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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
DANIEL LUNA LUCETTI
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA
DO ACETATO DE LUPEOL ISOLADO DE Himatanthus drasticus (MART.) PLUMEL
– APOCYNACEAE (JANAGUBA)
FORTALEZA-CE
2010
DANIEL LUNA LUCETTI
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA
DO ACETATO DE LUPEOL ISOLADO DE Himatanthus drasticus (MART.) PLUMEL
– APOCYNACEAE (JANAGUBA)
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia do Departamento
de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Ceará,
como requisito parcial para a obtenção do grau
de Mestre em Farmacologia.
Orientador (a):
Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
FORTALEZA – CE
2010
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde
L968a Lucetti, Daniel Luna
Avaliação das atividades antiinflamatória e antinociceptiva do acetato de lupeol isolado de
Himatanthus drasticus (MART.) Plumel – Apocynaceae (Janaguba)/ Daniel Luna Lucetti. – 2010.
101 f. : il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2010.
Orientação: Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
1. Terpeno 2. Apocynaceae 3. Hymatanthus drasticus 4. Inflamação 5. Medição da dor I.
Viana, Glauce Socorro de Barros (orient.). II. Título.
CDD: 615.1
DANIEL LUNA LUCETTI
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIINFLAMATÓRIA E ANTINOCICEPTIVA
DO ACETATO DE LUPEOL ISOLADO DE Himatanthus drasticus (MART.) PLUMEL
– APOCYNACEAE (JANAGUBA)
Dissertação submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia
da Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre em
Farmacologia.
Aprovada em 10/09/2010
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________
Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
_____________________________________________________
Profa. Dra. Flávia Almeida Santos
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________________
Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa
Universidade Federal do Ceará
À CRISTO, minha luz no caminho do senhor DEUS. A Ele toda honra e Glória.
Agradeço por tantas bênçãos alcançadas.
A minha esposa, Elaine C. Pereira Lucetti, responsável pelas maiores alegrias da minha
vida. Obrigado pela paciência, persistência, auxílio e carinho a mim dedicados em todos os
momentos.
Aos meus pais, Markos Lucetti e Valma Luna, pelos inúmeros sacrifícios em prol da minha
formação intelectual. Pela inabalável confiança em mim depositada e pela abnegação
pessoal em favor da plena felicidade dos filhos.
As minhas amadas irmãs, Anya Luna Lucetti e Dayanne Luna Lucetti, que embora separadas
de mim pela distância, sempre se fizeram presentes nos momentos mais importantes da minha
vida.
Ao meu avô e eterno torcedor, Hilário Lucetti, que foi chamado à presença do senhor antes
de ter a chance de vibrar por mais essa vitória alcançada pelo neto. Agradeço por todas as
histórias e lições, que tão importante foram na formação do meu caráter.
Á mestre, Profa. Dra. Glauce Viana, por ter me aberto as portas do mundo da pesquisa
científica, me honrando com seu conhecimento, confiança e amizade.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Glauce Viana, por ter me acolhido como orientando no meu retorno ao meio
acadêmico, pelo tempo e empenho dedicados na orientação desse trabalho e acima de tudo
pela doação de experiência e conhecimentos;
À Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa, que no início da minha vida como
pesquisador tanto me engrandeceu com valiosas lições que até hoje me norteiam;
À Profa. Dra. Luzia Kalyne Almeida M. Leal, pela co-orientação e colaboração indispensável
na realização deste trabalho;
À Profa. Dra. Mary Anne Bandeira, por ter fornecido a substância testada;
À Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito, pela inestimável contribuição no estudo
histopatológico, mostrando-se sempre solícita.
Às Profa. Dra. Silvânia Vasconcelos, pela atenção, confiança, gentileza e inestimável amizade
dispensada a mim e a minha esposa;
À Profa. Dra. Danielle Silveira Macedo, pela amizade e atenção dispensada a mim dês de a
iniciação científica;
À Vilani Rodrigues Bastos, pelo apoio técnico, companheirismo e parceria que ao longo do
tempo transformou-se em uma amizade verdadeira. Pelo exemplo de força e superação que
ela representa para aqueles que, como eu, tem a satisfação de conviver com este “patrimônio”
do Laboratório de Neurofarmacologia.
Ao amigo, Prof. Dr. Iri Sandro, que foi o principal incentivador do meu retorno ao meio
acadêmico, quando, cordialmente, doou parte de seu tempo na orientação dos meus estudos
durante o período de preparação para a seleção do mestrado;
À amiga Monalisa Ribeiro Silva, pela confiança e disponibilidade.
As bolsistas do laboratório de farmacognosia, Aline Holanda, Helenicy Veras e Amanda
Lopes pela dedicação e disponibilidade em ajudar em tudo que fosse necessário;
A Faculdade de medicina de Juazeiro do Norte – FMJ, por ter permitido que boa parte dos
experimentos fossem realizados em suas instalações;
As técnicas do departamento de biofisiologia da Faculdade de Medicina de Juazeiro – FMJ,
Ivina e Xênia, por terem me acolhido e ajudado em boa parte dos experimentos desse
trabalho, e por quem hoje tenho grande apreço.
RESUMO
Avaliação das atividades antiinflamatória e antinociceptiva do Acetato de Lupeol isolado
de Himatanthus drasticus (Mart.) PLUMEL – Apocynaceae (Janaguba). DANIEL LUNA
LUCETTI. Orientador (a): Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana. Dissertação de
Mestrado. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, UFC, 2010.
O Acetato de lupeol (FAL), isolado do látex extraído do caule de Himatanthus drasticus
(APOCYNCEAE), é quimicamente classificado como sendo um triterpeno pentacíclico
pertencente à classe do lupano, foi avaliado em modelos de nocicepção e inflamação. No teste
das contorções abdominais induzidas por ácido acético (10 ml/kg, i.p.) em camundongos, a
FAL (50 e 100 mg/kg, i.p.) reduziu de forma significativa o número de contorções
abdominais em 56 e 61%, respectivamente, e a indometacina (10 mg/kg, i.p.) reduziu em
66%. No teste da formalina, a FAL (25 e 50 mg/kg, i.p.) reduziu de forma significativa o
tempo gasto pelo animal lambendo a pata, tanto na fase inicial (21 e 46,5%, respectivamente)
quanto na fase tardia (57,6 e 61,3%, respectivamente) e a morfina (7,5 mg/kg, i.p.) reduziu em
62 e 91%, respectivamente. O pré-tratamento com Naloxona (2 mg/kg, i.p) reverteu de modo
significativo, os efeitos da FAL e da morfina tanto na fase inicial quanto na tardia do teste da
formalina. No edema de pata induzido por carragenina, a FAL (10, 25 e 50 mg/kg,i.p.)
reduziu de modo significativo, o volume do edema na 1ª, 2ª e 3ª hora após a aplicação da
carragenina (1%, 50µl, s.p.). Análise histopatológica do tecido de pata de camundongo
submetido à carragenina, demonstrou reduções significativas no edema e do infiltrado celular.
Na marcação imunohistoquímica, em tecido de pata de camundongo submetida ao estímulo da
carragenina, a FAL (50mg/kg, i.p.) promoveu uma discreta redução na expressão de TNF- α,
porém causou uma significante redução dos níveis de iNOS teciduais. No edema de pata
induzido por dextrano, a FAL (12,5 e 25 mg/kg, i.p.) reduziu de modo significativo, o volume
do edema na 2ª e 3ª hora após a aplicação de dextrano (12%, 50µl, s.p.). Na peritonite
induzida por carragenina, a FAL (1, 10 e 20 mg/kg, i.p.) diminuiu de forma significativa, o
número de leucócitos em 56, 80 e 92%, respectivamente. A Pentoxifilina (1 e 25mg/kg, i.p.)
inibiu em 39 e 68%, respectivamente o número de leucócitos. No teste da inibição da
atividade da enzima mieloperoxidase (MPO), a FAL (10, 25, 50 e 100 µg/ml) reduziu a
atividade da MPO em 36, 80, 79 e 74 %, respectivamente. A FAL não demonstrou atividade
antioxidante no teste do DPPH. Em conjunto, esses dados revelam que a FAL apresenta
atividade antinociceptiva, que pode ser explicada pela habilidade deste composto em
mimetizar efeitos de opióides endógenos, e antiinflamatória, explicada pela diminuição da
expressão de TNF-α e iNOS, bem como pela diminuição da atividades da mieloperoxidase,
resultando na inibição da migração de leucocitária para o foco da inflamação.
Palavras-chave: Terpeno. Inflamação. Medição da dor
ABSTRACT
Evaluation of antiinflammatory and antinociceptive activities of Lupeol Acetate isolated
from Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel - Apocynaceae (janaguba). DANIEL LUNA
LUCETTI. Supervisor: Prof. Dr. Glauce Socorro de Barros Viana. Master Dissertation.
Program of Post-graduation in Pharmacology. Department of Physiology and
Pharmacology, UFC, 2010.
The lupeol acetate (FAL), isolated from the latex extracted of the stem of Himatanthus
drasticus (APOCYNCEAE) is chemically classified as a pentacyclic triterpene belonging to
the lupane class, was evaluated in nociception and inflammation models. In the writhing test
induced by acetic acid (10 ml/kg, i.p.) in mice, FAL (50 and 100 mg/kg, i.p.) significantly
reduced the number of writhing in 56 and 61%, respectively, and indomethacin (10 mg/kg,
i.p.) reduced by 66%. In the formalin test, FAL (25 and 50 mg/kg, i.p.) significantly reduced
the time spent by the animal licking the paw, both in the initial phase (21 and 46.5%,
respectively) and in the late phase (57 , 6, and 61.3%, respectively) and morphine (7.5 mg/kg,
i.p.) reduced by 62 and 91%, respectively. Pretreatment with naloxone (2 mg/kg, i.p.)
significantly reversed the effects of FAL and morphine in both the early and in late phase in
formalin test. In the carrageenan induced paw oedema, FAL (10, 25 and 50 mg/kg, i.p.)
reduced in significant way the oedema volume in the 1st, 2
nd and 3
rd hour after carrageenan
application (1%, 50μl, s.p.). Histopathologic analysis of mice paw tissue subjected to
carrageenan, showed significant reductions in oedema and cellular infiltration. In the
immunohistochemical staining in mice paw tissue subjected to carrageenan stimulus, the FAL
(50mg/kg, i.p.) induced a slight reduction in the expression of TNF-α, but caused a significant
reduction of tissue iNOS levels. In the dextran induced paw oedema, FAL (12.5 and 25
mg/kg, i.p.) significantly reduced the oedema volume in the 2nd
and 3rd
hour after dextran
application (12%, 50μl, s.p.). In carrageenan-induced peritonitis, FAL (1, 10 and 20 mg/kg,
i.p.) significantly reduced the number of leukocytes at 56, 80 and 92%, respectively.
Pentoxifylline (1 and 25mg/kg, i.p.) inhibited by 39 and 68%, respectively, the number of
leukocytes. In the myeloperoxidase (MPO) enzyme inhibition test, FAL (10, 25, 50 and 100
µg/ml) reduced the activity of MPO at 36, 80, 79 and 74%, respectively. The FAL showed no
antioxidant activity in DPPH test. Together, these data reveal that the FAL has antinociceptive
activity, which can be explained by its ability in mimicking the endogenous opioids effects,
and antiinflammatory, explained by TNF-α and iNOS expression decreased, as well as by the
myeloperoxidase activity decreasing, resulting in inhibition of leukocyte migration to the
focus of inflammation.
Keywords: Terpene. Inflammation. Pain measurement.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Distribuição geográfica do Himatanthus drasticus ............................................. 18
FIGURA 3. Folhas (a), flores (b), fruto (c) de Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel-
Apocynaceae. ............................................................................................................................ 19
FIGURA 2. Himatanthus drasticus (A) e casca (B). .............................................................. 19
FIGURA 4. Estrutura química dos compostos fundamentais das principais famílias de
triterpenos pentacíclicos. .......................................................................................................... 22
FIGURA 5. Estrutura química do acetato de lupeol. ............................................................... 24
FIGURA 6. Representação esquemática do comportamento leucocitário frente a um estímulo
inflamatório local. ..................................................................................................................... 28
FIGURA 7. Oxidação da L - arginina em L – citrulina liberando óxido nítrico (NO) ............ 35
FIGURA 8. Ilustração do mecanismo de ação do NO endógeno e exógeno (iNO) ativando
GCs, aumentando os níveis de GMPc e conduzindo a diminuição de Ca2+ intracelular com
consequente relaxamento muscular (vasodilatação)................................................................. 36
FIGURA 9. Esquema de obtenção do acetato de lupeol ........................................................ 44
FIGURA 10. Efeito do acetato de lupeol no teste de contorções abdominais induzidas por
ácido acético em camundongos. ............................................................................................... 53
FIGURA 11. Efeito do acetato de lupeol no edema de pata induzido por carragenina em
camundongos. ........................................................................................................................... 57
FIGURA 12. Análise histológica de tecidos extraídos das patas de camundongos tratados
com acetato de lupeol e indometacina i.p., no teste de edema de pata induzido por
Carragenina. .............................................................................................................................. 59
FIGURA 13. Fotomicrografias de imunohistoquímica para TNF-α de tecidos extraídos das
patas de camundongos tratados com acetato de lupeol e indometacina i.p., no teste de edema
de pata induzido por carragenina .............................................................................................. 61
FIGURA 14. Fotomicrografias de imunohistoquímica para iNOS de tecidos extraídos das
patas de camundongos tratados com acetato de lupeol e indometacina i.p., no teste de edema
de pata induzido por carragenina .............................................................................................. 63
FIGURA 15. Efeito do acetato de lupeol no edema de pata induzido por dextrano em
camundongos. ........................................................................................................................... 65
FIGURA 16. Efeito do acetato de lupeol na reação inflamatória aguda induzida pela
administração de carragenina em peritônio de camundongo (peritonite). ................................ 67
FIGURA 17. Efeito do acetato de lupeol na degranulação de neutrófilos humano estimulados
pelo PMA, determinados pela atividade da mieloperoxidase(MPO). ...................................... 69
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Algumas das principais moléculas de adesão envolvidas no processo
inflamatório. ............................................................................................................................. 29
TABELA 2. Lista de drogas e regentes / origem ..................................................................... 41
TABELA 3. Lista de equipamentos / fabricantes .................................................................... 42
TABELA 4. O efeito da administração do acetato de lupeol (LAF), sobre o comportamento
da dor no teste. .......................................................................................................................... 55
TABELA 5. Avaliação do efeito anti-oxidante do acetato de lupeol, mensurado através da
atividade de captação de radicais livres (ACR), no teste do DPPH. ........................................ 70
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Porcetagem
µg Micrograma
µL microlitro
µm micrômero
ADP Adenosina Dinucleotídeo Fosfato
ANOVA Análise de Variância
ATP Adenosina trifosfato
Cg Carragenina
DAINES Drogas antiinflamatórias não-esteroidais
Dexa Dexametasona
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil)
E.P.M Erro Padrão da Média
eNOS Isoforma endotelial da enzima óxido nítrico sintase
(Endothelial form of nitric oxide synthase)
FAD Flavina adenina dinucleotídeo
FAL Fração acetato de lupeol
fMLP N-formil-metil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina
FMN Flavina adenina mononucleotídeo
G grama
H Hora
HE Hematoxilina-Eosina
i.p. Intraperitoneal
ICAM-1e ICAM-2
Moléculas de adesão intercelular-1 e 2 (do inglês:
Intercellular Adhesion Molecule)
IFN-α ou γ Interferon alfa ou gama
IL -8 Interleucina-8
IL-12 Interleucina-12
iNOS Isoforma induzida da enzima óxido nítrico sintase
(do inglês:
inducible form of nitric oxide synthase)
L-NA Nitro-L-arginina
L-NIL L-aminoettil-lisina
L-NIO Lσ-iminoetil-L-ornitina
L-NMMA Nω-Monometil-L-arginina
LPS Lipolissacarídeo bacteriano
MG miligrama
Min Minuto
mL Mililitro
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
associado com o íon hidrogênio
NFκβ Fator de transcrição nuclear Kappa B (do inglês:
Nuclear factor Kappa B
nNOS Isoforma neuronal da enzima óxido nítrico sintase
NOS Óxido nítrico (do inglês: Nitric oxide)
P.M.A Acetato de Formol Miristato
PAF Fator de ativação de plaquetas (do inglês: platelet
activator factor)
PCAM-1 Molécula de adesão de célula endotelial e plaqueta
PG Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandina E2
PMN Polimorfonucleares
PTX Pentoxifilina
S Segundo
s.c. Subcutânea
SNC Sistema nervoso central
TBXA2 Tromboxano A2
TNF - α Fator de Necrose tumoral – alfa
UI Unidades Internacionais
VCAM Molécula de adesão celular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 13
1.1 Plantas medicinais ............................................................................................................ 13
1.2 Plantas com atividade antiinflamatória .......................................................................... 15
1.3 Gênero Himatanthus ........................................................................................................ 16
1.3.1 Himatanthus drasticus (MART.) PLUMEL ............................................................... 17
1.3.2 Compostos da classe dos triterpenos ............................................................................ 20
1.3.3 Química dos triterpenos ................................................................................................ 21
1.3.4 Farmacologia pré-clínica do lupeol e do acetato de lupeol ........................................ 22
1.4 Processo Inflamatório ...................................................................................................... 24
1.4.1 Alterações vasculares .................................................................................................... 25
1.4.2 Eventos celulares ........................................................................................................... 27
1.4.3 Mediadores inflamatórios ............................................................................................. 30
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ................................................................................ 38
3 OBJETIVO .......................................................................................................................... 39
3.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 39
3.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 39
4 MATERIAIS ........................................................................................................................ 40
4.1 Material Botânico ............................................................................................................. 40
4.2 Animais .............................................................................................................................. 40
4.3 Drogas e reagentes ............................................................................................................ 41
4.4 Equipamentos ................................................................................................................... 42
5 MÉTODOS ........................................................................................................................... 43
5.2 Modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético. .................................. 45
5.3 Teste da formalina ............................................................................................................ 45
5.4 Modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos ..................... 46
5.5 Análise imunohistoquímica de TNF-α e iNOS ............................................................... 46
5.6 Avaliação Histopatológica ................................................................................................ 47
5.7 Modelo de edema de pata induzido por dextrano em camundongos ........................... 47
5.8 Indução, por carragenina, da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de
camundongos ........................................................................................................................... 48
5.9 Efeito da FAL sobre a degranulação leucocitária, mensurada pela atividade da
enzima mieloperoxidase (MPO) ............................................................................................ 49
5.9.1 Obtenção de leucócitos polimorfonucleares (PMNs) .................................................. 49
5.9.2 Degranulação dos PMNs ............................................................................................... 49
5.9.3 Determinação da atividade da MPO ............................................................................ 50
5.10 Determinação in vitro da atividade antioxidante pelo método do DPPH (2,2-difenil-
1-picrilhidrazil) ....................................................................................................................... 50
5.11 Análise Estatística ........................................................................................................... 51
6 RESULTADOS .................................................................................................................... 52
6.1 Determinação da atividade antinociceptiva do acetato de lupeol (FAL) ..................... 52
6.1.1 Teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos .... 52
6.1.2 Teste da formalina em camundongos .......................................................................... 54
6.2 Determinação da atividade antiinflamatória do acetato de lupeol (FAL) ................... 56
6.2.1 Modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos .................. 56
6.2.2 Análise histológica de tecidos extraídos das patas de camundongos tratados com
acetato de lupeol e indometacina no teste de edema de pata induzido por carragenina. 58
6.2.3 Efeito do acetato de lupeol na marcação imunohistoquímica para TNF-α .............. 60
6.2.4 Efeito do Acetato de lupeol na marcação imunohistoquímica para iNOS ............... 62
6.2.5 Modelo de edema de pata induzido por dextrano em camundongos ........................ 64
6.2.6 Peritonite induzida por carragenina em camundongos ............................................. 66
6.3 Avaliação da atividade antioxidante do acetato de lupeol ............................................ 70
7 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 71
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 78
9 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 80
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 81
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Plantas medicinais
O homem, durante o processo de evolução, utilizou diversas maneiras os recursos
oferecidos pela natureza, com a finalidade de buscar condições para sua sobrevivência e
melhor adaptação ao meio em que vive (DI STASI, 1996). Achados arqueológicos indicam
que os seres humanos vêm utilizando plantas como medicamentos por quase 60.000 anos
(SOLECKI et al., 1975) e os primatas superiores por aproximadamente 5 a 6 milhões de anos
(GIBBONS, 1992; HUFFMAN, 2003).
