universidade federal do cearÁ faculdade de medicina departamento de ... · perceber com mais...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM FARMACOLOGIA

GILMARA HOLANDA DA CUNHA

EFEITO FARMACOLGICO DAS FRAES HEXNICA, CLOROFRMICA E

METANLICA DO LEO ESSENCIAL DA ALPINIA ZERUMBET NA

REATIVIDADE VASCULAR IN VITRO E NOS PARMETROS

CARDIOVASCULARES IN VIVO

FORTALEZA

2012
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.nucom.ufc.br/brasaoUFC.jpg&imgrefurl=http://www.nucom.ufc.br/historia.html&usg=__sM867vOD0920GfMv-lLMmVckE54=&h=465&w=382&sz=53&hl=pt-BR&start=1&tbnid=5SD6Z1SCTfEHNM:&tbnh=128&tbnw=105&prev=/images%3Fq%3Dbras%25C3%25A3o%2Bufc%26gbv%3D2%26hl%3Dpt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.nucom.ufc.br/brasaoUFC.jpg&imgrefurl=http://www.nucom.ufc.br/historia.html&usg=__sM867vOD0920GfMv-lLMmVckE54=&h=465&w=382&sz=53&hl=pt-BR&start=1&tbnid=5SD6Z1SCTfEHNM:&tbnh=128&tbnw=105&prev=/images%3Fq%3Dbras%25C3%25A3o%2Bufc%26gbv%3D2%26hl%3Dpt-BR






Tese submetida Coordenao do Programa de Ps-

Graduao em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia da Universidade Federal do Cear, como

requisito parcial para obteno do grau de Doutor em

Farmacologia.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes

FORTALEZA

2012

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao Universidade Federal do Cear Biblioteca de Cincias da Sade

C978e Cunha, Gilmara Holanda da. Efeito farmacolgico das fraes hexnica, clorofrmica e metanlica

do leo essencial da Alpinia zerumbet na reatividade vascular in vitro e nos parmetros cardiovasculares in vivo / Gilmara Holanda da Cunha. 2012.

223 f.: il. color., enc. ; 30 cm. Tese (doutorado) Universidade Federal do Cear, Faculdade de

Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Ps-Graduao em Farmacologia, Fortaleza, 2012.

rea de Concentrao: Farmacologia. Orientao: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes. 1. Alpinia. 2. Fitoterapia. 3. Vasodilatao. 4. Hipertenso. 5.

Bloqueadores dos Canais de Clcio. I. Ttulo. CDD 615.1






Tese submetida Coordenao do Programa de Ps-Graduao em

Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade

Federal do Cear, como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em

Farmacologia.

Aprovado em: 18 de janeiro de 2012.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________ Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes (Orientadora)

Universidade Federal do Cear - UFC

____________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho

Universidade Federal do Cear - UFC

___________________________________________________ Prof. Dr. Francisco Vagnaldo Fechine Universidade Federal do Cear - UFC

___________________________________________________ Prof. Dr. Nilberto Robson Falco do Nascimento

Universidade Estadual do Cear - UECE

___________________________________________________ Profa. Dra. Gilmara Silva de Melo Santana

Universidade de Fortaleza - UNIFOR

DEDICATRIA

Aos meus queridos pais e ao meu amado esposo.

AGRADECIMENTOS

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeo a Deus, pois durante o doutorado senti sua

proteo como nunca fui capaz de sentir antes em minha vida. Ele me deu foras,

pacincia e sabedoria para estudar e realizar meus experimentos. Alm de me fazer

perceber com mais clareza o significado de ter sade, de relevar acontecimentos

desagradveis no trabalho e recomear... Hoje agradeo pela concretizao desta

etapa de minha vida acadmica.

A Nossa Senhora, minha me do cu e conselheira, por sua presena

constante em minha vida por meio da orao.

Aos meus queridos pais, Gilmar Ferreira da Cunha e Tnia Maria Holanda

da Cunha, pelo amor, cuidado e compreenso. J faz certo tempo desde que meu

pai me levava pela mo pra escola, e que minha me ensinava as minhas tarefas

em casa. Hoje compartilho com vocs a concluso do meu doutorado, visto que

foram fundamentais nesse processo, pois sempre me incentivaram a estudar. Vocs

so pais preciosos, nos quais vou me espelhar quando for criar os meus filhos.

Aos meus irmos, Gilmar Ferreira da Cunha Jnior e Giselly Holanda da

Cunha, pelo carinho.

Ao meu amado esposo, Alfredo Silveira Arajo Neto. Considero este

doutorado um investimento nosso, pois dedicamos muitos dos nossos momentos a

ele, assim como a minha dedicao exclusiva ps-graduao s foi possvel

devido a sua ajuda. Obrigada pelas vezes em me acompanhou nos experimentos

aos sbados, domingos e feriados, que segurou os ratos pra eu fazer gavagem, que

carregou minhas caixas de ratos... Acredito que sua compreenso, pacincia e

incentivo suavizaram o meu cansao, alm de ter demonstrado seu amor

incondicional por mim.

Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes. Deixo aqui registrado o

meu carinho e a minha admirao pela senhora, como pesquisadora, professora e

exemplo de trabalho. Durante o mestrado e doutorado em que a senhora foi minha

orientadora, muito aprendi com suas orientaes cientficas e tambm com nossas

conversas sobre a vida. Acredito que durante esta fase na Unidade de Farmacologia

Clnica (UNIFAC) fui capaz de absorver o que de melhor foi me passado, seja sobre

o ambiente de trabalho, dos ensaios clnicos e da pesquisa. Obrigada pelo apoio nos

momentos difceis da minha vida e pela oportunidade e confiana em me deixar

ministrar suas aulas na graduao, pois muito aprendi e aperfeioei minha

capacidade de ensinar. Hoje estou mais qualificada profissionalmente, seja como

professora ou pesquisadora. Agradeo tambm por usar a estrutura da UNIFAC para

realizar meus experimentos, visto que nunca me faltaram equipamentos e frmacos,

o que uma conquista da senhora por meio de seu esforo e trabalho.

Ao Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes Filho, que me deu a oportunidade

de estudar a Alpinia zerumbet, esta planta com tantos atributos farmacolgicos.

Gostaria de dizer que o senhor um pesquisador e professor pelo qual tenho

profundo respeito e admirao. Ainda lembro-me das suas aulas de farmacologia na

graduao da enfermagem, onde fui sua aluna. Sempre entusiasmado com as

novidades no mundo da pesquisa, alm de ser um exemplo de empreendedorismo

na rea da Farmacologia em nosso pas.

Ao Prof. Dr. Francisco Vagnaldo Fechine, meu coorientador. O considero

um cientista com grande devoo pela pesquisa. Voc uma pessoa pela qual

tenho muito carinho e estima. Meu eterno agradecimento pelas orientaes, apoio

dirio, pacincia, amizade e colaboraes valiosas durante o desenvolvimento desta

tese. Nunca esquecerei nossas discusses, s vezes estressantes, mas que eram

repletas de conhecimentos e orientaes que contriburam de forma estatisticamente

significante para o meu crescimento como pesquisadora.

Ao Prof. Dr. Edilberto Rocha Silveira. Apesar da pouca convivncia, pude

perceber sua dedicao ao ensino e a pesquisa. Obrigada pelas fraes do leo

essencial da Alpinia zerumbet, as quais foram estudadas nesse trabalho. Agradeo

tambm por ter recebido a mim em seu local de trabalho, na Qumica, depois das 17

horas e at aos sbados, e estar sempre disponvel quando lhe telefonava pra tirar

dvidas.

Ao qumico, Dr. Cludio Costa dos Santos, que participou da minha banca

de qualificao do doutorado, ajudou com as fraes do leo essencial da Alpinia

zerumbet e diluio das drogas utilizadas no estudo. Obrigada pelas discusses de

qumica e por sempre ser to atencioso.

Ao Prof. Dr. Fernando Antnio Frota Bezerra, um exemplo de professor e

mdico, que conheci na UNIFAC, e que muito contribuiu para o meu

desenvolvimento como pesquisadora.

enfermeira Ana Leite, gerente do ncleo da garantia da qualidade da

UNIFAC, pelas orientaes acerca da pesquisa clnica e pelas idias trocadas no

dia-a-dia.

Aos colegas de ps-graduao da UNIFAC, em especial, Jonaina Oliveira,

Andra Pontes, Marina Becker e Diogo de Almeida pela amizade.

Aos bolsistas de iniciao cientfica Layana Vieira, Ldia Audrey, Hugo

Robert, Danilo Galvo e Wallady Barroso por me ajudarem nos experimentos,

mesmo cansados, nos feriados, finais de semana e frias.

Aos colegas de ps-graduao do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, especialmente, Rafael Coelho Jorge, pela amizade.

Ao Professor Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhes e Dr. Rodrigo Siqueira,

pelas orientaes preciosas acerca dos experimentos de reatividade vascular.

A todos os professores do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Faculdade de Medicina da UFC, pelas orientaes acerca da Farmacologia.

