universidade federal do ceará centro de ciências agrárias...
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Universidade Federal do CearáCentro de Ciências Agrárias
Departamento de Tecnologia de AlimentosCurso de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Isabel Moreira da Silva
SUCO DE CAJU CONTENDO OLIGOSSACARÍDEOS PREBIÓTICOS
FORTALEZA-CEARÁ2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁCENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOSCURSO DE PÓS- GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
ISABEL MOREIRA DA SILVA
SUCO DE CAJU CONTENDO OLIGOSSACARÍDEOS PREBIÓTICOS
FORTALEZA-CEARÁ2010
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ISABEL MOREIRA DA SILVA
SUCO DE CAJU CONTENDO OLIGOSSACARÍDEOS PREBIÓTICOS
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Sueli Rodrigues
FORTALEZA-CEARÁ2010
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S578s Silva, Isabel Moreira da
Suco de caju contendo oligossacarídeos prebióticos / Isabel Moreira da Silva. -- Fortaleza, 2010.
61 f. ; il. color. enc.
Orientadora: Profa. Dra. Sueli Rodrigues
Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Depto. de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza, 2010.
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Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
A citação de qualquer trecho desta Dissertação é permitida, desde que seja feita de
conformidade com as normas da ética científica.
Isabel Moreira da Silva
Dissertação aprovada em 29 de Junho de 2010.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Sueli Rodrigues (Orientadora)Universidade Federal do Ceará - UFC
Prof. Dr. José Maria Correia da CostaUniversidade Federal do Ceará - UFC
Profa. Dra. Andrea Lopes de Oliveira FerreiraUniversidade Federal do Ceará - UFC
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Dedico este trabalho de pesquisa aos meus
pais Núbia e Odemilton, por estar presente em
todos os momentos de minha vida me apoiando
e incentivando com muito amor.
7
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por estar sempre presente, me protegendo e abençoando, em todos os momentos de minha vida.
Aos meus pais, Núbia e Odemilton, pelo amor, companheirismo, e pelo apoio nos momentos mais difíceis.
Ao Wagner, pelo amor, compreensão e dedicação constante.
Ao meu irmão, Israel, pelo companheirismo e incentivo.
Ao meu afilhado, Miquéias, pela ajuda e compreensão.
Às minhas tias, Elizabete, Helena, Neide, Odinilda e Oliene, pelo carinho, valiosos ensinamentos e incentivo.
Ao Sr. João Leite e D. Rosa pela apoio e grande ajuda.
À todos os meus familiares, que torcem pelo meu sucesso e que muito contribuíram para essa realização.
À minha orientadora professora Dra. Sueli Rodrigues, pelo apoio, dedicação, confiança, e ensinamentos de grande valor a quem tenho como exemplo de profissional
Aos professores Dr. José Maria Correia da Costa e Dra. Andrea Lopes de Oliveira Ferreira que gentilmente aceitaram o convite de participar desta banca de defesa de dissertação, contribuindo assim, para o enriquecimento deste trabalho.
Aos atuais e antigos membros do Laboratório de Biotecnologia: Alexandre, Ana Laura, Claudinha, Cris, Imilena, jamile, Jéssica, Jonas, Luiz Carlos, Mayra, Mariana, Simone, Soraya, Tiago, Tati Maciel, Tati Nunes e Tati Vidal pela amizade e momentos de descontração.
À Cristiane Rabelo, minha eterna gratidão pela amizade, paciência, ensinamentos e valiosa colaboração na realização dos experimentos.
Aos colegas da turma de mestrado: Suelane, Ana Valquiria, Simone, Alais, Giovana, Cristiane, Priscila, Rafaela, Carlos Eliardo, Geirla, Edna, Ana Cristina.
A todos os professores do Departamento de Tecnologia de Alimentos, pelos ensinamentos, colaboração e amizade durante o curso de Mestrado e graduação.
Ao secretário do curso de Mestrado, Paulo Mendes, por sua dedicação e ajuda no decorrer do curso.
À Universidade Federal do Ceará, pela possibilidade de cursar o Mestrado e por tudo de bom que ele vier a me proporcionar.