Alguns povos como chineses, árabes, caldeus, egípcios e incas dominaram, no
passado, os segredos da ação das plantas sobre o organismo humano. Na Idade Média e na
Era Moderna, as escolas médicas só diplomavam aqueles que demonstrassem um profundo
conhecimento sobre as plantas medicinais (YUNES et al., 2001).
No Brasil, a história da utilização de plantas, no tratamento de doenças, apresenta
influências da cultura africana, indígena e européia (MARTINS et al., 2000). A contribuição
dos escravos africanos com a tradição do uso de plantas medicinais, em nosso país, se deu por
meio das plantas trazidas consigo que eram utilizadas em rituais religiosos, e também por suas
propriedades farmacológicas empiricamente descobertas. Os índios que viviam aqui
utilizavam grande quantidade de plantas medicinais e, por intermédio dos pajés, este
conhecimento das ervas locais e seus usos foi transmitido e aprimorado de geração em
geração. Os primeiros europeus que chegaram ao Brasil depararam-se com estes
conhecimentos, que foram absorvidos por aqueles que passaram a viver no país e a sentir a
necessidade de viver do que a natureza lhes tinha a oferecer, e também pelo contato com os
índios que passaram a auxiliá-los como “guias”. Tais fatos fizeram com que os europeus
ampliassem seu contato com a flora medicinal brasileira e a utilizassem para satisfazer suas
necessidades alimentares e medicamentosas (LORENZI et al., 2002).
Os produtos naturais têm sido a maior fonte de fármacos por séculos, como
demonstrado com o isolamento da morfina a partir do ópio no início do século XIX e o
isolamento de outros fármacos que se seguiram como a cocaína, codeína, digitoxina e quinina
14
(BUTLER, 2004; NEWMAN et al., 2000). Estima-se que atualmente 25% a 30% dos
medicamentos utilizados derivam de produtos naturais. Além disso, o Brasil tem uma das
maiores biodiversidades do mundo, possuindo cerca de 20-22% de todas as plantas e
microorganismos existentes no planeta (CALIXTO, 2005; GREENWALD, 1998). Alguns
trabalhos vêm mostrando importantes resultados acerca da utilização de produtos naturais em
diferentes patologias (BUTLER, 2004; GULLO et al., 2006).
Como já descrito, o tratamento e a cura de muitas doenças através da utilização de
plantas vêm sendo feita ao longo da história. Ainda hoje, em regiões mais pobres do país e até
mesmo nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são comercializadas (MACIEL,
2002). Embora plantas medicinais sejam muitas vezes o único recurso terapêutico de
comunidades e grupos étnicos, o conhecimento agregado perante toda essa biodiversidade
ainda é pequeno (CALIXTO, 2005; MACIEL, 2002).
Na Região Nordeste do Brasil, o uso de plantas medicinais e preparações caseiras
assumem importância fundamental no tratamento das patologias que afetam as populações de
baixa renda, tendo em vista a deficiência da assistência médica, a influência da transmissão
oral dos hábitos culturais e a disponibilidade da flora (MATOS, 1989).
Apesar de a medicina convencional ter superado muitas dessas terapias, ressurgiu
nos últimos anos um grande interesse, especialmente pela indústria farmacêutica, em
examinar os potenciais recursos dos produtos naturais pelos efeitos medicinais que produzem
(ZHANG et al., 2001). Dessa forma, a indústria tem se voltado ao conhecimento popular a
fim de adquirir informações terapêuticas que foram sendo acumuladas durante séculos.
Ressurgindo das pequenas comunidades, a cultura medicinal tem despertado também o
interesse de pesquisadores, em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por
exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem os conhecimentos
sobre a inesgotável fonte medicinal natural, sendo um caminho promissor e eficaz para
descobertas de novos medicamentos (MACIEL, 2002).
A Portaria nº 886, de 20 de abril de 2010, do Ministério da Saúde, institui a
Farmácia Viva no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS). Com isto, favorece a ampliação
da oferta de fitoterápicos e de plantas medicinais que atendam à demanda e às necessidades da
população em geral.
15
1.2 Plantas com atividade antiinflamatória
O crescente avanço nas técnicas de biologia molecular vem propiciando o melhor
conhecimento do processo inflamatório, das moléculas que o constitui e de seus alvos de
ações. Diferentemente dos recentes fármacos disponíveis na clínica, é descrito na literatura
que muitas plantas medicinais utilizadas no tratamento de processos inflamatórios, exercem
suas atividades antiinflamatórias por mecanismos multifatoriais. Isto ficou claro em estudo
realizado por Trouillas et al. (2003), onde relatou-se a correlação entre atividade
antiinflamatória e antioxidante em plantas medicinais amplamente utilizadas na medicina
popular francesa, tais como Filipendula ulmaria, Alchemilla vulgaris, Rosmarinius officinalis,
Urtica dioiica, Equisetum arvense, Betula pendula, Ilieracium pilosella, Achiellea
millefolium, Lithospermum officinal, Cynara scolymus, Lamium album, Vaccinium myrtillus,
Chamomilla recutia, Humulus lupulus, Meliotus officinalis e Lotus corniculatus.
Muitas plantas que apresentam atividade antiinflamatória já tiveram os compostos
responsáveis por tal atividade isolados e caracterizados, como por exemplo, os terpenos e
flavonóides presentes na Matricaria recutita (apigenina, α-bisabolol e azuleno), os triterpenos
da Calêndula officinalis (taraxasterol e o lupeol), as lactonas sesquitêrpenicas da Arnica
Montana (helenalina), os triterpenos da Glycyrrhiza glabra (glicirrizina ou ácido glicirrízico),
Rosmarinus officinalis (ácido ursólico, ácido oleanólico e ácido micromerico) e os
sesquiterpenos da Cordia verbenaceae (α-humuleno) (ALTINIER et al., 2007; FERNANDES
et al., 2007; BLUMENTHAL, 2003; AKAMATSU et al., 1991).
Na China, onde o uso de plantas medicinais é bastante antigo, a Laggera
pterodonta mostrou ótimo resultado em modelos de pleurisia com redução de PGE2, além de
inibir a infiltração celular em modelo de inflamação crônica – cotton pellet (WU et al., 2006).
A Carapa guianensis, uma espécie rica em tetranotriterpenóides, é bastante
utilizada na medicina popular amazônica para dores e inflamações; em modelos experimentais
reduziu infiltração leucocitária, níveis de IL-1β e inibiu as vias de sinalização do NF-κB
(PENIDO et al., 2006).
A Marlierea obscura (Myrtaceae) pertence à família Myrtaceae e são utilizadas na
medicina popular como antidiabéticas, antidiarréicas, antireumáticas, adstringentes,
antiinflamatórias e no tratamento de úlceras crônicas. Estudos fitoquímicos prévios
demonstraram que esta família é rica em componentes flavonóides, quercitina e quercitrina
16
(JALVEZ et al., 1993) e componentes fenólicos do ácido elágico e metilelágico (AMARAL et
al., 2001) os quais possuem conhecida atividade antioxidante.
1.3 Gênero Himatanthus
Por apresentarem características morfológicas semelhantes Mueller Argoviensis
classificou as espécies Himatanthus e Plumeria como sinônimos (MABBERLEY, 1997).
Woodson em 1938, em revisão ao trabalho de Mueller, confirmou a proposta de autoria de
Willdenow, que previa a separação dos gêneros Plumeria e Himatanthus. Examinando todas
as espécies e as referências bibliográficas, Plumel em 1991, confirmou a separação dos
gêneros em questão, fornecendo informações adicionais baseando-se na pesquisa de
abundante material botânico. Ainda foi possível distinguir 13 espécies desse gênero, entre as
quais, várias espécies descritas inicialmente por Mueller Argoviensis e reclassificadas por
sinonímia por Woodson, sendo elas: Himatanthus articulatus (Vahl) Woodson, Himatanthus
attenuatus (Benth.) Woodson, Himatanthus bracteatus (A. DC.) Woodson, Himatanthus
drasticus (Mart.) Plumel, Himatanthus fallax (Müll. Arg.) Plumel, Himatanthus lancifolius
(Müll. Arg.) Woodson, Himatanthus obovatus (Müll. Arg.)Woodson, Himatanthus
phagedaenicus (Mart.) Woodson, Himatanthus semilunatus Markgr., Himatanthus speciosus
(Müll. Arg.) Plumel, Himatanthus stenophyllus Plumel, Himatanthus sucuuba (Spruce)
Woodson e Himatanthus tarapotensis (K. Schum.) Plumel.
As espécies do gênero Himatanthus apresentam sua distribuição restrita a região
neotropical ocorrendo desde o Panamá até o sudeste do Brasil, tendo como limite sul o trópico
de Capricórnio. A maioria das espécies do gênero ocorre na região amazônica, com as demais
espécies distribuídas fora da região amazônica (extra-amazônica) na costa e no centro-oeste
do Brasil. As espécies H. drasticus e H. bracteatus apresentam distribuição restrita ao Brasil,
ocupando respectivamente áreas de cerrado, campo rupestre, caatinga e de mata atlântica
(SPINA, 2004).
Muitas espécies do gênero Himatanthus, foram e estão sendo estudadas com
relação a sua constituição química, entre elas: H. articulatus, H. sucuuba, H. phagedaenicus e
H. lancifolius (COIMBRA, 1994). Com isso, várias classes químicas e algumas substâncias
17
de interesse medicinal foram isoladas e relatadas nos últimos anos, porém muito pouco se
conhece a respeito do potencial farmacológico dessas substâncias.
1.3.1 Himatanthus drasticus (MART.) PLUMEL
A espécie Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel pertence à subclasse Asteridae,
ordem Gentianales, família Apocynaceae e subfamília Plumeriodeae. Na Figura 1
percebemos que se trata de uma planta de ocorrência exclusiva no Brasil, estando presente nos
estados de Minas Gerais, Bahia, Sergipe, Alagoas, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Ceará,
Paraíba, Piauí, Maranhão, Pará e Roraima. É conhecida popularmente como tiborna, jasmim-
manga e raivosa em Minas Gerais e Bahia, e como janaguba no Ceará, pau-de-leite no Piauí,
joanaguba no Rio Grande do Norte. Cresce em altitudes de 200-1500 metros e em vegetação
de transição entre Cerrado e Caatinga. Floresce e frutifica praticamente o ano todo (SPINA,
2004).
No Ceará, essa espécie ocorre com maior freqüência na Chapada do Araripe,
extremo sul do estado, onde é explorada pela população daquela localidade, de forma
indiscriminada (AMARO et al., 2006a).
De acordo com Lorenzi e Matos (2002); Modesto (1997), a H. drasticus (Figura
2A) é uma espécie arbórea que pode atingir sete metros de altura, com folhagem densa nas
extremidades dos ramos, folhas ovais (Figura 3A), subcoriáceas, brilhantes, glabras, verde
escuro, com ápice arredondado a obtuso e pecíolos curtos. Possui flores brancas (Figura 3B),
aromáticas, fruto tipo folículo (Figura 3C), em forma de chifre, medindo entre 15 e 20 cm de
comprimento por 2,5cm de largura e sementes com alas concêntricas. A casca é rugosa
(Figura 2B) e exsuda um látex branco bastante utilizado na medicina popular, principalmente
pelos habitantes da região de ocorrência.
A casca da janaguba tem sido utilizada pela medicina popular na forma de
infusão, para o tratamento de tumores, gastrite, artrite e hemorróida. As compressas de folhas
frescas esmagadas são utilizadas contra herpes, impingem e verrugas. Existem ainda algumas
indicações sobre o uso na forma de chás (infusão ou decocção) contra irritação na uretra e
inflamação no útero (KAPLAN, 1967).
O leite da janaguba, como é chamado o látex pela população local, tem uma longa
18
história de emprego na cura do câncer no Nordeste, porém, quase sem registro na literatura
(AMARO et al., 2006b), também é utilizado para o tratamento de verminoses, gastrites e
artrites
(SPINA, 2004)
FIGURA 1. Distribuição geográfica do Himatanthus drasticus
19
Foto: Chapada do Araripe (SOUSA,
2008).
FIGURA 3. Folhas (a), flores (b), fruto (c) de Himatanthus drasticus (Mart.) Plumel-
Apocynaceae.
Foto: Chapada do Araripe (SOUSA, 2008).
FIGURA 2. Himatanthus drasticus (A) e casca (B).
