UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

CENTRO DE CIENCIAS AGRRIAS

PROGRAMA DE PS GRADUAO EM CINCIA E TECNOLOGIA DE

ALIMENTOS

ALESSANDRA CASAGRANDE RIBEIRO

EFEITO DA ADIO DE LEO ESSENCIAL DE PIMENTA ROSA (Schinus

terebinthifolius Raddi) MICROENCAPSULADO EM QUEIJO MINAS FRESCAL

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo, como parte das exigncias para obteno do Ttulo de Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos.

Orientadora: DSc. Mirela Guedes Bosi Co-orientadora: DSc. Patrcia Campos Bernardes

Co-orientadora: DSc. Pollyanna Ibrahim Silva

ALEGRE- ES

2015

i

Ao meu filho Felipe,

meu maior incentivador,

amor incondicional.

ii

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a DEUS por nunca me abandonar,

Aos meus pais por sempre me apoiarem,

Ao meu filho Felipe pelo amor e carinho,

Aos meus irmos e tios por estarem sempre torcendo por mim,

Aos meus avs por me inspirarem,

Aos meus amigos da UFES por encherem esses dias de alegria, companheirismo

e aprendizado, especialmente: Ariane, Carla, Carmelita, Gisela, Marcela, Paula e

Sabrina,

Joyce e ao Andr por fazerem parte deste trabalho,

CAPES pela to esperada Bolsa,

UFES e ao PCTA pela oportunidade de um curso de ps-graduao,

AGROROSA, pela gentil doao da pimenta rosa,

minha orientadora Mirela por toda dedicao, carinho, ensinamentos e

pacincia,

s minhas co-orientadoras: Patrcia e Pollyana por estarem sempre presentes

colaborando, incentivando e acrescentando este projeto,

Ao professor Srgio por toda ateno dedicada,

Aos professores Adilson, Christiano, Ren e Sukarno pela contribuio neste

trabalho,

Ao Toninho pelo apoio,

Aos tcnicos: Amanda, Eduardo, Letcia e Mariza por estarem sempre disponveis

a nos atender,

Edivnia pelo carinho especial,

E tantos outros que tornaram este momento possvel.

iii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Formulaes utilizadas para microencapsulao. _______________ 25

Tabela 2: Dados mdios de extrao de leo essencial de pimenta rosa. _____ 36

Tabela 3: Composio do leo essencial de pimenta rosa ________________ 37

Tabela 4: Valores mdios e respectivos desvio padro da atividade antioxidante

do leo essencial de pimenta rosa. __________________________________ 38

Tabela 5: Valores mdios e desvio padro () do halo de inibio (cm) do leo

essencial de pimenta rosa e antibiticos para o microrganismo S. aureus. ____ 40

Tabela 6: Caracterizao fsico-qumica das 3 formulaes de microcpsulas de

leo essencial de Pimenta Rosa ____________________________________ 42

Tabela 7: Dimetro mdio (m) das partculas das 3 formulaes de

microcpsulas de leo essencial de pimenta rosa _______________________ 43

Tabela 8: Parmetros de cor das trs formulaes de microcpsulas ________ 50

Tabela 9: Soma de ordens para as formulaes A, B, C e D de queijo Minas

Frescal adicionado 0,005; 0,010; 0,015 e 0,020%, de leo essencial de pimenta

rosa respectivamente e a diferena entre elas. _________________________ 52

Tabela 10: Mdias e desvios padro de acidez titulvel e pH do leite utilizado nos

trs processamentos do experimento. ________________________________ 53

Tabela 11: Mdia e desvio padro acidez titulvel e pH dos queijos produzidos

nos trs processamentos do experimento _____________________________ 53

Tabela 12: Mdias e desvios padro da composio centesimal do leite utilizado

no experimento. _________________________________________________ 54

Tabela 13: Composio centesimal dos queijos produzidos: mdias e desvios

padro dos 3 processamentos ______________________________________ 55

Tabela 14: Parmetros do perfil de textura instrumental dos queijos controle (CO)

e queijo adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado (OEPR)

______________________________________________________________ 56

Tabela 15: Parmetros de cor na formulao de queijo controle (CO) e queijo

adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado (OEPR) ____ 58

Tabela 16: Mdias das contagens de coliformes; Escherichia coli; fungos e

leveduras nos queijos _____________________________________________ 59

Tabela 17: Log da contagem de S.aureus dos queijos CO e OEPR em cada

tempo. ________________________________________________________ 60

Tabela 18: Mdias e seus respectivos desvios padro das notas dos julgadores

no teste sensorial de aceitao _____________________________________ 62

Tabela 19: Mdias e seus respectivos desvios padro da inteno de compra dos

julgadores. _____________________________________________________ 65

iv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Pimenta rosa (Fonte FAES e SENAR, 2009) ____________________ 9

Figura 2: Esquema bsico microencapsulao spray dryer (adaptao ASCHERI,

1997). _________________________________________________________ 13

Figura 3: Representao esquemtica das atividades realizadas no experimento.

______________________________________________________________ 18

Figura 4: Ficha para o teste de ordenao-preferncia (adaptao Minim, 2010) 34

Figura 5: Modelo de Ficha de avaliao utilizada no teste de aceitao sensorial

(adaptao de Minim, 2010) ________________________________________ 35

Figura 6: Crescimento de S. aureus diferentes concentraes (50%, 25%, 12,5%,

6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39% e 0%) de leo essencial de pimenta rosa

aps 11 horas de incubao. _______________________________________ 41

Figura 7: Imagens de microscopia eletrnica de varredura (MEV) da formulao

01 (Fo1), aumento 1000, 2000, 8000 e 20000 vezes. ____________________ 44

Figura 8: Espectro de Energia Dispersiva (EDS) obtido da formulao 01 ____ 45

Figura 9: Imagens de microscopia eletrnica de varredura (MEV) da formulao

02 (aumento 1000, 2000 e 8000 vezes). ______________________________ 46

Figura 10: Espectro de energia dispersiva (EDS) obtido da formulao 02. ___ 46

Figura 11: Imagens de microscopia eletrnica de varredura (MEV) da formulao

03 (aumento 1000, 2000 e 8000 vezes). ______________________________ 47

Figura 12: Espectro de energia dispersiva (EDS) obtido da formulao 03 ____ 48

Figura 13: Difratograma das Formulaes 01 (Fo1), 02 (Fo2) e 03 (Fo3). _____ 49

Figura 14: Contagem de S.aureus no queijo Minas Frescal CO e OEPR (Log

UFC.g-1 de queijo). _______________________________________________ 60

Figura 15: Distribuio de frequncias para o atributo aparncia ___________ 63

Figura 16: Distribuio de frequncias para o atributo sabor. ______________ 63

Figura 17: Distribuio de frequncias para o atributo textura ______________ 64

Figura 18: Distribuio de frequncias para o atributo impresso global ______ 64

v

RESUMO

Ribeiro, Alessandra Casagrande. : Efeito da adio de leo essencial de pimenta

rosa (Schinus terebinthifolius Raddi) microencapsulado em queijo Minas Frescal.

(Dissertao Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Universidade

Federal do Esprito Santo, Alegre - ES. Orientadora: DSc. Mirela Guedes Bosi.

Co-orientadoras: DSc. Patrcia Campos Bernardes e DSc. Pollyanna Ibrahim

Silva.

A pimenta rosa o fruto da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi), uma planta

nativa do Brasil. A extrao e caracterizao do seu leo essencial viabiliza a sua

utilizao industrial. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da adio de

leo essencial de pimenta rosa em queijo Minas Frescal . Foram identificados

95,36% dos constituintes do leo essencial, sendo o -careno-3 o compontente

majoritrio. O leo essencial de pimenta rosa apresentou caractersticas

antioxidante (2,53 0,28 mols de trolox por mL de leo) e antimicrobiana para o

desenvolvimento de Staphylococcus aureus. Foi observado, no teste de difuso

em gar, a formao do halo de inibio de 1,35 0,32 cm, e na anlise de

concentrao inibitria mnima, o valor de 3,13%. O leo essencial sensvel

degradao no meio em que se encontra, portanto necessita de processos

tecnolgicos para assegurar sua ao. Para proteger o leo essencial foi

realizada a microencapsulao por meio da secagem por spray dryer. O leo foi

microencapsulado utilizando trs formulaes com diferentes concentraes de

goma arbica, maltodextrina e amido modificado como papel de parede. As

microcpsulas obtidas foram analisadas quanto s suas caractersticas fsico-

qumicas e morfolgicas e foi selecionada uma formulao para posterior adio

ao queijo Minas Frescal. A formulao com 5% de amido modificado, 10% de

maltodextrina e 5% de goma arbica foi selecionada. Para definio da

concentrao de leo essencial que foi utilzada no queijo, foi realizado teste

sensorial de ordenao-preferncia, visto que a concentrao inibitria mnima

(3,13%) era muito alta para ser utilizada nos queijos. A formulao com 0,01% de

leo essencial foi a preferida e utilizada para fabricao dos queijos. Foram

elaborados e caracterizados os queijos controle (CO) e o queijo com adio das

microcpsulas de leo essencial de pimenta rosa (OEPR). Em relao s

vi

caractersticas fsico-qumicas, os queijos CO e OEPR s apresentaram diferena

significativa em relao umidade (P= 0,0021; =0,05). O queijo OEPR teve boa

aceitao sensorial com mdia de aceitao global de 7,6 0,97, no

apresentando diferena significativa, ao nvel de 95% de confiana, do queijo

controle (7,6 1,18). Para avaliar a capacidade do leo essencial de pimenta rosa

microencapsulado em inibir o desenvolvimento de S. aureus, foram inoculadas

nos queijos CO e OEPR concentraes iniciais de 106 UFG.g. Os queijos foram

armazenados em BOD temperatura de 4 1 C at realizao das anlises, que

ocorreram nos tempos: 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 30 dias. Houve reduo de 1,53 ciclos

Log no queijo adicionado de leo essencial de pimenta rosa. De acordo com os

resultados obtidos, conclui-se que o leo essencial de pimenta rosa uma

alternativa vivel de utilizao em queijo Minas Frescal , devido ao seu potencial

antioxidante, antimicrobiano e sua aceitao sensorial.

Palavras chaves: Staphylococcus aureus, microencapsulao, secagem por

atomizao.

vii

ABSTRACT

Ribeiro, Alessandra Casagrande. Effect of microencapsulated essential oil of pink

pepper (Schinus terebinthifolius Raddi) addition on Minas Frescal cheese.

