UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DEPARTAMENTO DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC

CNPq

RELATÓRIO TÉCNICO-CIENTÍFICO PERÍODO: 07/2014 a 07 /2015

( ) PARCIAL

(X) FINAL

Título do Projeto de Pesquisa: CONSTRUÇÃO DE UM BANCO DE DADOS DE MOLÉCULAS OBTIDAS DE PRODUTOS NATURAIS DA AMAZÔNIA: CONTRIBUIÇÃO NA BUSCA DE MOLÉCULAS BIOATIVAS PARA DOENÇAS TROPICAIS Nome do Orientador: Fábio Alberto de Molfetta Titulação do Orientador: Doutor Departamento: Faculdade de Química Unidade: Instituto de Ciências Exatas e Naturais Laboratório: Laboratório de Modelagem Molecular (LMM) Título do Plano de Trabalho: Planejamento de inibidores baseado em fragmentos moleculares para a enzima Cruzaína do Trypanosoma cruzi a partir de produtos naturais da Amazônia. Nome do Bolsista: Ana Paula da Silva Fonseca Tipo de bolsa: () PIBIC/ CNPq

() PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador

(X) PIBIC/UFPA

() PIBIC/ INTERIOR

() PIBIC/PARD

() PIBIC/FAPESPA

1. INTRODUÇÃO

Doenças tropicais negligenciadas são causadas por vírus, bactérias e parasitos que

atingem cerca de 1.4 bilhão de pessoas em 149 países [OMS, 2015]. São frequentes na faixa

tropical, nos quais afetam as populações pobres e vulneráveis, além disso, como a circulação

de pessoas se torna mais intensa, o problema das doenças tropicais se mostra cada vez mais

global (ANDRICOPULO et al., 2013). O termo “doenças negligenciadas” referem-se a

doenças como Tuberculose, Malária, Leishmanioses, Doença de Chagas, Doença do Sono,

entre outras, que são causadas por agentes infecciosos e parasitários. O termo

“negligenciadas” deve-se ao fato de que tais enfermidades não são de interesse para as

grandes empresas farmacêuticas na questão de produção de medicamentos e vacinas. Além

disso, como os recursos para pesquisas neste setor são mínimos, os métodos de profilaxia são

escassos em todo o mundo (NJOROGE, et al., 2014).

O Trypanossoma cruzi (T. cruzi) é o agente etiológico da Doença de Chagas, também

conhecida como tripanossomíase americana, foi descrito pelo médico brasileiro sanitarista

Carlos Ribeiro Justiniano das Chagas em 1909 (NEVES, 2005). A doença é transmitida

através de insetos do gênero triatoma, popularmente chamados de “barbeiros”. Outras formas

de transmissão são transfusões de sangue, transplante de órgãos e através das vias congênita e

oral. Outro fator que contribui para a expansão da doença de Chagas são os movimentos

imigratórios, com o movimento de pessoas infectadas para América do Norte, Europa e outros

países (Figura 1) (SCHMUNIS, 2007; COURA E VINÃS, 2010). A doença é endêmica em 21

países da América Latina, inclusive no Brasil, com níveis de casos elevados (cerca de oito

milhões) e taxa de mortalidade de 14.000 por ano (NOGUEIRA et al., 2011).

Figura 1- Rotas de migração a partir da América Latina e estimativa de indivíduos infectados

em países onde a Doença de Chagas não é endêmica.

Fonte: www.fiocruz.com.br

Com uma incidência anual de 28.000 casos na região das Américas, a doença de Chagas

afeta aproximadamente 6 a 8 milhões de pessoas e faz com que, em média, cerca de 12.000

mortes por ano. Embora a mortalidade tem diminuído de forma significativa, a doença pode

causar consequências irreversíveis e crônicas sobre o coração, o sistema digestivo eo sistema

nervoso. Estima-se que 65 milhões de pessoas nas Américas vivem em áreas de exposição e

estão em risco de contrair esta doença. [PAHO, 2014]

O T. cruzi infecta o homem durante a hematofagia (enquanto se alimenta do sangue,

elimina as formas tripomastigotas em suas fezes). As formas infectantes podem penetrar no

corpo através das mucosas, com o ato de coçar, pelo orifício da picada, entre outras formas

(REY, 2001). A Figura 2 mostra o ciclo biológico do T. cruzi que envolve um hospedeiro

vertebrado, humanos e outros mamíferos, e um invertebrado, geralmente os triatomíneos,

podendo ser encontrado nas seguintes formas: amastigotas, epimastigotas e tripomastigota

(TEIXEIRA et al., 2012).

