universidade federal do paranÁ identificaÇÃo e

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PROMOTORES SIGMA 70 NO GENOMA

DE Herbaspirillum seropedicae SmR1 UTILIZANDO MÉTODOS DE

INTELIGÊNCIA ARTIFICIAL

CURITIBA

2014

i

RODNEI DAMACENO FREIRE

IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE PROMOTORES SIGMA 70 NO GENOMA

DE Herbaspirillum seropedicae SmR1 UTILIZANDO MÉTODOS DE

INTELIGÊNCIA ARTIFICIAL

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Bioinformática,

Setor de Educação Profissional e Tecnológica, da

Universidade Federal do Paraná como requisito

parcial para a obtenção do grau de Mestre em

Bioinformática.

Orientadora: Profª Drª Liu Un Rigo

Coorientador: Prof Dr. Roberto Tadeu Raittz

CURITIBA

2014

iii

“Dedico este trabalho aos meus pais que me deram

apoio nos momentos mais difíceis da minha vida, a

minha esposa e filho que estiveram sempre ao meu

lado ao longo deste estudo, aos meus professores

que me ensinaram que por mais que achamos que o

nosso conhecimento já está bem profundo, estamos

enganados, pois o conhecimento é algo que estará

sempre se renovando”

http://www.brasilblogado.com/dedicatoria-monografia/

iv

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Profa. Dra. Liu Un Rigo pelo apoio, grandes ensinamentos,

confiança e por ter sempre acreditado no projeto.

Ao meu coorientador Prof. Dr. Roberto Tadeu Raittz, pelos ensinamentos,

paciência, apoio, e confiança no projeto.

À Profa. Dra Maria Berenice Reynaud Steffens, pelos aconselhamentos e pela

dedicação ao curso de Pós- Graduação em Bioinformática.

À Profa. Dra. Jeroniza Marchaukoski, pela dedicação e auxílio nos assuntos

relacionados ao curso de Pós-Graduação em Bioinformática.

Ao Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza, pelas sugestões e explicações.

À Profa. Dra. Rose Adele Monteiro pelo apoio e cooperação neste projeto.

Ao Prof. Dr. Leonardo Magalhaes Cruz, pelas sugestões e aconselhamentos.

Aos demais professores e funcionários do Programa de Pós-graduação em

Bioinformática.

À Dra. Heladia Salgado, Departamento de Microbiologia Molecular, Instituto de

Biotecnologia, Programa de Genômica Computacional, Centro de Ciências

Genômicas, Universidade Nacional Autônoma do México, pela gentileza e

contribuições importantes neste trabalho.

Ao companheiro de bancada Dr. Fernando Bachega Ruggiero, pela grande

amizade, aconselhamentos e colaborações relevantes a este projeto.

Ao Ms. Lucas M. Ferreira, pelos aconselhamentos e auxilio prestado.

v

À Suzana, pela atenção e dedicação ao Programa de Pós-graduação em

Bioinformática.

Aos amigos Eslei Xavier, Fausto Koga e Helba Cirino Barboza, pelo apoio,

incentivo e todos os momentos de descontração ao longo deste curso.

Aos demais colegas de laboratório, pelo apoio, incentivo e companheirismo.

Ao Núcleo de Fixação de Nitrogênio da Universidade Federal do Paraná.

Aos órgãos fomentadores: CAPES, CNPq e REUNI.

A Deus, acima de tudo.

vi

RESUMO

Sigma 70 ou sigma N constituem fatores complementares da RNA-polimerase, cuja

principal função é promover a transcrição de genes procarióticos. No caso de Escherichia

coli, o consenso da região -35 (TTGACA) e -10 (TATAAT) do fator sigma 70, está

localizado a partir do intervalo da décima à trigésima quinta base a montante do sítio de

início de transcrição e as bases mais conservadas estão localizadas nas posições -10 (A2

= 95% - T6 = 96%) e -35 (T1 = 82% - T2 = 84%). Propusemos neste trabalho identificar

sequências promotoras de transcrição dependentes do fator sigma 70, utilizando um

algoritmo que pré-seleciona candidatos aos promotores sigma 70 com base no padrão de

conservação. Os candidatos são então classificados através de treinamento de rede

artificial, com conjunto de sequências de promotores sigma 70 validados e um conjunto

de sequências improváveis, geradas aleatoriamente. O método foi testado in silico no

genoma da betaproteobactéria Herbaspirillum seropedicae SmR1, resultando em 4.998

sequências candidatas a promotores fator sigma 70. Deste grupo foram selecionados 288

candidatos a partir das regiões intergênicas de genes com alto nível de expressão. Isto

tornou possível validar os resultados obtidos para identificação de sequências promotoras

sigma 70 e propor uma sequência consenso para o promotor de transcrição sigma 70 em

Herbaspirillum seropedicae SmR1. A metodologia utilizada para identificar os sítios de

ligação sigma 70 mostrou-se eficaz na identificação de candidatos aos promotores sigma

70 em H. seropedicae SmR1 e possivelmente em outras proteobactérias.

Palavras-chave: Herbaspirillum, Promotores, Fatores de Transcrição, sigma 70.

vii

ABSTRACT

Sigma 70 or sigma N constitute complementary sigma factors of RNA-polymerase,

whose main function is to promote the transcription of prokaryotic genes. In the case of

Escherichia coli, the consensus of the -35 region (TTGACA) and -10 (TATAAT) sigma

70 factor sequence, located from the range of the tenth to the thirty-fifth base upstream

of the transcription start site and the bases more conserved are located at positions -10

(A2 = 95% - T6 = 96%) and -35 (T1 = 82% - T2 = 84%). We proposed in this work to

identify promoter sequences of the sigma 70 dependent transcription factor, using an

algorithm that pre-selects candidates for sigma 70 promoters based on conservation

pattern. The candidates sequences are ranked using artificial neural network training set

of validated sigma 70 promoter sequences and a set of randomly generated sequences.

The method was tested in silico using the Betaproteobacteria Herbaspirillum seropedicae

SMR1 genome, resulting in 4.998 candidate sequences for promoters to sigma 70 factor

with standard conservation. Among these candidates 288 were manually selected from

the intergenic regions of genes with high expression level. This made it possible to

validate the results obtained for indentification of sigma 70 sequences and propose a

consensus sequence for transcriptional promoter sigma 70 in Herbaspirillum seropedicae

SMR1. The methodology used to predict sigma 70 binding sites showed effectiveness to

identify candidates for sigma 70 promoters in H. seropedicae SMR1 and possibly in other

proteobacteria.

Keywords: Herbaspirillum, Promoters, Transcription Factors, sigma 70.

viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - ESQUEMA DO PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO ................................ 16

FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO DA INTERAÇÃO DO FATOR SIGMA À

APOENZIMA COMPONDO A HOLOENZIMA. ........................................................ 18

FIGURA 3 - INTERAÇÃO DA RNA-POLIMERASE COM A DUPLA FITA DE DNA

SOBRE A REGIÃO PROMOTORA DEPENDENTE DO FATOR SIGMA 70. ......... 19

FIGURA 4 - REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DAS SEQUÊNCIAS CONSENSO

PARA OS FATORES SIGMA 70 E SIGMA 54. .......................................................... 21

FIGURA 5 - REPRESENTAÇÃO DE PROMOTORES SIGMA 70 EM Escherichia

coli COM AS PROPORÇÕES DE BASES CONSERVADAS NOS HEXÂMEROS

QUE COMPÕEM A REGIÂO -35 E -10. ...................................................................... 21

FIGURA 6 - DESENHO REPRESENTATIVO DE UM NEURÔNIO BIOLÓGICO E

UMA REDE NEURAL ARTIFICIAL. .......................................................................... 27

FIGURA 7 - FASES DO RECONHECIMENTO DE PADRÕES................................. 31

FIGURA 8 - ETAPAS DA CONSTRUÇÃO DO ALGORITIMO. ............................... 44

FIGURA 9 - GRÁFICO BIDIMENSIONAL DE CLASSIFICACÃO PARA AS

REGIÕES -35 σ70 . ......................................................................................................... 47


REGIÕES -10 σ70. .......................................................................................................... 48

FIGURA 11 - MÉTODO DE VEROSSIMILHANÇA UTILIZADO. ........................... 49

FIGURA 12 - GRÁFICO COMPARATIVO ENTRE AS PONTUAÇÕES PARA A

REGIÃO -35 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1 ................. 50

FIGURA 13 - GRÁFICO REPRESENTANDO A SOBREPOSIÇÃO DA

PONTUAÇÃO PARA A REGIÃO -35 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H.

seropedicae SmR1. ......................................................................................................... 50


REGIÃO -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1. ................ 51

FIGURA 15 - GRÁFICO REPRESENTANDO A SOBREPOSIÇÃO DA

PONTUAÇÃO PARA AS REGIÕES -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H.

seropedicae SmR1 .......................................................................................................... 51

FIGURA 16 - GRÁFICO COMPARATIVO ENTRE AS PONTUAÇÕES PARA AS

REGIÕES -35 e -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1. ..... 52

FIGURA 17 - GRÁFICO REPRESENTANDO A SOBREPOSIÇÃO PARA A

PONTUAÇÃO DA REGIÃO -35 e -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H.

seropedicae SmR1 .......................................................................................................... 52

FIGURA 18 - COMPARAÇÃO DAS PROPORÇÕES DE BASES ENTRE O

CONSENSO DA REGIÃO -35 EM E. coli E H. seropedicae SmR1 ............................ 53

FIGURA 19 - COMPARAÇÃO DAS PROPORÇOES DE BASES ENTRE O

CONSENSO DA REGIÃO -10 EM E. coli E H.seropedicae SmR1 ............................. 54

ix

FIGURA 20 - GRÁFICO DE LOGO GERADO APARTIR DAS PROPORÇOES DE

BASES DO BOX -35 EM H. seropedicae SmR1. ......................................................... 56

FIGURA 21 - GRÀFICO GERADO APARTIR DAS PROPORÇOES DE BASES DO

BOX -10 EM H. seropedicae SmR1. ............................................................................. 57

FIGURA 22 - COMPARAÇÃO ENTRE AS REGIÕES PROMOTORAS SIGMA 70

DE Escherichia coli E REGIÕES PROMOTORAS SIGMA 70 PROPOSTAS EM

Herbaspirillum seropedicae SmR1. ............................................................................... 58

x

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - TIPOS DE FATORES SIGMA. .............................................................. 20

QUADRO 2 - CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Herbaspirillum seropedicae. 23

QUADRO 3 - EXEMPLOS DE ESPÉCIES DO GÊNERO HERBASPIRILLUM. ....... 24

QUADRO 4 - EXEMPLOS DE TAREFAS DE CLASSIFICAÇÃO. ........................... 30

QUADRO 5 - CONFIGURAÇÕES DE HARDWARE. ................................................ 39

xi

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - CANDIDATOS A PROMOTORES SIGMA 70 ENCONTRADOS NO

GENOMA DE Herbaspirillum seropedicae SmR1. ...................................................... 45

TABELA 2 - DADOS ESTATISTICOS DOS CANDIDATOS À PROMOTORES

SIGMA 70 EM GENOMA DE Herbaspirillum seropedicae SmR1. ............................ 46

TABELA 3 - PROPORÇÕES DAS BASES DO BOX -35 EM H. seropedicae SmR1 55

TABELA 4 - PROPORÇÕES DAS BASES DO BOX -10 EM H. seropedicae SmR1. 56

xii

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

α – alpha

β – beta

β´ – beta linha

σ – sigma

µm – micrômetros

Conteúdo GC – quantidade de bases “G” em adição às bases “C” em relação ao total de

bases de uma determinada sequência

DDBJ – DNA Databank of Japan

DDR – Double Data Rate

DNA – Ácido Desoxirribonucleico

EMBL – European Molecular Biology Laboratory Nucleotide Sequence Database

Gb – Giga Bytes

Gram negativa – bactéria que possui lipopolissacarídeos na membrana externa, o que

resulta em colaração avermelhada quando coradas pela técnica de Gram

I.A – Inteligência Articial

MATLAB – Matrix Laboratory

MLP – Multilayer Perceptron

NCBI – National Center for Biotechnology Information

N – nitrogênio (elemento químico)

N2 – nitrogênio (gás atmosférico)

NH4Cl – cloreto de amônio

Ns – bases indeterminadas

RBS – Ribosome Binding Site

RNA – Ácido Ribonucleico

RNAm – Ácido Ribonucleico Mensageiro

RNAr – Ácido Ribonucleico Ribossomal

RNAt – Ácido Ribonucleico Transportador

SM – Similaridae Máxima

spp. – conjunto de espécies distintas pertencentes ao mesmo gênero

TSS – Transcription Start Site (sítio de início de transcrição)

xiii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14

1.1 Bioinformática .................................................................................................... 14

1.2 Transcrição ......................................................................................................... 15

1.3 Fatores Sigma ..................................................................................................... 18

1.4 Regulação da expressão gênica em procariotos ................................................. 22

1.5 Herbaspirillum seropedicae ............................................................................... 23

1.6 Inteligência Artificial.......................................................................................... 25

1.7 Redes neurais artificiais ...................................................................................... 26

1.7.1 Estudo do reconhecimento de padrões ..................................................... 28

1.7.2 Conceito de Padrão e classe ..................................................................... 28

1.7.3 Fases de um sistema para reconhecimento de padrões ............................ 29

1.7.4 As propriedades comuns (“feature matching”) ........................................ 31

1.7.5 Sistema de reconhecimento de padrões supervisionado ........................... 32

1.7.6 Classificação de padrões baseada em verossimilhança ............................ 32

1.7.7 Técnica de extração de características ...................................................... 33

3 JUSTIFICATIVAS ..................................................................................................... 34

4 OBJETIVOS ............................................................................................................... 34

4.1 Objetivos gerais .................................................................................................. 34

4.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 34

5 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 35

5.1 Matlab ................................................................................................................. 35

5.2 Microsoft Excel .................................................................................................. 36

5.3 Rede neural MLP (Multilayer Perceptron) ......................................................... 36

5.4 Artemis ............................................................................................................... 37

5.5 NCBI - Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia .......................... 38

5.6 RegulonDB ......................................................................................................... 38

5.7 Hardware ............................................................................................................ 39

5.8 Algoritmo de busca utilizado ............................................................................. 40

5.9 Conjunto de dados .............................................................................................. 41

5.10 Primeiro treinamento e aprendizagem de rede neural artificial ........................ 41

5.11 Segundo treinamento e aprendizagem de rede neural artificial ........................ 42

xiv

5.12 Terceiro treinamento e aprendizagem de rede neural artificial ........................ 42

6 RESULTADOS ........................................................................................................... 44

6.1 Listagem de candidatos a promotores sigma 70 ................................................. 45

6.2 Análises dos dados através de modelos baseados em regressão logística .......... 47

6.3 Análises de dados através de modelos baseados em verossimilhança ............... 48

6.4 Consenso proposto para regiões promotoras sigma 70 em H. seropedicae

SmR1 ............................................................................................................................... 53

7 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 60

APÊNDICES .................................................................................................................. 64

14

1 INTRODUÇÃO

1.1 Bioinformática

A informática ao longo dos anos vem se destacando como uma área de

conhecimento específico e tecnológico de extrema importância para a humanidade,

associando-se com diversas áreas, auxiliando e acelerando pesquisas científicas de

diversas formas. A associação entre a área da Informática com a área das Ciências

Biológicas deu origem a uma nova área interdisciplinar, a Bioinformática, sendo esta

responsável pelo processamento da grande quantidade de dados e informações biológicas

geradas a partir de estudos e análises em laboratórios de Biologia Molecular.