A
B
B A C
20
Baseado no uso popular da H. drasticus, devido à suas ações antitumoral,
antifúngica e antiinflamatória (LARROSA; DUARTE, 2005), os estudos com esta planta têm
sido intensificados. Estudos realizados demonstraram que o látex de H. drasticus não possui
efeito citotóxico ou caráter hemolítico em testes in vitro, mas demonstrou efeitos antitumorais
in vivo (MOUSINHO et al., 2008). Colares (2008) demonstrou o efeito gastroprotetor do látex
em modelo de lesão gástrica induzida por etanol e indometacina.
1.3.2 Compostos da classe dos triterpenos
Triterpenos ou triterpenóides são metabólitos secundários não-esteroidais
presentes nas floras terrestre, marinha e na fauna, constituindo-se os componentes
majoritários em algumas plantas usadas na medicina tradicional, com ocorrência na forma
livre, bem como na forma de éteres, ésteres e glicosídeos. Como o nome deixa entender,
triterpenóides são isopentenóides compostos de 30 átomos de carbono, com esqueleto acíclico
do tipo mono-, di-, tri-, tetra- ou pentacíclico (MAHATO; KUNDU, 1994).
São originados da via do acetato-mevalonato a partir de uma unidade de isopreno,
uma estrutura com cinco átomos de carbono. A classificação dos terpenos é feita de acordo
com a quantidade de unidades isopreno: hemiterpenóides, C5; monoterpenóides, C10 e
sesquiterpenóides, C15 (componentes dos óleos essenciais, que contribuem para o aroma das
plantas); diterpenóides, C20; triterpenóides, C30; tetraterpenos (ou carotenóides), C40
(VICKERY; VICKERY, 1981).
Algumas plantas contêm grandes quantidades de triterpenóides em seu látex e
resinas cujas funções fisiológicas destes compostos é geralmente creditada a sua defesa
química contra patógenos e herbívoros (MAHATO, 1997).
Cotidianamente nos deparamos, de forma direta ou indireta, com diversos tipos de
compostos terpênicos, como por exemplo, os mono- e sesqui-terpenos compondo óleos
essenciais e contribuindo com o aroma de diversas espécies de plantas, tetraterpenos-
carotenóides abundantes em nossa alimentação e os politerpenos, do quais o mais importante
é o látex utilizado na fabricação de borracha (PATOČKA, 2003).
21
Os terpenos constituem uma família de compostos essenciais ao crescimento,
desenvolvimento e sobrevivência de cada organismo vivo, exercendo diversas atividades
biológicas em animais, incluindo o homem. Os terpenos possuem funções essenciais na
manutenção da estabilidade da membrana (esteróis), transporte de elétrons (ubiquinona,
menaquinona, plastoquinona), glicosilação de proteínas (dolicol) e regulação do
desenvolvimento celular (hormônios) (McCASKILL; CROTEAU, 1998).
Há um crescente interesse em triterpenóides de origem natural causado tanto
pelos aspectos da extração e análise estrutural destes compostos, como também pelo fato de
apresentar um amplo espectro de atividades biológicas, tais como, bactericida, fungicida,
antiviral, analgésica, anticarcinogênica, espermicida e antialérgica (PATOČKA, 2003). Por
exemplo, Ling et al., (1982) estudaram a relação entre a estrutura química e a atividade
antineoplásica de alguns triterpenóides pentacíclicos e tetracíclicos. Embora as aplicações
destes metabólitos secundários como agentes terapêutico sejam ainda limitadas, um grande
interesse na exploração das suas atividades tem ocorrido nos últimos anos (MAHATO et al.,
1992).
Sobre o ponto de vista biológico, os terpenóides são extremamente importantes. A
principal evidência do interesse científico e econômico por estas substâncias é o número de
citações presentes no banco de dados Pubmed (www.pubmed.com). Elas excediam 200.000
citações para a palavra chave “terpene” e 4.000 para a palavra “terpene and inflammation”,
até o dia 15 de Agosto de 2010.
1.3.3 Química dos triterpenos
Triterpenos compreendem um grande número de diferentes tipos de compostos
que são divididos em famílias de acordo com a estrutura química. Dentre os principais grupos
de triterpenóides e seus glicosídeos estão os derivados pentacíclicos de ursano, gamacerano,
lupano e hopano (PATOCKA, 2003).
A literatura indica para os triterpenos uma diversidade muito ampla quanto a
esqueleto carbônico e funcionalização. Os grupos funcionais, predominantemente oxigenados,
podem ser de qualquer espécie e é comum a ocorrência de triterpenos com mais de um grupo
funcional oxigenado (OLEA; ROQUE, 1990).
22
Os triterpenos pentacíclicos são baseados em um esqueleto formado por 30
átomos de carbonos dispostos em cinco anéis de seis membros (ursanos e gamacerano) ou
quatro anéis de seis membros e um de cinco membros (lupanos e hopanos) (figura 4).
FIGURA 4. Estrutura química dos compostos fundamentais das principais famílias de
triterpenos pentacíclicos.
Ursano Gamacerano
Lupano Hopano
1.3.4 Farmacologia pré-clínica do lupeol e do acetato de lupeol
Recentemente, muitos centros de pesquisa têm concentrado seus estudos nas
atividades biológicas dos derivados de lupano, em especial nas propriedades
antiinflamatórias, antineoplásicas e antivirais. Os experimentos conduzidos usando vários
modelos farmacológicos têm revelado que muitos desses compostos exercem uma significante
ação antiinflamatória, como o ácido oleanólico, e seus glicosídeos, isolados da calêndula
(Calendula officinalis) (SZAKIEL et al., 1995), a escina isolada da castanha-da-índia
23
(Aesculus hippocastanum) (SIRTORI, 2001) e a glicirrizina isolada do alcaçuz (Glycyrrhiza
glabra) (OLUKOGA; DONALDSON, 2000).
Dentre os derivados do lupano, um dos mais estudados é o lupeol. Ele é
encontrado em vegetais tais como repolho, pimentão, pepino, tomate, em frutas como a oliva,
figo, manga, morango, uvas vermelhas, e em plantas medicinais, como no ginseng americano
(BEVERIDGE et al., 2002; SALEEM, 2009).
O lupeol possui descritas várias atividades farmacológicas tais como antiofídica,
hepatoprotetora, cardioprotetora, antitumoral e antiinflamatória (CHATTERJEE et al., 2006;
FERNANDEZ et al., 2001; PREETHA et al., 2006; SALEEM et al., 2004; SUDHAHAR et
al., 2007).
O lupeol tem sido amplamente estudado pelo seu poder de suprimir os efeitos da
inflamação em modelos experimentais, tanto in vivo como in vitro (SALEEM, 2009). De
acordo com Fernandez et al., (2001), a aplicação tópica de lupeol nas doses de 0,5 e 1
mg/orelha, reduziu significantemente o edema produzido por 12-o-tetradecanoil-formol
acetato (TPA) no modelo de edema de orelha. No mesmo estudo a aplicação tópica de lupeol
diminuiu de forma significativa os níveis de mieloperoxidase (marcador específico da
atividade de neutrófilos), causando redução na infiltração de células em tecidos inflamados de
camundongos.
Existem poucos estudos quanto às possíveis propriedades farmacológicas dos
derivados de Lupeol. Estes demonstraram que os derivados palmitato, linoleato e acetato de
lupeol possuem notáveis propriedades antiinflamatórias, sendo estas superiores até mesmo
que às da indometacina em modelos experimentais (LIMA et al., 2007; RAMIREZ et al.,
2004; SUDHAHAR et al., 2008).
O Acetato de lupeol (Figura 5) foi isolado a partir do látex proveniente do caule
de Himatanthus drasticus e é um derivado esterificado do lupeol também presente em outras
espécies do mesmo gênero, como na Himatanthus articulata (BARRETO et al.,1998) e na
Himatanthus sucuuba (SILVA, et al., 1998).
24
FIGURA 5. Estrutura química do acetato de lupeol.
H3C
O1
2
34
56
7
8910
11
12
13
1415
24 23
25
2'
1'
26
27
1817
16
1922
28
29
2030
21
O
Assim como a maioria dos derivados do lupeol, o derivado acetilado apresenta
algumas atividades biológicas já descritas na literatura. Um estudo recente demonstrou que a
fração acetato de lupeol isolada do látex de Zanthoxylum rhoifolium possui notável efeito
antinociceptivo (PEREIRA et al., 2010). A inibição da expressão de mediadores inflamatórios
mostrou ser um dos mecanismos de ação do lupeol, tal efeito está ligado tanto à inibição de
citocinas (TNF-α e IL-2), quanto à modulação de fatores nucleares (NFκβ) que regulam a
expressão de mediadores (PEREIRA et al., 2010; SALEEM et al., 2004; LEE et al., 2007).
1.4 Processo Inflamatório
A exposição diária e contínua do organismo a uma variedade de patógenos
ambientais e estímulos lesivos pode causar uma lesão celular e, como conseqüência, um
fenômeno complexo denominado “Processo Inflamatório ou Inflamação”, cujas primeiras
descrições remontam aos papiros egípcios em 3000 a.C. Muitos de seus componentes têm
sido encontrados em todos os vertebrados estudados até o momento, além do fato de que
algumas formas de resposta adaptativa às condições adversas, tais como lesões e infecções,
ocorrerem em todos os animais e plantas (MEDZHITOV, 2008).
A cinética do processo inflamatório pode ser dividida em dois momentos. O
primeiro é desencadeado logo após o dano celular e/ou teciduais decorrentes de infecções
microbianas ou estímulos nocivos de origem química ou física (inflamação aguda).
Caracteriza-se por um aumento da permeabilidade vascular devido à liberação de vários
25
mediadores químicos, como histamina e óxido nítrico. É responsável pelo calor e rubor. Em
seguida a vasodilatação causa o aumento na permeabilidade da microcirculação, que leva ao
extravasamento de fluido rico em proteína (exsudato) para o tecido extravascular causando o
edema. E por último, ocorre a migração de leucócitos do sangue para o local da lesão. Essa
resposta é extremamente importante para a sobrevida do organismo afetado, pois atua em
direção à eliminação de patógenos com a finalidade da manutenção da homeostase do
organismo e reestruturação do tecido lesionado (MAJNO; PALACE, 1961; SCHMID-
SCHONBEIN, 2006).
No segundo momento, que depende da não resolução do processo na fase aguda,
os sinais típicos da inflamação podem não ser aparentes (inflamação crônica). Ela é
caracterizada pela presença de áreas de atividade inflamatória, como exsudato celular de
macrófagos e linfócitos ao lado de áreas de regeneração e/ou reparação tecidual
(BRASILEIRO- FILHO, 2009). A inflamação crônica é considerada um processo prolongado
que pode levar semanas ou até anos de duração. Pode ser observada na fisiopatologia de
muitas doenças como a tuberculose, artrite reumatóide e a doença pulmonar obstrutiva
crônica.
As características apresentadas tanto pela inflamação aguda como crônica podem
ser divididas em alterações vasculares e eventos celulares como descrito abaixo.
1.4.1 Alterações vasculares
As alterações no fluxo e calibre vasculares começam imediatamente após a lesão e
desenvolvem-se em velocidades variáveis, de acordo com a intensidade desta. Após uma
vasoconstrição transitória, de origem neurogênica, mediada por terminações do sistema
nervoso autônomo e que dura poucos segundos, tem início a vasodilatação. Esta envolve
primeiro as arteríolas, levando a abertura de novos leitos capilares, que resulta no aumento do
fluxo sangüíneo para a região, provocando calor e rubor (ROBBINS, 2005).
Nos vasos de pequeno calibre ocorrem modificações que permitem o
extravasamento de um fluído rico em proteínas, chamado de exsudato, para o espaço
extracelular, provocando aumento da pressão oncótica e retenção de água no interstício
(edema). Ocorre também a estase sanguínea advinda do aumento de permeabilidade da
26
microvasculatura, uma vez que o extravasamento de líquidos e proteínas para o interstício
provoca hemoconcentração, aumentando a viscosidade sanguínea e gerando má circulação.
Essas alterações são causadas por substâncias liberadas no local da inflamação, conhecidos
como mediadores inflamatórios. Dentre estes se encontram vários mediadores químicos,
incluindo-se a bradicinina, a serotonina, a histamina e as prostaglandinas da série E e da série
I. Estes dois últimos são metabólitos do ácido araquidônico, formados através da ativação da
via das ciclooxigenases. Essas enzimas coexistem nas isoformas constitutivas, que produzem
prostaglandinas em quantidades fisiológicas, e nas isoformas induzidas, que produzem
prostaglandinas em grandes quantidades, sendo estas as principais responsáveis pelos eventos
inflamatórios (BHANDARI et al., 2005; ROBBINS, 2005). Dentre os mediadores com
propriedades vasoativas, a bradicinina está entre as primeiras substâncias a serem liberadas na
inflamação. Trata-se de um neuropeptídeo produzido a partir do precursor plasmático
chamado cininogênio pelas proteases conhecidas como calicreínas, sua vida média é curta
(cerca de 15 minutos) e sua formação se dá a partir de vários fatores, como lesão tecidual,
reações alérgicas e outros eventos inflamatórios. Sua ação local produz dor, aumento da
permeabilidade vascular e vasodilatação mediada pela produção de fatores de relaxamento
vascular derivados do endotélio (EDRFs).
Já foi demonstrado que o óxido nítrico (NO) é um dos EDRFs liberados pelas
células endoteliais, que participa do controle do fluxo sangüíneo, da expressão de moléculas
de adesão e do aumento da permeabilidade vascular induzida pelo fator ativador de plaquetas
(PAF) e pela própria bradicinina (HARDMAN; LIMBIRD, 2003; MELLO; LAURINDO,
2000; MAYHAN, 1992;). O aumento da permeabilidade vascular pode ocorrer por diferentes
mecanismos, dependendo dos receptores ativados na célula endotelial ou da lesão provocada
no vaso sanguíneo. Propõe-se que a histamina e leucotrienos causam contração endotelial;
interleucina-1 (IL-1) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) participam da reorganização
citoesquelética endotelial; leucócitos ou agentes agressores provocam lesão vascular direta e
extravasamento de fluidos; fator de crescimento endotelial vascular gera aumento da
transcitose e neovascularização, que também provoca extravasamento de fluidos. O exsudato
contém vários mediadores que influenciam as células adjacentes e os próprios vasos
sanguíneos e incluem os componentes de quatro cascatas enzimáticas do plasma: sistema do
complemento, sistema da coagulação, sistema fibrinolítico e sistema das cininas (ROBBINS,
2005).
A reação inflamatória é caracterizada pelo acúmulo local de leucócitos
polimorfonucleares no tecido lesado que migram de vasos adjacentes. Os mecanismos de
27
acúmulo no local da lesão são complexos e dependem de uma seqüência de eventos que
compreendem a marginação, rolamento, adesão, migração em direção ao estímulo
quimiotático, fagocitose e degradação intracelular, ocorrendo também a liberação extracelular
de produtos de leucócitos (ROBBINS, 2005)
1.4.2 Eventos celulares
Os leucócitos são células sanguíneas que compreendem os granulócitos
(neutrófilos, eosinófilos e basófilos), relacionados à resposta imune inespecífica, e os
monócitos e linfócitos, relacionados à resposta imune específica. Os neutrófilos, que
constituem aproximadamente 63% dos leucócitos, são células polimorfonucleares (PMNs)
que apresentam núcleo segmentado e grânulos específicos em seu citoplasma (LORENZI,
2006).
Em relação aos processos celulares na inflamação, sabe-se que os leucócitos
desempenham papel fundamental na ativação e manutenção do estado inflamatório. Após um
estímulo lesivo, os polimorfonucleares neutrófilos e os monócitos se dispõem junto às paredes
internas dos pequenos vasos para depois atravessarem por diapedese e atingirem a área lesada,
sendo os neutrófilos as principais células do infiltrado em lesões agudas. Para que isto seja
possível, as etapas abaixo especificadas são necessárias (ROBBINS, 2005; COUSSENS;
WERB, 2002; MEDZHITOV, 2008; MELLO; LAURINDO, 2000; STEVENS; LOWE,
2002)
Com a diminuição do fluxo sanguíneo no início da inflamação, graças ao aumento
da permeabilidade vascular, ocorre a marginação dos leucócitos ao longo da superfície do
endotélio; Há ativação de moléculas de adesão da família das selectinas (P e E-selectinas),
que facilitam o rolamento destas células pelo endotélio vascular; Os leucócitos são ativados e
aderem ao endotélio, sendo imobilizados com o auxílio das moléculas de adesão da família
das integrinas e das imunoglobulinas; Com o tempo, o endotélio passa a ser revestido de
leucócitos (pavimentação).