Assim que penetra nas células, a forma tripomastigota perde o flagelo, passando para a

forma amastigota. Nessa forma, ocorre a multiplicação por divisão binária, até que a célula

infectada esteja repleta de amastigotas. Após esse estágio, os amastigotas retornam para a

forma tripomastigotas. Como a célula está com uma concentração muito elevada de

tripomastigotas, a célula se rompe. Desse modo, as formas tripomastigotas invadem a

circulação sanguínea e linfática, afetando principalmente o coração, tubo digestivo e sistema

nervoso. Se os triatomas se alimentarem do sangue de animais e pessoas infectados, podem

ingerir as formas tripomastigotas, tornando-se vetores da Doença de Chagas. As formas

tripomastigotas presentes no triatoma transformam-se em epimastigotas no tubo digestivo,

realizam reprodução por divisão binária, voltam a forma tripomastigota e são liberadas nas

fezes do vetor, reiniciando o ciclo de contágio (RASSI JR et al., 2010; HABERLAND et al., 2013).

Figura 2 - Ciclo de transmissão do T. cruzi (simplificado). Fonte: Venício Ribeiro, ICICT/Fiocruz.

A Doença de Chagas apresenta duas fases: aguda e crônica. A fase aguda, ou inicial,

pode ou não apresentar sintomas. Em geral, se sintomática, os sintomas da fase aguda

desaparecem espontaneamente, evoluindo posteriormente para uma forma aguda mais grave

ou para a fase crônica. Em grande parte dos casos, a doença evolui para a fase crônica

assintomática, permanecendo por tempo indeterminado sem demonstrar quaisquer sinais de

contágio (ANDRADE, 1985). Para o tratamento da doença, somente dois fármacos são

disponibilizados: o Nifurtimox e o Benzonidazol (Figuras 3A e 3B, respectivamente). O

Nifurtimox é proibido em diversos países latino-americanos, inclusive no Brasil. Ambos os

fármacos possuem elevada toxidez e são eficazes somente na fase aguda da doença (COURA,

2002; WIGGERS et al., 2013). Portanto, o estudo e possível desenvolvimento de um novo

fármaco, que apresente baixa toxidez e seja viável na fase crônica são de extrema relevância

no cenário global, para questões sociais, econômicas e científicas (LEITE, 2013).

Figura 3 - Fármacos disponíveis para Doença de Chagas.

O

N H

N NO

2

N

(3A - Nifurtimox) (3B - Benzonidazol)

Dessa forma, o estudo para desenvolvimento de novas alternativas envolve a seleção de

um alvo molecular do parasito. Alguns alvos macromolecures atrativos para possíveis novos

fármacos contra a Doença de Chagas foram identificados, sendo grande parte enzimas

(COURA, CASTRO, 2002; SOEIRO, DE CASTRO, 2008). As proteases são responsáveis

pela quebra de ligações peptídicas, sendo a base fundamental para a formação de polímeros de

aminoácidos (DRAG, SALVESEN, 2008). A enzima Cruzaína (ou Cruzipaína) é a principal

cisteíno-protease do parasito T.cruzi, e está intimamente envolvida com etapas de

desenvolvimento do parasito, ou seja, é um alvo para validar novos fármacos (CUDIC,

FIELDS, 2009). No entanto, outro fator que precisa ser estudado para produção de novos

fármacos é a eficiência em ambas as fases da doença, pois os fármacos disponíveis são

ineficientes na fase crônica da doença (COURA, 2009). Para as pesquisas sobre a Cruzaína,

uma série de ensaios virtuais foi feita baseada no método de docagem molecular. A docagem

molecular reduz o número de moléculas a serem submetidas a testes experimentais, o qual

reduz tempo e aumenta a possibilidade de resultados positivos (PATIL, 2013).

