentração de antibiótico

utilizada.

A cloxacilina benzatina é um antibiótico β-lactâmico usado clinicamente na

terapêutica veterinária devido à sua atividade antibacteriana gram-positiva. Este fármaco é utilizado

no tratamento e prevenção de mastite bovina causada por bactérias do gênero Staphylococcus

(Perez et al., 1997). A cloxacilina benzatina foi escolhida pela equipe da Embrapa Gado de Leite,

por não apresentar histórico de resistência bacteriana no banco de isolados de mastite da Embrapa

há aproximadamente 10 anos. Além disso, o sal benzatino faz com que a CloxB apresente menor

solubilidade em água em relação à cloxacilina, o que maximiza a taxa de encapsulação em

nanopartículas (Embrapa, 2009). A vetorização da cloxacilina benzatina objetiva a obtenção de uma

nova forma farmacêutica de administração do antibiótico e de tratamento da mastite, mantendo-se a

via de administração convencional, intramamária, obtendo-se concentrações elevadas do fármaco

no local da infecção, com redução na absorção sistêmica, diminuição da dose e dos efeitos adversos,

diminuição de resíduo do antibiótico no leite, além do aumento da retenção do fármaco no úbere

bovino. Para tal, foram desenvolvidas e caracterizadas físico-quimicamente e quanto à eficiência de

encapsulação e perfil de liberação do fármaco, nanocápsulas e nanoesferas destinadas ao

encapsulamento de cloxacilina benzatina, utilizando-se os polímeros poli-ε-caprolactona e

quitosana. O interesse pela quitosana têm sido crescente nos últimos anos, por ser um polímero

abundante na natureza e por suas propriedades de mucoadesividade e aumento de permeabilidade

das membranas, características que tornam esse polímero um forte candidato à produção de

nanopartículas com carga superficial positiva e mucoadesivas (Ilum, 1998).

O estolato de eritromicina é um antibiótico pertencente ao grupo dos macrolídeos

usado clinicamente na terapêutica humana e veterinária devido à sua atividade contra cocos gram-

positivos, tais como Staphylococcus aureus (Abu-Gharbieh et al., 2004). É um fármaco utilizado no

tratamento da mastite bovina e foi escolhido pela equipe da Embrapa Gado de Leite devido à sua

baixa solubilidade em água, baixo custo e facilidade de aquisição.

RAQUEL, GC

4

Diante do exposto, este trabalho visa à obtenção e caracterização de formulações

nanoestruturadas coloidais estáveis, que poderão, posteriormente, contribuir para o controle e

tratamento mais eficaz da mastite bovina.

RAQUEL, GC

5

REVISÃO DE LITERATURA

1 - Sistemas Vetorizados

Nas últimas décadas estudos têm demonstrado que uma abordagem eficaz para

aperfeiçoar a ação farmacológica de fármacos, é associar a molécula ativa a um sistema de liberação

nanoestruturado (Tabela 1) (Piñon-Segundo et al, 2005). A nanotecnologia vem sendo aplicada no

desenvolvimento desses sistemas de liberação controlada, que muitas vezes veiculam fármacos com

aplicação no tratamento do câncer, de doenças parasitárias, entre outras patologias (Mohanraj et al,

2006). É consenso que a utilização de sistemas coloidais nanoestruturados, tais como os lipossomas,

nanoemulsões e nanopartículas poliméricas, tornou-se uma alternativa que visa alterar a

biodistribuição de fármacos após administração por diferentes vias. O sistema de liberação vetor-

orientado tem o potencial de aumentar o índice terapêutico de diversos fármacos já disponíveis no

mercado, aumentando sua eficácia, prevenindo a degradação ou inativação durante o trânsito até o

sítio alvo, atingindo níveis plasmáticos constantes por um longo período e protegendo o corpo de

reações adversas devido à distribuição inapropriada (Banker & Rhodes, 1996). Finalmente, esses

sistemas também podem facilitar o desenvolvimento de sistemas de liberação multifuncionais com

aplicações terapêuticas e de diagnóstico (Alexis et al, 2008).

Dentre os sistemas de liberação controlado, também conhecidos como vetores,

incluem-se as micropartículas, os sistemas lipídicos (lipossomas e emulsões submicronicas) e

particulados coloidais (nanoesferas e nanocápsulas poliméricas).

Nanopartículas poliméricas (NP) são sistemas coloidais preparados a partir de

polímeros naturais ou sintéticos (Brigger et al, 2002; Reis et al, 2006). Esses vetores podem sofrer

manipulação de suas propriedades de superfície visando atingir órgãos ou tecidos específicos, além

de poderem atuar como carreadores de fármacos, vacinas, proteínas, peptídeos e DNA (Soppimath

et al, 2001; Hans et al, 2002).

RAQUEL, GC

6

Tabela 1: Diferentes tipos de nanocarreadores e algumas de suas funções (adaptado de Kanwar et

al., 2011)

Nome Estrutura Composição Perspectivas e usos Ref.

Nanopartículas

poliméricas

Polímeros

biodegradáveis

e/ou

biocompatíveis

Permitem maior controle da

farmacocinética do fármaco

carreado, gerando níveis mais

constantes dos mesmos

Rawa et

al., 2008;

Mahidhar

a et al.,

2011

Nanopartículas

lipídicas sólidas

Lipídeos

sólidos

Podem ser usadas como

adjuvantes em vacinas e como

agentes para transfecção não-

viral

Mehnert

& Mader,

2001

Nanopartículas

funcionalizadas

Metais

inorgânicos,

anticorpos,

ligantes

específicos

Pode-se incorporar

propriedades fluorescentes para

uso como biossensores;

também usadas como marcador

em biologia molecular e no

direcionamento de fármacos

específicos.

Schneider

et al.,

2000

Lipossomas

Lipídeos

anfifílicos

Alteram o perfil

farmacocinético de fármacos

encapsulados.

Rawa et

al., 2006

Micelas

poliméricas

Polímeros

dibloco

anfifílicos

Formadas em meio

hidrofóbico, adequadas para

carrear fármacos insolúveis em

água devido à composição do

núcleo.

Miyata et

al, 2011

Dendrímeros

Monômeros do

tipo ABn

Tamanho nanométrico, fácil

modificação e preparo. Usadas

como agentes de revestimento,

protegendo e direcionando

fármacos para vários sítios.

Choi et

al., 2005

Nanotubos de

carbono

Composto de

fulerenos

(C60) e/ou

outros

carbonos,

formando

estruturas ocas

Aumentam o volume interno e

podem modificar facilmente

superfícies internas e externas.

Com uma camada são usados

no direcionamento de genes e

fármacos; com duas camadas,

na transfecção.

Foley et

al., 2002;

Martin et

al., 2003

7

As NP poliméricas apresentam diâmetro inferior a 1μm e, dependendo do método de

preparo e das matérias-primas utilizadas, podem ser obtidas nanocápsulas (NC) ou nanoesferas

(NS) (Figura 1) (Irache et al, 2011, Rao et al, 2011). As NC são sistemas reservatório, constituídas

de um núcleo oleoso ou aquoso revestido por uma parede externa polimérica, contendo surfactantes

lipofílicos e/ou hidrofílicos em sua interface (Schaffazick et al, 2003a). Quando se objetiva

encapsular fármacos lipofílicos, diversos tipos de óleos podem ser utilizados, de origem vegetal ou

mineral. O principal determinante para a escolha do fármaco é a solubilidade deste no óleo ou meio

aquoso a ser utilizado. Por outro lado, as NS são sistemas matriciais, que, portanto, não apresentam

núcleo em sua estrutura. Na matriz das NS o fármaco pode estar adsorvido ou retido (Schaffazick et

al, 2003a). A nanoencapsulação tornou-se uma estratégia adequada para aumentar a

biocompatibilidade e a dispersão em escala nanométrica de compostos lipofílicos em meio aquoso e

biológico (Deda et al, 2009).

Figura 1: Representação esquemática de nanocápsulas (NC) e nanoesferas (NS) poliméricas: a)

fármaco dissolvido no núcleo oleoso das NC; b) fármaco adsorvido à parede polimérica das NC; c)

fármaco retido na matriz polimérica das NS; d) fármaco adsorvido ou disperso molecularmente na

matriz polimérica das NS (adaptado de Schaffazick et al., 2003a).

As nanopartículas (NP) poliméricas oferecem algumas vantagens específicas em

relação aos lipossomas, tais como melhor estabilidade em fluidos biológicos e durante

armazenamento, viabilizam liberação sustentada de fármacos e são aplicáveis à maioria das vias de

administração (Vila et al, 2002). Embora os lipossomas tenham sido, e ainda sejam, utilizados como

carreadores de fármacos, a sua produção ainda é limitada devido à algumas desvantagens, como:

baixa estabilidade durante o armazenamento que leva à agregação e fusão das partículas e,

principalmente o custo elevado de fosfolipídios utilizados na formulação (Mozarafi, 2005).

Os métodos mais comuns de preparo de NP são: emulsificação e evaporação do

solvente, polimerização do monômero, nanoprecipitação e salting-out (Vauthier et al, 2008). A

RAQUEL, GC

8

nanoprecipitação, também conhecida como deposição de um polímero pré-formado seguida de

evaporação do solvente, é uma técnica simples, reprodutível e facilmente transponível para a

produção de nanopartículas em grande escala (Couvreur et al, 2002, Fessi et al, 1989; Legrand et

al, 1999). Este método consiste basicamente em verter uma solução contendo o fármaco e polímero,

dissolvidos num solvente orgânico miscível com a água, numa fase aquosa contendo um tensoativo

hidrofílico como estabilizante. Imediatamente após a injeção, o solvente orgânico difunde-se na

água, dando origem a uma suspensão coloidal de nanoesferas. Para a obtenção de nanocápsulas, um

óleo e um tensoativo lipofílico são adicionados à fase orgânica da preparação. Após a formação das

partículas, as suspensões são submetidas à evaporação para remoção do solvente orgânico e

concentração até volume desejado (Fessi et al, 1989).

No desenvolvimento de NP como sistema de transporte e liberação de fármacos, as

principais características que devem ser controladas são o tamanho das partículas, as propriedades

de superfície e a liberação de substâncias farmacologicamente ativas, a fim de atingir a ação no

local específico, com aprimoramento da posologia e da terapêutica (Mohanraj et al, 2006). Além

das vantagens das nanopartículas já citadas acima, estes sistemas apresentam outros benefícios, do

ponto de vista tecnológico, dentre os quais se destacam: método de preparo simples, alto teor de

encapsulamento de fármacos e viabilidade de encapsular substâncias tanto lipofílicas quanto

hidrofílicas (Peltonen et al, 2004). Tais características das NP possibilitam melhoras na

biodisponibilidade de fármacos, modificação de seus perfis farmacocinéticos, especificidade de

ação com diminuição dos efeitos colaterais, proteção do fármaco contra degradação e penetração

intracelular de substâncias macromoleculares. Aliado a isso, a manipulação das características

físico-químicas e de superfície viabilizam o direcionamento passivo e ativo do fármaco após sua

administração (Irache et al, 2011).

A manipulação das características superficiais de NP por meio do recobrimento com

o polímero quitosana (QUI) é uma alternativa que vem sendo muito estudada como forma de

favorecer a retenção de NP em mucosas epiteliais e possivelmente aumentar a penetração de

fármacos nesses locais (de la Fuente et al, 2010; Mao et al, 2010; Meng et al, 2011) . Visto que em

pH fisiológico a QUI apresenta cargas positivas, devido ao protonamento de seus grupos amino,

pode ocorrer interação eletrostática entre as cargas positivas das partículas recobertas com QUI e as

cargas negativas comuns à mucosa (Calvo et al, 1997), o que caracteriza um fenômeno de

mucoadesividade.

RAQUEL, GC

9

2 - Polímeros utilizados no preparo de nanopartículas

Uma extensa variedade de materiais, tanto naturais quanto sintéticos, vem sendo

empregados no preparo de nanopartículas poliméricas. O polímero ideal deve ser não-tóxico,

biodegradável e/ou biocompatível, facilmente processável e livre de impurezas. Os polímeros

sintéticos (ácidos poli-lático e poli-glicólico, poli-ε-caprolactona, poli-acrilatos) possuem a

vantagem de permitirem a liberação sustentada do fármaco, visto que, em geral apresentam

degradação mais lenta que os polímeros naturais (quitosana, albumina, gelatina) (Irache et al,

2011). O homopolímero de poli-ε-caprolactona (PCL), por exemplo, sofre uma degradação total em

dois a quatro anos (Woodruff et al, 2010), enquanto a QUI é degradada em alguns dias ou meses,

dependendo do seu teor de desacetilação (Kean et al, 2010). Graças aos progressos na química de

polímeros e na físico-química de colóides poliméricos, atualmente é possível preparar NP

poliméricas com diversas propriedades em condições controladas (Couvreur et al, 2006).

O conceito atual da vetorização de fármacos não visa apenas prolongar a duração da

liberação, mas também realizar o controle da distribuição no organismo. O controle do tempo

consiste em alterar a cinética convencional de liberação do princípio ativo, durante o tratamento,

objetivando a liberação sustentada, com possível aumento do intervalo de doses. Já o controle da

biodistribuição visa o direcionamento de um vetor de fármacos para locais desejados, objetivando o

aumento da eficácia do princípio ativo, redução de efeitos colaterais e até mesmo redução da dose a

ser administrada (Brigger et al,2002).

2.1 - Poli-ε-caprolactona

A poli-ε-caprolactona (PCL) é um polímero sintético, produzido a partir da abertura

do anel da ε-caprolactona (Figura 2) e sua posterior polimerização. É um polímero hidrofóbico,

semicristalino, com baixo ponto de fusão (59-64 ºC), temperatura de transição de fase em torno de

60 ºC e com excepcional capacidade de se combinar a outras substâncias (Chang et al, 1986). A

PCL é utilizada em combinação a diversos polímeros, como quitosana, ácidos polilático e

poliglicólico a fim de manipular o perfil de liberação de fármacos em nano e micropartículas

(Chang et al, 1986, Malheiro et al, 2010; Sahoo et al, 2010; Woodruff et al, 2010; Wu et al, 2011).

A degradação da PCL no organismo humano é lenta se comparada a outros polímeros devido à falta

de enzimas apropriadas, o que não significa que este polímero não seja biodegradável (Vert, 2009).

A PCL é degradada em dois estágios: inicialmente, uma degradação hidrolítica não enzimática das

ligações éster e posteriormente, quando a PCL já apresenta menor massa molecular, uma

degradação intracelular. Essa hipótese foi reforçada pela detecção de fragmentos de PCL em

fagossomos de macrófagos (Wooward et al, 1985; Woodruff et al, 2010).

RAQUEL, GC

10

Figura 2: Representação esquemática do polímero poli-ε-caprolactona (PCL)

2.2 - Quitosana

A quitosana (QUI) (Figura 3) é um polímero natural produzido a partir da N-

desacetilação parcial da quitina, componente da parede celular de fungos e do exoesqueleto de

artrópodes. Possui características de biodegradabilidade e biocompatibilidade e baixa

imunogenicidade (Meng et al, 2011), além de ser bastante abundante e ter baixo custo de produção

(Berger et al, 2004). A QUI é metabolizada por algumas enzimas humanas, especialmente a

lisozima. Em pH ácido, seus grupamentos amino estão protonados, transformado-se em um

policátion que lhe confere característica de mucoadesividade.

A mucoadesividade se refere à bioadesividade de substâncias ou partículas ao muco

ou às membranas mucosas (Smart, 2005). Para que a adesão ocorra, as moléculas da substância

devem interagir com a interface, o que pode ocorrer por ligações iônicas, covalentes, de hidrogênio,

ligações de Van-der-Waals e hidrofóbicas. No caso da QUI com membranas mucosas, ocorre

predominantemente a ligação iônica, por meio da atração eletrostática entre as cargas positivas do

polímero e as cargas negativas da superfície de mucosas (Smart, 2005). Este fenômeno torna a QUI

um candidato importante para a liberação de fármacos em mucosas (Sayin et al, 2009; Kean et al,

2010; Kumari et al, 2010). Estudos relatam a baixa toxicidade desse polímero, particularmente via

oral, tendo sido atribuída a DL50 de 16 g/kg em camundongos, um valor semelhante aos de sacarose

e cloreto de sódio (Agnihotri et al, 2004).

RAQUEL, GC

11

Figura 3: Representação esquemática do polímero quitosana (QUI)

Polímeros catiônicos, como a quitosana e a poli-lisina podem interagir com as

proteínas das junções oclusivas (Figura 4), promovendo sua reorganização e subseqüente abertura

(Bravo-Osuna et al,2008), agindo portanto, como promotores de penetração (Kotzé et al1999;

Thanou et al, 2001).

Aliado a todas essas características que favorecem o uso da quitosana como polímero

de recobrimento de NP, há o fato de que ainda não existem relatos de uso da quitosana para

administração de NP via intramamária. Os estudos já desenvolvidos relatam a aplicação da

quitosana em vetores administrados por via oral (Prego et al, 2005), nasal (Illum et al, 1994; Vila et

al,2004), pulmonar (Grenha et al, 2005 e 2008) e oftálmica (de la Fuente et al, 2010).

O

H2C

NH

OH

O

H3C

O

OH

O

O

OH

H2C OH

NH2

O OH

H2C OH

NH2

O

x y z

RAQUEL, GC

12

Figura 4: Representação esquemática das junções oclusivas (adaptado de Biological Science 2/e –

Pearson Prentice Hall, Inc. 2005)

3 - Mastite e aplicabilidade de nanopartículas em veterinária

A vetorização de fármacos antibióticos é uma das áreas promissoras para emprego de

nanopartículas, especialmente no tratamento de infecções em humanos e animais (Santos-

Magalhães et al,2000; Schiffelers et al, 2001; Barratt, 2003).

A mastite é a enfermidade mais prevalente e economicamente relevante entre

bovinos leiteiros em todo o mundo (Vintov et al, 2003), afetando a produção e qualidade do leite,

além de poder ocasionar a morte do animal. No Brasil estima-se que as perdas decorrentes da

doença são da ordem de 10 a 15% na produção de leite total, o que representa, atualmente, prejuízos

de cerca de 3 a 4 milhões de litros por ano (Costa et al, 1998; Fonseca et al, 2000; Embrapa, 2010).

No mundo inteiro, estima-se que as perdas anuais ocasionadas pela mastite chegam a 35 bilhões de

dólares (Wellenberg et al, 2002).

Os prejuízos econômicos associados à mastite se devem principalmente à queda na

produção leiteira do rebanho, gastos com medicamentos, descarte do leite de animais em tratamento

e à reposição precoce de animais cronicamente acometidos, os quais acabam sendo sacrificados

(Costa et al, 2011). A mastite é a doença responsável por grande parte dos descartes em um

rebanho, chegando a 26,9% de causa dos descartes nos Estados Unidos (Demeu et al, 2011). Silva e

colaboradores (2004) verificaram que a mastite representa a causa de descarte de 56,82% dos

animais de raça holandesa no Brasil. Associado aos dados relatados, a contagem aumentada de

células somáticas e a diminuição de teores de gordura e caseína do leite provocam queda no

rendimento da indústria láctea (Wellenberg et al, 2002; Seegers et al, 2003).

A mastite bovina é uma inflamação da glândula mamária, caracterizada por

alterações patológicas no tecido glandular, com consequentes alterações físico-químicas no leite

(Gruet et al, 2001). Está relacionada à presença de microorganismos, principalmente bactérias,

como Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysagalactiae,

Corynebacterium bovis. Os principais agentes etiológicos da mastite foram classificados em dois

grupos, quanto à sua origem e modo de transmissão: microorganismos ambientais, que estão

presentes no meio ambiente e cuja transmissão pode ocorrer em qualquer etapa da vida do animal,

dentre os quais se destacam Escherichia coli, Streptococcus uberis, Enterobacter aerogenes,

Klebssiella spp; e microorganismos contagiosos, presentes no corpo do animal e cuja transmissão

RAQUEL, GC

13

ocorre principalmente durante a ordenha, entre eles Staphylococcus aureus, Streptococcus

agalactiae, Corynebacterium bovis (Gruet et al, 2001; Andersen et al, 2010; Dohoo et al, 2011).

A mastite pode ser classificada como clínica – com sinais clínicos no quarto mamário

inflamado e com alterações físico-químicas no leite – ou subclínica – que é assintomática e com

redução na produção e qualidade do leite (Gruet et al, 2001; Moon et al, 2007). O tratamento da

mastite, em geral, é realizado com uso de antimicrobianos, via intramamária – direcionando o

fármaco ao úbere, através do canal do teto – ou combinando infusão intramamária e administração

parenteral (Gruet et al, 2001). O método de administração pela via intramamária de agentes

antimicrobianos para o tratamento de mastite clínica ou subclínica é o preferido pela indústria do

leite, permitindo aplicações de pequenas quantidades de agentes antimicrobianos diretamente no

local da infecção (Tozzetti et al, 2008). Preferencialmente, o tratamento deve ocorrer durante o

período seco, visto que o úbere seco apresenta vantagens em relação ao úbere em lactação, tais

como (Oliver et al, 1990; Gruet et al, 2001):

Manutenção de níveis mais uniformes de antimicrobiano, uma vez que a glândula

não sofrerá esvaziamento constante;

Não há descarte de leite contaminado com antimicrobiano;

Podem ser administradas doses mais elevadas de antimicrobiano a fim de combater a

invasão precoce de patógenos no período seco.

A terapia no período seco é realizada com dois objetivos: tratar infecções

intramamárias em quartos contaminados e prevenir novas infecções no início do período de

lactação. A maior taxa de eliminação de infecção ocorre quando o tratamento dos quartos infectados

é feito após a última ordenha do período de lactação, com altas doses de formulações de liberação

lenta (Gruet et al, 2001). Apesar das vantagens do tratamento durante o período seco, a mastite

clínica muitas vezes precisa ser tratada durante a lactação, e deve apresentar resposta clínica

perceptível em 5 a 7 dias (Gruet et al, 2001). Nesses casos, o leite coletado deverá ser totalmente

descartado, uma vez que existe contaminação com antimicrobianos. Já a mastite subclínica deve ser

tratada durante o período seco.

O úbere da vaca é constituído de dois pares de glândulas mamárias (Figura 5), cada

uma drenada por uma teta. A produção do leite se dá por glândulas exócrinas que possuem alvéolos

dilatados onde o leite é estocado. As células secretoras são responsáveis pela formação da barreira

sangue-leite e pela difusão seletiva de fármacos entre ambos os compartimentos. O alvéolo libera o

leite em pequenos ductos, que convergem para ductos maiores, e estes para a cisterna da glândula.

Esta glândula é conectada à cisterna do teto, que se abre para o canal do teto. Este canal possui

RAQUEL, GC

14

proteção imunológica local, devido à presença de células linfóides, além de uma barreira física

contra a entrada de bactérias fornecida pela camada epitélio-queratinosa que reveste o canal do teto.

Um fármaco é efetivo no tratamento de mastite quando alcança uma concentração ótima no alvo da

infecção, sendo que os patógenos causadores de mastite podem estar no leite ou em compartimentos

intracelulares, como células epiteliais dos alvéolos da glândula mamária (Gruet et al, 2001; Gehring

et al, 2006).

Figura 5: Esquema da glândula mamária bovina (Sandholm et al., 1995)

O grande impacto econômico causado pela mastite levou ao desenvolvimento de

estratégias de controle da doença, sendo que o tratamento com antimicrobianos e a antissepsia dos

tetos antes e após a ordenha são as estratégias adotadas mais relevantes. Apesar da necessidade de

RAQUEL, GC

15

adoção dos antimicrobianos, há constante pressão internacional a fim de reduzir a sua dose e

freqüência de uso (Gruet et al, 2001).

