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Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ

Centro de Ciências da Saúde

Faculdade de Odontologia

ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS ASSOCIADOS AOS

MINI-IMPLANTES ORTODÔNTICOS

AMANDA OSÓRIO AYRES DE FREITAS, CD, MO

Tese submetida ao corpo docente da Faculdade de

Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro -

UFRJ, como parte dos requisitos, para a obtenção do Título

de Doutor em Odontologia (Ortodontia).

Rio de Janeiro

2014

ii

ASPECTOS MICROBIOLÓGICOS ASSOCIADOS AOS

MINI-IMPLANTES ORTODÔNTICOS

AMANDA OSÓRIO AYRES DE FREITAS, CD

Orientadores: Profª. Drª. MATILDE DA CUNHA GONÇALVES NOJIMA

Profª. Drª. DANIELA SALES ALVIANO MORENO

Tese submetida ao corpo docente da

Faculdade de Odontologia da Universidade do Brasil -

UFRJ, como parte dos requisitos para obtenção do Título

de Doutor em Odontologia (Ortodontia).

Comissão Examinadora:

__________________________ _____________________________

Profª. Drª. Celuta Sales Alviano Profª. Drª. Luciana Rougemont Química CD

__________________________ _____________________________

Profª. Drª. Ana Maria Bolognese Prof. Dr. Eduardo Franzotti Sant’Anna CD CD

_____________________________ Profª. Drª. Matilde da C. G. Nojima CD

Rio de Janeiro

2014

iii

Ficha Catalográfica

FREITAS, Amanda Osório Ayres de

Aspectos microbiológicos associados aos mini-implantes

ortodônticos. Rio de Janeiro: UFRJ/Faculdade de Odontologia, 2014.

xxii, 121f.

Tese: Doutorado em Odontologia (Ortodontia) – Universidade Federal

do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia, 2014.

1. Ancoragem esquelética 2. Mini-implante

3. Microbiologia 4. Teses

I. Título

II. Tese (Doutorado – UFRJ/ Faculdade de Odontologia)

iv

A Deus, e aos que estiveram sempre ao meu lado, iluminando meu caminho

e me amparando nos momentos de dificuldade. Aos meus queridos avós Dr.

Waldir Ayres e Lúcia Ayres, que com certeza continuam vibrando com minhas

conquistas.

DEDICO

v

HOMENAGEM ESPECIAL

A minha mãe, meu pai e meu irmão, agradeço pelo apoio e incentivo

para que conseguisse progredir na minha carreira profissional e,

principalmente, por entenderem a necessidade da minha ausência durante

este período de muito trabalho.

A minha querida sobrinha Beatriz Knoch Freitas pelo amor verdadeiro

e incondicional.

Muito obrigada!

vi

AGRADECIMENTOS

Aos professores, Drª. Ana Maria Bolognese, Dr. Antônio Carlos de

Oliveira Ruellas, Dr. Eduardo Franzotti Sant’ana, Dr. José Fernando Stangler

Brazzalle, Dr. Lincoln Issamu Nojima, Drª. Margareth Maria Gomes de Souza,

Drª. Matilde da Cunha Gonçalves Nojima, Drª. Mônica Tirre de Souza Araújo,

Drª. Teresa Cristina Moreira (in memoriam), que me apresentaram e me fizeram

apaixonar pela Ortodontia. Cada um contribuiu, de alguma maneira, para a minha

formação e para despertar a vontade de compartilhar meus conhecimentos e

aprender com os estudantes de Odontologia.

Agradeço novamente à orientação e ao carinho da Profª. Drª. Matilde da

Cunha Gonçalves Nojima. E, em especial, pela confiança e incentivo, me

estimulando sempre a seguir em frente, apesar das dificuldades.

Ao querido amigo Waltencir Ferreira e adorável família, por me acolherem

como se fizesse parte dela. Muito obrigada por tudo! Sempre me lembrarei do

carinho, ajuda, do apoio nos momentos difíceis e das boas risadas que demos

juntos. Aos funcionários e amigos do Departamento de Ortodontia.

Aos meus orientadores de iniciação científica no período de graduação,

Profª. Drª Mônica Tirre de Souza Araújo, Dr. Milton Santamaria Jr, Dr. Camilo

Aquino Melgaço, Luiz Felipe Miranda Costa, que me apresentaram ao mundo da

ciência.

vii

Aos colegas e amigos da 43ª turma de mestrado (2007/2008), Bianca Motta,

Carina Rodrigues, Joanna Binato, José Luiz Muñoz, Letícia Felicio, Mariana

Marquezan, Thiago Lau, pela solidariedade e convívio durante os dois anos de

curso.

Aos colegas e amigos da 42ª turma de mestrado (2006/2007), Ângela Dalvi,

Cristiane Machado, Luciana Boaventura, Matheus Pithon, Maurício Guerra,

Paula Nascimento, Raphael Mesquita e Rogério Lacerda, pela dedicação em

tornarem a permanência no curso de mestrado mais prazerosa.

Aos colegas e amigos da 44ª turma de mestrado (2008/2009), Alexandre

Ribeiro, Ana Sabanneff, Cláudia Trindade, Carolina Baratieri, Diego

Lorenzoni, Donizete D’Andrea, Ilana Cruz, Matheus Alves Jr, pelos bons

momentos que passamos juntos.

Aos colegas de turma do doutorado (2009/2013): Giselle Villani, Luiz Felipe

Miranda, Mariana Marquezan e Rodrigo Santiago pela parceria nos trabalhos,

pela ótima convivência e carinho.

Aos colegas da turma 2010/2014: Carolina Baratieri, Claudia Trindade e

Matheus Alves Jr ; da turma 2011/2015: Alline Birra, Dayanne Lopes, Geórgia

Lau, Lígia Claudino e Teresa Cristina Oliveira, pela companhia e especialmente

pela contribuição nos trabalhos realizados.

Aos alunos do curso de mestrado das 45ª, 46ª e 47ª turmas, por colaborarem

nas coletas de material biológico dos pacientes, que estavam sob sua

responsabilidade.

À Déborah Leite, doutoranda em Microbiologia, pela ajuda e orientação na

etapa laboratorial da biologia molecular. Obrigada pela dedicação, pelo carinho e

pela amizade que construímos! Sua gentileza e humildade ao passar seus

viii

conhecimentos farão de você uma professora exemplar e muito querida. Torço

muito pelo seu sucesso!

Às professoras Drª Celuta Sales Alviano e Drª Daniela Sales Alviano

Moreno, pela orientação, dedicação, confiança, carinho, pelos ensinamentos

profissionais e da vida... Faltam palavras para agradecer. Desejo toda felicidade do

mundo a vocês e à família, que vai aumentar em breve. Vocês têm toda a minha

admiração e gratidão.

Querida Fátima Goulart, muito obrigada por continuar fazendo parte da

minha vida. Guardo no coração todo o seu carinho e toda a sua paciência para me

ensinar a trabalhar no laboratório. Você é muito especial!

Aos queridos amigos que fiz no laboratório de Microbiologia Estrutura de

Superfícies. Saibam que tenho carinho muito especial por cada um, pois sempre

foram maravilhosos comigo. Os tenho como grandes amigos, para toda vida.

À brilhante Profa Dra Ana Paula Vieira Colombo, agradeço por aceitar a

colaboração nos meus trabalhos, pela oportunidade de ajudar nas aulas práticas

de Microbiologia Oral, por tudo que me ensinou durante nossas conversas,

contribuindo com minhas pesquisas e minha vida. Acima de tudo, obrigada pela

amizade, carinho, e por me acolher na turma animada do laboratório. Foram

momentos maravilhosos!

Meninas, nem sei por onde começar... Adorei conhecê-las. A amizade de

todas: Bete Brasil, Carina Boghossian, Rachel Miranda, Renata Souto e Talita

Lourenço, foi um presente que recebi durante estes quatro anos. Dividimos muitas

emoções, sem dúvida. Certamente, estaremos sempre juntas! Adoro vocês! Muito

obrigada pela ajuda nos trabalhos, pela generosidade e carinho com que me

receberam no laboratório e em suas vidas.

ix

Durante a vida, algumas pessoas tornam-se essenciais para seguirmos na

nossa caminhada. Felizmente tive o privilégio de fazer grandes amizades desde a

infância. Amigos que se tornam parte da família, por escolha. Queridas amigas:

Ana Carolina Amorim, Clarisse Moreno, Fernanda Alonso, Fernanda

Gorgulho, Michelle Seabra e Monique Cavalcante, muito obrigada por tudo! A

vida não seria tão boa sem vocês.

Cássia Neres e Marcela Rodrigues, não poderia deixar de agradecê-las

pelo carinho, apoio, companheirismo, durante e depois dos nossos quatro anos de

graduação. A amizade sólida durante nossa formação fortaleceu-se com o passar

dos anos e, com certeza, conto com vocês para toda vida!

Aos “guerreiros” e amigos da Turma EAS/EST 2013: Ten Alexandra Braga,

Ten Alexandro, Ten Cecília Pereira, Ten Damyelly, Ten Joyce Gomes, Ten

Guedes, Ten Luiza Garcia, Ten mariana Morais, Ten R. Bittencourt, Ten

Vanessa Nascimento, Ten Viviane Souza. A amizade de vocês foi um presente

inesperado e, principalmente, o apoio que precisei para tornar a adaptação ao meio

militar mais tranquila. Vocês são o verdadeiro “braço forte e mão amiga”!

À CAPES, pela bolsa de estudos concedida.

À Faperj, pelo financiamento dos projetos de pesquisa.

x

RESUMO

FREITAS, Amanda Osório Ayres de. Aspectos microbiológicos associados aos

mini-implantes ortodônticos. Orientadoras: Profª. Drª. Matilde da Cunha

Gonçalves Nojima, Profª. Drª. Daniela Sales Alviano Moreno. Rio de Janeiro: UFRJ/

Faculdade de Odontologia, 2014. Tese (Doutorado em Odontologia- Ortodontia).

xxii, 121f.

Os autores deste estudo avaliaram a topografia do perfil transmucoso de

mini-implantes ortodônticos (MI), a adesão microbiana na superfície destes

dispositivos e o método mais eficaz para o controle microbiano dos mesmos. Para

a análise da topografia da superfície do perfil transmucoso de MI, foram realizadas

fotomicrografias e leituras da rugosidade de três marcas comerciais nacionais, por

meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia de força atômica

(MFA). Após a inoculação com placa dental cultivada in vitro, coletada de pacientes

em tratamento ortodôntico, a adesão e formação de biofilme foram avaliadas em

ensaio microbiológico durante sete dias, a partir de MEV e microscopia óptica de

fluorescência (MF) do perfil transmucoso dos MI. Além disso, para detectar a

variedade e quantidade de micro-organismos aderidos, aplicou-se o “Checkerboard

DNA-DNA hybridization”. O estudo in vivo realizado comparou quatro protocolos de

xi

higienização dos MI (mecânico, e mecânico associado aos agentes químicos:

clorexidina, triclosan ou cloreto de cetilpiridínio), após 21 dias de aplicação. O

material biológico coletado do sulco peri-implantar foi submetido à análise

molecular por PCR real-time. Os resultados evidenciaram maior rugosidade na

superfície do perfil transmucoso da marca SIN®. As imagens de MEV e MF

demonstraram adesão, diversidade morfológica e viabilidade celular durante todo o

período experimental. Apesar da variedade de espécies detectadas pelo

“Checkerboard DNA-DNA hybridization”, os níveis bacterianos não apresentaram

diferença ao longo do ensaio. A avaliação dos quatro métodos propostos para

higienização do perfil transmucoso dos mini-implantes comprovou que o controle

microbiano é alcançado com a limpeza mecânica dos dispositivos, sem uso

adicional de agentes químicos.

xii

SUMMARY





xxii, 121f.

The authors of this study evaluated the topography of the transmucosal neck

of orthodontic mini-implants (MI), the microbial adhesion and biofilm formation on

the devices surface and determined the most effective method for their microbial

control. For topography surface analysis of the transmucosal neck of MI,

photomicrographs and roughness scanning of three different brazilian trademarks

were performed by scanning electron microscopy (SEM), and atomic force

microscopy (AFM). After inoculation with dental plaque cultured in vitro, colected

from orthodontic patients, adhesion and biofilm formation were observed during a

seven day microbiological assay, by SEM and optical fluorescence microscopy (FM)

of MI transmucosal neck. Furthermore, to detect the number and the variety of

adhered micro-organisms, Checkerboard DNA-DNA hybridization was applied. The

in vivo study was developed to compare four hygiene protocols for MI, after 21 days

of usage. The biological material collected from peri-implant sulcus was submitted

xiii

to molecular analysis by real-time PCR. Results evidenced greater surface

roughness on transmucosal neck surface of SIN™. Images from SEM e MF showed

adhesion, morphological diversity and cellular viability at all experimental time.

Despite the variety of species detected by Checkerboard DNA-DNA hybridization,

bacterial levels did not present difference during the assay. The evaluation of the

four hygiene methods proposed for transmucosal neck of MI proved that microbial

control is acquired by mechanical cleaning of the devices, without adicional

chemical agents usage.

xiv

RESÚMEN





xxii, 121f.

Los autores de este estudio evaluaron la topografía del perfil transmucoso

de mini-implantes ortodóncicos (MI), la adhesión microbiana en la superficie de

estos dispositivos y el método más eficaz para el control microbiano de los mismos.

Para el análisis de la topografía de la superficie del perfil transmucoso, fueron

realizadas fotomicrografías y lecturas de la rugosidad de tres marcas comerciales,

nacionales, por medio de microscopia electrónica de barrido (MEB) y microscopia

de fuerza atómica (MFA). Luego de la inoculación con placa dental cultivada in vitro,

colectada de pacientes en tratamiento ortodóncico, la adhesión y la formación del

biofilm fueron evaluadas en un ensayo microbiológico durante siete días a partir del

xv

MEV y microscopía óptica de fluorescencia (MF) del perfil transmucoso de los MI.

Además, para detectar la variedad y la cantidad de micro-organismos adheridos, se

aplicó el “Checkerboard DNA-DNA hybridization”. El estudio in vivo realizado

comparó cuatro protocolos de higienización de los MI (mecánico, y mecánico

asociado a los agentes químicos: clorhexidina, triclosán o cloruro de cetilpiridinio),

tras 21 días de aplicación. El material biológico colectado del surco peri-implantal

fue sometido a análisis molecular por medio de PCR real-time. Los resultados

evidenciaron mayor rugosidad en la superficie del perfil transmucoso de la marca

SIN®. Las imágenes de MEV y MF demostraron adhesión, diversidad morfológica

y viabilidad celular durante todo el período experimental. A pesar de la variedad de

especies detectadas por el “Checkerboard DNA-DNA hybridization”, los niveles

bacterianos no presentaron diferencia a lo largo del ensayo. La evaluación de los

cuatro métodos propuestos para higienización del perfil transmucoso de los mini-

implantes comprobó que el control microbiano se alcanza con la limpieza mecánica

de los dispositivos, sin el uso adicional de agentes químicos.

xvi

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

DELINEAMENTO DA PESQUISA

Quadro 1 Relação das cepas bacterianas empregadas na confecção das

sondas de DNA………………………………………………...........

DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA

ARTIGO 1

Figure 1 Photomicrographs from transmucosal neck of mini-implants. 1A.

Localization of transmucosal neck INP™; 1B. Detail of

transmucosal neck topography INP®; 1C. Localization of

transmucosal neck SIN™; 1D. Detail of transmucosal neck

topography SIN™; 1E. Localization of transmucosal neck

Conexão™; 1F. Detail of transmucosal neck topography

Conexão™. (a) Collection of the fluids from gingival sulcus (b)

Schematic design……………………………………………………

Página

36

48

Figure 2 Three-dimensional topography of the transmucosal neck of

mini-implants. 3A INPTM; 3B SINTM; CONEXÃOTM……………..

49

xvii

ARTIGO 2

Figure 1 Bacterial strains used for production of DNA probes…………….

Figure 2 Images of microbial adhesion and biofilm formation development

during experimental times. 1. 6h; 2. 12h; 3. 18h; 4. 24h; 5. 48h;

6. 72h; 7. 96h; 8. 120h; 9. 144h; 10. 168h. A. Fluorescence

microscopy 400X; B. Photomicrograph 1.200X; C.

Photomicrograph 5.000X.............................................................

Figure 3 Graphic representing the distribution of bacterial levels at

different experimental times; 0 (not detected); 1 (<105 cells); 2

(approximately 105); 3 (105–106); 4 (approximately 106), and 5

(>106 cells)…………………………………………………………..

62

64

66

xviii

LISTA DE TABELAS

DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA Página

Artigo1

Table 1 Comparison of Ra values (nm) intra and between groups after

AFM………………………………………………………………..

49

Artigo 3

Table 1 Intragroup and intergroup comparison regarding changes in

the number of bacterial cells (log 10) detected at baseline (T1)

and final observation time (T2), according to the hygiene

protocol applied in the study……………………………………….

81

xix

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

MI Mini-implantes / “Mini-implants”

DAT Dispositivo de Ancoragem Temporária

TAD “Temporary Anchorage Device”

MFA Microscopia de Força Atômica

AFM “Atomic Force Microscopy”

Ra média da rugosidade de superfície

MEV Microscopia Eletrônica de Varredura

SEM “Scanning Electron Microscopy”

MF Microscopia de Fluorescência

FM “Fluorescence Microscopy”

BHI “Bovine Brain Heart Infusion”/ Infusão de Cérebro e Coração Bovinos

UFC/mL Unidades Formadoras de Colônia por mililitro

PBS “Phosphate Buffer Solution”/ Solução Tampão de Fosfato

Tris-EDTA Solução tampão à base de EDTA (“Ethylenediamine Tetraacetic Acid”,

Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético)

TE Tris-EDTA

Aa Actinomyces actinomycetemcomitans

PCR “Polymerase Chain Reaction”/ Reação em Cadeia da Polimerase

xx

GM Grupo Higienização Mecânica

MG “Mechanical Hygiene Group”

GC Grupo Clorexidina

CG “Chlorhexidine Group”

GT Grupo Triclosan

TG “Triclosan Group”

GCCP Grupo Cloreto de Cetilpiridínio

CPCG “Cetilpiridine Chloride Group”

mix mistura de reagentes

xxi

ÍNDICE

Página

1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 23

2 PROPOSIÇÃO............................................................................................... 28

3

DELINEAMENTO DA PESQUISA .................................................................

3.2 METODOLOGIA PARA AVALIAÇÃO DA RUGOSIDADE DE

SUPERFÍCIE E TOPOGRAFIA DO PERFIL TRANSMUCOSO DE MINI-

IMPLANTES...................................................................................................

3.2 METODOLOGIA PARA OBSERVAÇÃO DA ADESÃO MICROBIANA

E FORMAÇÃO DE BIOFILME EM MINI-IMPLANTES................................

3.3 METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DO MÉTODO MAIS

EFICAZ NO CONTROLE MICROBIANO DO PERFIL TRANSMUCOSO DE

MINI-IMPLANTES ORTODÔNTICOS............................................................

29

29

31

38

4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA .........................................................

4.1 ARTIGO 1: OSÓRIO A, SILVA DL, ALVIANO DS, ALVIANO CS,

NOJIMA MCG. Topography of mini-implant’s transmucosal neck: a

preliminary study. Artigo a ser submetido ao Brazilian Oral Research………..

4.2 ARTIGO 2: OSÓRIO A, BOGHOSSIAN C, LOURENÇO TBG,

COLOMBO APV, ALVIANO DS, NOJIMA MCG. Microbial adhesion and

43

44

xxii

biofilm formation in orthodontic mini-implants. Artigo a ser submetido ao

Clinical Oral Implants Research......................................................................

4.1 ARTIGO 3: OSÓRIO A, LEITE D, SOUTO RM, COLOMBO APV,

ALVIANO DS, NOJIMA MCG. Microbial control of orthodontic mini-implants.

Artigo a ser submetido ao American Journal of Orthodontics and Dentofacial

Orthopedics…………………………………………………………………………

55

76

5 DISCUSSÃO .................................................................................................. 93

6 CONCLUSÃO ................................................................................................ 102

7 RECOMENDAÇÕES ..................................................................................... 103

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 104

9

ANEXOS ........................................................................................................

9.1 ANEXO 1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

9.2 ANEXO 2 APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA .............................

9.3 ANEXO 3 PROTOCOLO DE HIGIENIZAÇÃO 1..................................




9.7 ANEXO 7 ARTIGO 2, FIGURA 2 (PARTE 1)......................................

9.8 ANEXO 8 ARTIGO 2, FIGURA 2 (PARTE 2)......................................

112

112

115

116

117

118

119

120

121

23

1 INTRODUÇÃO

A ancoragem representa fator crítico para o sucesso do tratamento

ortodôntico (ALSAMAK et al, 2012; APEL et al, 2009; KYUNG et al, 2003). Diante

da praticidade e eficiência proporcionada pelos mini-implantes ortodônticos, estes

tornaram-se os dispositivos temporários de ancoragem (DTA) de escolha para a

substituição dos métodos tradicionais, como aparelhos extra-bucais, principalmente

em pacientes adultos (ALSAMAK et al, 2012; APEL et al, 2009; ARAÚJO et al,

2006; BAE et al, 2002; CELENZA e HOCKMAN, 2000; CHENG et al, 2004;

FREITAS et al, 2012; KANOMI, 2007; LUZI et al, 2009; MIYAWAKI et al, 2003;

RINALDI e ARANA-CHAVEZ, 2010; SINGH et al, 2010; TORTAMANO et al, 2012;

TSENG et al, 2006; WU e WU, 2009).

Os mini-implantes estão presentes na rotina da clínica ortodôntica (CHENG

et al, 2004; LUZI et al, 2009; LIOU et al, 2004; TORTAMANO et al, 2012; WILMES

et al, 2006). Fatores relacionados ao seu sucesso foram amplamente descritos na

literatura (APEL et al, 2009; CHENG et al, 2004; FREITAS et al, 2012;

TORTAMANO et al, 2012), como (estabilidade primária, definida como a

estabilidade do DTA imediatamente após sua inserção no tecido ósseo; critério do

24

profissional durante o procedimento cirúrgico; qualidade do osso hospedeiro e

região anatômica selecionada para a inserção do dispositivo. Para manutenção do

parafuso na cavidade bucal, destacam-se a influência da magnitude de força

aplicada, a presença de trauma e o controle de placa bacteriana ao redor do mini-

implante (ARAÚJO et al, 2006; LUZI et al, 2009; MAH e BUGSTRAND, 2005;

PITHON et al, 2008; SQUEFF et al, 2008; WILMES et al, 2006). Portanto, , os

fatores biológicos que interferem na estabilidade dos mini-implantes a longo prazo

também devem ser destacados; dentre os quais, ressalta-se a mucosite peri-

implantar (ARAÚJO et al, 2006; CARANO et al, 2005; CELENZA e HOCKMAN,

2000; FERREIRA JR et al, 2009; FREITAS et al, 2012; GRAY e SMITH, 2000;

HEUER et al, 2007; LUZI et al, 2009; MAH e BUGSTRAND, 2005; MELSEN, 2005;

MIYAWAKI et al, 2003; PIER-FRANCESCO et al, 2006; WILMES et al, 2006;

YOSHINARI et al, 2000).

Mini-implantes ortodônticos são usualmente constituídos de ligas de titânio,

visto suas excelentes propriedades mecânicas e de superfície, resistência à

corrosão e biocompatibilidade (ALSAMAK et al, 2012; SUBRAMANI et al, 2009;

STÁJER et al, 2012). Pesquisas comprovam que a rugosidade do material

representa fator importante para a adesão e consequente formação de biofilme

sobre a superfície destes dispositivos, além de interferir na remoção da placa dental

(AL-AHMAD et al, 2013; BURGÜERS et al, 2009; DORKHAN et al, 2012;

SCHMIDLIN et al, 2013; SUBRAMANI et al, 2009; STÁJER et al, 2012). Materiais

com superfícies mais polidas limitam a formação e progressão do biofilme (AL-

AHMAD et al, 2013; BURGÜERS et al, 2009; DORKHAN et al, 2012; SUBRAMANI

et al, 2009; STÁJER et al, 2012). A presença de irregularidades favorece a

25

colonização, pois protege as bactérias da força de limpeza do fluxo salivar, da

mastigação, deglutição e dos procedimentos de higienização, permitindo o

estabelecimento de ligações menos reversíveis entre os micro-organismos

presentes no biofilme (RIMONDINI et al, 1997; THEUGHELS et al, 2006).

Após a inserção do dispositivo transitório de ancoragem e a sua exposição

ao meio bucal, inicia-se a formação da película adquirida, que promove a adesão

entre micro-organismos iniciadores e a superfície do implante. Estas bactérias são

capazes de criar as condições necessárias para a adesão de outros micro-

organismos, inclusive patógenos periodontais (BODET et al, 2007; HEUER et al,

2007; LUZI et al, 2009).

A região peri-implantar, mais especificamente a área de sulco formada entre

o perfil transmucoso dos mini-implantes ortodônticos e a gengiva inserida

adjacente, corresponde à área que permanece em contato justo com os tecidos

moles. Espera-se que ocorra o selamento adequado da mucosa nesta área,

protegendo o sulco peri-implantar do ataque bacteriano e das influências do meio

bucal (LEE e WANG, 2010; STÁJER et al, 2012). Porém, a região do mini-implante

exposta é de fácil acúmulo de placa microbiana e a área peri-implantar, pelo acesso

clínico restrito, oferece maior dificuldade de higienização (APEL et al, 2009;

FREITAS et al, 2012). A evolução na formação de biofilme sobre o mini-implante

pode resultar na inflamação da mucosa adjacente e consequente perda de

estabilidade do dispositivo (ARAÚJO et al, 2006; BODET et al, 2007; CARANO et

al, 2005; CELENZA e HOCKMAN, 2000; DRAKE et al, 1999; FERREIRA JR et al,

2009; GRAY e SMITH, 2000; HEUER et al, 2007; LUZI et al, 2009; MAH e

BUGSTRAND, 2005; MELSEN, 2005; MINEOKA et al; 2008; PIER-FRANCESCO

et al, 2006; YOSHINARI et al, 2000; WILMES et al, 2006).

26

Um dos fatores de risco para inflamação peri-implantar está relacionado à

composição da microbiota constituinte e quantidade de placa bacteriana ao redor

do implante (GERBER et al, 2006; HEUER et al, 2007; MOMBELLI et al, 1993;

PIER-FRANCESCO et al, 2006; POGNARISON et al, 2007; TRAN e RUDNEY,

1996). As bactérias mais comumente associadas à inflamação peri-implantar são

aquelas relacionadas à doença periodontal: Prevotella intermedia, Porphyromonas

gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans; Bacteroides forsythus,

Treponema denticola, Prevotella nigrescens e Fusobacterium nucleatum (BOTERO

et al, 2005; FERREIRA JR et al, 2009; GERBER et al, 2006; HEUER et al, 2007;

HARTROTH et al, 1999; KURAMITSU et al, 2005; KAWADA et al, 2004; MINEOKA

et al; 2008; MARTÍNEZ-PABÓN et al, 2008; MOMBELLI et al, 1993; PIER-

FRANCESCO et al, 2006; POGNARISORN et al, 2007; SANTOS et al, 2002; TRAN

e RUDNEY, 1999). Esses micro-organismos são frequentemente detectados em

indivíduos com periodontite, embora também possam ser identificados, com menor

regularidade e em menor quantidade, em pacientes que possuem periodonto

saudável. Sendo assim, a manutenção da integridade dos tecidos adjacentes ao

implante está relacionada ao equilíbrio parasita-hospedeiro (resposta imune do

hospedeiro ao acúmulo de placa bacteriana) e, não somente à presença ou

ausência desses micro-organismos (BASTANCI et al, 2009; BODET et al, 2007;

BOTERO et al, 2005; COLOMBO et al, 2002; CORTELLI et al, 2008; GERBER et

al, 2006; GOSAU et al, 2010; HALLÉN et al, 2008; HEUER et al, 2007; INABA et al,

2008; ISHIGURO et al, 2009; KOLENBRANDER e ANDERSEN, 1989;

KURAMITSU et al, 2005; MARTÍNEZ-PABÓN et al, 2008; MINEOKA et al; 2008;

NAKANO et al, 2004; PASTER et al, 2001; PIER-FRANCESCO et al, 2006;

27

POGNARISORN et al, 2007; RIEP et al, 2009; VERNAL et al, 2009; YOSHINARI et

al, 2000).

Diante das propriedades de superfície dos dispositivos à base de titânio, do

ambiente ao qual estes são submetidos edas características individuais de cada

hospedeiro, alguns métodos de higienização paramini-implantes já foram

propostos, especialmente com a aplicação de agentes químicos (ARAÚJO et al,

2006; APEL et al, 2009; FREITAS et al, 2012; GOSAU et al, 2010; STÁJER et al,

2012). Apesar do consenso sobre a necessidade da redução dos fatores que

podem facilitar a adesão e formação de biofilme, ainda não foi definido pela

comunidade científica qual seria o método mais eficaz para o controle microbiano

dos mini-implantes na clínica ortodôntica.

Evidenciadaa importância dos fatores biológicos na permanência dos MI na

cavidade bucal, sustenta-se a necessidade da investigação destes, antes que haja

prejuízo aos tecidos adjacentes e consequente perda dos dispositivos de

ancoragem temporária.

28

2 PROPOSIÇÃO

Determinar os aspectos microbiológicos influentes na permanência dos mini-

implantes ortodônticos na cavidade bucal através de:

2.1 análise topográfica da superfície do perfil transmucoso de três mini-

implantes de fabricação brasileira;

2.2 acompanhamento do processo de evolução da adesão microbiana e

formação de biofilme, in vitro, na superfície de mini-implantes;

2.3 avaliação, in vivo, de quatro métodos de controle microbiano do perfil

transmucoso de mini-implantes.