Estas células passam por transmigração pelo endotélio, com o auxílio de proteases
extracelulares e de moléculas de adesão da família das imunoglobulinas, como a PECAM;
Após este extravasamento, os leucócitos migram para o tecido em direção ao local da lesão
28
por um processo denominado quimiotaxia; Ocorre acúmulo de leucócitos no foco
inflamatório, seguido de fagocitose e liberação de enzimas lisossômicas, metabólitos ativos
derivados do oxigênio e produtos do metabolismo do ácido araquidônico (prostaglandinas -
PGs – e leucotrienos - LTs), para uma efetiva destruição do agente lesivo.
Após a fagocitose, os neutrófilos sofrem apoptose e são removidos por
macrófagos ou pelos vasos linfáticos.
Diversas moléculas estão envolvidas no rolamento, adesão e transmigração
leucócito/endotélio. Os leucócitos possuem moléculas de adesão da família das selectinas (L-
selectina) e integrinas (VLAs, LFA-1, MAC-1), assim como glicoproteínas com resíduos de
carboidratos. O endotélio, por sua vez, possui P e E selectinas, imunoglobulinas e integrinas
(BRASILEIRO-FILHO, 2009).
As selectinas fazem parte de uma família de glicoproteínas transmembrana cálcio-
dependentes. A P-selectina é constitutivamente sintetizada por células endoteliais e plaquetas,
fica armazenada nos grânulos de Weibel-Palade, podendo ser rapidamente exposta após
alguns estímulos (TNF-alfa, IL-1, histamina e complemento). A P-selectina tem papel
importante no recrutamento inicial de leucócitos na inflamação. A E-selectina, por sua vez,
tem sua síntese no endotélio e é induzida por IL-1, TNF-alfa, lipopolissacarídeos (LPS) e
As principais etapas envolvem o rolamento de leucócitos (rolling), seguido pela sua adesão e transmigração. No
esquema encontram-se representadas as principais moléculas de adesão envolvidas em cada processo. Fonte:
(ROBBINS, 2005).
FIGURA 6. Representação esquemática do comportamento leucocitário frente a um estímulo
inflamatório local.
29
interferon-gama (IFN-gama) (potencializador). Os ligantes destas duas selectinas são
carboidratos das membranas dos leucócitos, especialmente os grupos Sialil Lewis X. Estão
envolvidas no rolamento de leucócitos (rolling) (BRASILEIRO-FILHO, 2009; PETRI;
PHILLIPSON; KUBES, 2008). As principais imunoglobulinas do endotélio são as ICAM-1 e
2 (molécula de adesão intercelular 1 e 2), VCAM -1 (molécula de adesão vascular) e PCAM -
1 OU CD 31 (molécula de adesão de célula endotelial e plaqueta). Seus ligantes são as
integrinas dos leucócitos (tabela 1). As ICAM-2 são constitutivamente expressas e
armazenadas, sendo rapidamente expostas após serem estimuladas com IL-1, TNF-alfa e
histamina. ICAM-1, VCAM-1 e CD-31, por sua vez, não são constitutivamente expressas,
sendo sua produção induzida por IL-1, TNF-alfa, além de IFN-gama e LPS (BRASILEIRO-
FILHO, 2009).
Adaptado de BRASILEIRO-FILHO, 2009 e JANEWAY, 2000.
TABELA 1. Algumas das principais moléculas de adesão envolvidas no processo
inflamatório.
30
1.4.3 Mediadores inflamatórios
O desencadeamento e a manutenção do estado inflamatório dependem de
inúmeras substâncias conhecidas como mediadores inflamatórios. Podem ser provenientes do
plasma ou secretados por células ativadas, são liberados concomitante ou sequencialmente
nos sítios da lesão, em resposta a um fator etiológico (HAJJAR; PINHEIRO, 1999; MELLO;
LAURINDO, 2000; MEDZHITOV, 2008). Tais mediadores podem ser divididos em:
Proteoglicanas: servem como sítio de ligação dos mediadores, além de uma atividade
regulatória;
Mediadores enzimáticos, como as proteases;
Mediadores quimiotáxicos, como as citocinas, os leucotrienos, o sistema complemento e
o fator ativador de plaquetas (PAF);
Mediadores com propriedades vasoativas, como a histamina, PAF, óxido nítrico (NO),
adenosina e os metabólitos do ácido araquidônico (prostaglandinas e leucotrienos).
A migração unidirecional de células inflamatórias, como neutrófilos e monócitos,
através dos espaços endoteliais ocorre através de um gradiente de concentração de fatores
quimiotáticos. A quimiotaxia é controlada por agentes quimiotáticos, tanto de origem
endógena, que são aqueles liberados pelas próprias células do hospedeiro (produtos da
lipoxigenase, citocinas, etc.), quanto de origem exógena, que são aqueles advindos do próprio
agente agressor (produtos bacterianos de origem lipídica e N-formil-metil-L-metionil-L-
leucil-L-fenilalanina (fMLP). Além destas, existem inúmeras substâncias que, em contato
com o soro, geram fatores quimiotáticos via ativação do sistema complemento. Neste
contexto, a fração C5a do sistema complemento está envolvida com a liberação de
mediadores inflamatórios, incrementa a adesão e ativação leucocitária e é considerado o mais
importante fator quimiotático para mastócitos, PMN e basófilos (MELLO; LAURINDO,
2000).
Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do corpo por serem
recrutados rapidamente ao local da inflamação através da quimiotaxia (ABBAS et al., 2002).
O aumento significativo da atividade da mieloperoxidase (MPO) tem uma proporção direta ao
número de neutrófilos infiltrados no tecido, portanto pode se utilizar sua atividade como
índice de migração leucocitária e de estresse oxidativo (SIMPSON et al., 1988; KOMATSU
et al., 1992; PERALTA et al.,1993).
31
A MPO é uma proteína glicosilada fortemente catiônica e tem um peso molecular
de 144 KD. É constituída por dois dímeros idênticos ligados por uma ponte disulfeto, e possui
um grupo protoporfirina com um íon ferro central (FIEDLER et al., 2000; NAUSEEF;
MALECH, 1986).
O neutrófilo sintetiza H2O2 por ação da enzima superóxido dismutase, daí a MPO
na presença do íon cloreto, converte o H2O2 em ácido hipocloroso (HOCl), agente oxidante
bactericida poderoso que destrói os microorganismos pela halogenação ou pela oxidação de
proteínas e lipídios (peroxidação lipídica). O sistema H2O2 – MPO – hialida é o sistema
bactericida mais eficiente e mais importante presente nos neutrófilos. Outros substratos para
MPO incluem o tiocianto e o nitrito (KETTLE; WINTERBOURN, 1994; KLEBANOFF,
1999; VAN DER VLIET et al., 1997).
Segundo Lau et al. (2005), a MPO ao ligar-se às integrinas CD11b/CD18 nos
PMNs, induzem uma cascata de reações intracelulares que levam a um aumento na
degranulação de PMNs, na expressão de CD11b e na atividade da NADPH oxidase de
maneira autócrina. Assim, diante dessas propriedades a MPO caracteriza-se como um
mediador pró-inflamatório, além das suas atividades bactericida e enzimática.
As citocinas são moléculas protéicas ou glicoprotéicas solúveis, de baixo peso
molecular, secretadas por diversas células com a finalidade de mediar informações, bem como
modular a função destas células por meio da ativação de receptores de superfície. Os efeitos
biológicos são variados e dependem da citocina liberada e do tipo de célula envolvida. De um
modo geral, as citocinas influenciam a ativação, a divisão, a apoptose e a quimiotaxia celular.
Estas podem também estar envolvidas na diferenciação celular, na inflamação, na imunidade
e no reparo tecidual (HANADA; YOSHIMURA, 2002; PARKIN; COHEN, 2001). Elas são
classificadas em 3 grupos: citocinas antivirais (IFN-gama, IL-15 e IL-12); citocinas pró-
inflamatórias (TNF-alfa, IL-1, IL-6, quimiocinas) e citocinas regulatórias (IL-10) (HAJJAR;
PINHEIRO, 1999).
Além de agirem diretamente sobre as células, algumas citocinas induzem a
formação de outras citocinas (formando uma cascata de amplificação), enquanto algumas
induzem a expressão dos receptores de outras citocinas, outras podendo apresentar interações
sinérgicas ou antagônicas com outras citocinas. A IL-6, por exemplo, é uma citocina
multifatorial secretada por todas as células quando lesadas ou ativadas por IL-1 e/ou TNF-α.
De outro modo, citocinas como a IL-4, IL-6, IL-10, IL-13 e IFN- α são eficientes em inibir in
vitro a síntese de IL-1 e TNF-α. As citocinas incluem peptídeos tanto pró-inflamatórios
quanto antiinflamatórios (ROBBINS, 2005).
32
Um dos mais importantes mediadores inflamatórios da classe das citocinas é o
TNF-α. Trata-se de uma glicoproteína da membrana plasmática celular, sintetizada na forma
de um precursor de 233 aminoácidos, com peso molecular de 26 kDa e constituída por um
domínio intracelular (ou citoplasmático), um domínio extracelular transmembrana
(BRADLEY, 2008).
Diversos tipos celulares são capazes de produzir e secretar o TNF-α após
estimulação apropriada. No entanto, os monócitos e os macrófagos são as principais fontes,
produzindo grandes quantidades dessa citocina. Outros tipos celulares incluem os linfócitos T,
os neutrófilos, as células endoteliais e os mastócitos, sendo estas últimas, ainda, capazes de
estocar o TNF-α em grânulos citoplasmáticos (AKIRA et al., 1990; GORDON et al., 1990).
Após estímulos físicos (luz ultravioleta, radiação-X ou calor), químicos e imunológicos,
ocorre a liberação de TNF-α por essas células. Adicionalmente, o próprio TNF-α, o LPS, a IL-
1, o INF-γ ou a fração C5a do complemento são capazes de estimular a liberação dessa
citocina. In vivo, o TNF-α é a citocina pró-inflamatória mais rapidamente produzida e seus
níveis séricos são detectáveis, em camundongos, em 30 minutos (TRACEY et al., 1987).
Acredita-se que o TNF-α, rapidamente liberado, é proveniente dos estoques transmembrana
pré-formados, em macrófagos, neutrófilos e células T ativadas, pela ação da enzima de
conversão de TNF-α (TACE) e liberação de grânulos citoplasmáticos de mastócitos e
eosinófilos (BLACK et al., 1997). A liberação subseqüente de TNF-α ocorre através de nova
síntese dessa citocina, em macrófagos e linfócitos T. Nesse sentido, a síntese de TNF-α é
regulada em níveis transcripcionais e pós-transcripcionais (ANDERSON, 2000; BIRAGYN;
NEDOSPASOV, 1995; HAN et al., 1990; LEWIS et al., 1998; RAABE et al., 1998;
VASSALLI, 1992).
As ações biológicas do TNF-α incluem um amplo espectro de efeitos. Sabe-se que
está diretamente envolvido na patogênese do choque séptico induzido por bactérias gram-
negativas e na patogênese da caquexia (DINARELLO, 1991). O TNF-α participa de vários
eventos inflamatórios, como a ativação de neutrófilos e conseqüente degranulação, produção
de intermediários reativos de oxigênio, aumento da citotoxicidade para certos patógenos,
aumento da atividade fagocítica, quimiotaxia de monócitos, bem como o aumento da
expressão das moléculas de adesão P-selectina, E-selectina e ICAM-1. Ainda, esta citocina
induz a reorganização dos filamentos de actina em células endoteliais, estimula a produção de
protaglandina E2 (PGE2), proliferação de fibroblastos e induz a síntese de proteínas de fase
aguda no fígado. Além disso, o TNF-α induz a produção de citocinas como a IL-1 e IL-6 por
células endoteliais e por macrófagos e de INF-γ por linfócitos T (AKIRA et al., 1990;
33
ALESSIO et al., 1998; EIGLER et al., 1997; GOLDBLUM et al., 1993; VASSALI, 1992).
Neste sentido, a produção desses mediadores da inflamação é reduzida quando ocorre
bloqueio da liberação rápida de TNF-α.
Dentre os mediadores com propriedades vasoativas, a histamina e a serotonina são
especialmente importantes, pois são os primeiros mediadores liberados durante a inflamação
aguda. Tipicamente, a histamina está distribuída por todos os tecidos sendo os mastócitos sua
principal fonte de liberação. Ela provoca a dilatação de pequenos vasos sanguíneos,
resultando em rubor, diminuição da resistência periférica total e aumento da permeabilidade
capilar, que ocorre pela ligação da histamina com seu receptor H1 nas células endoteliais
(ROBBINS, 2005).
A serotonina ou 5-hidroxitriptamina tem ações similares às da histamina sobre a
permeabilidade vascular em vênulas pós-capilares, na vigência de uma inflamação aguda.
Está presente nas plaquetas e sua liberação acontece quando agregados plaquetários entram
em contato com colágeno, trombina, difosfato de adenosina (ADP) e complexos antígeno-
anticorpo (MELLO; LAURINDO, 2000).
O sistema das cininas gera peptídios vasoativos a partir de proteínas plasmáticas,
o cininogênio, através de proteases específicas denominadas de calicreínas. A ativação desse
sistema resulta na liberação da bradicinina, um nonapetídio vasoativo (ROBBINS, 2005). Sua
vida média é curta (cerca de 15 minutos) e sua formação se dá a partir de vários fatores, como
lesão tecidual, reações alérgicas e outros eventos inflamatórios. Sua ação local produz dor,
aumento da permeabilidade vascular e vasodilatação, esta última mediada pela produção de
óxido nítrico e de prostaglandinas pelas células endoteliais vasculares (HARDMAN;
LIMBIRD, 2003; MELLO; LAURINDO, 2000).
O ácido araquidônico é um ácido graxo de 20 carbonos liberado a partir de
fosfolipídeos de membrana através da enzima fosfolipase-A2, a qual pode ser ativada por
diversos estímulos (químico, inflamatório, traumático) (MEDZHITOV, 2008). Duas grandes
rotas do metabolismo do ácido araquidônico em células de mamíferos correspondem à via da
ciclooxigenase e a via da lipoxigenase. Prostanóides incluindo prostaglandinas e tromboxano
A2 são produzidos pela via da ciclooxigenase (COX), já os leucotrienos são produzidos pela
via da 5-lipoxigenase (LOX) (YOSHIKAI, 2001).
Diante de um trauma tissular, por exemplo, o acúmulo local destes mediadores
leva à sensibilização periférica da dor, levando à hiperalgesia. Além disso, a PGE2 e a
prostaciclina (PGI2) são importantes na vasodilatação inflamatória e no incremento da
permeabilidade vascular e quimiotaxia promovida por outros mediadores. O Tromboxano A2
34
(TXA2), por sua vez, é um potente agente de agregação plaquetária e vasoconstritor,
rapidamente convertido à sua forma inativa TXB2. Além disso, as prostaglandinas também
estão envolvidas na patogênese da febre e dor na inflamação.
A enzima ciclooxigenase (COX) possui duas isoformas denominadas COX-1 e
COX-2. A atividade da COX-1 predomina em condições fisiológicas, agindo como
citoprotetora gástrica e mantenedora da homeostase renal e plaquetária. A COX-2 é conhecida
como uma enzima induzida em situações de trauma tissular e inflamação. A partir deste
princípio, o mecanismo de ação das drogas antiinflamatórias não-esteroidais baseia-se na
inibição, cada vez mais seletiva, da COX-2, a fim de minimizar os efeitos colaterais
relacionados a uma inibição não-seletiva. No entanto, a descoberta da presença constitutiva da
COX-2 em tecidos humanos e animais levanta o questionamento sobre a real vantagem desta
inibição específica pela qual buscam os mais recentes antiinflamatórios (FONSECA;
VILORIA; REPETTI, 2002; KUMMER; COELHO, 2002; MELLO; LAURINDO, 2000). Por
outro lado, as lipoxinas e as resolvinas derivadas de ácidos graxos ômega-3 da dieta e as
protectinas inibem a inflamação e promovem o reparo tecidual (MEDZHITOV, 2008).
O óxido nítrico (NO) é uma pequena molécula lipofílica gasosa, capaz de
difundir-se facilmente através das membranas biológicas, descrito inicialmente como fator
relaxante derivado do endotélio (EDRF). Trata-se, na verdade, de um radical livre,
extremamente reativo dentre uma série de óxidos de nitrogênio, que pode reagir com outros
radicais, formando espécies tão ou mais biologicamente ativas do que a molécula original
(BRUCKDORFER, 2005).