Desta maneira, algumas possibilidades podem ser investigadas com o objetivo de

desenvolver medicamentos mais eficazes para o tratamento dos animais infectados, com menor

difusão do fármaco para a corrente circulatória. A fim de diminuir essa difusão, a aplicação de

antibióticos por via intramamária é amplamente utilizada (Gruet et al, 2001; Mckellar et al, 2004;

Gehring et al, 2006; Kietzmann et al, 2010). Portanto, o desenvolvimento de uma formulação

antibiótica para o tratamento da mastite deverá possuir características como facilidade de

penetração em células fagocitárias, manutenção da atividade do antibiótico nos lisossomas dos

fagócitos, cujo meio é ácido, possibilidade de administração via intramamária sem acarretar perda

da atividade ou degradação do antibiótico e liberação sustentada no local de ação (Craven et al,

1984).

Diante desse contexto, a utilização de vetores nanoestruturados de fármacos, uma

estratégia amplamente estudada para terapia humana, surge como uma possível forma de tratamento

da mastite bovina. Sabe-se que estes vetores protegem o fármaco contra a degradação, são

rapidamente capturados por células do sistema mononuclear fagocitário e podem ser administradas

por várias vias, com aumento da seletividade pelo local de ação (Vila et al, 2002). De acordo com a

literatura, há poucos estudos quanto à utilização de vetores nanoestruturados na área veterinária

(Bodmeier et al, 1997; Gruet et al, 2001) e existem diversas possibilidades de aplicação, o que

possibilitou o depósito de patente por nosso grupo de trabalho que desenvolveu formulações

nanoestruturadas para aplicação na mastite bovina (Mosqueira, 2009).

O destino in vivo das NP parece depender das interações que ocorrem entre a

superfície da NP e os componentes biológicos ao redor dela, sendo que tais interações dependem da

via de administração do vetor (Vauthier et al, 2007). No desenvolvimento de um vetor para

administração em mucosas, como no caso da glândula mamária para o tratamento da mastite

bovina, deve ser considerado o caráter bioadesivo da superfície desse vetor, o que permitirá seu

aprisionamento no muco glandular e manutenção prolongada do vetor no sítio de ação, onde ele

poderá liberar o fármaco de maneira sustentada e diretamente no local desejado. As NP revestidas

por quitosana parecem ser promissoras para a terapia da mastite bovina já que apresenta

característica de mucoadesão (PI 1002601-0).

4 - Cloxacilina Benzatina

RAQUEL, GC

16

O surgimento de formas de liberação prolongada de penicilinas ocorreu nas décadas

de 40 e 50, sendo que uma delas foi a síntese de Penicilina G através da reação ácido-base da

penicilina com a N,N´-dibenziletilenodiamina, uma base forte, que produziu um sal com menor taxa

de degradação, menor hidrossolubilidade que a penicilina e níveis plasmáticos sustentados por um

longo período (Elias et al, 1951). Posteriormente foram desenvolvidos diversos sais derivados da

penicilina, como a Penicilina V e a Cloxacilina Benzatina (CloxB) (Szabo et al, 1951).

As penicilinas pertencem à família química dos antibióticos beta-lactâmicos, os quais

possuem estrutura semelhante à do dipeptídeo D-alanil-D-alanina presente no peptideoglicano da

parede celular das bactérias. O mecanismo de ação dos betalactâmicos ocorre por meio da sua

ligação covalente a um resíduo de aminoácido serina da enzima transpeptidase. Uma vez que essa

enzima está relacionada à síntese da parede celular bacteriana, a ligação do antibiótico a inibe e,

consequentemente, não ocorre formação da parede bacteriana (Faure, 2008).

A Cloxacilina Benzatina (Figura 6) é um antibiótico β-lactâmico usado em terapias

veterinárias devido à sua atividade contra bactérias gram-positivas. Suspensões contendo CloxB são

muito utilizadas no tratamento de mastite bovina por oferecer proteção prolongada contra novas

infecções no período seco. Apresenta eficácia contra estafilococos resistentes a penicilinas,

especialmente Staphylococcus aureus, o patógeno gram-positivo mais prevalente em infecções do

úbere bovino (Perez et al, 1997; Kietzmann et al, 2010). Suas propriedades físico-químicas, tais

como baixa solubilidade em água e em pH fisiológico, dificultam a administração de uma forma

farmacêutica convencional pela via tradicional, intramamária. Portanto, faz-se necessário o

desenvolvimento de uma formulação nanoestruturada, que seja eficaz na entrega seletiva do

fármaco no local de ação desejado, a glândula mamária.

Visando aumentar a disponibilidade da CloxB no local de ação, ou seja, dentro das

células infectadas da glândula mamária, nas quais reservatórios de bactérias se instalam e são de

difícil combate, uma das alternativas é a encapsulação da CloxB em vetores nanoestruturados.

Nanocápsulas possuindo carga superficial negativa e positiva contendo o antibiótico cloxacilina

benzatina foram preparadas e caracterizadas previamente por nosso grupo de pesquisa, obtendo-se

87% de encapsulação da CloxB em NC de PCL-QUI e 37% em NC de PCL e liberação mais rápida

do fármaco a partir de NC, com QUI como polímero de revestimento, em meio contendo PBS que

em meio contendo PBS e leite (Araújo, 2009).

RAQUEL, GC

17

Figura 6: Estrutura química da Cloxacilina Benzatina (CloxB)

5 - Liofilização de Nanopartículas

A liofilização é um processo, comumente utilizado na indústria, para assegurar a

estabilidade em longo prazo e preservar as propriedades originais de produtos farmacêuticos e

biológicos (Abdelwahed et al, 2006a). O processo consiste na remoção de água de uma amostra,

previamente congelada, por sublimação do gelo sob vácuo, o que transforma a água congelada

diretamente em vapor (Abdelwahed et al, 2006c).

O esquema do equipamento e a evolução da secagem (Boss, 2004) estão

representados na figura 7. A liofilização ocorre em três fases: a primeira etapa do processo é o

congelamento do produto (Figura 7a) a ser seco em baixas temperaturas. Ele pode ser inserido

congelado na câmara de secagem ou pode ser congelado na própria prateleira, dependendo do

equipamento. A segunda etapa é a secagem (Figura 7b). O vácuo é iniciado (Figura 7c) e o gelo é

sublimado por pressão reduzida. À medida que o gelo sublima, a amostra fica porosa. O vapor

originado na interface atravessa o material seco na câmara de liofilização e é condensado abaixo da

câmara de secagem, no condensador. Por último, ocorre a segunda secagem, na qual é retirada a

água residual adsorvida ao pó, obtendo-se o produto final seco (Figura 7d) (Tang et al, 2004; Chen

et al, 2007). Durante o processo de liofilização, a amostra congelada deve ser mantida abaixo de sua

temperatura de transição vítrea ou da temperatura de fusão (Qian et al., 2010).

ClN

O

C

HN

O N

O

S CH3

CH3

C

O O

N+

CH2

H2CH

CH2

N+

HH2C

H

H

2

RAQUEL, GC

18

Figura 7: Representação esquemática de um liofilizador e do processo de secagem (adaptado de

Araújo,2009).

O processo de liofilização tem sido aplicado, nos últimos anos, visando melhorar a

estabilidade em longo prazo de nanopartículas (De Chasteigner et al, 1996; Abdelwahed et al,

2006a). Esta aplicabilidade se deve ao fato de que os sistemas coloidais apresentam problemas de

instabilidade física (agregação e fusão de partículas) e química (hidrólise de polímeros, vazamento

de fármaco e reação química do fármaco durante estocagem) quando mantidas na forma de

suspensões aquosas por um longo período (Chacon et al, 1999; Abdelwahed et al, 2006c).

Apesar de a liofilização contribuir para o aumento da estabilidade de sistemas

coloidais, as etapas de congelamento e secagem podem provocar estresse na amostra, induzindo a

agregação das partículas e comprometendo a formação de um produto adequado (De Chasteigner et

al, 1996; Abdelwahed et al, 2006c). Entre os vários tipos de vetores, as nanocápsulas apresentam

maiores problemas durante a liofilização, devido à sua frágil estrutura, composta por uma fina

parede polimérica, envolvendo um núcleo oleoso ou aquoso. As NC podem ter sua estrutura

rompida, com extravasamento do núcleo e perda de fármaco encapsulado. Devido a tais problemas,

usualmente crioprotetores são adicionados à formulação, antes do congelamento. Além disso, o

processo de congelamento influencia os estágios primário e secundário de secagem e,

consequentemente, afeta o produto final formado. Portanto, a otimização do congelamento de

amostras deve ser considerada durante a liofilização (Patapoff et al, 2002; Abdelwahed et al,

2006c).

RAQUEL, GC

19

Diversas formas de congelamento já foram testadas para nanopartículas e estão

descritas na literatura. Para as nanoesferas é comum a utilização de nitrogênio líquido (-196°C)

(Chacon et al, 1999; De Jaeghere et al, 1999 ; Auvillain et al, 1989), congelamento em freezer a -

70°C (Chacon et al, 1999), a -45°C (Saez, et al, 2000; Abdelwahed et al, 2006d) e a -60°C (Konan

et al, 2002). Para as nanocápsulas já foram estudados o congelamento em freezer a -45 °C

(Abdelwahed et al, 2006b), a -20ºC (Schaffazick et al, 2003b), a -70°C e congelamento em

nitrogênio líquido a -196°C (Auvillain et al, 1989; Chacon et al, 1999).

Quando uma solução aquosa é congelada a -196ºC, em nitrogênio líquido, a

temperatura extremamente baixa resulta na rápida formação de núcleos de gelo, com crescimento de

pequenos cristais de gelo a partir desses núcleos. Entretanto, quando se utiliza uma temperatura

mais elevada de congelamento (-80, -60, -20ºC, por exemplo) a nucleação do gelo é lenta, e esse

núcleo tende a crescer como cristais de gelo maiores, levando à formação de produtos com poros

grandes e aleatórios após a liofilização (Qian et al, 2010).

Abdelwahed e colaboradores (2006d) descreveram o que ocorre com a amostra

durante o congelamento. Sabe-se que há uma separação defases entre o gelo e a solução crio-

concentrada, que contém as NP e os outros componentes da formulação. A alta concentração do

sistema particulado pode induzir agregação e, até mesmo a fusão das partículas, além do estresse

mecânico causado pela cristalização do gelo, conforme já mencionado. Para evitar tais problemas,

os crioprotetores devem ser adicionados à suspensão de NP (Abdelwahed et al, 2006a).

6 - Crioprotetores

Os crioprotetores mais comumente encontrados na literatura, usados na liofilização,

são os açúcares, tais como: sacarose, glicose (Figura 8), trealose e manitol (Auvillain et al, 1989;

Quintanar-Guerrero et al, 1998; Chacon et al, 1999; Saez et al, 2000; Konan et al, 2002;

Abdelwahed et al, 2006a) e polímeros, tais como: álcool polivinílico (Abdelwahed et al, 2006a) e a

gelatina (Saez et al, 2000). Os crioprotetores agem pela imobilização das NP na matriz vítrea dos

mesmos, o que pode prevenir sua agregação e protegê-las contra o estresse mecânico do processo

(Abdelwahed et al, 2006c). A quantidade de crioprotetor a ser adicionada varia de uma formulação

para outra. Na literatura encontram-se dados descrevendo desde o uso de 2% de crioprotetor até

30% (p/v) (Schwarz et al, 1997; Cavalli et al, 1997; Saez et al, 2000).

O mecanismo de proteção conferido pelos açúcares, utilizados como crioprotetores é

bem estudado em relação aos lipossomas (Crowe et al, 1996). São formadas pontes de hidrogênio

RAQUEL, GC

20

entre os açúcares e o grupo polar dos fosfolípides, impedindo a fusão dos lipossomas durante o

processo de desidratação (Nounou et al, 2005; Chen et al, 2010).

Em relação às NP poliméricas, o mecanismo de proteção conferido pelos

crioprotetores ainda não está totalmente elucidado. Uma hipótese é a de que os crioprotetores

formam uma matriz amorfa ao redor das NP, promovendo espaçamento entre elas e evitando, assim,

a agregação durante o congelamento, tornando-as redispersíveis (Saez et al, 2000). Além disso, seu

efeito protetor pode ser devido à formação de ligações de hidrogênio com a água fazendo com que

grupos polares presentes na superfície das partículas, como o poloxamer 188, sejam parcialmente

dessolvatados (Crowe et al., 1993; Allison et al., 1998).

Figura 8: Estrutura química da sacarose (a) e da glicose (b)

RAQUEL, GC

21

OBJETIVO GERAL

Desenvolver e caracterizar nanopartículas poliméricas contendo quitosana como

polímero de recobrimento, avaliando a influência de seus constituintes e concentrações na

estabilidade geral da formulação, bem como o efeito sobre as suas características físico-químicas,

para encapsulação eficiente da cloxacilina benzatina. Estudar ex vivo a interação de NP com a

glândula mamária em modelo de úbere bovino isolado.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver formulações de nanocápsulas e nanoesfera de CloxB a partir dos polímeros

quitosana e poli-ε-caprolactona, avaliando a influência de seus constituintes sobre os

aspectos físico-químicos e morfológicos da preparação;

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas obtidas quanto ao tamanho, índice de

polidispersão, potencial zeta e morfologia;

Avaliar a liberação in vitro de uma formulação de nanocápsula e uma de nanoesfera;

Avaliar ex vivo a interação dessas nanopartículas com o úbere isolado analisando seu

potencial de aplicação pela via intramamária.

CAPÍTULO I

Desenvolvimento e Caracterização de Nanocápsulas e Nanoesferas Bioadesivas

RAQUEL, G.C.

23

1. OBJETIVO GERAL

Neste capítulo o objetivo geral foi o preparo e a caracterização de nanopartículas

poliméricas, avaliando seus constituintes e suas concentrações, visando a otimização e padronização

dos parâmetros da formulação e maior reprodutibilidade do método.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver formulações de nanocápsulas e nanoesferas a partir dos polímeros quitosana e

poli-ε-caprolactona;

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas quanto ao tamanho, índice de polidispersão e

potencial zeta;

Avaliar a morfologia e as características de superfície das nanocápsulas e nanoesferas por

microscopia de força atômica.

RAQUEL, GC

24

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Materiais

Para o preparo das nanopartículas foram utilizadas as seguintes substâncias:

fosfatidilcolina de soja (~ 70% fosfatidilcolina) (Epikuron 170®, Lucas Meyer, França), monooleato

de sorbitan (Span 80) (Sigma, EUA), Miglyol® 812N (Sasol, Brasil), Velsan®

(triglicéride

cáprico/caprílico) (Pharma Special, Brasil), poloxamer 188 (Synperonic) (ICI Surfactants,

Cleveland, Reino Unido), poli-ε-caprolactona (PCL) (PM 42500Da) (Sigma, EUA), quitosana de

baixo peso molecular (QUI) (Sigma-Aldrich, Brasil), tween 80 (Vetec, Brasil), metanol grau

analítico (Labimpex, Brasil), acetona grau analítico (Vetec, Brasil), fosfato de potássio dibásico

(Rielde-Haёn®

), metanol grau CLAE (Merck, Alemanha), acetonitrila grau CLAE (Tedia, EUA). A

água de qualidade Milli-Q foi purificada nos sistemas Direct-Q e Symplicity/System 185, da

Millipore®.

3.2 Preparo das Nanopartículas

As nanopartículas foram preparadas pelo método de deposição interfacial de um

polímero pré-formado, descrito por Fessi e colaboradores (1989). O processo de obtenção de

nanopartículas consiste na mistura de uma fase orgânica, miscível em água, em uma solução aquosa

contendo surfactante hidrofílico (Figura 9).

Para o preparo de nanoesferas brancas foi feita a dissolução de PCL (2,5; 5; 10; 15

ou 20 mg/mL) em acetona (2,5; 3,5 ou 6,5 mL) e metanol (1,5 mL), sob agitação magnética. Essa

solução foi vertida em uma solução aquosa contendo 6 mg/mL de tween 80 e quitosana (0,25; 0,5;

1; 2,5; 5 ou 10 mg/mL) solubilizada em ácido cítrico 0,06 mol/L, também sob agitação magnética,

mantida por 10 minutos, a 500 rpm. Posteriormente, o excesso de solvente da suspensão coloidal

obtida foi evaporado à pressão reduzida em rotavapor (Heidolph Instruments, Alemanha), a uma

temperatura de 40 ºC, até volumes finais de 2 ou 5 mL.

Para o preparo de nanocápsulas brancas foi feita a dissolução de PCL (1; 5 ou 6

mg/mL), Epikuron 170®

(5; 6 ou 7,5 mg/mL) ou Span 80 (7,5 mg/mL) (tensoativos hidrofóbicos) e

25 μL/mL de Miglyol® ou Velsan® (fase oleosa) em acetona (3,5 mL) e metanol (1,5mL), sob

agitação magnética. Essa solução foi vertida em uma solução aquosa contendo Poloxamer 188 (6 ou

7,5 mg/mL) ou 6 mg/mL de tween 80 e quitosana (0,5; 1 ou 2 mg/mL) solubilizada em ácido cítrico

0,06 mol/L, também sob agitação magnética, a qual foi mantida a 500 rpm por mais 10 minutos. A

RAQUEL, GC

25

evaporação do excesso de solvente foi realizada conforme metodologia descrita acima, até volumes

finais de 2 ou 5 mL.

Figura 9: Etapas do Preparo de Nanocápsulas e Nanoesferas. 1) A solução orgânica é vertida na

solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por 10 minutos; 3) O solvente e o

excesso de água são evaporados.*No preparo de nanoesferas não são adicionados óleo e tensoativo

hidrofóbico.

Durante o desenvolvimento das formulações de nanocápsulas e nanoesferas, foi

estudada a influência da variação de alguns constituintes da formulação em seu tamanho, o índice

de polidispersão e o potencial zeta. Os parâmetros das formulações avaliados foram: variação nas

concentrações e nas proporções dos dois polímeros utilizados (PCL e QUI), presença ou ausência

de tensoativos hidrofóbicos, diferentes tipos de tensoativos hidrofóbicos e hidrofílicos, diferentes

tipos de óleos nas nanocápsulas e variação do volume final de formulação, sempre mantendo a

proporção de 1:2 de solventes orgânico/aquoso.

RAQUEL, GC

26

3.3 Determinação da solubilidade de CloxB em diferentes meios

Visando uma melhor avaliação dos resultados obtidos no desenvolvimento de

nanopartículas foi realizado o estudo de solubilidade da CloxB em óleos Miglyol® 812N e Velsan e

em água. Foi também determinado o coeficiente de partição octanol/água do fármaco.

Os experimentos de solubilidade foram realizados a 37ºC. Para o estudo de

solubilidade um excesso de CloxB (0,5g) foi equilibrado com cada um dos 3 meios (Miglyol®,

Velsan e água) por 72h sob agitação em um tubo de Falcon de 15 mL. Após esse período foram

coletadas alíquotas de 50 μL de cada um dos meios e colocadas em balões volumétricos de 2 mL

contendo acetonitrila:metanol (7:3). Após solubilização, alíquotas de 200 μL dessa solução foram

coletadas, diluídas para 1mL com acetonitrila: metanol (7:3) e quantificadas em CLAE a 225nm

(Mosqueira e cols., 2006).

Para a determinação do LogP, tubo Falcon contendo uma mistura 1:1 (volume total

de 15mL) de n-octanol:água foram mantidas sob agitação por 24h. Após esse período, centrifugou-

se a amostra, para separação dos meios. Em seguida foram adicionados 0,25g de CloxB a cada um

dos meios e estes mantidos sob agitação a 37ºC por mais 72h. Após esse período foram coletadas

alíquotas de 50 μL de cada um dos meios e colocadas em balões volumétricos de 2 mL contendo

acetonitrila:metanol (7:3). Após solubilização, alíquotas de 200 μL dessa solução foram coletadas,

diluídas para 1mL com acetonitrila: metanol (7:3) e quantificadas em CLAE a 225nm (Mosqueira e

cols., 2006).

3.4 Caracterização Físico-Química das Nanopartículas

3.4.1 Distribuição de tamanho

O tamanho médio e o índice de polidispersão das NC e NS foram determinados por

espectroscopia de correlação de fótons (ECF), utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS

Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As medidas de tamanho foram realizadas em quadruplicata

em alíquotas da mesma amostra e os resultados obtidos foram expressos em média ± desvio padrão.

O índice de polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no tamanho das

nanopartículas presentes na amostra, sendo que as amostras que apresentaram índice de

polidispersão menor que 0,3 foram consideradas monodispersas, segundo instruções do fabricante

do equipamento.

RAQUEL, GC

27

A técnica de espalhamento dinâmico da luz ou espectroscopia de correlação de

fótons baseia-se na determinação das flutuações na intensidade da luz espalhada pelas partículas,

em função do tempo, e no cálculo da respectiva função de auto- correlação. Uma grande vantagem

desta técnica em comparação ao espalhamento de luz estático é permitir a determinação da

distribuição do diâmetro das partículas, e não apenas um valor médio de diâmetro. A fim de

entendermos esse fenômeno, é necessário relembrar algumas definições. Partículas em meio líquido

movem-se ao acaso (movimento Browniano), devido a colisões com as moléculas do meio de

dispersão. Partículas menores se movimentam mais rapidamente que partículas grandes e, portanto,

apresentam coeficiente de difusão (D) maior. A medida da intensidade da luz espalhada por uma

dispersão permite detectar e analisar esse movimento browniano das partículas. A luz espalhada por

uma dispersão em um dado instante é combinada, formando um padrão de interferência que

depende das posições relativas das partículas. À medida que as partículas sofrem deslocamentos

aleatórios, o padrão de interferência acompanha estas modificações, produzindo uma variação da

intensidade da luz espalhada no detector. Embora a flutuação da intensidade espalhada seja aleatória

por natureza, ela ocorre em uma escala de tempo de micro a milissegundos. O movimento lento das

partículas grandes causará lentas alterações na intensidade da luz espalhada. Por outro lado, a

movimentação rápida de partículas pequenas provocará uma flutuação muito rápida na intensidade

da luz espalhada. Para uma dispersão de partículas com viscosidade η, em uma temperatura

constante T, o coeficiente de difusão D é inversamente proporcional ao diâmetro hidrodinâmico dH

das partículas, conforme mostra a equação de Stokes-Einstein:

Onde k é a constante de Boltzmann.

A constante de Boltzmann é uma constante física que relaciona temperatura e energia de moléculas.

É obtida pela razão entre a constante dos gases ideais (R) pela constante de avogrado (N).

As flutuações da intensidade da luz espalhada ao longo do tempo são representadas

por meio da função de correlação. No caso das partículas pequenas essa função de correlação entre

as intensidades diminui mais rapidamente com o tempo do que no caso das partículas grandes. No

tempo t= t0= 0, a intensidade de espalhamento em um tempo (t0 + ô) estará cada vez menos

Hd

kTD

3

KJN

Rk /103806503,1 23

RAQUEL, GC

28

correlacionada com a intensidade de espalhamento inicial, e a média dos produtos das intensidades

tende a zero. Para partículas esféricas e monodispersas, a função decai exponencialmente num

intervalo de tempo t, e a constante de decaimento da curva exponencial gerada pela função de

correlação está relacionada com o coeficiente de difusão translacional das partículas. A constante de

decaimento depende do índice de refração do líquido que dispersa as partículas, do ângulo de

detecção da luz espalhada e do comprimento de onda da luz incidente (Calvo e cols., 1995). O

diâmetro médio efetivo das partículas e sua dispersão foram determinados por meio da técnica de

espalhamento dinâmico de luz, a um ângulo de detecção da luz espalhada fixo em 90°, na

temperatura de 20°C em meio aquoso.