Para o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) o conceito

de Bioinformática é o campo da ciência no qual a Biologia, a Ciência da Computação e a

Tecnologia da Informação se unem para formar uma única disciplina, sendo o objetivo

final a descoberta de novos conhecimentos biológicos. De acordo com o NCBI, a Biologia

do século XXI está sendo transformada de uma biologia baseada somente no laboratório

para uma ciência da informação, e a Informática ajuda no entendimento de vários

processos químicos e biológicos. Já para Fox (2009), a Bioinformática deve envolver a

integração de computadores, ferramentas de software e bancos de dados em um esforço

para o direcionamento de questionamentos biológicos.

Assim, a bioinformática é a conversão de conhecimentos biológicos em modelos

computacionais processáveis (FOX, 2009). Como uma nova área de conhecimento, a

Bioinformática trouxe exaltação para a comunidade científica, justamente pela

possibilidade de imersão em um mundo totalmente novo e desconhecido (FOX, 2009).

De acordo com Bayat (2002), a Bioinformática é uma matéria interdisciplinar que abrange

várias áreas do conhecimento como Biologia, Medicina, Matemática, Física, Ciências da

Computação e Estatística. Um profissional adequado para a área de Bioinformática deve

ter noções específicas nas disciplinas de Biologia e Ciências da Computação, detendo a

capacidade de entender assuntos relacionados à Biologia Molecular além da aptidão de

desenvolver ou aplicar softwares. Algumas das atividades realizadas por esta nova

disciplina envolvem estudar e simular o metabolismo de células, construir árvores

15

evolutivas, estudar estruturas tridimensionais de moléculas, analisar imagens e sinais

biológicos (ARAGUAIA, 2011).

A Bioinformática teve sua origem na década de 1960, quando a pesquisadora

Margaret Dayhoff (1925-1983) organizou e disponibilizou o primeiro atlas de sequências

proteicas, publicado com o seguinte título “Atlas of Protein sequence and structure”

(DAYHOFF, 1969 apud FOX, 2009). Outro grande feito para a Bioinformática da mesma

pesquisadora foi o desenvolvimento da PAM (Point Accepted Mutation) em 1966, uma

matriz para a substituição de aminoácidos, amplamente utilizada nos dias atuais.

Os progressos na área da computação trouxeram várias facilidades para a

Bioinformática, permitindo o armazenamento de uma maior quantidade de dados com

qualidade e velocidade no processamento das informações. Com estes avanços na

tecnologia surgiu um aumento no número de projetos de montagem de genomas. Um

exemplo clássico é o próprio genoma humano, com o seu sequenciamento anunciado no

dia 26 de junho de 2000, 60 meses antes da data estimada em 1987 (VOGT, 2003).

Para termos uma ideia da progressão que a Bioinformática vem apresentando,

há vinte anos atrás uma sequência nucleotídica com uma média de 12 mil pares de bases

levaria um ano para ser sequenciada, há três anos a mesma sequência levaria cerca de

uma hora para ser concluída e atualmente leva menos de um minuto para que o

sequenciamento seja concluído (VOGT, 2003).

O NCBI (Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia), EMBL-EBI

(Instituto Europeu de Bioinformática) e o DDBJ (Base de Dados de DNA do Japão) são

as principais bases de dados que armazenam informações para a Bioinformática, tendo

como principal objetivo o fomento e armazenamento de dados importantes para o

desenvolvimento das mais variadas atividades recorrentes ao estudo como

armazenamento de dados, análise e manipulação de dados genéticos e a análise da

transcrição e seus reguladores.

1.2 Transcrição

A transcrição faz a passagem de informações contidas na molécula de DNA para

uma fita simples de RNA e no decorrer do processo de transcrição, um sistema enzimático

converte a informação genética de um segmento de DNA em uma fita de RNA

16

mensageiro com uma sequência de bases complementares a uma das fitas do DNA

(NELSON E COX, 2000). A figura 1 mostra como ocorre o processo de trancrição em

procariotos.

FIGURA 1 - ESQUEMA DO PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO

Em (A), o acoplamento da RNA-polimerase na região promotora de transcrição do DNA e o início de

transcrição compondo os primeiros nucleotídeos do mRNA. Em (B), podemos observar que à medida que

a RNA-polimerase desliza sobre o DNA, mais nucleotídeos são adicionados na cadeia ribonucleica,

compondo uma fita simples de mRNA. Em (C), temos a fase de alongamento da cadeia ribonucleica.

FONTE: ADAPTADO DE LEWIN B., GENES VII (2000).

A

C

B

5’ 3’

5’ 3’

BOLHA DE TRANCRIÇÃO - RNA

POLIMERASE

MOVIMENTO DA

POLIMERASE

CADEIA DE RNA CRESCE MAIS

5’ 3’

17

O processo de transcrição é muito similar ao processo de replicação em seu

mecanismo químico fundamental: sua polaridade, e o uso de um molde, possuindo

também semelhanças nas fases de iniciação, alongamento e terminação (NELSON E

COX, 2000). Nas regiões a serem transcritas existem sinalizadores compostos por

sequências reguladoras específicas que indicam o ponto onde deve ser iniciada a

transcrição e onde deve ocorrer a terminação (NELSON E COX, 2000).

Vários tipos de RNAs são gerados no processo de transcrição, como por

exemplo: um RNA mensageiro (mRNA), que codifica a sequência de aminoácidos de um

ou mais polipeptídios especificados por um gene ou conjunto de genes, RNA

transportador (ou de transferência, tRNA), que faz a leitura da informação codificada no

RNA mensageiro e leva os aminoácidos correspondentes a ela até os ribossomos e RNA

ribossomal (rRNA), que são constituintes do ribossomo, sendo estes maquinarias

celulares responsáveis pela síntese das proteínas. Além destes três tipos existem outros

RNAs sintetizados no processo de transcrição através da holoenzima de participação

fundamental denominada RNA-polimerase, presente em procariotos e em eucariotos.

Em eucariotos temos presentes três tipos de RNA-polimerase (NELSON E

COX, 2000). A nova fita de RNA é sintetizada na direção 5’ 3’, antiparalelo à fita

molde de DNA, e os nucleotídeos são adicionados respeitando interações de pareamento

de bases Watson-Crick, havendo uma substituição na ligação das bases nitrogenadas

Timina - Adenina pela Uracila – Adenina, configurando uma molécula de RNA

(NELSON E COX, 2000).

De acordo com Kumar (1981), a RNA-polimerase procariótica pode ser isolada

nas células das seguintes formas:

A) Completa com as cinco subunidades, formando a holoenzima completa;

B) Somente quatro delas, compondo a apoenzima.

As cinco subunidades do complexo enzimático da Holoenzima RNA-polimerase

são representados por β (beta ), β’ (beta linha), α (alfa), σ (sigma). Tendo em

vista que β e β´ compõem o centro catalítico da enzima, participando de todas as fases da

transcrição e duas subunidades α (alfa), estas quatro formando a apoenzima e a última, a

subunidade, ou fator σ (sigma), que quando ligada às demais forma a holoenzima, como

demonstrado na figura 2. Esta subunidade ou fator σ não é fixa na RNA-polimerase e

reconhecendo o sítio de ligações ao DNA, regiões específicas denominadas promotoras

(WÖSTEN, 1998).

18

Subunidades α2ββ´ + Fator σ = Subunidades α2ββ´σ

Essa figura enfatiza as diferenças entre a apoenzima e a holoenzima. A adição do fator σ na apoenzima

determina a composição da holoenzima.

FONTE: O AUTOR, (2014), BASEADO EM KUMAR, (1981).

1.3 Fatores sigma

Os fatores sigma são subunidades da RNA-polimerase capazes de reconhecer

uma determinada região do DNA denominada de região promotora. De modo inerente,

somente a holoenzima completamente formada é capaz de fazer a ligação com a molécula

de DNA e fazer as mudanças conformacionais necessárias para a separação da dupla fita

e iniciação da transcrição (ISHIHAMA, 1990). A holoenzima abre a dupla hélice para a

iniciação do processo de transcrição (DOUCLEFF et al., 2005).

O ciclo de ligação com os fatores sigma auxilia no aprimoramento do

metabolismo celular, nas respostas às mudanças que ocorrem no ambiente onde as células

estão inseridas, além das respostas aos sinais, orquestrando o desenvolvimento da célula

utilizando conjuntos diferentes de genes transcritos (MOONEY, 2005).

Os fatores sigma são subdivididos em duas grandes famílias: a família sigma 70

(σ70), relacionada com a manutenção/sobrevivência da célula (MOONEY, 2005) e

família sigma 54 (σ54) ou proteína RpoN, uma família de fatores sigmas alternativos

(BARRIOS et al., 1999). Eles são denominados em função do peso molecular do primeiro

membro da família identificado (DOUCLEFF et al., 2005; WÖSTEN, 1998).

APOENZIMA

FATOR SIGMA

HOLOENZIMA

FIGURA 2 - REPRESENTAÇÃO DA INTERAÇÃO DO FATOR SIGMA À

APOENZIMA COMPONDO A HOLOENZIMA.

19

A ligação da apoenzima ao fator sigma 70 constitui a holoenzima que tem a

capacidade de inicialização da transcrição por si mesma, pois consegue completar a

formação do complexo aberto (MC CLURE, 1985; GRALLA, 1996). Quando a

apoenzima se liga ao sigma 54, não existe a mesma capacidade de formação do complexo

aberto, e há necessidade de ligação com outros fatores proteicos para a ativação da

transcrição (SASSE-DWIGHT E GRALLA, 1988; MORETT E BUCK, 1989; e

MORETT E SEGOVIA, 1993).

A figura 3 mostra interação da RNA-polimerase com a dupla fita de dna sobre a

região promotora dependente do fator sigma 70.

FIGURA 3 - INTERAÇÃO DA RNA-POLIMERASE COM A DUPLA FITA DE DNA

SOBRE A REGIÃO PROMOTORA DEPENDENTE DO FATOR SIGMA 70.

As subunidades σ são responsáveis pelo reconhecimento do trecho promotor do DNA. A região

-35 (TTGACA) é reconhecida pelo σ4. A região -10 (TATAAT) é reconhecida pelo σ2, podendo

haver a interação da região -10 estendida (TGn) reconhecida pelo σ3. A subunidade β’ é

responsável pela ligação ao DNA. A subunidade β está envolvida na elongação e no início da

cadeia ribonucleotídica. As duas subunidades α estão relacionadas com o início da transcrição e

na interação com proteínas regulatórias que controlam os processos transcritivos.

FONTE: ADAPTADO DE MURAKAMI, 2002.

20

Estudos realizados em Escherichia coli, reportaram a presença de sete fatores

sigma constituintes das duas famílias principais de fatores sigma. A família do sigma 70,

constituída por seis destes fatores, o próprio sigma 70 (σ70) mais os fatores sigma 38

(σ38), sigma 32 (σ32), sigma 28 (σ28), sigma 24 (σ24) e sigma 19 (σ19). O último fator

identificado nos estudos é o fator sigma 54 (σ54) único que compõe a família do sigma

54 (WÖSTEN, 1998) demonstrados no quadro abaixo.

QUADRO 1 - TIPOS DE FATORES SIGMA.

SIGMA SIMBOLOGIA FAMÍLIA FUNÇÃO/RELAÇÃO

1 sigma 70 (σ70) sigma 70 Manutenção Celular






7 sigma 54 (σ54) sigma 54 Fixação de Nitrogênio

Quadro apresentando os tipos de fatores sigma relacionados com a família e função na célula.

FONTE: ADAPTADO DE WÖSTEN, 1998.

Cada uma das famílias de fatores sigma reconhece uma região de ligação ao

DNA especifica, não havendo possibilidade de uma família se ligar à região de ligação

da outra. Outras características que diferenciam as famílias são a isomerização e a

regulação (BARRIOS et al., 1999).

O sítio de ligação da família sigma 70 compreende os hexâmeros posicionados

nas bases -35 e -10 em relação à primeira base de transcrição, diferente do que ocorre

para a família do sigma 54 onde a holoenzima reconhece as bases -24 e -12, também em

relação à primeira base de transcrição (BARRIOS et al., 1999).

Outra diferença é que os promotores da família sigma 70 regulam genes

relacionados à manutenção e organização celular, já os promotores da família sigma 54

estão envolvidos com a regulação de genes bacterianos que promovem a fixação de

21

nitrogênio (BARRIOS et al., 1999). A figura 4 representa as sequências consenso para os

fatores sigma 70 e sigma 54.

Esquema inicial de representação de promotores σ70 e σ54 em procariotos.

FONTE: ADAPTADO DE POTVIN (2007) E BARRIOS (1999).

A região -10 pode ser chamada de Pribnow box, sendo esta região a mais

conservada. Enquanto para a região -35 não há outra denominação. As diferenças

principais entre os dois promotores estão relacionadas com a sequência de bases que as

compõem e a distância onde estas estão dispostas em relação ao +1 (sítio de início de

transcrição). A figura 5 representa os promotores sigma 70 em Escherichia coli com as

proporções de bases conservadas nos hexâmeros que compõem a regiâo -35 e -10.

Entre os hexâmeros poderá haver 16 aos 19 pares de bases, sem consenso descrito. Entre a região -10 e o

sitio de início de transcrição (TSS) pode haver de 5 - 9 pares de bases, sem consenso descrito.

FONTE: ADAPTADO DE LEWIN B., 2000.

TTGACA TATAAT 16 – 19 pb 5 – 9 pb TSS

T80% A95% T45% A60% A50% T96% T82% T84% G78% A65% C54% A45%

-35 -10 +1

SIGMA 70 - Escherichia coli

5’ 3’

FIGURA 4 - REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DAS SEQUÊNCIAS CONSENSO

PARA OS FATORES SIGMA 70 E SIGMA 54.

FIGURA 5 - REPRESENTAÇÃO DE PROMOTORES SIGMA 70 EM Escherichia

coli COM AS PROPORÇÕES DE BASES CONSERVADAS NOS HEXÂMEROS

QUE COMPÕEM A REGIÂO -35 E -10.

22

1.4 Regulação da expressão gênica em procariotos

Naturalmente a célula responde a sinais intra e extracelulares. Estes sinais são

captados e respondidos de acordo com a necessidade de adequação, tendo em vista que

comumente os organismos são expostos de forma repentina as mais diversas formas de

variação do meio em que estas se encontram, como por exemplo a variação de

temperatura, níveis de pH, osmolaridade e a disponibilidade de diversos tipos de

nutrientes (PARKINSON,1993; STOCK, NINFA E STOCK, 1989). Os sinais são

interpretados através de eficientes redes de transdução de sinal. Essas redes são formadas

por proteínas que interagem entre si, produzindo desta forma, respostas adaptativas e

condizentes ao meio que a célula se encontra (STOCK, ROBINSON E GOUDREAU,

2000).