(Dissertao Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Universidade

Federal do Esprito Santo, Alegre - ES. Advisor: Mirela Guedes Bosi. Co- Advisor:

Patrcia Campos Bernardes e Pollyanna Ibrahim Silva.

Pink pepper is the fruit of the pepper tree (Schinus terebinthifolius Raddi), a

native plant from Brazil. The extraction and characterization of its essential oil

enables its industrial use. This work aimed to evaluate the effect of essential oil of

pink pepper addition on Minas Frescal cheese. 95.36% of constituents of essential

oil were identified, and the -carene-3 was the major compontente. Pink pepper

essential oil showed antioxidant (2.526 0.277 mols per ml Trolox oil) and

antimicrobial characteristics regarding the development of Staphylococcus aureus.

It was observed in the agar diffusion test, the formation of inhibition zone of 1.35

0.322 cm, and in the minimum inhibitory concentration analysis, the value of

3.13%. Essential oil is sensitive to degradation, so it requires technological

processes to ensure its action. In order to protect the essential oil, it was

microencapsulated with the use of a spray dryer. To microencapsulate it, three

wallpaper formulations were developed using different concentrations of gum

arabic, modified starch and maltodextrin. The microcapsules were analyzed

according to their physical, chemical and morphological characteristics and a

formulation was selected to be added to Minas Frescal cheese. The formulation

with 5% modified starch, 10% of maltodextrin and 5% arabic gum was selected. In

order to define the cheese essential oil concentration, it was conducted a sensory

test-ordering preference and the formulation with 0.01% essential oil was the most

preferred. Control cheese (CO) and cheese with addition of pink pepper essential

oil microcapsules (OEPR) were prepared and characterized. Concerning physico-

chemical characteristics, CO and OEPR cheeses only differed on moisture. OEPR

cheese presented good sensory acceptance. Global acceptance means were 7.6

0.97, with no significant difference (p> 0.05) compared to control cheese (7.6

1.18). To evaluate the effect of pink pepper essential oil on inhibiting the

viii

development of S. aureus, the oil was inoculated in CO and OEPR cheeses with

initial concentrations of 106 CFU.g-1. The cheeses were stored in BOD at

temperature of 4 1 C during the period of time of analysis: 0, 3, 6, 9, 12, 15 and

30 days. Results showed reduction of 1.53 cycles Log in cheese with the addition

of pink pepper essential oil. According to these results, pink pepper essential oil is

a feasible alternative of addition in Minas Frescal cheese due to its antioxidant and

antimicrobial potential, and its sensory acceptance.

Key words: Staphylococcus aureus, microencapsulation, spray drying.

ix

SUMRIO

1 INTRODUO ............................................................................................. 1

2 OBJETIVOS ................................................................................................. 4

2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 4

2.2 Objetivos especficos ............................................................................. 4

3 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 5

3.1 Queijo Minas Frescal ................................................................................. 5

3.2 Gastroenterite estafiloccica ................................................................. 6

3.3 Pimenta rosa ............................................................................................ 8

3.4 Microencapsulao ............................................................................... 11

3.4.1 Secagem por atomizao ............................................................... 13

3.4.2 Material de parede .......................................................................... 14

4 MATERIAL E MTODOS........................................................................... 18

4.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa ...................................... 19

4.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa............................ 20

4.2.1 Composio qumica ...................................................................... 20

4.2.2 Atividade antioxidante ................................................................... 21

4.2.3 Atividade antimicrobiana ............................................................... 23

4.3 Microencapsulao do leo essencial de pimenta rosa .................... 24

4.4 Caracterizao fsico-qumica das microcpsulas ............................ 25

4.4.1 Atividade de gua ........................................................................... 26

4.4.2 Umidade .......................................................................................... 26

4.4.3 Higroscopicidade ............................................................................ 26

4.4.4 Microscopia eletrnica de varredura ............................................ 26

4.4.5 Difrao de raios x .......................................................................... 26

4.4.6 Cor ................................................................................................... 27

4.5 Elaborao do queijo Minas Frescal ................................................... 27

4.6 Caracterizao do queijo Minas Frescal ............................................. 30

4.6.2 Anlises microbiolgicas dos queijos .............................................. 32

4.6.3 Anlises sensoriais ............................................................................ 33

5 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................. 36

5.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa .......................................... 36

x

5.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa............................ 36

5.2.1 Composio qumica ...................................................................... 36

5.2.2 Atividade antioxidante ................................................................... 38

5.2.3 Atividade antimicrobiana ............................................................... 39

5.3 Microencapsulao do leo essencial de pimenta rosa .................... 42

5.3.1 Caracterizao fsico-qumica e morfolgica das microcpsulas de

leo essencial de pimenta rosa .................................................................. 42

5.3.2 Microscopia eletrnica de varredura ................................................ 43

5.3.3 Difrao de raios x .............................................................................. 48

5.3.4 Cor ........................................................................................................ 50

5.4 Elaborao e caracterizao do queijo Minas Frescal ....................... 51

5.4.1 Acidez titulvel e pH ....................................................................... 52

5.4.2 Composio centesimal do leite e do queijo Minas Frescal ........... 53

5.4.3 Anlises microbiolgicas .............................................................. 59

5.4.4 Teste de aceitao sensorial ......................................................... 62

6 CONCLUSES .......................................................................................... 66

7 PERSPECTIVAS FUTURAS ...................................................................... 67

REFERNCIAS ............................................................................................... 68

1

1 INTRODUO

O Minas Frescal um queijo no maturado com elevada atividade de gua

(Aw) e alto teor de nutrientes. Estas caractersticas o tornam favorvel para o

desenvolvimento de microrganismos, o que pode causar riscos sade do

consumidor. Dentre os microrganismos capazes de se desenvolver em queijo

Minas Frescal, Staphylococcus aureus tem sido bastante pesquisado, pois neste

produto h relatos de surtos causados por este microrganismo (ROCHA et. al.,

2006; SENGER; BIZANI, 2011; SOARES et al, 2008; WALSTRA, 2006).

O uso de conservantes uma alternativa obteno de produtos seguros

do ponto de vista microbiolgico. Porm, tem-se preferido produtos alimentcios

com um mnimo de conservantes, o que tem levado os pesquisadores a buscar

alternativas para atender a essa demanda. A adio de leo essencial extrado

de plantas (galhos, folhas e sementes), por suas propriedades antimicrobianas,

uma maneira encontrada para exercer esse controle (AZEVEDO et al., 2012;

BURT, 2004; HOLLEY; PATEL, 2005; OLIVEIRA et al., 2013; SOARES et al.,

2008).

A pimenta rosa o fruto da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi), uma

planta nativa do Brasil, pertencente famlia Anacardiaceae e que possui outros

nomes comuns como: aroeira-vermelha, aroeira-mansa, aroeira-branca, aroeira-

da-praia, aroeira-do-serto, araguaraba, fruto-de-sabi e rvore-da-pimenta

(BAGIO, 1988; SILVA-LUZ; PIRANI, 2015). Ocorre desde o Nordeste, passando

pelos cerrados, chegando ao Rio Grande do Sul e estendendo pela Argentina e

Paraguai. Seu plantio desponta como alternativa para a diversificao agrcola. A

extrao de seu leo essencial viabiliza sua utilizao industrial, conferindo sabor

peculiar ao produto ao qual adicionado (BAGIO, 1988; FAES e SENAR, 2009;

SILVA-LUZ; PIRANI, 2015). No entanto, sua composio, atividade

antimicrobiana e ao antioxidante precisam ser mais bem investigadas. leos

essenciais de organo, alecrim, louro tm sido usados com sucesso para

controlar reaes de oxidao em alimentos (OLMEDO et al., 2013; ARAJO,

2011; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).

A oxidao um fenmeno natural que ocorre em alimentos e bebidas,

sendo responsvel por uma srie de alteraes que levam perda do valor

2

nutricional, alterao das caractersticas sensoriais e formao de compostos

txicos (ARAJO, 2011). Os efeitos da oxidao afetam a maioria dos

componentes no alimento, incluindo micronutrientes e os macronutrientes. A

utilizao de substncias qumicas capazes de fornecer proteo contra a

oxidao uma alternativa para reduzi-la (ARAJO, 2011; BOROSKI et al., 2012;

OLMEDO et al., 2013; TRAJANO; 2010). Os antioxidantes, alm de retardar a

rancidez oxidativa, protegem carotenoides, vitaminas e outros compostos

insaturados. A atividade antioxidante est relacionada com estrutura e

composio qumica e os leos essenciais possuem compostos com

caractersticas qumicas propcias para atuarem como antioxidantes (ARAJO,

2011; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010). Dentre estes compostos esto

os hidrocarbonetos, lcoois e compostos carbonlicos.

Diversos constituintes qumicos dos leos essenciais so fotossensveis e

podem sofrer processos oxidativos nas condies ambientais. Alm disso, estes

compostos so de baixa massa molecular e apresentam grande volatilidade.

Assim para utiliz-los torna-se necessrio a aplicao de mtodos que ajudem a

preservar seus princpios ativos. A microencapsulao uma tcnica que permite

a proteo dos princpios ativos contra reaes de degradao e permite a

liberao desses compostos de maneira controlada. Na microencapsulao, as

substncias nos estados slido, lquido ou gasoso so revestidas por um agente

encapsulante, obtendo partculas de dimenses microscpicas (ASCHERI et.al,

2003; BRASILEIRO, 2011).

Um dos processos mais utilizados para microencapsular partculas

alimentcias a secagem em Spray-Dryer. Nele, o leo essencial de pimenta rosa

ou outro material ativo a ser encapsulado misturado ao material encapsulante

formando uma emulso. Ao ser atomizado dentro do secador, ocorre a

evaporao do lquido do agente encapsulante com a formao da membrana ao

redor das gotas do material ativo. O processo dividido em trs etapas: preparo

de uma emulso, homogeneizao e atomizao em cmara de secagem

(DZIEZAK, 1988; GHARSALLAOUI et al., 2007). Esse processo apresenta

algumas vantagens sobre os outros mtodos de encapsulao as propriedades e

a qualidade do produto so mais eficientemente controladas; podem ser usados

produtos sensveis ao calor como leos essenciais; h possibilidades de grandes

3

produes em operao contnua com equipamentos simples; produo de

partculas relativamente uniformes e esfricas; boa eficincia e baixo custo do

processo.

Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi produzir queijo Minas Frescal

adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado, a fim de verificar

o efeito do leo essencial nas caractersticas fsico-qumicas, microbiolgicas e

sensrias do queijo.