Aos funcionrios da UNIFAC, Malu Amaral, Fbia Bezerra, Tereza Rocha,

Flvia Martins, Raimundo, Tnia, Rogria, dona Bia, Dalva e Sr. Francisco por toda

ajuda durante meu doutorado na UNIFAC.

Aos funcionrios do Laboratrio de Oncologia Experimental (LOE),

especialmente, Silvana Frana, Erivanda Rios e Adelnia Roque.

Aos funcionrios do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Cear, em especial, Aura

Rhanes, Mrcia, Alana, Joana, Sr. Fernando e os funcionrios do biotrio, Sr. Bento

e Sr. Aroldo.

Aos professores doutores Gilmara Silva de Melo Santana e Nilberto

Robson Falco do Nascimento, por aceitarem participar na minha banca do

doutorado, bem como pelas contribuies e sugestes para a verso final desta

tese.

Meu singelo agradecimento e o meu respeito aos inmeros ratos, que

mesmo involuntariamente, deram suas vidas para a realizao desta pesquisa.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior

(CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq),

Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

(FUNCAP) e Instituto Claude Bernard (InCB) pela colaborao financeira e incentivo

ao desenvolvimento da pesquisa no Brasil.

EPGRAFE

Rir muito e com frequncia; ganhar o respeito de

pessoas inteligentes e o afeto das crianas; merecer a

considerao de crticos honestos e suportar a traio de

falsos amigos; apreciar a beleza, encontrar o melhor nos

outros; deixar o mundo um pouco melhor, seja por uma

saudvel criana, um canteiro de jardim ou uma redimida

condio social; saber que ao menos uma vida respirou mais

fcil porque voc viveu. Isso ter tido sucesso.

Ralph Waldo Emerson (1803-1882)

RESUMO

RESUMO Efeito farmacolgico das fraes hexnica, clorofrmica e metanlica do leo essencial da Alpinia zerumbet na reatividade vascular in vitro e nos parmetros cardiovasculares in vivo. Gilmara Holanda da Cunha. Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes. Tese de Doutorado em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia. Faculdade de Medicina. Universidade Federal do Cear, 2012. A Alpinia zerumbet uma planta da famlia Zingiberaceae, denominada popularmente colnia no Nordeste do Brasil. utilizada com fins medicinais no tratamento de hipertenso e tem sido estudada em relao as suas propriedades farmacolgicas. Esta pesquisa teve por objetivo analisar o efeito farmacolgico das fraes hexnica (FHOEAz), clorofrmica (FCOEAz) e metanlica (FMOEAz) do leo essencial da Alpinia zerumbet (OEAz) na reatividade vascular in vitro e nos parmetros cardiovasculares in vivo. O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comisso de tica em Pesquisa Animal, da Universidade

Federal do Cear, sob os protocolos n 55/10 e n 18/2011, de acordo com as normas de boas prticas que envolvem o uso de animais experimentais. Para todos os experimentos foram utilizados ratos Wistar machos. Realizaram-se experimentos de reatividade vascular no banho de rgos, com preparaes de aorta isolada de rato, com endotlio ntegro e desnudo, mantidos em carbognio e soluo de Krebs-Henseleit com concentrao em mmol/L: NaCl: 118,0; KCl: 4,7; KH2PO4: 1,2; MgSO4.7H2O; 1,2; NaHCO3: 15,0; CaCl2: 2,5 e Glicose: 5,5. Foi observada a variao da tenso isomtrica e utilizados diferentes frmacos inibidores especficos para anlise do mecanismo de ao do efeito vasodilatador. Analisou-se a presso arterial indireta por pletismografia de cauda em ratos submetidos ao modelo de hipertenso por inibio crnica do xido ntrico, atravs da administrao do L-NAME, obtendo-se a presso arterial sistlica, diastlica e mdia, frequncia cardaca, alm da variao do peso corporal. Constatou-se que o OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz

induzem relaxamento de anis articos pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L), de forma

dependente da dose, sendo a menor CE50 a da FMOEAz (150,45 g/mL). A administrao por gavagem de 100 mg/kg de OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz reduziu a presso arterial em ratos hipertensos pelo modelo de inibio crnica do xido ntrico, um efeito que foi superior ao controle negativo com gua destilada e inferior aos controles positivos com

Captopril e Nifedipina. A FMOEAz (0,1 - 3000 g/mL) induz relaxamento dependente da

dose em anis articos pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L) ou KCl (80 mmol/L), com endotlio intacto ou desnudo. Os estudos de mobilizao de clcio mostraram que a FMOEAz inibe o influxo de Ca2+ do meio extracelular, bem como interfere na contrao

induzida pela liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares pela Fenilefrina (1 mol/L) ou Cafena (30 mmol/L). A 4-aminopiridina (1 mmol/L) e a Iberiotoxina (30 nmol/L) aumentam a CE50 da FMOEAz, mas no interferem no seu efeito vasodilatador final. A pr-incubao

com L-NAME (100 mol/L), ODQ (10 mol/L); Indometacina (10 mol/L), Atropina (1

mol/L), Catalase (500 U/ml), SOD (300 U/mL); Wortmannina (0,5 mol/L), Tetraetilamnio

(10 mmol/L), Apamina (1 mol/L); Caribdotoxina (15 nmol/L) e Glibenclamida (10 mol/L) no interferiram no relaxamento induzido pela FMOEAz. Concluiu-se que o OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz possuem efeito hipotensor in vivo e vasodilatador in vitro, e que o mecanismo de ao da FMOEAz, provavelmente, envolve o antagonismo aos canais de clcio dependentes de voltagem, aos canais de clcio operados por receptor, interferindo tambm na liberao de clcio dos estoques intracelulares.

Palavras-chave: Alpinia; Fitoterapia; Vasodilatao; Hipertenso; Bloqueadores dos Canais de Clcio.

ABSTRACT

ABSTRACT Pharmacological effect of the hexanic, chloroformic and methanolic fractions of the essential oil of Alpinia zerumbet in the vascular reactivity in vitro and cardiovascular parameters in vivo. Gilmara Holanda da Cunha. Supervisor: PhD. Professor Maria Elisabete Amaral de Moraes. Doctoral Thesis in Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology. Faculty of Medicine. Federal University of Cear, 2012. The Alpinia zerumbet is a plant of the family Zingiberaceae, popularly called "colnia" in Northeastern Brazil. It is used for medicinal purposes to treat hypertension and has been studied in relation to its pharmacological properties. This study aimed to analyze the pharmacological effect of hexanic (HFEOAz), chloroformic (CFEOAz), and methanolic (MFEOAz) fractions of the essential oil of Alpinia zerumbet (EOAz) in the vascular reactivity in vitro and cardiovascular parameters in vivo. The research project was approved by the Ethics Committee on Animal Research, of the Federal University of Cear, under protocol numbers 55/10 and 18/2011, according to the standards of good laboratory practice involving the use of experimental animals. For all experiments male Wistar rats were used. Experiments of vascular reactivity were conducted in organ bath, with preparations of isolated rat aorta with intact endothelium and desnuded, kept in carbogen and Krebs-Henseleit solution with a concentration in mmol/L: NaCl: 118,0; KCl: 4,7; KH2PO4: 1,2; MgSO4.7H2O; 1,2; NaHCO3: 15,0; CaCl2: 2,5 e Glicose: 5,5. Was observed variation in isometric tension and used different specific inhibitors to analyze the mechanism of action of the vasodilator effect. We analyzed blood pressure indirectly by tail plethysmography in rats submitted to chronic hypertension by inhibition of nitric oxide by the administration of L-NAME, obtaining the systolic, diastolic and mean blood pressure, heart rate, beyond variation in body weight. It was found that the EOAz, HFEOAz, CFEOAz MFEOAz induced

relaxation of aortic rings pre-contracted with Phenylephrine (1 mol/L), of dose-dependent manner, with the smallest of the EC50 MFEOAz (150.45 mg/mL). The administration by gavage of 100 mg/kg EOAz, HFEOAz, CFEOAz MFEOAz reduced blood pressure in hypertensive rats by the model of chronic inhibition of nitric oxide, an effect that was greater than the negative control with distilled water and less than the positive controls with Captopril and Nifedipine. The MFEOAz (0.1 - 3000 g/mL) concentration dependently relaxed

Phenylephrine (1 mol/L) and KCl (80 mmol/L) contracted rings with intact or denuded endothelium. Studies of calcium mobilization showed that FMOEAz inhibits the influx of Ca2+ from the extracellular environment and interferes with the contraction-induced Ca2+ release

from intracellular stocks by Phenylephrine (1 mol/L) or Caffeine (30 mmol/L). The 4-aminopyridine (1 mmol/L) and Iberiotoxina (30 nmol/L) increased the EC50 of MFEOAz but do

not interfere in its final vasodilator effect. The pre-incubation with L-NAME (100 mol/L),

ODQ (10 mol/L), Indomethacin (10 mol/L), Atropine (1 mol/L), Catalase (500 U/mL), SOD

(300 U/mL), Wortmannin (0.5 mol/L), Tetraethylammonium (10 mmol/L), Apamin (1 mol/L);

Caribdotoxin (15 nmol/L) and Glibenclamide (10 mol/L) did not interfere with the relaxation induced by MFEOAz. It was concluded that the EOAz, HFEOAz, CFEOAz and MFEOAz have hypotensive effect in vivo and vasodilator effect in vitro, and that the mechanism of action of MFEOAz probably involves the antagonism of calcium channels voltage-dependent, the calcium channel operated by receptor, also interfering in the release of calcium from intracellular stores.