Em resposta aos sinais recebidos, ocorrem mudanças mais intensas,

estabelecendo uma necessária alteração do padrão da expressão gênica, onde será

transcrito um conjunto alternativo de proteínas (STOCK, NINFA e STOCK, 1989). A

transcrição é devidamente reprogramada de acordo com as respostas adaptativas das

células, modificando desta forma as enzimas que serão transcritas e quais enzimas serão

dispensadas para uma eventual reorganização do metabolismo celular, cuja alteração das

atividades de suas enzimas, reorganizam o fluxo metabólico de acordo com o novo meio

em que esta esteja inserida, definindo desta forma, vias metabólicas alternativas (WHITE,

2000).

Evolutivamente, as células desenvolveram alguns sistemas de monitoramento

dos sinais, como por exemplo o sistema regulador de dois componentes. Neste sistema,

um dos componentes funcionará como um sensor, sendo a atuação desta proteína sensora

uma quinase ou fosfatase sinalizando ao outro componente através do processo de

fosforilação ou desfosforilação, enquanto o outro componente atuará como regulador,

promovendo ou reprimindo a transcrição (WEST E STOCK, 2001). Desta forma o

sistema regulador de dois componentes é responsável pela percepção, interpretação e

resposta aos sinais recebidos, proporcionando uma devida adaptação dos organismos às

sucessivas e inesperadas mudanças de ambiente (STOCK, ROBINSON, GOUDREAL,

2000; FOUSSARD et al, 2001; GALPERIN, 2004).

23

1.5 Herbaspirillum seropedicae

Herbaspirillum, palavra derivada do latim herba (herbáceo) e spirillum (pequena

espiral) é um gênero de bactérias pertencentes à subclasse β das proteobactérias, aeróbias

e não fermentadoras de açúcares, Gram-negativas, móveis, vibrióides, algumas vezes

helicoidais, possuindo de um a três flagelos em um ou ambos os pólos e possuem entre

0,6-0,7 µm de diâmetro e seu comprimento pode variar de 1,5 a 5,0 µm (YOUNG, 1992).

Essas bactérias são encontradas em associação com raízes, caules e folhas de

diversas plantas monocotiledôneas, geralmente gramíneas de grande importância

econômica como arroz, sorgo, milho, trigo, cevada e cana-de- açúcar, entre outras plantas

forrageiras e até mesmo em plantas dicotiledôneas como banana e abacaxi (JAMES et al.

1998; RONCCATO-MACARI et al., 2003).

O quadro 2 mostra como é a classificação taxonômica de Herbaspirillum

seropedicae atualmente.

QUADRO 2 - CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Herbaspirillum seropedicae.

DOMÍNIO Bactéria

FILO Proteobactérias

CLASSE Proteobactérias beta

ORDEM Burkholderiales

FAMÍLIA Oxalobacteraceae

GÉNERO Herbaspirillum

ESPÉCIE Herbaspirillum seropedicae

O quadro acima mostra a classificação taxonômica atualizada para o gênero Herbaspirillum.

FONTE: www.ncbi.nlm.nih.gov/ , ACESSADO EM 20/05/2013.

http://es.wikipedia.org/wiki/Dominio_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria

http://es.wikipedia.org/wiki/Filo

http://es.wikipedia.org/wiki/Proteobacteria

http://es.wikipedia.org/wiki/Clase_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Orden_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Burkholderiales

http://es.wikipedia.org/wiki/Familia_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Oxalobacteraceae

http://es.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9nero_(biolog%C3%ADa)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

24

No quadro 3 a seguir, estão destacados alguns exemplares de espécies do gênero

Herbaspirillum.

QUADRO 3 - EXEMPLOS DE ESPÉCIES DO GÊNERO HERBASPIRILLUM.

Herbaspirillum hiltneri Herbaspirillum huttiense

Herbaspirillum frisingense Herbaspirillum lusitanum

Herbaspirillum putei Herbaspirillum chlorophenolicum

Herbaspirillum rubrisubalbicans Herbaspirillum autotrophicum

O quadro acima destaca oito espécies do gênero Herbaspirillum.

FONTE: ADAPTADO DE BALDANI et al, 1986.

A espécie Herbaspirillum seropedicae também foi isolada de outras plantas não-

leguminosas, como por exemplo a palmácea conhecida como dendê, onde foi encontrada

no interior de raízes e caules (DÖBEREINER et al., 1995). A disseminação natural de H.

seropedicae ainda não está bem evidente, podendo esta ocorrer por sementes ou através

da propagação vegetativa, como no caso de A. diazotrophicus em plantas de cana-de-

açúcar. A disseminação por propagação vegetativa foi confirmada pela presença da

Herbaspirillum em plantas de cana-de-açúcar originadas por processos de

micropropagação, nos quais o meristema apical não foi cuidadosamente extraído

(OLIVARES et al., 1996). A evidência de que sua disseminação comumente ocorre

através de sementes, foi comprovada a partir de isolados de sementes de cereais, como

por exemplo o arroz (BALDANI et al., 1997). Podemos afirmar que H. seropedicae não

sobrevive bem no solo natural, como outros endófitos, sendo sua sobrevivência menos

afetada em solo estéril, o que indica que fatores biológicos interferem na sobrevivência

desta bactéria. Todavia, a taxa de sobrevivência de H. seropedicae em ambos os solos foi

mais alta do que a observada para A. diazotrophicus (BALDANI et al., 1997).

25

A outra espécie do gênero Herbaspirillum, H. rubrisubalbicans, foi derivada da

reclassificação de Pseudomonas rubrisubalbicans, considerada um agente fitopatogênico

causador da doença conhecida como estria mosqueada em algumas variedades

susceptíveis de cana-de-açúcar cultivadas no Brasil (PIMENTEL et al.,1991). Esta

espécie foi incluída no gênero Herbaspirillum com base na homologia DNA:rRNA e em

algumas características fisiológicas, como a incorporação do gás 15N2 (BALDANI et al.,

1997).

Estudos de caracterização ecológica dessa nova espécie demonstram claramente

a ocorrência de H. rubrisubalbicans em raízes, caules e folhas de cana-de-açúcar de todas

as partes do mundo, sendo também encontrada em arroz e palmeira (FERREIRA et al.,

1995; BALDANI et al., 1997a; OLIVARES et al., 1996). A capacidade de

Herbaspirillum formar uma associação com gramíneas de interesse econômico como

milho, sorgo e cana-de-açúcar (DÖBEREINER, 1992), sem provocar doença, tem

despertado interesse para o seu estudo.

O mecanismo de colonização dos tecidos vegetais por essas bactérias ainda não

está completamente esclarecido. Análises microscópicas de plantas colonizadas sugerem

que ocorra a ligação à superfície da planta e proliferação das bactérias, seguida de

penetração na planta e ocupação de espaços intercelulares e feixes vasculares com

posterior colonização e estabelecimento nas partes aéreas e vasos do xilema (OLIVARES

et al.,1995, RONCATO-MACCARI et al., 2003). O potencial como biofertilizante de H.

seropedicae torna importante o estudo dos mecanismos celulares deste microrganismo.

1.6 Inteligência Artificial

De acordo com Luger (2004), a Inteligência Artificial (I.A) é um ramo da ciência

da computação que se ocupa com o comportamento inteligente e aprendizagem de

máquinas. Já para Rich (1994), a I.A é o estudo de como fazer os computadores

realizarem coisas que, atualmente, os humanos fazem melhor.

O objetivo principal da I.A se baseia em entender entidades inteligentes e

reproduzir o comportamento inteligente desenvolvendo sistemas para realizar tarefas que

não possuem solução algorítmica satisfatória pela computação convencional (LUGER,

2004).

26

Pensando em algumas características básicas desses sistemas, como a

capacidade de raciocínio, os métodos de I.A visam aplicar regras lógicas a um conjunto

de dados disponíveis para chegar a uma conclusão lógica, bem como a aprendizagem de

máquina visando o aperfeiçoamento baseado em erros e acertos, para que futuramente,

tenham uma ação de maneira mais eficaz (LUGER, 2004). Uma das atividades que

envolvem as técnicas de I.A aborda o reconhecimento de padrões, tanto padrões visuais

e sensoriais, como também padrões de comportamento, tendo como objetivo a inferência

computacional, sendo esta, a capacidade de conseguir aplicar o raciocínio das máquinas

em situações reais do nosso cotidiano através de treinamento e aprendizagem de redes

neurais artificiais (LUGER, 2004).

1.7 Redes neurais artificiais

Para Nievola (1998), as redes neurais consistem em uma abordagem de

inteligência artificial para as soluções de problemas que tem por base o cérebro humano.

Já para Rezende (2003), as redes neurais artificiais são modelos matemáticos que se

parecem com as estruturas neurais biológicas, tendo a capacidade computacional

adquirida através da aprendizagem e generalização.

Com a grande complexidade das redes neurais biológicas, possuindo bilhões de

neurônios, enquanto que as redes neurais artificiais apresentam apenas dezenas a milhares

de unidades de processamento, sendo a velocidade de aprendizagem das redes artificiais

torna-se o grande diferencial.

Os neurônios das redes artificiais, que podem ser chamados de nós ou nodos, são

interconectados imitando o funcionamento do cérebro humano, e dispostos em camadas

estão conectados a um ou mais neurônios. Essas conexões possuem pesos para o

nivelamento da resposta com uma facilidade de adaptação, imitando o funcionamento das

sinapses humanas (HAYKIN, 1999). Assim os neurônios são fundamentais para o

processamento nas redes neurais (HAYKIN, 2001).

A figura 6 é uma representação de um neurônio biológico e uma rede neural

artificial.

27

FIGURA 6 - DESENHO REPRESENTATIVO DE UM NEURÔNIO BIOLÓGICO E

UMA REDE NEURAL ARTIFICIAL.

Em (A), representação das conexões sinápticas entre o axônio de um neurônio com o dendrito de um

neurônio vizinho. O núcleo desta célula está contido no corpo celular do neurônio (Soma). Em (B),

representação de um modelo de rede neural artificial, com os dados de entrada sendo convertidos para pesos

sinápticos, associados à junção aditiva (Soma). Funções dos pesos e ativação determinam a saída dos dados

que irão interagir com o próximo neurônio artificial, como se fosse uma ligação sináptica.

FONTE: ADAPTADO DE FAUSETT (1994) E HAYKIN (2001).

Estruturalmente as redes apresentam uma disposição em paralelo, para que

quando houver uma falha de um ou mais neurônios os demais possam assumir o

processamento utilizando uma rota diferente, minimizando os efeitos da falha para o

resultado do processamento da rede neural. Isso torna o procedimento de tolerante às

falhas. No entanto, o meio de aprendizado utilizado para o reconhecimento do padrão de

conservação dos fatores sigma 70 a partir dos candidatos selecionados pelos algoritmos

foi a rede neural artificial pela sua facilidade de aprendizagem e precisão na resposta

obtida.

28

1.7.1 Estudo do reconhecimento de padrões

O reconhecimento de padrões é um algoritmo incumbido na identificação de

certas estruturas nos dados de entrada em comparação a estruturas conhecidas e sua

posterior classificação dentro de categorias, sendo o grau de associação maior entre

estruturas de mesma categoria e menor entre as categorias de estruturas diferentes.

Desta forma os dados de entrada são medidos por sensores e selecionados DE

acordo com o conteúdo de informações relevantes para a decisão, e passam por um

processo de redução de sua dimensionalidade para que possam ser usados por um

classificador, que o designará à classe que melhor o represente.

Segundo TOU e GONZALES (1981), o estudo do reconhecimento de padrões

pode ser dividido em duas categorias básicas:

1) Estudo de todos organismos vivos, visando estabelecer os modos pelos quais

os mesmos desenvolvem e aprimoram suas capacidades de reconhecimento de padrões;

2) Desenvolvimento e/ou aplicações de teorias e técnicas, visando a construção

de máquinas capazes de apresentar características semelhantes a dos seres humanos em

reconhecimento de padrões.

1.7.2 Conceito de Padrão e classe

De acordo com Tou e Gonzáles (1981), podemos definir conceitos básicos de

padrão e classe da seguinte forma:

A) Padrão: são propriedades que possibilitam o agrupamento de objetos

semelhantes dentro de uma determinada classe ou categoria, de acordo com a

interpretação dos dados de entrada, consentindo desta forma, a extração das

características condescendentes destes objetos;

B) Classe: a classe de um padrão pode ser definida como um conjunto de

atributos comuns aos objetos de estudo.

29

1.7.3 Fases de um sistema para reconhecimento de padrões

Segundo MARQUES, (1999), podemos dividir um sistema para reconhecimento

de padrões em 3 grandes fases. Estas fases são descritas da seguinte forma:

1) Representação dos dados de entrada e sua mensuração: essa etapa refere-se à

representação dos dados de entrada que podem ser mensurados a partir do objeto a ser

estudado. Essa mensuração descreve os padrões característicos do objeto, possibilitando

a sua posterior classificação em uma determinada classe. O vetor que caracteriza

perfeitamente um objeto seria de dimensionalidade infinita, descrito por um vetor: Z =

(z1, z2, z3, z4, zN), onde (z1, z2, z3,...,zN) são suas características.

2) Extração das características: essa etapa consiste na extração de características

intrínsecas e atributos do objeto e consequente redução da dimensionalidade do vetor

padrão. A escolha das características é de fundamental importância para um bom

desempenho do classificador. Esta escolha é feita objetivando os fenômenos que se

pretendem classificar. Exige-se, portanto, um conhecimento específico sobre o problema

em estudo. Nesta etapa, os objetivos básicos são: a redução da dimensionalidade do vetor

característico, sem que isso cause perda de informação inerente a classificação, visando

a redução do esforço computacional e a seleção das características significativas para a

tarefa de classificação.

3) Classificação do objeto em estudo: essa etapa de reconhecimento de padrões

envolve a determinação de procedimentos que permitam a identificação e classificação

do objeto em uma determinada classe de objetos. De modo distinto da segunda etapa, a

concepção do classificador pode ser abrangida abstratamente e independente da natureza

do problema, tendo em vista que os métodos usados em reconhecimento de voz, análise

de imagens, identificação de caracteres, entre outros, são muitas vezes os mesmos,

possibilitando a aplicação dessas técnicas em contextos variados, sem perda de sua

eficiência (MARQUES, 1999).

O Extrator de Características tem como função determinar e extrair as

características mais significativas que contribuam para a descrição do objeto, dentre as

infinitas características que possam descrevê-lo. Outra informação importante é que o

extrator de características sofre uma determinada variação, de acordo com o sistema a ser

analisado.

30

O quadro 4, a seguir, exemplifica várias tarefas de classificação, propostas por

um sistema de reconhecimento de padrões, com seus dados de entrada e respectivos dados

de saída (MARQUES, 1999).