A espectroscopia de correlação de fótons (ECF), além do diâmetro médio das

nanoestruturas, fornece por meio do cálculo, o índice de polidispersão (I.P.) das formulações. O I.P.

é utilizado para determinar a distribuição de tamanho das partículas nas amostras. Formulações de

NP com valores de I.P. menores ou iguais a 0,3 apresentam-se monodispersas (Scholes e

cols., 1993).

3.4.2 Potencial Zeta (ζ)

O potencial zeta foi determinado pela técnica de microeletroforese associada à

anemometria de laser Doppler (ALD), utilizando-se o equipamento Zetasizer 3000HS (Malvern

Instruments, UK). As amostras foram analisadas, diluindo 10 μL da suspensão de nanopartículas em

9990 μL de solução aquosa NaCl 1 mmol/L previamente filtrada em filtro de 0,45 μm, obtendo-se,

assim, suspensões coloidais com forças iônicas semelhantes (1,2 ± 0,2 mS/cm2). As medidas foram

realizadas em triplicata em alíquotas da mesma amostra e os resultados obtidos foram expressos

como média ± desvio padrão.

As medidas de potencial zeta se baseiam no fenômeno relacionado à carga líquida na

superfície da partícula que afeta a distribuição de íons na sua vizinhança, aumentando a

concentração de contra-íons junto à superfície. Assim, forma-se uma dupla camada elétrica na

interface da partícula com o líquido. Essa dupla camada divide-se em duas regiões: uma região

interna, que inclui íons fortemente ligados à superfície, e uma região externa onde a distribuição dos

íons é determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento térmico. Dessa maneira,

o potencial nessa região decai com o aumento da distância em relação à superfície. Quando se

alcança uma distância suficientemente grande, atinge-se o potencial de superfície, o qual é

convencionado como potencial zero. Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada

partícula e os íons fortemente ligados a ela se movem como uma unidade, e o potencial no plano de

cisalhamento entre essa unidade e o meio circundante é chamado potencial zeta (Figura 10).

RAQUEL, GC

29

Quando uma camada de macromoléculas é adsorvida na superfície da partícula, ela

move o plano de cisalhamento para longe da superfície, alterando o potencial zeta. O potencial zeta

é função da carga superficial da partícula, de qualquer camada adsorvida na interface com o meio e

da natureza e composição do meio que a circunda.

Figura 10: Esquema representativo da dupla camada elétrica

O potencial zeta (ζ) reflete o potencial elétrico existente na superfície das partículas e

pode ser influenciado pela carga dos diferentes componentes dessas estruturas, localizado na

interface com o meio dispersante, e pela adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão

(Legrand e cols., 1999).

3.4.3 Análise morfológica das nanopartículas

Até o momento foram realizadas análises morfológicas das nanoesferas brancas e

contendo 0,1 mg/mL de CloxB e da formulação de nanocápsula branca. Para análise morfológica

foi utilizada a microscopia de força atômica (MFA), utilizando os equipamentos Multimode e

Dimension 300, ambos monitorados por controlador Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa

Bárbara, EUA), no Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC, MG). As imagens foram obtidas

no modo de contato intermitente (tapping mode) utilizando sondas de silício de comprimento de

228 μm, com uma freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m e raio de

curvatura de 5 nm a 10 nm.

Para obtenção das imagens, aproximadamente 5 μL das amostras foram depositados

em placas de mica clivadas no momento do uso ou em lâminas de vidro contendo parafilme em sua

superfície. Após a deposição das amostras, essas foram secadas utilizando-se um jato de argônio

unidirecional. A varredura foi efetuada em uma velocidade de 1 Hz com resolução de 512 x 512

RAQUEL, GC

30

pixels. A análise das amostras foi realizada utilizando um programa de análise do sistema (Section

Analysis).

3.5 Análise Estatística dos Dados

O diâmetro médio e o potencial zeta das NC e NS vazias e contendo CloxB foram

comparados por análise de variância (ANOVA) utilizando o programa Prisma versão 4.0. Adotou-

se intervalo de confiança de 95%, sendo os valores de p<0,05 aceitos como estatisticamente

significativos.

RAQUEL, GC

31

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Preparo das Nanopartículas

As nanopartículas (NC e NS) (Figura 11) são formadas instantaneamente pela rápida

difusão do solvente orgânico para o meio aquoso, promovendo a deposição interfacial do polímero.

Ocorre uma rápida precipitação do polímero quando a solução polimérica é adicionada ao não-

solvente, um processo que é cineticamente controlado. A rápida formação das nanopartículas é

governada pelo chamado efeito Marangoni, que explica a geração de turbulência interfacial entre as

interfaces do solvente e do não-solvente (Quintanar-Guerreiro e cols., 1998). As características

estruturais e físico-químicas das nanopartículas podem ser grandemente influenciadas pela

composição das formulações. No preparo de nanopartículas por nanoprecipitação, a natureza e

concentração do polímero, razão entre a quantidade de fases externa e interna e a natureza e

concentração dos surfactantes são fatores essenciais na determinação do seu tamanho. Por esta

razão, 33 formulações foram previamente testadas, empregando-se diferentes componentes e

proporções. As suspensões coloidais resultantes foram avaliadas quanto ao tamanho médio de

partícula e índice de polidispersão. As formulações de tamanho e índice de polidispersão mais

adequados foram selecionadas para a encapsulação da cloxacilina benzatina e medida de potencial

zeta.

Figura 11: Representação esquemática da constituição de nanoesferas (a) e nanocápsulas

bioadesivas (b).

3.2 Determinação da solubilidade de CloxB em diferentes meios

A solubilidade da CloxB em Miglyol®, mostrada na Tabela 2, está de acordo com

resultados previamente obtidos em nosso laboratório (Araújo, 2009) para outros óleos, como

RAQUEL, GC

32

Labrafac e Plurol Oleique. A solubilidade da CloxB em Miglyol® é maior que em Velsan, o que

favorece o suo deste óleo para encapsulamento da CloxB. Pelos dados da tabela, observa-se que a

solubilidade da CloxB em água é próxima à sua solubilidade em Miglyol®. Estes dados indicam

que a CloxB é um fármaco que apresenta grupamentos hidrofílicos em sua estrutura e, portanto, não

é predominantemente hidrofóbico. Esta suposição foi confirmada pelo cálculo do LogP, com

valores de 0,6.

Tabela 2: Solubilidade da CloxB em diferentes meios

Meios Solubilidade

(μg/mL) a 37ºC

Miglyol® 1207,80

Velsan®

383,43

Água 1053,02

N-octanol 4079,53

Determinação a 37ºC.

P = solubilidade n-octanol/ solubilidade água = 3,874

LogP determinado = 0,6

3.3 Caracterização físico-química das nanopartículas

3.3.1 Distribuição de tamanho

A determinação do tamanho médio das nanopartículas é muito importante para a

caracterização físico-química das formulações. Por meio da determinação do tamanho das

nanoestruturas é possível acompanhar a estabilidade das formulações e a tendência das partículas

presentes na suspensão coloidal de se agregarem e sedimentarem (Magenhein e cols., 1991). O

tamanho das nanopartículas geralmente varia de 100 a 500 nm e depende de vários fatores, como

método de preparação, tipo e concentração do polímero utilizado, características físico-químicas do

fármaco encapsulado, concentração de surfactantes, proporção entre fase orgânica e aquosa,

viscosidade das fases utilizadas e velocidade de difusão da fase orgânica na aquosa (Legrand e

cols., 1999 e Mosqueira e cols., 2001).

RAQUEL, GC

33

Parâmetros envolvidos na preparação das nanocápsulas e nanoesferas (tipo e

proporção de polímeros, presença ou não de tensoativos, volumes de fase orgânica e fase aquosa e

tipo de óleo na fase orgânica de nanocápuslas) foram otimizados com a finalidade de obter

formulações monodispersas com partículas de diâmetro de até 450 nm. Os resultados estão

apresentados nas Tabelas 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9.

Tabela 3: Efeito das concentrações de polímeros no tamanho médio de nanoesferas

NS PCL

(mg/mL)

Quitosana

(mg/mL)

Tamanho

(nm) ± DPa

Índice de Polidispersão

(nm) ± DP

*1 20 5 800,1 ± 10,4 0,336 ± 0,054

*2 15 5 871,1 ± 5,3 0,338 ± 0,068

*3 10 5 660,2 ± 7,8 0,343 ± 0,024

*4 5 5 581,8 ± 5,0 0,375 ± 0,032

*5 20 - 223,6 ± 0,4 0,062 ± 0,016

*6 5 10 716,3 ± 8,5 0,309 ± 0,041

*7 5 2,5 348,6 ± 3,7 0,154 ± 0,015

*8 5 1 379,7 ± 2,6 0,333 ± 0,011

*9 5 0,5 294,8 ± 1,4 0,057 ± 0,022

*10 5 0,25 390,8 ± 2,1 0,126 ± 0,026

Volume final de 2 mL. aDP= desvio padrão (n=4). *Formulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando

teste ANOVA. Formulações sem surfactante.Concentrações finais após evaporação.

A formulação de NS com apenas o polímero PCL (NS 5) apresentou tamanho médio

abaixo de 250 nm e com índice de polidispersão menor que 0,1. Ao adicionar 5 mg de QUI na

formulação (NS 1) o tamanho médio das NS aumentou significantemente (p <0,05), para um valor

mais de 3 vezes maior, sugerindo que o polímero positivo (QUI) ficou adsorvido na superfície da

partículas e que ele contribui para esse aumento de tamanho.

Os resultados apresentados na Tabela 3 mostram uma redução significativa (p<0,05)

no tamanho médio das nanoesferas à medida que a concentração de PCL é diminuída, mantendo-se

a concentração constante de QUI. Quando a concentração de PCL foi reduzida de 20 para 5 mg/ml

obteve-se NS com tamanhos médios de 800,1 nm e 581 nm, respectivamente. A redução na

concentração de PCL reduz a viscosidade do meio, o que facilita a difusão da fase orgânica através

RAQUEL, GC

34

da fase aquosa, conforme descrito por Legrand et al, em 2007. Assim, ocorre uma precipitação mais

rápida do polímero, impedindo a coalescência das nanogotas poliméricas e gerando esferas

estabilizadas com tamanho menor.

Quanto à presença do polímero QUI, observa-se uma redução acentuada no tamanho

médio das nanoesferas, por volta de 500 nm, quando a quitosana é retirada da formulação (NS 1 e

5). Provavelmente, a presença da quitosana (assim como ocorreu com o PCL) aumenta a

viscosidade do meio aquoso, interferindo no processo de interação entre as fases aquosa e orgânica

(Calvo e cols., 1997). Apesar de induzir um aumento no tamanho médio da nanopartícula, a

presença da QUI na formulação é necessária, uma vez que este polímero é responsável pela muco e

bioadesividade da partícula. Sendo assim, foram produzidas NS revestidas com quitosana, a fim de

obter uma concentração ideal de QUI, capaz de manter as propriedades de bioadesividade do

polímero em nanopartículas com tamanho médio abaixo de 400 nm e população monodispersa

(I.P<0,3).

A redução na concentração da QUI até valores de 0,5 mg/mL leva a uma diminuição

significativa do tamanho médio da partícula, provavelmente devido à redução da viscosidade do

meio aquoso e favorecimento da interação entre fases orgânica e aquosa, conforme descrito

anteriormente (Legrand e cols., 2007). Porém, quando é utilizada uma concentração de QUI de 0,25

mg/mL (NS 10), observa-se um aumento no tamanho médio das partículas. Esse fato foi atribuído à

alta proporção de PCL em relação à QUI (20:1), sendo que, provavelmente, a quantidade de QUI

não foi suficiente para promover o revestimento completo da nanopartícula, resultando na formação

de estruturas instáveis e de tamanho médio elevado. Além disso, após a determinação do potencial

zeta, constatou-se um desequilíbrio de cargas na formulação contendo 0,25 mg/mL de QUI, levando

a valores de carga superficial muito baixos (+4,5 mV), quando comparados à formulação com 0,5

mg/mL de QUI (+28 mV).

Além dos fatos discutidos anteriormente, foi observado, para todas as formulações

sem surfactante, a formação de precipitado logo após a evaporação do excesso de solvente (NS 1, 2,

3, 5, 6 e 7) ou no dia seguinte ao preparo da formulação (NS 4, 8, 9 e 10), indicando a necessidade

do uso de surfactante. O surfactante contribui para a estabilização da formulação uma vez que reduz

a tensão interfacial entre as fases aquosa e orgânica (Lannibois e cols., 1997; Peltonen e cols., 2003;

P. Legrand e cols., 2007). Portanto, na etapa seguinte foram produzidas formulações contendo 0,5

mg/mL de QUI e 6 mg/mL do surfactante Tween 80.

A observação dos resultados, apresentados na tabela 4, evidenciam como a presença

de um surfactante hidrofílico influencia no tamanho médio das partículas.

RAQUEL, GC

35

Tabela 4: Efeito da presença de Tween 80 no tamanho médio de nanoesferas

NS PCL (mg/mL) CloxB

(mg/mL)

Tween 80

(mg/mL)

Tamanho (nm)

± DPc

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPc

*11a 5 - - 417,8 ± 3,5 0,095 ± 0,037

*12a 5 - 6 293,8 ± 4,3 0,225 ± 0,026

#13

b 5 0,5 - 843,3 ± 3,8 0,240 ± 0,013

#14

b 5 0,5 6 279,0 ± 2,4 0,224 ± 0,018

Volume final de 2 mL(a) e 5mL (

b).

cDP= desvio padrão (n=4). *

, #Formulações significativamente diferentes

(p<0,05) utilizando teste ANOVA.

Como apresentado na tabela 4, a presença do surfactante hidrofílico e não-iônico

(Tween 80) influencia significativamente (p<0,05) o tamanho médio da nanoesfera. A presença

desse surfactante leva a uma redução no tamanho médio da partícula, tanto para nanoesferas sem a

cloxacilina benzatina (NS 11 e 12) quanto para aquelas contendo o fármaco (NS 13 e 14). Esse

efeito pode ser explicado pela propriedade do Tween 80 em reduzir a tensão interfacial da fase

aquosa, formando nanoesferas termodinamicamente mais estáveis pelo efeito estérico superficial

das cadeias de PEG do Tween 80 (Figura 12) reduzindo também tamanho médio das NP. Durante a

formação das nanoesferas pelo método de nanoprecipitação, a porção hidrofílica do surfactante se

organiza voltada para a fase aquosa e a porção hidrofóbica se volta para a fase orgânica (Figura 12),

o que reduz a tensão interfacial do sistema. Este fenômeno favorece a interação entre as fases

aquosa e orgânica e possibilita a formação de nanopartículas termodinamicamente estáveis e de

tamanho reduzido. Dados da literatura relatam a obtenção de nanopartículas menores pelo método

de nanoprecipitação quando surfactantes são adicionados à formulação (Lannibois e cols., 1997;

Peltonene cols., 2003; P. Legrand e cols., 2007). Adicionando-se 0,5 mg/mL de CloxB não foi

verificada variação estatística nos tamanhos médios das partículas coloidais.

RAQUEL, GC

36

Figura 12: Representação esquemática da organização do tween 80 entre as fases aquosa e orgânica

(a). Adaptado de Baldursdottir e cols., 2011. Estrutura química do tween 80 (b).

Tabela 5: Efeito do Volume final de solvente no preparo das NP no tamanho médio de NS

NS Quitosana

(mg/mL)

Volume final

(mL)

Tamanho

(nm) ± DPc

Índice de Polidispersão

(nm) ± DPc

*15a 1 2 546,1 ± 4,5 0,142 ± 0,031

*16a 1 5 307,5 ± 1,4 0,205 ± 0,027

*17b 0,5 2 293,8 ± 4,3 0,225 ± 0,026

*18b 0,5 5 251,7 ± 0,4 0,094 ± 0,018

Volume final de 2 mL(a) e 5mL (

b).

cDP= desvio padrão (n=4). *

, #Formulações significativamente diferentes

(p<0,05) utilizando teste ANOVA. Formulações preparadas com 5mg/mL de PCL e 6 mg/mL de tween 80.

Em relação à variação do volume final da formulação, na tabela 5 é demonstrado que

a evaporação do excesso de solvente para um volume de 5mL produziu NS de tamanho médio

menor se comparado àquelas evaporadas para 2 mL. Diante de todas as variáveis abordadas para a

formulação (concentração de PCL e QUI, presença e ausência de Tween 80, diferentes volumes

finais), a formulação 18 foi selecionada como a NS ideal para encapsulamento do antibiótico

CloxB, em experimentos realizados posteriormente e descritos no capítulo 2. Essa formulação

apresenta a seguinte composição: 5 mg/mL de PCL solubilizado em 5 mL de fase orgânica, 6

mg/mL de tween 80 e 0,5 mg/mL de quitosana, em 10mL de fase aquosa. O volume final da

formulação foi 5 mL.

Após a seleção da NS ideal, passou-se para o desenvolvimento da formulação de

nanocápusla. Para as NC foram avaliadas a variação na concentração dos polímeros PCL e QUI,

além da variação no tipo de surfactante hidrofóbico e no tipo e concentração do surfactante

hidrofílico. Os resultados para a variação dos polímeros estão descritos na tabela 6.

RAQUEL, GC

37

Tabela 6: Comparação do tamanho médio de nanocápsulas em relação à variação na concentração

de polímeros PCL e Quitosana

NC PCL

(mg/mL)

Quitosana

(mg/mL)

Tamanho

(nm) ± DPa

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPa

a,*19 6 2 369,4 ± 8,6 0,373 ± 0,041

#20 5 2 355,3 ± 5,6 0,401 ± 0,045

*#21 1 2 485,7 ± 3,8 0,482 ± 0,043

a, b, c22 6 1 407,5 ± 12,7 0,529 ±0,026

b23 5 1 420,4 ± 3,6 0,589 ± 0,013

b24 1 1 516,9 ± 7,4 0,721 ± 0,008

a, c25 6 0,5 236,6 ± 1,7 0,128 ± 0,022

Volume final de 5 mL. aDP= desvio padrão (n=4). *

, #, b, cFormulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando

teste ANOVA. a Fomulações 19 e 22 apresentam diferença significativa no tamanho médio em relação à formulação 25.

Formulações contendo 6mg/mL de tween 80 e 7,5 mg/mL de epikuron.

Como pode ser observado na Tabela 6, a redução na concentração do polímero PCL

de 6 para 5mg/mL (NC 19 e 20 e NC 22 e 23) não altera significativamente o tamanho médio das

partículas. Porém, quando se reduz a concentração de PCL para 1,0 mg/mL, mantendo-se a

concentração de QUI (NC 21 e NC 24), ocorre um aumento significativo do tamanho médio. Este

fato é atribuído à necessidade de se manter uma proporção ideal entre os dois polímeros a fim de se

produzir formulações estáveis e com tamanho médio ideal. Além disso, sabe-se que não é possível

obter formulações contendo somente o polímero QUI, na ausência de PCL, uma vez que o segundo

é responsável pela formação do sistema matricial, em nanoesferas, e da parede polimérica em

nanocápsulas.

Conforme apresentado para a formulação 25 a redução da concentração de QUI para

0,5 mg/mL leva à formação de NC de tamanho significativamente menor, semelhante aos dados

observados anteriormente para as NS.

RAQUEL, GC

38

Tabela 7: Efeito do tipo de surfactante hidrofílico no tamanho médio de nanocápsulas

NC Poloxamer

188 (mg/mL)

Tween 80

(mg/mL)

Tamanho

(nm) ± DPa

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPa

26 - 7,5 407,5 ± 12,7 0,529 ±0,026

27 7,5 - 250,5 ± 2,4 0,226 ± 0,027

Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4). Formulações significativamente diferentes (p<0,05) utilizando

teste ANOVA. Formulações contendo 6 mg/mL de PCL e 1 mg/mL de QUI.

Quanto ao tipo de surfactante hidrofílico utilizado, é possível observar pela tabela 7

que, nas condições utilizadas, o poloxamer 188 levou à formação de partículas de tamanho médio

inferior em relação ao tween 80. Portanto, o poloxamer 188 foi escolhido para o desenvolvimento

de demais formulações.

Tabela 8: Efeito do tipo de óleo e concentração do surfactante hidrofóbico no tamanho médio de

NC

NC Epikuron

(mg/mL)

Span 80

(mg/mL)

Tamanho

(nm) ± DPa

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPa

19 7,5 - 369,0 ± 8,6 0,373 ± 0,041

28 - 7,5 1070,2 ± 353,1 1,356 ± 0,126

29 - - Instável Instável


teste ANOVA. Formulações contendo 6 mg/mL de PCL e 2 mg/mL de QUI.

Pela tabela 8 observa-se que entre as NC 19 e 28 há diferença significativa de

tamanho (p<0,05), demonstrando que o Epikuron® produz nanocápsulas de menor tamanho médio

que o Span 80. O Span 80 (Figura 13) é um surfactante de maior viscosidade que o Epikuron®, o

que afeta o tamanho médio das NP produzidas (Duro e cols., 1999; Müller e cols., 2001;

Lboutounne e cols., 2002). Associado a esse fato, deve-se considerar que o Epikuron® possui

caráter aniônico, o que facilita sua interação com a QUI, um polímero catiônico (Siqueira, 2008)

(Figura 14).

RAQUEL, GC

39

Figura 13: Estrutura química do monooleato de sorbitan (Span 80)

Figura 14: Estrutura química da fosfatidilcolina enriquecida com lecitina de soja (Epikuron 170®)

Tabela 9: Comparação das propriedades de tamanho de nanocápsulas em relação à variação do tipo

de óleo e variação da concentração de surfactante hidrofóbico

NC Epikuron

(mg/mL)

Miglyol®

(μL/mL)

Velsan

(μL/mL)

Tamanho

(nm) ± DPa

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPa

30 7,5 25 - 263,7 ± 1,7 0,226 ± 0,027

31 7,5 - 25 234,5 ± 0,9 0,126 ± 0,011

32 6 - 25 243,1 ± 2,1 0,122 ± 0,027

33 5 - 25 262,7 ± 0,8 0,152 ± 0,017


teste ANOVA.Formulações contendo7,5 mg/mL de poloxamer 188. Formulações contendo 6 mg/mL de PCL e

0,5mg/mL de quitosana.

Pela tabela 9, observa-se que o Velsan® (triglicerídeos de cadeia média) induz a

formação de nanocápsulas de menor tamanho que o Miglyol®, o que pode ser devido à maior

viscosidade do Miglyol®

em relação ao Velsan®

, o que torna a dispersão mais difícil durante a

formação da partícula, resultando em partículas maiores (Yu e cols., 1993). Mosqueira e

colaboradores demonstraram, em 2000, que a viscosidade do óleo e sua tensão interfacial têm

influência direta sobre o tamanho médio da partícula formada. Isto porque óleos com maiores

viscosidade e tensão interfacial fazem com que a migração da fase orgânica através da fase aquosa

seja mais lenta, e este é um parâmetro que influencia significativamente o tamanho médio de NP –

quanto mais lenta a migração, maior o tamanho médio das partículas formadas. Além disso, o

RAQUEL, GC

40

Miglyol® foi escolhido porque a CloxB apresentou uma maior solubilidade nesse óleo (415,04

μg/mL) que no Velsan (112,70 μg/mL), conforme resultados apresentados na Tabela 2.