O NO é biossintetisado a partir do aminoácido L-arginina (L-arg), através da ação
das enzimas óxido nítrico sintases (NOS). Tais enzimas catalisam uma série de eventos óxido-
redutores, onde, inicialmente a L-arg é oxidada ao intermediário NGhidroxi- L-arginina
(NOH-L-arg), que posteriormente é convertido em L-citrulina (Lcit) e NO. Ambos os passos
requerem oxigênio molecular (O2) e fosfato de nicotinamida-adenina dinucleotídeo (NADPH)
como substratos, além de tetraidrobiopterina (BH4), flavina-adenina dinucleotídeo (FAD),
flavina mononucleotídeo (FMN), proteína do choque térmico, ferroprotoporfirina IX (heme) e
calmodulina/Ca2+
como co-fatores, os quais se ligam a sítios específicos das enzimas no
processo de transferência de elétrons (ARUL; KONDURI, 2009; BARRETO et al., 2005;
REID, 1998) (Figura 2).
35
FIGURA 7. Oxidação da L - arginina em L – citrulina liberando óxido nítrico (NO)
Fonte: adaptado de Barreto et al. (2005).
O NO é capaz de permear rapidamente através de membranas biológicas,
conforme mostrado na figura 7, o que lhe confere uma grande capacidade de poder interagir
rapidamente, após sua liberação, com a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) localizada em
células próximas, resultando em aumento das concentrações de monofosfato cíclico 3’, 5’ de
guanosina (GMPc). Este, por sua vez, estimula a proteína quinase dependente de GMPc
(PKG), a qual pode fosforilar diversas proteínas (ARUL; KONDURI, 2009; MONCADA et
al., 1991). Na musculatura lisa vascular, a PKG pode ativar canais para K+, induzindo
hiperpolarização, ou estimular a saída de Ca2+
do citoplasma da célula, levando à
vasodilatação. A PKG pode, igualmente, diminuir a sensibilidade da maquinaria contrátil ao
Ca2+
, diminuindo a contração muscular (MONCADA et al., 1991). A ativação de canais para
K+ diretamente pelo NO, sem envolver a participação do GMPc, também tem sido descrita
(FERNANDES et al., 2002).
O NO é rapidamente inativado em combinação com a hemoglobina no sangue
para formar hemoglobina nitrosilada e então oxidada em metemoglobina e nitratos e nitritos
inorgânicos (ARUL; KONDURI, 2009).
36
FIGURA 8. Ilustração do mecanismo de ação do NO endógeno e exógeno (iNO) ativando
GCs, aumentando os níveis de GMPc e conduzindo a diminuição de Ca2+ intracelular com
consequente relaxamento muscular (vasodilatação).
Foram identificadas três diferentes isoformas de NOS em células de mamíferos
(produtos de diferentes genes): NOS endotelial (eNOS ou NOS III) em células endoteliais,
epiteliais e miócitos cardíacos; NOS neuronal (nNOS ou NOS I) em neurônios, células
musculares esqueléticas e neutrófilos (GREENBERG et al., 1998) e a NOS induzida (iNOS
ou NOS II), em macrófagos, hepatócitos, células musculares lisas (TITHERADGE, 1999). A
eNOS e nNOS são classificadas como enzimas constitutivas e dependentes de cálcio,
enquanto que a iNOS é classificada como uma enzima induzida, cujas ações independem de
aumento na concentração de Ca2+ por mecanismos dependentes de tirosina quinases sem o
requerimento de agonistas para esses receptores. Esse processo pode ser induzido por
estímulos físicos, como o estresse de cisalhamento produzido pela força mecânica do
turbilhonamento sanguíneo que, através da proteína quinase B (PKB), fosforila diretamente a
iNOS, ativando-a (BRUCKDORFER, 2005).
37
A expressão de iNOS é regulada via fator de transcrição nuclear, dentre eles o
fator de transcrição nuclear kappa B (NFκB) (ALDERTON et al., 2001). Esta enzima pode
ser induzida em células como macrófagos, células endoteliais, células da musculatura lisa
vascular e miócitos cardíacos, após estímulo por LPS, citocinas (IL-12, TNF-K, IFN-3, IL-6),
entre outros (CHAN; FISCUS, 2004).
Em presença de oxigênio, o NO é rapidamente metabolizado em radicais nitrito
(NO2) e nitrato (NO3-), podendo reagir também com ânion superóxido, originando os
peroxinitritos, que são considerados responsáveis pela sua ação lesiva ao tecido. As ações do
NO vão desde a influência sobre a função imune de macrófagos, ação como neurotransmissor
no sistema nervoso central (SNC) e periférico e no relaxamento de vasos sanguíneos.
(DAWSON; DAWSON, 1995; SAUTEBIN et al, 1998).
O NO possui uma série de ações consideradas pró-inflamatórias: é um potente
vasodilatador, aumenta a permeabilidade vascular e induz a produção de prostaglandinas; no
entanto, outras de suas propriedades podem ser consideradas antiinflamatórias, tais como a
redução da agregação plaquetária e da adesão de leucócitos, apesar deste último parâmetro
mostrar dados controversos na literatura (MELLO; LAURINDO, 2000).
Eventos patológicos têm sido associados à liberação excessiva de NO, tais como o
choque séptico (THIERMERMANN; VANE, 1990), doenças neurodegenerativas (JENNER;
OLANOW, 1996), inflamação aguda e crônica, doenças auto-imunes e aterosclerose (RANG;
DALE, 2007). Foi proposto que níveis elevados de NO estariam associados a dano tecidual
nessas patologias. Assim, agentes capazes de modular a atividade das NOS, particularmente a
iNOS, teriam um considerável valor terapêutico.
38
2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Atualmente, alguns dos principais alvos relacionados à pesquisa com plantas
medicinais são os problemas oriundos de processos inflamatórios. A relação entre os produtos
obtidos de fontes naturais e as ações antiinflamatórias e analgésicas é antiga e tem sido objeto
de estudos incessantes na busca de uma substância com efeito terapêutico ideal. Neste
contexto, os triterpenos pentacíclicos têm sido vastamente investigados.
Partes da Himatanthus drasticus tem sido utilizadas pela medicina popular para o
tratamento de inflamações dos mais diversos tipos (KAPLAN, 1967). Do gênero Himatanthus
já foram já foram isoladas várias substâncias biologicamente ativas da classe dos triterpenos.
Várias atividades biológicas já foram descritas na literatura, como atividades antimalárica,
antineoplásica, gastroprotetora e analgésica (COIMBRA, 1994).
Por não haver na literatura trabalhos que reportem as atividades farmacológicas do
acetato de lupeol isolado de H. drasticus, e tendo como referência resultados obtidos com
compostos da mesma classe química, isolados de outras espécies de plantas, vimos nessa
substância um grande potencial farmacológico.
39
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade antinociceptiva e antiinflamatória do acetato de lupeol (FAL), um
triterpeno natural de Himatanthus drasticus, em modelos experimentais de dor e inflamação
aguda em camundongos, bem como investigar os possíveis mecanismos envolvidos.
3.2 Objetivos específicos
Avaliar a atividade antinociceptiva da FAL, empregando modelos de dor e nocicepção
como contorções abdominais induzidas por ácido acético e teste da formalina em
camundongos;
Avaliar a atividade antiflamatória da FAL nos modelos de edema de pata induzido por
carragenina e dextrano e no modelo da peritonite induzida por carragenina em
camundongos;
Realizar a análise histopatológica e análise imunohistoquímica para TNF-α e iNOS no
edema de pata induzido por carragenina em camundongos;
Determinar o efeito da FAL sobre a degranulação de neutrófilos, através de
determinação da atividade enzimática da mieloperoxidase in vitro;
Avaliar a capacidade antioxidante da FAL pelo método do DPPH in vitro.
40
4 MATERIAIS
4.1 Material Botânico
O látex de H. drasticus foi coletado na Chapada do Araripe, região sul do Estado
do Ceará, com autorização do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis. A identificação da planta foi realizada através de exsicatas que foram submetidas
a comparação com as já registradas no Herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do
Ceará (UFC) (n º 31.685). O acetato de lupeol foi obtido a partir do látex extraído do caule de
Himatanthus drasticus no Laboratório de Farmacognosia do Departamento de Farmácia da
UFC pela Profa. Dra. Mary Anne Bandeira. Para os experimentos, o acetato de lupeol foi
solubilizado em 1% de Tween 80 em água destilada.
4.2 Animais
Camundongos albinos (Mus musculus), variedade Swiss Webster, adultos,
machos, pesando entre 25-30 g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da UFC, foram acondicionados em caixas de polipropileno, à temperatura de 24
± 2ºC, com ciclos de claro/escuro de 12 em 12 h, recebendo ração padrão (Purina Chow) e
água ad libitum.
41
4.3 Drogas e reagentes
TABELA 2. Lista de drogas e regentes / origem
Drogas e reagentes Origem
Ácido acético - PA Vetec, Brasil
Anticorpo biotinilado TNF-alfa; Dako, Dinamarca
Avidina – horseradish peroxidase Vector, U.S.A
Anticorpo biotinilado iNOS; Dako, Dinamarca
Carragenina (λ) Tipo IV Fluka, Suíça
Dextrana Sigma, U.S.A
Tween 80 – Polyoxyethilene Sorbitan Mono-oleate Sigma, U.S.A
Eosina Reagen, Brasil
Hematoxilina Reagen, Brasil
Formaldeído Reagen, Brasil
Dexametasona Ache, Brasil
Indometacina Sigma, U.S.A
Solução fisiológica estéril Gaspar Viana, Brasil
Naloxona Sigma, U.S.A
Sulfato de Morfina Cristalia, Brasil
Heparina Wyeth. U.S.A
Pentoxifilina Sanofi-Aventis, U.S.A
DAB Dako, Dinamarca
PMA Sigma, U.S.A
DPPH Sigma, U.S.A
Violeta de genciana Reagen, Brasil
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4.4 Equipamentos
TABELA 3. Lista de equipamentos / fabricantes
Equipamentos Fabricante
Balança analítica
Modelo H5, Mettler, Suíça.
Balança para animais Filizola ID-1500 – Brasil
Banho Maria Modelo 102/1, FANEN, SP, Brasil.
Pletismômetro Ugo Basile, Itália
Sonicador Modelo PT 10-35. Brinkmann Inc. NY, USA
Cronômetros Incoterm, Brasil
Microscópio óptico Olympos, U.S.A
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5 MÉTODOS
5.1 Obtenção do Acetato de Lupeol
A obtenção do látex da janaguba (Himatanthus drasticus) é feita retirando-se uma
pequena área (5x30 cm) de casca do tronco, e coletando-se o látex com auxílio de um
recipiente. Um volume de 100 ml do látex é coletado, em cada corte, e a este é adicionado
igual volume de água. Essa mistura, látex/água, forma uma suspensão que resulta em um
sedimento esbranquiçado com cerca de 1/4 a 1/3 do volume total da solução e um
sobrenadante róseo.
Inicialmente, a mistura látex/água foi submetida a uma extração, em funil de
separação, com acetato de etila. O extrato acetato de etila (HDEA) foi evaporado a
temperatura ambiente e em seguida submetido a uma cromatografia em coluna de amido de
milho com o auxílio de pressão, utilizando como eluente uma mistura de diclorometano /
acetona em polaridade crescente. Como resultado, obteve-se um sólido esbranquiçado com
alto rendimento (1 litro de látex = 10 g). Depois disso, o sólido foi submetido à purificação
em coluna de sílica, utilizando, como eluente, uma mistura de hexano / diclorometano em
polaridade crescente. A partir deste processo de purificação em sílica, obtiveram-se 120
frações que foram analisadas por cromatografia em camada delgada (eluente: diclorometano;
revelação: lâmpada UV e iodo). A partir de uma fração semi purificada, que apresentou o
acetato de lupeol como componente predominante (98%) e uma mistura de alfa-amairina e
beta-amirina como componente minoritário (2%), realizou-se a purificação final, pelo método
de cromatografia em camada delgada, tendo como resultando um sólido branco e cristalino
(rendimento de 1%) que teve sua estrutura confirmada com base na análise dos dados
espectroscópicos, RMN13
C, sendo caracterizado como acetato de lupeol. As características
físico-químicas do acetato de lupeol foram corroboradas por estudo anterior (SILVA, 1998).
44
FIGURA 9. Esquema de obtenção do acetato de lupeol
Eluição: CH2Cl2
Eluição: Hexano / CH2Cl2
Eluição: CH2Cl2 / Acetona
HDEA/Ac
Mistura látex / água
H. drasticus
Fração AcOEt
HDEA
Eluição: AcOEt
Fração aquosa
HDEAq
Cromatografia amido
HDEA/D
Cromatografia sílica
Frações
1-120
Acetato de lupeol
CCD
45
5.2 Modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético.
Os grupos foram compostos de 8 animais cada e utilizados para investigar a ação
da FAL no teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos,
segundo o método de Koster et al. (1959), conforme descrito a seguir.
A FAL foi testada nas doses de 50 e 100 mg/Kg, administrada no volume de 10
mL/Kg, i.p., uma única vez, 30 min antes da injeção da solução de ácido acético 0,6%. A
partir de 10 minutos após o tratamento dos animais com o ácido acético, o número de
contorções foi registrado durante 20 minutos. O grupo controle recebeu suspensão de Tween
80 a 1% (veículo de dissolução da FAL). A indometacina foi utilizada como controle positivo,
na dose de 10 mg/Kg.
5.3 Teste da formalina
Os grupos foram compostos de 6 a 16 animais e foram utilizados para determinar
o efeito da FAL no teste da formalina, segundo o método de Hunskaar e Hole (1987)
conforme descrito a seguir.
A FAL foi testada nas doses de 10, 25 e 50 mg/Kg, i.p., uma única vez, 30 minutos
antes da injeção intraplantar de 20 μL da solução de formalina 1%, na pata traseira direita do
animal. O tempo (em segundos), gasto pelo animal lambendo a pata, foi registrado durante os
primeiros 5 minutos (fase inicial ou 1ª fase) e de 20 a 25 minutos (fase tardia ou 2a fase) após
a injeção de formalina. O grupo controle recebeu suspensão de Tween 80 a 1% (veículo de
dissolução da FAL). A morfina foi utilizada como controle positivo, na dose de 7,5 mg/Kg,
i.p. Esse teste foi realizado a temperatura ambiente de 26 – 28 °C, na ausência de fatores
estressantes tais como sons, odores e grande luminosidade, que pudessem causar alterações no
comportamento dos animais.
Para investigar o envolvimento do sistema opióide, no efeito da FAL sobre a
nocicepção induzida por formalina, foi utilizado um grupo tratado com FAL 50 mg/Kg, i.p.,
15 minutos após a administração de naloxona na dose de 2 mg/Kg, s.c. e 30 minutos antes da
injeção de formalina e também um grupo que recebeu morfina 7,5 mg/Kg, i.p., 15 minutos
46
após a administração de naloxona 2 mg/Kg, s.c. e 30 minutos antes da injeção de formalina,
além dos grupos citados anteriormente.
5.4 Modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos
Os grupos foram compostos de 6 a 23 animais e foram utilizados para determinar
a ação da FAL no modelo de edema de pata induzido por carragenina, segundo o método de
Winter et al. (1962), conforme descrito a seguir.
A fração acetato de lupeol foi testada nas doses de 5, 10, 25 e 50 mg/Kg, i.p., 30
minutos antes da injeção subplantar de 50 µl da solução de carragenina 1% na pata traseira
direita do animal. O volume da pata foi medido antes e com 1, 2, 3, 4 e 24 horas após a
administração de carragenina, foi determinado pelo cálculo da diferença entre o volume da
pata medido nesses intervalos de tempo e o seu volume determinado antes da injeção de
carragenina. Os grupos controle e controle positivo receberam solução de Tween 80 a 1% e
indometacina 10 mg/Kg, respectivamente.