O Banco de Moléculas da Amazônia (BMA) atualmente possui 870 compostos,

proveniente da maior e mais rica biodiversidade do mundo, além de componentes importantes

para a área farmacêutica da região Amazônica (CALDERON et al., 2009). Desse modo, o

Laboratório de Modelagem Molecular (LMM) da Universidade Federal do Pará criou e vem

implementando o número de compostos oriundos de produtos naturais dessa região, para

realizar ensaios virtuais para encontrar compostos que possam ser promissores para produzir

novos fármacos contra doenças negligenciadas. Pois, sabe-se que a construção de bancos de

dados facilita a identificação de substâncias químicas bioativas dirigidas a alvos biológicos de

interesse (FREITAS et al., 2009).

As moléculas presentes no BMA foram extraídas de teses, dissertações e artigos de

pesquisadores da Amazônia que tenham isolado ou sintetizado as respectivas estruturas de

produtos naturais. Desta forma, os melhores resultados foram submetidos à dinâmica

molecular, selecionando estruturas promissoras para auxiliar o desenvolvimento de novos

fármacos para a Doença de Chagas.

Os métodos de Dinâmica Molecular utilizam função de busca determinística e

fundamentos da mecânica molecular clássica para descrever o comportamento dinâmico do

sistema ao longo do tempo; logo, descrevem as posições dos átomos em função do tempo, que

tendem a se ajustar no sistema para diminuir a energia potencial [Namba, 2008]. O objetivo

da mecânica molecular é predizer a energia associada com determinada conformação de uma

molécula além de, pela minimização de energia, corrigir distorções na molécula

tridimensionais como formação desfavorável de comprimentos e ângulos de ligações e

ângulos diedros [VERLI, 2009].

2. OBJETIVOS

2.1- Objetivo geral:

Expandir o Banco de Moléculas da Amazônia com base em pesquisas

bibliográficas em teses, dissertações e artigos da literatura. Objetivo alcançado.

2.2- Objetivos Específicos:

Selecionar compostos oriundos do BMA que sejam seletivos contra a enzima

Cruzaína da Doença de Chagas. Objetivo alcançado.

Selecionar através de docagem molecular, com os programas Autodock Vina

1.1.0, e Dock 6.3, e da análise consensual moléculas seletivas contra o agente etiológico

do T. cruzi. Objetivo alcançado.

Realizar cálculos de Dinâmica Molecular com a estrutura selecionada através do

programa computacional Amber 12. Objetivo alcançado.

Avaliar os resultados das interações dos resíduos da enzima com a molécula

através da Dinâmica Molecular observando os valores de RMSD (Root Mean Square

Deviation). Objetivo alcançado.

3. JUSTIFICATIVA

A utilização de bancos de dados como ferramenta no processo de descoberta de novos

fármacos constitui uma etapa essencial da era moderna da química medicinal (OPREA, 2005).

O banco de dados permite a identificação de características estruturais de crucial importância

(FREITAS et al., 2009), de forma que a expansão do banco de dados facilitará a identificação

de substâncias químicas bioativas dirigidas ao alvo biológico de interesse.

A Doença de Chagas acomete um grande número de pessoas no Brasil, cerca de oito

milhões, e faz parte das seis doenças endêmicas parasitárias reconhecidas como prioridade

pela Organização Mundial de Saúde. Os danos causados são irreversíveis e na maioria dos

casos leva a óbito (COURA, 2005). Para o tratamento da doença, sabe-se que há apenas dois

fármacos disponíveis no mercado: Nifurtimox e Benzonidazol, que são eficazes somente na

fase aguda da doença e causam sérios efeitos colaterais. O uso de métodos de modelagem

molecular com as moléculas do BMA e a realização de ensaios virtuais são de grande

importância para o processo de identificação de novos ligantes para os alvos biológicos

selecionados e para estudo da seletividade das moléculas bioativas, bem como a descrição dos

processos de interação fármaco-receptor (MONTANARI, 2011).

4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Banco de Moléculas da Amazônia (BMA)

Como relatado anteriormente, a biodiversidade amazônica é excessivamente ampla.

Para tanta biodiversidade, uma série de compostos provenientes dessa região podem ser fontes

para novos possíveis fármacos. As moléculas de origem de produtos naturais podem ser

importantes fontes de compostos biologicamente ativos (PAZ-Y-MINÕ et al., 2012).