4

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar o efeito da adio do leo essencial de pimenta rosa microencapsulado

em queijo Minas Frescal nas suas caractersticas fsico-qumicas, sensoriais e

microbiolgicas.

2.2 Objetivos especficos

Extrair o leo essencial de pimenta rosa.

Determinar a composio qumica do leo essencial de pimenta rosa.

Avaliar a atividade antioxidante do leo essencial de pimenta rosa.

Determinar a atividade antimicrobiana do leo essencial de pimenta rosa

para o desenvolvimento de Staphylococcus aureus: teste de difuso em gar e

concentrao inibitria mnima (CIM).

Microencapsular o leo essencial.

Determinar as caractersticas fsico-qumicas e morfolgicas das

microcpsulas.

Elaborar o queijo Minas Frescal com leo essencial de pimenta rosa

microencapsulado.

Avaliar por meio de teste de ordenao-preferncia o queijo Minas Frescal

com diferentes concentraes de leo essencial de pimenta rosa

microencapsulado.

Determinar as caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas do queijo

Minas Frescal adicionado de leo essencial microencapsulado.

Verificar a eficincia do leo essencial de pimenta rosa microencapsulado

em inibir o desenvolvimento de S. aureus no queijo Minas Frescal.

Avaliar a aceitao sensorial do queijo Minas Frescal adicionado de leo

essencial de pimenta rosa microencapsulado.

5

3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Queijo Minas Frescal

Segundo Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade para Leite e

Derivados da Portaria n 146 de 07/03/1996 do Ministrio da Agricultura, Pecuria

e Abastecimento (MAPA) entende-se por queijo o produto fresco ou maturado que

se obtm por separao parcial do soro do leite ou leite reconstitudo (integral,

parcial ou totalmente desnatado) ou de soros lcteos, coagulados pela ao fsica

do coalho, de enzimas especficas, de bactria especfica, de cidos orgnicos,

isolados ou combinados, todos de qualidade apta para uso alimentar, com ou sem

agregao de substncias alimentcias e/ou especiarias e/ou condimentos,

aditivos especificamente indicados, substncias aromatizantes e matrias

corantes (BRASIL, 1996).

O queijo o produto gelatinizado obtido pela agregao da casena por

ao de enzimas ou por alterao do pH. No processo tradicional de fabricao

de queijo Minas adicionada a enzima quimosina (renina) ao leite. Por ser um

produto classificado como fresco, est pronto para o consumo logo aps sua

fabricao segundo mesma portaria do MAPA (BRASIL, 1996).

A alta atividade de gua e composio nutricional o torna propcio ao

desenvolvimento de diversos microrganismos, inclusive bactrias patognicas. A

qualidade inicial do leite a primeira condio a ser observada na produo de

queijo, pois um nmero inicial elevado de bactrias patognicas, no ter

destruio eficiente pelos processos de beneficiamento. Todo o leite utilizado na

fabricao de queijo Minas dever ser pasteurizado. O desenvolvimento de

bactrias em leite pasteurizado est relacionado com condies de

armazenamento inadequadas: temperaturas superiores s estabelecidas pela

legislao ou prtica higinicas inaceitveis (ROCHA; BURITI; SAAD, 2006;

VIERA et al., 2008;).

Na microbiota capaz de se desenvolver no queijo Minas Frescal esto

bactrias patognicas, que podem causar infeco (ingesto de microrganismo

que podem se multiplicar e disseminar em tecidos e rgos) ou toxinfeco

alimentar (pela a ingesto de toxinas). Os sintomas dessas doenas alimentares

6

variam desde diarreia, vmitos, febre, flatulncia at abortos. Alguns exemplos de

bactrias que podem estar presentes no queijo Minas Frescal so: S. aureus,

Salmonella spp, Shigella spp e Listeria spp (VIEiRA et al., 2008).

Por estar associado a infeces no bere, S. aureus pode estar presente

no leite cru e, devido a falhas no processo de fabricao, ser transmitido aos

queijos (ASPERGER; ZANGERL, 2011). Pasteurizao inadequada, ou utilizao

de leite cru no processamento dos queijos so possveis maneiras desta

contaminao ocorrer. Outra forma de contaminao seria atravs de

manipulao inadequada. Os manipuladores nas fbricas de processamento de

lcteos tambm podem ser hospedeiros deste microrganismo e, por falhas nos

programas de boas prticas de fabricao, contaminar os queijos. Se houver

produo de enterotoxinas haver intoxicao estafiloccica (FOX, 1988; VIEIRA

et al., 2008; WALSTRA, 2006).

A produo de alimentos seguros, que no causem danos sade do

consumidor, um dos alvos a serem alcanados pela indstria alimentcia.

Portanto, aliado a boas prticas de fabricao, o uso de substncias que reduzam

o desenvolvimento microbiano, a oxidao de lipdios e com isso as alteraes

indesejveis nos alimentos vem atender a essa demanda.

3.2 Gastroenterite estafiloccica

A gastroenterite estafiloccica causada pela ingesto de alimentos que

contenham uma ou mais enterotoxinas, produzidas por algumas espcies e

linhagens de estafilococos. Embora a produo de enterotoxinas esteja associada

a Staphylococcus aureus coagulase e ternonucleases (TNase) positivos, algumas

espcies que no produzem estas enzimas podem produzir enterotoxinas (JAY,

2005).

S. aureus um importante patgeno oportunista que tem impacto sobre a

sade humana. Embora seja conhecido por causar infeces de pele e dos

tecidos moles, ele tem capacidade de infectar quase todos os sistemas e rgos

do corpo humano, muitas vezes com consequncias fatais devido variedade de

seus fatores de virulncia (BOSE; BAYLES, 2013). Os fatores de virulncia so

estruturas, produtos ou estratgias que as bactrias utilizam para driblar o

7

sistema de defesa do hospedeiro e causar uma infeco. Alguns esto

relacionados com a colonizao do microrganismo e outros com as leses

causadas pelo organismo, por exemplo, as toxinas como o caso do estafilococo

(TRABULSI; ALTERTHUM, 2008).

O gnero Staphylococcus inclui mais de 30 espcies, sendo 18 delas de

real e potencial interesse em alimentos. Dessas 18 espcies e subespcies

somente 6 so coagulase positiva e produzem nuclease termoestvel (TNase).

Das coagulases negativas, 10 demonstraram capacidade de produzir

enterotoxinas, mas no produzem nucleases, ou se produzem, elas so

termossensveis. Estafilococos produtores de enterotoxina, em particular, S.

aureus, so provavelmente a principal causa de doena de origem alimentar em

todo o mundo (ASPERGER; ZANGERL, 2011).

O desenvolvimento de S. aureus em alimentos est relacionado a casos de

intoxicao alimentar pela ingesto de enterotoxina. Enterotoxinas so protenas

produzidas por algumas espcies de estafilococos. Geralmente os alimentos

associados so: carne (bovina, suna e aves), e seus subprodutos (presunto,

salsichas e salames), saladas com presunto ou frango ou batata, cremes de

recheio de produtos panificados e produtos lcteos, com destaque para os queijos

(APHA, 2001).

S. aureus um patgeno associado a infeces em animais. (APHA,

2001). Ele pode colonizar e infectar a glndula mamria de vacas. A adeso ao

epitlio escamoso e mido fundamental para colonizao de S. aureus

(FOSTER, 2011). Este microrganismo pode expressar uma srie de protenas de

superfcie, que interagem com a superfcie das clulas epiteliais escamosas, e

que contribuem para o processo infeccioso. Estas protenas promovem a

aderncia matriz extracelular, a evaso de respostas imunes e invaso das

clulas epiteliais. Alm disso, elas inibem a migrao de neutrfilos e danificam as

membranas das clulas hospedeiras, incluindo fagcitos.

Portanto o leite e produtos lcteos, especialmente os queijos, podem ser

contaminados por este microrganismo quando no existem boas prticas de

higiene, incluindo o controle de mastite; ou o leite no pasteurizado

adequadamente. Aps a contaminao com estafilococos enterotoxignica, a

intoxicao alimentar pode acontecer quando o desenvolvimento abundante e

http://www.infoescola.com/microbiologia/fatores-de-virulencia-adesao-invasao-e-sideroforos/

8

formao de enterotoxina ocorrem durante a produo e armazenamento destes

produtos lcteos (ASPERGER; ZANGERL, 2011).

Devido s suas caractersticas e sua constituio qumica, o leo essencial

desponta como uma alternativa para controlar o desenvolvimento de

microrganismos, alm da oxidao de lipdios. Porm so necessrios estudos

que investiguem sua ao antimicrobiana, antioxidante e os efeitos de sua

utilizao em alimentos.

3.3 Pimenta rosa

A aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi) uma planta nativa do Brasil,

pertencente famlia Anacardiaceae e possui outros nomes comuns como:

aroeira-vermelha, aroeira-de-remdio, aroeira-mansa, aroeira-branca, aroeira-da-

praia, aroeira-do-serto, araguaraba, fruto-de-sabi e rvore-da-pimenta (BAGIO,

1988; SILVA-LUZ; PIRANI, 2015). Ocorre desde o Nordeste (Alagoas, Bahia,

Cear, Paraba, Pernambuco, Piau, Rio Grande do Norte, Sergipe) passando

pelos cerrados (Mato Grosso do Sul), regio sudeste (Esprito Santo, Minas

Gerais, Rio de Janeiro, So Paulo) chegando regio sul (Paran, Rio Grande do

Sul, Santa Catarina) e se estendendo pela Argentina e Paraguai (SILVA-LUZ;

PIRANI, 2015). Seu plantio desponta como alternativa para a diversificao

agrcola, pois uma espcie que permite o sistema integrado de produo

agroflorestal. A espcie florestal (aroeira) atua como elemento bsico para

amenizao ambiental e diversificao da produo agrcola (BAGIO, 1988).

O fruto da Aroeira conhecido como pimenta rosa, ou poivre-rose na

Frana; pink pepper nos Estados Unidos da Amrica. A pimenta rosa possui

sabor peculiar, bastante apreciado na culinria internacional, sendo a produo

nacional praticamente voltada para exportao. A pimenta rosa, por sua cor

atrativa utilizada para decorar pratos, conferindo-lhes requinte. Portanto os

frutos com injrias ou verdes so descartados. Uma alternativa para utilizao

destes frutos seria a extrao do seu leo essencial (BERTOLDI, 2006).