5.5 Análise imunohistoquímica de TNF-α e iNOS
A imunohistoquímica para o TNF-α e iNOS foi realizada utilizando o método de
estreptavidina-biotina-peroxidase (HSU; RAINE, 1981). Três grupos de camundongos foram
tratados com água destilada, outros dois grupos foram tratados, respectivamente, com FAL
(50mg/kg, ip) e indometacina (10 mg / kg, ip). Após 30 minutos, uma injeção subplantar de
50 µl de solução de carragenina 1% foi administrada na pata traseira direita do animal Três
horas após a aplicação de carragenina, os animais foram sacrificados e uma amostra de 5 mm
da pata traseira direita foi retirada e fixada em formol 10% por 24 h para confecção de
lâminas apropriadas para imunohistoquímica. Os cortes foram desparafinizados, hidratados
em xilol e álcool e imersos em tampão citrato 0,1 M (pH 6), sob aquecimento em forno de
microondas, por 18 minutos para a recuperação antigênica. Após o resfriamento, obtido em
47
temperatura ambiente durante 20 minutos, foram feitas lavagens com solução tamponada de
fosfato (PBS), intercaladas com o bloqueio da peroxidase endógena com solução de H2O2 a
3% (15 minutos). Os cortes foram incubados durante a noite (4°C) com anticorpo primário de
coelho anti-TNF-α diluído 1:200 ou anti-iNOS diluído 1:400 em PBS com albumina sérica
bovina 5% (PBS-BSA). Após a lavagem no dia seguinte, foi feita a incubação com o
anticorpo secundário (de detecção) biotinilado anti-IgG de coelho, diluído 1:200 em PBS-
BSA, por 30 minutos. Depois de lavado, os cortes foram incubados com o complexo estrepto-
avidina peroxidase conjugada (complexo ABC Vectastain®,Vector Laboratories, Burlingame,
CA, USA) por 30 minutos. Após nova lavagem com PBS, seguiu-se coloração com o
cromógeno 3,3`diaminobenzidine-peróxido (DAB), seguida por contra-coloração com
hematoxilina de Mayer. Por fim, realizou-se a desidratação das amostras e montagem das
lâminas para análise das mesmas.
5.6 Avaliação Histopatológica
Para verificação das alterações teciduais microscópicas da pata foram realizados
cortes histológicos de todos os grupos tratados de acordo com o modelo de edema de pata
induzido por carragenina. O tecido foi fixado em formaldeído tamponado 10% e incluído em
parafina. Os cortes foram obtidos através de micrótomo 4 µm, corados em lâminas com
hematoxilina-eosina e examinados a microscopia ótica. A análise histopatológica foi realizada
pela Profa. Dra. Gerly Anne Castro de Brito do Departamento de Morfologia da UFC.
5.7 Modelo de edema de pata induzido por dextrano em camundongos
Os grupos foram compostos de 5 a 7 animais e foram utilizados para determinar a
ação da FAL no modelo de edema de pata induzido por dextrano, segundo método de Gupta
et al. (2005). conforme descrito a seguir.
48
A FAL foi testada nas doses de 12,5 e 25 mg/Kg, i.p., 30 minutos antes da injeção
subplantar (50µl) na pata traseira direita do animal de solução de dextrano 12%. O volume da
pata foi medido antes e com 1, 2, 3 e 4 horas após a administração de dextrano, foi
determinado pelo cálculo da diferença entre o volume da pata medido nesses intervalos de
tempo e o seu volume determinado antes da injeção de dextrano. Como controles positivos
utilizamos grupos tratados com dexametasona 1,5 e 3 mg/Kg, i.p. Um grupo foi tratado em
associação com FAL 12,5 mg/Kg e após 15 minutos administrou-se dexametasona 1,5
mg/Kg, i.p. Os grupos controles receberam solução de Tween 80 a 1% no volume de 10
mL/Kg, i.p.
5.8 Indução, por carragenina, da migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de
camundongos
Os grupos foram compostos de 8 animais e foram utilizados para determinar a
ação da FAL no modelo de peritonite induzida por carragenina, segundo o método de
Ferrándis e Alcaraz (1991), conforme descrito a seguir.
Os grupos foram tratados com FAL (0,1, 1, 10 e 20 mg/kg, i.p.), Pentoxifilina
(0,1, 1 e 25 mg/kg, i.p.) ou veículo. Um grupo foi tratado em associação com FAL 0,1mg/Kg
e após 15 minutos administrou-se Pentoxifilina 0,1 mg/Kg, i.p. Os grupos controles
receberam solução de Tween 80 a 1% no volume de 10 mL/Kg, i.p Decorridos 30, os animais
receberam uma injeção i.p. de 10 ml/kg de carragenina 1%. A seguir os animais foram
devolvidos às caixas e deixados com livre acesso à ração e água durante 5 horas. O exsudato
peritoneal foi coletado com uma pipeta Pasteur plástica através de laparoscopia abdominal.
Para coleta todos os animais receberam uma injeção de salina heparinizada (5 UI/ml). Uma
amostra do lavado peritoneal foi diluída 1:10 em líquido de Türk para contagem de leucócitos
totais. As células foram coradas com o corante panótico rápido e os resultados foram
expressos em número de células/mm3.
49
5.9 Efeito da FAL sobre a degranulação leucocitária, mensurada pela atividade da
enzima mieloperoxidase (MPO)
5.9.1 Obtenção de leucócitos polimorfonucleares (PMNs)
O isolamento dos PMNs foi realizado conforme descrito por Boyum (1968). Para
tanto, foi utilizado sangue humano de doadores sadios coletado com citrato de sódio 3,8%
como anticoagulante. Ao sangue humano (400 ml) foi adicionado igual volume de solução de
dextrano 2% em soro fisiológico. Após suave homogeneização a mistura foi deixada em
repouso por 60 min, tempo necessário para a separação das duas fases. A fase superior, foi
centrifugada a 325 g durante 15 min a temperatura ambiente e ao sedimento ligeiramente
contaminado com hemácias foi adicionado 45 ml de água destilada a 4°C seguida de 5 ml de
tampão HBSS modificado concentrado. Após centrifugação (325 g - 10 min a temperatura
ambiente), foram adicionados ao sedimento 10 ml de HBSS modificado e em seguida 10 ml
de Percol (1,09 g/ml), para obtenção de um gradiente e separação das células PMNs. Por fim,
o material foi novamente centrifugado, 20.000 g durante 20 min., e a fase intermediária, foi
separada, ressuspendida em HBSS e realizada a contagem de leucócitos, predominantemente
neutrófilos (85,0 ± 2,8 %). A viabilidade celular, determinada pelo teste do azul de Trypan,
foi de 97.7 ± 0.94 %.
5.9.2 Degranulação dos PMNs
O ensaio foi desenvolvido segundo protocolo experimental proposto por Lucisano
e Mantovani (1984). A suspensão de PMNs (2,5 x 106) foi pré- incubada em solução
tamponada de Hank´s, contendo cálcio e magnésio. As células foram incubadas com a FAL
(10, 25, 50 e 100µg/ml) por 15 minutos a uma temperatura de 37 °C. Os neutrófilos foram
estimulados, pela adição de acetato de formol miristato (PMA, 0,1 µg/ml), por 15 minutos a
50
37 °C. Após a estimulação dos neutrófilos, a suspensão foi centrifugada por 10 minutos a
2000 g em temperatura de 4 °C.
5.9.3 Determinação da atividade da MPO
Aos 5 0µl do sobrenadante foram adicionadas solução salina tamponada com
fosfato - PBS (100 μL), tampão fosfato (50 μL) e H2O2 (0,012%). Após 5 min a 37 °C foi
acrescido 20 μL de monofosfato de tiamina (TMP 1,5 mM) e a reação foi interrompida pela
adição de 30 μL de acetato de sódio (1,5 M; pH 3,0). A absorbância foi determinada em
triplicatas por espectrofotometria (620 nm). A construção de uma curva padrão pela adição de
quantidades crescentes de MPO permitiu relacionar a absorbância com as unidades
enzimáticas/ml. Os resultados foram expressos como percentual de inibição da atividade
enzimática.
5.10 Determinação in vitro da atividade antioxidante pelo método do DPPH (2,2-difenil-
1-picrilhidrazil)
A atividade antioxidante da FAL e alfa-tocoferol (padrão positivo) foram
determinadas pelo ensaio de DPPH, conforme descrito por De Gaulejac et al., (1999). 0,1 ml
de uma solução de alfa-tocoferol (50 µg/ml) e FAL (10, 25, 50 and 100 µg/ml), foram
colocados em tubos de ensaio, seguido pela adição de 3,9 ml a 0,3 mM de DPPH em solução
metanólica na proporção de 1:1. Os tubos contendo a FAL, alfa-tocoferol, solução metanólica
de DPPH (padrão negativo), e o veículo (DMSO a 30% em solução metanólica na proporção
de 1:1) foram submetidos à vigorosa agitação em ambiente escuro por 60 minutos. Como
branco, utilizou-se 0,1 ml de uma solução de metanol/etanol (1:1). Após o tempo de reação, a
redução do DPPH foi determinada espectrofotometricamente a 517 nm. A atividade de
captação de radicais livres (ACR) foi calculada em porcentagens de descoloração das
soluções contendo o DPPH, utilizando a seguinte equação:
51
ACR% = [(ADPPH - As)/ADPPH] x 100
Onde AS é a absorbância da solução teste, na qual a FAL e o alfa-tocoferol foram
adicionados, e ADPPH é a absorbância da solução de DPPH.
5.11 Análise Estatística
Os resultados são expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M). Para comparação
múltipla dos parâmetros foi utilizada a Análise de Variância (ANOVA), e o nível de
significância entre os grupos foi determinada pelo teste de Student Newman Keuls. Em todas
as análises, considerou-se estatisticamente significante um valor de p< 0,05.
52
6 RESULTADOS
6.1 Determinação da atividade antinociceptiva do acetato de lupeol (FAL)
6.1.1 Teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos
A Figura 10 demonstra o efeito inibitório da administração intraperitoneal do
acetato de lupeol (FAL) na nocicepção induzida por acido acético, no modelo de contorções
abdominais. A FAL na doses de 50 e 100 mg/kg, reduziu, de modo significativo, o número de
contorções abdominais em 57 e 61%, respectivamente. A indometacina, droga não esteroidal,
na dose 10 mg/kg, i.p., utilizada como controle positivo, reduziu de modo significativo o
número de contorções abdominais em 66%.
53
FIGURA 10. Efeito do acetato de lupeol no teste de contorções abdominais induzidas
por ácido acético em camundongos.
Controle 10 50 1000
5
10
15
20
25
Ind. FAL
aa a
Nº
de c
on
torções
ab
dom
inais
Os valores estão expressos como média ± E.P.M. do número de contorções abdominais. Os animais receberam:
controle (Tween 80, 1% em água destilada, i.p.), FAL nas doses de 50 e 100 mg/Kg, i.p. ou indometacina 10
mg/Kg (Ind), i.p. 30 min antes da indução da administração do ácido acético 0,6% no volume de 10ml/kg,i.p. A
partir de 10 minutos após o tratamento dos animais com o ácido acético, o número de contorções foi registrado
durante 20 minutos a p<0,05 vs controle. (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
54
6.1.2 Teste da formalina em camundongos
A Tabela 4 demonstra o efeito inibitório da administração intraperitoneal do
Acetato de lupeol (FAL) sobre a nociceptição induzida por formalina. A FAL nas doses de 10,
25 e 50 mg/kg, reduziu o tempo gasto pelo animal lambendo a pata, tanto na fase inicial (1ª
fase) quanto na fase tardia (2ª fase) do teste, em relação ao grupo controle. Entretanto, esse
resultado mostrou-se significativo apenas nas duas maiores doses. Os valores de inibição
causada pela administração da FAL nas doses de 25 e 50 mg/kg, i.p., foram, respectivamente,
21 e 46,5 % na primeira fase e 57,6 e 61,3 % na segunda fase.
O pré-tratamento com um antagonista opióide, naloxone (2mg/kg, i.p.) reverteu
completamente o efeito da FAL (50mg/kg), tanto na primeira quanto na segunda fase,
indicando o envolvimento do sistema opióide nas ações antinociceptiva e antiinflamatória. De
modo significante em relação ao controle, a inibição produzida pela morfina, ocorreu em
ambas as fases, tendo como valores 62 e 91,1 %, respectivamente. Como esperado, esse efeito
também foi revertido pela administração de naloxone.
55
TABELA 4. O efeito da administração do acetato de lupeol (LAF), sobre o
comportamento da dor no teste.
Grupo Tempo de lambedura de pata (s)
Controle 64.0 ± 2.9 (-) 32.6 ± 3.9 (-)
Morfina (mg/kg, i.p.)
7.5 23.8 ± 2.8a (62.8) 2.9 ± 1.6
a (91.1)
FAL (mg/kg, i.p.)
10 55.8 ± 3.6 41.2 ± 5.3 (-)
25 50.3 ± 4.7a (21). 13.8 ± 3.9
a (57.6)
50 36.1 ± 2.2a (46.5) 12.6 ± 2,2
a (61.3)
Morfina + Naloxona
(7.5 + 2 mg/kg, i.p.) 51.5 ± 5.3b (19.5) 29.1 ± 2.4
b (10.7)
FAL + Naloxona
(50 + 2 mg/kg, i.p.) 56.4 ± 2.0c (11.9) 29.1 ± 2.5
c (10.7)
Os valores representam a média ± EPM do tempo de lambedura de pata. Entre parênteses, os valores
indicam a porcentagem de redução do tempo de lambedura da pata em relação ao grupo controle.
Controle (1% de Tween 80 em salina, i.p.), FAL (10, 25 e 50 mg/kg, i.p.), Morfina (7,5 mg/kg, i.p.)
foram administrados 30 minutos antes da injeção subplantar de formalina. Foram utilizados de 6 a 16
animais por grupo. ap<0,05 vs controle;
bp<0,05 vs Morfina;
cp<0,05 vs LAF 50. (ANOVA e teste de
Student Newman Keul).
0 -5 min (%) 20-25 min (%)
1ª Fase Inibição 2ª Fase Inibição
56
6.2 Determinação da atividade antiinflamatória do acetato de lupeol (FAL)
6.2.1 Modelo de edema de pata induzido por carragenina em camundongos
A Figura 11 demonstra o efeito antiedematogênico da administração
intraperitoneal do acetato de lupeol no edema de pata induzido por carragenina em
camundongos. O pré-tratamento com FAL nas doses 10, 25 e 50 mg/kg, i.p., reduziu, de forma
significativa, o volume do edema (ml) nas 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora, após a administração da
carragenina, quando comparado ao grupo controle. As doses que apresentaram maiores efeitos
foram 25 e 50 mg/kg, e estas promoveram a inibição da formação do edema em 50 (1ª h), 58
(2ª h), 57 (3ª h), 56% (4ª h) e 72 (1ª h), 72 (2ª h), 79 (3ª h), 88% (4ª h), respectivamente. A
indometacina (10 mg/kg, i.p.), um antiinflamatório não esteroidal, utilizado como controle
positivo, reduziu significativamente o edema induzido por carragenina em 54 (1ª h), 43 (2ª h),
43 (3ª h), 43 (4ª h) e 90% (24ª h).
57
FIGURA 11. Efeito do acetato de lupeol no edema de pata induzido por carragenina em
camundongos.
1ª hora
Controle 10 5 10 25 500.0
0.1
0.2
0.3
a
aa
a
a
FALInd
Volu
me d
o e
dem
a (
mL)
2ª hora
Controle 10 5 10 25 500.0
0.1
0.2
0.3
aa
aa
a
FALInd
Vo
lum
e d
o e
dem
a (
mL
)
Controle 10 5 10 25 500.0
0.1
0.2
0.3
a
a
aa
a
Ind FAL
3ª hora
Vo
lum
e d
o e
dem
a (
mL
)
4ª hora
Controle 10 5 10 25 500.0
0.1
0.2
0.3
a
aa
a
FALInd
Volu
me d
o e
dem
a (
mL)
24ª hora
Controle 10 5 10 25 500.0
0.1
0.2
0.3
a
a
FALInd
Volu
me d
o e
dem
a (
mL)
Os valores estão expressos como média ± E.P.M. da diferença do volume de pata em ml (volume do edema) em
relação ao tempo zero. Os Animais receberam: controle (Tween 80, 1% em água destilada, i.p.), FAL nas doses
de 5, 10, 25 e 50 mg/Kg, i.p. ou indometacina 10 mg/Kg (Ind), i.p. 30 min antes da indução dos edemas pela
administração de carragenina 1% (50 μL). Foram realizadas medidas dos volumes das patas nos tempos zero, 1
(A), 2 (B), 3 (C), 4 (D) e 24 (E) horas após a administração de carragenina; a
p<0,05 vs controle. (ANOVA e
Teste de Student Newman Keul).
A B
C D
E
58
6.2.2 Análise histológica de tecidos extraídos das patas de camundongos tratados com
acetato de lupeol e indometacina no teste de edema de pata induzido por carragenina.