À vista disso, o BMA possui atualmente cerca de 870 moléculas originadas dessa

região, entre as mais variadas classes. Para o armazenamento dessas moléculas, foi utilizado o

programa Instant JChem 6.1 (ChemAxon, 2013) para a construção do BMA. Desta forma,

através do BMA é possível realizar triagens virtuais de moléculas que possam apresentar

atividade inibitória em doenças negligenciadas, tal como a doença de Chagas. Desta forma,

contribuir com o desenvolvimento de novos fármacos que auxiliem na terapia contra a doença

de Chagas.

4.2- Docagem Molecular

O processo de docagem molecular teve seu início na década de 80, tendo extensa

aplicação na química medicinal e biologia estrutural. Assim sendo, é uma ferramenta

importante no planejamento de fármacos. O método consiste em predizer o modo de ligação

de moléculas pequenas em sítios de ligação de macromoléculas alvo, avaliando os resultados

da docagem (como posição e energia) após a finalização dos cálculos (GUIDO, 2014).

O processo de docagem molecular aperfeiçoa a molécula ligada ao sítio ativo do

receptor e informa as interações entre ligante e receptor (LI et al.,2012). Esse método procura

predizer geometricamente e energeticamente a conformação e orientação do composto com o

sítio de ligação da macromolécula alvo (MUÑOZ et al., 2012; CHEN et al., 2012).

Para esse método, são usados programas computacionais para a identificação do modo

de ligação de moléculas candidatas a fármacos. Neste trabalho, foram usados os programas

Autodock Vina 1.1.0 (TROTT et al., 2010) e o Dock 6.3 (LANG et al., 2009). A docagem

molecular é uma importante ferramenta computacional na triagem in silico para a descoberta

de novos fármacos, pois auxilia a seleção de compostos promissores como ligantes de alvos

terapêuticos de interesse (WINK, 2012; FUKUNISHI, 2011).

Os protocolos de docagem são descritos como a combinação de duas componentes: as

funções de pontuação e de busca. As funções de pontuação são usadas para prever o encaixe,

ou seja, as afinidades de ligação dos ligantes com a proteína. Já as funções de busca geram as

possíveis conformações dos ligantes (RODRIGUES et al., 2012). No entanto, os resultados da

docagem variam de acordo com as características do receptor e do programa escolhido

(FREITAS, 2009).

4.3- Docagem Consensual

Com os resultados dos valores de energia de ligação obtidos nos programas Autodock

Vina 1.1.0 e Dock 6.3 a partir da docagem molecular, a energia em ambos os programas foi

analisada e feito um escalonamento (WIGGERS et al., 2013). Esse processo consiste em coletar e ranquear os dados de cada programa, um por vez,

para extrair a melhor pontuação. A partir dessa etapa, uma combinação dos resultados dos

programas com as diferentes funções de pontuação é realizada, permitindo uma nova

classificação das estruturas submetidas à docagem molecular (PINHEIRO, 2013).

Dessa forma, foi realizado um escalonamento das energias obtidas em cada programa

através da Equação 1:

(1)

onde xesc. é o valor escalonado, x é o valor da pontuação original da estrutura, xmáx e xmín são

os valores máximos de mínimos do conjunto utilizado, respectivamente. Sendo que xmáx

corresponde ao maior valor da energia de afinidade e, portanto, o pior valor de energia

encontrado no conjunto de compostos em determinado programa de docagem, e xmín

corresponde ao menor valor de energia, portanto, corresponde ao melhor valor de energia

encontrado no conjunto de compostos utilizando determinado programa de docagem.

Ao utilizar os valores escalonados ao invés dos valores de energia originais, as

pontuações se distribuem dentro de um intervalo entre 0 e 1 para o conjunto de compostos em

determinado programa de docagem, onde 0 e 1 correspondem aos compostos com pior e

melhor valor de energia de afinidade, respectivamente. A partir da realização deste

escalonamento, o valor das diferentes funções de pontuação de cada programa de docagem

utilizado é o mesmo, permitindo que essas pontuações sejam combinadas através da soma,

obtendo assim um rank final, onde as estruturas que tiverem pontuação mais próxima de 2 (no

caso da utilização de 2 diferentes programas de docagem) serão as melhores pontuadas em

relação a energia de afinidade (PINHEIRO, 2013 ; SATORI, 2012).

Após a realização da análise consensual, no qual as estruturas foram pontuadas em cada

programa, foram analisados também o número de interações, a massa molar e a presença de

grupos genotóxicos. Após essa avaliação, foram selecionadas duas das melhores estruturas

para a Dinâmica Molecular.