9

Figura 1: Pimenta rosa (Fonte FAES e SENAR, 2009)

Para conseguirem proteo contra inimigos potenciais tais como bactrias,

fungos, vrus, nematoides, caros, insetos, mamferos ou animais herbvoros, os

vegetais desenvolveram sistemas de defesas. O primeiro nvel de defesa envolve

a superfcie da planta (cutcula e periderme). O segundo nvel est relacionado a

um grupo de diversos compostos vegetais, existentes apenas no reino vegetal e

conhecidos como metablitos secundrios (TAIZ; ZEIGER, 2013).

Sabe-se que muitos produtos do metabolismo secundrio tm funes

importantes nos vegetais: eles agem como atrativos para polinizao; protegem

as plantas contra herbvoros e contra a infeco por microrganismos patognicos,

entre outras funes (TAIZ; ZEIGER, 2013). Apesar de no apresentar funo

direta no crescimento e desenvolvimento dos vegetais os metablitos secundrios

geralmente desempenham papel fundamental nas funes vitais das plantas

como: fotossntese, respirao, transporte de solutos, translocao, sntese de

protenas, assimilao de nutrientes entre outros (TAIZ; ZEIGER, 2013). Os

metablitos secundrios podem ser divididos em 3 grupos quimicamente distintos:

terpenos, compostos fenlicos e compostos nitrogenados.

Os leos essenciais fazem parte dos metablitos secundrios, importante

grupo de constituintes dos vegetais e so responsveis pelos seus odores

aromticos caractersticos (BIZZO; HOVELl; REZENDE, 2009). Os leos

essenciais compreendem uma mistura complexa de hidrocarbonetos, alcois e

compostos carbonlicos. Os hidrocarbonetos, por sua vez, so uma mistura de

substncias volteis, os terpenos e em menor frequncia, esquiterpenos

10

(ARAUJO, 2011; PAWLOWSKI et al., 2012). A extrao do leo essencial da

pimenta rosa viabiliza sua utilizao industrial, conferindo seu sabor ao produto ao

qual adicionado (BAGIO, 1988; BERTOLDI, 2006; FAES e SENAR, 2009;

PAWLOWSKI et al., 2012).

Entre as diferentes classes de produtos naturais encontrados em leos

essenciais, os terpenos esto associados aos danos no processo de diviso

celular, sntese de ATP e anormalidades cromossmicas o que pode estar

envolvido no seu mecanismo antimicrobiano (PAWLOWSKI et al., 2012).

Outra caracterstica que vem sendo associada aos leos essenciais a

capacidade antioxidante. O estresse oxidativo caracterizado pelo desequilbrio

entre a produo de radicais livres e a sua inativao pelos sistemas de defesa do

organismo. Est sujeito de ocorrer em todos os organismos expostos a ambientes

oxigenados. O oxignio atmosfrico possui baixa energia de ativao inicial,

porm durante o metabolismo do oxignio, podem ser produzidas espcies

altamente reativas causadoras de danos a biomolculas. Em alimentos, isto pode

provocar a oxidao de lipdios, pigmentos, vitaminas e protenas, acarretando

perda de sabor, descolorao e perda de nutrientes importantes, alm de

formao de compostos carcinognicos. Logo os sistemas biolgicos, animais e

vegetais, desenvolveram diversas defesas antioxidantes, a fim de se proteger da

oxidao (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; DECKER, 2002).

Os alimentos que so derivados de diferentes tecidos biolgicos contm

uma srie de diferentes sistemas de defesa para prevenir os efeitos prejudiciais

das espcies reativas do oxignio, como os radicais superxido (O2-.),

hidroperoxila (HO2.), hidroxila (OH) e o perxido de hidrognio (H2O2)

(FERREIRA; MATSUBARA, 1997). Porm durante o processamento as espcies

reativas podem aumentar levando a um descontrole oxidativo, resultando em

perda de qualidade, diminuio de tempo de conservao e formao de

compostos txicos. Para garantir a qualidade e segurana dos alimentos so

adicionados antioxidantes aos alimentos processados (DAMODARAN; PARKIN;

FENNEMA, 2010; DECKER, 2002).

Os antioxidantes utilizados em alimentos podem ser sintticos ou naturais.

Em geral os antioxidantes sintticos so estruturas fenlicas, e os naturais so

compostos fenlicos, quinonas, lactonas e os polifenis. Nos mecanismos de

11

controle de oxidao de lipdios esto envolvidos os bloqueadores da reao em

cadeia (doadores de hidrognio) e os complexadores de metais. Os bloqueadores

so classificados em dois grupos: doadores e receptores de eltrons (ARAJO,

2011). Os antioxidantes doadores de eltrons ou hidrognio competem pelo

radical formado, diminuindo a velocidade da reao de oxidao. A eficincia da

atuao dependente da estrutura qumica e estabilidade do radical formado. Os

antioxidantes receptores de eltrons competem com o oxignio triplete pelo

radical livre, reduzindo a formao de radicais, principalmente o radical peroxil

(ARAJO, 2011).

O segundo mecanismo envolve a complexao de metais, catalisadores da

reao de oxidao de lipdios. um mecanismo definido como preventivo, pois

no ocorre interao entre radicais e sim complexao de ons metlicos, inibindo

com isso a decomposio dos perxidos (ARAJO, 2011).

A busca por uma alimentao mais saudvel e natural, com o mnimo de

conservantes ou aditivos sintticos tem incentivado as pesquisas para encontrar

aditivos ou antioxidantes eficazes e de baixo custo (DECKER, 2002). Alm dos

esforos para reduo da deteriorao oxidativa, busca-se o desenvolvimento de

tcnicas de processamento de alimentos que ajudem a preservar antioxidantes

endgenos. Estes compostos tambm tm sido associados a benefcios para a

sade (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; DECKER, 2002).

Portanto o leo essencial de pimenta rosa pode ser uma alternativa vivel

para o controle da oxidao de lipdios e do desenvolvimento de microrganismos,

dentre estes o S. aureus, patgeno associado toxinfeces alimentares.

3.4 Microencapsulao

Uma das grandes dificuldades tecnolgicas em relao aos leos

essenciais a preservao de suas caractersticas fsico-qumicas, sensoriais e

aromticas durante o processamento e estocagem, pois possuem grande parte

dos componentes sensveis ao calor e oxidao, alm de serem altamente

volteis. Alm disso, os leos essenciais podem reagir com outros ingredientes na

formulao alterando suas propriedades (MLLER, 2011). A cor, o sabor e o odor

originais dos alimentos geralmente so os mais afetados pelos mtodos

12

tradicionais de processamento. Com isso, se torna necessrio implantar mtodos

que preservam estas caractersticas, alm de deixar componentes nutricionais

mais bio-acessveis. Uma maneira encontrada para a aplicao dos leos

essenciais a microencapsulao.

Microencapsulao o processo de empacotamento de materiais ativos

(slidos, lquidos ou gasosos), as quais podem liberar o contedo de forma

controlada e sob condies especficas (REBELLO, 2009). As microcpsulas

podem ser descritas como embalagens extremamente pequenas, compostas por

um polmero como material de parede e um material ativo chamado de ncleo. As

microcpsulas so empregadas para melhorar o desempenho do material ativo ou

possibilitar novas aplicaes (ARSHADY, 1993).

A microencapsulao tem a funo de preservar os componentes como

aromas e vitaminas dos alimentos. A perda destes nutrientes traz prejuzos ao

seu valor nutricional, alm de afetar suas caractersticas sensoriais,

transformando o alimento em um produto distante do produto original (REBELLO,

2009).

As microcpsulas tm a capacidade de modificar e melhorar a aparncia e

as propriedades de uma substncia. Sua utilizao visa a atender s

necessidades especficas da indstria de alimentos como reduzir a reatividade do

ncleo com o ambiente; facilitar a manipulao do material encapsulado;

promover liberao controlada de determinadas substncias; mascarar sabor e

odor desagradveis e promover a diluio homognea do material encapsulado

em uma formulao alimentcia (REBELLO, 2009).

Alm dos leos essenciais, existem outros compostos para os quais a

microencapsulao utilizada, dentre os quais: pigmentos, compostos de sabor,

nutrientes, enzimas, conservantes, acidulantes, probiticos, entre outros

(MLLER, 2011).

Diversos mtodos tm sido utilizados na elaborao das microcpsulas,

tais como: spray drying ou secagem por atomizao, coacervao, liofilizao,

secagem em leito em espuma, spray cooling, extruso, extruso centrfuga,

recobrimento em leito fluidizado, lipossomas e complexao por incluso

(REBELLO, 2009).

13

Conforme o tamanho, as cpsulas podem ser classificadas em 3

categorias: macro (> 5000 m), micro (0,2- 5000 m) e nano cpsulas (< 0,2 m).

As cpsulas podem ser divididas em dois grupos: aquelas nas quais o ncleo

nitidamente centralizado, envolto em um filme bem definido de material de

parede, caracterizando as verdadeiras microcpsulas; e aquelas nas quais o

ncleo disperso na regio matricial, denominada as microesferas (PINTO,

2012).

3.4.1 Secagem por atomizao

A secagem por atomizao tambm conhecida como secagem por

asperso consiste na transformao do material do estado lquido para o slido,

atravs da disperso de gotculas que entram em contato com ar quente dentro

de uma cmara. Essa tcnica a mais utilizada pela indstria de alimentos. O

material que dever ser seco pode estar sob a forma de soluo, suspenso,

emulso ou pasta. A microencapsulao por atomizao conforme ilustrado na

Figura 2, envolve as operaes de emulsificao do material ativo com uma

soluo aquosa do material de parede, atomizao dentro da cmara de

secagem, seguida de secagem das gotculas atomizadas (ASCHERI, 1997).

Figura 2: Esquema bsico microencapsulao spray dryer (adaptao ASCHERI,

1997).

14

Como a evaporao da gua acontece rapidamente, a temperatura dentro

do ncleo no ultrapassa 100 C, com temperaturas geralmente em torno de 60

C, reduzindo a ocorrncia de alteraes indesejveis nos compostos

termossensveis. Esta considerada a principal vantagem da atomizao

(AZEREDO, 2005).

3.4.2 Material de parede

A seleo do material de parede adequado crtica para o sucesso da

microencapsulao. O material correto evita interaes qumicas, oxidao e

volatilizao do ncleo alm de maximizar a reteno do leo essencial aps o

processo de secagem. Os materiais de parede no devem reagir com o material

ativo do ncleo e devem ser seguros para o uso em alimentos (AZEREDO, 2005;

FERNANDES et al., 2014). Alm disso, para encapsulao de leos, os materiais

de parede devem possuir capacidade de formar e estabilizar emulses,

proporcionando uma pelcula em torno da superfcie das gotculas de leo da

emulso durante a homogeneizao, formando uma barreira ao oxignio, principal

responsvel pela oxidao (GARTI, 2008).