A injeção intraplantar de solução de carragenina 1% na pata posterior direita
produziu um edema representativo, caracterizado por bolhas nos tecido epitelial e conjuntivo,
além de uma intensa infiltração de células inflamatórias PMN, principalmente neutrófilos, em
comparação com o grupo que não recebeu o estímulo inflamatório (controle normal) (Figuras
12A e 12B, respectivamente). Nos grupos pré-tratados com LAF (50 mg / kg, i.p.) ou
indometacina (10 mg / kg, i.p.), houve diminuição significativa do edema, bem como na
infiltração de células inflamatórias (Figuras 12D e 12C, respectivamente), na 3ª hora após a
administração da carragenina.
59
FIGURA 12. Análise histológica de tecidos extraídos das patas de camundongos tratados
com acetato de lupeol e indometacina i.p., no teste de edema de pata induzido por
carragenina.
A: Controle (Tween 80 0,04%); B: Carragenina (10mg/ml, s.p.); C: Indometacina (10mg/kg, i.p.) +
Carragenina; D: FAL (50mg/kg, i.p.) + Carragenina ( 10mg/ml, s.p.). Hematoxilina e eosina. Todas as figuras
foram aumentadas em x 100.
A B
C D
60
6.2.3 Efeito do acetato de lupeol na marcação imunohistoquímica para TNF-α
A análise imunohistoquímica mostrou um grande número de células expressando
TNF-α (principalmente mononucleadas) no tecido conjuntivo da pata de camundogos
submetidos à inflamação induzida por carragenina (Figura 13B), em relação à expressão
observada na pata de um animal normal (Figura 13A). Nos grupos pré-tratados com LAF (50
mg/kg, i.p.) ou indometacina (10 mg/kg, i.p.), (Figuras 13D e 13C), observou-se uma
discreta redução da expressão de TNF-α.
61
FIGURA 13. Fotomicrografias de imunohistoquímica para TNF-α de tecidos extraídos das
patas de camundongos tratados com acetato de lupeol e indometacina i.p., no teste de edema
de pata induzido por carragenina
A: Controle (Tween 80 0,04%); B: Carragenina (10mg/ml, s.p.); C: Indometacina (10mg/kg, i.p.) + Carragenina; D:
FAL (50mg/kg, i.p.) + Carragenina (10mg/ml, s.p.). Hematoxicilina e eosina. Todas as figuras foram aumentadas
em x 400.
C D
A B
62
6.2.4 Efeito do Acetato de lupeol na marcação imunohistoquímica para iNOS
A análise imunohistoquímica mostrou um grande número de células expressando
iNOS (principalmente neutrófilos) no tecido conjuntivo da pata de camundogos submetidos à
inflamação induzida por carragenina (Figura 14B), em relação à expressão observada na pata
de um animal normal (Figura 14A). Nos grupos pré-tratados com LAF (50 mg / kg, i.p.) ou
indometacina (10 mg / kg, i.p.), (Figuras 14D e 14C, respectivamente), reduziu,
consideravelmente, a marcação imunohistoquímica para iNOS.
63
FIGURA 14. Fotomicrografias de imunohistoquímica para iNOS de tecidos extraídos das
patas de camundongos tratados com acetato de lupeol e indometacina i.p., no teste de edema
de pata induzido por carragenina
A: Controle (Tween 80 0,04%); B: Carragenina (10mg/ml, s.p.); C: Indometacina (10mg/kg, i.p.) + Carragenina;
D: FAL (50mg/kg, i.p.) + Carragenina (10mg/ml, s.p.). Hematoxicilina e eosina. Todas as figuras foram
aumentadas em x 400.
A B
C D
64
6.2.5 Modelo de edema de pata induzido por dextrano em camundongos
A Figura 15 demonstra o efeito antiedematogênico da administração
intraperitoneal do acetato de lupeol no edema de pata induzido por dextrano em camundongos.
O pré-tratamento com FAL nas doses 12,5 e 25 mg/kg, i.p., reduziu, de forma significativa, o
volume do edema (ml) na 2ª (31 e 41%) e 3ª (30 e 50%) hora, respectivamente, após a
administração de dextrano, quando comparado ao grupo controle. A dexametasona (1,5 e 3
mg/kg, i.p.), um antiinflamatório esteroidal, utilizado como controle positivo, reduziu
significativamente o volume do edema na 2ª (25 e 54%), 3ª (38 e 54%) e 4ª (68 e 80%) hora,
respectivamente, após a administração de dextrano, quando comparado ao grupo controle. O
grupo tratado com dexametasona (1,5 mg/kg,i.p.) em associação com a menor dose da FAL
(12,5 mg/kg, i.p.) causou redução significativa do edema na 2ª (49%), 3ª (58%) e 4ª (55%)
hora, após a administração de dextrano, quando comparado ao grupo controle.
65
FIGURA 15. Efeito do acetato de lupeol no edema de pata induzido por dextrano em
camundongos.
1ª hora
Controle 1,5 3 12,5 25 1,5 + 12,50.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
FALDexa Dexa + FAL
Vo
lum
e d
o e
de
ma
(m
L)
2ª hora
Controle 1,5 3 12,5 25 1,5 + 12,50.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
aa
a
a a
FALDexa Dexa + FAL
Volu
me d
o e
dem
a (
mL)
3ª hora
Controle 1,5 3 12,5 25 1,5 + 12,50.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
a aa
aa
FALDexa Dexa + FAL
Volu
me d
o e
dem
a (
mL)
4ª hora
Controle 1,5 3 12,5 25 1,5 + 12,50.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
a
aa
FALDexa Dexa + FAL
Volu
me d
o e
dem
a (
mL)
Os valores estão expressos como média ± E.P.M. da diferença do volume de pata em ml (volume do edema) em relação ao
tempo zero. Os Animais receberam: controle (Tween 80, 1% em água destilada, i.p.), FAL nas doses de 12,5 e 25 mg/Kg,
i.p., dexametasona nas doses de 1,5 e 3 mg/Kg (Dexa), i.p. ou FAL 12,5 mg/Kg, i.p., em associação com Dexa 1,5mg/Kg,
i.p., 30 min antes da indução dos edemas pela administração de dextrano 12% (50 μL, s.p.). Foram realizadas medidas dos
volumes das patas nos tempos zero, 1 (A), 2 (B), 3 (C) e 4 (D) horas após a administração de dextrano; a p<0,05 vs controle.
(ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
A B
C D
66
6.2.6 Peritonite induzida por carragenina em camundongos
A Figura 16 demonstra o efeito do acetato de lupeol (FAL) sobre a migração de
leucócitos polimorfonucleares (PMN) (nº de células/mm3) induzida por carragenina. A
administração de carragenina 1% (10ml/kg) induziu um aumento significativo no número de
PMN (7792 ± 692) em relação ao grupo não tratado com carragenina, veículo (Tween 80, 1%
em água destilada) (2246 ± 331). Porém, o pré-tratamento dos animais com a FAL (1, 10 e 20
mg/kg, i.p.) reduziu o infiltrado celular (3400 ± 384; 1528 ± 149 e 658 ± 79,
respectivamente), correspondendo a inibições de 56, 80 e 92 % respectivamente, em relação
ao grupo controle (carragenina). A pentoxifilina (1 e 25 mg/kg), usada como controle
positivo, reduziu a migração de PMN (4692 ± 239 e 2465 ± 198, respectivamente),
correspondendo a inibições de 39 e 68 % respectivamente. Os grupos tratados com
pentoxifilina e FAL 0,1 mg/kg, i.p., não inibiram, de forma significativa, a migração de PMN
(15 e 5%, respectivamente), quando comparado ao controle. No entanto, quando essas doses
foram administradas em associação, promoveram uma inibição de 37%.
67
FIGURA 16. Efeito do acetato de lupeol na reação inflamatória aguda induzida pela
administração de carragenina em peritônio de camundongo (peritonite).
Veículo Controle 0,1 1,0 25 0,1 1,0 10 20 0,1 + 0,10
2000
4000
6000
8000
10000
Pentox FAL Pentox + FAL
a
a
a
a
a
a
ab
Nº
de
cé
lula
s /m
m3
Os valores estão expressos como média ± E.P.M. do número de leucócitos polimorfonucleares presentes na
cavidade peritoneal. Os Animais receberam: controle (Tween 80, 1% em água destilada, i.p.), FAL nas doses de
0,1, 1,0, 10 e 20 mg/Kg, i.p., pentoxifilina nas doses de 0,1, 1,0 e 25 mg/Kg (Pentox), i.p. ou FAL 0,1 mg/Kg,
i.p. em associação com Pentox 0,1mg/Kg, i.p., 30 min antes da indução da peritonite pela administração de
carragenina 1% 10ml/Kg, i.p. Ao Grupo veículo foi administrado Tween 80 (1% em água destilada, i.p) e este
não sofreu estímulo inflamatório. A retirada do fluído peritoneal e a contagem dos leucócitos totais ocorreram 5
horas após administração de carragenina; a p<0,05 vs controle;
bp<0,05 vs Pentox 0,1 mg/Kg (ANOVA e Teste
de Student Newman Keul).
68
6.2.7 Efeito do acetato de lupel na degranulação de neutrófilos humanos induzida por
PMA: atividades da enzima mieloperoxidase (MPO)
A Figura 17 demonstra o efeito do acetato de lupeol na inibição da liberação da
enzima mieloperoxidase, um biomarcardor da inflamação. Observa-se que a incubação de
leucócitos polimorfonucleares, predominantemente neutrófilos com a FAL nas concentrações
de 10, 25, 50,100 μg/kg inibiu em 36, 80, 79, 74 %, respectivamente, a atividade da MPO
liberada por neutrófilos estimulados pelo PMA.
69
FIGURA 17. Efeito do acetato de lupeol na degranulação de neutrófilos humano estimulados
pelo PMA, determinados pela atividade da mieloperoxidase(MPO).
10 25 50 1000
20
40
60
80
100
ab
ab ab ab
FAL
Ati
vid
ad
e M
PO
(%
in
ibiç
ão
)
Os valores estão expressos como média ± E.P.M. da porcentagem de inibição da atividade da enzima
mieloperoxidase. Os resultados obtidos na presença das drogas testes (FAL 10, 25, 50 e 100μg/ml) foram
comparados em relação ao controle (100 % atividade enzimática). As análises foram realizadas pelo menos em
quadruplicata e repetidas em três dias diferentes; a
p<0,05 vs controle (solução de Hanks); bp<0,05 vs veículo
(Tween 80, 0,4% em água destilada) (ANOVA e Teste de Student Newman Keul).
70
6.3 Avaliação da atividade antioxidante do acetato de lupeol
A fim de detectar qualquer possível efeito antioxidante da LAF, o ensaio DPPH
foi realizado. Os resultados expressos na Tabela 5 mostram que LAF, nas concentrações de
10, 25, 50 e 100 μg/ml, não apresenta qualquer capacidade seqüestradora de radicais livres.
Ao contrário da vitamina E, utilizada como padrão positivo, diminuiu significativamente o
valor de absorbância, em relação aos controles.
Tabela 5. Avaliação do efeito anti-oxidante do acetato de lupeol, mensurado através da
atividade de captação de radicais livres (ACR), no teste do DPPH.
Grupo
DPPH (absorbância 517nm) ACR%
Controle
3,056 ± 0,02 -
α-Tocoferol (μg/ml)
50
0,924 ± 0,2
92,1%a
FAL (μg/ml)
10
25
50
100
3,055 ± 0,01
3,056 ± 0,02
3,094 ± 0,01
3,044 ± 0,02
0,03%
0%
0%
0,4%
Os valores representam à média ± E.P.M. da absorbância. ACR% expressa a capacidade de captação de radicais
livres. Os resultados obtidos na presença das drogas testes (FAL 10, 25, 50 e 100μg/ml) foram comparados em
relação ao controle (padrão negativo). As análises foram realizadas em triplicatas; a p<0,05 vs controle (ANOVA
e Teste de Student Newman Keul).
71
7 DISCUSSÃO
Partes aéreas de plantas do gênero Himatanthus são tradicionalmente utilizadas
para o tratamento de tumores, gastrites, uretrites e infecções bacterianas (KAPLAN, 1967).
Embora esse gênero apresente 14 espécies, distribuídas em áreas tropicais e subtropicais,
apenas 5 delas foram estudadas sob os pontos de vista químicos e / ou biológico. Em estudos
anteriores verificou-se que o látex destas espécies é rico em triterpenos, incluindo lupeol, da
classe dos lupanos, com propriedades antitumorais e antiinflamatórias (FERNANDEZ et al.,
2001; GAUTHIER et al., 2006; LEE et al., 2007; MARQUEZ et al. 2006; PETRONELLI et
al., 2009; SALEEM et al., 2004; VASCONCELOS et al., 2008;). No Brasil, esses estudos
foram realizados com espécies como H. sucuuba e H. lancifolia, comuns nas regiões de mata
atlântica e amazônia. Além disso, poucas obras são encontradas na literatura relacionando as
propriedades farmacológicas do Himatanthus drasticus.
Neste estudo, demonstrou-se que a fração acetato de lupeol (FAL), isolada do
látex de H. drasticus, apresenta efeitos antinociceptivos e antiinflmatórios em modelos de
nocicepção (contorção abdominal induzida por ácido acético e teste da formalina) e
inflamação (edema de pata induzido por carragenina, edema de pata induzido por dextrano,
peritonite induzida por carragenina e atividade enzimática da mieloperoxidase).
A FAL foi avaliada primeiramente no teste de contorções abdominais induzidas
por ácido acético, um modelo animal clássico que permite avaliar a capacidade de substâncias
em suprimir a nocicepção. A FAL, em todas as doses utilizadas, foi capaz de diminuir de
modo significativo à dor induzida pela administração do ácido acético. Estes resultados
sugerem uma ação antinociceptiva caracterizada pela redução do número de contorções
abdominais.
O teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético é considerado um
modelo antinociceptivo inespecífico, visto que o ácido acético induz indiretamente a liberação
de mediadores endógenos que sensibilizam os neurônios nociceptivos e este efeito pode ser
revertido por uma grande variedade de drogas, tais como, antiiflamatórios não-esteroidais,
entorpecentes ou outras drogas que agem no sistema nervoso central (XIAOHUA et al.,
2010).
Foi demonstrado considerável aumento dos níveis de prostaglandinas E2 e F2a no
fluido peritoneal, após a injeção de ácido acético e, portanto, o pronunciado efeito analgésico
de fármacos não-esteroidais sobre as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
72
pode ser explicado pelo bloqueio da síntese de prostaglandinas e conseqüente inibição no
desenvolvimento da hiperalgesia. Há também o envolvimento dos receptores opióides na
inibição da hiperalgesia induzida por ácido acético, já que a morfina também se mostra eficaz
contra as contorções induzidas por esse agente irritante (DERAEDT et al., 1980; GYIRES;
TORNA, 1984).
Mesmo se tratando de um teste com baixa especificidade, em relação ao
mecanismo de ação envolvido, o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido
acético nos forneceu fortes indicativos de uma ação analgésica por parte da FAL. Para que se
evitassem más interpretações dos resultados, os efeitos antinociceptivos da FAL foram
confirmados no teste da formalina, um modelo de dor com duas fases distintas, que podem
indicar tipos diferentes de dor (HUNSKAAR; HOLE, 1987).
As fases inicial (1ª fase: 0 a 5 minutos após a administração da formalina) e tardia
(2ª fase: 20 a 25 minutos após a administração da formalina) do teste de formalina, possuem
características diferenciadas, portanto, este teste é útil não apenas para avaliar substâncias
analgésicas, mas também para elucidar os mecanismos que envolvem esta ação (SHIBATA et
al.,1989). A dor na fase inicial induzida pela formalina é denominada não-inflamatória ou
neurogênica, resulta da estimulação direta de nociceptores das fibras sensoriais aferentes,
principalmente fibras do tipo C, refletindo a dor mediada pelo sistema nervoso central,
segundo Shibata et al. (1989), a substância P e a bradicinina estão envolvidas na mediação da
dor nesta fase. Já a dor na fase tardia, chamada dor inflamatória, é causada pela inflamação
local com liberação de mediadores inflamatórios, tais como histamina, serotonina, bradicinina
e prostaglandinas (SHIBATA et al., 1989; HUNSKAAR; HOLE, 1987).