4.4- Simulação de Dinâmica Molecular

A Dinâmica Molecular (DM) é fundamentada nos princípios da Mecânica Clássica e

fornece informações sobre o comportamento dinâmico microscópico, dependente do tempo,

dos átomos individuais que compõem o sistema em estudo (HÖLTJE et al., 2003). A

Dinâmica Molecular (DM) é uma das técnicas computacionais mais versáteis no estudo de

complexos enzimáticos, e no planejamento de fármacos contribui exaustivamente em diversos

estágios do processo, já que a DM permite a melhor compreensão da flexibilidade da proteína

e amostras conformacionais (DURRANT et al, 2009).

As simulações de dinâmica molecular constituem-se em uma importante estratégia para a

exploração do espaço conformacional, sendo baseadas nos conceitos físicos de mecânica

molecular. Neste contexto, os átomos de uma molécula interagem com outros átomos de

acordo com as regras do campo de força empregado (SKJÆRVEN, L. et al., 2011). A escolha

do campo de força depende, em grande parte, do sistema a ser estudado e das propriedades

que serão investigadas (Namba, 2008).

O programa Amber é um pacote de programas utilizado para conduzir cálculos de

Mecânica e Dinâmica Molecular de biomoléculas em determinados campos de força, os quais

se diferem pela natureza das equações, assim como detalhes das suas parametrizações (Case,

2005). Dentro do programa Amber existem outros softwares tal como o AmberTools que é uma

ferramenta do Amber. Dentro destes, foi utilizado o chamado Antechamber, que cria arquivos

para as simulações de um complexo dos ligantes selecionados e realiza simulação neste

complexo. O Tleap permite solvatar e neutralizar as moléculas do ligante dentro de uma caixa

de água, o módulo Sander que simula os cálculos de minimização, aquecimento e equilíbrio e

dinâmica e, por fim, o Ptraj onde e extrair as informações necessárias para a criação dos

gráficos de RMSD (Equação 2). (AMBER, 2013).

(2)

onde r i (t) e r i (0) são as coordenadas do i-ésimo átomo no tempo t e 0, respectivamente, e N

é o número de átomos no domínio de interesse (geralmente C α ou átomos da cadeia

principal).

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Através do BMA, foram selecionados 116 compostos com Massa Molar abaixo de 250

Da. Através da Regra de Lipinski e colaboradores (LIPINSKI et al., 1997) para que um

fármaco possa ser ativo através de administração oral este não deve possuir Massa Molar

acima de 500 Da. Desta forma, foi feita uma triagem virtual no qual os compostos

selecionados foram submetidos à docagem molecular com a enzima Cruzaína (código PDB:

3IUT) através dos programas Autodock Vina 1.1.0 (TROTT et al., 2010) e Dock 6.3 (LANG

et al., 2009). Após a realização dos cálculos, foi feita uma análise consensual, baseada nos

resultados das energias obtidas nos diferentes programas. Assim, foram selecionadas 20

estruturas do BMA, sendo ranqueadas por meio de um escalonamento com base nos valores

de energia.

A Tabela 1 mostra as vinte estruturas selecionadas, a estrutura química, a Massa Molar,

os valores de energia obtidos pelos programas Autodock Vina (TROTT et al., 2010) e Dock

(LANG et al., 2009), além dos valores obtidos através do autoescalonamento. Com base nos

compostos da Tabela 1, foi realizado uma analise da toxidez das moléculas por meio do

servidor OChem (SUSHKO, 2012), que informa se uma determinada estrutura apresenta

grupos tóxicos ou não. A análise da toxidez se faz necessária, pois muitos compostos são

excluídos durante o processo de estudo e desenvolvimento de novos fármacos por

apresentarem efeitos indesejados e/ou toxidez (DINGERMANN et al., 2004). Destarte, os

compostos 682 e 842 foram excluídos do processo por apresentarem grupos tóxicos.