29

3 DELINEAMENTO DA PESQUISA

3.1 METODOLOGIA PARA AVALIAÇÃO DA RUGOSIDADE DE SUPERFÍCIE

E TOPOGRAFIA DO PERFIL TRANSMUCOSO DE MINI-IMPLANTES

A avaliação preliminar da rugosidade de superfície e topografia do perfil

transmucoso de marcas comerciais diferenciadas de mini-implantes nacionais

determinou o dispositivo utilizado no experimento in vitro

3.1.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

Foram selecionadas três marcas comerciais de mini-implantes nacionais:

SIN® (São Paulo, SP, Brasil); INP® (São Paulo, SP, Brasil) e Conexão® (Arujá, SP,

Brasil), todos constituídos de Ti6 Al4 V, tipo auto perfurante, com 1,0 mm de perfil

transmucoso. Para determinação do número amostral, foi realizado um estudo

piloto, que apontou a necessidade de três mini-implantes de cada fabricante para

que fosse detectada a diferença entre as respectivas marcas em cada análise

realizada na presente investigação.

3.1.2 ANÁLISE DA TOPOGRAFIA DO PERFIL TRANSMUCOSO DE MINI-

IMPLANTES

Fotomicrografias obtidas a partir de microscopia eletrônica de varredura

(MEV) (Equipamento JEOL-JSM, 6460LV, Tóquio, Japão) evidenciaram detalhes

da área de interesse das diferentes marcas utilizadas no estudo.

30

O material avaliado não indicou a necessidade de preparo prévio para a

análise, visto quea composição metálica atendia às demandas exigidas pela

técnica.

3.1.3 ANÁLISE DA RUGOSIDADE DE SUPERFÍCIE DO PERFIL

TRANSMUCOSO DE MINI-IMPLANTES

Os dispositivos utilizados foram fixados em lâminas de vidro com auxílio de

cera utilidade (Wilson, Polidental Indústria e Comércio Ltda., Cotia, SP), de modo

que a superfície do perfil transmucoso permanecesse paralela à lâmina. Para

viabilizar a leitura, foi necessária a remoção do colar entre a cabeça do mini-

implante e o perfil transmucoso.

No microscópio de força atômica (Equipamento JPK Nanowizard, modelo

Nr: H-01-0086, Berlim, Alemanha), com ponta revestida de silício (NanoWorld,

NCLR-20, Neuchâtel, Suíça), em modo não contato, haste de frequência de

ressonância de 190 kHz e constante de força de 48 N/mm (SILVA et al, 2013) foram

realizadas, 27 leituras: três por mini-implante, aproximadamente, a cada 0,3 mm.As

imagens originadas foram processadas a partir do software (JPK Image Processing,

versão 3.0, JPK instruments) para visualização da topografia tridimensional dos

perfis transmucosos, assim como para determinação do valor da rugosidade da

superfície (Ra) dos mesmos (SILVA et al, 2013).

3.1.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A avaliação das fotomicrografias foi realizada por inspeção visual e descritiva

da superfície do perfil transmucoso dos mini-implantes.

31

Aos resultados obtidos a partir da microscopia de força atômica (MFA) foram

aplicados os métodos de análise estatística descritiva, além da comparação entre

os valores de rugosidade de superfície. Diante da distribuição normal da amostra,

detectada pelo teste Kolmogorov- Smirnov, foram utilizados os testes T-Student

para determinar a diferença intragrupos e ANOVA complementado pelo Post-Hoc

Tukey para diferenças intergrupos. Todo o desenvolvimento estatístico foi realizado

no “software” SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Sciences; SPSS Inc.,

Chicago, IL, USA). A significância estatística adotada foi ao nível de 5%.

3.2 METODOLOGIA PARA OBSERVAÇÃO DA ADESÃO MICROBIANA E

FORMAÇÃO DE BIOFILME NOS MINI-IMPLANTES

Quarenta mini-implantesforam submetidos ao ensaio microbiológico in vitro,

desde 6 horas até 7 dias após a inoculação em meio de cultura obtido a partir da

coleta de placa supragengival doada por pacientes em tratamento ortodôntico na

Clínica do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (Ortodontia) da

Universidade Federal do Rio de Janeiro. A marca comercial escolhida para este

experimento foi a que apresentou maior rugosidade de superfície no estudo

preliminar: SIN® (São Paulo, SP, Brasil). As observações foram realizadas porMEV,

microscopia de fluorescência (MF) e “Checkerboard DNA-DNA Hybridization”.

Os 40 mini-implantes foram distribuídos em duas placas de 24 poços de

acordo com os tempos de análise. Nas primeiras 24 horas, foram realizadas

análises a cada seis horas e, a partir desse tempo, com intervalo de 24 horas, até

serem completados os sete dias de avaliação. Foram utilizados quatro dispositivos

temporários de ancoragem para cada tempo de observação, sendo dois para

análise molecular, um para visualização em MEV e um para MF.

32

3.2.1 OBTENÇÃO DO INÓCULO

Doze pacientes, adultos jovens, de ambos os gêneros, em tratamento

ortodôntico na Clínica do Programa de Pós-Graduação em Odontologia

(Ortodontia) da Universidade Federal do Rio de Janeiro doaram placa

supragengival. Foram estabelecidos critérios de exclusão, como: presença de

doenças sistêmicas, antibioticoterapia recente (6 meses anteriores ao início do

período de coleta) e mulheres gestantes. Todos os participantes deram ciência ao

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1, página 112), previamente

aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Estudos em Saúde

Coletiva da Universidade Federal do Rio de Janeiro (Anexo 2, página 115). A coleta

foi realizada em tempo único, durantea consulta de rotina do tratamento

ortodôntico. Para tal, ambos os arcos foram mantidos em isolamento relativo com

roletes de algodão, secos com jato de ar comprimido emitido por seringa tríplice.

Em seguida, a placa supragengival foi coletada com auxílio de sonda exploradora

# 5esterelizada (ref. 11511, Duflex ®, SS White ®, RJ, Brasil), removendo-se o

material presente na superfície dentária ao redor das margens dos acessórios

colados, constituintes da aparelhagem ortodôntica fixa.

O material obtido foi depositado em tubos Eppendorf® com 1mL de solução

salina redutora estéril, composta por 0,85% de cloreto de sódio e 1% de tioglicolato

de sódio. Os tubos foram pesados antes e após a coleta da placa supragengival

para determinar a massa de material coletado. Em seguida, o material foi

transferido para caldo de BHI (Brain Heart Infusion, Himedia) suplementado com

sacarose 3%, hemina 5 µg/mL e menadione 10 µg/mL, mantendo-o incubado por 7

dias, a 37 ºC, em jarra de anaerobiose.

33

Após a incubação, foi realizada a leitura da densidade óptica do inóculo no

espectrofotômetro (Beckman Coulter DU 530 Spectrophotometer), a qual

correspondeu a 1,5 x 108 UFC/mL, usando os valores da escala de McFarland como

referência.

3.2.2 SENSIBILIZAÇÃO DOS MINI-IMPLANTES

Os mini-implantes foram sensibilizados com 200 µl saliva 10% (PBS),

durante 2h, sob agitação (WALKER et al, 2010). Em seguida, foram acondicionados

nas placas de 24 poços para inoculação.

3.2.3 INOCULAÇÃO DOS MINI-IMPLANTES

Foi respeitada a proporção de 500 µl de meio de cultura (BHI suplementado

com sacarose 3%, hemina 5 µg/mL e menadiona 10 µg/mL) para 500 µl de inóculo

preparado. O meio de cultura foi renovado a cada 48 horas após as primeiras 72

horas de incubação (SÁNCHEZ et al, 2011). Em cada placa havia dois poços

disponíveis para o controle negativo, que possuíam 1mL de meio de cultura puro.

Em cada tempo de avaliação no decorrer do estudo, cada mini-implante foi

preparado de acordo com a técnica de análise empregada.

3.2.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Para a microscopia eletrônica de varredura, os mini-implantes foram lavados

em PBS, suavemente secos em gaze estéril e fixados com glutaraldeído 2,5% em

tampão cacodilato 0,1 M, por 24h. Em seguida, foram novamente lavados em PBS,

secos e montados em “stubs” de alumínio. Por meio de pulverização catódica, os

34

DTA foram revestidos com ouro e levados ao microscópio (Quanta FEG 400; FEI

Company, Eindhoven, Holanda).

3.2.5 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

Após a contaminação, cada mini-implante foi lavado com solução salina

redutora estéril, composta por 0,85% de cloreto de sódio e 1% de tioglicolato de

sódio e, em seguida, inserido em tubo Eppendorf® contendo 300 µL da mesma

solução. Os reagentes do “kit” LIVE/DEAD® BacLight (Molecular Probes –

Invitrogen. Eugene, Oregon, EUA), utilizados para avaliar viabilidade bacteriana,

foram preparados pela mistura dos seus dois componentes: SYTO 9 (A) para

células viáveis e Iodeto de propidium (B) para células inviáveis. Alíquotas de 0,5 µL

de cada reagente foram acrescentadas a cada tubo Eppendorf® contendo o mini-

implante e a solução salina. Posteriormente, o conjunto foi mantido no escuro,

durante 15 minutos, à temperatura ambiente.

Em seguida, os mini-implantes foram fixados em lâmina de vidro com

esmalte incolor (Colorama®, São Paulo, SP) e a emissão de fluorescência foi

detectada pelo microscópio (Axiovert® 200M; Carl Zeiss Microlmaging GmbH,

Göttingen, Alemanha). As imagens geradas foram captadas por câmera digital

acoplada (Axiocam MRc5/MRm; Carl Zeiss Microlmaging GmbH) e trabalhadas no

software AxioVision 4.6 (Carl Zeiss Microlmaging GmbH).

35

3.2.6 “CHECKERBOARD DNA-DNA HYBRIDIZATION”

As bactérias aderidas à superfície dos MI foram identificadas e semi-

quantificadas a partir da adaptação da técnica previamente descrita na literatura

(COLOMBO et al, 2002; 2005; LOURENÇO, 2011; SOCRANSKY et al,1994).

Os mini-implantes foram lavados com PBS após a incubação e, em seguida,

inseridos em tubo Eppendorf® contendo 150 µL da solução 10 Mm Tris, 1Mm EDTA

e água destilada (TE) estéril para agitação em vórtex. Após a liberação das células

aderidas aos mini-implantes para a solução, foram acrescidos 150 µL de 0,5 M de

NaOH. Em seguida, aqueceu-se a solução (100°C em banho-maria por 5 min) para

promover lise celular e liberação do material genético presente. O DNA em

suspensão foi neutralizado pela adição de 0,8 mL de 5 M de acetato de amônia. As

amostras foram inseridas nas canaletas do “Minislot” (Immunetics, Cambridge, MA,

EUA), sob o qual encontrava-se a membrana de nylon (15 X 15 cm) com carga

positiva (Hybond-N+, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, EUA), para

deposição do DNA. Após a remoção do aparato, a membrana foi submetida à

temperatura de 120°C por 20 min em forno (Fanem Ltda., São Paulo, SP), para

fixação do DNA da amostra na mesma. As duas últimas canaletas do “Minislot”

foram preenchidas com a mistura das espécies bacterianas que deram origem às

sondas de DNA de interesse, em concentrações de 105 e 106 células/mL

(LOURENÇO, 2011).

Em seguida, foi realizada a pré-hibridização da membrana em solução de

50% de formamida, 1% de caseína, 5 x SSC, 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e

0,5 mg/mL de RNA de levedura, por uma hora, a 42C. A membrana pronta foi

posicionada sob a placa acrílica do “Miniblotter” 45 (Immunetics, Cambridge, MA,

36

EUA) de maneira que o DNA fixado estivesse perpendicular às canaletas do

aparato (LOURENÇO, 2011).

Foram preparadas 40 sondas específicas para 43 espécies bacterianas

(Quadro1, página 33), através do Kit DIG-High Prime (Roche Brasil, São Paulo, SP,

Brasil). Os sorotipos “a”, “b” e “c” da espécie Aa foram agrupados em sonda única

(LOURENÇO, 2011).

As diversas sondas específicas foram diluídas em solução de hibridização,

composta por 45% de formamida, 5 X SSC, 20 mM de fosfato de sódio (pH 6,5),

0,2 mg/mL de RNA de levedura, 10% de sulfato de dextrano, 1% de caseína, e

mantidas na concentração de 20 ng/mL. Deste modo, alíquotas de 135 L das

sondas específicas de DNA foram pipetadas em cada canaleta do “MiniBlotter” 45

(Immunetics, Cambridge, MA, EUA). A hibridização das sondas com o material

genético da amostra foi efetuada a partir da incubação do aparato por 16 horas, a

42 °C (LOURENÇO, 2011).

Espécie Cepa* Espécie Cepa*

Aggregatibacter actinomycetemcomitans a 43718 Leptotrichia buccalis 14201

Aggregatibacter actinomycetemcomitans b 29523 Neisseria mucosa 19696

Aggregatibacter actinomycetemcomitans c 625** Porphyromonas gingivalis 33277

Actinomyces gerensceriae 23860 Prevotella intermedia 25611

Actinomyces israelli 12102 Prevotella melaninogenica 25845

Actinomyces odontolyticus 17929 Prevotella nigrescens 33563

Actinomyces naeslundii 12104 P. micra 33270

Actinomyces viscosus 43146 Propionibacterium acnes I 11827

Capnocytophaga gingivalis 33624 Propionibacterium acnes II 43541

Capnocytophaga ochracea 33596 Streptococcus anginosus 33397

Capnocytophaga sputigena 33612 Streptococcus constellatus 27823

Campylobacter concisus 33237 Streptococcus mitis 49456

Campylobacter rectus 33238 Streptococcus intermedius 27335

Campylobacter showae 51146 Streptococcus noxia 43541

Eubacterium nodatum 33099 Streptococcus oralis 35037

Eubacterium saburreum 33271 Streptococcus sanguinis 10556

Eikenella corrodens 23834 Streptococcus gordonii 10558

37

Fusobacterium periodonticum 33693 Tannerella forsythia 43037

Fusobacterium nucleatum ss. vincentii 49256 Treponema denticola B1**

F. nucleatum ss nucleatum 25586 Treponema socranskii S1**

F. nucleatum ss polymorphum 10953 Veillonella parvula 10790

Gemella morbilorum 27824

*ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA), **The Forsyth Institute, (Boston, MA, EUA),

Cores correspondentes aos complexos microbianos da placa supragengival.

Quadro 1. Relação das cepas bacterianas empregadas na confecção das sondas de DNA.

As sondas fracamente hibridizadas foram removidas da membrana após

lavagem em solução adstringente (0,1 X SSC, 0,1% SDS) por 40 min, a 65C.