Keywords: Alpinia; Phytotherapy; Vasodilatation; Hypertension; Calcium Channel Blockers.

LISTAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA cido araquidnico

ACH Acetilcolina

AcOEt Acetato de etila

ADP Difosfato de adenosina

AMPc Adenosina 3',5'-monofosfato cclico

Anvisa Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

APA Apamina

ATP Trifosfato de Adenosina

ATPase Famlia de enzimas que catalisam a hidrlise do ATP

4-AP 4-aminopiridina

Ca2+ Clcio

CaCl2 Cloreto de clcio

CaM Calmodulina

CTX Caribdotoxina

CE50 Concentrao ou dose necessria para produzir 50% da resposta mxima

CEPA Comisso de tica em Pesquisa Animal

CHCl3 Clorofrmio

COBEA Colgio Brasileiro de Experimentao Animal

COX Ciclooxigenase

DC Doenas cardiovasculares

DER Dose equivalente em ratos

DL50 Quantidade de substncia que causa morte em 50% da populao em estudo

DMSO Dimetilsulfxido

DMT Dose mxima tolerada

ECA Enzima conversora de angiotensina

FCOEAz Frao clorofrmica do leo essencial da Alpinia zerumbet

EGTA Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N,N-tetraacetic acid

Emax Resposta mxima passvel de ser produzida pela substncia

FC Frequncia cardaca

FDA Food and Drug Administration

FHOEAz Frao hexnica do leo essencial da Alpinia zerumbet

FMOEAz Frao metanlica do leo essencial da Alpinia zerumbet

GC Guanilato ciclase

GLIB Glibenclamida
http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Hidr%C3%B3lise

GMPc Monofosfato cclico de guanosina

GPCR Receptor controlado por protena G

GCs Guanilato Ciclase solvel

HAS Hipertenso arterial sistmica

HDL High Density Lipoprotein

H2O2 Perxido de hidrognio

HO Radical hidroxil

IA ndice aritmtico

INDO Indometacina

ITX Iberiotoxina

IK ndice de Kovats

IP3 Trifosfato de inositol

IP3R Receptor de IP3

K+ Potssio

KCl Cloreto de potssio

KH2PO4 Fosfato de potssio monobsico

km Fator para converso

LDL Lipoprotena de baixa densidade

L-NAME N-Nitro-L-arginine-methyl-ester-hydrocloride

log tR Logaritmo do tempo de reteno

M Molar

mM Milimolar

MeOH Metanol

MgSO4.7H2O Sulfato de magnsio hidratado

mmHg Milmetro de mercrio

mN MiliNewton

MLCK Quinase da cadeia leve de miosina

NaCl Cloreto de sdio

NaHCO3 Bicarbonato de sdio

NaOH Hidrxido de sdio

N2 Gs nitrognio

NAD Nicotinamida adenina dinucleotdeo

NADP Nicotinamida adenina dinucletido fosfato

NO xido ntrico

NOAEL No observable adverse effect level

O2 Oxignio molecular

O2- Superxido

ODQ 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one

OEAz leo essencial da Alpinia zerumbet

PA Presso arterial

PAD Presso arterial diastlica

PAM Presso arterial mdia

PAS Presso arterial sistlica

PDE Fosfodiesterase

PFV Protena fluorescente verde

PGI2 Prostaglandina I2

pH Potencial de hidrognio inico

PHE Fenilefrina

PK Protena quinase

PLC Fosfolipase C

RMN Ressonncia magntica nuclear

RMN 1H Ressonncia magntica nuclear de hidrognio

SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia

SOD Superxido dismutase

SR Retculo sarcoplasmtico

TEA Tetraetilamnio

TGO Transaminase glutmico oxalactica

TGP Transaminase glutmico pirvica

tR Tempo de reteno

U Unidade

LISTA DE FIGURAS

1. A: Msculo liso multiunitrio. B: Msculo liso unitrio...........................................

36

2. Estrutura fsica do msculo liso.............................................................................

38

3. Acoplamento excitao-contrao no msculo liso...............................................

39

4. Mecanismos de controle da contrao e do relaxamento do msculo liso...........

40

5. Subunidades que constituem o canal de clcio.....................................................

48

6. Domnios I, II, III e IV da subunidade 1 do canal de clcio e segmentos transmembrana......................................................................................................

48

7. Foto ilustrativa de um espcime de Alpinia zerumbet...........................................

54

8. Foto ilustrativa da Alpinia zerumbet na poca da florao....................................

55

9. Foto ilustrativa da Alpinia zerumbet, evidenciando a estrutura interna da flor......

55

10. Estrutura qumica do Terpinen-4-ol.......................................................................

60

11. Estrutura qumica do 1,8-Cineol............................................................................

60

12. Foto ilustrativa da exsicata de material coletado da Alpinia zerumbet..................

68

13. Fluxograma de obteno das fraes hexnica (FHOEAz), clorofrmica (FCOEAz) e metanlica (FMOEAz) do OEAz.......................................................

70

14. Estruturas qumicas dos componentes majoritrios do OEAz: 1,8-Cineol e Terpinen-4-ol.........................................................................................................

72

15. Espectros de ressonncia magntica nuclear de hidrognio (RMN 1H) do OEAz.....................................................................................................................

73

16. Estruturas qumicas dos componentes majoritrios da FHOEAz: sabineno, p-cimeno e -terpineno.............................................................................................

74

17. Espectro de ressonncia magntica nuclear de hidrognio (RMN 1H) da FHOEAz.................................................................................................................

75

18. Estruturas qumicas dos componentes majoritrios da FCOEAz: 1,8-Cineol e Terpinen-4-ol.........................................................................................................

76

19. Espectros de ressonncia magntica nuclear de hidrognio (RMN 1H) da FCOEAz.................................................................................................................

77

20. Estruturas qumicas dos componentes majoritrios da FMOEAz: 1,8-Cineol Terpinen-4-ol.........................................................................................................

78

21. Espectros de ressonncia magntica nuclear de hidrognio (RMN 1H) da FMOEAz...............................................................................................................

79

22. Unidade de Farmacologia Clnica (UNIFAC) e Laboratrio de Farmacologia Pr-clnica..............................................................................................................

80

23. Rato Wistar macho................................................................................................

81

24. Procedimento para retirar aorta torcica do rato...................................................

84

25. Preparao dos anis de aorta para experimento de reatividade vascular...........

85

26. Experimento de reatividade vascular.....................................................................

86

27. Equipamentos utilizados no experimento de reatividade vascular........................

87

28. Representao esquemtica do teste de viabilidade dos anis articos..............

88

29. Representao esquemtica do protocolo para anlise inicial do efeito relaxante do OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz..............................................

89

30. Medida indireta da presso arterial por pletismografia de cauda..........................

91

31. Grfico obtido atravs de medida indireta da presso arterial por pletismografia de cauda, evidenciando presso arterial do rato de 118 x 85 mmHg...................

92

32. Descrio dos grupos e fluxograma do experimento in vivo.................................

95

33. Representao esquemtica do protocolo para avaliao do efeito da FMOEAz em anis articos pr-contrados com Fenilefrina e a participao do endotlio vascular.................................................................................................................

96

34. Representao esquemtica do protocolo para avaliao do efeito da FMOEAz em anis articos pr-contrados com KCl e a participao do endotlio vascular.................................................................................................................

97

35. Representao esquemtica do protocolo para avaliao do envolvimento do xido ntrico no efeito relaxante da FMOEAz........................................................

97

36. Representao esquemtica do protocolo para avaliao da contribuio da GCs para o efeito relaxante da FMOEAz..............................................................

98

37. Representao esquemtica do protocolo para avaliao do envolvimento de prostanides no efeito relaxante da FMOEAz.......................................................

98

38. Representao esquemtica do protocolo para avaliao da participao dos receptores muscarnicos para o efeito relaxante da FMOEAz..............................

99

39. Representao esquemtica do protocolo para anlise da participao de espcies reativas de oxignio no efeito vasodilatador da FMOEAz......................

99

40. Representao esquemtica do protocolo da avaliao da participao do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no efeito vasodilatador da FMOEAz.................

100

41. Representao esquemtica do protocolo para anlise da contribuio do bloqueio no seletivo dos canais de K+ no efeito relaxante induzido pela FMOEAz................................................................................................................

100

42. Representao esquemtica do protocolo para anlise da contribuio do bloqueio seletivo dos canais de K+ no efeito relaxante induzido pela FMOEAz................................................................................................................