Pela análise dos tamanhos médios obtidos para as formulações 31, 32 e 33 é possível

perceber que a redução das concentrações de Epikuron® levou a um aumento significativo (p<0,05)

no tamanho médio das formulações (NC 32 e 33). Resultados semelhantes já foram observados por

Mosqueira e colaboradores, em 2000, que demonstraram que um mínimo de 0,3% (3 mg/mL) de

lecitina de soja (Epikuron®) é necessário numa suspensão contendo 2,5% de fase oleosa, para a

formação de NC estáveis e com tamanho médio reduzido. Além disso, o uso de concentrações mais

elevadas de lecitina afeta a quantidade de quitosana associada à superfície da nanocápsula, uma vez

que o revestimento de quitosana na superfície das nanocápsulas ocorre devido à interação das

cargas positivas da molécula de quitosana com as cargas negativas do fosfolipídio e do polímero

(Prego e cols., 2006).

Para o encapsulamento da CloxB em nanocápsulas, foi escolhida a formulação 30,

com a seguinte composição: 6 mg/mL de PCL, 7,5 mg/mL de Epikuron 170®

e 25μL/mL de

Miglyol® dissolvidos em 5 mL de fase orgânica e 7,5 mg/mL de poloxamer 188 e 0,5 mg/mL de

quitosana em 10mL de fase aquosa. A formulação foi evaporada até volume final de 5 mL

As formulações selecionadas (NS 18 e NC 30) apresentaram tamanho médio abaixo

de 300nm, população monodispersa (I.P.<0,3) e ausência de precipitado. Foi então realizada a

medida de potencial zeta das duas NP e posterior encapsulação da cloxacilina benzatina.

3.3.2 Potencial Zeta (ζ)

Os resultados de potencial zeta da NS18 e da NC30, escolhidas por serem mais

estáveis e com tamanho ideal, estão apresentados na tabela 10. Os valores positivos de potencial

zeta evidenciam o revestimento da superfície das nanopartículas com QUI, visto que as

nanopartículas contendo apenas o polímero PCL apresentam potencial zeta negativo devido à

presença dos grupos carboxílicos terminais (Leroueil-Le Verger e cols., 1998; De Campos e cols.,

2003; Mora-Huertas e cols., 2010). A QUI, por sua vez, apresenta grupamentos amino protonados

em pH abaixo de 6,5, o que torna positivas as nanopartículas revestidas de QUI, caracterizando a

propriedade catiônica desse polímero (Bilensoy e cols., 2009; Dash e cols., 2011).

RAQUEL, GC

41

Tabela 10: Potencial zeta de formulações estáveis de NC e NS brancas

NPa

Tamanho

(nm) ± DPb

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPc

Potencial zeta (ζ)

(mV) ± DPd

18 (NS) 256,5 ± 2,06 0,099 ± 0,025 +26,6 ± 0,9

30 (NC) 263,7 ± 1,65 0,155 ± 0,018 +23,7 ± 2,3

aVolume final de 5 mL;

bDP=desvio padrão (n=4);

camostras monodispersas (abaixo de 0,3);

dDP= desvio padrão

(n=3). NS e NC brancas= sem CloxB.

3.3.3 Análise morfológica das nanopartículas

A avaliação morfológica de sistemas nanoestruturados é realizada a partir da

observação da forma, tamanho e superfície das partículas por meio das técnicas de microscopia

(Schaffazick e cols., 2003). As microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão são as mais

comumente utilizadas. Entretanto, há alguns anos, também a microscopia de força atômica (MFA)

tem sido uma ferramenta muito usada na caracterização de nanoestruturas, como lipossomas (Li &

Palmer, 2004), nanoesferas (Gref e cols., 1994) e nanocápsulas (Leite e cols., 2005; Mosqueira e

cols., 2005). A MFA é uma das modalidades de microscopia eletrônica de varredura por sonda

mecânica e fornece informações com alta resolução, em escala nanométrica e em três dimensões,

sendo capaz ainda de resolver detalhes de superfície ao nível atômico (Neves e cols., 1998). A MFA

é uma técnica que apresenta várias vantagens em relação às microscopias eletrônicas de varredura e

de transmissão, entre elas: dispensar a utilização de vácuo ou de recobrimento da amostra,

possibilitar a realização de medidas diretas de altura e rugosidade, além de possibilitar a obtenção

de imagens de superfície de materiais sob as mais variadas condições (ar, vácuo e em meio líquido).

Nas imagens das figuras 16 e 17 podem ser observadas NS brancas depositadas sobre

a mica recentemente clivada, que indicam a presença de estruturas esféricas nanométricas. Pela

imagem de fase (b) da Figura 15, aparentemente, a nanoesfera não apresenta superfície lisa, e sim

irregular (setas pretas). A imagem de fase, tem se mostrado sensível para analisar as propriedades

da superfície do material, tais como rigidez, viscoelasticidade, e a composição química (Raghavan

et al., 2000).

RAQUEL, GC

42

Figura 15: Imagens de MFA de nanoesferas brancas, altura (a) e fase (b). Escaneamento de 5 μm x

5 μm. Z range: 200nm. É demonstrada a estrutura esférica das nanoesferas, com superfície irregular.

Figura 16: Imagens de fase de MFA de nanoesferas brancas. Escaneamento de 5 x 5 μm. É

possível visualizar a forma esférica das partículas e sua superfície irregular.

Para um melhor entendimento da superfície irregular da NS, foram feitas imagens em

zoom (Figura 17). Uma análise detalhada das imagens na Figura 17 confirma a impressão inicial a

respeito da superfície da NS branca. É possível visualizar uma superfície irregular, aparentemente

macia, mais facilmente percebida nas imagens de fase e amplitude. Estas características podem ser

RAQUEL, GC

43

produzidas pelo recobrimento com quitosana ou, mais provavelmente à presença do polímero PCL

na NP. Já foram descritas estruturas formadas por filmes de PCL, em imagens obtidas por

microscopia de força atômica (Beekmans e cols., 2000; Marletta e cols., 2007). Beekmans e

colaboradores (2000), relataram a formação de um filme de PCL – a partir do derretimento de

cristais desse polímero – que apresentava estruturas lamelares alongadas, com diferentes

orientações e com bordas curvas.

Figura 17: Imagens de MFA de nanoesferas brancas em zoom, altura (a), fase (b) e amplitude (c).

Escaneamento de 1.2 μm x 1,2 μm. Z range: 200 nm. É destacada a superfície irregular da

nanoesfera.

Na Figura 18, são apresentadas estruturas esféricas bem definidas (a), com relação

diâmetro/altura de aproximadamente 5,0. Esse resultado é diferente dos valores comumente

encontrados para NS, as quais são estruturas mais rígidas que as NC e, portanto não se achatam com

a passagem da sonda da MFA (Montasser e cols., 2002). Nesse caso, o maior achatamento pode

seratribuído à presença da quitosana, um polímero hidrofílico, que aumenta a hidrofilia da matriz e

torna a partícula mais macia e deformável. Nanoesferas rígidas tem a relação próxima de 1.

RAQUEL, GC

44

Figura 18: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando

altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h= 4,9.

Foram também realizadas imagens de NC brancas recobertas com QUI (Figura 19),

cuja obtenção se revelou difícil, devido ao aparecimento de material flexível e disforme ao redor

das partículas, reduzindo a resolução da imagem. Aparentemente algumas estruturas grudaram na

sonda e foram arrastadas, formando algumas projeções pontiagudas ao redor da partícula. A Figura

20 demonstra a imagem tridimensional de NC brancas, na qual podem ser visualizadas algumas

estruturas pontiagudas, que podem ser atribuídos artefactos e deformações devido à baixa fixação

da amostra ao suporte e também à diferente composição estrutural das nanocápsulas.

RAQUEL, GC

45

Figura 19: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, altura (a) e imagem de fase (b),

evidenciando a estrutura esférica das nanocápsulas. Escaneamento de 3 μm x 3 μm. Z range: 200

nm.

Figura 20: Imagem em 3D de nanocápsulas brancas analisadas por MFA. Escaneamento de 5 x 5

μm. Z range: 200nm.

Devido à dificuldade de obtenção de imagens de NC, foi utilizado o parafilm no

lugar da mica como superfície de preparo da amostra (Figura 21). A parafina que o constitui retém

menor quantidade de partículas – por ser uma superfície mais hidrofóbica – e pode tornar a

visualização mais fácil das NP, sem que essas sejam “arrastadas” pela sonda.

RAQUEL, GC

46

Figura 21: Imagem de MFA de nanocápsulas brancas, imagem de fase (a) e amplitude (b) de

amostras preparadas em superfície de parafilm, evidenciando sua estrutura esférica. Escaneamento

5 μm x 5 μm.

Para as NC, o perfil topográfico demonstra que a relação diâmetro/altura tem um

valor de aproximadamente 7,1. Esse resultado indica achatamento da NC, e está de acordo com a

hipótese de que as NC possam se achatar na superfície da mica, devido à seu núcleo líquido envolto

por uma membrana deformável (Montasser, e cols., 2002; Leite e cols., 2005; De Assis e cols.,

2008).

Figura 22: Imagem de MFA de nanoesferas brancas (a) e perfil topográfico (b) demonstrando

altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis). Relação d/h = 7,1.

RAQUEL, GC

47

Espectroscopia de Correlação de Fótons (ECF) mede o raio hidrodinâmico da

partícula e a técnica de MFA permite medir diretamente o tamanho de amostras em um estado

parcialmente seco, depositados em placas de mica recém-clivadas. O tamanho médio de NS e NC

brancas obtidas por MFA não foram significativamente maiores que os obtidos por ECF (tabela 11).

O aumento observado provavelmente se deve ao fenômeno de achatamento das NP na superfície de

mica sob pressão exercida pela sonda de varredura.

Tabela 11: Tamanho médio de NS e NC brancas analisadas por ECF e MFA

NPa

Tamanho médio ±

DPa (nm) (ECF)

Tamanho médio ±

DPb (nm) (MFA)

Índice de

polidispersãoc

18 (NS) 256,5 ± 2,0 277,1 ± 46,1 0,099 ± 0,025

30 (NC) 263,7 ± 1,7 302,9 ± 43,8 0,155 ± 0,018




dDP= desvio padrão

(n=3). NS e NC brancas= sem CloxB.

Diante dos resultados expostos, foram selecionadas duas formulações, uma de NS e

uma de NC para dar sequência aos experimentos, com o encapsulamento do fármaco Cloxacilina

benzatina. As duas formulações selecionadas apresentaram tamanho médio e I.P. adequados (Tabela

11), além de cargas superficiais positivas (Tabela 10), características necessárias para a obtenção de

formulações bioadesivas.

CAPÍTULO II

________________________________________________________________________________

Preparo e Caracterização de Nanocápsulas e Nanoesferas contendo Cloxacilina

Benzatina e Estudo em modelo de perfusão de úbere bovino isolado

RAQUEL, G.C.

49

1. OBJETIVO GERAL

Preparar e caracterizar suspensões de nanocápsulas e nanoesferas contendo o

antibiótico CloxB de uso veterinário, a partir de formulações desenvolvidas e otimizadas no

capítulo I. Estudar a interação de nanocápsulas em modelo de perfusão de úbere bovino isolado.


Desenvolver formulações de nanocápsulas e nanoesferas contendo cloxacilina benzatina a

partir dos polímeros quitosana e poli-ε-caprolactona;

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas, com o fármaco encapsulado, quanto ao

tamanho, índice de polidispersão e potencial zeta;

Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de CloxB nas nanopartículas;

Avaliar a solubilidade da CloxB em diferentes meios;

Avaliar a cinética de liberação da CloxB em nanopartículas poliméricas in vitro;

Avaliar a estabilidade das NP ao longo do tempo;

Estudar a interação de nanocápsulas em modelo de perfusão de úbere bovino isolado ex vivo.

RAQUEL, GC

50


3.1 Materiais

Para o preparo das nanocápsulas e nanoesferas foram utilizadas as seguintes

substâncias: cloxacilina benzatina, gentilmente cedida pela EMBRAPA (Lote CCB0811110),

fosfatidilcolina de soja (≈ 70% fosfatidilcolina) (Epikuron 170®, Lucas Meyer, França), mygliol®

812N (Sasol, Brasil), poloxamer 188 (Synperonic) (ICI Surfactants, Cleveland, Reino Unido), poli-

ε-caprolactona (PCL) (PM 42500Da) (Sigma, EUA), quitosana de baixo peso molecular (QUI)

(Sigma-Aldrich, Brasil), tween 80 (Vetec, Brasil), metanol grau analítico (Labimpex, Brasil),

acetona grau analítico (Vetec, Brasil). A água de qualidade ultra-pura foi purificada nos sistemas

Direct-Q e Symplicity/System 185, da Millipore®.

Para os estudos de porcentagem e eficiência de encapsulação e perfil de liberação

foram utilizadas as seguintes substâncias: fosfato de potássio dibásico (Rielde-Haёn®

), metanol

grau CLAE (Merck, Alemanha), acetonitrila grau CLAE (Tedia, EUA), leite integral em pó (Nestlé,

Brasil).

3.2 Preparo e caracterização físico-química das nanopartículas

As nanocápsulas e nanoesferas foram preparadas conforme a metodologia descrita no

capítulo I (Fessi et al., 1989).

Para o preparo de nanocápsulas foi feita a dissolução de 6 mg/mL de PCL, 7,5

mg/mL de epikuron 170® e 25μL/mL de mygliol (fase oleosa) em acetona (3,5 mL) e metanol (1,5

mL), sob agitação magnética. Essa mistura foi vertida em uma solução aquosa contendo 7,5 mg/mL

de poloxamer 188 e 0,5 mg/mL de QUI, solubilizada em ácido cítrico 0,06mol/L, também sob

agitação magnética, a qual foi mantida a 500 rpm por mais 10 minutos. Posteriormente, o excesso

de solvente da suspensão coloidal obtida foi evaporado à pressão reduzida em rotavapor (Heidolph

Instruments, Alemanha), a uma temperatura de 40ºC, até volume final de 5 mL.

Para o preparo de nanoesferas 5 mg/mL de PCL foi dissolvido em acetona (3,5 mL) e

metanol (1,5 mL), sob agitação magnética. Essa solução foi vertida em uma solução aquosa

contendo 6 mg/mL de tween 80 e de 0,5 mg/mL de QUI, solubilizada em ácido cítrico 0,06mol/L,

também sob agitação magnética, mantida por 10 minutos, a 500 rpm. A evaporação do excesso de

solvente foi realizada conforme metodologia descrita acima, até volume final de 5 mL.

Para a obtenção tanto de nanocápsulas quanto de nanoesferas contendo cloxacilina

benzatina, o fármaco foi solubilizado em metanol e adicionado à fase orgânica de maneira a se obter

RAQUEL, GC

51

diferentes concentrações finais. Foram preparadas NC de CloxB com concentrações de 0,5; 1,0; 2,0;

2,5; 3,0; 5,0; 7,0; 8,0 e 10,0mg/mL e NS de CloxB com concentrações de 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0; 5,0

e 7,0 mg/mL.

Após o preparo, todas as nanopartículas foram submetidas à caracterização físico-

química por meio da medida de distribuição de tamanho em Nanosizer N5 PLUS Beckmann

Coulter (Fullerton, EUA), conforme descrito no item 3.3.1 do capítulo I e de potencial zeta em

Zetasizer 3000HS (Malvern Instruments, UK) conforme descrito no item 3.3.2 do capítulo I.

3.3 Determinação do teor de fármaco encapsulado

Para determinação da porcentagem e eficiência de encapsulação por CLAE,

inicialmente foi construída uma curva padrão da Cloxacilina Benzatina (CloxB), por um método de

doseamento previamente validado, em sistema cromatográfico consistindo de uma bomba de

módulo de separação Waters Alliance 2695, composto de injetor automático, forno de coluna e

detector de arranjo de diodos Waters 2996. A separação foi realizada em uma coluna C18 Waters

Spherisorb com partícula de 5 μm, 250 mm x 4,6 mm, protegido por uma pré-coluna de segurança

Phenomenex AJO-7597 C18 (2 mm x 4,6 mm, 3 mm). As condições cromatográficas foram: fase

móvel acetonitrila: tampão fosfato pH 3,4 (35:65), temperatura de 34°C, fluxo de 1 mL/min, de

acordo com métodos previamente validados por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009).

3.3.1 Porcentagem e Eficiência de Encapsulação

A porcentagem e eficiência de encapsulação foram determinadas pela técnica de

ultrafiltração/centrifugação por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) no

aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de arranjo de diodos (DAD) Waters 2996,

por método de doseamento previamente validado por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009). A

porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor de fármaco incorporado à nanopartícula

em relação ao total de fármaco na formulação. Foram dosadas a quantidade total de CloxB na

suspensão coloidal, a quantidade total de CloxB na suspensão coloidal após filtração em membrana

de 0,8 μm (Millex, Nalgene®

) para retirada do precipitado e a quantidade de CloxB livre solúvel na

fase aquosa externa.

A porcentagem de encapsulaçãofoi calculada pela diferença entre a quantidade total

de CloxB na suspensão coloidal filtrada e a quantidade de CloxB livre solúvel na fase aquosa

RAQUEL, GC

52

externa, dividida pela quantidade total de CloxB na suspensão após filtração x 100. Utilizou-se,

portanto, a seguinte fórmula:

% Encapsulação = CloxB total na suspensão filtrada (mL) - CloxB no ultrafiltrado (mL) x 100

CloxB total na suspensão (mL)

O fármaco total foi determinado pela completa dissolução de 100 μL da suspensão de

nanopartículas agitadas, após filtração em membrana de 0,8μm, em 2 mL de acetonitrila:metanol

(7:3). A mistura foi submetida ao vórtex por cerca de 5 minutos. Em seguida, 3 alíquotas de 600 μL

foram transferidas para 3 eppendorfs e estes, centrifugados a 500 rpm por 10 minutos. Após a

centrifugação, 500 μL do sobrenadante foram misturados a 500 μL de acetonitrila:metanol (7:3) e a

quantidade de fármaco presente nesta mistura, determinada por CLAE. A CloxB livre e solúvel na

fase externa aquosa foi determinada pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 400μL da

suspensão de NP a 500 x g por 30 minutos em unidades de AMICON (membranas de MICROCON

de 50 kDa, Millipore®

) (Figura 23). 10 μL do ultrafiltrado foram retirados e diluídos com 240 μL de

acetonitrila:metanol (7:3).

A quantidade de CloxB ligada à membrana foi determinada após a

ultrafiltração/centrifugação. Para tal a membrana do AMICON foi lavada com água Milli-Q, imersa

em 500 μL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao vórtex por 15 minutos, centrifugada e a CloxB

dosada no sobrenadante. A eficiência de encapsulação das NP foi calculada pela quantidade de

CloxB encapsulado em 50μL da suspensão de NP, dividido pela quantidade de CloxB pesada e

adicionada ao preparo da suspensão de NP x 100. Seguiu-se, portanto, a seguinte fórmula:

Eficiência de Encapsulação% = Quantidade total de CloxB encapsulado (mL) x 100

Quantidade de CloxB pesada e colocada na NP (mL)

RAQUEL, GC

53

Figura 23: Representação esquemática das dosagens de CloxB nas formulações de NC e NS para

determinação de porcentagem e eficiência de encapsulação.

3.4 Análise visual e fotomicrografia de nanopartículas

Visando a determinação da estabilidade em longo prazo das NP produzidas, foi

realizada a análise visual dessas, com avaliação da formação ou não de precipitado após esse

período. Além disso, para algumas NP, em que claramente houve formação de precipitado,

realizou-se fotomicrografia, a fim de visualizar cristais de fármaco.

3.5 Análise morfológica das nanopartículas

A análise morfológica da NS contendo 0,5 mg/mL de CloxB encapsulada foi

realizada por microscopia de força atômica (MFA) conforme metodologia descrita no capítulo 1.

3.6 Solubilidade da CloxB em PBS com diferentes quantidades de leite

As solubilidades da CloxB em tampão fosfato salino (PBS) e em tampão fosfato

salino contendo 30 e 70% de leite (PBS +30% leite e PBS+70% leite) foram avaliadas a fim de

determinar a condição sink (até 20% da concentração de saturação no meio) para os experimentos

de cinética de liberação in vitro.

Os experimentos de solubilidade foram realizados a 37ºC. Um excesso de CloxB

(0,5g) foi equilibrado com cada um dos 3 meios (PBS e PBS+30% leite e PBS+70% leite) por 72h

sob agitação em um tubo de Falcon de 15 mL. Após esse período foram coletadas alíquotas de 50

RAQUEL, GC

54

μL de cada um dos meios e colocadas em balões volumétricos de 2 mL contendo

acetonitrila:metanol (7:3). Após solubilização, alíquotas de 200 μL dessa solução foram coletadas,

diluídas para 1mL com acetonitrila: metanol (7:3) e quantificadas em CLAE a 225nm (Mosqueira e

cols., 2006).

Para o estudo de solubilidade de CloxB em amostras contendo leite, previamente foi

realizado um experimento de extração da CloxB do leite, utilizando-se uma metodologia

previamente descrita (Pérez e cols., 1997). A extração foi realizada em amostras de leite contendo

três concentrações diferentes de CloxB solubilizadas (10, 50 e 200 μg/mL). A 200 μL de amostra

foram acrescentados 400 μL de acetonitrila em eppendorf, seguido de agitação em vórtex por

10minutos e centrifugação a 10.000 rpm por 10minutos. O sobrenadante foi coletado, e a ele, foram

acrescentados 200 μL de clorofórmio, seguido de agitação em vórtex por 15minutos. Este

procedimento foi repetido duas vezes, sendo coletado o líquido inferior do eppendorf. O volume

coletado foi evaporado até secura sob vácuo e, posteriormente ressuspendidos em 1 mL de

acetonitrila:metanol (7:3) e quantificados em CLAE (Figura 24).

Figura 24: Representação esquemática da extração de CloxB em amostras de leite.

3.7 Determinação da cinética de liberação in vitro

Após o desenvolvimento da formulação e a avaliação da porcentagem e eficiência de

encapsulação dessa, foi avaliado o perfil de liberação das NP in vitro. Por este este estudo é possível

determinar a quantidade de fármaco liberado por unidade de tempo em diferentes meios,

obedecendo à condição sink (20% da concentração de saturação do fármaco no meio). A condição

sink garante que o fármaco tem o potencial de solubilização completa no meio, evidenciado-se a

capacidade da forma farmacêutica de prolongar a liberação.

A avaliação do perfil de liberação in vitro da CloxB a partir de nanocápsulas e

nanoesferas foi realizada para NS e NC contendo 1,0 mg/mL de CloxB encapsulada. As técnicas

utilizadas foram a diálise reversa em tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4 e diálise direta em PBS

RAQUEL, GC

55

contendo 70% de leite (PBS+70% leite), a 37ºC e sob agitação moderada (Banho Dubnoff

mod.304-TPAE, Nova Ética, Brasil).

Para o estudo de liberação em PBS, pela técnica de diálise reversa, sacos de diálise

contendo 500 μL de PBS foram inseridos em três recipientes com 200 mL de PBS. Em cada um dos

três recipientes foi acrescentado um volume de formulação (NC ou NS) contendo fármaco em

concentração referente à condição sink (condição sink = 2,5%). Em intervalos pré-definidos (15, 30,

60, 180, 360, 720, 1440 e 2880 minutos) foram coletadas três alíquotas de 250 μL do meio contido

no interior do saco de diálise (1 em cada recipiente) e três alíquotas de 500 μL do meio externo para

manter o equilíbrio entre os meios interno e externo. A cada uma dessas amostras foi adicionada

quantidade igual de acetonitrila, seguida de homogeneização em vórtex por 5 minutos. Ao final do

experimento, foram coletados 700 μL de cada amostra, aos quais foram adicionadas 300 μL de

metanol (a fim de manter a proporção utilizada de acentonitrila:metanol - 7:3) para precipitação dos

sais do tampão, com posterior homogeneização em vórtex por 2 minutos e centrifugação a 1000rpm

por 10 minutos. Após centrifugação foram coletadas alíquotas de 300μL do sobrenadante e

quantificadas em CLAE a 225nm.