Existe uma grande variedade de materiais de parede utilizados para a

microencapsulao. Polmeros naturais como protenas (gelatina, protenas do

soro de leite, caseinato de sdio e protena de soja), pequenas molculas de

hidratos de carbono (emulsionantes, amidos e amidos modificados, sacarose,

glicose, lactose, maltodextrina), gomas (goma arbica, xantana, guar) entre outros

(GARTI, 2008). Os polmeros naturais tm sido preferidos nestes aspectos, sendo

compatveis com formulaes alimentcias (FERNANDES et al., 2014).

A goma arbica considerada um excelente material de parede, mas

problemas relacionados utilizao desse material tm levado a estudos que

indiquem substitutos. Seu custo elevado e fornecimento limitado esto entre os

principais problemas. O amido modificado e a maltodextrina tornaram-se uma

alterativa vivel para a substituio da goma arbica, devido alta disponibilidade

e baixo custo.

15

A goma arbica um dos materiais mais utilizados para compor as

paredes das microcpsulas (FERNANDES et al., 2014). um biopolmero

extrado de um arbusto, Accia Senegal, encontrado principalmente na frica. A

goma arbica uma mistura complexa de diferentes biopolmeros, com pelo

menos trs fraes principais com alto massa molecular. Tem sido proposto que a

frao surfactante ativa consiste em arabinogalactanos ramificados ligados

cadeia de um polipeptdio. A cadeia polipeptdica tem grupos laterais hidrofbicos,

responsveis pela sua adsoro dos lipdios na superfcie. J a outra poro

hidroflica dos blocos de arabinogalactano se posiciona na fase aquosa formando

uma camada interfacial. A esta camada creditada a estabilidade contra a

agregao das gotculas, principalmente por meio de repulso estrica, mas com

alguma contribuio da repulso eletrosttica (KASAPIS, 2009; DICKISON, 2003).

No entanto, quando comparada a outros biopolmeros de superfcie, a

goma arbica tem baixa afinidade pelas interfaces leo-gua. recomendada sua

utilizao em concentraes elevadas ou juntamente com outros biopolmeros

para formao de emulses estveis (DICKISON, 2003; KASAPIS, 2009).

Problemas frequentes associadas com variaes de qualidade, tm levado

a pesquisas para investigar fontes alternativas de emulsificantes de biopolmeros

para uso em alimentos (ASCHERI, 1997; ASCHERI; MARQUEZ; MARTUCCI,

2003; FERNANDES et al., 2014; KASAPIS, 2009).

Os amidos naturais costumam ter pouca atividade de superfcie por serem

molculas predominantemente hidroflicas. No entanto, a sua modificao qumica

ir produzir emulsionantes altamente eficazes. Geralmente esta modificao

feita anexando grupos laterais hidrfobos ao longo de suas estruturas (NILSSON;

BERGENSTAHL, 2006; TRUBIANO, 1995). Estes amidos modificados so

amplamente utilizados como emulsionantes na indstria de bebidas,

frequentemente como um alternativa ou substituio goma arbica. Um dos

amidos modificados mais utilizado um derivado de octenilsuccinato de milho

ceroso. O amido modificado consiste principalmente em amilopectina

quimicamente modificada para conter grupos laterais aninicos e no polares

(ASCHERI, 1997; I; ASCHERI; MARQUEZ; MARTUCCI, 2003; FERNANDES et

al., 2014).

16

Estes grupos laterais apolares se prendem s superfcies das gotculas

lipoflicas, enquanto as cadeias de amido polares posicionam direcionadas para a

fase aquosa (KASAPIS, 2009), caracterstica fundamental de um bom

emulsificante. Estas cadeias de amido polimricas hidroflicas protegem as

gotculas da coalescncia, atravs principalmente de repulso estrica; embora a

repulso eletrosttica tambm possa desempenhar algum papel. Esta

modificao tambm confere ao material excelente capacidade de reteno de

volteis durante a atomizao no atomizador (ROCHA et al., 2012) .

Como o mecanismo dominante de estabilizao das emulses adicionadas

de amido modificado a repulso estrica, estas se tornam resistentes a

alteraes do pH, a fora inica e temperatura (CHANAMAI; MCCLEMENTS,

2002).

Da mesma maneira que a goma arbica, o amido modificado possui baixa

atividade interfacial quando comparado com protenas ou agentes tensoativos.

Por isso deve tambm ser usado em grandes concentraes (recomenda-se 1:1 a

proporo de amido e leo nas emulses leo em gua) para garantir que todas

as superfcies das gotculas sejam revestidas adequadamente (KASAPIS, 2009).

A maltodextrina qualificada como um polmero sacardeo no doce, que

consiste em unidades de D-glicose ligadas principalmente por cadeias -1,4 com

dextrose equivalente (DE) menor que 20. Apresenta-se em p branco ou soluo

concentrada obtida a partir da hidrlise parcial do amido com cido ou enzimas.

A sua utilizao como material de parede de ingredientes alimentcios tem sido

pesquisada, pois oferece vantagens em relao a outros materiais de parede:

custo relativamente baixo, aroma e sabor neutros, baixa viscosidade em altas

concentraes de slidos e uma boa proteo do ncleo contra reaes de

oxidao. A sua limitao ao uso est relacionada sua baixa capacidade de

emulsificao e reteno de compostos volteis, sendo recomendada a sua

utilizao com outros materiais de parede (FERNANDES et al., 2014).

Entre suas propriedades funcionais podemos destacar a capacidade de

formao de pelcula em torno do material ativo, protegendo-o; baixa

higroscopicidade; baixa viscosidade e boa dissoluo em gua, facilitando com

isso a reidratao do material encapsulado. medida que se aumenta o nmero

de dextroses equivalentes da maltodextrina aumenta-se sua higroscopicidade

17

porm, sua viscosidade diminui (ASCHERI, 1997; I; ASCHERI; MARQUEZ;

MARTUCCI, 2003).

Este estudo avaliou o efeito de goma arbica, amido modificado e

maltodextrina na composio, caractersticas fsico-qumicas e morfologia das

micropartculas de leo essencial de pimenta rosa.

18

4 MATERIAL E MTODOS

As atividades foram divididas em trs etapas: Etapa 1 Extrao e

caracterizao do leo essencial de pimenta rosa; Etapa 2 Microencapsulao

do leo essencial de pimenta rosa; Etapa 3 Fabricao do queijo Minas Frescal

adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado juntamente com

sua caracterizao fsico-qumica; anlises microbiolgicas e teste de aceitao

sensorial do produto elaborado.

A representao esquemtica com as etapas do estudo e suas respectivas

fases mostrada na Figura 3.

Figura 3: Representao esquemtica das atividades realizadas no experimento.

Para caracterizao do leo essencial de pimenta rosa, o experimento foi

conduzido segundo delineamento inteiramente casualizado com trs repeties;

Extrao do leo essencial

Caracterizao do leo essencial

Composio qumica

Atividade antioxidante

Atividade antimicrobiana

Microencapsulao

Elaborao do Queijo Minas

Caracterizao fsico-qumica

Anlises microbiolgicas

Anlises sensoriais

Caracterizao das microcpsulas

19

sendo todas as anlises foram realizadas em duplicata. Foram calculadas as

mdias e respectivos desvios padro. As anlises estatsticas foram realizadas

utilizando o Excell e o programa estatstico SAEG (2007) DEMO.

Para a caracterizao das microcpsulas o delineamento foi inteiramente

casualizado com trs repeties. As anlises foram realizadas em duplicata e

foram calculadas as mdias e respectivos desvios padro. Os resultados foram

analisados utilizando a Anlise Estatstica Univariada (ANOVA) para verificar a

existncia de diferena significativa e por fim foi realizado teste de comparao de

mdias, Tukey, nvel de 95 % de confiabilidade para verificar a existncia de

diferena entre as trs formulaes de microcpsulas.

A caracterizao fsico-qumica, microbiolgica e sensorial dos queijos

produzidos tambm ocorreu sob o delineamento inteiramente casualizado com

trs repeties e todas as anlises foram realizadas em duplicata e tiveram

calculadas as mdias e os respectivos desvios padro calculadas. Os dados

mdios da composio centesimal do queijo Minas Frescal com microcpsulas de

leo essencial e controle foram comparados, utilizando o teste t ao nvel de 95 %

de probabilidade e os resultados analisados para se verificar a existncia de

diferena significativa entre os tratamentos. Para avaliao dos dados

microbiolgicos em relao ao tempo foram calculadas mdias e desvios padro.

Os resultados obtidos pelo teste de ordenao-preferncia foram analisados pelo

teste de Friedman ao nvel de 5% de probabilidade, utilizando-se a Tabela de

Newel e McFarlane, conforme Minim (2011). Os resultados da aceitao sensorial

foram tabulados e as mdias obtidas foram comparadas, utilizando o teste t ao

nvel de 5 % de probabilidade. Os resultados foram analisados para se verificar a

existncia de diferena significativa entre os tratamentos.

4.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa

A extrao do leo essencial foi realizada no Laboratrio de Operaes

Unitrias do Centro de Cincias Agrrias, da Universidade Federal do Esprito

Santo (UFES), em Alegre, ES.

Os frutos in natura foram fornecidos pela empresa AgroRosa Ltda,

exportadora de pimenta rosa, localizada na cidade de So Mateus, ES. Esses

20

frutos foram selecionados e desidratados pela mesma empresa, utilizando

equipamentos eletrnicos, segundo sua densidade e colorao, sendo que frutos

verdes, pretos e de alta densidade foram excludos do processo de secagem. Os

frutos recebidos foram embalados em sacos de polietileno de alta densidade e

armazenados temperatura ambiente, em local seco e arejado at sua utilizao.

O leo essencial de pimenta rosa foi extrado por hidrodestilao, utilizando

um sistema Clevenger. Os frutos foram modos em moinho Cadence (MDR301)

para facilitar a extrao e colocados em balo volumtrico de 2000 mL, na

proporo de 450 g de frutos modos para 1200 mL de gua destilada. A mistura

foi aquecida at ebulio, e aps condensao, o leo separou-se da gua devido

diferena de densidade. Aps trs horas de extrao, o leo foi recolhido do

sistema de Clevenger para um balo de decantao. Com ajuda de uma pipeta de

Pasteur, o leo foi retirado do balo e colocado em tubo de centrifugao. Em

seguida, o leo foi centrifugado a 1500 rpm por 15 minutos utilizando centrfuga

Fanem/Excelsa II e armazenado temperatura de 5 1 C, em frasco mbar

envolto em folha de alumnio.