Em seguida, foram avaliadas as interações de hidrogênio na enzima Cruzaína através do

programa LigPlus+ (PETTERSEN et al., 2004). Os compostos que apresentaram interações

de hidrogênio no Autodock Vina 1.1.0 (TROTT et al., 2010) ou no Dock 6.3 (LANG et al., 2009) com a enzima Cruzaína foram 10, 451, 455, 180, 450, 329, 140, 71, 60, 855, 719, 37 e

139. Os demais compostos foram excluídos por não apresentarem interações de hidrogênio

com resíduos da Cruzaína. Posteriormente, realizou-se a docagem dos 13 compostos usando

os programas AutoDock 1.1.0 e Dock 6.3 na Catepsina L (código PDB: 1MHW), que é a

enzima homóloga humana. Esta docagem se faz necessária para verificar a seletividade dos

compostos, e se estes apresentam interações de hidrogênio na enzima Catepsina L. Desta

forma, verificou-se que apenas cinco compostos não apresentaram atividade contra a enzima

Catepsina L em ambos os programas. A Tabela 2 indica os compostos selecionados, as

respectivas estruturas, os valores de energia e as interações de hidrogênio obtidos nos

diferentes programas.

Tabela 1 - Análise consensual das 20 melhores estruturas

Massa Energia Energia

Compostos Estrutura Molar Dock Vina

(Daltons) (kJ/mol) (kJ/mol)

682 198,30 -24,976 -5,0 1,6396

10 212,24 -25,94 -4,8 1,6165

842 192,17 -27,14 -4,5 1,5656

451 208,21 -29,759 -4,1 1,5652

73 202,34 -23,595 -4,7 1,4176

455 208,25 -28,550 -3,9 1,3981

180 162,19 -24,890 -4,4 1,3730

450 192,21 -26,813 -4,1 1,3700

62 204,26 -21,870 -4,8 1,3460

329 154,12 -25,045 -4,2 1,2963

140 198,17 -26,898 -3,9 1,2887

71 192, 21 -25,002 -4,1 1,2500

101 204,35 -22,342 -4,5 1,2477

60 208,25 -25,415 -4,0 1,2339

855 194,27 -25,24 -4,0 1,2223

719 154,12 -23,653 -4,2 1,2041

69 200,32 -20,345 -4,7 1,2023

83 204,35 -21,291 -4,5 1,1780

37 194,18 -23,729 -4,1 1,1657

139 170,12 -26,318 -3,7 1,1633

Tabela 2 - Compostos com melhores resultados

Energia Energia Interação Interação

Compostos Estrutura Dock Vina Dock Vina

(kJ/mol) (kJ/mol) (3IUT) (3IUT)

Gln19,

10 -25,94 -4,8 Gly20 His162,

Asp161

Asp161,

60

-25,415 -4,0 Cys25,

-

His162,

Ser24

71 -25,002 -4,1 - Trp26

450 -26,813 -4,1 Met68 -

Asp161,

451 -29,759 -4,1 His162, Asn69

Met68

A inspeção visual dos complexos preditos pela docagem molecular foi feita levando-se

em conta o número de ligações de hidrogênio, os resíduos com os quais as moléculas

interagiram e a complementaridade com o sítio. Analisando os valores de energia e as

interações de hidrogênio ligante-receptor, duas estruturas obtiveram os melhores resultados:

os compostos 10 e 60. O composto 10 apresenta ligação de hidrogênio com a Gly19, Asp161

e His162. Já o composto 60 faz ligação de hidrogênio com o resíduo Ser24, Cys25, Asp161 e

His162. Destaca-se que esses resíduos participam do mecanismo catalítico da enzima

proposto por Powers e colaboradores (POWERS, et al., 2002) e Leung e colaboradores

(LEUNG, et al., 2000), os quais desempenham um papel primordial para a atividade da

enzima e, do mesmo modo, devem estar estritamente relacionados com o processo de inibição

deste alvo biológico.

Outro dado importante está no fato de que os compostos 10 e 60 apresentam atividade

contra outros alvos, sendo que o composto 10 está presente em óleos essenciais e apresenta

atividade antibactericida (NAJJAA et al., 2007), enquanto o composto 60 apresenta uma

classe de compostos com atividades contra a Malária (LEE et al., 2003). Esses dois

compostos foram selecionados para a etapa de dinâmica molecular, pois se mostraram

promissores para o tratamento da Doença de Chagas tendo como alvo a enzima Cruzaína.

Assim, o sistema (ligante mais a enzima) foi submetido à dinâmica molecular no

programa Amber 12 durante 34 ns para o ligante 60 e 30 ns para o ligante 10. Com a

ferramenta Ptraj do programa Amber 12, foi possível extrair as informações necessárias para a

criação dos gráficos de RMSD (Raiz dos Desvios Médios Quadráticos) contra o numero de

Frames/segundo.