Postreriormente, a membrana foi mantida em solução bloqueadora durante uma

hora (0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20, 0,5% caseína,

pH 8,0) e mais 30 min nesta solução acrescida de anticorpo anti-digoxigenin-AP

1/25.000 (Roche, São Paulo, SP, Brasil), para manutenção das ligações já

realizadas. Em seguida, a membrana foi lavada duas vezes por 15 min em solução

tampão (0,1 M ácido maleico, 3 M NaCl, 0,2 M NaOH, 0,3% Tween 20, pH 8,0), e

uma vez por 5 min em solução 0,2 M de dietanolamina (pH 9,5) e 2 mM MgCl2. Por

fim, a membrana foi sensibilizada pelo substrato fluorescente da solução detectora

(ECF, GE Healthcare Life Sciences). A membrana foi escaneada e a imagem

captada pelo Sistema de Imagens Storm TM 860 (Molecular Dynamics, GE

Healthcare Life Sciences) (BOGHOSSIAN et al, 2011; LOURENÇO, 2011).

A análise da imagem foi realizada por comparação visual com a intensidade

dos sinais emitidos pelos controles de 105 e 106 células bacterianas das espécies

avaliadas na membrana. Os sinais foram ranqueados como: 0: não detectado; 1:

<105 células; 2: ~105 células; 3: 105-106 células; 4: ~106 células; 5: >106 células. A

ausência de sinal, determinada como zero não caracteriza a inexistência de células

38

bacterianas, as quais poderiam estar presentes no níveis entre 1-1.000, já que a

sensibilidade do ensaio foi ajustada para detecção de 104 células (BOGHOSSIAN

et al, 2011; LOURENÇO, 2011).


No intuito de avaliar se houve diferença estatística significante entre os níveis

de detecção dos micro-organismos (score de 0-5) ao longo do tempo, foi aplicado

o teste de Kruskal-Wallis. A distribuição dos níveis de prevalência de cada micro-

organismo ao longo do tempo foi representada em gráfico.

3.3 METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DO MÉTODO MAIS EFICAZ

NO CONTROLE MICROBIANO DO PERFIL TRANSMUCOSO DE MINI-

IMPLANTES ORTODÔNTICOS

O estudo in vivo comparou quatro dos principais procedimentos de

higienização utilizados pelos pacientes, através da análise quantitativa por reação

em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real.

Os indivíduos selecionados para esta pesquisa eram adultos e adultos-

jovens, de ambos os gêneros, os quais encontravam-se em tratamento ortodôntico

na Clínica do Programa de Pós-Graduação em Odontologia (Ortodontia) da

Universidade Federal do Rio de Janeiro. Os critérios de exclusão estabelecidos

foram: presença de doenças sistêmicas, antibioticoterapia recente (6 meses

anteriores ao início do período de coleta) e mulheres gestantes. Todos os

participantes deram ciência ao Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo

1, página 112). O projeto de pesquisa foi previamente aprovado pelo Comitê de

39

Ética em Pesquisa do Instituto de Estudos em Saúde Coletiva da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, sob parecer n0 149/2011 (Anexo 2, página 115).

Dentre 42 pacientes que possuíam mini-implantes instalados na cavidade

bucal, 39 participaram e contribuíram com 59 dispositivos temporários de

ancoragem, variando em quantidade de um a quatro MI por indivíduo. Estes

pacientes foram divididos, aleatoriamente, em quatro grupos, correspondentes aos

métodos de higienização aplicados: mecânico (GM) e mecânico associado ao

químico, complementado porcolutórios bucais à base de clorexidina (GC), triclosan

(GT) ou cloreto de cetilpiridínio (GCCP). Para padronizar o controle microbiano, os

participantes foram orientados e receberam o protocolo de higienização a ser

seguido por escrito (Anexos 3, 4, 5 e 6, páginas 116, 117, 118 e 119).

3.3.1 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO

Após isolamento relativo com roletes de algodão, remoção de placa

supragengival com gaze estéril, aplicação de jato de ar ao redor da cabeça dos

mini-implantes e da superfície dentária adjacente, o material de interesse foi

coletado da área de sulco formado pelo perfil transmucoso e a gengiva inserida, a

partir da introdução de quatro cones de papel absorventes # 40 estréreis (ENDO

POINTS®, Manacapuru, AM, Brasil) durante 45 segundos (BOTERO et al, 2005;

FERREIRA JR et al, 2009; FREITAS, 2011; GERBER et al, 2006; HARTROTH et

al, 1999; JERVOE-STORM et al, 2007; MORIKAWA et al, 2008; NARANJO et al,

2006; SAKAMOTO et al, 2001).

Estes procedimentos foram realizados no tempo inicial (“baseline”) e 21 dias

após o início da terapêutica (tempo final).

40

Todo material coletado foi armazenado em tubos do tipo Eppendorf® com

capacidade para 1,5 ml, contendo 50 µl de Tris EDTA e mantido a -20°C até o

processamento laboratorial (ROÇAS et al, 2002).

3.3.2 EXTRAÇÃO DO DNA DO MATERIAL BIOLÓGICO

Após o descongelamento, os tubos foram agitados em vórtex por 60

segundos e os quatro cones de papel foram removidos, restando apenas o material

biológico.

O DNA foi extraído segundo o método da Proteinase K (SMITH et al, 1989).

Após a centrifugação do material, o pellet foi preservado e foram adicionados 44 µL

de TE, 5 µL de Tween 20 5% e 1 mL de 10 mg/mL de Proteinase K. Assim, obteve-

se o volume total de 50 µL de solução para reação. O material extraído foi

quantificado por espectrofotometria a fim de viabilizar a padronização da alíquota

de DNA utilizada na reação (NanoDrop® 2000, Thermo Scientific, Waltham, MA,

EUA).

3.3.3 ANÁLISE QUANTITATIVA POR PCR EM TEMPO REAL

Para avaliar os métodos de higienização indicados anteriormente, foi

realizada a quantificação total de bactérias presentes na área de sulco peri-

implantar nos tempos inicial e final determinados no estudo. O PCR em tempo real

foi conduzido com os reagentes do Power SYBER Green PCR Master Mix (Applied

Biosystems, Foster City, CA, EUA), em 20 µL de reação. Os primers universais

utilizados foram descritos por ASAI e colaboradores (2002) (5’ - GAT TAG ATA

CCC TGG TAG TCC AC – 3’ e 5’ – TAC CTT GTT ACG ACT T – 3’) Deste volume,

as alíquotas para todas as reações foram de 5 µL (3 ng/mL) de DNA da amostra,

10 µL de MIX, 0,4 µL de cada primer, 0,4 µL de ROX (1:10) para correção de

41

variações de volume e evaporação ao longo da reação, assim como 3,8 µL de água

ultra pura para PCR. As reações foram dispostas em placas de 96 poços, seladas,

centrifugadas e inseridas na termocicladora para amplificação. As reações foram

submetidas aos seguintes ciclos: 1 ciclo de 95ºC/10min; 40 ciclos de 95ºC/1min, 40

ciclos de 52ºC/1min e 40 ciclos de 72ºC/1min. As amplificações da PCR foram

medidas a 78 ºC. A cada ciclo, a fluorescência do corante repórter foi monitorada

(PAIVA et al, 2013).

Para que os resultados das reações fossem aferidos, curvas-padrão,

constituíramreferência para interpretação dos dados. As curvas-padrão utilizadas

neste estudo possuíam relação de 1:1 entre o número de cópias obtidas e o número

de células bacterianas presentes na amostra investigada. Essas foram descritas

por PAIVA e colaboradores (2013), apresentando variação na concentração de 102

até 107, tendo, como base, o DNA extraído da cepa de Enterococcus Faecalis

ATCC 29212. Ao mesmo tempo em que a reação ocorreu, os sinais emitidos foram

transcritos em gráficos e os valores numéricos obtidos resultaram de cálculo

matemático realizado pelo software v2.0.4 ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster

City, CA, EUA).


O tratamento estatístico dos dados obtidos foi realizado com auxílio do

software SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Sciences; SPSS Inc., Chicago,

IL, USA), através da análise descritiva dos resultados, com determinação de

valores de média e desvio-padrão. Diante da normalidade dos dados, evidenciada

pelo teste Kolmogorov-Smirnov, foram aplicados os testes T-Student pareado para

42

avaliação intragrupos e ANOVA com Post-Hoc Tukey para detectar diferença

intergrupos. A significância estatística adotada foi ao nível de 5%.

43

4 DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA

4.1 ARTIGO 1

OSÓRIO A, SILVA DL, ALVIANO DS, ALVIANO CS, NOJIMA MCG. Topography

of mini-implant’s transmucosal neck: a preliminary study. Artigo a ser submetido

ao Brazilian Oral Research no American Journal of Orthodontics and Dentofacial

Orthopedics.

4.2 ARTIGO 2

OSÓRIO A, BOGHOSSIAN C, LOURENÇO TBG, COLOMBO APV, ALVIANO

DS, NOJIMA MCG. Microbial adhesion and biofilm formation in orthodontic mini-

implants. Artigo a ser submetido ao Clinical Oral Implants Research.

4.3 ARTIGO 3

OSÓRIO A, LEITE D, SOUTO RM, COLOMBO APV, ALVIANO DS, NOJIMA

MCG. Microbial control of orthodontic mini-implants. Artigo a ser submetido ao

American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.

44

4.1 ARTIGO 1

OSÓRIO A, SILVA DL, ALVIANO DS, ALVIANO CS, NOJIMA MCG. Topography of

mini-implant’s transmucosal neck: a preliminary study. Artigo a ser submetido ao

Brazilian Oral Research.

Abstract

The authors aimed to analyze the topography of the transmucosal neck of three

different brazilian orthodontic mini-implants. Nine samples were used to evaluate

the surface topography by scanning electron microscopy (SEM). The surface

roughness was determined by atomic force microscopy (AFM). Twenty seven

lectures were made and the results were submitted to descriptive statistics and intra

and inter-group comparisson. The photomicrographs from SEM and the three-

dimensional images produced from AFM were visually analyzed. Results indicated

statistical difference among surface roughness of evaluated groups, as well as the

variation among values from mini-implants of the same brand. Photomicrographs

and three dimensional images also showed the visual difference among mini-

implants of the same and the different brands. According to the transmucosal neck

charactherstics, SIN® (São Paulo, SP, Brazil) presented roughest surface when

compared to Conexão® (Arujá, SP, Brazil) and INP® (São Paulo, SP, Brazil). The

last brand also presented great variation of surface roughness among the mini-

implants studied herein.

45

Keywords

Surface characteristics; surface properties; orthodontic anchorage procedures.

INTRODUCTION

Anchorage control represents a critical factor for successful orthodontic

treatment 1-3. Orthodontic mini-implants became popular due to their simple use,

success rates and independence of patients cooperation. Therefore, these implants

were ellected for substitution of traditional anchorage devices, as headgears,

especially in adult patients 1,2,4-18.

Titanium alloys are widely used in orthodontic mini-implants constitution due

to their excelent mechanical properties, surface characteristics, corrosion resistance

and biocompatibility 1,19, 20. However, recent studies proved that surface roughness

represents an important factor for bacterial adhesion and biofilm formation, thus

interferes with the surface cleaning 19-25. Irregularities on the material surface harbor

microorganisms from forces of salivary flow and clearance, chewing, swallowing and

hygiene procedures 26, 27. For long-term permanence of the temporary anchorage

devices, it is necessary to control biofilm formation around them and the adjacent

mucosa8. Then, rough transmucosal neck of mini-implants facilitate bacterial

colonization in the peri-implant area, and can interfere in its health leading to

mucosal seal failure 8,19-23.

According to this issue, the purpose of the present study was to analyze the

topography of the transmucosal neck of orthodontic mini-implants by scanning

electron microscopy and determine the surface roughness by atomic force

microscopy.

46

MATERIALS AND METHODS

Samples Characterization

Self-drilling Ti6 Al4 V alloy mini-implants from three brazilian brands were

selected for this study: SIN™ (São Paulo, SP, Brazil), INP™ (São Paulo, SP, Brazil),

and Conexão™ (Arujá, SP, Brazil), all with 1.0 mm transmucosal neck. A pilot study

detected the need for three mini-implants from each manufacturer to determine the

statistical difference among the samples.

Surface topography

Three mini-implants from each brand were used to evaluate the surface

topography of their transmucosal neck. Photomicrographs obtained from scanning

electron microscope (SEM; JEOL-JSM, 6460LV, Tokio, Japan) evidenced details

from the interest area.

The samples were observed as-recieved, since they were made of metallic

material and met the criteria required by the applied technique.

Surface roughness

Following the proposed, three mini-implants of each brand were evaluated.

After the removal of the collar, the devices were fixed on a glass slide with segment

of wax, so that the transmucosal neck was parallel to the glass slide 24.

Measures were obtained from atomic force microscopy (AFM; JPK Nano

Wizard, Nr: H-01-0086, Berlin, Germany). In total, nine measurements of each

brand were made (three of each sample). The scanning areas were 20 µm x 20 µm,

with intervals of approximately 0.3 mm, from the limit between the collar and the

47

transmucosal neck to the limit between that and the active portion of the screw.

Values of the arithmetic average roughness (Ra) and the three-dimensional

topography of the transmucosal neck of mini-implants were processed by a specific

software (JPK Image Processing, versão 3.0, JPK instruments) 24.

Data analysis

Topographic analysis of transmucosal neck surface was described after

macroscopic and visual observation of photomicrographs and three-dimensional

images.

Data from AFM were subjected to SPSS 17.0 (Statistical Package for Social

Sciences; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Descriptive statistical analysis was

applied, as well as Kolmogorov- Smirnov test to detect normality among samples.

Then, Ra values were submitted to ANOVA and Tukey post-hoc test to identify the

diferences among the tested variables. The significance level was set at 5%.

Results

Surface Topography

Photomicrographs (Figure 1) showed the visual difference among the mini-

implants. According to the transmucosal neck charactherstics, the SIN™ (São Paulo,

SP, Brazil) presented roughest surface when compared to INP™ (São Paulo, SP,

Brazil) and Conexão™ (Arujá, SP, Brazil).

48

Figure 1. Photomicrographs from transmucosal neck of mini-implants. 1A. Localization of

transmucosal neck INP™; 1B. Detail of transmucosal neck topography INP™; 1C. Localization of

transmucosal neck SIN™; 1D. Detail of transmucosal neck topography SIN™; 1E. Localization of

transmucosal neck Conexão™; 1F. Detail of transmucosal neck topography Conexão ®.

Surface roughness

After verifying normality among samples, the results were tested and

indicated the significant difference among the evaluated groups, as well as an

intragroup variation between mini-implants of the same brand (Table 1). The three-

dimensional topography of the transmucosal neck of mini-implants evidenced the

visual aspect of results from AFM (Figure 2).

1A 1B

1C 1D

1E 1F

49

Table 1. Results regarding intragroup and intergroup comparison of readings (n=9) Ra values (nm)

after AFM.

* (P<0.05).