4.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa

O leo essencial foi caracterizado quanto sua composio qumica,

atividade antioxidante e ao antimicrobiana para o microrganismo S. aureus.

4.2.1 Composio qumica

A determinao da composio qumica do leo essencial de pimenta rosa

foi realizada na Central Analtica, do Centro de Cincias Agrrias, da

Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre, ES.

O leo essencial obtido foi submetido anlise por cromatografia gasosa

acoplada espectrometria de massa (CG-MS), utilizando aparelho modelo QP-

PLUS-2010 (SHIMADZU). A coluna cromatogrfica utilizada foi do tipo capilar de

slica fundida com fase estacionria Rtx-5MS, de 30 m de comprimento e 0,25

mm de dimetro interno. As condies operacionais foram: fluxo de gs de arraste

(He) de 1 mL.min-, temperatura do injetor e do detector de 220 C e 300 C

respectivamente. A temperatura inicial da coluna foi 60 C aumentando de 2 C

21

por minuto at 240 C, permanecendo constante por 30 minutos. Injetou-se 1 L

de cada amostra preparada a partir de 10 L de leo essencial de pimenta rosa,

diludo em 1 mL de hexano (ADAMS, 2007).

A identificao dos compostos foi realizada por comparao dos espectros

de massa obtidos experimentalmente com o banco espectral Wiley, 7 Edio ou

por comparaes dos espectros de massas obtidos com os existentes na

biblioteca NIST e tambm pelo ndice de reteno relativo (ADAMS, 2007).

A quantificao dos constituintes qumicos do leo essencial foi realizada

por cromatografia em fase gasosa em equipamento SHIMADZU GC-2010 Plus,

equipado com detector de ionizao de chama (CG-DIC) de acordo com mtodos

descritos por PINHEIRO et al. (2013) e Rondelli et al. (2012). O gs de arraste

utilizado foi o nitrognio e a coluna capilar Rtx-5MS, 30 m de comprimento e 0,25

mm de dimetro interno. As temperaturas do injetor e do detector foram fixadas

em 240 C e 250 C, respectivamente. Uma quantidade de 10 mg da amostra foi

diluda em diclorometano (1 mL) e injetou-se 1 L da mistura.

4.2.2 Atividade antioxidante

O Laboratrio de Qumica de Alimentos do Centro de Cincias Agrrias, da

Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre, ES foi utilizado para

determinao da atividade antioxidante do leo essencial de pimenta rosa.

Para o ensaio ABTS foi utilizado o trolox como referncia. Dentre os

mtodos antioxidantes utilizados in vitro, optou-se pelo ensaio ABTS (2,2-

azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato), segundo adaptao do mtodo descrito

por Re et al. (1999). A atividade antioxidante do leo essencial foi determinada

pela descolorao do ABTS, medindo a reduo do ction radical (ABTS+) como

porcentagem da inibio da absorbncia a 734 nm.

A diminuio da absorbncia do radical ABTS+ produzido pela oxidao

ABTS pela amostra proporcional concentrao de substncias antioxidantes

presentes, e est representado pelas equaes 2 e 3.

+ 228 + (equao 02)

+ + () + + + (equao 03)

max = 734 nm

22

Para a determinao da atividade antioxidante do leo essencial de

pimenta rosa foi utilizada uma soluo estoque de ABTS (7 mM). Para o seu

preparo foram necessrios 0,0979 g de ABTS e gua destilada para completar o

volume de balo volumtrico de 25 mL. Em seguida, preparou-se a soluo de

persulfato de potssio (2,45 mM), em que foram utilizados 0,1672 g de persulfato

de potssio e gua destilada completando um balo volumtrico de 250 mL. Para

o preparo do radical misturaram-se 10 mL da soluo estoque de ABTS e 10 mL

de soluo persulfato de potssio, deixando reagir por 16 horas no escuro. A

diluio do radical foi realizada ajustando a sua absorbncia a 0,700; por meio da

adio de lcool absoluto.

Para construo da curva analtica foram utilizadas as concentraes de

200 M, 150 M, 130 M, 110 M, 90 M, 70 M, 50 M, 30 M, 10 M e 0 M da

soluo padro de trolox. Para todas as diluies foi utilizado lcool absoluto.

Em tubos de ensaio coletou-se 0,5 mL da amostra de cada concentrao e

foram adicionados 3,5 mL de radical ABTS, colocando-se para reagir por 6

minutos envoltos de folha de alumnio e no escuro. Aps este tempo foi feita a

leitura em espectrofotmetro a 734 nm. A partir dos valores obtidos construiu-se

uma curva com linha de tendncia linear e observou-se o R2.

Aps ajustar a curva padro, o leo essencial de pimenta rosa foi

adicionado, em balo volumtrico, nos volumes de 0,5 mL; 0,3 mL e 0,1 mL

completando-se o balo para 10 mL de lcool absoluto. Logo em seguida,

transferiu-se 0,5 mL de cada balo para tubos de ensaio e foi adicionado radical

ABTS deixando reagir por 6 minutos, envoltos em folha de alumnio e no escuro.

Aps este tempo, fez-se a leitura em espectrofotmetro a 734 nm e foi analisado

se os valores obtidos estavam dentro dos pontos da curva padro.

Os clculos para determinao da atividade antioxidante foram feitos com

base na equao do grfico da curva padro e na quantidade de leo essencial

utilizada para reduo do radical ABTS em cada amostra, considerando as

diluies realizadas, sendo os valores obtidos expressos em mols de trolox por

mL de leo essencial.

23

4.2.3 Atividade antimicrobiana

A determinao da ao antimicrobiana do leo essencial de pimenta rosa

foi realizada no Laboratrio de Microbiologia de Alimentos do Centro de Cincias

Agrrias, da Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre. Foram

utilizadas cepas de S. aureus provenientes da coleo do mesmo Laboratrio.

A cepa utilizada foi estocada durante toda a realizao do experimento sob

refrigerao (3,0 1,0 C) em meio de cultura de congelamento (para cada 100

mL de gua destilada: 15 mL de glicerol; 0,5 g de peptona bacteriolgica; 0,3 g de

extrato de levedura e 0,5 g de NaCl; pH 7,3 1,0). Para a ativao e utilizao

das cepas, foi transferida uma alquota para tubos de ensaio ou tubos Falcon

contendo caldo infuso crebro e corao (BHI). Foi realizado um repique neste

meio de cultura com incubao a 37,0 C, por 24 horas para ativao da cultura.

Para a padronizao do nmero de clulas utilizou-se mtodo descrito por

Valeriano et. al (2012). As cepas foram inicialmente inoculadas em tubo de ensaio

ou tubo Falcon contendo 7 mL do caldo infuso crebro e corao (BHI)

incubados a 37 C. Em seguida, a partir do BHI, foram realizadas estrias simples

para verificao da morfologia do microrganismo. A cultura foi estriada em placas

contendo PCA e incubada a 37 C por 24 horas. Das colnias formadas na

superfcie do PCA, foi retirada uma alada e transferida para um tubo de ensaio

contendo 7 mL de BHI e incubada a 37 C, at atingir 1 x 108 UFC.mL-1.

Para determinao da atividade antimicrobiana do leo essencial de

pimenta rosa foi utilizado o mtodo de difuso em gar segundo adaptao do

mtodo de Filho (2010). O meio de cultura utilizado foi o Mueller Hinton (MH).

Uma camada do inculo de S. aureus na concentrao 1 x 108 UFC.mL-1 foi

depositada na superfcie das placas com o meio de cultura. Em seguida, 10 L do

leo essencial de pimenta rosa foram transferidos para os discos. Para se

comparar os halos obtidos foi utilizado como controle negativo do crescimento

bacteriano a mistura de antibiticos: sulfato de neomicina, sulfato de paromicina,

cido nalidxico. Para controle positivo utilizou-se gua destilada. As placas foram

incubadas a 37 C, por 24 horas e aps esse perodo, os halos de inibio

formados foram medidos com o auxlio de um paqumetro.

24

Para determinar a concentrao inibitria mnima (CIM) foi utilizado o

mtodo de microdiluio em placas de Elisa. Nas placas de Elisa de fundo U

foram depositados na fileira A 100 L de BHI duplo concentrado com 0,1% de

tween 80, 100 L de leo essencial de pimenta rosa e 100 L do inculo diludo

a 106. Na fileira B transferiram-se 100 L da fileira A, 100 L do caldo BHI

concentrao normal com 0,1% de tween 80 e 100 L do inculo, na fileira C

transferiram-se 100 L da fileira B, o caldo BHI de concentrao normal com 0,1%

de tween 80 e 100L do inculo, dessa forma transferindo-se para a fileira

seguinte at a fileira H os mesmos compostos, ou seja, reduziu-se a concentrao

de leo essencial de uma fileira para outra em 50%. Aps completar os poos

com caldo BHI e leo essencial foi adicionado o inculo de S. aureus de forma

que cada poo ficasse com uma concentrao de 5x105 UFC.mL-1. Para leitura do

branco, os poos foram adicionados apenas de meio de cultura e leo essencial.

Foram feitos controles positivos para o crescimento de microrganismo e controles

para verificar a esterilidade dos meios de cultura. As leituras foram feitas em

leitor de Elisa Thermo Scientific, nos intervalos de trinta minutos nas quatro

primeiras leituras, nas 12 seguintes foram feitas de hora em hora. Ao final da

anlise a menor concentrao que apresentou atividade antimicrobiana

observada pela medida de absorbncia foi definida como CIM.

O experimento foi realizado com trs repeties e os resultados expressos

como a mdia e o desvio padro das mdias dos trs valores. A atividade

antibacteriana foi caracterizada pelo comprimento do crescimento bacteriano,

observado pela formao de halo de inibio.

4.3 Microencapsulao do leo essencial de pimenta rosa

Antes da sua utilizao nos queijos, o leo essencial de pimenta rosa foi

microencapsulado segundo adaptao do mtodo descrito por Ascheri; Marquez;

Martucci, (2003) utilizando o mtodo fsico de secagem por spray dryer. Essa

etapa ocorreu no Laboratrio de Operaes Unitrias do Centro de Cincias

Agrrias, da Universidade Federal do Esprito Santo (UFES), em Alegre.