QUADRO 4 - EXEMPLOS DE TAREFAS DE CLASSIFICAÇÃO.

TAREFAS DE

CLASSIFICAÇÃO DADOS DE ENTRADA DADOS DE SAÍDA

Reconhecimento de espécies Conjunto de espécies Identificação da espécie

Diagnósticos Médicos Sintomas Identificação da

Patologia

Previsão do tempo Mapas atmosféricos Chuva, sol, vento, etc...

Reconhecimento de

sequências de DNA

Sequências de DNA

padronizadas

Identificação de

sequências de DNA

Quadro apresentando exemplos de tarefas de classificação e suas respectivas aplicações.

FONTE: ADAPTADO DE MONTEIRO A. A, 2002.

Uma vez extraídas as características é necessário a classificação do objeto. Esta

classificação pressupõe a designação do objeto a uma determinada classe, dentre as várias

que se apresentam. Nesta etapa o classificador “aprende” a distinguir dentre as classes,

aquela à qual o objeto pertence. Os padrões de uma mesma classe tendem a se aglomerar,

compondo os agrupamentos (MARQUES, 1999).

Quando o treinamento do classificador exigir amplo conhecimento da estrutura

estatística dos padrões a serem estudados e o padrão de entrada for apontado como

membro de uma classe pré-definida pelos padrões de treinamento, o classificador será

chamado de Classificador Paramétrico e a classificação se processa de forma

supervisionada. Entretanto, quando o classificador utilizar determinado modelo

estatístico, sofrendo ajustes mediante processos adaptativos e a associação entre padrões

se fizer com base em similaridades dos padrões de treinamento, o classificador será

chamado de Classificador Não Paramétrico e a classificação se processará de forma não

supervisionada (MARQUES, 1999).

A maior dificuldade no desenvolvimento de um projeto de reconhecimento de

padrões está exatamente na escolha da técnica adequada para que as fases do

31

reconhecimento de padrões ocorram de modo a representar satisfatoriamente os

fenômenos do mundo real. Este presente trabalho utiliza o Classificador Paramétrico. A

figura 7 mostra as distintas fases do reconhecimento de padrões.

Ilustração, de forma mais detalhada, das diversas fases do reconhecimento de padrões desde a representação

dos dados de entrada até categorização e padronização dos dados atribuídos para classe de padrão.

FONTE: MONTEIRO A. A, 2002.

1.7.4 As propriedades comuns (“feature matching”)

A principal característica das propriedades comuns (“feature matching”) está

relacionada com o extrator das características do sistema, sendo esta abordagem

responsável pelo bom desempenho do sistema de reconhecimento de padrões. Quando

FIGURA 7 - FASES DO RECONHECIMENTO DE PADRÕES.

32

são determinadas a partir de uma amostra, todas as características de um padrão de classe,

o processo de reconhecimento remetese simplesmente em estabelecer comparações com

os novos objetos submetidos para análise. Porém é extremamente difícil, identificar todas

as características determinantes de uma classe de padrão. A utilização deste conceito

implica frequentemente no desenvolvimento de técnicas que permitam aperfeiçoar e

otimizar a extração das características dos objetos em estudo (TOU E GONZÁLES,

1981).

Tendo em vista propriedades comuns, a caracterização de padrões é efetivada de

acordo com algumas “características principais” pertinentes aos elementos desta classe

(TOU e GONZÁLES, 1981). Os padrões pertencentes a uma mesma classe possuirão

propriedades comuns de discriminação dessa classe. Desta forma, suas características são

extraídas e comparadas com aquelas armazenadas como discriminantes das classes,

ocorrendo sempre que um desconhecido padrão é identificado pelo sistema. O

classificador então, “classificará” este novo padrão em uma das classes existentes ou

então designará o objeto a uma nova classe.

1.7.5 Sistema de reconhecimento de padrões supervisionado

O sistema aprende a reconhecer padrões por meio de esquemas de adaptação

quando estes padrões representativos em cada classe estão disponíveis. Assim um sistema

de reconhecimento de padrões supervisionado consiste na disponibilidade de “padrões de

treinamento” e de um “procedimento de aprendizado” (TOU e GONZÁLES, 1981). A

poderosa ferramenta perceptron, gradiente, erro quadrático mínimo e funções potenciais

são alguns exemplos de algoritmos utilizados no reconhecimento de padrões

supervisionados.

1.7.6 Classificação de padrões baseada em verossimilhança

A classificação por distância de funções é um dos primeiros conceitos em

reconhecimento automático de padrões. Esta técnica uma boa ferramenta para a solução

33

de problemas em que cada padrão de classe apresenta um grau de variabilidade limitado,

como por exemplo a identificação de impressões digitais através da leitura biométrica.

A verossimilhança compõe uma abordagem apropriada para o problema de

classificação. A classificação por verossimilhança estabelece a distância entre um padrão

“y” de classificação desconhecida em relação ao protótipo de cada classe e nomeia o

padrão à classe que se encontra mais próxima (TOU E GONZÁLES, 1981).

1.7.7 Técnica de extração de características

A extração de características se tornou uma aliada importante no

desenvolvimento de aplicações pertinentes a área de Bioinformática, deixando de ser um

simples exemplo ilustrativo (SAEYS, 2007).

Sendo uma técnica utilizada para o aprendizado de máquina, a extração de

características pode ser compreendida como qualquer medição útil extraída no processo

de identificação de um determinado padrão. A extração de características pode ser de

modo simbólico, numérico ou ambos ao mesmo tempo, sendo as variáveis apresentadas

de forma contínua ou discreta (SOUZA, 1999).

Nesta técnica é escolhido um subconjunto das funcionalidades disponíveis para

a aplicação destes a um algoritmo de aprendizagem, sendo que, o melhor conjunto é

sempre aquele que revela uma melhor precisão com uma menor quantidade de dimensões

(SEWELL, 2007).

De acordo com Sewell, (2007), podem ser utilizadas as seguintes abordagens

para extração de características:

A) Forward selection: este processo é iniciado sem nenhuma variável e elas são

adicionadas uma a uma, com o erro minimizado a cada etapa de diminuição do erro.

Quando o erro não é minimizado de forma significativa o processo é interrompido.

B) Backward selection: inicialmente neste processo estão presentes todas as

variáveis, sendo removidas uma a uma para que o erro seja minimizado até ser

estabilizado, ainda que uma remoção não minimize o erro de forma significativa.

34

3 JUSTIFICATIVAS

A identificação e análise dos genes regulados por proteínas ativadoras de transcrição

dependentes do fator sigma 70 permitirá a compreensão da função deste fator na

regulação e na expressão de genes em Herbaspirillum seropedicae SmR1 e possivelmente

em outras proteobactérias.

A abordagem de candidatos a promotores de transcrição utilizando as redes neurais,

busca um padrão mais confiável na predição de promotores de transcrição dependentes

do fator sigma 70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1.

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivos gerais

Identificar e propor um padrão de conservação nas bases reconhecidas pela

holoenzima RNA-polimerase associado ao fator sigma no genoma da proteobactéria

Herbaspirillum seropedicae SmR1.

Desenvolver uma metodologia automatizada baseada em reconhecimento de padrões

através de treinamento de redes neurais artificiais para a identificação de regiões

promotoras de transcrição dependentes do fator sigma 70 em genomas de bactérias.

4.2 Objetivos específicos

Identificar o padrão de conservação de bases reconhecido pela holoenzima formada

em ligação com o fator sigma 70;

Desenvolver um programa computacional para a busca de candidatos às sequências de

regiões promotoras com padrão de conservação do fator sigma 70;

35

Introduzir uma metodologia para tomada de decisão na identificação de regiões

promotoras reguladas pelo fator sigma 70, através de técnicas de reconhecimento de

padrões e classificação por redes neurais artificiais;

Localizar no genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1 as sequências de DNA

válidas dependentes do fator sigma 70, identificando possíveis genes regulados por este

fator;

Propor um consenso relacionados às proporções de bases nitrogenadas que compõem

as regiões promotoras de transcrição dependentes do fator sigma 70 em Herbaspirillum

seropedicae SmR1.

5 MATERIAL E MÉTODOS

Com exceção do software MATLAB® e do MICROSOFT EXCEL, os materiais

utilizados neste trabalho são disponibilizados gratuitamente na Rede Internet. A longo da

descrição dos materiais, será fornecida todas as fontes e endereços eletrônicos onde estes

materiais estão disponibilizados e como estes foram empregados neste presente trabalho.

5.1 Matlab

Para este trabalho foi utilizada uma ferramenta para o desenvolvimento de

cálculos científicos denominada Matlab, cuja palavra, é proveniente da língua inglesa,

significando Matrix Laboratory. Segundo a desenvolvedora do programa, MathWorks, o

MATLAB® é uma linguagem computacional técnica de alto nível e um ambiente

interativo para o desenvolvimento de algoritmos, visualização e análise de dados e

computação numérica (MATHWORKS, 2011). O MATLAB® pode ser utilizado para um

grande leque de aplicações como processamento de sinais e imagens, comunicação,

36

controle de desing, medição e teste, modelamento e análise financeira e computação

biológica (MATHWORKS, 2011).

O MATLAB® conta com diversos tipos de bibliotecas que contém várias funções

desenvolvidas pela Mathworks, como por exemplo, a Toolbox de Bioinformática já

inclusa na versão R2012a. Em complemento a todas estas bibliotecas disponibilizadas

pela desenvolvedora, programadores espalhados pelo mundo fazem o desenvolvimento

de novas funções complementares, como o caso da Toolbox de Bioinformática-UFPR,

para o acréscimo das atividades utilizando o MATLAB®.

5.2 Microsoft Excel

O Microsoft Excel® foi utilizado para a implementação deste trabalho. O mesmo

fora empregado na tabulação em planilhas eletrônicas dos resultados obtidos e criação de

gráficos que representassem as respostas obtidas pela execução do algoritmo.

O Microsoft Excel® faz parte da suíte de aplicativos para escritório chamada

Office desenvolvidos pela Microsoft® e segundo a mesma, o Microsoft Excel® possibilita

a análise, o gerenciamento e o compartilhamento de informações ajudando a tomada de

decisão (MICROSOFT, 2011).

5.3 Rede Neural MLP (Multilayer Perceptron)

A rede neural artificial utilizada neste trabalho é uma rede MLP (Multilayer

Perceptron). O treinamento da rede foi realizado em MATLAB® utilizando comandos

previamente gravados e disponibilizados pelo grupo colaborativo do Laboratório de

Bioinformática - UFPR. A qualidade da rede neural está diretamente relacionada ao

número de possíveis candidatos ao fator de transcrição dependente do sigma 70

adquiridos no banco de dados biológicos RegulonDB.

As redes neurais MLP são redes neurais, cuja a função é mapear os conjuntos de

entradas de dados em conjuntos de saída apropriados. Desta forma as redes MLPs vem

37

apresentando êxito em aplicações nas mais diversas áreas, como no reconhecimento de

padrões e processamento de sinais.

Uma rede do tipo MLP é composta por um conjunto de nós fonte, compondo a

camada de entrada de dados na rede, uma ou mais de uma camada oculta e uma camada

de saída. A camada de entrada é a única não constituída por neurônios e assim não

possuindo capacidade computacional (HAYKIN, 1999).

A rede MLP apresenta característica progressiva, tendo em vista que a saída de

uma camada alimenta exclusivamente a entrada da próxima camada sem a presença de

realimentação, desta forma o sinal se propaga através da rede de forma progressiva

(HAYKIN, 1999). O algoritmo de treinamento de backpropagation, é outra característica

da rede MLP. Este algoritmo é baseado na heurística de aprendizado por correção do erro,

sendo este erro retro propagado através das camadas de saída para as camadas ocultas.

5.4 Artemis

Para a visualização dos resultados obtidos a partir da execução da aplicação

desenvolvida neste trabalho foi utilizado o programa ARTEMIS®, desenvolvido pelo

instituto Sanger. Este software é utilizado para a visualização de sequências de DNA e

como uma ferramenta para a anotação de genomas, podendo apresentar o resultado de

uma única análise ou de um conjunto delas (RUTHERFORD, 2000). O programa pode

ser executado nas mais diversas plataformas computacionais, Microsoft Windows®,

Apple Mac OS® ou Linux® já que é um programa desenvolvido em linguagem JAVA®

possuindo assim um alto grau de portabilidade (RUTHERFORD, 2000). No programa

podem ser utilizados diversos tipos de dados, sendo eles do Genbank® ou EMBL. Além

de ser utilizado localmente pode estar contido em um site na internet através de uma

applet do JAVA® (RUTHERFORD, 2000). O programa ARTEMIS® pode ser

gratuitamente adquirido para diversas plataformas no portal do NCBI ou através deste

endereço eletrônico: http://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/

http://www.sanger.ac.uk/resources/software/artemis/

38

5.5 NCBI - Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia

O Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) disponibilizado

no seguinte endereço eletrônico http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ , é parte da Biblioteca

Nacional dos Estados Unidos de Medicina (NLM), uma filial do National Institutes of

Health. O NCBI está localizado em Bethesda, Maryland, e foi fundada em 1988 por meio

de legislação patrocinada pelo senador Claude Pepper. O NCBI abriga genomas

sequenciados e disponíveis no formato fasta ou GenBank, além de um vasto índice de

artigos de pesquisa biomédica na PubMed Central e PubMed, bem como outras

informações relevantes para a biotecnologia. Todos esses bancos de dados estão

disponíveis on-line através do motor de busca Entrez.

5.6 RegulonDB

RegulonDB - Centro de Ciências Genômicas – UNAM, disponibilizado no

seguinte endereço eletrônico http://regulondb.ccg.unam.mx/ é o banco de dados

biológicos da rede de regulação especializado em um organismo de referência primária

Escherichia coli K-12. A empresa tem expandido seu contexto biológico para que a

regulação da transcrição seja parte de uma unidade que inicia com o sinal e continua com

a transdução de sinal para o núcleo de regulação, modificando a expressão dos genes-alvo

afetados e responsáveis pela resposta (COLLADO-VIDES, MAGASANIK E GRALLA,

1991).

Esse banco de dados biológicos fornece informações com curadoria de

organização e regulação do gene em E. coli. A informação corrente é fornecida sobre o

gene ou operon. Futura expansão irá incluir informações sobre a regulação para além da

iniciação da transcrição. O RegulonDB tem informações sobre as unidades de transcrição

e os detalhes mecânicos de regulação das referidas unidades incluindo: promotores e

fatores sigma, terminadores e regulons. Além disso, os sítios de ligação do ribossomo e

reguladores da transcrição estão incluídos (COLLADO-VIDES, MAGASANIK E

GRALLA, 1991).

Há também informações sobre o produto do gene. Inicialmente é recolhido e

analisado um grande grupo de promotores e sua regulação em E. coli, sendo publicado

39

no início dos anos 90 (COLLADO-VIDES, MAGASANIK E GRALLA, 1991). Alguns

anos mais tarde, uma versão expandida (GRALLA E COLLADO-VIDES, 1996),

converte o conteúdo biológico para a versão electrónica, tal como uma base de dados

relacional no portal RegulonDB, onde foi publicado inicialmente em 1998 (Huerta et al.,

1998). Alguns anos depois, houve o ingresso na equipe EcoCyc com Monica Riley,

Milton Saier e Pedro Karp e a primeira versão de EcoCyc com informações de

regulamentação foi publicada em 2002 (KARP et al., 2002). Tal equipe é a verdadeira

fonte de curadoria especializada em Escherichia coli K-12, alimentando tanto a base de

dados biológicos do RegulonDB quanto o EcoCyc.