Figure 2. Three-dimensional topography of the transmucosal neck of mini-implants. 3A INP™; 3B

SIN™; 3C CONEXÃO™.

Discussion

The importance of surface characteristics is largely discussed in scientific

literature, since it can interfere in dental materials behavior 28. This preliminary study

focused on determining in advance a mini-implant that could favor the microbial

adhesion and biofilm formation over the transmucosal neck surface to further

develop an in vitro microbiological assay.

Commercially, mini-implants’ brands are avaialble in T6Al4V. Titanium alloys

offer excellent biocompatibility and surface properties, as polishing, corrosion

resistance, bacteriostatic action, and mechanical strength 1, 19.

The results of the present study agreed with AlSamak et al (2012),

considering the photomicrographs and three-dimensional images that showed

irregular surface topography of mini-implants, with parallel lines along the device,

2A 2B

3A 3B 3C

50

as well as structural defects (Figures 1 and 3). The authors also agreed that

manufactures should prepare materials in order to decrease their adhesion

potential, specially producing smooth surface textures 22, 28, 29. Difference of

structural surface topography was found among mini-implants of the same brand,

evidencing the necessity of better finishing of products.

When exposed to the oral environment, high surface roughness in titanium

devices may promote bacterial adhesion and hamper microbial biofilm removal 23.

Salivary pellicle immediatly covers the titanium surface, and its proteins work as

receptors for micro-organisms binding and subsequent biofilm formation 23. Plaque

accumulation usually follows the sequence of onset: cocci, rods, filamentous,

fusiforms, spirochetes and aggregates as corn-cobs 26, 27. The coccoid forms found

in initial biofilm formation stage are considered nono-pathogenic, unlike the others

associated with mature plaque 26.

Bollen et al (1997) suggested a maximum Ra value of 0.2 µm for better

bacterial adhesion control. The highest mean of Ra value found in this experiment

was 0.25 µm, which could be considered acceptable. Rougher surfaces are

favorable to greater plaque accumulation and retention 27, since they increase the

available area for colonization and the presence of pits and gooves protect bacteria

from removal forces allowing the establishment of less reversible binding to the

surface 21, 26, 28.

The peri-implant area determined by the gingival attachment to the neck of

the implant, which is responsable for mucosal seal and protection of mini-implant

health, should be resistant to bacteria adhesion and retention. Therefore, the

transmucosal neck of mini-implants deserves better polishing and smoother surface

to prevent enviromental injures 8, 19-23.

51

In order to promote bacteria adhesion and biofilm formation, which are

essential for a future in vitro microbiological essay, and considering the aspects

previously described, one can conclude that the mini-implant with greater surface

roughness SIN™ (São Paulo, SP, Brazil) should be the elected to that purpose.

Conclusion

The authors concluded that the transmucosal neck of orthodontic mini-

implants evaluated presented important surface roughness, particularly SIN™.

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55

4.2 ARTIGO 2

OSÓRIO A, BOGHOSSIAN C, LOURENÇO TBG, COLOMBO APV, ALVIANO DS,

NOJIMA MCG. Microbial adhesion and biofilm formation in orthodontic mini-

implants. Artigo a ser submetido ao Clinical Oral Implants Research.

Abstract

Objectives: To follow the microbial adhesion and biofilm formation on

orthodontic mini-implants. Material and Methods: Forty mini-implants were

subjected to an in vitro microbiological assay of seven days. The adhesion and

biofilm development were evaluated by scanning electron microscopy (SEM),

fluorescence microscopy (FM) and DNA-DNA checkerboard hybridization. Results:

It was observed a representative microbial adhesion and great variety of micro-

organisms morphology. Images from SEM showed mature bacterial colonies

formation at 96 and 120 hours. The Live/Dead FM showed representative cellular

viability throughout the research time. The six different microbial complexes of

supragingival plaque were detected after 12 hours of incubation. The largest variety

of micro-organisms was observed between six and 48 hours. There was no

significant difference among bacterial levels during experimental times (p=0.2).

Conclusion: The microbial adhesion on the transmucosal neck of mini-implants

was detected after six hours of incubation. Cellular organization similar to biofilm

was observed after 96 hours of experiment. One can conclude that the transmucosal

56

neck of mini-implants represented a propitious site for microbial adhesion and

biofilm formation, and thus confirms the importance to control bacterial colonization

in order to preserve the mucosal seal around implants, preventing inflammation and

devices’s failure.

INTRODUCTION

Mini-implants are routinely used in contemporary orthodontics and have

aroused attention among professionals, since they offer absolute anchorage to

undesirable tooth movement with high levels of clinical success (Tortamano et al,

2012; Wu & Wu, 2009).

The long-term maintenance of mini-implants depends on some factors as

design, diameter, length and primary stability of the temporary anchorage devices

(TAD), host’s bone thickness, orthodontic mechanics, magnitude of applied force,

presence of trauma and plaque control around the device (Araújo et al, 2006; Luzi

et al, 2009; Mah & Bugstrand, 2005; Pithon et al, 2008; Squeff et al, 2008; Wilmes

et al, 2006).

The insertion of a mini-implant in the oral cavity creates a new sulcus by the

contact between the device’s surface and the adjacent mucosa. A proper mucosal

seal guarantees the sulcus health (Lee & Wang, 2010; Stájer et al, 2012).. However,

after exposition to the oral environment, a salivary pellicle readily coats the material

surface, favoring microbial adhesion and biofilm formation. .

Biofilm can grow and establish on several surfaces, as living tissues, teeth,

orthodontic accessories, acrylic resin and implants (Subramani et al, 2009).The

biofilm formation on implants is similar to that on teeth surface and follows a

sequential process (Subramani et al, 2009). After 24 hours, it is observed great

57

bacterial colonization on titanium surface, with several layers of bacteria. The

bacterial count remains similar during 14 days (Rasperinni et al, 1998; Stájer et al,

2010).

As the evolution of biofilm can interfere in the sulcus mucosa seal, cause peri-

implant mucosite and stability loss of the TAD (Araújo et al, 2006; Bodet et al, 2007;

Carano et al, 2005 Celenza & Hockman, 2000; Drake et al, 1999; Ferreira Jr et al,

2009; Gray & Smith, 2000; Heuer et al, 2007; Luzi et al, 2009; Mah & Bugstrand,

2005; Melsen, 2005; Mineoka et al; 2008; Pier-Francesco et al, 2006; Yoshinari et

al, 2000; Wilmes et al, 2006), the authors aimed to better understand the adhesion

and biofilm formation on orthodontic mini-implants.


In order to observe how adhesion and biofilm formation occur in orthodontic

mini-implants, an in vitro microbiological assay of seven days was developed for

scanning electron microscopy (SEM), fluorescence microscopy (FM) and DNA-DNA

checkerboard hybridization analysis.

Forty mini-implants were used for evaluation from six hours to seven days

after inoculation in culture medium obtained from the collection of supragingival

plaque. The trademark SIN™(São Paulo, SP, Brazil): 8.0 mm long, 1.4 mm

diameter, and 1.0 mm transmucosal neck was sellected for this study, since

presented rougher surface according to a preliminar study. The mini-implants were

distributed on two 24-well tissue culture plates, according to the times of inoculation.

In the first 24 hours, the observation was performed after six hours time intervals.

Then, the observation was done every 24 hours, until completing seven days of

58

incubation. Four anchorage devices were used at each interval time: two for

molecular analysis, one for SEMand one for FM.

Supragingival plaque collection

Twelve patients, young adults, from both genders, under treatment at the

Graduation Clinic of Orthodontics at the School of Dentistry of Federal University of

Rio de Janeiro, Brazil, donated supragingival plaque for this experiment. The

exclusion criteria were the presence of systemic disease, recente antibiotic therapy

(six months before study) and pregnancy. All patients signed a consent form

previously approved by the Research Ethics Committee of IESC/ UFRJ (protocol

#50/2011; report #149/2011).

Collection was performed in a single stage, during routine orthodontic

appointment. Both dental arches were isolated from buccal and labial mucosa with

cotton rolls and teeth were dried with air. Then, supragingival plaque was collected

with sterile explorer #5 (ref. 11511, Duflex ®, SS White ®, RJ, Brazil), removing the

material around the edges of the bonding brackets. The supragingival plaque was

inserted into a Eppendorf™ tube containing 1 mL of 0,85% sterile saline.

Inoculum preparation

After centifugation, the pellet was transferred to three tubes containing 30 mL

of BHI broth (Brain Heart Infusion, Oxoid™, Hampshire, UK) supplemented with 3%

saccharose, 5 µg/mL hemine and 10 µg/mL menadione, incubated for seven days

at 37ºC, in an anaerobic jar, with oxygen restriction.

59

After incubation, the optical density of growing culture was measured

(Beckman Coulter DU 530 Spectrophotometer, Brea, CA). The inoculum presented

1.5 x 108 UFC/mL, using the McFarland standards as reference.

Saliva collection and processing

Unstimulated saliva was collected from the same subjects who donated

supragingival plaque. The saliva samples were diluted to 1:10 in PBS, centrifugated

and supernatant was filter sterilized.

Adhesion and biofilm development assay

The mini-implants were coated with 10% sterile saliva for two hours at room

temperature under agitation (Walker et al, 2010). Next, they were placed in 24-well

tissue culture plates.

Each well was filled with 500 µL of BHI broth (Oxoid™, Hampshire, UK)

supplemented with 3% saccharose, 5 µg/mL hemin and 10 µg/mL menadione, and

500 µL of pooled bacterial culture. The culture medium was renewed every 48 hours

after 72 hours of incubation (Sánchez et al, 2011). On each culture plate, two wells

were used as control, with 1mL of sterile medium.

After incubation, the mini-implants were processed according to the methods

of analysis applied in the study.

Scanning electron microscopy

For scanning electron microscopy, the mini-implants were gently rinsed in

PBS and fixed in 2.5% glutharaldheyde diluted in 0.1 M cacodylate buffer for 24h.

60

Following, they were rinsed in PBS once again, dried, fixed on specific stubs for

metallization and observed by SEM (Quanta FEG 400; FEI Company, Eindhoven,

Netherlands).

Fluorescence microscopy

After contamination, the mini-implants were rinsed in 0,85% sterile saline and

inserted into an Eppendorf™ tube filled with 300 µL of the same solution. Reagents

of LIVE/DEAD™ BacLight (Molecular Probes – Invitrogen. Eugene, Oregon, USA)

viability kit for microscopy assay were prepared by mixing SYTO 9 (A), for live and

active cells (fluorescent green) and propidium iodide (B), for dead and inactive cells

(fluorescent red). Aliquots of 0.5 µL of each reagent were added to each Eppendorf™

tube containing the mini-implant and the saline solution. Then the tubes were

maintained in darkness, at room temperature for 15 minutes.

Following, the mini-implants were fixed on glass slides, so that the

transmucosal neck was parallel to the glass slide. Microscopy images of ten devices

were captured by a digital camera (Axiocam™ MRc5/MRm; Carl Zeiss Microlmaging

GmbH) connected to the microscope (Axiovert™ 200M; Carl Zeiss Microlmaging

GmbH, Göttingen, Germany) and processed by the software AxioVision 4.6 (Carl

Zeiss Microlmaging GmbH).

Checkerboard DNA-DNA hybridization

After incubation, mini-implants were rinsed in PBS and transferred to

Eppendorf™ tubes with 150 µL of 10 Mm Tris, 1Mm EDTA, sterile distilled water

solution (TE) for vortex shaking. The cells adhered to the mini-implants were

61

dispersed and 150 µL of 0.5 M NaOH solution was added to them (Boghossian et

al, 2011).

The cells were lysed and the denatured DNA was neutralized by 0.8 mL of

5M ammonium acetate. The DNA suspension was fixed on a nylon membrane

(Hybond-N+, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) using the Minislot

device (Immunetics™,Cambridge, MA, USA). After prehybridization against DNA

samples, the membrane was positioned so that the DNA lines were upright to the

Miniblotter 45 slots (Immunetics™, Cambridge, MA, USA). Next, the membrane was

hybridized against genomic DNA probes digoxigenin labelled (Kit Dig-High Prime™,

Roche Applied Science, São Paulo, SP, Brazil). The bacterial species selected to

produce the DNA probes were described in Square 1. After hybridization, the

membrane was washed at high stringency solutions and linked probes were

identified by phosphatase-conjugated antibody against digoxigenin (Roche Applied

Science, São Paulo, SP, Brazil). Finally, the fluorescence was captured by the

Storm™ 860 imaging system (GE™ Healthcare Life Science, São Paulo, SP,

Brazil). Signals were compared to the standards of 105 and 106 bacterial cells for

the evaluated species on the same membrane. They were scored as: (0) not detect;

(1) <105 cells; (2) approximately 105; (3) 105–106; (4) approximately 106, and (5)

>106 cells. The absence of signal, considered as zero, could represent bacterial

ranges between 1–1000, since the sensitivity of the assay was adjusted detect 104

cells of a given species by adjusting the concentration of each DNA probe

(Boghossian et al, 2011).

62

Species Strains* Species Strains*

Aggregatibacter actinomycetemcomitans a 43718 Leptotrichia buccalis 14201

Aggregatibacter actinomycetemcomitans b 29523 Neisseria mucosa 19696

Aggregatibacter actinomycetemcomitans c 625** Porphyromonas gingivalis 33277

Actinomyces gerensceriae 23860 Prevotella intermedia 25611

Actinomyces israelli 12102 Prevotella melaninogenica 25845

Actinomyces odontolyticus 17929 Prevotella nigrescens 33563

Actinomyces naeslundii 12104 P. micra 33270

Actinomyces viscosus 43146 Propionibacterium acnes I 11827

Capnocytophaga gingivalis 33624 Propionibacterium acnes II 43541

Capnocytophaga ochracea 33596 Streptococcus anginosus 33397

Capnocytophaga sputigena 33612 Streptococcus constellatus 27823

Campylobacter concisus 33237 Streptococcus mitis 49456

Campylobacter rectus 33238 Streptococcus intermedius 27335

Campylobacter showae 51146 Streptococcus noxia 43541

Eubacterium nodatum 33099 Streptococcus oralis 35037

Eubacterium saburreum 33271 Streptococcus sanguinis 10556

Eikenella corrodens 23834 Streptococcus gordonii 10558

Fusobacterium periodonticum 33693 Tannerella forsythia 43037

Fusobacterium nucleatum ss. vincentii 49256 Treponema denticola B1**

F. nucleatum ss nucleatum 25586 Treponema socranskii S1**

F. nucleatum ss polymorphum 10953 Veillonella parvula 10790

Gemella morbilorum 27824

*ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), **The Forsyth Institute, (Boston, MA, USA),

Colors corresponding to the supragingival plaque microbial complexes.

Figure 1. Bacterial strains used for production of DNA probes.

Data analysis

Data from photomicrographs and digital images were described after

macroscopic and visual observation. Results obtained from checkerboard DNA-

DNA hybridization were submitted to SPSS 17.0 (Statistical Package for Social

Sciences; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kruskal-Wallis test was applied for

detection of possible statistical difference among the score during interval times.