101

43. Representao esquemtica do protocolo para investigao do efeito inibitrio da FMOEAz sobre o influxo de Ca2+ atravs dos canais de clcio dependentes de voltagem, sem depleo do Ca2+ intracelular...................................................

102

44. Representao esquemtica do protocolo para investigao do efeito inibitrio da FMOEAz sobre o influxo de Ca2+ atravs dos canais de clcio operados por receptor ou canais de Ca2+ regulados por voltagem, aps depleo do Ca2+ intracelular.............................................................................................................

103

45. Representao esquemtica do protocolo para investigao da interferncia da FMOEAz na liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares..................................

104

46. Curvas concentrao-efeito relativas ao relaxamento induzido por diferentes concentraes (0,01 a 3000,0 g/mL) do leo essencial de Alpinia zerumbet e fraes hexnica (FHOEAz), clorofrmica (FCOEAz) e metanlica (FMOEAz) em anis de aorta com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L)...................................................................................................................

112

47. Efeito bifsico induzido pela frao hexnica (FHOEAz) e, de forma menos pronunciada, pelo leo essencial de Alpinia zerumbet (OEAz) e fraes clorofrmica (FCOEAz) e metanlica (FMOEAz)..................................................

113

48. Avaliao da potncia do leo essencial de Alpinia zerumbet (OEAz) e fraes hexnica (FHOEAz), clorofrmica (FCOEAz) e metanlica (FMOEAz) em relao ao grau de relaxamento em anis de aorta com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L)...................................................................

114

49. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) durante a fase de induo da hipertenso arterial sistmica (HAS)...................................................

115

50. Taxa de aumento da presso arterial sistlica (TAPAS) observada nos grupos gua e L-NAME durante a fase de induo da HAS (0 a 30 dias)........................

116

51. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) durante a fase de induo da hipertenso arterial sistmica (HAS)...................................................

117

52. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) durante a fase de induo da hipertenso arterial sistmica (HAS)...................................................

117

53. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) durante a fase de induo da hipertenso arterial sistmica (HAS).....................................................................

118

54. Variao da massa corporal, em termos percentuais dos grupos gua e L-NAME durante a fase de induo da HAS (0 a 30 dias), em relao ao valor basal......................................................................................................................

118

55. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz.................................................................................

119

56. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz............................................................................

120

57. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz............................................................................

121

58. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz............................................................................

122

59. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz..............................................................................

123

60. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz...........

124

61. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz......

125

62. Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz......

126

63 Progresso temporal da presso arterial sistlica (PAS) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz.....

127

64. rea sob a curva da presso arterial sistlica (PAS) em funo do tempo (30

ao 60 dia), referente aos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz............

128


ao 60 dia), referente aos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz.......

128


ao 60 dia), referente aos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz.......

129


ao 60 dia), referente aos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz......

129


ao 60 dia), referente aos grupos OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz.............

129

69. Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) observada nos grupos

Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz durante a fase de tratamento (30 ao

60 dias).................................................................................................................

130


Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz durante a fase de tratamento (30 ao

60 dia)..................................................................................................................

130


Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz durante a fase de tratamento (30 ao

60 dia)..................................................................................................................

131

72 Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) observada nos grupos

Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz durante a fase de tratamento (30 ao

60 dia)..................................................................................................................

131


EOAz, FHEOAz, FCEOAz e FMOEAz durante a fase de tratamento (30 ao

60 dias).................................................................................................................

131

74. Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz durante os primeiros 6 dias da fase de tratamento (30 ao 36 dias)....................................................................................................

132

75. Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz durante os primeiros 6 dias da fase de tratamento (30 ao 36 dias)..................................................................................

132

76. Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz durante os primeiros 6 dias da fase de tratamento (30 ao 36 dias)..................................................................................

133

77. Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz durante os primeiros 6 dias da fase de tratamento (30 a 36 dias)....................................................................................

133

78. Taxa de reduo da presso arterial sistlica (PAS) nos grupos EOAz, FHEOAz, FCEOAz e FMOEAz durante os primeiros 6 dias da fase de tratamento (30 ao 36 dias)..................................................................................

134

79. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz.................................................................................

135

80. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz............................................................................

136

81. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz............................................................................

137

82. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz............................................................................

138

83. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) nos grupos OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz..............................................................................

139

84. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz...........

140

85. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz......

141

86. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz......

142

87. Progresso temporal da presso arterial diastlica (PAD) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz.....

143

88. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz.................................................................................

144

89. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz............................................................................

145

90. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz............................................................................

146

91. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz. ..........................................................................

147

92. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) nos grupos OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz. ............................................................................

148

93. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz...........

149

94. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz......

150

95. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz......

151

96. Progresso temporal da presso arterial mdia (PAM) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz.....

152

97. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz.................................................................................

153

98. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz............................................................................

154

99. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz............................................................................

154

100. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz............................................................................

155

101. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) nos grupos OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz..............................................................................................

155

102. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e OEAz.............................

156

103. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FHOEAz........................

157

104. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FCOEAz........................

157

105. Progresso temporal da frequncia cardaca (FC) durante a fase de tratamento observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina e FMOEAz........................

158

106. Variao da massa corporal, em termos percentuais, observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina, OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz durante a fase de induo da HAS (0 a 30 dias), tomando-se como valores basais aqueles mensurados no dia 0 do experimento......................................................

159

107. Variao da massa corporal, em termos percentuais, observada nos grupos Controle, Captopril, Nifedipina, OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz durante a

fase de tratamento da HAS (31 a 60 dias), tomando-se como valores basais aqueles mensurados no dia 30 do experimento....................................................

159

108. Efeito vasodilatador induzido pela FMOEAz em anis de aorta de rato pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L) em preparaes com endotlio ntegro (Endotlio(+)) e desprovidas de endotlio (Endotlio(-)).......................................

160

109. Efeito vasodilatador induzido pela FMOEAz em anis de aorta de rato pr-contrados com KCl (80 mmol/L) em preparaes com endotlio ntegro (Endotlio(+)) e desprovidas de endotlio (Endotlio(-)).......................................

161

110. Curvas concentrao-efeito relativas ao relaxamento induzido pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L) ou KCl (80 mmol/L)..............................................................................

162

111. Curvas concentrao-efeito relativas ao relaxamento induzido pela FMOEAz em anis de aorta de rato desprovidas de endotlio pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L) ou KCl (80 mmol/L).............................................................

163

112. Efeito da N-Nitro-L-arginine-methyl-ester-hydrocloride (L-NAME) (100 mol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).........................

164

113. Efeito do 1H-[1,2,4]Oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ) (10 mol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).................................

165

114. Efeito da Indometacina (10 mol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).............................................................................................

166

115. Efeito da Atropina (1 mol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).............................................................................................

167

116. Efeito da Catalase (500 U/mL) e SOD (300 U/mL) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com fenilefrina (1 mol/L)....................................................................

168

117. Efeito da Wortmannina (0,5 mol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).............................................................................................

169

118. Efeito do Tetraetilamnio (TEA) (10 mmol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L)...................................................................

170

119. Efeito da 4-Aminopiridina (1 mmol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).............................................................................................

171

120. Efeito da Apamina (1 mol/L), Caribdotoxina (15 nmol/L) e Iberiotoxina (30 nmol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).............

172

121. Efeito da Glibenclamida (10 mol/L) na resposta vasodilatadora induzida pela FMOEAz em anis de aorta de rato com endotlio ntegro pr-contrados com Fenilefrina (1 mol/L).............................................................................................

173

122. Efeito da FMOEAz na contrao induzida por CaCl2 em anis de aorta de rato com endotlio intacto. Curvas concentrao-efeito para CaCl2 foram determinadas em soluo de Krebs sem clcio contendo KCl (60 mmol/L).........

174

123. Efeito da FMOEAz na contrao induzida por CaCl2 em anis de aorta de rato desprovidos de endotlio. Curvas concentrao-efeito para CaCl2 foram determinadas em soluo de Krebs sem clcio contendo KCl (60 mmol/L).........

175

124. Efeito da FMOEAz na contrao induzida por CaCl2 em soluo sem clcio contendo KCl (60 mmol/L), aps a depleo dos estoques intracelulares de clcio. As curvas concentrao-efeito foram determinadas em anis de aorta de rato com endotlio intacto na ausncia (CaCl2) ou aps 30 minutos de incubao com FMOEAz (300 g/mL)..................................................................

176

125. Efeito da FMOEAz na contrao induzida por CaCl2 em soluo sem clcio contendo KCl (60 mmol/L), aps a depleo dos estoques intracelulares de clcio. As curvas concentrao-efeito foram determinadas em anis de aorta de rato desprovidos de endotlio na ausncia (CaCl2) ou aps 30 minutos de incubao com FMOEAz (300 g/mL)..................................................................

176

126. Efeito da FMOEAz na contrao induzida por CaCl2 em soluo sem clcio contendo Fenilefrina (1 mol/L), aps a depleo dos estoques intracelulares de clcio. As curvas concentrao-efeito foram determinadas em anis de aorta de rato com endotlio intacto na ausncia (CaCl2) ou aps 30 minutos de incubao com FMOEAz (300 g/mL)..................................................................