O estudo de liberação em PBS+70% de leite foi realizado pela técnica de diálise

direta. Para tanto, três sacos de diálise contendo 5,355 mL de formulação com 1,0 mg/mL de CloxB

(condição sink = 2,5%) foram inseridos em três recipientes com 200 mL de PBS+70% de leite,

mantidos sob agitação em banho a 37ºC. Em intervalos pré-definidos (15, 30, 60, 180, 360, 720,

1440 e 2880 minutos) foram coletadas três alíquotas de 250 μL do meio externo (1 em cada

recipiente) e acrescentados 250 μL de PBS+70% de leite aos recipientes, para manter o equilíbrio

do meio. A cada uma das amostras coletadas foram adicionados 500 μL de acetonitrila, seguindo-se

o procedimento de extração descrito no item 3.6. Após a evaporação de cada amostra, foram

adicionadas 250 μL de acetonitrila:metanol (7:3) para ressuspensão da amostra e estas foram

quantificadas em CLAE a 225 nm.

Foi determinada também a solubilidade da CloxB em meios PBS e PBS+70% leite

num período de 48 horas. Para isso, 2mg de CloxB foram precisamente pesados e acrescentados em

tubos de ensaio. A esses tubos foram adicionados 2mL de PBS ou PBS+70% leite e o sistema foi

mantido sob agitação a 37ºC. Em tempos pré-determinados (15, 30, 60, 180, 360, 720, 1440 e 2880

minutos) coletou-se 100 μL do meio, ultracentrifugou-se a 8.000 rpm por 5 minutos, retirou-se 70

μL do sobrenadante. Às amostras retiradas do meio PBS acrescentou-se 70 μL de acetonitrila,

seguido de agitação em vórtex por 5 minutos. Novamente a amostra foi ultracentrifugada a 8.000

rpm, coletado o sobrenadante e adicionados 60 μL de metanol, seguida de quantificação em CLAE.

Já as amostras retiradas do meio PBS+70% leite, passaram pelo processo de extração descrito no

item 3.6, seguidas de ressupensão em acetonitrila:metanol (7:3) e quantificação em CLAE.

RAQUEL, GC

56

Os dados obtidos dos perfis de liberação/dissolução foram submetidos a tratamentos

matemáticos para a determinação de cinética de liberação/dissolução. Para isso foram aplicados aos

modelos matemáticos:

Modelo de Higuchi: para cada formulação foram construídos gráficos da raiz quadrada do

tempo versus porcentagem liberada (√t x %D)

Modelo de Korsmeyer-Peppas: para cada formulação foi calculado o expoente de difusão

(n) a partir da construção de gráficos de log do tempo pelo log da porcentagem de fármaco

não liberada (log t x log %NL).

3.8 Interação de nanocápsulas com a glândula mamária em modelo de perfusão de úbere

bovino isolado

O estudo da interação de NC em modelo de úbere bovino perfundido isolado foi

realizado de acordo com metodologia descrita por Kietzmann e cols. (1993). Os úberes bovinos

apresentando tamanho médio, formato simétrico e comprimento de teto entre 6-8 cm, foram obtidos

de vacas Girolando (Bos taurus taurus × Bos taurus indicus), que estavam em lactação antes do

abate. Cada úbere foi examinado antes do abate através de apalpação dos quartos e inspeção do

leite. Além disso, o tecido glandular foi avaliado quanto à possibilidade de haver incisões

decorrentes do abate, o que poderia prejudicar o experimento. Foi verificado se as artérias

(pudendal)externas direita e esquerda poderiam ser canuladas. Após 10-15 minutos após o abate,

uma glândula (suitable) foi limpa para remoção de sangue e coágulos nas veias, por meio de

lavagem com 2 L de solução Tyrode (136.8 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 1.8 mmol/L CaCl2 x

2H2O, 1.05 mmol/L MgCl2 x 6H2O, 0.416 mmol/L NaH2PO4 x 2H2O, 11.9 mmol/L NaHCO3 e 5.5

mmol/L D(+)-glicose x 1H2O; a 39oC) contendo citrato de sódio 0.1%. Os úberes foram

transportados ao laboratório e fixados numa posição natural, com um suporte de metal usando uma

inserção na pele proximal e no ligamento suspensório (Figura 41). Em seguida, as grandes artérias

do úbere foram imediatamente supridas com o liquido de perfusão (ou seja, solução Tyrode

gaseificada com carbogênio (95% O2, 5% CO2) a 38oC). O fluxo do perfusato foi mantido entre 60-

100 mL/min. As grandes veias foram canuladas para possibilitar o recuperação do líquido de

perfusão. A glândula mamária foi drenada por cerca de 5 min durante os 30 min de fase de

equilíbrio. A viabilidade do úbere perfundido foi controlada usando parâmetros bioquímicos, como

atividade de lactato-desidrogenase (LDH) e consumo de glicose do perfusato. Esses testes foram

RAQUEL, GC

57

realizados com uso de kits comerciais, LDH P-L e GLUC-PAP, respectivamente (Randox Crumlin,

Reino Unido). Quatro quartos mamários foram usados nesse experimento. Decorrido o tempo de

equilíbrio, 500 mg de CloxB em NC foram administrados via canal do teto e massageado para a

cisterna da glândula. A CloxB injetada estava encapsulada em NC de quitosana ligada

covalentemente à fluoresceína isotiocianato (FITC) (Ma & Lim, 2003) Após 6 horas, três amostras

de tecido glandular foram coletadas dos quartos tratados ( a 5, 10 e 15 cm de distância da base do

teto). As amostras de tecido foram congeladas a -80oC e em seguida, foram feitos cortes de tecido

com micrótomo de congelamento (HYRAX-C50, Carl Zeiss, Jena, Alemanha). Imagens e fotos do

tecido glandular foram feitas em microscópio óptico de fluorescência (Axioplan I, Carl Zeiss, Jena,

Alemanha).

RAQUEL, GC

58


4.1 Preparo e caracterização físico-química das nanopartículas

Quando se pretende uma administração intravenosa das NP, o tamanho dessas deve

ser estritamente controlado, pois partículas maiores que 4 μm de diâmetro podem causar oclusão

dos capilares sanguíneos, um fenômeno conhecido como embolia (Chorny e cols.,2002). Porém,

uma vez que as NP desenvolvidas nesse trabalho destinam-se à administração intramamária, o

controle do tamanho e índice de polidispersão não necessita ser tão rigoroso. Portanto, foram

consideradas aceitáveis NP que apresentassem tamanhos até 400 nm e índice de polidispersão até

0,4, desde que permanecessem estáveis ao longo de alguns meses. Os parâmetros de estabilidade ao

longo dos meses foram estabelecidos por meio do exame visual das formulações e da determinação

de tamanho médio e I.P. após três meses de preparo. Os resultados de medida de tamanho médio,

índice de polidispersão e potencial zeta estão apresentados nas tabelas 12 e 13 para nanoesferas e

nanocápsulas, respectivamente.

Tabela 12: Efeito das variações de concentrações de Cloxacilina Benzatina no tamanho das NS

NS CloxB

(mg/mL)

Tamanho médio

(nm) ± DPa

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPa

Potencial

Zeta (ζ)

(mV) ± DPb

Ns18 - 256,5 ± 2,1 0,099 ± 0,02 +26,6±0,9

NsA 0,5 246,7 ± 0,9 0,130 ± 0,04 +52,0 ± 0,4

NsB 1,0 230,8 ± 0,7 0,101 ± 0,02 +51,9±0,2

NsC* 2,0 306,5 ± 3,2 0,108 ± 0,03 +19,9±1,1

NsD 2,5 270,2 ± 4,7 0,107 ± 0,04 +16,0±0,7

NsE* 3,0 294,1 ± 12,9 0,139 ± 0,02 +18,6±1,7

NsF* 5,0 542,7 ± 8,8 0,370 ± 0,03 +23,8±0,7

NsG* 7,0 897,2 ± 33,6 0,467 ± 0,07 -3,5±1,0

Volume final de 5 mL. aDP= desvio padrão (n=4),

bDP= desvio padrão (n=3). *Formulações significativamente

diferentes (p<0,05) em relação à NS13B, utilizando teste ANOVA.

Os resultados da caracterização físico-química das NS revestidas com QUI estão

mostrados na Tabela 12. De acordo com os resultados, é possível inferir que o aumento da

concentração do fármaco induz uma variação no tamanho médio e no índice de polidispersão das

RAQUEL, GC

59

NS. Nas concentrações iniciais (0,5 e 1,0mg/mL) ocorre uma pequena redução no tamanho das

partículas em relação à NS branca (Ns18). Nas NsD e NsE, contendo 2,5 e 3,0 mg/mL de CloxB há

uma redução no tamanho médio, provavelmente devido ao extravasamento de fármaco da NP. Uma

vez que pouca quantidade de fármaco está efetivamente encapsulado, o tamanho médio da

nanoesfera se aproxima ao da formulação branca. Nas NsF e G (contendo 5,0 e 7,0 mg/mL de

CloxB), há um aumento excessivo no tamanho médio, atribuído a uma instabilidade na partícula,

provocada pelo excesso de fármaco e a alterações significativas do potencial zeta. Associado a isso,

durante a análise visual, as NsF e G foi observado aumento de tamanho médio e do I.P. três meses

após o preparo, caracterizando instabilidade da formulação.

As nanoesferas foram consideradas adequadas em relação ao tamanho médio e I.P.

até concentrações de CloxB de 3,0mg/mL, uma vez que concentrações maiores de fármaco levaram

a um aumento significativo e excessivo de tamanho médio em relação à formulação branca.

O potencial zeta reflete o potencial elétrico das superfícies das partículas, que é

influenciado pela carga dos diferentes componentes das NS, como os tensoativos e polímeros

(Couvreur e cols., 2002). Lecitinas, poloxamer e polímeros são os componentes que mais afetam

este parâmetro. Apesar de muitos polímeros, especialmente os á-hidróxi-ácidos como o PLA e

lecitinas gerarem carga negativa na superfície da partícula, tensoativos não-iônicos como poloxamer

tendem a reduzir o valor absoluto do potencial zeta. Valores de potencial zeta acima de 30 mV

(positivos ou negativos) indicam suspensões de NS (NsA e B) mais estáveis porque a repulsão entre

as partículas previne a agregação (Couvreur e cols., 2002; Hans & Lowman, 2002). Ainda, o

potencial zeta é muito útil para investigar se a substância biologicamente ativa está encapsulada no

núcleo da nanoestrutura ou simplesmente adsorvida na superfície (Couvreur e cols., 2002). Calvo e

colaboradores (1997b) prepararam emulsões submicrométricas e NC de PCL, em que a QUI foi

incorporada à interface óleo/água para fornecer carga positiva às nanopartículas (+ 37 mV a + 61

mV), objetivando facilitar a interação destas com as membranas biológicas, aumentando a

capacidade de transportar fármacos e prevenindo a desestabilização das nanoestruturas devido a

adsorção de cátions e proteínas catiônicas presentes nos fluidos biológicos.

Em relação às medidas de potencial zeta (tabela 12), os valores mantiveram-se

positivos, caracterizando um recobrimento pela quitosana (Santander-Ortega e cols., 2011; Meng e

cols., 2011), até concentrações de CloxB de 5,0 mg/mL. A utilização de 0,15 % de QUI na

formulação conferiu um potencial zeta positivo para as formulações em torno de +25 mV,

corroborando com os valores positivos obtidos por outros autores para nanopartículas com o mesmo

revestimento (Calvo e cols., 1997b; Campos e cols., 2003; Prego e cols., 2005). O potencial

positivo é devido à presença dos grupamentos amino do polissacarídeo quitosana (Calvo e cols.,

1997a; Felt e cols., 1998). O diâmetro de partícula e população unimodal mostraram-se compatíveis

RAQUEL, GC

60

com as nanopartículas obtidas pelo método de nanoprecipitação (Fessi e cols., 1988; Couvreur e

cols., 2002). Os valores elevados de potencial zeta favorecem a estabilidade da formulação, uma

vez que as partículas não sofrerão atração umas pelas outras e, portanto, não tenderão à agregação.

Quando uma concentração mais elevada de CloxB, de 7,0 mg/mL, é adicionada à formulação, é

observada uma brusca redução do potencial zeta, para valores negativos e próximos a zero. O valor

negativo sugere uma interferência do fármaco sobre o recobrimento com quitosana, uma vez que

prevalece uma carga característica de NP que contêm somente o polímero PCL (Tabela 12) (Verger

e cols.,1998).

A tendência à sedimentação da suspensão coloidal de nanopartículas em longo prazo

e estudos de estabilidade podem ser monitorados pela determinação de mudanças na distribuição de

tamanho de partículas das suspensões coloidais (Magenhein e cols., 1991). No estudo de

estabilidade de armazenamento, as NS também mantiveram tamanho próximo ao inicial, sem

diferença significativa (p<0,05), até concentrações de fármaco de 3,0 mg/mL (Figura 25).

Figura 25: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NS recém-preparadas e

após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2 meses (p<0,05)

utilizando teste ANOVA.

Quanto às nanocápsulas, os resultados de tamanho médio mostram um aumento

significativo (p<0,05) no tamanho das NC com o aumento da concentração do fármaco, o que está

de acordo com trabalho anterior (Araujo, 2009). Entretanto, mesmo com essa elevação, as partículas

RAQUEL, GC

61

ainda apresentam tamanho médio e I.P. aceitáveis até concentrações de CloxB de 7,0 mg/mL

(Tabela 13).

Araújo(2009) relatou que o tamanho da NC revestida com quitosana contendo

cloxacilina benzatina a 2,5 mg/ml foi de 291 nm com IP de 0,319. Já no presente trabalho estes

resultados foram de 353,7 nm e 0,398. Isto pode ser devido aos diferentes tipos de óleo, tensoativos

e peso molecular da quitosana utilizados.

Tabela 13: Efeito da concentração de Cloxacilina Benzatina no tamanho de NC

NC CloxB

(mg/mL)

Tamanho médio

(nm) ± DPa

Índice de

Polidispersão

(nm) ± DPa

Potencial

Zeta (ζ)

(mV) ± DPb

30 - 263,7 ± 1,6 0,155 ± 0,02 +23,7±2,3

NcA 0,5 264,9 ± 3,7 0,194 ± 0,03 +39,4±0,7

NcB 1,0 295,3 ± 2,0 0,204 ± 0,04 +41,3±2,7

NcC 2,0 282,0 ± 6,1 0,230 ± 0,02 +28,2±0,7

NcD 2,5 353,7 ± 5,3 0,398 ± 0,07 +30,8±0,7

NcE 3,0 328,3 ± 1,5 0,336 ± 0,02 +28,5±2,3

NcF 5,0 403,2 ± 11,7 0,403 ± 0,01 +34,7±1,9

NcG 7,0 349,6 ± 1,9 0,335 ± 0,01 -26,7+1,3

NcH 8,0 429,1 ± 6,3 0,402 ± 0,02 -24,3±4,3

NcI 10,0 380,6 ± 4,9 0,252 ± 0,02 -28,2±5,4

Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4),

bDP= desvio padrão (n=3). Formulações significativamente

diferentes (p<0,05) utilizando teste ANOVA.

As medidas de potencial zeta (Tabela 13) apresentaram valores positivos para

concentrações de fármaco até 5,0 mg/mL, caracterizando um recobrimento superficial das NP pela

quitosana (Santander-Ortega e cols., 2011; Meng e cols., 2011; Araújo, 2009), semelhante ao que

foi observado para as nanoesferas. Se comparado o valor de NC revestida com quitosana contendo

2,5 mg/ml deste trabalho (+30 mV) com o do trabalho anterior de Araujo (+16,5mV) é observado

um valor absoluto maior do primeiro em relação ao segundo, indicando uma maior estabilidade em

longo prazo (Araújo, 2009). Em concentrações mais elevadas de CloxB, de 7,0; 8,0 e 10,0 mg/mL,

nota-se uma brusca redução do potencial zeta, para valores negativos próximos a -20 mV. Assim

RAQUEL, GC

62

como suposto para as NS, o valor negativo sugere uma interferência do fármaco sobre o

recobrimento com quitosana. Provavelmente, o sal benzatino está dissolvido no núcleo oleoso da

NC, enquanto a cloxacilina, que apresenta carga negativa, interage com as cargas positivas da

quitosana. Sendo assim, com um excesso de fármaco, todas as cargas positivas da quitosana podem

ter sido neutralizadas pelas cargas negativas da cloxacilina, restando ainda um excedente de cargas

negativas, devido à alta concentração do fármaco.

No estudo de estabilidade de armazenamento, as NC mantiveram tamanho próximo

do inicial, sem diferença significativa (p<0,05), até concentrações de fármaco de 5,0mg/mL (Figura

26).

Figura 26: Estabilidade no armazenamento referente ao diâmetro médio de NC recém-preparadas e

após 90 dias (4ºC). Volume final das formulações: 5 mL. *Aumento significativo de tamanho após 2 meses (p<0,05)

utilizando teste ANOVA.


4.2.1 Porcentagem e Eficiência de encapsulação

A porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor de fármaco incorporado

às nanoestruturas em relação ao total de fármaco presente na suspensão coloidal final de NP. A

determinação da quantidade de fármaco associada às NP é especialmente complexa devido ao

RAQUEL, GC

63

tamanho reduzido dessas, o que dificulta a separação da fração de fármaco livre da fração associada

à NP. Uma técnica de separação bastante utilizada é a ultracentrifugação, na qual a concentração de

fármaco livre e solúvel, presente na suspensão, é determinada no centrifugado. Por sua vez, a

concentração total de fármaco é geralmente determinada pela completa dissolução da NP em um

solvente adequado. Dessa maneira, a concentração do fármaco associado às nanoestruturas é

calculada pela diferença entre as concentrações de fármaco total e livre. Os valores de porcentagem

e eficiência de encapsulação (EE) estão apresentados nas tabelas 14 e 15.

As NS apresentaram baixa EE para formulações contendo maiores concentrações de

fármaco (5,0 e 7,0 mg/mL), devido à instabilidade dessas nanopartículas. Um resultado

contraditório foi uma baixa porcentagem e eficiência de encapsulação para a NS contendo 0,5

mg/mL de CloxB, o que pode ter ocorrido devido a problemas de agregação pelo potencial de

superfície.

A análise da quantidade em massa de CloxB em NS, considerando a eficiência de

encapsulação, mostra que pode ser encapsulada uma quantidade máxima de 1437,21 µg de fármaco.

Tabela 14: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NS com variadas

concentrações de CloxB

NS

CloxB

(mg/mL)

%

Encapsulação

± DPa

Eficiência de

Encapsulação

(%) ± DPa

Massa de pptb

(μg)

Massa CloxB

encapsuladac

(μg)

NsA 0,5 54,86 ± 1,73 21,89 ± 0,77 10,59 109,47

NsB 1,0 74,26 ± 2,26 47,85 ± 1,62 155,97 478,53

NsC 2,0 67,20 ± 0,51 41,83 ± 0,16 127,89 836,66

NsD 2,5 67,15 ± 1,86 46,57 ± 3,48 91,26 1164,31

NsE 3,0 67,79 ± 1,55 47,90 ± 3,5 97,19 1437,21

NsF 5,0 55,23 ± 2,05 25,96 ± 1,40 1696,48 1298,43

NsG 7,0 44,67 ± 5,02 13,98 + 1,89 3521,69 979,19

Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=3).

bprecipitado dosado após filtração das formulações.

cmassa CloxB

encapsulada considerando a eficiência de encapsulação.

Semelhante ao ocorrido com as nanoesferas, as NC também apresentaram baixa EE

para formulações contendo maiores concentrações de fármaco (5,0; 7,0; 8,0 e 10,0 mg/mL), devido

à instabilidade dessas nanopartículas. Entretanto, a porcentagem de encapsulação foi maior que a de

RAQUEL, GC

64

nanoesferas. Esse resultado está de acordo com estudos realizados anteriormente, que mostram que

as NC encapsulam maior quantidade em peso de fármacos lipofílicos que as NS (Barratt, 2000;

Santos-Magalhães & Mosqueira, 2010) devido a problemas estéricos de acomodação das moléculas

na matrix polimérica.

Observa-se, pela comparação entre as tabelas 14 e 15, que as nanoesferas são mais

influenciadas pelo aumento da concentração de CloxB, sofrendo uma maior redução na

porcentagem de encapsulação. As NC, teoricamente, podem acomodar uma maior quantidade de

fármaco em seu núcleo líquido, se comparado à estrutura matricial das NS (Mosqueira e cols.,

2006). Há uma quantidade máxima de CloxB que pode ser encapsulada tanto em NC quanto em NS,

provocando menores efeitos na carga superficial, no tamanho médio e na teor de fármaco

encapsulado.

Tabela 15: Porcentagem e eficiência de encapsulação de formulações de NC com variadas

concentrações de CloxB

NC CloxB

(mg/mL)

% Encapsulação

± DPa

Eficiência de

Encapsulação

(%) ± DPa

Massa de

pptb (μg)

Massa CloxB

encapsuladac

(μg)

NcA 0,5 78,32 ± 1,97 58,14 ± 6,27 30,27 290,70

NcB 1,0 79,55 ± 0,26 52,65 ± 0,05 0,24 526,52

NcC 2,0 78,96 ± 0,41 36,90 ± 0,19 270,96 738,13

NcD 2,5 77,78 ± 0,29 36,16 ± 0,32 504,69 904,12

NcE 3,0 72,27 ± 0,19 21,80 ± 0,06 1298,31 654,07

NcF 5,0 59,46 ± 0,13 16,03 ± 0,04 2656,27 801,74

NcG 7,0 64,26 ± 0,39 11,54 ± 0,17 4839,31 808,35

NcH 8,0 64,36 ± 1,33 10,55 ± 0,69 5576,75 844,41

NcI 10,0 68,69 ± 0,41 12,45 ± 0,17 6736,62 1245,54

Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=3).

bprecipitado dosado após filtração das formulações.

cmassa CloxB

encapsulada considerando a eficiência de encapsulação.

De acordo com estudos publicados, diversos fatores são capazes de influenciar a

quantidade de fármaco associada a sistemas nanoestruturados, dentre os quais se destacam as

características físico-químicas do fármaco (Calvo e cols., 1996), o pH do meio (Brasser e cols.,

1991), as características da superfície das partículas ou a natureza do polímero (Vila e cols., 2002) e

RAQUEL, GC

65

a quantidade de fármaco adicionada à formulação (Brasser e cols., 1991). Modificando-se as

características de superfície das partículas, é possível obter diferentes taxas de encapsulação do

fármaco, para uma mesma concentração inicial do mesmo.

Em comparação a resultados já obtidos em nosso laboratório (Araújo, 2009), as

nanopartículas recobertas de quitosana apresentadas no presente trabalho mostraram uma maior

taxa de encapsulação de CloxB se comparadas a NP contendo somente polímero PCL (potencia zeta

negativo). Como exemplo, podemos citar as NC com 0,5 mg/mL de CloxB. As NC negativas

apresentaram 67% de porcentagem de encapsulação e 34% de eficiência de encapsulação, enquanto

para as NC positivas, recobertas com quitosana, os valores foram de 78,32% e 58,14%,

respectivamente (Tabela 15) (Araújo , 2009). Os dados reforçam os argumentos já discutidos nesse

trabalho, de que a presença da quitosana, um polímero carregado positivamente, pode interagir com

o ânion cloxacilina e favorecer a sua adsorção na superfície das NP.