63

The level of signifficance was set at 5%. The distribution of the prevalence levels

was presented in graphic.

Results

Scanning electron microscopy and fluorescence microscopy

After six hours of incubation, representative microbial adhesion was

observed, and kept relatively constant during the experiment, as well as the quantity

and morphology of micro-organisms found. However, 5.000X magnification images

from SEM showed cellular organization similar to more mature bacterial colonies

formation at 96 and 120 hours. Since the initial experimental times, micro-organisms

with different morphological charcteristics were identified, as coccus, rods, bacilli,

filaments and corn cobs. The live/ dead fluorescence showed cellular viability

throughout the research time. This evidenced that the transmucosal neck of mini-

implants, when submitted to the experimental conditions applied at this study,

represented a propitious site for microbial adhesion and biofilm formation (Figure

1).

64

Figure 2. Images of microbial adhesion and biofilm formation development during experimental times. 1. 6h; 2. 12h; 3. 18h;

4. 24h; 5. 48h; 6. 72h; 7. 96h; 8. 120h; 9. 144h; 10. 168h. A. Fluorescence microscopy 400X; B. SEM photomicrograph

1.200X; C. SEM photomicrograph 5.000X.

65

Checkerboard DNA-DNA hybridization

The six different microbial complexes of supragingival plaque were found

since initial search time, except the red complex, which was detected after 12 hours

of incubation. The largest variety of micro-organisms was observed between six and

48 hours, decreasing within 72 hours and raising again until the 168 hours (Figure

2). However, there was no significant difference among bacterial levels considering

the experimental times evaluated in the study (p=0.2).

66

Figure 3. Graphic representing the bacterial levels distribution at different experimental times; 0 (not detected); 1 (<105 cells); 2 (approximately 105); 3 (105–106); 4 (approximately 106), and

5 (>106 cells).

0

1

2

3

4

5

6h 12h 18h 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h

67

Discussion

A previous study was performed to determine the ideal mini-implant for the

development of bacterial adhesion and biofilm formation assay. Results pointed

SIN™ (São Paulo, SP, Brazil: 8.0 mm long, 1.4 mm diameter, and 1.0 mm

transmucosal neck) mini-implant as the rougher transmucosal neck surface. It is

well known that irregular surfaces promote colonization and mainly reduce

hygiene procedures efficiency, thereby encourages the evolution of biofilm and

its complexity (Quirynen et al, 1993; Rimondini et al, 1997; Schmidlin et al, 2013).

The transmucosal neck of temporary anchorage devices was in focus in

the present study because it remains in contact with the adjacent mucosa,

forming a new sulcus. Depending on the anatomic location of the mini-implant, it

offers difficulty in access and cleaning (Freitas et al, 2012; Lee & Wang, 2010;

Stájer et al, 2012).

After insertion, the mini-implant’s surface exposed to oral cavity is covered

by salivary pellicle, followed by microbial adsortion and adhesion (Gosau et al,

2010), although the adquired pellicle on titanium surfaces presents lower albumin

adsortion capability (Lee & Wang, 2010). The sulcus seal is essential for peri-

implant mucosa health and must be protected from bacteria invasion (Lee &

Wang, 2010; Stájer et al, 2012). The long-term permanence of temporary

anchorage devices depends on microbial control around them, since poor

hygiene can lead to mucosal inflammation and mini-implant’s failure (Apel et al,

2009; Bürgers et al, 2010; Freitas et al, 2012; Hoiby et al, 2010; Tortamano et al,

2012; Tseng et al, 2006).

It is expected that the biofilm formation on implants occurs similar to the

teeth (Dhir et al, 2013; Lee & Wang, 2010). Then, as described in our study, initial

colonizers were observed in the early stage of biofilm formation. Despite most

68

are commensal bacteria, they provide the pre-conditions for the aggregation of

the subsequent colonizers, as gram negative anaerobic bacteria, and influence

the stages of biofilm formation (Li et al, 2004; Kreth et al, 2009; Heuer et al, 2011).

The oral cavity is a complex environment difficult to reproduce (Al-Ahmad

et al, 2013). The supragingival plaque was collected from patients and cultured

in vitro. Although the authors followed previously published methods for biofilm

formation (Sànchez et al, 2011; Walker et al, 2007), our cells culture suffered

selection.

Microscopic images showed microbial adhesion at six hours of incubation,

corroborating with prior studies that described initial colonization after 30 minutes,

among the interval times from zero to four hours, or from two to six hours of oral

exposure (Al-Ahmad et al, 2013; Dhir et al, 2013; Lee & Wang, 2010; Subramani

et al, 2009). The bacterial morphology evidenced cocci, rods, bacilli, short and

long filaments and corn cobs during all experimental times. Stájer et al (2012)

described the presence of early colonizers in the first 24 hours and the

maintenance of stable colonization up to 14 days. Freitas et al (2012) also

evidenced the colonization of Streptococcus on mini-implants’s gingival sulcus

after 24 hours of insertion, which remained stable for three months. Other

authors reported the presence of similar bacterial morphologies, as Dhir et al

(2013), Kreth et al, (2008), Rimondini et al (1997) and Subramani et al (2009).

However, between 96 and 120 hours, SEM and FM images of this study showed

more mature cellular organization. Teughels et al (2006) reported that mature

plaque was present, but only after several days, and showed increased

proportions of rods, motile and spirochets. In almost all our fluorescence

photomicrographs, the oral bacteria colonization on the surface was monolayer

69

or isolated aggregation of cells, as well as previously described by Gosau et al

(2010).

The molecular evaluation showed the diversity of micro-organisms in the

transmucosal neck of mini-implants at interval times. Species of all bacteria

complexes were found at 12 hours of incubation, even those belonging to the red

complex. Similar results were found by Li et al (2004) that analyzed the biofilm

collected from teeth, except for the observation of bacteria from the red complex

even in the early stages from zero to six hours time interval. In spite of the

diversity, the levels of bacteria remained stable in this study, with no significant

statistical difference during the follow-up period.

Results confirmed that different microbial communities of supragingival

complexes could resist and grow on mini-implants surface. The orange and the

red complexes, usually associated with periodontal disease and clinical signs of

inflammation (Haffajee et al, 2008), were detected at initial time and remained in

high levels (3-5) even after six or seven days of incubation. Periodontopathogen

species as P. melaninogenica, F. nucleatum vicentii, G. morbilorum, C. concisus,

C. showae, S. noxia, classified in the orange complex, and E. nodatum, T.

socranskii, P. gingivalis, T. forsythia, from the red complex, when adhered to mini-

implants in the oral cavity, in the same levels evidenced in this study, would

possibly cause peri-implant inflammation and contribute to stability loss. In

contrast, bacteria classified in the purple, green, blue or yellow complexes,

observed in periodontal health, were detected during all experimental times, and

mostly in lower levels (0-2), except for A. naeslundii, Aa a+b+c, A. gerencseria,

V. parvula, C. gingivalis and S. gordonii. Therefore, its was verified that biofilm

composition became more complex over time, with predominance of pathogenic

micro-organims.

70

Conclusion

According to the results, mini-implants represented a propitious site for

microbial adhesion and biofilm formation. Itconfirms the importance to control

bacterial colonization in order to preserve the mucosal seal around implants,

preventing inflammation and devices’s failure.

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4.3 ARTIGO 3

OSÓRIO A, LEITE D, SOUTO RM, COLOMBO APV, ALVIANO DS, NOJIMA

MCG. Microbial control of orthodontic mini-implants. Artigo a ser submetido ao

American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics.

Abstract

Introduction: Microbial control around mini-implants is considered an important

factor for the temporary anchorage device (TAD) maintainance during orthodontic

treatment, since poor hygiene can lead to inflammation of peri-implant mucosa

and stability loss. Thereby, the authors aimed to evaluate four methods applied

for mini-implant microbial control, and indicate the most suitable hygiene

procedure for cleaning mini-implants. Methods: At baseline and 21 days after

usage of mechanical, chlorexidine, triclosan or cetylpyridinium chloride methods

of oral hygiene, biological material was collected from 59 mini-implants and

processed for real-time PCR molecular investigation of total nonspecific bacteria.

Results: There was significant difference between baseline and 21 days

bacterial total count considering each hygiene method, except for the

cetylpyridinium chloride. However, no statistical difference was detected when all

methods were compared. Conclusions: The mechanical hygiene of orthodontic

mini-implants works well to keep microbial control of the devices.

77

INTRODUCTION

Anchorage in Orthodontics is defined as resistance to undesirable tooth

movement. 1-4 The conventional methods for anchorage are not the best for

critical cases, since they involve structures with potencial mobility as teeth and

depend on patient cooperation. 1-3, 5 The development of skeletal anchorage

methods contributed to difficult tooth movements, as mesiodistal movement of

posterior teeth, individual or mass intrusion, become more easily achieved.6

Thus, mini-implants are replacing anchorage devices as headgears, elastics and

arch bars. 3, 6

Several studies showed clinical applications, mechanical strategies and

properties of these skeletal devices. Nevertheless, the biological factors

associated with long-term success of mini-implants are underexploited. Microbial

control around mini-implants is considered a relevant factor for the device

maintainance, 1, 4, 7, 8 specially because the poor hygiene can lead to inflammation

of peri-implant mucosa and TAD’s stability loss. 3, 9-10

Immediately after intra-oral exposure, the mini-implant’s surface is covered

by adquired pellicle, which promotes the adhesion of early colonizers. These

bacteria create favorable conditions for adhesion of other species, including

periodontophatogens, which are frequently associated with inflammation and

periodontal disease. 21-25

The sulcus formed between the transmucosal neck of mini-implants and

the adjacent gingiva establishes an area of close contact between the material

surface and the mucosa. However, this area can be colonized if dental plaque

accumulation persists and implant hygiene procedures fail. 4, 26, 27

78

Some methods have been proposed for mini-implants’s hygiene,

especially based on chemical agents. 1, 4, 9, 23, 27 Despite the consensus about the

necessity to reduce factors influencing microbial adhesion and biofilm formation,

an efficient method for microbial control around mini-implants is not yet defined.

Therefore, the aim of the present study was to evaluate the efficiency of four

methods indicated for orthodontic mini-implant’s microbial control.


Among 42 young adults, from both genders, under treatment at the

Graduation Clinic of Orthodontics at the School of Dentistry of Federal University

of Rio de Janeiro, Brazil, 39 individuals were sellected for the present research

and contributed with 59 mini-implants in total. The exclusion criteria were the

presence of systemic diseases, recent antibiotic therapy (six months before the

beginning of the study and/or over the study period) and pregnancy. All patients

signed a consent form previously approved by the Research Ethics Committee

of IESC/ UFRJ (protocol #50/2011; report #149/2011).

Individuals were randomly distributed in four groups according to the

hygiene method applied, comprising: mechanical hygiene (MG), or mechanical

hygiene associated with chemical agent: chlorhexidine 0.12% (CHXG), Triclosan

0.03% (TG), or cetylpyridinium chloride 0.05% (CPCG). To standardize the

hygiene methods, the participants received oral hygiene instructions and a written

protocol to be followed, adapted to each group of the study.

Sample collection

79

Collections were performed in the sulcus formed between the mini-

implants’s transmucosal neck and the attached gingiva at baseline and 21 days

after the use of the therapeutic methods. 4, 11

Previously, supragingival plaque was removed with sterile gauze and

compressed air around dental surface and mini-implant’s head. The anchorage

devices were kept isolated with sterile cotton rolls. 28-31

Four endodontic paper points # 40 (ENDO POINTS®, Manacapuru, AM,

Brasil) were gently inserted in the sulcus formed between the TAD’s

transmucosal neck and the attached gingiva during 45 seconds to collect the

biological material. 11, 32-34

The paper points were stored inside Eppendorf® tubes with 50 µl of Tris

EDTA and maintained at -20°C until laboratorial process.11, 35

DNA extraction

DNA samples were extracted by proteinase K method. 36 After defrosting,

tubes were vortexed for 60 seconds and the four paper points inside each tube

were despised. The biological material was centrifuged, the pellet was preserved

and 44 µL of TE, 5 µL of Tween 20 5% and 1 mL of Proteinase K 10 mg/mL were

added to the tube. A total volume of 50 µL was obtained for reaction. The DNA

concentration was measured (NanoDrop® 2000, Thermo Scientific, Waltham,

MA, USA) and standardized to guarentee the fidelity of the reaction results.

Real-time PCR quantitative analysis

The quantitative analysis of total bacteria was performed at baseline and

21 days after treatment in each group to evaluate the hygiene methods applied

over the study. Total bacteria quantification was made using 16S ribossomal

80

RNA (rRNA) gene targeted real- time PCR. Power SYBER Green PCR Master

Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was used for a total volume of

20 µL reaction. The universal primers sellected were described by Asai et al

(2002) (5’ - GAT TAG ATA CCC TGG TAG TCC AC – 3’ and 5’ – TAC CTT GTT

ACG ACT T – 3’). Each reaction comprised 5µL DNA(3 ng/µL),10 µL MIX, 0.4 µL

of each primer, 0.4 µL ROX (1:10) to control variation in volume and evaporation

along the reaction, and 3.8 µL of ultrapure water for PCR. The reactions were

distributed to 96-well culture plates, sealed, centrifuged and inserted into the

thermocycler for amplification. The programmed cycles were: 1 cycle

95ºC/10min; 40 cycles 95ºC/1min, 40 cycles 52ºC/1min and 40 cycles 72ºC/1min.

Amplifications were measured at 78 ºC. The fluorescence was monitored in every

cycle.

Standard curves used as reference to acquire the results and assess

bacterial levels presented 1:1 ratio between the number of copies obtained and

the number of bacterial cells evidenced in the analyzed samples.37 The curves

concentration ranged from 102 to 107, based upon DNA extracted from

Enterococcus Faecalis ATCC 29212 strain. While the reaction occured, the

fluorescent signals were input into graphics and numeric values obtained as

results of mathematical calculs carried out on software v2.0.4 ABI 7500 (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA).

Data analysis

Data was analyzed on SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Sciences;

SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Descriptive analysis of results was performed by

mean values and standard deviation. Data normality was tested by Kolmogorov-

Smirnov. Paired T Student test was applied to verify intragroup difference and

81

ANOVA with Tukey Post-Hoc to detect diferences among groups. The assumed

significance level was 5%.

Results

Real time PCR results revealed that it is important to establish a routine

for mini-implants’s hygiene. The methods applied in the present study showed

significant difference between baseline and final observation times, except for

CPCG with cetylpyridinium chloride 0.05%. Nevertheless, there was no statistical

difference among all hygiene protocols studied herein (Table I). This evidenced

that the mechanical hygiene of orthodontic mini-implants per se is enough to keep

microbial control of the devices.

Table I. Intragroup and intergroup comparison regarding changes in the number of bacterial cells

(log 10) detected at baseline (T1) and final observation time (T2), according to the hygiene

protocol applied in the study.