Os materiais escolhidos para utilizao neste experimento foram a goma

25

arbica, amido modificado e maltodextrina, devido s suas propriedades como

excelentes agentes microencapsulantes de leos essenciais. A soluo do

material de parede (goma arbica, maltodextrina, amido modificado e gua), nas

suas devidas propores (Tabela 1), foi preparada no dia anterior do preparo da

emulso e mantida por 8-12 horas, temperatura ambiente, para assegurar

saturao das molculas dos polmeros. Para o preparo da emulso, o leo

essencial de pimenta rosa foi adicionado progressivamente soluo do material

de parede sob agitao constante (3500 rpm/ 10 minutos) utilizando um

liquidificador Walita RI2044. A emulso foi utilizada como lquido de alimentao

no processo de secagem por pulverizao.

Foram utilizadas trs combinaes de goma arbica; maltodextrina e amido

modificado conforme Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Formulaes utilizadas para microencapsulao.

Ingrediente (%) Fo1 Fo2 Fo3

Goma arbica 10 5

Maltodextrina 10 10 10

Amido modificado - 10 5

leo essencial 5 5 5

gua 75 75 75

Fonte: adaptado Ascheri et al. (2003)

A secagem ocorreu nas seguintes condies: temperatura de entrada do ar

de 175 C, temperatura de sada do ar menor que 60 C e vazo do lquido de

alimentao de 0,8 L/h. A quantidade de leo nas emulses foi de 5%. Foram

realizadas anlises para caracterizao fsico-qumica e morfolgica das

microcpsulas conforme descrito no item abaixo, 4.4.

4.4 Caracterizao fsico-qumica das microcpsulas

Foram realizadas as seguintes anlises nas microcpsulas obtidas:

umidade, atividade de gua, higroscopicidade, microscopia eletrnica de

varredura, difrao de raio x e cor.

26

4.4.1 Atividade de gua

A atividade de gua (Aw) foi mensurada por meio de leitura direta no

equipamento Labmaster, Novasina, com temperatura controlada de 25 0,5 C.

4.4.2 Umidade

A determinao da umidade das microcpsulas foi realizada pelo mtodo

gravimtrico (perda por dessecao temperatura em 105C, at obteno de

massa constante segundo AOAC, 2005).

4.4.3 Higroscopicidade

A higroscopicidade foi determinada segundo adaptao do mtodo

proposto por Fernandes; Borges; Botrel, 2013. As amostras de p de cada

tratamento (aproximadamente 1 g) foram colocadas em dessecador com uma

soluo saturada de NaCl (75,29% de umidade relativa) a 25 C. Aps uma

semana, as amostras formam pesadas, e a higroscopicidade expressa como g de

umidade absorvida por 100 g de slidos secos (g/100 g).

4.4.4 Microscopia eletrnica de varredura

As anlises de microscopia eletrnica de varredura foram realizadas no

Laboratrio de Microscopia do Departamento de Fsica da Universidade Federal

de Viosa (UFV), em Viosa, MG.

As anlises microscpicas foram conduzidas com algumas modificaes do

mtodo descrito por Binning et al. (1986), citado por Ferreira (2006). Os ps

(microcpsulas) foram fixados em uma fita adesiva dupla-face, montada em bases

com 1 cm dimetro e 1 cm de altura, revestidos com ouro sob vcuo e

examinados no microscpio eletrnico de varredura. O microscpio foi operado a

20 KV e foram feitas ampliaes de 800-20.000 vezes.

4.4.5 Difrao de raios x

As anlises de difrao de raios x foram realizadas no Laboratrio de

Difrao de raios X do Departamento de Fsica da Universidade Federal de

Viosa (UFV), em Viosa, MG.

27

Para obter informaes acerca da estrutura (cristalina ou amorfa) das

microcpsulas de leo essencial de pimenta rosa, foi utilizado o difratmetro de

raios X da marca Bruker , modelo D8 Discover , com radiao de cobre a 40 KV,

30 mA, velocidade de varredura de 1/seg sob ngulo 2 variando de 4 a 45.

4.4.6 Cor

Devido importncia da cor para aceitao dos produtos pelos

consumidores foram realizadas anlises de cor nas microcpsulas com auxlio de

um colormetro KONICA MINOLTA (modelo: CM-5) em sistema tridimensional L*,

a* e b*, em que L* indica a luminosidade, que varia do preto (l* = 0) ao branco (l*

= 100), a* consiste no eixo que varia do vermelho ao verde, e b* varia do amarelo

ao azul. Alm disso, foram observados os valores de h (ngulo de tonalidade

cromtica), c* (saturao de cor).

As amostras de cada formulao (Fo1, Fo2 e Fo3) foram devidamente

colocadas em placas de acrlico e levadas porta de reflectncia do colormetro

para leitura. As leituras foram realizadas em duplicata.

4.5 Elaborao do queijo Minas Frescal

A elaborao e a caracterizao fsico-qumica, sensorial e microbiolgica

do queijo Minas Frescal foi realizada nos laboratrios de Tecnologia de Produtos

Agrcolas (TPA), Qumica de Alimentos, Anlise Sensorial e Microbiologia de

Alimentos do Centro de Cincias Agrrias, da Universidade Federal do Esprito

Santo (UFES), em Alegre, ES.

O leite utilizado no processamento foi proveniente da rea experimental do

Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo,

localizado em Rive-Alegre, ES. O leite, ao ser recebido no Laboratrio de

Tecnologia de Produtos Agrcolas (TPA), passou por anlises fsico-qumicas de

determinao da acidez titulvel e pH. Foi coletada uma amostra para realizao

posterior das anlises de protenas, gordura, extrato seco total (EST) e cinzas.

28

O leite foi ento pasteurizado (65 C por 30 minutos). O queijo foi fabricado

por coagulao enzimtica do leite com adio de cloreto de clcio (0,02% em

relao ao volume de leite), cido ltico (0,04%) e coalho (0,1%).

Os queijos foram salgados aps a dessoragem, antes da enformagem.

Para o queijo adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado, a

adio ocorreu juntamente com o sal. Foi utilizada a concentrao de leo

essencial de pimenta rosa que teve preferncia no teste de ordenao descrito no

item 4.6.1. Na Figura 4 apresentado o fluxograma do processo de fabricao do

queijo.

29

Figura 4: Fluxograma da fabricao do queijo Minas Frescal com e sem adio de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado.

Pasteurizao do leite

Resfriamento

Adio de cido ltico, cloreto de clcio e coalho

Coagulao

Corte da massa

Mexedura

Dessoragem

Queijo teste

Adio de leo essencial microencapsulado e sal

Queijo controle

Adio de sal

Enformagem

Armazenamento sob refrigerao

30

4.6 Caracterizao do queijo Minas Frescal

4.6.1 Anlises fsico-qumicas

Foram realizadas no leite utilizado no trs processamentos e nos queijos

produzidos anlises de acidez titulvel e pH e composio centesimal para sua

caracterizao.

4.6.1.1 Acidez titulvel e pH

A acidez titulvel foi determinada com a titulao da amostra de leite,

utilizando soluo Dornic (soluo de hidrxido de sdio na concentrao de

0,111N) como titulante, na presena do indicador fenolftalena (soluo se

fenolftalena na concentrao de 1 %). O resultado foi expresso em porcentagem

de cido ltico (AOAC, 2005).

O pH foi medido em pHmetro digital de bancada ION LAB (modelo: pH

B500), segundo metodologia indicada pela AOAC (2005).

4.6.1.2 Composio centesimal do leite e queijo Minas Frescal

Para determinao da composio centesimal do leite utilizado no

processamento dos queijos foram realizadas as anlises de: extrato seco total,

teor de gordura, protena, cinzas e carboidratos.

A anlise de extrato seco total do leite e umidade do queijo Minas Frescal

foram determinadas com a secagem em estufa a 105 C ( 2 C) at massa

constante. Para a anlise do leite, foram utilizados 5 mL da amostra misturado a

10 gramas de areia purificada, e para a anlise do queijo, foram utilizados 5 g da

amostra (AOAC, 2005).

O teor de gordura do leite e dos queijos foi determinado pelo Mtodo de

Gerber, o qual se baseia na digesto total dos componentes orgnicos, exceto a

gordura, por meio da adio de cido sulfrico, lcool isoamlico; utilizando para o

leite butirmetro de leite e para o queijo butirmetro de queijo, com sua posterior

centrifugao. A leitura da camada amarelo-clara, obtida aps a centrifugao, foi

feita dentro da escala graduada dos butirmetros que corresponde porcentagem

de gordura da amostra (AOAC, 2005).

O teor de protena foi determinado segundo o teor de nitrognio total da

31

amostra, obtido pelo mtodo de Kjeldahl, que se baseia na digesto com cido

sulfrico do nitrognio da amostra, transformando-se em sulfato de amnio, o qual

segue para a etapa de destilao com liberao da amnia. A amnia liberada

fixada em uma soluo cida e, posteriormente, titulada. O valor total de protena

na amostra de leite determinado pela multiplicao da porcentagem de

nitrognio total pelo fator de correo 6,38 (AOAC, 2005).

O teor de cinzas obtido por incinerao foi determinado com a transferncia

de 5g (massa exato) da amostra para um cadinho, previamente aquecido a 550

C (10 C). Em seguida, o cadinho com a amostra seca foi carbonizado em

chapa aquecedora e incinerado em mufla a 550 C (10 C), at que o material se

tornou branco ou cinza claro. O material foi colocado em dessecador por cerca de

20-30 minutos para esfriar e pesado novamente (AOAC, 2005).

A quantificao do teor de carboidratos do leite foi realizada por diferena

de acordo com a seguinte equao: Carboidrato (%) = % Extrato Seco Total (%

Gordura + % Protena + % Cinzas) (AOAC, 2005).

4.6.1.3 Cor

Foram realizadas medidas de cor nos queijos segundo mesmo mtodo

descrito no item 4.4.6. Cada amostra de queijo Minas Frescal controle (CO) e

adicionado de leo essencial de pimenta rosa (OEPR) foi devidamente colocada

em placa de acrlico e levada porta de reflectncia do colormetro para leitura.

As leituras foram realizadas em duplicata para cada processamento. Foram

calculadas as mdias e desvios padro de cada parmetro avaliado.