177

127. Efeito da FMOEAz na contrao induzida por CaCl2 em soluo sem clcio contendo Fenilefrina (1 mol/L), aps a depleo dos estoques intracelulares de clcio. As curvas concentrao-efeito foram determinadas em anis de aorta de rato desprovidos de endotlio na ausncia (CaCl2) ou aps 30 minutos de incubao com FMOEAz (300 g/mL).............................................................

177

128. Efeito da FMOEAz na resposta contrtil induzida pela Fenilefrina em anis de aorta de rato com endotlio intacto em soluo de Krebs sem clcio...................

178

129. Efeito da FMOEAz na resposta contrtil induzida pela Fenilefrina em anis de aorta de rato desprovidos de endotlio em soluo de Krebs sem clcio.............

179

130. Efeito da FMOEAz na resposta contrtil induzida pela Cafena em anis de aorta de rato com endotlio intacto em soluo de Krebs sem clcio...................

179

131. Efeito da FMOEAz na resposta contrtil induzida pela Cafena em anis de aorta de rato desprovidos de endotlio em soluo sem clcio............................

180

LISTA DE QUADROS

1. Classificao filogentica e funo dos canais de clcio.........................................

49

2. Classificao atual dos frmacos antagonistas dos canais de Ca2+........................

50

3. Classificao atual das diidropiridinas......................................................................

50

4 Frmacos e diluies utilizadas nos experimentos in vitro.......................................

106

5. Frmacos, dosagem e veculo utilizados nos experimentos in vivo.........................

106

6. Sntese dos resultados obtidos nos experimentos para identificao do possvel mecanismo de ao da FMOEAz.............................................................................

181

LISTA DE TABELAS

1. Propriedades fsico-qumicas do OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz...............................................................................................................

71

2. Constituintes qumicos do OEAz identificados por cromatografia gasosa acoplada ao detector de massa............................................................................

72

3. Constituintes qumicos da FHOEAz identificados por cromatografia gasosa acoplada ao detector de massa............................................................................

74

4. Constituintes qumicos da FCOEAz identificados por cromatografia gasosa acoplada ao detector de massa............................................................................

76

5. Constituintes qumicos da FMOEAz identificados por cromatografia gasosa acoplada ao detector de massa............................................................................

78

6. Valores da CE50 e Emax referentes ao efeito vasodilatador do leo essencial de Alpinia zerumbet (OEAz) e das fraes hexnica (FHOEAz), clorofrmica (FCOEAz) e metanlica (FMOEAz) em relao ao grau de relaxamento............

114

SUMRIO

SUMRIO

1 INTRODUO........................................................................................ 36

1.1 O msculo liso vascular....................................................................... 36

1.2 Hipertenso arterial sistmica e abordagens teraputicas............... 43

1.3 O clcio, a farmacologia e os antagonistas dos canais de clcio.... 45

1.4 Os fitoterpicos..................................................................................... 51

1.5 Alpinia zerumbet................................................................................... 53

1.5.1 Propriedades farmacolgicas da Alpinia zerumbet................................. 56

1.5.2 leo essencial da Alpinia zerumbet (OEAz)........................................... 59

1.6 Relevncia e justificativa...................................................................... 63

2 OBJETIVOS............................................................................................ 66

3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL............................................................ 68

3.1 Anlise fitoqumica............................................................................... 68

3.1.1 Coleta do material vegetal....................................................................... 68

3.1.2 Preparao do material vegetal.............................................................. 69

3.1.2.1 leo essencial da Alpinia zerumbet............................................ 69

3.1.2.2 Fraes hexnica, clorofrmica e metanlica do leo essencial

da Alpinia zerumbet.................................................................................

69

3.1.3 Identificao e anlise dos constituintes qumicos do OEAz, FHOEAz,

FCOEAz e FMOEAz...............................................................................

71

3.2 Local de realizao do estudo............................................................. 80

3.3 Animais.................................................................................................. 81

3.4 Aspectos ticos..................................................................................... 82

3.5 Experimentos......................................................................................... 82

3.5.1 Procedimentos para realizao dos estudos in vitro............................... 83

3.5.2 Estudo in vitro preliminar ou inicial: Anlise do efeito relaxante do

OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz em anis de aorta pr-

contrados com Fenilefrina......................................................................

89

3.5.3 Estudo in vivo: Medida indireta da presso arterial por pletismografia

de cauda em ratos submetidos ao modelo de hipertenso crnica por

inibio do xido ntrico e tratamento com OEAz, FHOEAz, FCOEAz,

e FMOEAz...............................................................................................

89

3.5.4 Aplicao de protocolos especficos in vitro para caracterizao do

possvel mecanismo de ao da substncia que mostrou melhor perfil

farmacolgico no estudo in vitro preliminar ou inicial e no estudo in

vivo..........................................................................................................

96

3.5.4.1 Efeito da FMOEAz em anis articos pr-contrados com

Fenilefrina e a participao do endotlio vascular..................................

96

3.5.4.2 Efeito da FMOEAz em anis articos pr-contrados com KCl e

a participao do endotlio vascular.......................................................

97

3.5.4.3 Avaliao do envolvimento do xido ntrico no efeito relaxante

da FMOEAz.............................................................................................

97

3.5.4.4 Contribuio da Guanilato Ciclase solvel (GCs) para o efeito

relaxante da FMOEAz.............................................................................

98

3.5.4.5 Avaliao do envolvimento de prostanides no efeito relaxante

da FMOEAz.............................................................................................

98

3.5.4.6 Participao dos receptores muscarnicos no efeito relaxante

da FMOEAz.............................................................................................

99

3.5.4.7 Participao de espcies reativas de oxignio no efeito

vasodilatador da FMOEAz......................................................................

99

3.5.4.8 Avaliao da participao do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)

no efeito vasodilatador da FMOEAz........................................................

100

3.5.4.9 Contribuio do bloqueio no seletivo dos canais de K+ no

efeito relaxante induzido pela FMOEAz..................................................

100

3.5.4.10 Contribuio do bloqueio seletivo dos canais de K+ no efeito

relaxante induzido pela FMOEAz............................................................

101

3.5.4.11 Efeito do pr-tratamento com a FMOEAz na contrao

induzida por clcio na presena de alta concentrao de K+.................

102

3.5.4.12 Efeito do pr-tratamento com a FMOEAz na contrao

induzida por clcio na presena de Fenilefrina ou alta concentrao

de K+ aps depleo do Ca2+ intracelular...............................................

103

3.5.4.13 Efeito do pr-tratamento com FMOEAz na contrao induzida

por Fenilefrina ou Cafena na ausncia de clcio extracelular...............

104

3.6 Frmacos e diluies utilizadas no estudo........................................ 105

3.7 Equipamentos e materiais utilizados no estudo................................ 107

3.8 Anlise estatstica................................................................................. 108

4 RESULTADOS........................................................................................ 112

4.1 Estudo in vitro inicial: Anlise do efeito relaxante OEAz, FHOEAz,

FCOEAz e FMOEAz em anis de aorta pr-contrados com PHE.....

112

4.2 Estudo in vivo: Medida indireta da presso arterial por pletismo-

grafia de cauda em ratos submetidos ao modelo de hipertenso

crnica por inibio do xido ntrico e tratamento com OEAz,

FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz...............................................................

115

4.2.1 Modelo de hipertenso crnica por inibio do xido ntrico.................. 115

4.2.2 Anlise da presso arterial sistlica........................................................ 119

4.2.3 Anlise da presso arterial diastlica...................................................... 135

4.2.4 Anlise da presso arterial mdia........................................................... 144

4.2.5 Anlise da frequncia cardaca............................................................... 153

4.2.6 Anlise da variao do peso dos ratos................................................... 158

4.3 Caracterizao do possvel mecanismo de ao da FMOEAz.......... 160

4.3.1 Efeito relaxante da FMOEAz em preparaes de aorta de rato com

endotlio ntegro e no ntegro pr-contradas com Fenilefrina.............

160

4.3.2 Efeito relaxante da FMOEAz em preparaes de aorta de rato com

endotlio ntegro e no ntegro pr-contradas com KCl.........................

161

4.3.3 Comparao do efeito relaxante da FMOEAz em preparaes de

aorta de rato com endotlio ntegro pr-contradas com PHE ou KCl....

162

4.3.4 Comparao do efeito relaxante da FMOEAz em preparaes de

aorta de rato desprovidas de endotlio pr-contradas com PHE e KCl

163

4.3.5 Avaliao do envolvimento do xido ntrico no efeito relaxante da

FMOEAz..................................................................................................

164

4.3.6 Avaliao da contribuio da Guanilato Ciclase Solvel (GCs) para o

efeito relaxante da FMOEAz...................................................................

165

4.3.7 Avaliao da participao de prostanides endgenos na resposta de

relaxamento vascular da FMOEAz..........................................................

166

4.3.8 Avaliao da participao dos receptores muscarnicos na resposta

de relaxamento vascular da FMOEAz.....................................................

167

4.3.9 Avaliao da inibio de espcies reativas do oxignio para o efeito

relaxante da FMOEAz.............................................................................