N= sample number; SD (standard deviation). * Statistical significance level at 5%.. *Paired t test for intragroup comparison. ANOVA with Tukey Post-Hoc for intergroup comparison.

Discussion

Success in skeletal orthodontic anchorage is mainly dependent on TAD’s

primary stability. It is defined as implant fixation immediately after insertion. Mini-

implant’s stability is influenced by operator skill during surgical procedure, quality

of the host bone and anatomical region sellected for insertion. Titanium alloys are

82

biocompatible materials, which offer corrosion resistance,mechanical resistance

and great surface topography. 6, 9, 12, 24, 27, 38- 40 For implants’s long-term stability,

it is also important to consider the magnitude of the applied force, presence of

trauma and plaque control around the screw. 9, 14, 15, 19, 40, 41

An adquired pellicle readly covers the mini-implant’s surface after oral

exposure and the early colonizers begin the biofilm formation process, promoting

the attachment of virulent species responsable for tissue inflammation and

periodontal disease. 13, 21-25When implant hygiene fails, the peri-implant gingival

sulcus is colonized by dental plaque constituted by micro-organisms with different

levels of virulence and loses the natural seal, compromising device permanence

in the oral cavity.1, 4, 9, 27, 39, 43.

The mouthwash rinses are products used for oral hygiene since they help

maintain oral health and improve the quality of life for patients, as well as their

general health. 44 However, some authors reported that brushing the teeth with

fluoride dentifrice is enough to reduce clinical periodontal index and the quantity

of 40 species from oral microbiota 45

Gosau et al (2010) described that mechanical debridment on implants

surfaces does not remove all adhering micro-organisms, and should be

complemented with other peri-implant therapies as use of antiseptics. The

combined use of chemical agentes and mechanical theraphy should be preferred.

Our results revealed significant difference among the therapies applied

between baseline and final observation times over the study, except for the

Cetylpyridinium Chloride 0.05% mouthwash. Results were favorable to mini-

implants microbial control maintenance, since reduced non-specific total bacteria

colonization, which is considered an important factor to restore the equilibrium

between peri-implant microbiota and host defense. 23

83

Prior studies have shown that Chlorhexidine 0.12% presents wide-

spectrum antibacterial activity. 46, 47It acts by altering the bacterial cell membrane

and causing subsequent leakage and destruction of the cell. 21, 47 Chlorhexidine

also reveals great substantivity, defined as the ability to bind to tissues with slow

release.48 The efficacy of chlorhexidine is comproved by several results

described in the literature.49 Chlorhexidine gluconate inhibit plaque formation

around natural teeth and implants.21, 23

Other chemicals, as triclosan, are reported as plaque-reducing mouth

rinses. Triclosan 0.03% was searched by several authors and defined as high

antibacterial potente agent, capable to reduce the attached bacteria, including

gram-positive, gram-negative and anaerobic bacteria. 50, 51 However, among the

studies evaluated by Gosau et al (2010), none of them evidenced that triclosan

was as efficient as chlorexidine.

Cetylpyridinium chloride 0.05% exhibited reduction in gingivitis and

supragingival plaque index, overall score of bacteria in gingival sulcus and saliva,

as significant decrease in anaerobic bacteria of supragingival plaque after 14

days of use. 52-54

The present study did not reveal statistical difference among the hygiene

methods tested. Previous researches comparing Chlorexidine 0.12%, Triclosan

0.03% and Cetylpyridinium Chloride 0.05% showed greater efficacy of

chlorexidine or triclosan based mouth rinses in bacteria recolonization control as

well as supragingival plaque and gingivitis clinical index after five days use.55, 56

Nevertheless Lang et al (2012) described that products as Triclosan 0.03% and

Chlorexidine 0.12% offer modest efficacy in plaque acumulation and gingivitis

reduction when conventional oral hygiene is not applied (Lang et al, 2012).

84

However, based on our data, it was evidenced that only the mechanical

hygiene of mini-implants maintains microbial control of orthodontic mini-implants.

Our results are similar to studies which pointed that mouth rinses based on

triclosan or chlorexidine in addition to toothbrushing with dentifrice containing

triclosan 0,03% did not bring better benefit to the oral microbial control.57, 58

Toothbrushing with triclosan 0.03% dentifrice has greater efficacy when

compared with the conventional fluoride ones.51, 59 Peri-implant microbial control

is achieved by brushing with triclosan 0.03% and copolymer dentifrice. Those

dentifrices reduce supragingival plaque index and gingivitis, besides the mainly

periodontopathogens.60 It is also important to emphasize that even in low

concentrations of NaF, in an acidic environment, the reaction between Ti and the

proton of HF in solution, destroy the titanium oxide layer, which is responsable

for corrosion resistance of titanium alloys. Treatment with these solutions causes

significant changes on Ti surface roughness, favoring the development of more

mature plaque and hampering biofilm removal.27 Thus, mechanical hygiene of

peri-implant area should be better applied in oral hygiene routine.

CONCLUSION

The mechanical hygiene of orthodontic mini-implants by itself maintains

microbial control of the devices. The different methods applied in this study were

capable to control microbial colonization around TADs, except for the

Cetylpyridinium Chloride 0.05% mouthwash.

85

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93

5 DISCUSSÃO

A influência dos fatores biológicos associados ao sucesso dos mini-

implantes ortodônticos é um aspecto ainda pouco explorado a despeito da sua

importância. Apesar do pouco tempo de permanência destes dispositivos

transitórios de ancoragem, quando comparado ao período total do tratamento

ortodôntico ou ao tempo de permanência de um elemento dentário ou implante,

não se justifica a escassez de pesquisas sobre o assunto. A inflamação do tecido

adjacente ao parafuso gera desconforto e pode causar perda de estabilidade do

mesmo, na ausência de terapia adequada.

A área peri-implantar, que corresponde à área de contato entre o perfil

transmucoso do mini-implante e a gengiva inserida adjacente é responsável pelo

selamento mucoso e proteção do dispositivo contra adesão e retenção

microbiana (AL-AHMAD et al, 2013; BURGÜERS et al, 2009; DORKHAN et al,

2012; FREITAS et al, 2012; STÁJER et al, 2012; SUBRAMANI et al, 2009). Ao

ser inserido na cavidade bucal, a superfície do mini-implante e a mucosa definem

um novo sulco, o qual, dependendo da localização, pode oferecer dificuldades

para o acesso clínico e a higienização (FREITAS et al, 2012; LEE e WANG,

2010; STÁJER et al, 2012). Portanto, o perfil transmucoso foi eleito como região

de interesse para os experimentos in vitro e in vivo que têm sido desenvolvidos.

A literatura apresenta estudos prévios abordando alguns fatores que

podem interferir no controle microbiano dos mini-implantes, como as

94

propriedades do material do dispositivo, os métodos de higienização aplicados,

a colaboração e as características individuais dos pacientes.

A importância das características da superfície dos materiais

odontológicos é bastante discutida na literatura científica, visto que interferem no

seu comportamento na cavidade bucal (QUIRYNEN et al, 2009). Os mini-

implantes são constituídos de ligas de titânio T6Al4V, pois este material apresenta

excelentes características de superfície e biocompatibilidade, além de

resistência mecânica, resistência à corrosão (ALSAMAK et al, 2012;

SUBRAMANI et al, 2009).

Com o objetivo de determinar a topografia do material de maior

rugosidade de superfície, para o desenvolvimento do experimento in vitro, foi

desenvolvido o estudo preliminar com três marcas comerciais de mini-implantes

nacionais (página 44). Para tal, estes foram submetidos à microscopia eletrônica

de varredura (MEV) e microscopia de força atômica (MFA).

Os resultados apresentados nas fotomicrografias e nas imagens

tridimensionais da superfície do perfil transmucoso dos mini-implantes

analisados encontram-se expostos nas Figuras 1 e 2 (páginas 48 e 49), e

corroboram com estudo já publicado, evidenciando a irregularidade na topografia

dos DTA, com estrias paralelas entre si e defeitos estruturais ao longo do perfil

transmucoso (ALSAMAK et al, 2012). Os autores também concordam que

fabricantes deveriam produzir materiais com superfície mais lisa e homogênea,

no intuito de diminuir o potencial de adesão microbiana nos mini-implantes

ortodônticos (BÜRGERS et al, 2009; DRAKE et al, 1999; QUIRYNEN et al,

1993). Além da diferença entre as marcas avaliadas, observou-se, também, a

diferença visual importante entre dispositivos de um mesmo fabricante,

95

ratificando a necessidade de melhor acabamento das peças (Tabela 1, página

49).

BOLLEN et al (1997) sugeriram o valor de 0,2 µm Ra como valor máximo

de rugosidade de superfície para o controle da adesão bacteriana. Os valores

encontrados no presente estudo mostraram a marca SIN® (São Paulo, SP,

Brasil) com os maiores valores de rugosidade de superfície do perfil

transmucoso, apresentando diferença estatística em relação aos demais mini-

implantes avaliados (Tabela 1, página 49). Os dispositivos da marca SIN®

revelaram média de rugosidade maior em relação àquela considerada ideal para

o controle microbiano, determinada em 0,25 µm. No entanto, transpondo os

resultados para a aplicação clínica de fato, os autores deste estudo não

acreditam que 0,05 µm comprometam sua utilização na prática ortodôntica,

quando realizada higienização adequada.

Após a exposição do titânio à cavidade bucal, forma-se imediatamente

uma película salivar, apesar desta apresentar menor capacidade de adsorção da

albumina sobre o material considerado (LEE e WANG, 2010). As proteínas da

película salivar agem como receptores para adesão de micro-organismos sobre

a superfície do titânio, com subsequente formação de biofilme (DORKHAN et al,

2012).

Superfícies rugosas favorecem o acúmulo e a retenção de placa

bacteriana (TEUGHELS et al, 2006). A rugosidade aumenta a área de superfície

disponível para colonização, com a formação de picos e vales, além de permitir

estabelecimento de ligações mais fortes entre as mesmas e a superfície do

titânio (AL-AHMAD et al, 2013; QUIRYNEN et al, 1993; RIMONDINI et al, 1997).

Portanto, o perfil transmucoso dos mini-implantes merece acabamento mais

refinado e superfície mais polida, a fim de reduzir injúrias do ambiente bucal (AL-

96

AHMAD et al, 2013; BURGÜERS et al, 2009; DORKHAN et al, 2012; FREITAS

et al, 2012; STÁJER et al, 2012; SUBRAMANI et al, 2009).

É constatado que superfícies irregulares reduzem a eficiência dos

procedimentos de higiene e, por consequência, facilitam a formação, a evolução

e o aumento da complexidade do biofilme (QUIRYNEN et al, 1993; RIMONDINI

et al, 1997; SCHMIDLIN et al, 2013). Como o selamento do sulco entre a

superfície do titânio e a mucosa adjacente é essencial para manutenção da

saúde peri-implantar, este deve ser protegido da invasão bacteriana (LEE e

WANG, 2010; STÁJER et al, 2012).

A formação do biofilme em implantes constituídos de titânio ocorre de

modo semelhante à superfície dentária (DHIR et al, 2013; LEE e WANG, 2010).

Logo, os colonizadores iniciais são semalhantes e são observados no estágio

inicial da formação do biofilme. A maioria das bactérias colonizadoras iniciais são

comensais, porém fornecem as condições necessárias para agregação dos

colonizadores subsequentes, como anaeróbios gram-negativos e influenciam

nos estágios de formação do biofilme (LI et al, 2004; KRETH et al, 2009; HEUER

et al, 2011).

O meio bucal é um ambiente complexo que apresenta condições

especiais, sendo de difícil reprodução em laboratório (AL-AHMAD et al, 2013).

Para observar a adesão e a formação de biofilme na superfície do perfil

transmucoso de mini-implantes ortodônticos, foi realizado o ensaio

microbiológico in vitro. Utilizou-se inóculo cultivado em laboratório, a partir da

placa supragengival coletada de pacientes ortodônticos, sob restrição de

oxigênio. Com isso, o inóculo sofreu, portanto, sua primeira seleção. Os autores

seguiram os modelos de desenvolvimento de biofilme in vitro publicados por

SÀNCHEZ et al (2011) e WALKER et al (2007). Os métodos aplicados podem

97

ter influenciado os resultados obtidos na presente pesquisa, principalmente, no

que diz respeito aos resultados nas primeiras 72 horas de experimento, pois a

renovação do meio de cultura foi realizada de 48 em 48 horas após as primeiras

72 horas de incubação (Figura 2, página 64; Anexos 7 e 8, páginas 120 e 121).

A viabilidade e a diversidade decresceram nos tempos iniciais, e aumentaram

com a renovação do meio de cultura (Figura 2, página 64; Anexos 7 e 8, págnas

120 e 121).

As imagens obtidas em MEV, neste estudo, evidenciaram adesão

microbiana após seis horas de experimento, corroborando com resultados já

descritos em estudos prévios (Figura 2, página 64; Anexos 7 e 8, páginas 120 e

121). Estes mostraram a colonização inicial após 30 minutos de inoculação; entre

intervalos de zero e duas horas assim como intervalos entre duas e seis horas

de exposição à cavidade bucal (AL-AHMAD et al, 2013; DHIR et al, 2013; LEE e

WANG, 2010; SUBRAMANI et al, 2009). STÁJER et al (2012) descreveram a

presença de colonizadores iniciais nas primeiras 24 horas de experimento, com

manutenção da colonização de modo estável até 14 dias. FREITAS et al (2012)

também detectaram a colonização inicial de streptococcus spp nas primeiras 24

horas, a qual permaneceu estável por três meses. A morfologia bacteriana

observada nas imagens de MEV (Figura 2, página 64; Anexos 7 e 8, páginas 120

e 121) mostrou variação desde os tempos iniciais, com a presença de cocos,

bastões, bacilos, filamentos curtos e longos, concordando com formas descritas

por autores em estudos anteriores, como DHIR et al (2013), KRETH et al, (2008),

RIMONDINI et al (1997) e SUBRAMANI et al (2009). Nas fotomicrografias entre

96 e 120 horas, ou seja após 4 e 5 dias do início do experimento, observou-se

organização celular mais madura (Figura 2, página 64; Anexos 7 e 8, páginas

120 e 121). Nossos achados diferem de TEUGHELS et al (2006), os quais

98

reportaram a presença de placa madura entre sete e 10 dias, aproximadamente,

com a constatação de bastões e espiroquetas. Nas fotomicrografias por

fluorescência, a colonização bacteriana na superfície do titânio dos DTA da

marca SIN® mostrou-se em camada única, com micro-colônias ou células

isoladas durante todo o tempo experimental (Figura 2, página 64; Anexos 7 e 8,

págs. 120 e 121), conforme descrito por GOSAU et al (2010).