8
Ao CNPq, pela concessão da bolsa de estudo durante todo o curso e pelo apoio financeiro.
À Embrapa Agroindústria Tropical pelo fornecimento do suco de caju utilizado neste experimento
A todos que contribuíram de forma direta ou indireta, para a realização deste trabalho.
9
“Em tempo de paz convém ao homem serenidade
e humildade; mas quando estoura a guerra deve
agir como um tigre!”
William Shakespeare
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RESUMO
Os alimentos funcionais constituem hoje prioridade em pesquisas devido a crescente busca dos consumidores por alimentos que além da função básica de nutrir possam trazer outrosbenefícios. Dessa forma, estudos para o desenvolvimento de prebióticos tornam-se interessantes. A enzima dextrana-sacarase quando em meio contendo sacarose e um aceptor como substrato produz oligossacarídeos prebióticos. O suco de caju funciona como fonte de aceptores, uma vez que é rico em glicose e frutose. A produção da enzima dextrana-sacarase pode ser realizada via processo fermentativo através da inoculação da bactéria Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F ao meio de cultura contendo sacarose. Dessa forma o objetivo desse trabalho foi a produção de oligossacarídeos prebióticos via processo enzimático com adição da enzima dextrana–sacarase ao suco de caju clarificado. Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que o suco de caju clarificado pode ser empregado como uma alternativa de substrato de baixo custo para a síntese de oligossacarídeos prebióticos, por via enzimática utilizando a enzima dextrana-sacarase. O rendimento em dextrana foi favorecido pela combinação de baixas concentrações de sacarose e açúcares redutores. A formação de oligossacarídeos foi favorecida pelo aumento da concentração dos açúcares redutores e pela combinação de elevadas concentrações de sacarose e açúcares redutores. Neste trabalho amaior concentração de oligossacarídeos obtida foi de 104,73 g/L utilizando-se 75 g/L de sacarose em combinação com 75 g/L de açucares redutores e por fim a análise qualitativa mostrou que em concentrações de 25 g/l e 75 g/l de sacarose e açúcar redutor, respectivamente foi possível obter oligossacarídeos de grau de polimerização até 12.
PALAVRAS-CHAVE: Dextrana-sacarase, Leuconostoc mesenteroides B512, pedúnculo de caju.
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ABSTRACT
Functional foods are now a research priority due to growing demand for foods that, besides the basic function of nurture, can bring benefits. Thus, studies for the development of prebiotics become interesting. The enzyme dextransucrase in a medium containing sucrose and an acceptor as substract synthesizes prebiotics oligosaccharides. The cashew apple juice works as a source of acceptors, since it is rich in glucose and fructose. The production of dextransucrase enzyme can be accomplished by fermentative process by inoculating the bacterium Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F into a culture medium containing sucrose.Thus the aim of this work was the production of prebiotic oligosaccharides by enzymatic process with addition of the dextransucrase enzyme to the clarified cashew apple juice. Based on the results we can conclude that the clarified cashew apple juice can be used as low cost alternative substrate for the synthesis of prebiotic oligosaccharides through enzyme synthesis using the dextransucrase enzyme. Dextran yeld was favored by the combination of low concentrations of sucrose and reducing sugars. The formation of oligosaccharides was favored by increasing the concentration of reducing sugars and by the combination of high concentrations of sucrose and reducing sugars, where the largest concentration of oligosaccharides obtained was 104.73 g/L using 75g/L sucrose in combination with 75g/L of reducing sugars and finally the qualitative analysis shows that at concentrations of 25 g/L and 75g/L sucrose and reducing sugar, respectively, is possible to obtain oligosaccharides of degree of polymerization up to 12.
Keywrods: dextransucrase, Leuconostoc mesenteroides B512, clarified cashewapple juice.