5.7 Hardware

Foi utilizado um computador fornecido pela Universidade Federal do Paraná -

Laboratório de Bioinformática.

QUADRO 5 - CONFIGURAÇÕES DE HARDWARE.

MODELO Lenovo ThinkCentre M90P

PROCESSADOR Core i5 650 (3,2Ghz)

DISCO RÍGIDO 320Gb

SISTEMA OPERACIONAL Windows®

Quadro apresentando as configurações de hardware utilizado neste trabalho.

FONTE: O AUTOR, (2014).

A metodologia adotada consiste em um treinamento de rede neural artificial

utilizando dados biológicos de sequências de promotores descritas e disponibilizadas em

banco de dados biológicos especializados e a incorporação dos dados da rede treinada em

um algoritmo especifico, adequado para tarefa de predição computacional de possíveis

candidatos a promotores de transcrição dependentes do fator sigma 70 em Herbaspirillum

e outras proteobactérias.

40

5.8 Algoritmo de busca utilizado

O algoritmo utilizado para a predição de regiões promotoras dependentes do

fator de transcrição sigma 70 recebeu o nome de S70FINDER e o script utilizado, bem

como as funções, são encontradas nos apêndices.

A funções utilizadas na construção deste algoritmo não foram criadas

exclusivamente para os testes realizados, apenas adaptadas para o caso em questão, tendo

em vista que estas funções já existiam anteriormente, armazenadas na biblioteca de

funções em MATLAB® mantidas e disponibilizadas pelo grupo de Bioinformática-

UFPR. O resultado da modelagem deste algoritmo, aliado ao conjunto de dados de

treinamento disponibilizados pela rede neural, deu origem a uma poderosa ferramenta

computacional, utilizada na identificação de regiões promotoras de transcrição

dependentes do fator sigma 70, introduzindo desta forma uma nova metodologia

capacitada na predição computacional de promotores sigma 70 em Herbaspirillum

seropedicae SmR1 e possivelmente em trechos disponíveis de genomas pertencentes a

outras proteobactérias.

A vantagem deste algoritmo em relação a outros é a rapidez no processamento e

a praticidade no retorno das informações, tendo em vista que este algoritmo realiza a

predição de promotores sigma 70 com rapidez em pequenos trechos do DNA, levando

menos de 7 minutos para processar genomas completos, proporcionando uma maior

comodidade ao usuário desta ferramenta.

Para execução deste algoritmo, é necessário fornecer uma sequência genômica

no formato GenBank® (*.gb), disponibilizado gratuitamente através do portal eletrônico

do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), referente à

proteobactéria a ser analisada pelo programa.

Importantes informações como posição no mapa genômico, número de bases,

sentido de leitura de sequência e pontuação dos possíveis candidatos a promotores sigma

70, ficam armazenadas em um arquivo (*.gb), gerado ao final do processo, sendo

considerado como dado de saída de toda a leitura realizada pelo algoritmo. Para

visualização e análise dos dados obtidos, é necessário carregar os arquivos referentes ao

dado de saída e a sequência genômica escolhida no software ARTEMIS®.

41

5.9 Conjunto de dados

Para realização deste trabalho foi de extrema importância à obtenção e seleção

de dados pertinentes a sequências de regiões promotoras de transcrição dependentes do

sigma 70. Os dados coletados referentes a promotores sigma 70, foram salvos como

arquivo de texto, com a extensão (*.txt), pois possui fácil leitura em funções

desenvolvidas especificamente para mineração de dados. Essas funções foram utilizadas

na estruturação do algoritmo incumbido no treinamento e aprendizagem de rede neural

artificial. Para obter um bom treinamento da rede neural foi necessário ter uma quantidade

elevada de dados referente ao problema em questão. Estes dados devem ser confiáveis

para que não sejam induzidos erros ou vícios no treinamento da rede neural artificial.

Atualmente, a quantidade de dados disponibilizados referente a sequências de

regiões promotoras dependentes do fator sigma 70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1

é relativamente inferior à quantidade de dados disponibilizados, referente a sequências de

regiões promotoras dependentes do fator sigma 70 em Escherichia coli. Portanto, para se

obter um bom treinamento de rede neural artificial, foram utilizados somente dados de

regiões promotoras dependentes do fator sigma 70 encontrados e mapeados em genoma

da proteobactérias Escherichia coli K12. O banco de dados com maior número de regiões

promotoras catalogados para esta proteobactérias foi encontrado no site RegulonDB.

5.10 Primeiro treinamento e aprendizagem de rede neural artificial

Inicialmente foram utilizados um total de 4.341 sequências de promotores sigma

70, da família sigma 70, obtidas no portal eletrônico do RegulonDB. Essa quantidade de

dados de promotores, com inferência computacional, sem supervisão humana, gerou um

número elevado de candidatos a promotores sigma 70 considerados falsos positivos.

No primeiro treinamento de rede neural artificial foram utilizadas seis

características, cada característica representa uma base nitrogenada exclusiva de DNA. O

conjunto dessas seis bases representam o hexâmero da região promotora -35 (TTGACA).

Para cada hexâmero da lista de possíveis candidatos a promotores sigma 70, foi gerado

aleatoriamente, através de função especifica, hexâmeros artificiais, representando os

falsos candidatos a promotores sigma 70. Para o conjunto dessas características foram

42

atribuídas duas classes. A primeira classe representa os verdadeiros hexâmeros para as

região -35 e a segunda classe representa os falsos hexâmeros para as região -35.

5.11 Segundo treinamento e aprendizagem de rede neural artificial

Para este segundo treinamento de rede neural artificial, foram utilizadas seis

características, cada característica representa uma base nitrogenada exclusiva de DNA. O

conjunto dessas seis bases representam o hexâmero da região promotora -10 (TATAAT).

Para cada hexâmeros da lista de possíveis candidatos a promotores sigma 70, foi gerado

aleatoriamente, através de função especifica, hexâmeros artificiais, representando os

falsos candidatos a promotores sigma 70. Para o conjunto dessas características foram

atribuídas duas classes. A primeira classe representa os verdadeiros hexâmeros para as

região -10 e a segunda classe representa os falsos hexâmeros para as região -10.

5.12 Terceiro treinamento e aprendizagem de rede neural artificial

Para realizar o terceiro treinamento foram utilizadas 820 sequências de

candidatos a promotores sigma 70 depositadas e submetidas à curadoria do RegulonDB,

baseada em supervisão humana, ou seja, candidatos a promotores sigma 70 analisados e

validados. Para cada um dos 820 possíveis candidatos selecionados foi designado um

falso candidato, derivado do resultado do primeiro e do segundo treinamento da rede

neural artificial, totalizando 820 falsos positivos.

O critério principal adotado para a seleção manual destes falsos candidatos está

relacionado com a distância entre o promotor e o gene, e o número de pares de bases entre

as regiões promotoras -35 e -10. Promotores que apareceram em regiões gênicas foram

considerados como falso positivo, pois não possuem sentido biológico, já que devem estar

dispostos em regiões intergênicas, a montante dos genes que codificam para um produto

final (proteínas ou RNA).

Com esses novos dados inseridos no terceiro treinamento, houve uma

diminuição do número de falsos positivos, aumentando a capacidade de a rede neural

43

artificial de reconhecer um determinado padrão, com forte potencial de identificação de

sequências promotoras dependentes do fator sigma 70. No 3° treinamento foram

atribuídas doze características que representam a combinação dos dois hexâmeros que

compõem a região -35 e -10. Desta forma foram reduzido os casos onde apareceram

elevadas repetições de hexâmeros individualizados ao longo do genoma bacteriano, tendo

em vista que a principal característica de um promotor dependente do fator sigma 70 é

ser representado pelos dois hexâmeros que compõem a região -35 e região -10. Para estas

doze características foram atribuídas novamente duas classes. A primeira classe

representa os verdadeiros hexâmeros das regiões -35 e -10 unidas e a segunda classe

representa os falsos hexâmeros das regiões -35 e -10 unidas.

Foi estabelecido uma linha de corte para as regiões promotoras que apresentaram

pares de bases que não obedeceram ao limite mínimo de 12 pares de bases e o limite

máximo de 20 pares de bases entre as regiões -35 e -10. Desta forma foi obtido o melhor

treinamento da rede neural artificial baseando-se em regiões promotoras completas,

incluindo os pares de bases localizados entre as regiões BOX -35 e BOX -10 dos

promotores de transcrição dependentes do fator σ70. Para os pares de bases entre as

sequências que compõe o BOX -35 e BOX -10 dos promotores sigma 70 não temos um

padrão de conservação descrito ou preestabelecido através dos testes realizados neste

trabalho, podendo ter estas sequências padrão variável.

Para melhor compreensão do trabalho, foi elaborado um fluxograma das etapas

mais relevantes deste projeto desde a obtenção dos dados referentes aos promotores de

transcrição dependentes do fator sigma 70, obtidos no portal eletrônico do RegulonDB,

até os dados referentes à sequência genômica da proteobactéria Herbaspirillum

seropedicae SmR1, obtida no portal eletrônico do NCBI.

A figura 8 mostrada a seguir representa as etapas da construção do algoritimo.

44

FIGURA 8 - ETAPAS DA CONSTRUÇÃO DO ALGORITIMO.

No fluxograma acima podemos observar as etapas da construção da ferramenta computacional utilizada

na predição de regiões promotoras de transcrição em H. seropedicae SmR1 desde a obtenção dos dados

de entrada até a análise dos dados de saída obtidos através do processamento do programa.


6 RESULTADOS

Os resultados obtidos através da rede neural artificial treinada, apontam 4.498

candidatos a promotores de transcrição dependentes do fator sigma 70 em H. seropedicae

SmR1. Destes 4.998 candidatos foram selecionados 288 candidatos entre as regiões

intergênicas dos 100 genes mais expressos em H. seropedicae SmR1, segundo

BARBOZA, (2014). Destes 288 candidatos, separamos uma listagem com 100

promotores com maio valor de pontuação, de acordo com os testes de verossimilhança.

Estes 100 candidatos estão localizados a montante dos 100 genes mais expressos em H.

seropedicae SmR1 e podem ser facilmente visualizados no programa Artemis.

CONJUNTO

DE DADOS

1° TREINAMENTO

DA REDE MLP

BOX -35

2 CLASSES

6 CARACTERÍSTICAS

SELEÇÃO DE

CANDIDATOS

LINHA DE CORTE

DE 12 – 20 pb (Ns)

EXTRAÇÃO DE

CARACTERÍSTICAS

E

PROJEÇÃO

BIDIMENSIONAL

DOS DADOS

3° TREINAMENTO

DA REDE MLP

2 CLASSES

VISUALIZAÇÃO E

ANÁLISE DOS DADOS

2° TREINAMENTO

DA REDE MLP

BOX -10

2 CLASSES

6 CARACTERÍSTICAS

45

6.1 Listagem de candidatos a promotores sigma 70

A tabela 1 a seguir representa um subgrupo retirado da listagem final obtida (em

anexo), contendo dez sequências de candidatos a promotores de transcrição dependentes

do fator sigma 70 identificados pela rede neural e os respectivos genes, mapeados ao

longo do genoma da betaproteobactéria Herbaspirillum seropedicae SmR1.

TABELA 1 - CANDIDATOS A PROMOTORES SIGMA 70 ENCONTRADOS NO

GENOMA DE Herbaspirillum seropedicae SmR1.

Cand. Box -35 Ns Nº

(Ns) Box -10 GC% Pont. Gene Dow. Gene Up.

1 Ttggaa tggcttcttataccgc 16 aagaat 39.29 20,3 Hsero_0068 cdsA

2 Ttgaca gtctagagatgttcctc 17 tatagt 37.93 21,2 tufB ampG

3 Ttgaca gtctagagatgttcctc 17 tatagt 37.93 21,2 secE ampG

4 Atcaat aaggagccgtcatggca 17 aagaag 44.83 17,7 rplJ nusG

5 Atcaat aaggagccgtcatggca 17 aagaag 44.83 17,7 rplL nusG

6 Ttgcca acgaagagcgaatctcc 17 tatcat 44.83 20,9 fusA rpoC

7 Ttgact tccgcgccgcccaccttt 18 tactat 53.33 20,0 Hsero_0326 Hsero_0344

8 Ttgacc gagcagctaagtgcctg 17 tataat 44.83 21,5 rplU Hsero_0361

9 Ttgcat cctccctaacccgccac 17 tagaat 51.72 21,0 nrdB Hsero_0378

10 Tttcgt catcttgtttgtggtggtg 19 tacaat 38.71 19,6 cspC Hsero_0503

A primeira coluna está relacionada ao número do possível candidato a promotor sigma 70 encontrado. A

segunda coluna se refere a região -35 do promotor sigma 70 também chamado de BOX -35. A terceira

coluna, refere-se as bases indeterminadas (Ns) entre as regiões -35 e -10 do promotor. A quarta coluna se

refere a quantidade de pares de bases encontradas em Ns. A quinta coluna se refere a região -10 do promotor

sigma 70 também chamado de BOX -10. A conteúdo GC de cada região promotora completa foi colocada

na sexta coluna. A sétima coluna refere-se a uma pontuação baseado na máxima similaridade. Com essa

pontuação foi possível selecionar apenas um candidato a promotor para um determinado conjunto de

candidatos a promotores preditos para um único gene, tendo em vista que os demais candidatos a

promotores não foram descartados, sendo relacionados em outra listagem de resultados mais detalhada. A

oitava coluna se refere ao gene dowstream localizado logo abaixo do possível candidato a promotor sigma

70, ou seja, o nome do gene no qual o candidato a promotor sigma 70 está relacionado no momento da

transcrição. A nona coluna faz referência ao gene upstream, ou seja, o nome do gene que está acima do

candidato a promotor sigma 70, fazendo parte da vizinhança do gene dowstream.


46

Os dados bioestatísticos foram obtidos através uma amostragem de 100 genes

mais expressos, segundo BARBOSA (2014), e seus possíveis candidatos listados podem

ser observados na tabela 2 abaixo:

TABELA 2 - DADOS ESTATISTICOS DOS CANDIDATOS À PROMOTORES

SIGMA 70 EM GENOMA DE Herbaspirillum seropedicae SmR1.

MÉDIA MEDIANA MODA *D. P MÁXIMO MÍNIMO

% GC 40,6 40,7 44,8 10,1 65,6 21,2

N° (Ns) 17,6 17,0 17,0 1,2 20,0 16,0

PONTUAÇÃO 20,0 20,1 20,1 0,9 21,6 17,7

% GC - Conteúdo GC; N° (Ns) - Número de pares de bases entre o box -35 e box -10; PONTUAÇÃO -

Valor atribuído para cada candidato baseando-se em verossimilhança; (*) - Desvio padrão.