Os resultados mostraram que a FAL nas doses de 25 e 50 mg/kg, i.p., inibiu, de
modo significativo, tanto a dor na fase inicial quanto na tardia, embora este efeito tenha se
mostrado mais pronunciado sobre a dor na fase tardia (2ª fase), semelhante ao que foi
demonstrado por Pereira et al. (2010), onde o acetato de lupeol extraído de Zanthoxylum
rhoifolium foi efetivo em ambas as fases do teste da formalina, porém, assim como ocorreu no
nosso estudo, a analgesia na fase inflamatória foi bem mais pronunciada. Este resultado
sugere que pelo menos boa parte do efeito analgésico do acetato de lupel é provocado pela
inibição da liberação e/ou das ações de mediadores inflamatórios (HUNSKAAR; HOLE,
1987; TJOLSEN et al., 1992; CORRÊA; CALIXTO, 1993; LAPA et al., 2003).
73
Com o intuito de elucidar os mecanismos envolvidos nessa ação, voltamos nossos
esforços para modelos experimentais que nos permitiram fazer uma melhor avaliação dos
efeitos antiinflamatórios da FAL.
A carragenina (Cg) é um composto químico vastamente utilizado em modelos
farmacológicos com o objetivo de investigação da fisiopatologia da resposta inflamatória
aguda. Ela induz uma reação inflamatória aguda envolvendo liberação de mediadores que
resultam em mudanças na permeabilidade vascular e formação de edema. Portanto, o edema
induzido por esta substância flogística é empregado como modelo experimental para
avaliação farmacológica de diversas substâncias na inflamação (Di ROSA et al., 1971;
POSADAS et al., 2004; VINEGAR et al., 1973; WINTER et al., 1962). A Cg constitui um
agente flogístico de escolha para avaliar drogas antiinflamatórias por depender inteiramente
de estímulo local e sua ação inflamatória pode ser inibida por drogas antiinflamatórias
esteroidais e não-esteroidais como, por exemplo, dexametasona e indometacina. Assim,
substâncias capazes de inibi-lo têm sido consideradas, do ponto de vista de eficácia
farmacológica, boas candidatas a agentes antiinflamatórios (CARVALHO et al., 1996;
HENRIQUES et al., 1987; SANTOS, 1999; SRINIVASAN et al., 2001).
De acordo com dados da literatura, o edema de pata induzido pela carragenina
está associado com duas fases distintas de alterações de permeabilidade vascular induzida por
mediadores: a 1ª fase (0 – 24 h), e a 2ª fase (24ª h em diante) após a injeção de carragenina
(GUAY et al., 2004). Os efeitos inflamatórios verificados na 1ª fase são associados ao
aumento nos níveis mediadores inflamatórios, tais como: histamina, serotonina, bradicinina,
oxido nítrico (NO), tromboxanos e prostaglandinas (PGs) (HENRIQUES et al., 1987). A
liberação de PGs coincide com a migração de leucócitos, principalmente neutrófilos, que
amplificam a resposta inflamatória com a produção dentre outros mediadores, de espécies
reativas de oxigênio (ROS) e proteases tais como a mieloperoxidase (MPO) (FANTONE;
WARD, 1982; NANTEL et al., 1999; POSADAS et al., 2004). Portanto, na tentativa de
caracterizar o potencial antiinflamatório da FAL, avaliamos seus efeitos no edema
inflamatório induzido por carragenina assim como no aumento dos níveis de TNF-α e iNOS
na pata de camundongos, além da análise histológica.
FAL à semelhança da indometacina, inibidor inespecífico da enzima
ciclooxigenase, após administração sistêmica, reduziu significativamente o edema de pata
induzido pela carragenina. Esse resultado sugere um potencial antiinflamatório, fato este
corroborado pela capacidade da FAL em bloquear parcialmente a infiltração de leucócitos
para o foco inflamatório, observada pela análise histopatológica. Isso condiz com estudos
74
anteriores, que demonstraram a ação antiedematogênica do cetato de lupeol (PEREIRA et al.,
2010; CHATTERJEE et al., 2006).
O fato de o lupeol não demonstrar efeitos anti-piréticos e ulcerogenicos indicam
que este triterpeno não parece possuir um efeito inibitório sobre PG-sintetase (GEETHA;
VARALAKSHMI, 2001), sugerindo que, apesar dos efeitos da FAL e da indometacina serem
semelhantes, possivelmente, seus mecanismos de ação sejam distintos.
Segundo Rocha et al. (2006), o desenvolvimento do edema induzido pela
carragenina é dependente, pelo menos em parte, da produção e liberação de citocinas pró-
inflamatórias, incluindo o TNF-α. Esta citocina ativa as células T, macrófagos e granulócitos,
induzindo a expressão alterada de moléculas de adesão e liberação de outras citocinas
(GROVES et al., 1995). Embora o acetato lupeol seja capaz de reduzir a produção de TNF-α
in vitro, (ASHALATHAB et al., 2010), nossos resultados mostraram que a fração acetato de
lupeol (FAL) reduziu de modo discreto, os níveis teciduais de TNF-α no teste de edema de
pata induzida por carragenina observado na marcação imunohistoquímica.
Leucócitos e outras células fagocitárias se utilizam da liberação de espécies
reativas de oxigênio (ERO), óxido nítrico (NO) e superóxido, para combater agentes
infecciosos (BOSE; FARNIA, 1995). Sendo consideradas pró-inflamatórias, algumas ações
do oxido nítrico que vão desde um potente efeito vasodilatador, passando pelo aumento da
permeabilidade vascular, chegando a induzir a síntese de prostaglandinas (MELLO;
LAURINDO, 2000).
No presente estudo, a FAL foi efetiva em reduzir os níveis teciduais da enzima
óxido nítrico sintetase induzível (iNOS) observado pela diminuição da marcação
imunohistoquímica, podendo este ser um dos mecanismos de inibição da resposta
inflamatória. Alguns triterpenos pentacíclicos já foram descritos com atividade inibidora
sobre a iNOS, um recente exemplo desta ação foi atribuída ao Tirucallol isolado do látex de
Euphorbia lactea ( FERNANDEZ-ARCHE et al., 2010).
Segundo Park et al. (2007), a redução dos níveis do NO através da inibição da
iNOS é um dos mecanismos relacionados à diminuição do edema de pata induzida por
carragenina.
Vários estudos têm demonstrado que o acetato de lupeol inibe NF-kappaB
significativamente, incluindo a fosforilação da proteína IKB - α (ASHALATHAB et al.,
2010; SALEEM et al., 2004; LEE et al., 2007). Baldwin (2001) relatou que a NF-kappa B
está envolvido na expressão de vários mediadores inflamatórios, fatores de transcrição e
moléculas de adesão celular e tem um papel central em uma ampla variedade de doenças
75
inflamatórias. Tais estudos corroboram com os nossos resultados, já que, a diminuição da
marcação imunohistoquímica tanto para TNF-α quanto para iNOS podem está diretamente
relacionada a inibição do NF-κβ (CHAN; FISCUS, 2004).
Após a administração intraperitoneal, a FAL também inibiu de modo significativo
o edema induzido por dextrano na pata de camundongo. As inibições máximas aconteceram
na 3ª hora após a injeção de dextrano.
O edema da pata de rato induzido por dextrano (polissacarídeo sulfatado) envolve
a degranulação de mastócitos e, portanto resulta principalmente da liberação de histamina e de
5–HT. A reação inflamatória causada por dextrano difere daquela provocada por carragenirna,
visto que é caracterizada pela presença de um número pequeno de leucócitos no exsudado
(MASSO et al., 1993).
Quando comparamos os resultados obtidos nos edemas de pata induzidos por
dextrano e carragenina, podemos observar uma maior reversão do edema neste último
modelo, o que liga a ação da pela FAL a inibição da migração de células polimorfonucleares
mediada por NO e TNF – α, confirmada pela análise imunohistoquímica.
A FAL inibiu a migração leucócitária, com efeito, dose-dependente, significativo,
na doses de 1, 10 e 25 mg/kg, no teste de peritonite induzida por carragenina, corroborando
com os resultados obtidos no teste de edema de pata induzida por carragenina. Curiosamente,
os efeitos da Pentoxifilina (PTX), um conhecido inibidor de TNF-α (SHIMIZU et al., 2000),
foram potencializados pela associação desta droga com FAL.
Segundo Maleki et al. (2001), na primeira fase da inflamação aguda induzida por
carragenina, há o acumulo de PMN no peritônio do animal. Assim para avaliar o possível
efeito da FAL sobre a inibição e infiltração dos neutrófilos, estes eventos foram estudados na
migração leucocitária em modelo de peritonite induzidos por carragenina em camundongos.
Tem-se observado que as drogas kappa-opióides exercem um poderoso efeito
antiinflamatório, ao reduzir a liberação e expressão de TNF-α (WALKER, 2003). Além disso,
tem sido demonstrado que a expressão de receptores opióides ocorre durante a inflamação
periférica (POL; PUIG, 2004). Considerando que o efeito foi potencializado pela associação
FAL + PTX, e revertida pela naloxona, um antagonista opióide, no teste da formalina,
podemos supor que pelo menos em parte, a FAL atua inibindo o TNF-α endógeno. Esta
citocina é considerada um importante fator em várias doenças inflamatórias, e sua regulação é
mediada por fatores de transcrição nucleares, como o NF-κβ (EDER, 1997)
Estudos anteriores (RAGHAVENDRA et al., 2003), mostraram que há ativação
glial espinal e aumento de citocinas pró-inflamatórias, em modelos animais de dor
76
neuropática. Estes autores demonstraram que Propentofilina (quimicamente semelhante à
PTX), administrada cronicamente, atua como um modulador nas células da glia com atividade
antiinflamatória, atenuando o desenvolvimento de hiperalgesia, e restaurando a atividade
analgésica da morfina, administrada de forma aguda, em ratos com manifestação de dor
neuropática.
Segundo Romano et al. (1997), a relação entre citocinas, PGE2 e migração
celular, durante as várias fases da inflamação aguda induzida por carragenina, foram
avaliados no modelo de bolsão de ar em dorso de camundongo. Estes autores concluíram que
o TNF-α desempenha um papel importante neste modelo, especialmente para a migração dos
leucócitos na primeira fase do processo inflamatório. Foi também demonstrado que a PTX
reduziu a lesão pulmonar e a atividade dos neutrófilos pulmonares, em modelo de choque
hemorrágico em ratos (DEREE et al., 2007), e esta ação foi associada a diminuição NF-
kappaβ.
A mieloperoxidase (MPO) é uma enzima multifuncional envolvida nos
mecanismos de defesa do hospedeiro e na lesão tecidual relacionada à inflamação. E além de
produzir compostos oxidantes, contribui também para a regulação da resposta inflamatória à
invasão de microorganismos (ARNHOLD et al., 2004). Esta enzima é encontrada nos
neutrófilos, é comumente usada como um índice da infiltração de granulócitos, e sua inibição
é um indicativo de atividade antiinflamatória (FUJII et al., 2002).
Estudo realizado por Lau et al. (2005) permitiu caracterizar as propriedades da
MPO na inflamação. Primeiramente, a MPO não modula apenas a cascata de sinalização
intercelular, mas também modifica a via de sinalização intracelular nos PMNs. Em segundo
lugar as mudanças proporcionadas pela ativação PMNs independe da ação catalítica da
enzima, mas depende de suas propriedades biofísicas como ligante das integrinas
CD11b/CD18. Conseqüentemente, a ligação da MPO às integrinas leva a um aumento na
fosforilação da tirosina, ativação MAPK (mitogen antigen activate kinase) quinase,
translocação do NFκB e a modificações dos eventos que são sensíveis a reação redox
(GRIENDLING et al., 2000; HOMMES et al., 2003). Como as integrinas CD11b/CD18 estão
presentes também nos monócitos e células natural killer, a MPO de neutrófilos pode modular
também a ativação de outros leucócitos ligados à progressão de doenças inflamatórias
crônicas (HARRIS et al., 2000; LIBBY, 2002). Portanto, a MPO exerce funções que são
comuns às citocinas pró-inflamatórias potentes como TNF-α e IL-8, servindo não somente
como índice de recrutamento de neutrófilos, mas também modulando o estado de ativação de
leucócitos em doenças inflamatórias (LAU et al., 2005).
77
A FAL inibiu de modo significativo a secreção da mieloperoxidase e isto nos leva
a crer que este é um dos mecanismos de inibição da migração de PMNs para a cavidade
peritoneal de camundongos. Estudos que corroboram com nossos resultados (COIMBRA et
al., 2006), demonstraram que a pentoxifilina é capaz de reduzir a atividade da MPO e a
ativação do NF-kappaB no modelo de lesão pulmonar aguda induzida por LPS. Um
mecanismo semelhante pode também explicar a ações da FAL.
É comumente aceito que, em situações de estresse oxidativo, espécies reativas de
oxigênio (ERO), como o superóxido, radicais hidroxila e peroxil são gerados. Os ROS
desempenham um importante papel na patogênese de várias doenças graves, como desordens
neurodegenerativas, cancro, doenças cardiovasculares, aterosclerose, catarata, e inflamação
(ARUOMA, 1998; KRIS-ETHERTON et al., 2004). Além disso, vários estudos sugerem que
os antioxidantes e agentes anti-inflamatórios pode ser benéfico na prevenção e tratamento
dessas patologias (BAUEROVA; BEZEK, 1999; RAHMAN, 2002; HORTON, 2003).
A atividade antioxidante da FAL foi avaliada pela sua capacidade seqüestradora
de radicais livres no teste do DPPH, tal capacidade está relacionada com inibição da
peroxidação lipídica (REKKA; KOUROUNAKIS, 1991). Neste modelo, a fração acetato de
lupeol não demonstrou nenhuma atividade seqüestradora de radicais livres. Apesar dos
resultados obtidos, os dados são insuficientes para afirmarmos que o acetato de lupeol não
possui atividade antioxidante, visto que em estudos anteriores (CHATTERJEE et al., 2006), o
acetato de lupeol se mostrou eficaz como antioxidante no teste da atividade da enzima
superóxido-dismutase (SOD).
As propriedades analgésica e antiinflamatória do acetato de lupeol isolado do
látex de H. drasticus, evidenciadas neste estudo confirmam o valor etnofarmacológico da
espécie e apontam a droga como uma alternativa no tratamento de doenças nas quais o
processo inflamatório esteja presente.
78
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo dos efeitos da administração da fração acetato de lupeol (FAL) em
vários modelos de inflamação e nocicepção nos permitem as seguintes conclusões:
A FAL demonstrou pronunciada atividade analgésica no modelo de
contorções abdominais induzidas por ácido acético, inibindo a hiperalgesia
peritoneal, caracterizada pela redução do número de contorções abdominais;
No teste da formalina, a FAL inibiu a dor tanto na fase inicial quanto na
tardia, demonstrando que sua ação analgésica inibe mecanismos centrais e
periféricos de dor. Esta ação se mostrou mais pronunciada na fase tardia,
inibindo a dor de origem inflamatória;
O pré-tratamento com naloxona, antagonista opióide, no teste da formalina,
foi capaz de reverter o efeito antinociceptivo da FAL, demonstrando a
possível participação do sistema opióide no mecanismo de ação da FAL;
A FAL mostrou uma efetiva atividade antiedematogênica observada pela
inibição do edema de pata induzido por carragenina e dextrano em
camundongos;
A atividade antiedematogênica da FAL foi corroborada pela diminuição do
acúmulo de células inflamatórias, evidenciado na análise histopatológica dos
tecidos de pata de ratos submetidos ao modelo de edema induzido por
carragenina;
A atividade antiedematogênica da FAL parece estar relacionada com a
inibição da migração de PMNs para o foco inflamatório;
79
A FAL reduziu predominantemente a marcação de iNOS e de forma mais
discreta, TNF-α. Como avaliado na análise imunohistoquímica de tecido
conjuntivo de ratos de pata submetidos ao modelo de edema de pata induzido
por carragenina;
A FAL inibiu a migração de células para o foco inflamatório, no modelo de
peritonite induzida por carragenina, e este efeito pode está relacionada ao
bloqueio da degranulação de neutrófilos, prevenindo assim a ação da enzima
mieloperoxidase.
O mecanismo de ação da FAL pode estar relacionado à habilidade deste
composto em mimetizar efeitos de opióides endógenos, bem como, modular
fatores nucleares ligados à expressão de mediadores inflamatórios, contudo,
outros estudos são necessários para a confirmação desta hipótese.
80
CONCLUSÃO
O estudo forneceu evidências de que o acetato de lupeol, isolado de Himatanthus
drasticus, possui atividade antinociceptiva e antiinflamatória, demonstrando eficácia na
inibição de vias que induzem a inflamação.
81
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