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LISTA DE TABELAS
Tabela Página1 Oligossacarídeos prebióticos comercialmente disponíveis. . . . . . 202 Meio padrão otimizado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313 Planejamento experimental para a síntese enzimática dos
oligossacarídeos prebióticos no suco de caju . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4 Planejamento experimental e resultado obtido em dextrana no suco de caju . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
5 Efeitos estimados do rendimento em dextrana. . . . . . . . . . . . . . . . 436 Análise de variância para o rendimento em dextrana no suco de
caju. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
7 Planejamento experimental e resultados obtidos de concentração de oligossacarídeos prebióticos e rendimentos em oligossacarídeos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
8 Efeitos estimados de concentração de oligossacarídeos. . . . . . . . . 469 Análise de variância para concentração de oligossacarídeos no
suco de caju46
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LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Estrutura química dos principais frutooligossacarídeos. . . . . . . . . 222 Fórmula estrutural da inulina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 Rendimento em dextrana em função da concentração de sacarose
e açúcares redutores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
4 Oligossacarídeos prebióticos obtidos em função da concentração de sacarose e açúcares redutores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
5 Oligossacarídeos detectados através de cromatografia de camada delgada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 REVISÃO DA LITERATURA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.1 Alimentos funcionais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.2 Oligossacarídeos prebióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.3 Tipos de oligossacarídeos prebióticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.3.1 Frutooligossacarídeo (FOS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.3.2 Inulina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.4 Propriedades funcionais e aplicações tecnológicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . 242.5 Dextrana-sacarase.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.6 Mecanismo de síntese de oligossacarídeos prebióticos. . . . . . . . . . . . . . . 262.7 Leuconostoc mesenteroides B-512F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.8 Caju . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.9 Suco de caju. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282.10 Aspectos da produção e economia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.11 Utilização do suco de caju como substrato em processos biotecnólogicos. . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3 MATERIAL E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313.1 Obtenção do microrganismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313.2 Ativação do Leuconostoc mesenteroides B512 F liofilizado . . . . . . . . . . . 313.3 Ativação do microrganismo congelado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323.4 Produção da enzima dextrana-sacarase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323.5 Purificação parcial da enzima. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333.6 Obtenção do suco de caju. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333.7 Caracterização físico-química do suco de caju clarificado. . . . . . . . . . . . 343.8 Síntese enzimática dos oligossacarídeos prebióticos. . . . . . . . . . . . . . . . . 343.9 Métodos Analíticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.9.1 pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.9.2 Determinação de açúcares redutores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 363.9.3 Determinação do crescimento microbiano. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.9.4 Determinação da Dextrana .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.9.5 Determinação da atividade enzimática . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.9.6 Detecção de oligossacarídeos através de cromatografia de camada delgada
(CCD). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.9.7 Determinação de açucares residuais através de cromatografia líquida de alta
eficiência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403.9.8 Análise dos dados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 414. RESULTADOS E DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.1 Caracterização do suco de caju. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424.2 Síntese enzimática de oligossacarídeos prebióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 425. CONCLUSÕES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
ANEXOS 60
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1. INTRODUÇÃO
Os alimentos funcionais constituem hoje a prioridade de pesquisa na área de nutrição e
tecnologia de alimentos. Levando-se em conta o interesse do consumidor em alimentos mais
saudáveis, os alimentos funcionais além de nutrir devem modelar o sistema fisiológico do
organismo (BORTOLOZO E QUADROS, 2007). Com relação à interferência dos alimentos
funcionais na flora intestinal, estes podem ser divididos em três grupos: probióticos,
simbióticos e prebióticos (GIBSON, 1999; HUTCHENSO, 1987).
Os Probióticos são definidos como microrganismos viáveis que afetam beneficamente
a saúde do hospedeiro por promoverem balanço da microbiota intestinal, sendo Lactobacillus
e Bifidobacterium as espécies mais utilizadas como probióticos (FULLER, 1989).
O termo prebiótico é definido como um ingrediente alimentar não digerível pela
maioria dos microrganismos do intestino, e que afeta beneficamente o hospedeiro, pelo
estímulo seletivo do crescimento e/ou atividade de apenas um ou de um número limitado de
bactérias no cólon (GIBSON & ROBERFROID, 1995). Alguns carboidratos têm sido
denominados prebióticos por não serem metabolizados no estômago e no intestino delgado,
sendo capazes de chegar ao intestino grosso (CHUNG e DAY, 2004). Um produto
denominado simbiótico é aquele em que há a combinação de um probiótico e um prebiótico.