FONTE: O AUTOR, (2014) BASEADO EM ANÁLISE ESTATÍSTICA DE 288

CANDIDATOS.

A porcentagem do conteúdo GC obteve a média de 40,69% apresentando uma

frequência modal de 44,83%. Não foram identificados candidatos à promotor com

conteúdo GC abaixo de 19,35% ou acima de 65,63%. O número médio de pares de bases

esperadas entre os hexâmeros dos box -35 e -10 descritos em Escherichia coli coincidiu

com a frequência do número de pares de bases entre os hexâmeros dos box -35 e -10

preditos computacionalmente em Herbaspirillum seropedicae SmR1. A pontuação

estipulada para os candidatos a promotores sigma 70 indicados pela rede neural artificial

nos testes realizados, foi fundamentada com métodos de verossimilhança. As sequências

com maior similaridade em relação ao consenso proposto para sequências promotoras

sigma 70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1 e as proporções das bases nitrogenadas

visualizadas em cada posição dos hexâmeros, receberam uma pontuação máxima de 21,6.

As sequências que apresentaram baixa similaridade em relação ao consenso proposto para

as sequências promotoras sigma 70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1, receberam

uma pontuação com valor mínimo de 17,7.

47

6.2 Análises dos dados através de modelos baseados em regressão logística

Os candidatos a promotores sigma 70 são apresentados com vetor de

características bidimensional, proporcionando maior facilidade de visualização dos

resultados obtidos.

Ao final do processamento dos dados são plotados gráficos bidimensionais

representando o momento da separação entre bons candidatos considerados pela rede

neural como verdadeiros e candidatos com baixo potencial considerados pela rede neural

artificial como falsos positivos.

Os gráficos gerados para as regiões -35 e -10 serão respectivamente apresentados

nas figuras 9 e 10:


REGIÕES -35 σ70 .

O gráfico gerado ao final do processamento possibilita visualizar em 2 dimensões o momento da separação

entre os bons candidatos (em azul), e os candidatos com baixo potencial (em vermelho) a promotores de

transcrição dependentes do fator sigma 70.

FONTE: O AUTOR (2014), ATRAVÉS DO PROCESSAMENTO DO ALGORITIMO.

Pontuação

Po

ntu

ação

x

y

48


REGIÕES -10 σ70.

O gráfico gerado ao final do processamento possibilita visualizar em 2 dimensões o momento da separação

entre os bons candidatos (em azul), e os candidatos com baixo potencial (em vermelho) a promotores de

transcrição dependentes do fator sigma 70.

FONTE: O AUTOR (2014), ATRAVÉS DO PROCESSAMENTO DO ALGORITIMO.

6.3 Análises de dados através de modelos baseados em verossimilhança

Os candidatos a promotores sigma 70 foram submetidos a análise baseada em

modelos de verossimilhança, com o propósito de obter e atribuir valores de pontuação

para os candidatos a promotores sigma 70 mais próximos do consenso proposto em

Herbaspirillum seropedicae SmR1. Foram selecionados 288 candidatos a promotores

sigma 70, situados a montante dos 100 genes mais expressos segundo BARBOSA (2014),

“Re-anotação do genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1 com dados de

transcriptoma por RNA-Seq”.

A figura 11 mostra o cálculo utilizado para realização de testes de

verossimilhança nos possíveis candidatos a promotores sigma 70 em H. Seropedicae.

Pontuação

Po

ntu

ação

x

y

49

FIGURA 11 - MÉTODO DE VEROSSIMILHANÇA UTILIZADO.

Em A o método mais adequado para calcular a verossimilhança neste caso. Em B a adaptação deste cálculo

para aplicação nos candidatos a promotores sigma 70 neste projeto.

FONTE: APTADO DE N. PROVART E D. GUTTMAN, BIOINFORMATIC

METHODS I - INTRO FOR LAB 4 ∙ SLIDE 20, ACESSADO GRATUITAMENTE EM

22/05/2014, NO SEGUINTE ENDEREÇO ELETRÔNICO https://www.coursera.org/ .

Nesta adaptação, as variáveis P1, P2, P3, P4, P5 e P6 correspondem as

frequências de bases que compõem os hexâmeros das regiões box -35 e box -10 em

Herbaspirillum seropedicae SmR1. VS -35 igual ao produto das frequências de bases

observadas nas seis posições do hexâmero que compões o box -35. VS -10 é igual ao

produto das frequências de bases observadas nas seis posições do hexâmero que

compõem o box -10. VS PS70 é igual a soma da verossimilhança do box -35 e da

verossimilhança do box -10, resultando em um valor utilizado como pontuação para

sequências completas de candidatos a promotores sigma 70.

A comparação entre os valores de pontuação para a região -35 em E. coli e para

a região -35 em Herbaspirillum seropedicae SmR1, revelou em sua maioria, um

agrupamento destes valores, permitindo uma sincronização destes dados como

demonstrado na figura 12 a seguir.

Sendo:

VS -35 = (P1).(P2).(P3).(P4).(P5).(P6)

VS -10 = (P1).(P2).(P3).(P4).(P5).(P6)

VS PS70 = VS -35 + VS -10

B

A

https://www.coursera.org/

50


REGIÃO -35 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1

O eixo y representa os valores de pontuação para cada região -35 (0 – 12). O eixo x representa a quantidade

de candidatos a promotores sigma 70 analisados (1 – 288). Em preto temos as pontuações atribuídas para

regiões do box -10 através de uma matriz baseada em proporções de bases conservadas, descritas em E.

coli. Em verde temos as pontuações atribuídas para regiões do box -10 através de uma matriz baseada em

proporções de bases conservadas observadas em H. seropedicae SmR1.

FONTE: O AUTOR (2014).

Na figura 13 podemos observar a sobreposição dos valores de pontuação para a região -35.

FIGURA 13 - GRÁFICO REPRESENTANDO A SOBREPOSIÇÃO DA PONTUAÇÃO PARA A

REGIÃO -35 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1.

O eixo x e y representam os valores de pontuação para a região -35 nas duas espécies. A reta em diagonal,

representa a aproximação destes candidatos sobrepostos. Nos pontos, temos a sobreposição dos valores de

pontuação atribuídos para região -35 em E. coli e H. seropedicae SmR1.


0

2

4

6

8

10

12

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101111121131141151161171181191201211221231241251261271281

4

5

6

7

8

9

10

11

12

4 5 6 7 8 9 10 11 12

y

x

y

x

51

A figura 14 mostra uma comparação entre os valores de pontuação para a região

-10 em E. coli e a região -10 em Herbaspirillum seropedicae SmR1, revelando em muitos

picos uma proximidade destes valores.


REGIÃO -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1.

O eixo y representa os valores de pontuação para cada região -10 (0 – 12). O eixo x representa a quantidade


regiões do box -10 através de uma matriz baseada em proporções de bases conservadas, descritas em E.

coli. Em verde temos as pontuações atribuídas para regiões do box -10 através de uma matriz baseada em

proporções de bases conservadas observadas em H. seropedicae SmR1.


Em outro gráfico podemos observar a sobreposição dos valores de pontuação para a

região -10, sugerindo um agrupamento destes valores em determinadas regiões do

gráfico.

FIGURA 15 - GRÁFICO REPRESENTANDO A SOBREPOSIÇÃO DA PONTUAÇÃO

PARA AS REGIÕES -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1

O eixo x e y representam os valores de pontuação para a região -10 nas duas espécies. A reta em diagonal,

representa a aproximação destes candidatos sobrepostos. Nos pontos, temos a sobreposição dos valores de

pontuação atribuídos para região -10 em E. coli e H. seropedicae SmR1.


4

5

6

7

8

9

10

11

12

1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 97105113121129137145153161169177185193201209217225233241249257265273281289

4

5

6

7

8

9

10

11

12

4 5 6 7 8 9 10 11 12

y

x

x

y

52

A figura 16 mostra uma comparação entre os valores de pontuação para a região

-35 e -10 em E. coli e para região -35 e -10 em Herbaspirillum seropedicae SmR1,

revelando um agrupamento destes valores.

FIGURA 16 - GRÁFICO COMPARATIVO ENTRE AS PONTUAÇÕES PARA AS

REGIÕES -35 e -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H. seropedicae SmR1.

O eixo y representa os valores de pontuação para cada candidato (0 – 24). O eixo x representa a quantidade


regiões do box -35 e -10 através de uma matriz baseada em proporções de bases conservadas, descritas em

E. coli. Em verde temos as pontuações atribuídas para regiões do box -35 e -10 através de uma matriz

baseada em proporções de bases conservadas observadas em H. seropedicae SmR1.


Em outro gráfico gerado, podemos observar a sobreposição dos valores de

pontuação para as regiões -35 e -10, revelando um agrupamento destes valores em

determinadas regiões do gráfico, significando a proximidade dos valores de pontuação

para as duas espécies.

FIGURA 17 - GRÁFICO REPRESENTANDO A SOBREPOSIÇÃO PARA A

PONTUAÇÃO DA REGIÃO -35 e -10 DE PROMOTORES σ70 EM E. coli E H.

seropedicae SmR1

O eixo x e y representam os valores de pontuação da regiões -35 e -10 em E. coli e H. seropedicae SmR1.

A reta em diagonal, representa a aproximação destes candidatos sobrepostos. Nos pontos, temos a

sobreposição dos valores de pontuação atribuídos para as regiões -35 e -10 nas duas espécies.


x

y

y

x

53

6.4 Consenso Proposto para regiões promotoras sigma 70 em H. seropedicae SmR1

Após obtenção da lista composta por candidatos a promotores de transcrição

dependentes do fator sigma 70 em H. seropedicae SmR1, validados através da análise de

regiões intergênicas de genes com alto nível de expressão, podemos propor uma

sequência consenso para estes candidatos. Para isso, foi utilizada uma função (ambiente

Matlab), desenvolvida pelo grupo de Bioinformática-UFPR, específica para esta tarefa.

Essa função tem como objetivo alinhar de forma consensual as letras que representam as

bases nitrogenadas de várias sequências de DNA, retornando, como resultado final, um

consenso. Neste caso, são sequências que compõem os hexâmeros dos BOX-35 e BOX-

10 retirados de uma amostragem de 100 genes mais expressos em H. seropedicae SmR1

e seus respectivos candidatos a regiões promotoras de transcrição dependentes do fator

sigma 70, obtidos através de treinamento da rede neural artificial, validados e testados no

genoma desta proteobactéria.

A figura 18 mostra uma comparação entre as sequências consenso para a região

do BOX-35 obtidas para H. seropedicae e E. coli.

BOX -35 SIGMA 70

FIGURA 18 - COMPARAÇÃO DAS PROPORÇÕES DE BASES ENTRE O

CONSENSO DA REGIÃO -35 EM E. coli E H. seropedicae SmR1

Nessa figura observamos as diferenças nas proporções de bases dispostas para as seis posições dispostas

no box -35 em candidatos a promotores de transcrição dependentes do fator σ70 em H. seropedicae SmR1

comparados com o consenso e proporções de bases descritas na região -35 de promotores de transcrição

dependentes do fator σ70 em E. coli.


1 2 3 4 5 6

T T G A C A82% 84% 78% 65% 54% 45%

1 2 3 4 5 6

T T G A C A

91% 100% 71% 43% 47% 40%

Herbaspirillum seropedicae SMR1

Escherichia coli

54

A sequência consenso proposta para região -35 em H. seropedicae SmR1

apresentou alta similaridade em relação a sequência consenso para região -35 em E. coli.

Em uma amostragem de 100 candidatos a promotores validados, todos apresentavam

100% da base nitrogenada timina (T) na segunda posição. Isso sugere uma forte

conservação desta base, obtendo pouca variação.

A figura 19 mostra uma comparação entre as sequências consenso para a região

do -10 obtidas para H. seropedicae e E. coli.

BOX -10 SIGMA 70

FIGURA 19 - COMPARAÇÃO DAS PROPORÇOES DE BASES ENTRE O

CONSENSO DA REGIÃO -10 EM E. coli E H.seropedicae SmR1

Nessa figura observamos as diferenças nas proporções de bases dispostas nas seis posições do box -10 em

candidatos a promotores de transcrição σ70 em H. seropedicae SmR1 comparados com o consenso e

proporções de bases descritas na região -10 de promotores de transcrição Sigma 70 em E. coli.


A sequência consenso proposta para região -10 em H. seropedicae SmR1

apresentou alta similaridade em relação a sequência consenso para região -10 em E. coli

conforme demonstrada na figura 19. Em uma amostragem de 100 candidatos a

promotores validados todos apresentaram a base nitrogenada adenina (A) na segunda

posição. A similaridade revelada entre o consenso proposto e o consenso descrito em E.

coli, bem como nas proporções de bases encontradas, reforçam a comprovação destes

candidatos, bem como a validação dos dados obtidos através do algoritimo.

1 2 3 4 5 6

T A T A A T80% 95% 45% 60% 50% 96%

1 2 3 4 5 6

T A T A A T56% 100% 52% 74% 74% 87%

Herbaspirillum seropedicae

Escherichia coli

55

O consenso proposto permitiu a análise das proporções das bases dispostas nos

hexâmeros do box -35 e do hexâmero do box -10. A porcentagem de ocorrência das bases

que compõem os dois hexâmeros proporcionou a construção de uma matriz utilizada nos

testes envolvendo métodos de verossimilhança.

Podemos observar na tabela 3 as proporções das bases dispostas no hexâmero da

região -35 retiradas de uma amostragem de 100 candidatos validados.

TABELA 3 - PROPORÇÕES DAS BASES DO BOX -35 EM H. seropedicae SmR1

BOX -35 BASES NITROGENADAS

T A C G

PO

SIÇ

ÕE

S

1 * 91% 7% 2% 0%

2 *100% 0% 0% 0%

3 16% 5% 8% *71%

4 14% *43% 35% 8%

5 11% 27% *47% 15%

6 24% *40% 18% 18%

(*) Em destaque, as bases nitrogenadas com maior frequência nas seis posições do box -10. Bases

nitrogenadas T = Timina A = Adenina C = Citosina G = Guanina

FONTE: O AUTOR (2014), TENDO COMO BASE UMA AMOSTRAGEM DE 100

CANDIDATOS A PROMOTORES σ70 EM H. seropedicae SmR1 VALIDADOS.

Através de uma função denominada ‘seqlogo’ encontrada na biblioteca de

funções do software Matlab®, plotamos um gráfico representando as proporções das bases

nitrogenadas dispostas na região -35. As bases são empilhadas de acordo com a ordem

crescente das proporções em cada posição. As bases nitrogenadas deste gráfico são

diferenciadas por cores variáveis. Quanto maior for a proporção de uma determinada

base, maior será seu tamanho em relação as demais bases.

56

FIGURA 20 - GRÁFICO DE LOGO GERADO APARTIR DAS PROPORÇÕES DE

BASES DO BOX -35 EM H. seropedicae SmR1.