Os resultados obtidos a partir do Checkerboard DNA-DNA hybridization

confirmaram a diversidade microbiana durante todos os tempos de avaliação

investigados no estudo in vitro aqui discutido (Figura 3, página 66). Todos os

complexos microbianos da placa supragengival descritos por HAFFAJEE et al

(2008) foram detectados nas primeiras 12 horas de incubação, inclusive os dos

complexos laranja e vermelho, que estão associados às doenças periodontais

(Figura 3, página 66). Resultados semelhantes foram descritos por LI et al (2004)

a partir da coleta de placa bacteriana da superfície dentária, exceto pela

detecção de bactérias do complexo vermelho a partir das primeiras seis horas

de experimento. Apesar da diversidade de micro-organismos observados, os

níveis bacterianos permaneceram estáveis, sem diferença estatística significante

entre os intervalos de tempo estudados (página 65). A sensibilidade da técnica

e os níveis de detecção utilizados podem ter colaborado para os baixos níveis

bactérias evidenciados. O fato de a técnica não ter detectado a presença de

determinadas espécies não significa, obrigatoriamente, que estas não estavam

presentes. Pode-se afirmar somente que não alcançaram o nível mínimo de

detecção do método aplicado.

Diante da evidência da rápida e estável colonização microbiana na

superfície do perfil transmucoso de mini-implantes ortodônticos, justifica-se,

portanto, que o método de controle microbiano adequado do sulco peri-implantar

99

tenha sido investigado nesta pesquisa (página 76). A inflamação do periodonto

ocorre quando a higiene é insatisfatória e não há controle microbiano adequado

da região peri-implantar, prejudicando a permanência dos dispositivos

temporários de ancoragem na cavidade bucal (APEL et al, 2009; BÜRGERS et

al, 2010; FREITAS et al, 2012; HOIBY et al, 2010; TORTAMANO et al, 2012;

TSENG et al, 2006).

Enxaguatórios são amplamente utilizados como produtos auxiliares da

higiene bucal, pois contribuem para a saúde bucal e geral dos pacientes,

influenciando na melhora da qualidade de vida dos mesmos (CORTELLI et al,

2010). Entretanto, autores descreveram que o uso de dentifrício fluoretado na

escovação seria suficiente para reduzir índices clínicos periodontais e diminuir o

nível de micro-organismos na microbiota bucal (BOGREN et al, 2007).

O debridamento mecânico da superfície de implantes dentários foi

descrito, por GOSAU et al (2010), como estratégia insuficiente para remoção de

todos os micro-organismos aderidos. A higiene na região implantar deveria ser

complementada por antissépticos bucais, associando as estratégias mecânica e

química para o controle microbiano (GOSAU et al, 2010).

O estudo in vivo (página 76) revelou a eficácia de todas as terapias de

controle microbiano aplicadas na metodologia, exceto pelo bochecho de cloreto

de cetilpiridínio 0,05% (p > 0,05) (Tabela 1, página 81). A quantidade total de

bactérias inespecíficas detectadas pelo PCR real-time diminuiu nos grupos

avaliados, apesar de a diferença estatística não se apresentar em todos. Este

resultado é considerado favorável ao controle microbiano, visto que a redução

do nível bacteriano é fator importante para manter o equilíbrio entre a microbiota

peri-implantar e a defesa do hospedeiro (GOSAU et al, 2010).

100

A clorexidina possui amplo espectro de atividade antibacteriana (SLOTS

et al. 1991; QUIRYNEN et al; 2002), atua na membrana celular, causando sua

ruptura e, desse modo, a lise celular (QUIRYNEN et al, 2002; BÜRGERS et al,

2008). Além disso, a clorexidina também apresenta substantividade, a qual é

definida pela capacidade de ligar-se aos tecidos e ser lentamente liberada

(MANDEL, 1994). Resultados descritos na literatura comprovam sua eficácia

(GUSBERTI e SAMPATHKURMAR, 1988) e destacam que o gluconato de

clorexidina inibe a formação de placa bacteriana na superfície dentária e ao redor

de implantes (BÜRGERS et al, 2008; GOSAU et al, 2010).

Outras substâncias antissépticas são descritas como enxaguatórios

bucais capazes de reduzir a placa bacteriana. O triclosan 0,03% apresenta alto

potencial antibacteriano, pois reduz a adesão de bactérias gram-positivas, gram-

negativas e anaeróbias (HAROSZTHY et al, 2010; WALKER et al, 1994). Porém,

os estudos avaliados por GOSAU et al (2010) não comprovaram a maior

eficiência do triclosan em relação à clorexidina.

O cloreto de cetilpiridínio 0,05% foi citado, em pesquisas anteriores, como

responsável pela redução da gengivite, do índice de placa supragengival, e do

total de bactérias presentes no sulco gengival e saliva. Constatou-se, também,

a diminuição significativa do número de bactérias anaeróbias na placa

supragengival após 14 dias de sua utilização (ALLEN et al, 1998; ESCRIBANO

et al, 2010; Hu et al, 2009).

Os resultados deste estudo não demonstraram diferença estatística entre

os quatro métodos de higiene estudados (Tabela 1, página 81), caracterizando

a higienização mecânica como método suficiente para o controle de placa nos

DAT. No entanto, estudos prévios compararam bochechos a base de clorexidina

0,12%, triclosan 0,03% e cloreto de cetilpiridínio 0,05%, determinando maior

101

eficácia da clorexidina e do triclosan no controle da recolonização bacteriana,

placa supragengival, gengivite e dos índices clínicos periodontais, após cinco

dias de uso (PIZZO et al, 2006; SHIM et al, 2012).

Considerando os dentifrícios utilizados na escovação, aqueles que

contêm triclosan 0,03% apresentaram melhores resultados quando comparados

aos convencionais, somente fluoretados (CIANCIO et al, 2011; WALKER et al,

1994). O controle microbiano peri-implantar é alcançado através da escovação

com dentifrício contendo triclosan 0,03% e copolímero. Estes dentifrícios

reduzem os índices de placa supragengival e gengivite, assim como os principais

patógenos periodontais (SREENIVASAN et al, 2011). Cabe ressaltar ainda que,

mesmo em baixas concentrações, a presença do fluoreto de sódio em ambiente

ácido estimula a reação entre o Ti e os prótons de HF, destruindo a camada de

óxido de titânio responsável pela resistência à corrosão das ligas de titânio. A

utilização de colutórios bucais, géis fluoretados ou soluções aquosas de NaF

altera a rugosidade de superfície do titânio, favorece o desenvolvimento de placa

bacteriana madura e dificulta a remoção do biofilme (STÁJER et al, 2012).

De acordo com os resultados obtidos nesta pesquisa, fica evidente a

importância da indicação do controle microbiano dos mini-implantes e da região

peri-implantar, visto que os DTA apresentam superfície favorável à adesão e

desenvolvimento de diferentes espécies de micro-organismos desde os estágios

iniciais de contato com os mesmos. A estratégia de higienização mecânica dos

DTA é eficaz e elimina a etapa adicional do controle químico do biofilme aderido,

a qual exige maior colaboração e custo adicional aos pacientes portadores

destes dispositivos. Com isso, a saúde do periodonto adjacente aos mini-

implantes seria mantida e deixaria de ser um fator contribuinte para a perda de

estabilidade dos mesmos.

102

6 CONCLUSÃO

6.1 Os mini-implantes da marca SIN® (São Paulo, SP, Brazil)

apresentaram rugosidade de superfície signicativamente maior quando

comparados aos mini-implantes das marcas INP® (São Paulo, SP, Brasil) e

Conexão® (Arujá, SP, Brasil).

6.2 A adesão microbiana, in vitro, na superfície de mini-implantes

ortodônticos foi evidenciada a partir de seis horas de incubação, com diferentes

morfologias bacterianas e seguiu sem variação importante. A colonização

bacteriana na superfície do titânio ocorreu em camada única, com micro-colônias

ou células isoladas. A quantidade e a qualidade das bactérias detectadas

mantiveram-se sem diferença estatística ao longo do estudo.

6.3 Todas as terapias de controle microbiano peri-implantar investigadas

apresentaram-se eficazes. Não houve diferença estatística entre os quatro

métodos de higiene estudados: mecânica, ou complementada com soluções à

basse de clorexidina, triclosan e cloreto de cetilpiridínio.

103

7 RECOMENDAÇÕES

7.1 Aumentar a variedade de marcas comerciais de mini-implantes

ortodônticos para avaliação topográfica, incluindo os de fabricação estrangeira,

e considerar, também, a avaliação da energia livre de superfície dos DTA;

7.2 Utilizar câmara de anaerobiose para preparar o inóculo e estudar a

adesão de micro-organismos presentes na placa subgengival, bem como a

formação de biofilme in vitro nos mini-implantes ortodônticos;

7.3 Trocar o meio de cultura utilizado no ensaio in vitro com menor

intervalo de tempo;

7.4 Aplicar PCR Real-time com método TaqMan de detecção para

diagnosticar e quantificar os micro-organismos com capacidade de adesão na

superfície de titânio ao longo do tempo;

7.5 Realizar o ensaio microbiológico in vitro com diferentes marcas

comerciais, que apresentem diferentes características de superfície, a fim de

avaliar a influência destas características na adesão e formação de biofilme;

7.6 Estudar a topografia de mini-implantes removidos da cavidade bucal,

de modo a determinar a influência do meio e da colonização microbiana sobre a

mesma.

7.7 Estender o tempo de avaliação dos métodos de higienização dos mini-

implantes ortodônticos, visando maior alcance clínico nos resultados.

104

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112

9 ANEXOS

9.1 ANEXO 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Essas informações estão sendo fornecidas de modo a convidá-lo (a) a

participar de maneira voluntária na pesquisa denominada: Caracterização de

aspectos biológicos associados aos mini-implantes ortodônticos, que tem

como objetivo verificar os microorganismos que vivem ao redor dos mini-

implantes, determinar o melhor método de mantê-los limpos e combater esses

microorganismos.

Essa pesquisa justifica-se pela grande indicação e utilização destes

dispositivos como auxiliares de ancoragem no tratamento ortodôntico. Além

disso, a inflamação na região de inserção dos mini-implantes corresponde a uma

das principais causas da perda clínica desses dispositivos, e conseqüente

prejuízo no andamento do tratamento.

Você deverá estar matriculado e encontrar-se em tratamento na Clínica

de Ortodontia do Departamento de Odontopediatria e Ortodontia da Faculdade

de Odontologia da UFRJ, além de apresentar indicação da utilização de mini-

implantes no seu plano de tratamento. Será orientado a seguir as instruções de

higiene bucal determinadas por um protocolo, de modo a não haver prejuízos

quanto à saúde bucal durante o seu período de realização. Com a finalidade de

pesquisa, será realizado o seguinte procedimento, além do tratamento de rotina:

Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Odontologia Departamento de Odontopediatria e Ortodontia Curso de Pós-Graduação em Odontologia - Ortodontia

113

Coleta de fluido no sulco entre o mini-implante e a gengiva adjacente,

em dois dias diferentes: um inicial e outro 21 dias após o início da

higienização indicada pelo pesquisador.

Coleta de placa bacteriana ao redor dos bráquetes que compõem o

aparelho ortodôntico fixo e nos dentes.

A participação nesta pesquisa é voluntária e, em caso de desistência, o

você poderá retirar o consentimento, com a certeza de que não haverá prejuízos

em relação à sua assistência, e seus dados não serão utilizados na pesquisa.

Os resultados obtidos, na totalidade, serão publicados sob forma de

artigo, em revista de caráter científico e estarão disponíveis também no serviço.

Os dados pessoais dos participantes serão mantidos em absoluto sigilo. Os

resultados individuais do experimento serão de competência dos pesquisadores

envolvidos no projeto. Não será permitido o acesso a terceiros, garantindo

proteção contra qualquer tipo de discriminação ou estigmatização. Esta pesquisa

não resultará em prejuízos biológicos, psicológicos ou sociais dos seus

participantes. Qualquer dúvida ou informação adicional poderá ser respondida

pelas pesquisadoras envolvidas: Drª Amanda Osório Ayres de Freitas e Profª Drª

Matilde da Cunha Gonçalves Nojima, pelo telefone 2590-2727, sempre que

solicitadas.Caso você tenha dificuldade de entrar em contato com o pesquisador

responsável, comunique o fato à Comissão de Ética em Pesquisa do Instituto de

Estudos em Saúde Coletiva pelo telefone (21) 2598-9328 ou pelo e-mail

[email protected].

Acredito ter sido informado(a) de maneira satisfatória a respeito do estudo

citado acima. Eu discuti com a Dra. Amanda Osório Ayres de Freitas sobre a

minha decisão em participar desse estudo. Ficaram claros para mim quais são

os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus

desconfortos e riscos; as garantias de confidencialidade, e de esclarecimento

permanentes. Ficou claro também que a minha participação é isenta de

despesas e que tenho garantido o acesso ao tratamento ortodôntico durante a

pesquisa. Concordo em participar deste estudo e poderei retirar o meu

consentimento a qualquer momento, sem penalidades ou prejuízos no meu

atendimento na Instituição.

_________________________________ Data ____/____/______.

Participante da pesquisa/ Responsável

mailto:[email protected]

114

_________________________________ Data ____/____/______.

Profª Drª Matilde da Cunha Gonçalves Nojima

_________________________________ Data ____/____/______.

Drª Amanda Osório Ayres de Freitas

115

9.2 ANEXO 2: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

116

9.3 ANEXO 3: PROTOCOLO DE HIGIENIZAÇÃO 1

Protocolo de Higienização Controle para Grupo Mecânico

1) Higienizar sempre após as refeições;

2) Realizar higiene bucal com fio dental, escovação com pasta

fluoretada, escova interdental.

3) Higienizar isoladamente a região do mini-implante, delicadamente,

com o auxílio de escova interdental e pasta fluoretada.

Universidade Federal do Rio de Janeiro Faculdade de Odontologia Departamento de Odontopediatria e Ortodontia Curso de Pós-graduação em Odontologia - Ortodontia

117


Protocolo de Higienização para Grupo Clorexidina




3) Após higienizar isoladamente a região do mini-implante,

delicadamente, com o auxílio de escova dental e pasta fluoretada,

complementar a limpeza com o auxílio de escova interdental

umedecida com a solução fornecida.


118


Protocolo de Higienização para Grupo Triclosan









119


Protocolo de Higienização para Grupo Cloreto de Cetilpiridínio









120

9.7 ANEXO 7: ARTIGO 2, FIGURA 2 (PARTE 1)


4. 24h; 5. 48h; 6. 72h; 7. 96h; 8. 120h; 9. 144h; 10. 168h. A. Fluorescence microscopy 400X; B. Photomicrograph 1.200X;

C. Photomicrograph 5.000X.

121

9.8 ANEXO 8: ARTIGO 2, FIGURA 2 (PARTE 2)


4. 24h; 5. 48h; 6. 72h; 7. 96h; 8. 120h; 9. 144h; 10. 168h. A. Fluorescence microscopy 400X; B. Photomicrograph 1.200X;

C. Photomicrograph 5.000X.

universidade federal do rio de janeiro ufrj centro de ... · amanda osÓrio ayres de freitas, ......

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