4.3 Análise visual e de microscopia óptica das nanopartículas

Após um mês de preparo das nanopartículas, essas foram analisadas visualmente

quanto à formação de precipitado. Foi observada formação de precipitado nas seguintes

formulações:

- NsF e NsG (contendo 5,0 e 7,0 mg/mL de CloxB, respectivamente)

- NcF, NcG, NcH e NcI (contendo 5,0; 7,0; 8,0 e 10,0 mg/mL de CloxB,

respectivamente).

Nas figuras 28, 29 e 30, é possível observar a formação de precipitado, atribuído ao

fármaco, em algumas das formulações citadas acima. As imagens, associadas ao aumento de

tamanho médio após três meses e à redução na porcentagem e eficiência de encapsulação e na carga

superficial de tais formulações, indicam que o aumento da concentração de fármaco, reduz a

estabilidade da partícula. Além disso, sugerem que o limite de fármaco passível de ser encapsulado,

foi excedido. A estabilidade dos sistemas coloidais foi, provavelmente, comprometida pela redução

da carga superficial das nanopartículas, induzindo agregação dessas.

RAQUEL, GC

66

Figura 27: Fotografia de formulações de nanoesferas, com destaque para a formação de precipitado

provocado pelo aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NsC (1,0 mg/mL de CloxB)

e (b) NsG (7,0 mg/mL de CloxB).

Figura 28: Fotografia de formulações de nanoesferas, comparando duas formulações com a mesma

composição, mas com diferentes concentrações de fármaco. (a) NsC contendo 1,0 mg/mL de

CloxB, sem precipitado aparente e (b) NsF contendo 5,0 mg/mL de CloxB, com precipitado

aparente.

RAQUEL, GC

67

Figura 29: Fotografia de formulações de nanocápsulas, com destaque para a formação de

precipitado provocado pelo aumento da concentração de fármaco à formulação. (a) NcC (1,0

mg/mL de CloxB), (b) NcG (7,0 mg/mL de CloxB) e (c) NcI (10,0 mg/mL de CloxB).

Em seguida foram feitas fotomicrografias de algumas formulações, a fim de

visualizar cristais de fármaco nas formulações em que havia agregado aparente. As fotomicrografias

foram realizadas em Microscópio Óptico, obtendo-se imagens de duas NS (NsC e NsG) e duas NC

(NcG e NcI). A Figura 30, demonstra a imagem comparativa entre uma NS em que não há

formação de precipitado aparente (NsC) e uma em que há precipitado aparente (NsG). Para as

nanoesferas, mesmo aquelas em que há formação aparente de precipitado, não foi possível observar

cristais de fármaco. Apenas é possível visualizar agregados grosseiros, atribuídos tanto às partículas

quanto ao fármaco.

Figura 30: Fotomicrografia de formulações de nanoesferas, em que é possível comparar uma NsC

em que não há formação de precipitado (a) e uma NsG em que há formação de precipitado (b).

RAQUEL, GC

68

Destaca-se a visualização de agregados, atribuídos às nanopartículas e ao fármaco, na imagem b.

Aumento 1000x.

Na Figura 31, estão representadas fotomicrografias de nanocápsulas com formação

de precipitado e é possível observar estruturas semelhantes a cristais, que foram atribuídas à CloxB.

A imagem A representa a NcG, sendo possível observar cristais refringentes à esquerda e à direita

da imagem, além de alguns agregados de nanopartículas. Na imagem B, que representa a NcI, nota-

se ao centro um grande agregado de cristais, atribuído à CloxB a vários agregados de nanopartículas

por toda a extensão da lâmina.

Figura 31: Fotomicrografia de formulações de nanocápsulas, em que é possível observar cristais,

atribuídos à precipitação da CloxB. (a) NcG e (b) NcI. Aumento 1000x

4.4 Análise morfológica das nanopartículas

Nanoesferas recobertas por QUI contendo 0,5mg/mL CloxB encapsulada foram

analisadas morfologicamente por microscopia de força atômica. As imagens obtidas podem ser

visualizadas nas figuras 33, 34 e 35 e. Nas imagens da Figura 32, podem ser observadas partículas

depositadas sobre a mica recentemente clivada, indicando a presença de estruturas esféricas

nanométricas. É possível visualizar também uma maior quantidade de partículas apresentando

tamanhos variados, o que está de acordo com o aumento do índice de polidispersão das NS com

fármaco encapsulado (0,133) em relação à NS branca (0,099). Na imagem topográfica da Figura 33,

é possível notar que há um aumento no tamanho médio da NS contendo fármaco (312,5 nm) em

relação à NS branca (280,5), o que está de acordo com as medidas de tamanho médio por ECF.

RAQUEL, GC

69

Figura 32: Imagem de MFA de nanoesferas, altura (a) e imagem de fase (b). Escaneamento 10 μm

x 10 μm. Z range: 200 nm. Observa-se grande número de partículas com tamanhos variados.

Figura 33: Imagem de altura de MFA de nanoesferas contendo 0,5 mg/mL de CloxB (a) e perfil

topográfico (b) demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e

verdes).Relação d/h = 5,1.

Na imagem tridimensional da Figura 34, são observadas estruturas esféricas, assim

como observado anteriormente para NS brancas.

(a) (b)

RAQUEL, GC

70

Figura 34: Imagem tridimensional de nanocápsulas contendo 0,5 mg/mL de CloxB analisadas por

MFA. Escaneamento de 5 x 5 μm. Z range: 200nm.

Quando foram feitas imagens sucessivas da mesma região da amostra de NS (Figura

35), é observado um escurecimento da NP a cada passagem da sonda, o que pode ser mais um

indício de que a NS apresenta estrutura mais macia e deformável, não observado em nanoesferas

produzidas exclusivamente a partir do PCL.

RAQUEL, GC

71

Figura 35: Imagens de MFA de fase de NS destacando escurecimento das NP com a passagem

sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10 μm. Z range: 341 nm.

Ainda a respeito das NS contendo 0,5 mg/mL de CloxB, à medida que as NP vão

escurecendo pela passagem da sonda, a superfície irregular da partícula fica mais visível (Figura

36).

RAQUEL, GC

72

Figura 36: Imagem MFA de NS, fase, destacando a superfície irregulares da NS com 0,5 mg/mL

de CloxB e seu escurecimento pela passagem sucessiva da sonda (a, b, c). Escaneamento 1,5 μm x

1,5 μm. Z range: 341 nm.

Conforme já discutido no capítulo 1, a obtenção de imagens de NC é difícil, devido

ao arraste da partícula pela sonda. Nas figuras 38 e 39, são apresentadas imagens de NC contendo

1,0 mg/mL de CloxB, depositadas sobre mica recentemente clivada.

A Figura 37 demonstra estruturas esféricas de NC, com uma maior dispersão de

tamanho médio, o que está de acordo com os dados obtidos anteriormente, uma vez que a adição de

fármaco à formulação contribui para o aumento do índice de polidispersão das partículas.

Figura 37: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB, destacando

escurecimento das NP com a passagem sucessiva da sonda (a, b,c,d). Escaneamento 10 μm x 10

μm. Z range: 400 nm.

RAQUEL, GC

73

A Figura 38 apresenta o perfil topográfico da NC com 1,0 mg/mL de CloxB, a qual

apresenta relação diâmetro/altura (D/h) de 7,5, caracterizando achatamento da NC devido à sua

estrutura vesicular, conforme discutido anteriormente no capítulo 1.

Figura 38: Imagem de MFA de NC contendo 1,0 mg/mL de CloxB (a) e perfil topográfico (b)

demonstrando altura das nanoesferas (setas vermelhas) e diâmetro (setas azuis e verdes). Relação

d/h = 7,5.

Foi avaliado também o tamanho médio das NP contendo CloxB, medidos por MFA,

e estes comparados à medida realizada pela técnica de ECF. Os resultados estão apresentados na

Tabela 16

Tabela 16: Tamanho médio de NS e NC com 1,0 mg/mL de CloxB analisadas por ECF e MFA

NPa

Tamanho médio ±

DPa (nm) (ECF)

Tamanho médio ±

DPb (nm) (MFA)

Índice de

polidispersãoc

NS 230,8 ± 0,71 295,91 ± 30,89 0,101 ± 0,02

NC 295,3 ± 1,98 328,8 ± 47,04 0,204 ± 0,04




dDP= desvio padrão

(n=3).

RAQUEL, GC

74

4.5 Solubilidade da CloxB em PBS com diferentes quantidades de leite

A solubilidade em PBS e PBS+30% leite (Nestlé) apresentou-se elevada, com

valores acima do esperado. Esta elevada solubilidade pode ter sido favorecida pela temperatura

(37ºC) e pela presença de grupamentos carboxila e hidroxila da cloxacilina, a qual está presente na

CloxB em proporção de 2 moléculas de cloxacilinas para 1 de benzatina (2:1). Os dados da Tabela

17 mostram que a solubilidade da CloxB em PBS contendo 70% de leite é maior que a solubilidade

em PBS contendo 30% de leite. Dessa maneira, o meio PBS + 70% de leite foi selecionado para os

estudos de cinética de liberação in vitro. Além disso, deve-se considerar que a CloxB pode se ligar a

algumas substâncias presentes no leite, tais como gorduras, proteínas, entre outros, o que aumenta a

solubilidade desse fármaco em amostras contendo leite.

Tabela 17: Solubilidade da CloxB em diferentes meios

Meios Solubilidade

(μg/mL) a 37ºC

PBS 713,47

PBS + 30% leite 675,30

PBS + 70% leite 1070,96

PBS: tampão fosfato salino pH7,4. Leite em pó integral ressuspendido conforme fabricante (Nestlé).

Os resultados da Tabela 17 demonstram que a solubilidade da CloxB no óleo

Miglyol® é aproximadamente quatro vezes maior que a sua solubilidade no óleo Velsan®. Esse

resultado justifica a utilização do Miglyol® em substituição ao Velsan® para o encapsulamento de

CloxB, apesar de ter sido demonstrado no capítulo 1 que o Velsan® leva à formação de NC de

menor tamanho que o Miglyol® (dados apresentados na Tabela 9 – capítulo 1).

Outra informação obtida na Tabela 17 é a respeito da hidrofobicidade da CloxB.

Observa-se que a solubilidade do fármaco em água é cerca de duas vezes menor que em Miglyol®,

indicando que a CloxB possui, predominantemente, grupamentos hidrofóbicos em sua composição,

o que justifica a boa encapsulação desse em NS e NC. O resultado de solubilidade em água está de

acordo com dados previamente obtidos por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009), em que foi

encontrada solubilidade de 0,3 mg/mL. Em relação à solubilidade da CloxB em meios contendo

PBS e leite, essa apresenta quase o dobro de solubilidade em PBS contendo 70% de leite. Esta

maior solubilidade pode ter sido obtida pelo fato de o leite possuir substâncias como lipídeos,

proteínas, entre outras, às quais a CloxB pode se ligar, aumentando sua solubilidade nesse meio

RAQUEL, GC

75

(Rossi & Wright, 1997). Sendo assim, esse meio foi selecionado para os estudos de liberação em

leite.

4.6 Determinação da cinética de Liberação in vitro

O sistema de liberação controlado de fármacos foi desenvolvido com o objetivo de

favorecer a condução, captação, retenção e liberação do fármaco no local e doses adequados e por

um período prolongado (Langer, 1990). O estudo do perfil de liberação in vitro fornece informações

fundamentais a respeito dos processos físico-químicos e dos mecanismos que influenciam a taxa de

liberação de fármacos. Os dados obtidos favorecem uma abordagem científica para o a projeção e

desenvolvimento de sistemas de liberação sustentada com propriedades desejáveis (D´Souza e cols.,

2005).

Três possíveis mecanismos de liberação do fármaco a partir de sistemas constituídos

de polímeros biodegradáveis são os seguintes, a saber: (i) difusão através do polímero, (ii) difusão

através dos poros da matriz polimérica e (iii) liberação do fármaco através da erosão do polímero

(Jeong e cols., 2003). Entretanto, predizer o perfil de liberação exato de um fármaco ainda é difícil,

pois esse perfil é governado por diversos fatores, dentre os quais: interação polímero-fármaco

(Blanco e cols., 1997), a interação fármaco-fármaco (Kang e cols., 2008), a adsorção de água (Desai

e cols., 2010), e o fechamento dos poros existentes na matriz (Kang e cols., 2008).

O transporte através do polímero pode ocorrer quando a molécula do fármaco for

pequena e hidrofóbica (Raman e cols., 2005). Contudo, o fármaco deve entrar na fase aquosa, na

superfície ou nos poros dentro dos sistemas de liberação controlada, antes de ser liberado. O

fármaco encapsulado também pode ser liberado sem qualquer transporte devido à degradação do

polímero, isto é, sua erosão. Esta gera poros e assim aumenta a taxa de difusão (Raman e cols.,

2005). Parte do fármaco pode também, permanecer adsorvida à superfície da partícula. Nesse caso,

o fármaco adsorvido se dissolve em contato com o meio de liberação, sendo liberado mais

rapidamente, num chamado “efeito burst”, o qual, em geral, é seguido por uma liberação mais lenta

a partir do interior da partícula (Dash e cols., 2011a). No caso de NC, que são sistemas

reservatório, espera-se, em geral, uma liberação mais rápida do fármaco que de NS, que são

sistemas matriciais. Isto porque a difusão do fármaco através da parede polimérica das NC deve ser

mais rápida que através da matriz polimérica das NS.

A degradação do PCL é bastante lenta, se comparada a outros polímeros (Pitt, 1990).

O mecanismo de liberação de fármacos a partir de sistemas coloidais contendo PCL é geralmente

dominado pela difusão do fármaco através da matriz polimérca (Sinha e cols., 2004; Mukerjee e

RAQUEL, GC

76

cols., 2007). Sendo assim, em geral formulações compostas por PCL liberam a droga em um padrão

bifásico, na qual a liberação em “burst” é mais acentuada para fármacos hidrofílicos que lipofílicos

(Dash e cols, 2011b).

A quitosana é um polímero hidrofílico e a difusão de água no interior e sua matriz é

rápida, anterior à sua degradação. Sendo assim, sistemas constituídos de quitosana absorvem água e

intumescem (Ren e cols., 2005), afetando a liberação de fármacos nesses sistemas. A liberação de

fármacos, a partir de sistemas particulados compostos de quitosana, usualmente segue três

mecanismos: (i) liberação a partir da superfície das partículas, (ii) difusão através da matriz

intumescida e (iii) liberação devido à erosão da superfície da partícula (Dash e cols., 2011a). Na

maioria dos casos, a liberação segue mais de um dos mecanismos citado. Na liberação a partir da

superfície da partícula, ocorre o chamado “efeito burst”, citado acima.

A liberação controlada através da difusão ocorre em três etapas: (a) a água penetra no

sistema particulado, (b) a matriz vítrea se torna emborrachada e intumesce, (c) a droga se difunde a

partir da matriz intumescida (Dash e cols., 2011a). Esse tipo de liberação é inicialmente lento, mas

se torna mais rápido quando o fármaco se dissolve e a matriz intumesce.

Nas formulações descritas no presente trabalho, há a influência dos polímeros PCL e

quitosana na liberação do fármaco CloxB. Assim, é provável que a liberação da CloxB resulte em

quatro possíveis mecanismos de liberação (Fig. 29):

Liberação de fármaco adsorvido à superfície da partícula (“efeito burst”);

Difusão através da matriz polimérica intumescida;

Difusão através dos poros do polímero.

O perfil de liberação é usado como base para a avaliação dos mecanismos envolvidos

no processo. Entretanto, conforme citado anteriormente, este perfil de liberação de fármacos é

algumas vezes bifásico ou trifásico. A interpretação quantitativa dos valores obtidos no teste de

liberação/dissolução é facilitada pelo uso de equações genéricas, que matematicamente traduzem a

curva de dissolução em função de alguns parâmetros relacionados com a forma farmacêutica (Costa

& Lobo, 2001). Vários modelos cinéticos têm sido propostos para descrever as características de

liberação do fármaco em sistemas poliméricos (Fredenberg e cols., 2011). Dentre estes, dois dos

mais importantes e facilmente aplicáveis, são o modelo de Higuchi e modeo de Korsmeyer-Peppas,

cujas equações são descritas abaixo:

RAQUEL, GC

77

Modelo de Higuchi

Mt/M∞ = KHt1/2

(1)

Modelo de Korsmeyer-Peppas

Mt/M∞ = Ktn (2)

Onde Mt é a quantidade do fármaco liberada no tempo t, M∞ a quantidade total de

fármaco num tempo infinito, e K é a constante cinética.

O Modelo de Higuchi (1) descreve o mecanismo de liberação dos fármacos como um

processo de difusão baseado na lei de Fick, sendo dependente da raiz quadrada do tempo. Porém, o

uso desta relação em sistemas que intumescem, tais como aqueles compostos de quitosana, pode

tornar-se insuficiente, uma vez que esses sistemas podem sofrer erosão (Costa & Lobo, 2001).

Um dos critérios mais comuns para se escolher um modelo que melhor descreve o

perfil de liberação de determinada formulação é através do coeficiente de correlação linear, r2. Para

tanto, realiza-se a regressão linear para cada modelo, sendo que o modelo mais adequado para

aquela formulação será aquele que apresentar o maior r2

(Costa & Lobo, 2001).

O Modelo de Korsmeyer-Peppas, 1983, (4) é geralmente usado para analisar a

liberação de formas farmacêuticas poliméricas quando o mecanismo não está bem esclarecido ou

quando resulta da combinação de dois processos aparentemente independentes: difusão do fármaco

(transporte Fickiano) e do chamado transporte caso II (não Fickiano, controlado pela erosão do

polímero e relaxamento das cadeias poliméricas). Os valores do expoente difusional (n) são usados

a fim de caracterizar diferentes mecanismos de liberação. A Tabela 18 mostra os valores de n

agrupados para cada geometria de forma farmacêutica correlacionando o mecanismo de liberação

proveniente a cada valor.

Tabela 18: Modelização dos mecanismos de liberação de fármacos a partir de sistemas poliméricos

de liberação controlada considerando as diferentes geometrias

Expoente difusional (n) Mecanismo de liberação do

fármaco

Filmes Cilindos Esferas

0,5 0,45 0,43 Difusão fickiana

0,5 < n < 1,0 0,45 < n < 0,89 0,43 < n < 0,85 Transporte anômalo

1,0 0,89 0,85 Transporte caso II

> 1,0 > 0,89 > 0,85 Transporte super-caso II

Fonte: adaptado de Costa & Lobo, 2001.

RAQUEL, GC

78

Os resultados referentes aos perfis de liberação da CloxB a partir de NS e NC

poliméricas estão apresentados nas figuras 40 e 41.

Figura 39: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS em

condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS). Gráfico maior = tempos de 0 a

2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos.

A dissolução da CloxB em PBS é mais rápida que sua liberação das NP nos

primeiros 180 minutos, confirmando a hipótese de liberação sustentada das NP (Figura 39).

Entretanto, após esse periodo a liberação da CloxB das NC é tão rápida quanto a dissolução do

fármaco livre. Essas diferenças podem ser atribuídas à capacidade das NS, em particular, em reter o

fármaco disperso na sua matriz polimérica (Irache e cols., 2011, Rao e cols., 2011). O efeito burst é

pronunciado para os dois tipos de NP, indicando uma grande quantidade de fármaco associado à

superfície das NP (40-60%). Esse resultado está de acordo com valores obtidos de potencial zeta,

discutidos previamente neste capítulo. Após 6 h (360 minutos), ambas as formulações apresentaram

liberação próxima a 100% (91% para NS e 89% para NC), mantendo a porcentagem de fármaco

liberada a partir desse tempo. Esse resultado está de acordo com trabalho anterior realizado por

nosso grupo de pesquisa(Araújo, 2009), onde NC revestidas de quitosana contendo 2,5 mg/mL de

CloxB apresentaram liberação em PBS contendo 1% de leite de mais de 70% após 6 h. Foi

determinado a LogP da CloxB, obtendo-se um valor de 0,6, o que indica uma substância com

relativa hidrofilia. Fármacos mais hidrofílicos, como a cloxacilina, em geral apresentam liberação

mais rápida em condições sink, mesmo quando encapsulados na forma de sal benzatino. Além disso

presença da quitosana, um polímero hidrofílico, favorece a captação de água, com conseqüente

RAQUEL, GC

79

intumescimento do polímero, facilitando a dissolução do fármaco e fornecendo uma liberação mais

rápida. Resultados anteriores, obtidos por nosso grupo de pesquisa (Araújo, 2009), mostraram que a

liberação de CloxB a partir de NC de PCL-QUI foi mais rápida que as de NC de PCL. A associação

do ânion cloxacilina com a interface da NP é, aparentemente, facilitada pela carga positiva dos

grupos de quitosana. A membrana de diálise no meio PBS parece não ser uma barreira à difusão,

porque o perfil de dissolução não se apresentou muito diferente do perfil de liberação. Esse fato

valida o método de diálise reversa para o estudo desse tipo de liberação em condições sink.

Figura 40: Perfil de liberação in vitro de NP (NS 1,0mg/mL e NC 1,0mg/mL) a 37ºC em PBS+

70% leite em condições sink (2,5% da solubilidade máxima de CloxB em PBS+leite). Gráfico

maior = tempos de 0 a 2880 minutos; Gráfico menor= tempos de 0 a 180minutos.

Formulações visando administração intramamária em vacas, durante ou após o

periodo de lactação, devem ser avaliadas em meios contendo baixas e altas procentagens de leite, de

acordo com o perído de administração (período seco ou período de lactação). A metodologia para

avaliar a liberação da droga de carreadores nanoparticulados nessas condições é bem mais

complexa, porque gotículas de leite, com cerca de 0,5 μm (Keenan e cols., 2000) interferem na

separação de NP do meio externo. Além disso, há a possibilidade da CloxB se associar a proteínas e

lipídeos do leite (Rossi & Wright, 1997), o que pode facilitar a liberação de drogas das NP. Por

outro lado, esse fato pode impedir a difusão da CloxB liberada para dentro da membrana de diálise,

mecanismo que ocorre na técnica de diálise reversa, comprometendo o experimento em presença de

leite. Sendo assim, entre as diferentes metodologias, a diálise direta é uma alternativa para o estudo

da liberação em meio contendo leite. Sua desvantagem é a simulação de liberação em meios nos

RAQUEL, GC

80

quais a contato entre a NP e o meio não é direta. Apesar disso, a diálise direta foi utilizada nesse

trabalho devido à sua simplicidade e aplicabilidade. O perfil de liberação da CloxB de PCL-QUI-

NP em PBS contendo 70% de leite é mostrado na Figura 40. Há um burst inicial, mais pronunciado

para NC, assim como observado na liberação em PBS. A NC liberou CloxB mais rápido que a NS

ao longo de todo o experimento, pois NS são sistemas matriciais e liberam o fármaco mais

lentamente. Após 360 minutos, NS haviam liberado 37% da CloxB e as NC 47%, enquanto 67% da

CloxB livre havia sido dissolvida. Após 48 horas de experimento, a quantidade máxima de CloxB

liberada das NS era 70% e das NC era 73%. Esses resultados sugerem que as NP são capazes de

reter a CloxB em meios contendo leite. Uma vez que o meio utilizado no estudo se assemelha

àquele encontrado no local de administração – glândula mamária – a retenção de cerca de 30% da

CloxB, mesmo após 48 h de estudo, evidenciam a aplicabilidade dessas formulações. Os resultados

obtidos com essa metodologia foram diferentes daqueles obtidos em PBS, provavelmente devido às

diferentes técnicas aplicadas e à presença do leite no meio de liberação.