A figura mostra as maiores proporções medidas em Bits ao longo das seis posições que compõem o

hexâmero da região -35 em candidatos a promotores Sigma 70 em H. seropedicae SmR1. Bases



CANDIDATOS A PROMOTORES DE TRANSCRIÇÃO DEPENDENTES DO FATOR

σ70 EM H. seropedicae SmR1.

Podemos observar na tabela 4 as proporções das bases dispostas no hexâmero da

região -10 retiradas de uma amostragem de 100 candidatos validados.

TABELA 4 - PROPORÇÕES DAS BASES DO BOX -10 EM H. seropedicae SmR1.

BOX -10 BASES NITROGENADAS

T A C G

PO

SIÇ

ÕE

S

1 *56% 31% 13% 0%

2 0% *100% 0% 0%

3 *52% 16% 9% 23%

4 10% *74% 9% 7%

5 9% *74% 6% 11%

6 *87% 0% 4% 9%

(*) Em destaque, as bases nitrogenadas com maior frequência nas seis posições do box -10. Bases

nitrogenadas T = Timina A = Adenina C = Citosina G = Guanina.



57

Novamente, através de uma função denominada ‘seqlogo’ encontrada na

biblioteca de funções do software Matlab®, plotamos um gráfico representando as

proporções das bases nitrogenadas dispostas na região -10. As bases são empilhadas de

acordo com a ordem crescente das proporções em cada posição. As bases nitrogenadas

deste gráfico são diferenciadas por cores variáveis. Quanto maior for a proporção de uma

determinada base, maior será seu tamanho em relação as demais bases. A figura 21 mostra

o gráfico gerado com a função ‘seqlogo’.

FIGURA 21 - GRÁFICO GERADO APARTIR DAS PROPORÇÕES DE BASES DO

BOX -10 EM H. seropedicae SmR1.

A figura mostra as maiores proporções medidas em Bits ao longo das seis posições que compõem o

hexâmero da região -10 em candidatos a promotores Sigma 70 em H. seropedicae SmR1. Bases



CANDIDATOS PROMOTORES DE TRANSCRIÇÃO DEPENDENTES DO FATOR

σ70 EM H. seropedicae SmR1.

Verificamos que o consenso das regiões promotoras de transcrição dependentes

do fator σ70 descritas em E. coli, mostraram-se conservadas em H. seropedicae SmR1.

A figura 22 apresenta uma comparação entre as regiões promotoras σ70 de E. coli

e regiões promotoras σ70 propostas em H. seropedicae SmR1.

58

A figura revela, tendo como base uma amostragem de 100 candidatos a promotores sigma 70 em H.

seropedicae SmR1 validados, as proporções de bases nitrogenadas apresentaram pequenas diferenças. O

número de pares de bases entre os box -35 e -10 tiveram um aumento de apenas 1 par de bases em relação

ao número de pares de bases entre os box -35 e -10 descrito em E. coli. O número de pares de bases entre

o box -10 e o sítio de início de transcrição (TSS), não tiveram alterações. O consenso proposto em H.

seropedicae SmR1 possui alta similaridade em relação ao consenso descrito em E. coli. Bases nitrogenadas:

T = Timina A = Adenina C = Citosina G = Guanina.

FONTE: O AUTOR (2014), BASEADO EM UMA AMOSTRAGEM DE 100


FIGURA 22 - COMPARAÇÃO ENTRE AS REGIÕES PROMOTORAS SIGMA 70

DE Escherichia coli E REGIÕES PROMOTORAS SIGMA 70 PROPOSTAS EM

Herbaspirillum seropedicae SmR1.

-35 -10

-10 -35

TTGACA TATAAT

+1

+1

Sequência consenso promotor σ70

em Escherichia coli

PRIMEIRA BASE

DE TRANSCRIÇÃO

5’ 3’

Proposição para sequência consenso σ70 em

Herbaspirillum seropedicae SmR1

16 – 19 pb TSS 5 – 9 pb

T80% A95% T45% A60% A50% T96% T82% T84% G78% A65% C54% A45%

C54% A45%T96%

T91% T100% G71% C35% C47% A40%

C54% A45%T96%

T56% A100% T52% A74% A74% T87%

TTGACA TATAAT

5’ 3’ 5 – 9 pb TSS 16 – 20 pb

PRIMEIRA BASE

DE TRANSCRIÇÃO

59

7 CONCLUSÕES

O algoritmo utilizado neste trabalho identificou 4.998 candidatos a promotores de

transcrição dependentes do fator sigma 70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1.

O consenso proposto de 288 candidatos a promotores sigma 70 validados através dos

100 genes mais expressos em Herbaspirillum seropedicae SmR1 possui alta similaridade

em relação ao consenso descrito em Escherichia coli, diferenciando apenas nas

proporções de frequência de bases nitrogenadas nas posições dos hexâmeros.

O padrão de conservação das 3 primeiras bases da região -35 permaneceu presente em

grande parte dos candidatos, sendo o trímero TTG considerado o mais conservado da

região -35 do promotor sigma 70 em ambas as espécies analisadas.

O box -10 manteve-se conservado no consenso proposto em relação ao consenso

descrito em E. coli.

A segunda base do hexâmero do box -35 (T2) assim como a segunda base do hexâmero

do box -10 (A2) revelaram ser as mais conservadas nas sequências de promotores sigma

70, em uma amostragem de 100 candidatos.

O número de pares de bases, localizadas entre os box -35 e box -10 em Herbaspirillum

seropedicae SmR1 manteve-se com média igual ao número de pares de bases localizadas

entre os box -35 e box -10 descritos em E. coli.

O método de predição computacional melhora proporcionalmente a adição de dados

de promotores sigma 70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1 confirmados em

laboratório

Os resultados obtidos fornecem dados importantes para trabalhos futuros, visando a

confirmação destes candidatos a promotores de transcrição dependentes do fator sigma

70 em Herbaspirillum seropedicae SmR1, através de técnicas de Biologia Molecular.

60

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64

APÊNDICES

Listagem contendo 288 sequências candidatas a promotores de transcrição

dependentes do fator sigma 70 em H. seropedicae SmR1 segundo dados de transcriptoma

por RNA-Seq em Re-anotação do genoma de Herbaspirillum seropedicae SmR1

(BARBOSA, 2014).

Gene Dow

GC% BOX -35

BOX -10

Ns Nº

(Ns) Pon

Gene Up

Sent.