168

4.3.10 Avaliao da participao do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no

efeito vasodilatador da FMOEAz.............................................................

169

4.3.11 Avaliao da participao de canais de potssio no seletivos na

resposta de relaxamento vascular da FMOEAz......................................

170

4.3.12 Avaliao da participao de canais de potssio seletivos na resposta

de relaxamento vascular da FMOEAz.....................................................

171

4.3.13 Efeito do pr-tratamento com a FMOEAz na contrao induzida por

clcio na presena de alta concentrao de K+......................................

174

4.3.14 Efeito do pr-tratamento com a FMOEAz na contrao induzida por

clcio na presena de alta concentrao de K+ ou Fenilefrina aps

depleo do Ca2+ intracelular..................................................................

175

4.3.15 Efeito do pr-tratamento com FMOEAz na contrao induzida por

Fenilefrina ou Cafena na ausncia de clcio extracelular......................

178

5 DISCUSSO........................................................................................... 183

5.1 Estudo in vitro preliminar ou inicial: Anlise do efeito relaxante

do OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz em anis de aorta pr-

contrados com Fenilefrina..................................................................

185

5.2 Estudo in vivo: Medida indireta da presso arterial por

pletismografia de cauda em ratos submetidos ao modelo de

hipertenso crnica por inibio do xido ntrico e tratamento

com OEAz, FHOEAz, FCOEAz e FMOEAz...........................................

187

5.3 Caracterizao do possvel mecanismo de ao da substncia

com menor CE50 no estudo in vitro inicial e perfil farmacolgico

mais satisfatrio no estudo in vivo: FMOEAz....................................

190

6 CONSIDERAES FINAIS.................................................................... 200

7 CONCLUSO......................................................................................... 203

REFERNCIAS....................................................................................... 205

APNDICE A Exemplo de traado obtido no experimento de reatividade vascular inicial para anlise do efeito relaxante do leo essencial da Alpinia zerumbet e suas fraes hexnica, clorofrmica e metanlica...............................................................................................

220

ANEXO A Aprovao Comisso de tica em Pesquisa Animal

(CEPA): Projeto .....................................................................................

222

ANEXO B Aprovao Comisso de tica em Pesquisa Animal

(CEPA): Projeto ...................................................................................

223

INTRODUO

36

1 INTRODUO

1.1 O msculo liso vascular

O msculo liso dividido em dois tipos principais: o msculo liso

multiunitrio e o msculo liso de uma s unidade (Figura 1). A caracterstica mais

importante das fibras do msculo liso multiunitrio que cada fibra pode contrair-se

independentemente das outras, e elas so controladas, em grande parte, por sinais

neurais, contrastando com o controle predominante nos msculos lisos viscerais, por

estmulos no neurais. Alguns exemplos de msculo liso multiunitrio so as fibras

musculares lisas do msculo ciliar do olho, a ris do olho e os msculos piloeretores

(GUYTON; HALL, 2006; AKATA, 2007).

FIGURA 1 A: Msculo liso multiunitrio. B: Msculo liso unitrio (GUYTON; HALL, 2006).

37

O msculo liso de uma s unidade uma expresso que no significa

fibras musculares nicas, mas define uma grande massa de centenas a milhes de

fibras musculares que se contraem juntas, como uma s unidade. Essas fibras

ocorrem em geral em feixes ou camadas e suas membranas celulares so aderentes

entre si, em diversos pontos, de modo que a fora gerada por uma fibra muscular

pode ser transmitida seguinte. Alm disso, as membranas celulares so unidas por

junes abertas, o que permite o fluxo de ons de uma clula a outra, de modo que o

potencial de ao se propaga de uma fibra para a seguinte, fazendo com que todas

as fibras musculares se contraiam a um s tempo. Esse tipo de msculo liso tambm

chamado de msculo liso sincicial, devido s interconexes entre suas fibras.

encontrado na parede da maioria das vsceras do corpo, inclusive no intestino, vias

biliares, ureteres, tero e vasos sanguneos, sendo referido muitas vezes, como

msculo liso visceral (GUYTON; HALL, 2006; RANG et al., 2007).

O msculo liso contm tanto filamentos de actina como de miosina,

ambos com caractersticas qumicas semelhantes s dos filamentos de actina e de

miosina do msculo esqueltico. Todavia, ele no contm troponina, de modo que o

mecanismo para o controle da contrao diferente. O processo contrtil ativado

pelos ons clcio (Ca2+), enquanto o trifosfato de adenosina (ATP) degradado a

difosfato de adenosina (ADP) para o fornecimento de energia para a contrao

(HIPLITO et al., 2009).

Por meio de microscopia eletrnica, observou-se grande nmero de

filamentos de actina presos aos chamados corpos densos. Alguns desses corpos

densos esto fixados membrana celular. Outros ocorrem dispersos no interior da

clula e so mantidos em seus lugares por malha de protenas estruturais que os

interconecta. Alguns dos corpos densos fixados membrana de clulas adjacentes

esto interligados por pontes de protenas intracelulares. principalmente por meio

dessas interligaes que a fora da contrao transmitida de uma clula para a

seguinte. Espalhados entre os numerosos filamentos de actina existem alguns

filamentos de miosina. Esses filamentos de miosina tm dimetro mais de duas

vezes maior que o dos filamentos de actina. Parte dessa diferena causada pelo

fato de que a proporo entre os comprimentos dos filamentos de actina e de

miosina, no msculo liso, bem maior que a encontrada no msculo esqueltico

(Figura 2) (GUYTON; HALL, 2006; AKATA, 2007).

38

FIGURA 2 Estrutura fsica do msculo liso. Os filamentos de actina irradiam-se dos corpos densos. O detalhe direita da fibra inferior apresenta as interrelaes entre os filamentos de miosina e os de actina (GUYTON; HALL, 2006).

O potencial de ao do msculo liso um evento algo lento e impreciso

em comparao com o comportamento do msculo esqueltico e cardaco. Na

maioria dos casos, gerado por canais de clcio do tipo L, mais do que por canais

de sdio regulados por voltagem, constituindo uma importante via de entrada de

Ca2+. Alm disso, muitas clulas musculares lisas possuem canais de ctions

regulados por ligantes, que permitem a entrada de Ca2+ quando respondem a

transmissores. Entre eles, os mais caracterizados so os receptores do tipo P2x, que

respondem ao ATP liberado dos nervos autonmicos. As clulas musculares lisas

tambm armazenam Ca2+ no retculo sarcoplasmtico, a partir do qual pode ser

liberado quando o receptor de trifosfato de inositol (IP3) ativado por IP3, o qual

39

gerado por ativao de muitos tipos de receptores acoplados protena G. Em

contraste com o msculo esqueltico e cardaco, pode ocorrer liberao de Ca2+ e

contrao do msculo liso, quando esses receptores so ativados sem a

participao de eventos eltricos e entrada de Ca2+ atravs da membrana

plasmtica (MILESI et al., 1999; AKATA, 2007; HIPLITO et al., 2011).

A maquinria contrtil do msculo liso ativada quando a cadeia leve de

miosina sofre fosforilao, permitindo a sua liberao dos filamentos de actina. Esta

fosforilao catalisada pela quinase da cadeia leve de miosina que ativada ao

ligar-se Ca2+-calmodulina. Uma segunda enzima, a miosina fosfatase, reverte a

fosforilao e provoca relaxamento. Por conseguinte, a atividade da quinase da

cadeia leve de miosina e da miosina fosfatase exerce efeito balanceado,

promovendo a contrao e o relaxamento, respectivamente. Ambas as enzimas so

reguladas por nucleotdeos cclicos (AMPc e GMPc), e muitos frmacos que

provocam contrao ou relaxamento do msculo liso, mediados atravs de

receptores acoplados protena G ou atravs de receptores ligados guanilato

ciclase, atuam dessa maneira (Figura 3) (MILESI et al., 1999; GUYTON; HALL,

2006; RANG et al., 2007).

FIGURA 3 Acoplamento excitao-contrao no msculo liso. GPCR: receptor controlado por protena G; IP3: trifosfato de inositol; IP3R: Receptor de IP3; SR: retculo sarcoplasmtico; CaM: calmodulina; MLCK: quinase da cadeia leve de miosina (RANG et al., 2007).

40

A complexidade dos mecanismos de controle e interaes explica por que

os farmacologistas e outros estudiosos ficaram fascinados com o msculo liso, bem

como ainda desenvolvem estudos envolvendo esta temtica. Ademais, muitos

agentes teraputicos atuam contraindo ou relaxando o msculo liso, particularmente,

os que afetam os sistemas cardiovascular, respiratrio e gastrintestinal.

O msculo liso vascular controlado por mediadores secretados pelos

nervos simpticos e endotlio vascular, bem como por hormnios circulantes. A

contrao da clula muscular lisa iniciada por uma elevao da concentrao de

Ca2+ intracelular, que ativa a quinase da cadeia leve de miosina, causando

fosforilao da miosina, ou pela sensibilizao dos miofilamentos ao Ca2+ atravs da

inibio da miosina fosfatase (Figura 4) (RANG et al., 2007; MACMILLAN;

MCCARRON, 2009).