Geralmente, os prebióticos se constituem de oligossacarídeos, carboidratos de alto
peso molecular encontrados na natureza, como a rafinose, ou obtidos através de reações
enzimáticas, como os galacto-oligossacarídeos, o frutooligossacarídeos (FOS) e os isomalto-
oligossacarídeos (KIMURA, 2002). São substâncias direcionadas para estimular o
crescimento de alguns gêneros da microbiota intestinal e não sofrem as dificuldades de
sobrevivência que os microrganismos probióticos precisam enfrentar. Algumas características
são importantes ao se selecionar prebióticos: essas substâncias não devem ser hidrolizadas ou
absorvidas na parte superior do trato intestinal, precisam ser substratos seletivos para um
número limitado de microrganismos habitantes do cólon e devem alterar essa microbiota
tornando-a mais saudável para o hospedeiro. Certos carboidratos, oligo e polissacarídeos,
ocorrem naturalmente e podem ser usados como prebióticos (ROBERFROID, 1998).
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Uma das formas de obtenção de oligossacarídeos prebióticos é por via enzimática
utilizando a enzima dextrana- sacarase. Essa enzima catalisa a formação de dextrana quando
em meio contendo sacarose como único substrato. Entretanto, quando em meio contendo um
aceptor (maltose, frutose, glicose, etc) como substrato predominante e sacarose como segundo
substrato, a enzima produz oligossacarídeos prebióticos (RODRIGUES et al., 2005; RABELO
et al., 2006). Esta reação secundária é denominada reação do aceptor.
A reação do aceptor consiste em adições de unidades de glicose provenientes da
sacarose ligadas ao aceptor (glicose, frutose, maltose, etc). À medida que unidades de glicose
são incorporadas na cadeia vão sendo formadas séries homólogas. Para esta reação são
conhecidas séries homológas contendo até 10 unidades de glicose, sendo incorporadas a este
carboidrato através da síntese enzimática (ligação glicosídica -1,6). Estes oligossacarídeos,
embora apresentem aplicações técnicas relevantes, são considerados de difícil síntese
(HEINKE et al., 1999; RABELO et al., 2006, RODRIGUES et al., 2006).
A produção da enzima que catalisa a síntese desse oligossacarídeos pode ser realizada
via processo fermentativo através da inoculação da bactéria Leuconostoc mesenteroides NRRL
B512F ao meio de cultura contendo sacarose. O suco de caju funciona como fonte de
aceptores, uma vez que é rico em glicose e frutose. Além disso, a utilização de substratos
regionais como o suco de caju visa o aproveitamento de matérias-primas regionais agrícolas.
O caju é composto por 10% de amêndoa e 90% de pedúnculo. Dessas duas partes, o
pedúnculo apresenta o menor aproveitamento (LIMA, 2008). O produto de maior expressão
econômica é a amêndoa, sendo tipicamente um produto de exportação, enquanto os produtos
obtidos a partir do processamento do pedúnculo destinam-se basicamente ao mercado interno
(CHAGAS 2007; RABELO 2008). Além disso, a utilização de suco de caju, como substrato
na síntese enzimática de oligossacarídeos prebióticos, torna-se interessante por tratar-se de
uma matéria-prima de baixo custo para uso como substrato em processos fermentativos, uma
vez que não requer nenhum tratamento prévio como hidrólise ou tratamento enzimático,
Honorato e Rodrigues (2010) verificaram que a enzima dextrana-sacarase parcialmente
purificada apresenta estabilidade extraordinária em suco de caju à temperatura ambiente,
sendo estável por 96 horas.
17
Dessa forma, neste projeto, a síntese enzimática para produção de oligossacarídeos
prebióticos foi estudada, utilizando a enzima dextrana-sacarase parcialmente purificada
adicionada ao suco de caju.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Alimentos funcionais
Nos seus primórdios, a ciência de alimentos preocupava-se somente em desenvolver
alimentos para a sobrevivência humana, em seguida, esse conceito foi subtituído pelo
conceito de produzi-lo com qualidade. Mais recentemente, a idéia passou a ser usá-los como
veículos de promoção de bem-estar e saúde, ao mesmo tempo reduzindo o risco de doenças
(MATSUBARA, 2001). Daí a importãncia de desenvolver novos estudos envolvendo
alimentos funcionais.