O valor de RMSD representa o desvio padrão entre a posição inicial e final dos átomos

nas duas conformações, expressa o valor de medida para todas as distâncias e ângulos de

ligação na proteína de estudo em unidades de comprimento. Esta medida é muito usada

também para avaliar se a estrutura de uma macromolécula gerada por uma dinâmica

molecular está já em equilíbrio ou não, além da flexibilidade ou rigidez do complexo (ligante-

receptor) da enzima. Deve-se considerar um valor em torno de RMSD em torno de 3Å quando

todos os átomos do sistema são empregados na medida [Verli, 2006].

Na Figura 4 observam-se os valores de RMSD para o ligante 10 obtidos e verifica-se

que em torno de 20ns de dinâmica observa-se uma tendência do sistema entrar em equilibro,

apesar das pequenas flutuações apresentadas no gráfico nota-se que os desvios são menores

que 2 Å para o complexo estudado, o que prova a estabilidade do ligante estudado.

Figura 4 - Valores de RMSD calculados para o composto 10 em função do número de

Frames/segundo.

Na Figura 5 observam-se os valores de RMSD para o ligante 60, no qual se pode notar

que em torno de 20ns a estabilização do ligante em torno de 1,4 Å. Assim, o comportamento

do gráfico pode ser explicado como uma relaxação da estrutura cristalográfica do sistema

(enzima-ligante) no qual a formação de cristal leva a uma restrição de movimentos dos

átomos da mesma. Deste modo, é possível prosseguir para as próximas etapas do processo de

dinâmica, tal como o cálculo de energia livre.

Figura 5 - Valores de RMSD calculados para o composto 60 em função do número de

Frames/segundo.

6. CONCLUSÃO

A partir do BMA, foram selecionados compostos contra a enzima Cruzaína do T. Cruzi,

que é a principal cisteíno-protease do parasito. Para realização dos estudos, foi utilizado o

método de docagem molecular, o qual consiste em predizer o modo de ligação e a energia de

pequenas moléculas em sítios de ligação de macromoléculas alvo.

Através dos resultados da docagem molecular, obtidos pelos programas computacionais

Autodock Vina e Dock, e a partir da análise consensual dos valores de energia da docagem,

foram selecionados 20 compostos. Depois, foi analisada a toxidez dos compostos por meio do

servidor OChem, e a partir desta análise, foram eliminados dois compostos, pois apresentaram

grupos tóxicos.

Com os compostos restantes, foram avaliados as ligações de hidrogênio nas enzimas

Cruzaína e Catepsina L (enzima homóloga humana). Os compostos que apresentaram

interações com a Catepsina L foram eliminados do processo, pois se busca seletividade nas

moléculas obtidas. Assim, apenas os compostos que não apresentam interações de hidrogênio

com a Catepsina L foram escolhidos. Desta forma, apenas cinco compostos apresentaram tais

resultados, sendo que os melhores resultados foram os compostos 10 e 60, pois fazem

importantes ligações de hidrogênio com principais resíduos da enzima Cruzaína do T. cruzi, e,

portanto, foram utilizados para a etapa de dinâmica molecular.

Os resultados de dinâmica molecular obtidos pelos valores de RMSD se mostraram

satisfatórios por apresentarem valores menores que 2 Å, o que mostrou que os ligantes se

mostraram estáveis. Deste modo, o projeto cumpre a proposta por novos inibidores oriundos

do BMA contra a Doença de Chagas.

7. REFERÊNCIAS

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DIFICULDADES

A aluna iniciou seu trabalho em Março de 2015 e teve pouco tempo para se

familiarizar com as técnicas de quiminformática.

PARECER DO ORIENTADOR

A aluna realizou as atividades previstas no plano de trabalho, que era a realização dos

cálculos de Dinâmica Molecular.

Além disso, apesar do pouco tempo, a aluna se familiarizou com o sistema operacional

Linux. Assim, a busca por novos ligantes para o alvo selecionado está em andamento. Desta

forma, sugiro que a bolsa seja renovada.

DATA : 10/08/2015

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ASSINATURA DO ORIENTADOR

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ASSINATURA DO ALUNO