FIGURA 4 Mecanismos de controle da contrao e do relaxamento do msculo liso. 1. Receptor acoplado protena G para agonistas excitatrios. 2. Canais de clcio regulados por voltagem. 3. Canais de ctions regulados por ligantes. 4. Canais de potssio. 5. Receptores acoplados protena G para agonistas inibitrios. 6. Receptor de peptdeo natriurtico atrial. 7. Guanilato ciclase (GC) solvel ativada pelo xido ntrico (NO). 8. Fosfodiesterase (PDE). AC: adenilato ciclase; PKA: protena-quinase A; PKG: protena-quinase G; PLC: fosfolipase C (RANG et al., 2007).

41

Os agentes que causam contrao podem: liberar o Ca2+ intracelular,

secundariamente formao de IP3 mediada por receptores; despolarizar a

membrana, permitindo a entrada de Ca2+ atravs dos canais de clcio regulados por

voltagem; ou permitir a entrada de Ca2+ atravs dos canais de clcio operados por

receptores. J os agentes que causam relaxamento podem: inibir a entrada de Ca2+

atravs dos canais de clcio regulados por voltagem, direta (nifedipina) ou

indiretamente por meio de hiperpolarizao (ativadores do K+, como a cromacalina);

aumentar a concentrao intracelular de AMPc e GMPc, pois o AMPc causa

inativao da quinase da cadeia leve de miosina e pode facilitar o efluxo de Ca2+; o

GMPc ope-se a aumentos da concentrao intracelular de Ca2+ induzidos por

agonistas (Figura 4) (RANG et al., 2007; HIPLITO et al., 2009).

Nesse contexto, um fato de extrema importncia para a compreenso do

controle vascular foi a descoberta de que o endotlio vascular uma fonte de

mediadores qumicos potentes, como os prostanoides, o xido ntrico, peptdeos,

fatores de hiperpolarizao derivados do endotlio, entre outros. O endotlio

vascular um revestimento da superfcie luminal de todos os vasos sanguneos,

localizado entre a corrente circulatria e o msculo liso vascular.

A descoberta da prostaglandina I2 (PGI2), tambm conhecida como

prostaciclina, se deu por Bunting, Gryglewski, Moncada e Vane em 1976. A PGI2

relaxa o msculo liso e inibe a agregao plaquetria ao ativar a adenilato-ciclase.

As clulas endoteliais dos microvasos sintetizam PGE2, que um vasodilatador

direto e que tambm inibe a liberao de noradrenalina das terminaes nervosas

simpticas, enquanto carece do efeito da PGI2 sobre as plaquetas (RANG et al.,

2007).

O fator relaxante derivado do endotlio foi descoberto por Furchgott e

Zawadzki em 1980, e identificado subsequentemente como xido ntrico pelos

grupos de Moncada e de Ignarro (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; RANG et al.,

2007). O xido ntrico ativa a guanilato-ciclase, sendo importante nos vasos de

resistncia em virtude da liberao contnua, produzindo um tnus vasodilatador e

contribuindo para o controle fisiolgico da presso arterial. Alm disso, inibe a

proliferao e migrao de clulas musculares lisas vasculares, a adeso

leucocitria, a agregao plaquetria, entre outras aes (MIZUNO; JACOB;

42

MASON, 2010). Processos fisiolgicos e patolgicos podem ser mediados pelo xido

ntrico, dependendo de sua origem e concentrao (BONAVENTURA et al., 2007). A

produo excessiva de xido ntrico pode contribuir para o desenvolvimento de

hipertenso atravs da formao aumentada de espcies reativas de oxignio,

enquanto nveis normais ou fisiolgicos aumentam a vasodilatao e interferem em

processos aterotrombticos (MIZUNO; JACOB; MASON, 2010).

Ao que se refere s espcies reativas de oxignio, so molculas que

contm um oxignio num estado altamente reativo, com uma alta capacidade

oxidativa, sendo as espcies mais conhecidas: o superxido (O2-), o radical hidroxil

(HO) e o perxido de hidrognio (H2O2). Sob circunstncias controladas, a formao

de espcies reativas de oxignio se inicia pela reduo incompleta do oxignio

molecular por enzimas que incluem a xantina oxidase (converte xantinas em cido

rico), xido ntrico sintase, NADPH oxidase, citocromo P450 e vias mitocondriais

(MIZUNO; JACOB; MASON, 2010). A produo endgena de espcies reativas de

oxignio controlada por mecanismos anti-oxidantes que limitam sua ao por

elimin-las ou repararem modificaes oxidativas potencialmente danosas clula.

Como principais anti-oxidantes enzimticos temos: a superxido dismutase (SOD),

catalase e a glutationa peroxidase. Como enzimticos destacam-se: o cido

ascrbico, glutationa, NADPH/NADP+, NADH/NAD+ (ANSELM et al., 2007; ANOZIE

et al., 2007; CAMPANA et al., 2009).

O endotlio tambm secreta peptdeos vasoativos, como o peptdeo C

natriurtico, que est relacionado ao peptdeo natriurtico atrial, e a endotelina que

um potente peptdeo vasoconstritor (RANG et al., 2007).

Em relao ao fator de hiperpolarizao derivado do endotlio, a dilatao

dependente do endotlio que ocorre em resposta a vrios mediadores, como a

acetilcolina e bradicinina, pode persistir, a despeito da inibio completa da sntese

de prostaglandinas e de NO. Este relaxamento acompanhado de hiperpolarizao

endotlio-dependente do msculo liso vascular, que produzida pelo fator de

hiperpolarizao derivado do endotlio. Sua identidade qumica permanece incerta,

porm, existem atualmente trs candidatos principais que no se excluem

totalmente: 1. epoxieicosanides sintetizados a partir do cido araquidnico por uma

isoforma do citocromo P450; 2. propagao eletrotnica da hiperpolarizao do

43

endotlio para o msculo liso vascular atravs de junes intercelulares; 3. K+

liberado do endotlio, que paradoxalmente hiperpolariza o msculo liso vascular ao

ativar canais de potssio retificadores de orientao interna (RANG et al., 2007).

O msculo liso vascular tem sido alvo de muitas pesquisas,

principalmente, relacionadas fisiologia e farmacologia cardiovascular, seja para a

descoberta de novos medicamentos, como para o aperfeioamento dos frmacos

que j existem para o tratamento de afeces relacionadas a esse sistema.

1.2 Hipertenso arterial sistmica e abordagens teraputicas

De acordo com a Sociedade Brasileira de Cardiologia (SBC) (2010), a

hipertenso arterial sistmica (HAS) uma condio clnica multifatorial,

caracterizada por nveis elevados e sustentados de presso arterial (PA), maiores

que 140x90 milmetros de mercrio (mmHg). Associa-se frequentemente a

alteraes funcionais e/ou estruturais dos rgos-alvo (corao, encfalo, rins e

vasos sanguneos) e a alteraes metablicas, com consequente aumento do risco

de eventos cardiovasculares fatais e no fatais.

So vrios os fatores de risco para HAS. A prevalncia aumenta com a

idade, principalmente, aps 65 anos, sendo mais elevada no sexo masculino

(CESARINO et al., 2008) e entre indivduos de cor no branca, no entanto, no se

conhece com exatido, o impacto da miscigenao sobre a HAS no Brasil (SBC,

2010). Est relacionada com excesso de peso desde idades jovens (CAMPANA et

al., 2007). O consumo de sdio em excesso tem sido correlacionado com a elevao

da PA (HE; MACGREGOR, 2008; STRAZZULO et al., 2009), assim como a ingesto

de lcool por perodos prolongados tambm pode aumentar a PA e a mortalidade

cardiovascular (SCHERR et al., 2009). A incidncia de HAS e a mortalidade so

reduzidas quando se pratica atividade fsica (PESCATELLO et al., 2004).

A HAS tem alta prevalncia e baixas taxas de controle, o que a faz ser

considerada um dos mais importantes problemas de sade pblica (TIRAPELLI et

44

al., 2010). No Brasil, as doenas cardiovasculares (DC) tm sido a principal causa

de morte. Como exemplo, em 2007 foram registradas 1.157.509 internaes por DC

no Sistema nico de Sade (SUS). Em relao aos custos, em novembro de 2009

houve 91.970 internaes por DC, resultando em custo de R$ 165.461.644,33 (SBC,

2010).

No Brasil a HAS mais prevalente entre indivduos com menor

escolaridade (CESARINO et al., 2008; CONEN et al., 2009). Ademais, apesar de at

o momento no existirem variantes genticas para predizer o risco individual de se

desenvolver HAS, a contribuio de fatores genticos para a gnese da HAS est

bem estabelecida na populao (OLIVEIRA et al., 2008). Alm de apresentar relao

com estilo de vida pouco saudvel (SBC, 2010).