Visando auxiliar o entendimento dos mecanismos de liberação do fármaco, alguns

modelos matemáticos foram aplicados de forma à descrever matematicamente o fenômeno, para

ambas as técnicas de liberação in vitro. Na Tabela 19 são apresentados os valores de coeficiente de

correlação linear (r2), coeficiente difusional (n) e constante de velocidadede liberação (k) obtidos a

partir da construção de gráficos nos modelos de Higuchi (raiz quadrada do tempo em função da

porcentagem liberada) e modelo de Korsmeyer-Peppas. Além disso, foram construídas as equações,

correspondentes ao modelo selecionado para cada formulação.

Tabela 19: Parâmetros cinéticos de liberação resultantes da aplicação dos modelos matemáticos de

Higuchi e Korsmeyer-Peppas aos dados de liberação da CloxB a partir de NC e NS

Formulação/meio de

liberação

Modelo de Higuchi modelo de Korsemeyer-Peppas Mecanismo de

transporte r

2 K r

2 k n

NSPBS 0,6998 0,046 0,9671 0,163 0,269 Difusão Fickiana

NCPBS 0,6053 0,036 0,8093 0,298 0,174 Difusão Fickiana

NSPBS-Leite 0,9320 0,021 0,989 0,057 0,326 Difusão Fickiana

NCPBS-Leite 0,8709 0,026 0,9832 0,044 0,389 Difusão Fickiana

r2: coeficiente de correlação linear;

k: constant de velocidade de liberação, n: expoente difusional, NS: nanoesfera,

NC: nanocapsula. NS e NCPBS = estudo de liberação em PBS a 37oC. NS e NCPBS-Leite = estudo de liberação em PBS

com 70% de leite integral a 37oC; Modelos de Higuchi e Korsemeyer-Peppas (Costa & Lobo, 2000).

RAQUEL, GC

81

A liberação da CloxB a partir de NP de PCL-QUI é melhor descrita pelo modelo

matemático descrito por Korsmeyer-Peppas (1983) (Tabela 19), conforme o coeficiente de

correlação linear obtido (entre 0,809 e 0,989). Correlações menores foram obtidos para o modelo de

Higuchi (entre 0,6053 e 0,9320). O valor de expoente difusional, abaixo de 0.43 para todas as

formulações, indica que a liberação é regida principalmente pela difusão Fickiana a partir da matrix

polimérica.

A análise dos resultados obtidos no estudo de liberação mostra que a administração

de uma dose de CloxB encapsulada em NP tem potencial de controle da liberação da CloxB em

meio similar ao presente no interior da glândula mamária, se comparado ao fármaco livre.

4.7 Interação de nanocápsulas em modelo de perfusão de úbere bovino isolado

O úbere da vaca é composto por dois pares de glândulas mamárias, cada uma

drenada por um teto. Conforme descrito previamente, a produção do leite ocorre em glândulas

exócrinas que possuem alvéolos dilatados, onde o leite é estocado e em seguida liberado nos ductos.

Tais ductos convergem para a cisterna da glândula (Gehring & Smith, 2006). Em geral, após a

administração intramamária, a formulação deve ir contra o fluxo de leite, em ductos galactóforos,

para atingir o tecido proximal do úbere (em relação ao teto). Úberes isolados perfundidos foram

usados para avaliar a interação entre o tecido e a NC contendo CloxB e marcadas com quitosana

fluorescente. A atividade de LDH menor que 10 U/L e consumo de glicose maior que 0.6 mg/h

(correspondendo a 10% da glucose perfundida) garantiram a viabilidade dos úberes durante a

perfusão, no período de experimento (Kietzmann e cols., 2010). A Figura 41 mostra cortes

histológicos representativos da glândula mamária a 5, 10 e 15 cm da base do teto e um corte

controle (tecido sem NC). Podem ser observados ductos galactóforos (setas vermelhas) em todos os

cortes. A 5cm, três ductos fluorescentes estão evidenciados, mostrando a presença de NC com

quitosana marcada. Nos cortes a 10 e 15 cm é possível ver um ducto fluorescente em cada imagem,

considerando que, com o aumento da distância vertical da base do teto, há uma redução no número

e diâmetro dos ductos. Esses resultados indicam uma migração vertical das NC a partir do local de

aplicação, até regiões mais proximais do úbere (em relação ao teto). Estudos preliminares, usando

formulações convencionais de cloxacilina, descreveram que a concentração da droga diminuía com

o aumento da distância vertical da base do teto (Kietzmann e cols., 2010). Esse fato contribui para a

falha terapêutica no tratamento da mastite, pois os patógenos estão geralmente localizados nas

regiões mais proximais do úbere, como nas células envolvidas na produção e estocagem do leite

(Gruet e cols., 2001). As fotomicrografias mostram claramente a presença de fluorescência aderida

RAQUEL, GC

82

a tais regiões do úbere. Isso indica que provavelmente um tempo de contato mais prolongado dos

fármacos com os patógenos possa ocorrer nestes sítios do úbere bovino. Além disso, as NC

submicrônicas aparentemente migram contra o fluxo da glândula mamária, o que é favorecido pelo

movimento browniano intrínseco às nanopartículas. Uma vez que as vacas estavam em lactação

antes do abate e considerando que continuou ocorrendo produção de um pseudo-leite durante todo o

experimento, os resultados obtidos são promissores para estudos mais aprofundados. Portanto, uso

de carreadores nanométricos de fármacos se revela uma estratégia interessante no tratamento da

mastite.

Figura 41: Interação de NC em modelo de perfusão de úbere bovino. Glândula mamária fixada em

suporte de metal para experimento ex vivo (a), cortes histológicos representativos de tecido

mamário em microscopia de campo brilhante (b1 e c1) e de fluorescência (b2 e c2). Corte de tecido

controle (sem NC) (b1 e b2) e cortes de tecido da glândula mamária a 5, 10 e 15 cm da base do teto

após 6 horas de administração intramamária de NC de quitosana contendo CloxB (c1 e c2). As setas

vermelhas indicam os ductos galactóforos. Destaca-se a fluorescência visualizada em todos os

cortes de 5, 10 e 15 cm, demonstrando presença de NC nas regiões tanto proximais quanto distais

da base do teto. Barra = 0,15mm.

83

CAPÍTULO III

Liofilização de Nanopartículas

RAQUEL, GC

84

1. OBJETIVO GERAL

Liofilizar suspensões de nanopartículas, contendo CloxB, utilizando diferentes

condições de congelamento e crioprotetores. Realizar a caracterização físico-quimica e morfológica

do material liofilizado.


Liofilizar as formulações otimizadas de nanocápsulas e uma nanoesferas contendo 1mg/mL

de CloxB encapsulado, utilizando duas condições de congelamento – freezer -80ºC e

nitrogênio líquido – e cinco concentrações de dois crioprotetores – sacarose e glicose.

Caracterizar as nanocápsulas e nanoesferas liofilizadas quanto ao tamanho, índice de

polidispersão e potencial zeta;

Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de CloxB nas nanopartículas após liofilização e

avaliar seus efeitos sobre esses parâmetros;

Avaliar os efeitos da liofilização sobre as características de morfologia das nanopartículas

por microscopia de força atômica.

RAQUEL, GC

85


3.1 Materiais

Para os experimentos de liofilização foram usados sacarose (Isofar, Brasil) e glicose

(Vetec, Brasil), como crioprotetores. Além desses reagentes, foram usados todos os materiais

necessários à produção de NC e NS, conforme descrito no capítulo II.

Nos experimentos em modelo de perfusão em úbere bovino isoladoforam utilizados

cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, diidrogenofosfato de

sódio e hidrogenocarbonato de sódio, todos obtidos da Sigma-Aldrich (Brasil). D(+)-glicose foi

obtida da Vetec (Brasil) e dióxido de carbono e oxigênio da White-Martins (Brasil).

3.2 Preparo de nanopartículas

As nanocápsulas e nanoesferas foram preparadas conforme a metodologia descrita no

capítulo II (Mosqueira e cols., 2011). No estudo de liofilização foram usadas tanto NC quanto NS

contendo 1,0 mg/mL de CloxB.

3.3 Liofilização de nanopartículas

Selecionou-se uma nanocápsula e uma nanoesfera, com as quais foram realizados

experimentos de liofilização. A liofilização foi realizada em liofilizador L101 (Liobras, Brasil), que

atinge temperatura de -45 ± 5ºC e possui bomba de vácuo, permitindo que a pressão do sistema

fique em torno de 150 μHg. Cada formulação de nanopartícula foi liofilizada variando-se

parâmetros de congelamento, tipo e concentração de crioprotetores. O volume de amostra inserido

no liofilizador não ultrapassou 30% da capacidade desse, um parâmetro pré-fixado nos

experimentos descritos neste trabalho.

As condições utilizadas tanto para nanocápsulas quanto para nanoesferas, no presente

trabalho foram:

- Congelamento por 24h a -80ºC, seguido de liofilização por 24 horas;

- Congelamento em nitrogênio líquido (-196ºC) por 2 minutos, seguido de liofilização por 24

horas;

RAQUEL, GC

86

- Uso de sacarose ou glicose como crioprotetores nas concentrações de 2,5; 5; 10; 25 e 30%

(p/v).

Assim, a cada 0,5 mL da suspensão de nanopartículas foi adicionado mais 0,5 mL da

solução de crioprotetor em variadas concentrações, com posterior agitação, em recipientes de

plástico, conforme Tabela 20.

Tabela 20: Formulações liofilizadas com variadas concentrações de crioprotetores.

Açúcar Açúcar % (p/v) Formulação de

nanoesferas (Ns)

Formulação de

nanocápsulas (Nc)

Sacarose

2,5

5,0

10,0

25,0

30,0

Ns S 2,5%

Ns S 5%

Ns S 10%

Ns S 25%

Ns S 30%

Nc S 2,5%

Nc S 5%

Nc S 10%

Nc S 25%

Nc S 30%

Glicose

2,5

5,0

10,0

25,0

30,0

Ns G 2,5%

Ns G 5%

Ns G 10%

Ns G 25%

Ns G 30%

Nc G 2,5%

Nc G 5%

Nc G 10%

Nc G 25%

Nc G 30%

3.4 Caracterização físico química de nanopartículas

Após o preparo das NP, todas foram submetidas à caracterização físico-química por

meio da medida de distribuição de tamanho em Nanosizer N5 PLUS Beckmann Coulter (Fullerton,

EUA), conforme descrito no item 3.3.1 do capítulo I. Algumas formulações foram selecionadas

para medida de potencial zeta em Zetasizer 3000HS (Malvern Instruments, UK) conforme descrito

no item 3.3.2 do capítulo I.

RAQUEL, GC

87


O teor defármaco encapsulado foi determinado para algumas formulações

selecionadas de NC e NS. A seleção de tais formulações foi feita de acordo com as medidas de

tamanho médio obtidas pela técnica de Espectroscopia de correlação fotônica (ECF). Formulações

que apresentaram menor variação de tamanho médio e índice de polidispersão, antes e após a

liofilização, foram selecionadas.

3.6 Análise morfológica de formulações liofilizadas

A análise morfológica de NP contendo 1,0 mg/mL de CloxB encapsulada foi

realizada por microscopia de força atômica (MFA) conforme metodologia descrita no capítulo I.

RAQUEL, GC

88


4.1 Liofilização de nanopartículas

4.1.1 Tamanho médio de nanopartículas liofilizadas

O tamanho médio e o índice de polidispersão das nanoesferas e das nanocápsulas

contendo 1,0 mg/mL de CloxB, foram avaliados, antes e após a liofilização, e os resultados estão

apresentados nas tabelas 21 e 21.

Na Tabela 21 são apresentados os resultados de tamanho médio e índice de

polidispersão de nanoesferas liofilizadas utilizando dois tipos de crioprotetores (glicose e sacarose)

e duas condições de congelamento (-80oC e -196

oC – nitrogênio líquido). Foi avaliada a eficácia

comparativa de glicose e sacarose em proteger as NS do estresse provocado pela etapa de

congelamento, com resultados expressos quanto ao tamanho médio e índice de polidispersão (I.P.) .

Além disso, foi avaliada também, a influência da condição de congelamento no tamanho médio e

I.P. de NP.

Na primeira parte da tabela, são apresentados os resultados da liofilização de NS sem

adição de crioprotetores, congeladas a -80ºC por 24h e a -196ºC (nitrogênio líquido) por 5 minutos.

Foram observados, nesses casos, agregação das NS e aumento significativo do tamanho médio e

índice de polidispersão, destacado pela grande variação positiva nos tamanhos médios, I.P., além de

relação de tamanhos médios final e inicial (Tf/Ti), de 2,34 para NS congelada a -196ºC e 2,40 para

NS congelada a -80ºC. Dados semelhantes já foram observados por diversos autores, tanto para

nanopartículas quanto para lipossomas (Konan e cols., 2002; Nounou e cols., 2005; Abdelwahed e

cols., 2006d), uma vez que os crioprotetores, quando presentes na formulação, protegem as NP dos

efeitos danosos do congelamento, evitam a desestabilização e conseqüente agregação dessas.

Na segunda parte da tabela, são apresentados os resultados das formulações de NS

liofilizadas com sacarose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). É possível observar que, o

congelamento a -196ºC (nitrogênio líquido), levou a uma menor variação no tamanho médio e do

I.P. das NS. Esse resultado foi anteriormente observado por outros autores (Abdelwahed e cols.,

2006d). Esses dados podem ser mais claramente visualizados pela relação Tf/Ti, a qual apresentou

um número maior de valores próximos a 1,0 para as formulações de NS congeladas a -196ºC.

RAQUEL, GC

89

Tabela 21: Variação do tamanho médio e índice de polidispersão de nanoesferas congeladas a -

80ºC ou a -196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.

Formulação

Variação de

tamanho médio final

e inicial (nm)

Variação de I.P. final

e inicial Tf/Ti

Ns 0% (-196ºC) + 413,2* + 0,73 2,34

Ns 0% (-80ºC) + 429,9* + 0,74 2,40

Ns S 2,5% (-196oC) + 109,0* + 0,03 1,35

Ns S 2,5% (-80oC) + 171,1* + 0,27 1,55

Ns S 5% (-196oC) + 51,1* + 0,06 1,16

Ns S 5%(-80oC) + 65,5* + 0,37 1,21

Ns S 10% (-196oC) + 8,2 + 0,01 1,02

Ns S 10% (-80oC) + 120,2* + 0,38 1,39

Ns S 25% (-196oC) + 36,8 - 0,07 1,11

Ns S 25% (-80oC) + 442,8* + 0,81 2,44

Ns S 30% (-196oC) + 53,9* - 0,06 1,17

Ns S 30% (-80oC) ND ND ND

Ns G 2,5% (-196oC) + 72,9* + 0,20 1,23

Ns G 2,5% (-80oC) + 110,5* + 0,27 1,36

Ns G 5% (-196oC) + 14,7 + 0,06 1,04

Ns G 5% (-80oC) + 111,1* + 0,36 1,36

Ns G 10% (-196oC) - 18,4 - 0,03 0,94

Ns G 10% (-80oC) + 18,3 + 0,03 1,05

Ns G 25% (-196oC) - 35,3 - 0,13 0,88

Ns G 25% (-80oC) - 11,7 - 0,09 0,96

Ns G 30% (-196oC) - 21,9 - 0,07 0,93

Ns G 30% (-80oC) - 6,6 - 0,05 0,98

S: Sacarose. G: Glicose. I.P.: índicede polidispersão. Variação no tamanho médio final e inicial = tamanho médio

após liofilizar – tamanho médio antes de liofilizar. Variação no I.P. final e incial = I.P.após liofilizar – I.P. antes de

liofilizar. Tf/Ti= tamanho final (após liofilização)/tamanho incial (antes da liofilização). ND=não

determinado.*Formulações com diferença significativa do tamanho médio final em relação ao tamanho médio inicial

(306,9nm).

Quando um congelamento ultra-rápido é aplicado à amostra, como no caso da

imersão em nitrogênio líquido, o crioprotetor mantém-se uniformemente disperso por toda a

RAQUEL, GC

90

formulação. Já no congelamento lento, o crioprotetor pode distribuir-se heterogeneamente na

amostra, reduzindo sua capacidade de proteção para as NP. Além disso, o congelamento lento leva a

formação de cristais de gelo maiores, os quais são prejudiciais na manutenção da integridade da

matriz da NP, resultando numa estrutura desordenada do produto final (Chen e cols., 2010).

Ainda na segunda parte da tabela, é observado que concentrações maiores de

sacarose, de 5 a 30% - no congelamento a -196ºC - e de 5% e 10% - no congelamento a -80ºC -

levaram a uma redução do tamanho médio das NS, indicando que há uma concentração mínima

necessária de crioprotetor capaz de proteger as NP dos danos provocados pelo processo (Liversidge

e cols., 1994). Nas amostras congeladas a -196ºC, as concentrações de 25 e 30% de sacarose ainda

mostraram-se satisfatórias, com relações Tf/Ti próximas a 1,0. Já para as amostras congeladas a

-80ºC, as NS liofilizadas com 25 e 30% de sacarose apresentaram alta taxa de formação de

precipitado após ressuspensão, além de uma valor Tf/Ti de 2,44 para NS com 25% de sacarose. Esta

diferença, ocorrida entre as duas condições de congelamento, pode ser atribuída à heterogeneidade

de distribuição da solução do crioprotetor na amostra durante o congelamento lento (-80ºC por

24h). Uma vez que as soluções mais concentradas de sacarose apresentam alta viscosidade, é

possível que parte da solução tenha migrado para o fundo do recipiente antes do congelamento.

Sendo assim, apesar de concentrações mais altas de crioprotetores serem capazes de proteger

melhor as NP (Engel e cols., 1994; Liversidge e cols., 1994), nesse caso não houve boa distribuição

da solução de sacarose na amostra, dificultando a ação do crioprotetor na mesma.

Para a sacarose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho médio e

relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC utilizando 10% e 25% de sacarose (Ns S 10% e Ns S

25%, -196ºC).

Na terceira parte da tabela, são apresentados os resultados de liofilização de NS com

glicose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). Assim como observado para a sacarose, no

caso de NS liofilizadas com glicose, o congelamento a -196ºC também apresentou melhores

resultados de tamanho médio e I.P. Ainda na terceira parte da tabela, observa-se que um aumento da

concentração de sacarose de 2,5 até 30%, nas duas condições de congelamento, levou a uma

redução na relação Tf/Ti das NS. Nas amostras com 25 e 30% de glicose, congeladas a -80ºC,

apesar de ter havido redução do tamanho médio, a formulação quebrou, apresentando formação de

precipitado após a ressuspensão. Nas amostras congeladas a -196ºC, as concentrações de 25 e 30%

de sacarose ainda mostraram-se satisfatórias, mantendo os parâmetros da formulação próximos aos

anteriores à liofilização.

Um problema encontrado na liofilização de NS usando glicose como crioprotetor, foi

alteração de cor do pó formado. O produto formado na liofilização com sacarose apresentava cor

RAQUEL, GC

91

branca, já o produto formado na liofilização com glicose apresentou aspecto arroxeado. Já foi

relatada a formação de produto de cor amarelada em nanossuspensões liofilizadas, coloração que foi

atribuída à presença de Tween 80 na formulação (Van Eerdenbrugh e cols., 2007). O aparecimento

desta coloração pode ser atribuído a algum tipo de reação indesejável entre os constituintes da

formulação, que deverá ser investigado posteriormente.

Para a glicose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho médio e

relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC, utilizando 10% de glicose e congelamento a -80ºC,

utilizando 10% de glicose.

RAQUEL, GC

92

Tabela 22: Tamanho médio e índice de polidispersão de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou a -

196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.

Formulação

Variação de

tamanho médio final

e inicial (nm)

Variação de I.P.

final e inicial Tf/Ti

Nc 0% (-196ºC) + 695,4* + 0,85 3,24

Nc 0% (-80ºC) + 1032,6* + 0,69 4,33

Nc S 2,5% (-196oC) + 2866,8* + 0,65 10,35

Nc S 2,5% (-80oC) + 200,1* + 0,32 1,66

Nc S 5% (-196oC) + 3303,9* + 1,34 11,66

Nc S 5% (-80oC) + 122,7* + 0,15 1,40

Nc S 10% (-196oC) + 431,0* + 0,66 2,41

Nc S 10% (-80oC) + 111,2* + 0,13 1,37

Nc S 25% (-196oC) + 149,4* + 0,27 1,49

Nc S 25% (-80oC) ND ND ND

Nc S 30% (-196oC) + 123,6* + 0,26 1,41

Nc S 30% (-80oC) ND ND ND

Nc G 2,5% (-196oC) + 5203,0* + 0,05 17,96

Nc G 2,5% (-80oC) + 11641,8* - 0,12 38,94

Nc G 5% (-196oC) + 8625,0* + 0,72 29,11

Nc G 5% (-80oC) + 10020,8* + 0,34 33,66

Nc G 10% (-196oC) + 3549,5* + 1,24 12,57

Nc G 10% (-80oC) + 2641,3* - 0,04 9,61

Nc G 25% (-196oC) + 262,8* + 0,63 1,86

Nc G 25% (-80oC) + 434,0* + 0,89 2,42

Nc G 30% (-196oC) + 526,4* + 0,79 2,72

Nc G 30% (-80oC) + 147,6* + 0,33 1,49

S: Sacarose. G: Glicose. I.P.: índicede polidispersão. Variação no tamanho médio final e inicial = tamanho médio

após liofilizar – tamanho médio antes de liofilizar. Variação no I.P. final e incial = I.P.após liofilizar – I.P. antes de

liofilizar. Tf/Ti= tamanho final (após liofilização)/tamanho incial (antes da liofilização).ND=não determinado.

*Formulações com diferença significativa do tamanho médio final em relação ao tamanho médio inicial (309,7nm).

RAQUEL, GC

93

Na Tabela 22 são apresentados os resultados de tamanho médio e índice de

polidispersão de nanocápsulas liofilizadas utilizando dois tipos de crioprotetores (glicose e

sacarose) e duas condições de congelamento (-80oC e -196

oC – nitrogênio líquido). Também foram

avaliadas a eficácia comparativa de glicose e sacarose como crioprotetores e a influência da

condição de congelamento no tamanho médio e I.P. de NP.

Na primeira parte da tabela, são apresentados os resultados da liofilização de NC sem

adição de crioprotetores, congeladas a -80ºC por 24h e a -196ºC (nitrogênio líquido) por 5 minutos.

Após ressuspensão das NC liofilizadas, foi observada quebra da formulação, com grande

quantidade de precipitado formado, separando a amostra em duas fases, confirmando resultados já

esperados devido à ausência de crioprotetores.

Na segunda parte da tabela, são apresentados os resultados de NC liofilizadas com

sacarose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). É possível observar que, o congelamento a -

196ºC (nitrogênio líquido), levou a uma maior variação no tamanho médio e I.P. das NC, resultado

mais facilmente visualizado pela relação Tf/Ti, a qual apresentou um número valores acima de 1,0

para todas as NS congeladas a -196ºC com sacarose. Para concentrações de 2,5 e 5% de sacarose os

valores Tf/Ti foram de 10,35 e 11,66, respectivamente, indicando que o crioprotetor não estava

presente em quantidade suficiente para proteger a NC da desestabilização e formação de agregados.

A sacarose foi mais eficiente em proteger as NC contra os danos provocados pela etapa de

congelamento em concentrações de 25 e 30%, ou seja, em concentrações mais elevadas. Esse

resultado está de acordo com dados anteriormente observados (Liversidge e cols., 1994), em que foi

demonstrado que concentrações de sacarose próximas a 25% eram mais adequadas para liofilização

de NP.