4.6.1.4 Perfil de textura instrumental (TPA)

O perfil de textura instrumental dos queijos CO e OEPR foi determinado

com auxlio do Analisador de Textura Brookfield (Modelo CT3), segundo

adaptao do mtodo descrito por Maruyama et al., 2006. As anlises foram

realizadas em duplicata no terceiro dia de fabricao. Foi realizado teste de dupla

compresso, utilizando probe cilndrico de acrlico com 25 mm de dimetro,

realizando compresso de 80% da altura inicial. A velocidade empregada no teste

e no pr-teste foi de 2 mm.s-1 e no ps teste de 10 mm.s-1. Os queijos estavam

armazenados sob refrigerao at o momento da anlise. Foram retirados

32

pedaos com as seguintes dimenses: altura de 3,5 cm; comprimento 2,0 cm e

largura 1,0 cm.

As amostras foram analisadas temperatura ambiente (25 C) e os

parmetros de textura determinados foram: dureza, coesividade, gomosidade e

elasticidade. A coleta dos dados e a construo das curvas de perfil de textura

foram realizadas com auxlio do software Texture Pro CT V 1.4 Build 17.

4.6.2 Anlises microbiolgicas dos queijos

Foi inoculado S. aureus nos queijos objetivando verificar o efeito do leo

essencial em inibir o seu desenvolvimento. As cepas utilizadas foram cultivadas

em caldo infuso de crebro e corao (BHI) e incubadas em B.O.D. a 37 C. Os

estoques foram iniciados a partir das culturas do Laboratrio de Microbiologia de

Alimentos do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito

Santo (UFES) em caldo BHI e estriadas em gar padro para contagem (PCA).

As clulas foram coletadas por centrifugao a 3000 g por 15 minutos,

lavadas em soluo salina peptonada 0,1% e ressuspensas em soro de leite

drenado durante a produo do queijo. Foi feita uma srie de diluies seriadas

em soro de leite e as bactrias foram adicionadas massa do queijo (contagem

inicial 1x105 UFC.g-1). A massa foi homogeneizada manualmente por 2 minutos e

enformada. Os queijos com aproximadamente 100 g foram para incubadora

B.O.D. a 4 C, em embalagens plsticas esterilizadas. Paralelamente, foi

realizado tratamento controle, sem adio de leo essencial.

Para a contagem de S. aureus, coliformes e fungos e leveduras nos queijos

controle (CO) e adicionado de leo essencial de pimenta rosa microencapsulado

(OEPR) foram coletadas amostras de 11g de cada queijo devidamente

homogeneizados em 99 mL de soluo salina peptonada 0,1%. Estas amostras

foram devidamente diludas e plaqueadas.

Foi utilizado Petrifilm especfico para contagem de S. aureus; Escherichia

coli e coliformes respectivamente. Para a contagem de fungos e leveduras foi

utilizado o meio de cultura gar batata glicose 2%, acidificado com pH prximo a

3,5, e temperatura de incubao de 25 1 C. Para acidificao foi utilizado cido

tartrico 10%. Foi inoculado 1,0 mL das diluies e adio de gar batata glicose

2% acidificado a pH 3,5.

33

A contagem de coliformes, Eschericia coli e fungos e leveduras ocorreu no

tempo 0. A contagem de S.aureus ocorreu nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 15 e 30 dias.

Os resultados foram expressos em UFG.g de queijo.

4.6.3 Anlises sensoriais

4.6.3.1. Teste de ordenao-preferncia

O teste de ordenao foi realizado para verificar a formulao mais

preferida pelos julgadores, a fim de definir a concentrao de leo essencial de

pimenta rosa do queijo Minas Frescal. Foi realizado segundo mtodo descrito por

Carneiro e Minim (2010), no Laboratrio de Anlise Sensorial do Centro de

Cincias Agrrias da Universidade Federal do Esprito Santo, em cabines

individuais temperatura ambiente.

Para o teste de ordenao-prefercia, participaram 73 julgadores no

treinados. Foi apresentada aos julgadores, uma bandeja com uma srie de 4

amostras codificadas com nmeros aleatrios de trs dgitos, de maneira

casualizada e balanceada juntamente com uma ficha de avaliao conforme

Figura 5. Estas amostras tiveram as seguintes concentraes de leo essencial:

0,005; 0,010; 0,015 e 0,020%, denominadas FA, FB, FC e FD, respectivamente.

As amostras foram servidas em cubos de aproximadamente 2 cm de aresta e

colocados em pratos descartveis. Foi solicitado aos julgadores que analisassem

sensorialmente as amostras e as ordenassem de acordo com a sua preferncia,

marcando sua resposta na ficha de avaliao. A amostra mais preferida deveria

receber o nmero 1; 2 para a segunda mais preferida, e assim sucessivamente.

34

Figura 4: Ficha para o teste de ordenao-preferncia (adaptao Minim, 2010)

4.6.3.2. TESTE DE ACEITAO

Os queijos produzidos foram submetidos a testes de aceitao sensorial.

Participaram 69 julgadores no treinados que avaliaram os seguintes atributos:

aparncia, sabor, textura e impresso global.

Os testes de aceitao foram realizados segundo metodologia descrita por

Reis e Minim (2010) no Laboratrio de Anlise Sensorial da Universidade Federal

do Esprito Santo, em cabines individuais temperatura ambiente.

As amostras foram servidas individualmente, em cubos de

aproximadamente 2 cm de aresta em pratos descartveis e codificadas com 3

dgitos, sendo servidas as duas amostras de forma aleatria e balanceada entre

os consumidores. Junto com cada amostra foi apresentada uma ficha de

avaliao conforme Figura 06.

A aceitao do queijo foi avaliada por meio de escala hednica de nove (9)

pontos sendo a menor nota 1 (desgostei extremamente), e a maior nota 9 (gostei

extremamente).

35

Figura 5: Modelo de Ficha de avaliao utilizada no teste de aceitao sensorial

(adaptao de Minim, 2010)

Juntamente com a aceitao sensorial, foi solicitado aos julgadores que

verificassem a inteno de compra do produto. Foi utilizada escala hednica de

cinco (5) pontos, sendo a menor nota 1 (certamente no compraria) e a maior

nota 5 (certamente compraria).

36

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Extrao do leo essencial de pimenta rosa

Na Tabela 2, esto apresentados dados mdios de extrao do leo

essencial de pimenta rosa. Todas as extraes foram feitas por um perodo de

trs horas. A partir dos dados de extrao calculou-se a densidade do leo. O

rendimento foi calculado comparando a quantidade de leo essencial de pimenta

rosa extrado da massa de pimenta rosa moda.

Tabela 2: Dados mdios de extrao de leo essencial de pimenta rosa.

Pimenta moda

(g)

Volume leo

(cm3)

Massa do

leo

(g)

Densidade

g/cm3

Rendimento

%

466,67 19,66 19,93 2,47 17,21 1,91 0,87 0,05 4,08 0,39%

Clemente (2006), ao extrair leo essencial de frutos maduros de pimenta

rosa, obteve 4,65% de rendimento em relao matria seca, valor muito

prximo ao encontrado no presente estudo. J nos estudos realizados por Bertoldi

(2006) foram encontrados valores mdios em torno de 7%. Com isso, pode-se

concluir que a composio da pimenta rosa varia, influenciando no rendimento da

extrao do seu leo. Alm disso, o mtodo de extrao tambm pode afetar o

seu rendimento.

5.2 Caracterizao do leo essencial de pimenta rosa

5.2.1 Composio qumica

De todo o leo essencial extrado, devidamente homogeneizado, foi

retirada uma amostra para determinao de sua composio qumica. Na Tabela

3 esto apresentados os dados de composio qumica do leo essencial de

pimenta rosa.

Foram determinados os componentes majoritrios do leo essencial, com

identificao de 95,36 % dos constituintes (Tabela 3). Podemos verificar que o -

careno, um monoterpeno, foi encontrado em maior concentrao. Este composto

37

se caracteriza pelo sabor doce, pungente, encontrado no leo essencial

(BERTOLDI, 2006).

Tabela 3: Composio do leo essencial de pimenta rosa

Componente tR % (rea)

-careno 3 12,578 42,49

d-limoneno 13,433 15,37

-felandreno 12,257 14,68

-pireno 9,049 10,29

mirceno 11,737 5,70

acetato de benzila 13,223 1,64

Cariofileno 31,854 1,39

-cardineno 36,331 1,29

-terpinoleno 16,326 1,17

Naftaleno 34,353 0,80

-pireno 10,902 0,55

Total 95,36

tR: Tempo de reteno

A composio qumica do leo essencial depende diretamente da

composio dos frutos utilizados para extrao do leo. Lloyd et al. (1977)

caracterizaram os terpenos dos frutos da aroeira (Schinus terebinthifolius Raddi),

concluindo que os componentes majoritrios so: -pireno, -pinene, sabinene,

careno, felandreno, limoneno cymeno e torpinoleno. Pode-se verificar que estes

componentes tambm foram encontrados no presente estudo. A concentrao de

cada componente pode variar de acordo com a regio, poca do ano, horrio de

coleta dos frutos entre outros fatores.

Clemente (2006), ao avaliar ao caracterizar frutos e leo essencial de

pimenta rosa, verificou que a composio varia de acordo com o estado de

38

maturao dos frutos, sendo bastante diferente entre frutos verdes e maduros.

Portanto este outro fator a ser considerado na determinao da composio dos

leos essenciais. Ao determinar a composio do leo essencial de pimenta rosa

Pawlowski et al. (2012) tambm encontraram resultados bastante similar aos

encontrados neste trabalho. Portanto as caractersticas do leo essencial

encontrado neste estudo esto relacionadas com os frutos utilizados neste

experimento, seu estgio de maturao, poca de colheita dos frutos e tempo de

secagem.

A atividade antimicrobiana e antioxidante do leo essencial depende da

sua composio. Ao analisar a atividade antioxidante do leo essencial de

pimenta (Piper nigrum), Baghe et al. (2014) constataram que os componentes

como -cariofileno, limoneno, sabinene, -pinene, 3-careno, -pireno esto

relacionados com o potencial antioxidante deste leo. A presena destes

componentes no leo extrado no presente estudo justifica a avaliao de sua

capacidade antioxidante.

5.2.2 Atividade antioxidante

Para a determinao da atividade antioxidante, foi utilizada diluio de 0,5

mL do leo essencial de pimenta rosa em 10 mL lcool etlico absoluto, e a leitura

foi realizada em duplicata. Na Tabela 4 so apresentados os valores mdios de

mols de trolox por mL de leo essencial das trs repeties, assim como o

des