As abordagens teraputicas incluem medidas no medicamentosas e

medicamentosas. As mudanas no estilo de vida so recomendadas na preveno

primria da HAS, assim como hbitos saudveis de vida devem ser adotados desde

a infncia, respeitando-se as caractersticas regionais, culturais, sociais e

econmicas dos indivduos. As principais recomendaes incluem: alimentao

saudvel, com baixo teor de gordura e hipossdica, controle do peso, realizao de

atividade fsica, consumo controlado de lcool e combate ao tabagismo

(RAINFORTH et al., 2007; SBC, 2010). O tratamento medicamentoso da HAS

envolve o uso de frmacos anti-hipertensivos, os quais devem reduzir a PA e os

eventos cardiovasculares fatais e no fatais, bem como a taxa de mortalidade.

As classes de anti-hipertensivos disponveis para uso clnico no Brasil so:

diurticos (tiazdicos, de ala, poupadores de potssio), inibidores adrenrgicos

(agonistas 2-centrais, bloqueadores -adrenrgicos, bloqueadores 1-

adrenrgicos), vasodilatadores diretos (hidralazina, minoxidil), antagonistas dos

canais de clcio (fenilalquilaminas, benzotiazepinas, diidropiridinas), inibidores da

enzima conversora de angiotensina (ECA), inibidor direto da renina (alisquireno) e

bloqueadores do receptor de angiotensina II do subtipo 1 (SBC, 2010).

O tratamento deve ser individualizado e a monoterapia deve ser a

estratgia anti-hipertensiva inicial, dependendo dos nveis da PA. Se a meta

teraputica no for atendida, as associaes de anti-hipertensivos so indicadas,

45

devendo-se no combinar medicamentos com mecanismos de ao similares (SBC,

2010). Os prescritores devem ter acesso s diretrizes nacionais e internacionais

acerca do tratamento da HAS, assim como conhecer os resultados de ensaios

clnicos bem conduzidos que referem as melhores associaes e tratamentos, os

quais foram capazes de reduzir a PA, bem como suas complicaes.

No contexto dos anti-hipertensivos, ressaltamos neste trabalho os

frmacos antagonistas dos canais de clcio, acerca dos quais so feitas algumas

consideraes a seguir.

1.3 O clcio, a farmacologia e os antagonistas dos canais de clcio

Os efeitos de frmacos sobre o mecanismo de contrao do msculo liso

constituem a base de numerosas aplicaes teraputicas, visto que o msculo liso

um importante componente da maioria dos sistemas fisiolgicos, incluindo vias

respiratrias, trato gastrintestinal e vasos sanguneos. Ao que se refere ao clcio,

este se trata de um importante eletrlito, principalmente, quando se observa sua

participao na homeostase do organismo, de forma que sua concentrao no corpo

humano varia de 8,5-10,5 mg/dL. um elemento qumico que foi isolado pela

primeira vez em 1808, na sua forma impura, pelo qumico britnico Humphry Davy.

Este fato se deu a partir de uma reao de eletrlise envolvendo amlgama de

mercrio (HgO) e cal (CaO) (MOORE, 1911).

Quando observamos os estudos acerca do clcio na histria da cincia

alguns achados relevantes podem ser expostos para um melhor entendimento do

que dispomos hoje. Iniciando-se em 1883, o mdico fisiologista britnico Sydney

Ringer, atravs de uma observao casual de seus experimentos sobre a funo

contrtil de coraes isolados de sapo, onde substituiu gua destilada por gua da

torneira, constatou o papel do clcio como regulador importante da funo celular,

passando ento a utilizar em seus experimentos, uma soluo acrescida de

determinados sais que foi denominada por ele de soluo de Ringer (RINGER, 1883;

MOORE, 1911).

46

Em 1901 Stiles descreveu a atividade do Ca2+ sobre a contrao do

msculo liso. Enquanto Ebashi e Weber em 1959 postularam que para a ativao da

ATPase miofibrilar necessrio Ca2+. Ebashi e Kodama em 1965 descobriram a

troponina. Em 1968, Endo constatou que o Ca2+ induz liberao de mais Ca2+.

Kariuchi e Yamazaki em 1969 descobriram a calmodulina (STILES, 1901;

GODFRAIND; KABA, 1969).

Theophille Godfraind em 1969 percebeu que frmacos como a cinarazina,

reduziam a resposta contrtil da artria mesentrica de coelho, utilizando pela

primeira vez o termo antagonistas dos canais de clcio (GODFRAIND; KABA,

1969). No mesmo ano, Fleckenstein tambm estudava o papel do Ca2+ no msculo

cardaco, ao mesmo tempo em que testava compostos com ao inotrpica negativa

e vasodilatadora coronariana, um prottipo do que viria a ser o verapamil, sintetizado

pela indstria Pfizer, inserindo no mesmo ano o conceito de antagonistas dos

canais de Ca2+ (FLECKENSTEIN et al., 1969). Em meados de 1976, Sobiezek e

Small afirmaram que a fosforilao da cadeia leve de miosina induzia a contrao do

msculo liso. Berrigge e Irvine em 1984 observaram que o IP3 ocasionava a

liberao de Ca2+ dos estoques intracelulares (STILES, 1901; GODFRAIND; KABA,

1969).

Neste contexto de descobertas, algo que revolucionou os estudos de

regulao do clcio foi o desenvolvimento da microscopia de fluorescncia. Ainda

mais pela identificao de uma fotoprotena sensvel ao clcio, a qual comeou a ser

estudada em 1962, por um qumico chamado Shimomura, o qual isolou a protena

verde fluorescente da gua-viva Aequoria victoria, e identificou a estrutura protica

do cromforo responsvel pelo fenmeno da bioluminescncia. Este fenmeno

ocorria por intermediao da protena aequorina que, ao se ligar a ons Ca2+, emitia

luz azul. Esta luz por sua vez, absorvida pela protena fluorescente verde (PFV),

que fluoresce na regio verde. A partir do trabalho de Shimomura, Chalfie

incorporou, por manipulao gentica, a PFV no DNA da bactria Escherischia coli

tornando-a fluorescente. Com o desenvolvimento da tcnica de formao de

protenas fundidas com PFV e sua utilizao como marcador biolgico, Tsien

ampliou o campo de utilizao destas protenas fundidas por substituio de vrios

aminocidos da cadeia da PFV. Com isto, obteve diversas protenas que absorvem e

47

emitem luz em vrias outras regies do espectro (SHIMOMURA; JOHNSON; SAIGA,

1962).

Assim, os cientistas passaram a colorir protenas de modo diferenciado

e acompanhar as interaes entre elas. Estes trs cientistas referidos anteriormente

receberam por conta destes estudos o prmio Nobel em qumica, em 2008. Todos

estes contriburam para o que dispomos hoje nessa rea, que so os marcadores de

clcio Fluo-3 AM amplamente utilizados em microscopia de fluorescncia.

Na dcada de 80, Sakmann e Neher revolucionaram o estudo de canais e

mensurao de eventos eltricos da membrana de clulas por meio do mtodo

patch-clamp (KARMAZNOV; LACINOV, 2010), uma tcnica aperfeioada do

mtodo voltage-clamp (Na+/K+), desenvolvida por Hodgkin e Huxley em 1952

(HODGKIN; HUXLEY, 1952; GODFRAIND; KABA, 1969; SAKMANN; NEHER,

1984). De 1985 a 1990, Richard Tsien e colaboradores, utilizando a tcnica de

patch-clamp, identificaram diferentes correntes de clcio, que foram denominadas de

L, T e N (TSIEN; TSIEN, 1990). A partir de 2000, com as tcnicas de biologia

molecular, Catterall foi capaz de descrever o canal de clcio (CATTERALL et al.

2000).

O canal tem uma subunidade maior, denominada 1, que constitui a

principal unidade formadora de poro do canal. Esta possui quatro domnios

homlogos (I, II, III e IV), em que cada um constitudo de seis segmentos

transmembrana (S1-S6) (MICHEL; HOFFMAN, 2011). A subunidade uma

protena localizada no interior da clula, que regula a amplitude da corrente de

entrada de clcio e influencia a corrente de inativao. A subunidade 2 e

modulam a subunidade 1. A subunidade uma protena plasmtica que atua na

manuteno do estado de inativao espera de um potencial mais hiperpolarizado

para que ocorra a ativao do canal. Ver Figuras 5 e 6 a seguir:

48

FIGURA 5 Subunidades que constituem o canal de clcio (CATERRALL, 2002).

FIGURA 6 Domnios I, II, III e IV da subunidade 1 do canal de clcio e segmentos transmembrana (RANG et al., 2007).

49

Em 2000, foi proposta uma nova nomenclatura para os canais de clcio

que leva em considerao a classificao filogentica desses canais. A seguir, o

Quadro 1 mostra a nomenclatura filogentica do canal, a localizao e a funo

(ERTEL, et al., 2000; CATERRAL, 2002).

QUADRO 1 Classificao filogentica e funo dos canais de clcio (ERTEL, et al., 2000; CATERRAL, 2002).

Quanto aos frmacos

universidade federal do cearÁ faculdade de medicina departamento de ... · perceber com mais...

Documents