1 Hsero_0068

50.0 ttggca taaatt gatgctgcgacccgatgg 18 19,7 Hsero_0073

R 36.67 tttcaa tatgct tcaaagacccagaggaaa 18 18,8

38.71 ttttta tatgat tgccttgctgcggctttgt 19 19,1 cdsA

39.29 ttggaa aagaat tggcttcttataccgc 16 20,3

2 tufB 44.83 ttgcct tagaat ggaatgctgatgttgcc 17 21,2

ampG F 37.93 ttgaca tatagt gtctagagatgttcctc 17 21,0

3 secE 44.83 ttgcct tagaat ggaatgctgatgttgcc 17 21,2

ampG F 37.93 ttgaca tatagt gtctagagatgttcctc 17 21,0

4 rplJ 44.83 atcaat aagaag aaggagccgtcatggca 17 17,7 nusG F

5 rplL 44.83 atcaat aagaag aaggagccgtcatggca 17 17,7 nusG F

6 fusA 41.38 atgaag taaaat agcctgggtctgcatct 17 19,6 rpsG

F 44.83 ttgcca tatcat acgaagagcgaatctcc 17 20,9 rpoC

7 Hsero_0326

53.33 ttgact tactat tccgcgccgcccaccttt 18 20,0

Hsero_0344

R 43.33 ttgcct aactgt ggttactgccaatcgaaa 18 18,8

43.75 ttgctt aaaact gcctggttactgccaatcga 20 19,1

53.57 ttgctg aatagg gtgccgacgatgacga 16 18,7

8 rplU

41.94 ttttga tataat ccgagcagctaagtgcctg 19 20,2

Hsero_0361

F

43.33 tttgac tataat cgagcagctaagtgcctg 18 19,9

44.83 ttgacc tataat gagcagctaagtgcctg 17 21,5

58.06 ttgccg aatagt atctcggcgctgttgccgg 19 20,3

34.48 ttgaat aataat tggctatccggaagtga 17 21,1

26.67 tttttt aataat gtccttgatgtacaagga 18 19,6

9 nrdB 57.69 ttgcat cactag cctccctaacccgc 14 18,1 Hsero_

0378 F

51.72 ttgcat tagaat cctccctaacccgccac 17 21,0

10 cspC 38.71 tttcgt tacaat catcttgtttgtggtggtg 19 19,6 Hsero_0503

F

11 rpoD 51.72 ttccaa tacaat tcgggtgccagtgctgc 17 19,8 Hsero_0865

F

12 groES

1

41.38 ttgaaa tatact attccccaacccatccc 17 20,5

nodD R 21.88 ttccac taaatt atattccatatattcagaaa 20 18,8

35.71 ttttgc catatt cttacctcacattcca 16 18,3

65

28.13 ttctgt aatatt catttgagttggagttaatc 20 18,5

13 Hsero_1181

39.29 ttgtac tacaat gtttgtccacacagct 16 20,0 Hsero_1179

F

14 hflB 35.71 ttgtcc cagtat ctcaatgagataaaac 16 19,2

greA F 35.48 ttgtcc tattct ctcaatgagataaaaccag 19 19,1

15 rpsT 41.38 ttgcct ttataa gctcacgcaaatctgg 16 13,2

uup F 53.33 ttgccg aagaag gcaaaggccatttcctgg 18 19,8

16 cspD 30.0 ttgcat aatcgt tctcgatttaatgagtat 18 19,3

ispF F 30.0 ctaaag aatatt cacccgaaaaagtcatta 18 17,3

17 clpS 39.29 ttgaca aagcat gtacctgttgccataa 16 20,3

icd F 25.81 ttgcca taaact taaaagcatctttcaaata 19 20,2

18 clpA 39.29 ttgaca aagcat gtacctgttgccataa 16 20,3

icd F 25.81 ttgcca taaact taaaagcatctttcaaata 19 20,2

19 Hsero_1639

27.59 tttgac tagaat tttatgcacgattaaac 17 19,5 Hsero_1642

R 28.57 ttgact tagaat ttatgcacgattaaac 16 21,3

50.0 ttgcgc cagaat gcacgggattgataac 16 19,9

20 rpmF

25.81 tttgac tattat tggtaaggaaattttctgt 19 19,0 Hsero_1908

F 26.67 ttgact tattat ggtaaggaaattttctgt 18 20,8

40.63 tttacg taaaat gaaacctggatccggtgtgt 20 20,4

21 acpP

41.94 ttggcg taaaag caatcttgccaggaatagt 19 19,3

fabG F 25.0 ttgcca aatttt ggaatagttaaaagta 16 19,7

40.63 ttggcg aaaagt caatcttgccaggaatagtt 20 19,2

41.18 ctgcta acctat aaatgcgcgcacttttgta 19 13,6

22 rpoE

46.88 tttccg aataat cgccgcagatcccattgatc 20 20,5 fabH

F 43.33 ttgtcg aagtat accaggaatccctgaaca 18 19,5

25.0 ttgcca aatttt ggaatagttaaaagta 16 19,7 fabG

41.94 ttggcg taaaag caatcttgccaggaatagt 19 19,3

23 infC 28.13 tttatt aatagc ggattttaaaaggaaactgc 20 17,9 thrS F

24 Hsero_2062

20.69 atcgta aattca ttgaaaatatgcaatta 17 12,3 Hsero_2064

R 34.38 ttgcta aaatat gcctggctatatcgtattga 20 19,5

25 flaG 37.93 ttgaaa taggat taagcctgatagctagg 17 20,2

Hsero_2071

R

35.48 ttgcgt aagact aaaaccctaaactttttcc 19 19,3 Hsero_2072

26 fliC

35.48 ttgcgt aagact aaaaccctaaactttttcc 19 19,3

Hsero_2072

R 28.57 tttacc taaagt acaacagatattttcc 16 19,5

34.38 tttgcg aagact taaaaccctaaactttttcc 20 18,4

28.13 tttctt taaagt taccacaacagatattttcc 20 18,9

27 Hsero_2071

56.67 ttgcgc aaggat gtcatcgaaatcgccccc 18 19,3 lexA

R 33.33 ttgaca aaaaat caaggattgcacctgtat 18 21,1 phoH

50.0 ttgcct aaacat tccgtcggcatcaatcgtcc 20 19,9

28 rpsB 44.83 ttgaac tagaat aaagtgacggggtcgag 17 20,9

66

24.14 tttttg tatctt gcaatgtttgtagaaaa 17 17,9 Hsero_2174

F 41.38 ttttga taaaag aacgcgaatccgttcgc 17 18,7

29 lon

33.33 atccta aaaaat gtagctctatgtctgaga 18 18,3

clpP R 38.71 ttgata tataac aatggcactggcagtgaca 19 19,9

32.26 ttgcct taaatt ttctgcgcaaatttttgac 19 20,1

31.25 tttgcc taaatt tttctgcgcaaatttttgac 20 18,7

30 Hsero_2905

25.81 ttccaa tatttg atttcactgtcagtaaatt 19 17,8 antB R

31 hfq

28.57 ataaaa tattcc ttggtaaagcacttga 16 16,1

Hsero_2949

R 26.67 ttgaag aatagc ctaaaatcgtttaaattg 18 18,8

31.03 ttggcg taaatt ttgaagctaaaatcgtt 17 19,4

31.03 atcaat gaagct gtttttggcgtt 12 13,0

32 ndk

25.81 ttatca tatttt attcttggctttaagcctt 19 18,4 rumT

R 27.59 atcaat tatttt tcttggctttaagcctt 17 17,5

39.29 tttccc catcat tcatgcaacaagacat 16 19,2 rpoS

33 cheW

21.43 ttcaga tatagg agaaataagaaaaata 16 18,6

metC

R 26.67 ttgtaa aagtgt aaaaacgcaagttttctt 18 18,8

44.83 ttttaa tagaat gcccggctgtgtggtca 17 20,1

72.41 ttccgg tatagt cgccggcgcgctgcgcg 17 19,2 Hsero_2991

34 flhC


metC




35 flhD


metC




36 cspD

37.93 ttgact aacaat tttgcatttcgaccgag 17 20,6

Hsero_1400

R 31.25 atcacg tattac taagatctagatgagataga 20 17,2

45.16 ttgcca taagct tgcgtttgttcgaccatca 19 19,1

56.25 ttgccg catgat ttggaagccgactgcacgtg 20 19,8

37 efp

14.29 atgaac tatatt gatataaataattaac 16 19,2

Hsero_3062

F

13.33 atgaac tattat gatataaataattaacta 18 19,3

23.33 ttgcga aactat tgaacgatataaataatt 18 19,4

21.88 attaac aaatat tatattattgcgcacaatct 20 17,9

21.21 ttgcga tatatt tgaacgatataaataattaac 21 20,4

38 Hsero_3196

45.16 ttggcg tattct tgggttaccgtttctaagg 19 18,8 acd F

39 qor 41.38 ttgaca tatatt aacggaacacagctccg 17 20,9

fabG F 45.16 ttgaca tattcg aacggaacacagctccgta 19 18,9

67

46.88 ttccca aatgat gtattgaggaccgcaccaga 20 19,5

40 Hsero_3500

41.38 ttgaca tatatt aacggaacacagctccg 17 20,9

fabG F 45.16 ttgaca tattcg aacggaacacagctccgta 19 18,9

46.88 ttccca aatgat gtattgaggaccgcaccaga 20 19,5

41 ihfB

31.03 ttgatt taatat gacaagggtttttctgc 17 19,6

Hsero_3700

R

57.14 tttcca catcat atccgcgcaaggccgg 16 19,6

48.28 tttccc aagagt tcgaagaagagatgcgc 17 19,3

18.75 tttttt tacagt aagaatatccttatttttca 20 18,3

20.0 ttttaa tacagt gaatatccttatttttca 18 18,9

19.35 ttttta tacagt agaatatccttatttttca 19 18,5

42

Hsero_3696

20.69 atatta taatct ttcattttttgatgtcg 17 16,0 Hsero_3672

F 57.14 ttgccc tatagc tggccatcgactaggg 16 19,3

43 Hsero_3845

40.0 ttgacg tatact ctaagtccttgaaaaggc 18 20,4

ubiF R

48.28 ttccca aaggat tgcgctcgggaagataa 17 19,2

46.67 tttccc aaggat atgcgctcgggaagataa 18 19,1

38.71 tttgac tatact gctaagtccttgaaaaggc 19 18,8

37.5 ttttga tatact cgctaagtccttgaaaaggc 20 19,1

41.38 ttgcaa tatatt cgcacaaagcgctttgc 17 20,6

51.61 ttctcc aatact agcatgatcgaggccgagc 19 18,7

44 rplM

48.28 ttccca aaggat tgcgctcgggaagataa 17 19,2

ubiF R

46.67 tttccc aaggat atgcgctcgggaagataa 18 19,1

40.0 ttgacg tatact ctaagtccttgaaaaggc 18 20,4

38.71 tttgac tatact gctaagtccttgaaaaggc 19 18,8

37.5 ttttga tatact cgctaagtccttgaaaaggc 20 19,1

37.5 ttattg tatatt caacgcacaaagcgctttgc 20 18,3

51.61 ttctcc aatact agcatgatcgaggccgagc 19 18,7

45 Hsero_3857

58.06 ttgcat tacaat gacccgggggcagatggcg 19 20,5 gdhA R

46 yhbH

25.0 tttttt tatact gctttgctaattcgtt 16 18,8 Hsero_3965

F 65.63 ttgcct catgat gcggcccagcccagcgtgac 20 19,9

61.29 ttgccg tacagt caccacggccacgatctgg 19 19,8

47 Hsero_4198

25.0 ttgcat tatact aattttttaaagcgtc 16 20,2 pth

F 46.43 ttgccg cattat atcgagatcagcgaga 16 19,9

Hsero_4186

36.67 ttgagc aaaaat ttgtgaacgggagcaaaa 18 20,2 dgt

16.67 tttcgt tatttt tacattttttctgaaaat 18 18,6

48 Hsero_4295

29.03 ttatgc taaaat cccacaatcgacatttttt 19 18,9 dapF F

40.63 atcaag aataag tttctgcagttgcagccgat 20 18,0

49 atpE

29.03 tttgac tataat ttaccagaaaacgaacctt 19 19,9 Hsero_4370

R 30.0 ttgact tataat taccagaaaacgaacctt 18 21,6

31.25 ttcaga tatttt aaacgtttactccaactgag 20 18,6

68

50 Hsero_4678

41.38 tttacc aattag gcaggttggagtgaaga 17 18,8

Hsero_4685

F

65.52 ttgtca tagact gcgccggccaggctccc 17 19,9

51.61 ataacg tagtat atcgcctggcgtgagcagg 19 18,0

45.16 ttgctg tattct atgccggaatagccatcga 19 18,8

48.39 ttggtg aatagt gaccagttgaacttgcgcc 19 19,1

51 dnaN

28.13 ttcagc aagatt tttatagttaggctgtttat 20 18,5 fdx

F 37.93 ataaca aatcat cacaacgtcaaggatcg 17 18,4

53.57 tttgtc aataag gatggggccgtggtgg 16 18,3 Hsero_4803

52 rpsJ 28.13 tttcgt aatcat gcattaaagacttaggaata 20 19,2

rpsG F 41.38 atgaag taaaat agcctgggtctgcatct 17 19,6

53 rplD 37.93 ttgtgc tataat gcttttgttttacgggc 17 20,5 tufB F

54 rplW 37.93 ttgtgc tataat gcttttgttttacgggc 17 20,5 tufB F

55 rpsC

40.63 ttgacg tatgtg agctgaaagtcaagaccatt 20 18,6

rplB F

46.43 ttgcag aaaagt acctgatccgcggtaa 16 19,6

32.26 ataaga tatgat aggctaagaaataaggtcc 19 18,1

39.29 atcaac aataat ttcaccgaggaggcta 16 19,0 rplD

56 rplE 41.38 ttctgt aagatt aaggagtggtcatggca 17 18,2

rpsQ F 41.38 ttgcgt cataat gctcgatattatgctgc 17 20,4

57 rplR

35.71 ctcaaa aatagg gaaaccaagaagaagt 16 16,9 rpsH

F 46.67 ttatcg aagaag acgaccaatcgaagtcgg 18 18,3 rplE

41.38 ttctgt aagatt aaggagtggtcatggca 17 18,2 rpsQ

41.38 ttgcgt cataat gctcgatattatgctgc 17 20,4

58 infA

33.33 gttcta aaaaat aggattatcgatcatggc 18 15,8 rpsF

F


46.67 ttatcg aagaag acgaccaatcgaagtcgg 18 18,3 rplE



59 rpsM

33.33 gttcta aaaaat aggattatcgatcatggc 18 15,8 rpsF

F


46.67 ttatcg aagaag acgaccaatcgaagtcgg 18 18,3 rplE



60 dksA 46.43 ttggca tacaat tccggaatcgttggtg 16 20,4 thiF F

61 dnaK 29.03 tttcct aaaact ccacatattaaaaccattc 19 19,0

hemH F 59.38 ttgccg taaaat gcccgctcctactggcctgc 20 20,9

62 sucC 56.67 ttgcct aatggt caccgttgcgatgccctg 18 19,4 recA F

63 groEL

1

41.38 ttgaaa tatact attccccaacccatccc 17 20,5

nodD R 35.71 ttttgc catatt cttacctcacattcca 16 18,3

21.88 ttccac taaatt atattccatatattcagaaa 20 18,8

69

42.86 ttgcct tattcc tacctcacattccaca 16 18,2

28.13 ttctgt aatatt catttgagttggagttaatc 20 18,5

56.67 ttgacc aatacg tgagaaccggcgccgaac 18 19,2

60.71 ttggcg tatacg tccgtaccggtgaggg 16 18,7

61.29 ttgccg tatagc gcatcggtaccggtgagcg 19 19,3

61.29 ttgccg tatagg gcatcggtaccgctgaggg 19 19,6

64 Hsero_1104

58.62 ttgcca aagaag aggcggccagtgcgttg 17 20,2 edd F

65 rpmG 27.59 ttgaaa tatact agtctaagttttttccc 17 20,5 radC R

66 fdxA

26.67 tttgtg taaaat ggaaaaatcgaattacct 18 19,0

acb R 25.81 ttattt aagcct acttatacgtaatctgtat 19 16,7

25.0 tttatt aagcct tacttatacgtaatctgtat 20 17,7

27.59 ttgtgg taaaat gaaaaatcgaattacct 17 20,0

67 nuoA 35.71 tttagc aagagt tgattgtgcattgaac 16 18,9

tpiA F 30.0 ttgaac tacaat aagagtaacaaatgaagg 18 20,5

68 fabF1

25.0 ttgcca aatttt ggaatagttaaaagta 16 19,7

fabG F 41.94 ttggcg taaaag caatcttgccaggaatagt 19 19,3

41.18 ctgcta tatcat aaatgcgcgcacttttgtaacc 22 18,6

69 rseA 35.71 ataaca taagat aagcgggatatggaac 16 18,1 rpoE F

70 rplT 28.13 tttatt aatagc ggattttaaaaggaaactgc 20 17,9 thrS F 71 flgG 35.48 ttgccc cagaat tgtatcaatagttgatttc 19 20,4 fliA F

72 rpsF

34.48 ttgctg tatgat ttctatccaaaagcttg 17 19,8

Hsero_2068

F 58.62 ttgacg aataag ccggggtgggcgtcttc 17 20,3

41.38 ttgctt aaaagt tatcgggcagtcttgga 17 19,3

25.0 tttacg aagact caaaaaaatctttttc 16 19,2

73 rpsR

34.48 ttgctg tatgat ttctatccaaaagcttg 17 19,8

Hsero_2068

F 58.62 ttgacg aataag ccggggtgggcgtcttc 17 20,3

41.38 ttgctt aaaagt tatcgggcagtcttgga 17 19,3

25.0 tttacg aagact caaaaaaatctttttc 16 19,2

74 tsf

44.83 ttgaac tagaat aaagtgacggggtcgag 17 20,9

Hsero_2174

F 24.14 tttttg tatctt gcaatgtttgtagaaaa 17 17,9

41.38 ttttga taaaag aacgcgaatccgttcgc 17 18,7

75 Hsero_2186

55.17 ttgtcg aatact ggcgcagccacggcaaa 17 19,7 Hsero_2185 F

35.71 tttaga tattat tggcggtcatttgctg 16 19,8 cdsA

76 Hsero_2187

55.17 ttgtcg aatact ggcgcagccacggcaaa 17 19,7 Hsero_2185 F

35.71 tttaga tattat tggcggtcatttgctg 16 19,8 dxr

70

77 Hsero_2243

50.0 ttgcaa aatacg tgcatgcggtcaacccca 18 19,2 Hsero_2252

R 60.0 ttgcag aatcat cgacagggcgactgccgc 18 20,0

78 clpX

38.71 ttgata tataac aatggcactggcagtgaca 19 19,9

clpP R 31.25 tttgcc taaatt tttctgcgcaaatttttgac 20 18,7

32.26 ttgcct taaatt ttctgcgcaaatttttgac 19 20,1

79 clpP 38.71 ttggac taaaat tatcggcgctttttccgta 19 20,0 creA R

80 tig 38.71 ttggac taaaat tatcggcgctttttccgta 19 20,0 creA R

81 hns

44.83 ttgctc tattgt tagtttgccagctggct 17 19,1

Hsero_2877

R

19.35 ttatca aaaaat tcctgaaagaataaattga 19 19,5

23.33 ataaaa aagaat gtctttttatcatcctga 18 18,7

18.75 tttatc aaaaat atcctgaaagaataaattga 20 19,5

38.71 ttgctt cagaat ttgttattttctgcgcagg 19 19,9

82 Hsero_2904

25.81 ttccaa tatttg atttcactgtcagtaaatt 19 17,8 Hsero_2906

R

83 Hsero_2928

32.14 ttttta tatagg gcaaattggtctgtca 16 18,3

pbpC R

50.0 ttgtcg tatagc aagaacaccgatgcgg 16 18,9

37.93 ttcttg taaaag ctgatgtcgttcagttg 17 17,9

50.0 ttggcg aatcat ccttgtcgagatcggt 16 19,6

46.67 ttgcgc aagaat aaagatttgccgccgatg 18 20,3

84 Hsero_2957

26.67 gtattt tatcat tagcatgaaaccattaga 18 14,5

Hsero_2951

F

27.59 ataatt tagcat cgatgaaccttgtattt 17 17,5

28.13 ttgata tagcat attcgatgaaccttgtattt 20 20,0

25.0 ataaaa aagaat ataaaggcttaaagcc 16 18,7

28.57 ttgcca aaaaat tgagaaaaactccaat 16 21,0

58.06 ttgtcg aagaat gcgcgacggatctcgaccc 19 20,4

85 cheY 42.86 ttcctg aagaat aagatagcctgccatg 16 19,2 dnaJ F

86 Hsero_2984


metC R 26.67 ttgtaa aagtgt aaaaacgcaagttttctt 18 18,8


87 motB


metC R 26.67 ttgtaa aagtgt aaaaacgcaagttttctt 18 18,8


88 glnA 30.0 ttgttt aatggt cttccattagtgcatttt 18 18,4 Hsero_3130

R

89 iscU 56.67 ttgcgg aagaat atggccaggtagggcagg 18 20,3 Hsero_3148

R

90 slyD 43.75 ttggca tataat gccaccaagtttgatgcagg 20 21,1 Hsero_

3274 R

31.03 ttgtgc aattat gatgaataattaccggt 17 19,4

91 spoVK 41.94 ttgctt aataag gagttcatccaacgacgtc 19 19,7 Hsero_3475

R

71

51.61 tttccg cagaat atggacgtccgtaaacggc 19 19,8 Hsero_3479

30.0 ttgcct taaact cacaggaatttaatcaat 18 19,9 Hsero_3481

92 rpsA

18.75 tttttt tacagt aagaatatccttatttttca 20 18,3

Hsero_3700

R 20.0 ttttaa tacagt gaatatccttatttttca 18 18,9

19.35 ttttta tacagt agaatatccttatttttca 19 18,5

41.38 ttgcgt aaagat attacgcttgcatctcg 17 19,3

93 Hsero_3880

44.83 tttatc cataat aatcaacggcgcagcgg 17 19,6

fabG F 50.67 atcaat aatagg caacggcgcagcggcat 17 17,3

48.39 ttatca aatagg atcaacggcgcagcggcat 19 18,1

46.43 ttatca cataat atcaacggcgcagcgg 16 19,6

94 rpoN

25.0 tttttt tatact gctttgctaattcgtt 16 18,8

Hsero_3965

F 65.63 ttgcct catgat gcggcccagcccagcgtgac 20 19,9

61.29 ttgccg tacagt caccacggccacgatctgg 19 19,8

95 petC 21.43 ctattc aaaagt agcttatatataatca 16 16,0 Hsero_

4051 R

46.67 ttgaca aatgtt atgggttgcgctgcgtca 18 19,7

96 Hsero_4196

25.0 ttgcat tatact aattttttaaagcgtc 16 20,2 pth

F 46.43 ttgccg cattat atcgagatcagcgaga 16 19,9 Hsero_4186 36.67 ttgagc aaaaat ttgtgaacgggagcaaaa 18 20,2

97 wecB

34.48 tttcgg tattag cattgtcaaaaatgcac 17 18,4 Hsero_2738 F 28.57 tttttg tattcc gtcaaaattgcaacat 16 16,4

54.84 ttgccg tatcgg gtgagcatgatgaccttgg 19 18,7 cheD

98 atpA

29.03 tttgac tataat ttaccagaaaacgaacctt 19 19,9

Hsero_4370



50.0 ttgttg tatagg atgtcagccaggccag 16 18,6 Hsero_4372

99 atpH


Hsero_4370




100 atpB


Hsero_4370




universidade federal do paranÁ identificaÇÃo e

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