Para as NC congeladas a -80ºC, com sacarose, obteve-se resultados satisfatórios, para

sacarose a 2,5, 5 e 10%, com valores de Tf/Ti iguais a 1,66, 1,40 e 1,37, respectivamente. Usando

concentrações de 25 e 30% de sacarose, nessa condição de congelamento mais lenta, obteve-se um

produto com aspecto “açucarado” e com grande quantidade de precipitado após ressuspensão, não

sendo possível determinar seu tamanho médio.

Utilizando a sacarose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho

médio e relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC utilizando 25% e 30% de sacarose (Nc S 25%

e Nc S 30%, -196ºC) e congelamento a -80ºC utilizando 5% de sacarose (Nc S 5%, -80ºC).

Na terceira parte da tabela, são apresentados os resultados de liofilização de NC com

glicose em cinco diferentes concentrações (2,5-30%). Para concentrações de glicose até 10%,

ambas as condições de congelamento se mostraram inadequadas, resultando em partículas com

tamanho médio acentuadamente aumentado e grande formação de precipitado. Os valores de Tf/Ti

RAQUEL, GC

94

apresentaram-se todos acima de 9,0, indicando a formação de agregados e a provável ruptura da

partícula, com separação de fases na amostra ressuspendida.

Com o uso de concentrações mais elevadas de glicose, de 25 e 30% obteve-se

melhora nos produtos finais, com destaque para a Nc com 25% de glicose congelada a -196ºC – que

apresentou Tf/Ti=1,86 – e para a Nc com 30% de glicose congelada a -80ºC – que apresentou

relação Tf/Ti=1,49.

Para a glicose, as melhores condições encontradas, em termos de tamanho médio e

relação Tf/Ti, foram: congelamento a -196ºC, utilizando 25% de glicose e congelamento a -80ºC,

utilizando 30% de glicose.

A análise dos resultados sugere que, para a liofilização de NC, são necessárias

quantidades maiores de crioprotetores, uma vez que as NC possuem estrutura mais frágil que as NS,

e podem ser afetadas pelo estresse do congelamento, resultando na formação de agregados

(Abdelwahed e cols., 2006a; Abdelwahed e cols., 2006b). Para as NC há uma grande dificuldade no

estabelecimento de boas condições para liofilização. Abdelwahed e colaboradores(2006ª)

descreveram a liofilização de NC de PCL, com sucesso, utilizando sacarose e PVP a 5%. Já

Auvillan e colaboradores (1989), liofilizaram NC de PLA e PCL com trealose a 30%, empregando

diferentes tipos de óleos. Entretanto, o PVP inviabiliza a administração por vias parenterais e

mesmo intramamária, devido à baixa biodegradabilidade deste polímero. A trealose, por sua vez

possui custo elevado e poderia inviabilizar a produção em grande escala.

Em nosso grupo de pesquisa, foram liofilizadas NC brancas (sem fármaco),

utilizando sacarose, glicose, manitol e polidextrose, sendo que, somente amostras contendo sacarose

forneceram bons resultados (Ararújo, 2009).

4.1.2 Determinação do teor de fármaco encapsulado

Os valores de porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) das NP liofilizadas

estão apresentados nas tabelas 23 e 24. Os resultados comparam os valores de porcentagem e

eficiência de encapsulação das NP antes e após a liofilização, a fim de verificar a influência desse

processo no teor de fármaco encapsulado.

RAQUEL, GC

95

Tabela 23: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanoesferas congeladas a -80ºC ou a

-196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.

Formulação Variação na % encapsulação

final e inicial Variação na EE final e inicial

Ns S 2,5% (-196oC) ND ND

Ns S 2,5% (-80oC) -0,47 -13,28

Ns S 5% (-196oC) -7,67 -23,15

Ns S 5% (-80oC) 3,5 -15,59

Ns S 10% (-196oC) -5,75 -19,11

Ns S 10% (-80oC) 1,6 -25,7

Ns S 25% (-196oC) 4,28 -19,37

Ns S 25% (-80oC) ND ND

Ns S 30% (-196oC) -1,64 -24,63

Ns S 30% (-80oC) ND ND

Ns G 10% (-196oC) 12,17 -4,87

Ns G 10% (-80oC) ND ND

Ns G 25% (-196oC) 9,04 -12,82

Ns G 25% (-80oC) -21,77 -45,25

Ns G 30% (-196oC) -11,48 -23,34

Ns G 30% (-80oC) -59,37 -47,19

S: Sacarose. G: Glicose. EE: Eficiência de encapsulação. Variação na % encapsulação final e inicial = %

encapsulação após liofilizar – % encapsulação antes de liofilizar. Variação na EE final e incial = EE após liofilizar –

EE antes de liofilizar.

Experimentos de porcentagem e eficiência de encapsulação foram realizados em

amostras de NS liofilizadas e que, após ressupensão, apresentaram tamanho médio e I.P. dispersão

adequados, além de ausência de precipitado. A amostra Ns S 2,5% (-80ºC), por exemplo,

apresentou tamanho médio e I.P. adequados, porém, houve clara formação de precipitado após

ressupensão.

É observado que, para algumas formulações liofilizadas tanto com sacarose quanto

com glicose, houve aumento no teor de fármaco encapsulado após a liofilização, se comparados ao

resultado anterior ao processo. Esses dados provavelmente se devem às variações de absorbância e

RAQUEL, GC

96

área sob a curva obtidas por CLAE, uma vez que os experimentos para NS antes e depois de

liofilizadas foram realizados em dias diferentes.

Todas as NS liofilizadas com sacarose testadas, utilizando ambos os métodos de

congelamento, apresentaram porcentagem de encapsulação acima de 65% e EE acima de 20%. É

possível perceber que os valores de porcentagem de encapsulação estão mais próximos do valor

encontrado antes da liofilização, que era de 74,26%. Entrento, para os valores de EE, há uma nítida

redução após a liofilização. A EE leva em consideração as perdas durante o processo, sendo assim,

uma vez que há perdas na produção de NP, somadas às perdas durante a liofilização, valores

menores de EE depois da liofilização são esperados. Para as NS liofilizadas com sacarose, as que

forneceram melhores resultados para porcentagem e eficiência de encapsulação,

respectivamente,foram:

- Ns S 5% a -80ºC (77,76/32,26%)

- Ns S 25% a -196ºC (78,54/28,48%)

Entre as duas formulações citadas, a Ns liofilizada com sacarose a 25% foi

considerada a mais adequada devido aos resultados de tamanho médio e I.P., somados aos

resultados de teor de fármaco encapsulado.

Dentre as NS liofilizadas com glicose, a maioria apresentou porcentagem de

encapsulação acima de 60% e EE acima de 26%, com excessão das Ns congeladas a -80ºC, com 25

e 30% de glicose e da Ns congelada a -196ºC, com 30% de glicose, que apresentaram valores

baixos de EE, chegando a 0,66% para a Ns G 30% (-80ºC).

Conforme descrito anteriormente, todas as Ns congeladas com glicose, formaram pós

de cor arroxeda, o que pode ser um indício de reação que venha a instabilizar a amostra a longo

prazo. É possível que os valores satisfatórios de porcentagem e EE, chegando a até 43% de EE,

tenham sido obtidos uma vez que esse experimento foi realizado no mesmo dia da liofilização.

Assim como relatado para a sacarose, houve uma maior alteração nos valores finais

de EE que nos de porcentagem de encapsulação.

Para as NS liofilizadas com glicose, as que forneceram melhores resultados para

porcentagem e eficiência de encapsulação, respectivamente, foram:

- Ns G 10% a -196ºC (86,43/42,98%)

- Ns G 10% a -80ºC (79,8/37,6%)

- Ns G 25% a -196oC (83,3/35,03%)

Entre as três formulações citadas, a Ns liofilizada com glicose a 10% e -196ºC foi



RAQUEL, GC

97

Tabela 24: Porcentagem e eficiência de encapsulação (EE) de nanocápsulas congeladas a -80ºC ou

a -196ºC (nitrogênio líquido), usando glicose ou sacarose como crioprotetores.

Formulação Variação na %

encapsulação final e inicial

Variação na EE final e

inicial

Nc S 5% (-196oC) ND ND

Nc S 5% (-80oC) + 2,54 -22,71

Nc S 10% (-196oC) -1,05 -8,98

Nc S 10% (-80oC) -1,54 -30,32

Nc S 25% (-196oC) + 3,68 -9,48


Nc S 30% (-196oC) + 1,19 -19,52


Ns G 30% (-196oC) ND ND

Ns G 30% (-80oC) + 5,05 -19,39

S: Sacarose. G: Glicose. I.P.: índicede polidispersão. Tf/Ti: tamanho final (após liofilização)/tamanho incial (antes da

liofilização).

Em relação às NC, os estudos de teor de fármaco encapsulado foram realizados para

uma menor quantidade de amostra, devido a problemas de instabilidade dessas e a tamanhos médios

inadequados. Foram selecionadas, para os experimentos, amostras sem formação de precipitado e

com pouca variação de tamanho médio em relação à NC antes da liofilização. Entre as NC

selecionadas para o experimento, todas as liofilizadas com glicose e sacarose, utilizando ambos os

métodos de congelamento, apresentaram porcentagem de encapsulação acima de 78% e EE acima

de 22%.

Assim como ocorrido com as NS, entre as NC houve uma menor variação dos

valores de porcentagem de encapsulação que dos EE, comparando-se dados antes e após a

liofilização.

Apesar das NC terem apresentado um maior aumento de tamanho médio e I.P., após

a liofilização, que as NS, em relação aos resultados de teor de fármaco encapsulado, foram obtidos

resultados satisfatórios para todas as NC. Os dados apresentados indicam que houve sucesso na

RAQUEL, GC

98

liofilização de NC utilizando tanto a sacarose, em concentrações entre 5 e 30%, quanto a glicose a

30%.

Para as NC liofilizadas, tanto com sacarose quanto com glicose, as que forneceram

melhores resultados para porcentagem e eficiência de encapsulação, respectivamente, foram:

- Nc S 25% a -196ºC (83,23/43,17%)

- Nc G 30% a -80ºC (84,6/33,26%)

Entre as duas formulações citadas, a Nc liofilizada com sacarose a 25% e -196ºC foi



O processo de liofilização pode comprometer, não só a estrutura das NP, como

também o teor de fármaco nelas encapsulado. Alguns estudos envolvendo lipossomas e

nanopartículas relatam a redução da eficiência de encapsulação de fármacos em amostras

liofilizadas, se comparadas com as mesmas antes da liofilização. Glavas-Dodov e colaboradores

(2005) descreveram uma pequena redução da eficiência de encapsulação em todas as amostras de

lipossomas liofilizadas com sacarose. Beck-Broichsitter e colaboradores (2011) demonstraram a

liofilização de nanopartículas contendo sildenafil. As NP eram compostas pelo polímero ácido

poli(D,L-co-glicólico) (PLGA) e pelo copolímero de álcool polivinínico e PLGA (PVA-co-PLGA)

e em nenhuma delas houve redução significativa do teor de fármaco encapsulado.

Os açúcares são bem conhecidos como agentes crioprotetores (Li e cols., 2000). Eles

podem formar uma matriz amorfa e vítrea em torno da partícula durante o congelamento, além de

exibirem uma baixa mobilidade molecular após secagem. Esta formação vítrea é essencial para

prevenir danos à partícula, tais como processos de fusão e cristalização, que poderiam levar ao

extravasamento de fármacos encapsulados (Van Winden e cols., 1999). Sendo assim, a adição de

crioprotetores como glicose e sacarose às formulações, colaboram para que haja apenas uma

pequena redução da eficiência de encapsulação.

4.1.3 Análise morfológica de nanopartículas liofilizadas

Imagens da morfologia de nanopartículas foram realizadas, para a mesma amostra,

antes e depois de sua liofilização, após ressuspensão do pó em água milli-Q. Objetivou-se investigar

possíveis alterações provocadas pelo processo de congelamento e secagem das NP, além do efeito

do crioprotetor sobre elas.

RAQUEL, GC

99

Para tanto, foram selecionadas duas amostras, uma de NS e uma de NC. Foram

selecionadas as amostras que forneceram melhores resultados de tamanho médio e teor de fármaco

encapsulado após a liofilização. Entre as NS, foi selecionada aquela liofilizada com 25% de

sacarose, congelada a -196ºC. Apesar de as NS liofilizadas com glicose terem apresentado bons

resultados, o produto formado apresentou coloração não característica, arroxeada, conforme

descrito anteriormente. A NC selecionada também foi aquela liofilizada com 25% de sacarose e

congelada a -196ºC.

As imagens de nanoesferas obtidas estão representadas pelas figuras 42, 43, 44 e 45.

A Figura 42 demonstra imagens de altura e fase de NS antes (a e b) e após a

liofilização (c e d). Pela observação das imagens é possível afirmar que as formulações, tanto antes

quanto depois de liofilizadas, apresentam forma esférica.

Figura 42: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NS com 1,0 mg/mL de CloxB.


Escaneamento 20 μm x 20 μm (a e b) e 10 μm x 10μm (c e d). Z range: 500 nm (a e b) e 1000nm (c

e d).

RAQUEL, GC

100

Ainda a respeito da Figura 42, observou-se que algumas NS antes da liofilização,

apresentaram-se associadas (destaque em vermelho), o que não ocorreu nas imagens de NS

liofilizadas. Estas parecem ser protegidas da agregação pela presença do crioprotetor. Isto porque o

crioprotetor, ao recobrir as partículas, fornece um espaçamento entre elas, impedindo sua

agregação.

As NS liofilizadas estão depositadas sobre alguma substância, uma espécie de

“nuvem”, atribuída ao crioprotetor, uma vez que esse apresenta superfície hidrofílica (sacarose) e de

difícil secagem. Esses resultados já foram observados anteriormente por nosso grupo de pesquisa

(Araújo, 2009) e também foram atribuídas à sacarose. As “nuvens” de crioprotetor sobre as quais as

NS se depositam, podem ser melhor visualizadas nas figuras 48 e 49. Na Figura 43, são

representadas imagens de altura (a) e fase (b), nas quais observam-se as NS, sendo que algumas

estão depositadas sobre uma mancha clara, atribuída à nuvem de crioprotetor citada.

Figura 43: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NS liofilizadas e ressuspendidas em água,

destacando manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose, sobre as quais estão depositadas

algumas NS . Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm.

RAQUEL, GC

101

Figura 44: Imagens de MFA de altura de NS liofilizadas, após ressupensão em água, destacando

manchas claras, atribuídas ao crioprotetor sacarose. Escaneamento 30 x 30 μm. Z range: 1000 nm.

Além dos resultados já discutidos, a análise da imagem tridimensional das NS após a

liofilização (Figura 45), permite inferir que os crioprotetores aparecem como camadas envolvendo

as partículas. É possível visualizar apenas a ponta dessas NS na imagem tridimensional, além de ser

vista uma superfície irregular, com morros, sobre a qual as NS estão depositadas. Essa superfície

provavelmente é causada pela sacarose. Observam-se também camadas de material sobre a lâmina

com baixa altura, que provavelmente são referentes às camadas de crioprotetor após secagem.

RAQUEL, GC

102

Figura 45: Imagem tridimensional de NS analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).

Destaque para a diferença de topografia das NS, com essas “mergulhadas” em crioprotetor (b),

sendo possível visualizar somente as pontas das NS. Escaneamento de 10 x 10 μm. Z range: 200nm.

As imagens de nanocápsulas obtidas estão representadas pelas figuras 46, 47, 48 e

49.

Na figura 46 são observadas imagens de altura e fase de NC antes (a e b) e após a

liofilização (c e d). Pela observação das imagens é possível afirmar que as formulações, tanto antes

quanto depois de liofilizadas, apresentam forma esférica. Assim como visualizado nas NS, as NC

liofilizadas, apresentaram camadas de crioprotetor envolvendo-as, o que é mais facilmente

visualizado na imagem de fase (item d). O crioprotetor utilizado na liofilização de ambas as NP é a

sacarose. Na imagem de fase da NC liofilizada (item d) também observa-se o espaçamento

provocado pelo recobrimento do crioprotetor, que impede a agregação e/ou fusão das NC.

RAQUEL, GC

103

Figura 46: Imagens de MFA de altura (a e c) e fase (b e d) de NC com 1,0 mg/mL de CloxB.


Escaneamento 15 μm x 15 μm (a e b) e 10 μm x 10 μm (b e c). Z range: 500 nm (a e b) e 2000nm (c

e d). Destaca-se a formação de nuvem de crioprotetor sob as NC (d).

Imagens tridimensionais de NC antes e após a liofilização (Figura 47), indicam que

ocorre uma pequena alteração no aspecto geral das NC após a liofilização e ressupensão em água

milli-Q. A superfície sobre a qual foram vistas as NC liofilizadas apresenta diversas manchas,

atribuídas à presença do crioprotetor, sacarose.

RAQUEL, GC

104

Figura 47: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA antes (a) e após a liofilização (b).

Destaque para a diferença de topografia das NC, com aparente achatamento de algumas das

partículas após liofilização (b). Escaneamento de 15 x 15 μm. Z range: 500nm.

A agregação/fusão de NC é comum no processo de deposição e secagem da amostra

sobre a mica (Mosqueira e cols., 2005). Entretanto, para as NC liofilizadas, observa-se a

aproximação dessas, porém sem agregação. Este fato é devido ao recobrimento pela sacarose, o que

impede que as NP se agreguem, conforme discutido anteriormente. As imagens das figuras 53 e 54

demonstram claramente os dados discutidos aqui. São visualizadas, tanto pelas imagens de altura e

fase (Figura 48), quanto pela imagem tridimensional (Figura H), que as NC estão próximas, mas

sem sofrer agregação/fusão.

RAQUEL, GC

105

Figura 48: Imagens de MFA de altura (a) e fase (b) de NC liofilizadas e ressuspendidas em água,

destacando aproximação das partículas, sem agregação/fusão. Escaneamento 3 x 3 μm. Z range:

1500 nm.

Figura 49: Imagem tridimensional de NC analisadas por MFA após a liofilização. Não ocorre

agregação das NC devido ao recobrimento pela sacarose. Escaneamento de 3 x 3 μm. Z range:

1500nm.

4.1.4 Medida de potencial zeta de nanopartículas liofilizadas

RAQUEL, GC

106

Na Tabela 25 estão representados os valores de potencial zeta de nanopartículas

antes e após a liofilização. Os resultados indicam uma redução significativa das cargas superficiais

tanto de NS quanto de NC, porém ainda mantidas em valores elevados o suficiente para garantir a

estabilidade das formulações. Essa redução dos valores de potencial zeta pode ser atribuída ao

estresse decorrente do processo de congelamento e liofilização e também à presença do crioprotetor

sacarose.

Tabela 25: Medida de potencial zeta de nanopartículas antes e após a liofilização.

NP

Potencial

Zeta (ζ) antes da

liofilização

(mV) ± DPb

Potencial

Zeta (ζ) após a

liofilização

(mV) ± DPb

Ns S 25% (-196oC) + 51.9 + 38.2

Nc S 25% (-196oC) + 41.3 + 30.7

Volume final de 5 mL. . aDP= desvio padrão (n=4),

bDP= desvio padrão (n=3). Formulações significativamente

diferentes (p<0,05) utilizando teste ANOVA.

RAQUEL, GC

107

CONCLUSÃO

RAQUEL, GC

108

Foram desenvolvidas e otimizadas duas formulações de NP preparadas pelo método de

nanoprecipitação. Uma nanocápsula e uma nanoesfera, as quais foram utilizadas no

encapsulamento do fármaco Cloxacilina benzatina;

A MFA foi uma técnica considerada precisa para determinar a variabilidade na relação

diâmetro/altura das nanoesferas. Está técnica permitiu observar as NS e NC com relação a

sua morfologia e determinar algumas características superficiais. As imagens de AFM de

NP brancas mostraram partículas de superfície irregular aparentemente macia,

características atribuídas à forma de organização da QUI na superfície das NP. A relação

diâmetro altura das NS foi de 5,1, acima do valor 1,0 normalmente encontrados para NS e

atribuído à presença da quitosana;

O fármaco cloxacilina benzatina foi eficientemente associado às nanoesferas até

concentrações de 3,0mg/mL. Acima dessa concentração as formulações apresentaram

redução acentuada da eficiência de encapsulação, além de aumento significativo do tamanho

e índice de polidispersão em relação à NS branca e formação de precipitado (a partir de

5,0mg/mL).

O fármaco cloxacilina benzatina foi eficientemente associado às nanocápsulas também até

concentrações de 3,0mg/mL, a partir da qual houve redução acentuada da eficiência de

encapsulação. Entretanto, diferente do ocorrido com as NS, a formação de precipitado só

ocorreu em formulações contendo fármaco a paritr de 7,0mg/mL.

Todas as formulações contendo QUI apresentaram valores positivos de potencial zeta,

caracterizando o recobrimento da NP pelo polímero. As exceções foram as NP contendo

CloxB encapsulada em concentrações elevadas (7,0mg/mL de CloxB em NS e 7,0; 8,0 e

10,0mg/mL de CloxB em NC). A redução brusca dos valores de potencial zeta dessas

formulações corroboram com os dados de instabilidade apresentados por elas, tais como

aumento significativo de tamanho e formação de precipitado.

As imagens de NS contendo 0,5mg/mL de CloxB mostraram uma maior variabilidade de

tamanho de partículas em relação à NS branca, além de superfície macia e deformável,

atribuída à associação entre o fármaco e a quitosana na superfície da NS.

A cloxacilina benzatina apresentou elevada solubilidade em mygliol®, em meio PBS e PBS

contendo 70% de leite.

No estudo de liberação, os gráficos mostram uma liberação inicial rápida para as duas NP,

seguida de uma liberação mais gradual do fármaco. Após 6h (360minutos), ambas as

formulações apresentaram liberação próximo a 100% (91% para NS e 89% para NC),

mantendo a porcentagem de fármaco liberada a partir desse tempo;

RAQUEL, GC

109

Os estudos de cinética de liberação em meio PBS contendo 70% de leite demonstrou uma

liberação incial rápida da CloxB, tanto de NC quanto de NS. Após 48 h de experimento,

cerca de 70% da CloxB havia sido liberada das NP. A manutenção de 30% do fármaco,

mesmo após 48 h do experimento indica que essas NP são capazes de manter o fármaco em

sua estrutura em meios contendo leite. Esse é um resultado promissor para o tratamento de

mastite, visando à liberação sustentada de fármacos;

Estudo da interação de NC em modelo de perfusão de úbere bovino isolado demonstrou uma

clara migração dessas nanopartículas até regiões mais altas do úbere bovino. Esse resultado

indica a possibilidade de obtenção de concentrações mais elevadasde fármacos nessas

regiões, o que, normalmente não é obtido com formulações convencionais;

Formulações otimizadas de NS e NC foram liofilizadas, avaliando-se duas condições de

congelamento (freezer a -80ºC e nitrogênio líquido a -196ºC) e dois crioprotetores (sacarose

e glicose). Resultados satisfatórios foram obtidos para a liofilização com 25% de sacarose e

congelamento em nitrogênio líquido, tanto para NC quanto para NS.

110

ANEXO I

Nanoesfera 1,0 mg/mL de CloxB – liberação em PBS

RAQUEL, GC

111

Nanocápsula 1,0 mg/mL CloxB – liberação em PBS

RAQUEL, GC

112

Nanoesfera 1,0 mg/mL – liberação em PBS + 70% de leite

RAQUEL, GC

113

Nanocápsula 1,0 mg/mL de CloxB – liberação em PBS + 70% leite

RAQUEL, GC

114

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RAQUEL, GC

115

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