Alimento funcional é qualquer alimento, natural ou preparado, que contenha uma ou
mais substâncias, classificadas como nutrientes ou não nutrientes, que seja capaz de atuar no
metabolismo e na fisiologia humana, promovendo efeitos benéficos para a saúde, podendo
retardar o estabelecimento de doenças crônico-degenerativas e melhorar a qualidade e a
expectativa de vida das pessoas (SGARBIERI e PACHECO, 1999).
A definição legal de alimento funcional é todo alimento ou ingrediente que, além das
funções nutricionais básicas, quando consumido como parte da dieta usual, produz efeitos
metabólitos e/ou fisiológico e/ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo
sem supervisão médica (BRASIL, 1999 a).
A regulamentação sobre alimentos funcionais no Brasil é feita pela Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (ANVISA), que publicou em 30 de abril de 1999 três resoluções
relacionadas ao tema. A resolução n° 17 aprova as diretrizes básicas para a avaliação de risco
e segurança dos alimentos; a resolução n° 18 aprova as diretrizes básicas para análise e
comprovação de propriedades funcionais e/ou de saúde alegadas em rotulagem de alimentos e
a resolução n° 19 aprova procedimentos para registro de alimentos com alegação de
propriedades funcionais e ou saúde em sua rotulagem (BRASIL, 1999 b; BRASIL, 1999 c;
BRASIL,1999 d; VERGARA, 2007).
Os principais grupos biologicamente ativos atualmente conhecidos como ingredientes
funcionais são as fibras solúveis e insolúveis, flavonóides, carotenóides, fitosteróis,
19
fitostanóis, ácidos graxos (ômega 3 e ômega 6), prebióticos e probióticos (BELLO, 1995;
TORRES, 2001).
Um alimento funcional é similar em aparência a um alimento convencional, no
entanto, foi modificado com ingredientes que fornecem efeitos adicionais à saúde. Na busca
por novos alimentos funcionais, os prebióticos têm sido estudados como ingredientes em
vários alimentos, entre eles bebidas lácteas funcionais ou simbióticas (SILVA e STAMFORD,
2000).
2.2 Oligossacarídeos prebióticos
Entre os prebióticos são conhecidos alguns carboidratos, peptídeos, proteínas e
lipídeos. Entretanto, os carboidratos denominados de oligossacarídeos – cadeias curtas de
polissacarídeos – são os que mais se enquadram na definição e nas características dos
prebióticos. “Os mananoligossacarídeos (MOS) e os frutoligossacarídeos (FOS) são os dois
grupos mais utilizados, para algumas espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium” (HIDAKA
et al., 1986).
São considerados prebióticos os oligossacarídeos resistentes, ou seja, carboidratos
complexos de configuração molecular que os tornam resistentes à ação hidrolítica da enzima
salivar e intestinal, atingindo o cólon intactos, com efeitos sobre a microbiota colônica, uma
vez que ao chegarem ao intestino grosso são metabolizados pelas bifidobactérias e
lactobacilos ali presentes, estimulando o seu crescimento (BORGES, 2002; FAGUNDES e
COSTA, 2003; CHUNG e DAY, 2004). Os oligossacarídeos são utilizados como novos
ingredientes funcionais dos alimentos apresentando grande potencial para melhorar a
qualidade de muitos alimentos (MAKINO, 2004).
Para um ingrediente alimentar ser classificado como um prebiótico é necessário: não
sofrer hidrólise e nem ser absorvido na parte superior do trato gastrointestinal; ser um
substrato seletivo para um número limitado de bactérias potencialmente benéficas ao cólon,
que são estimuladas para crescerem e desenvolverem atividades metabólicas; ser capaz de
promover uma biota intestinal saudável e, como conseqüência, induzir efeitos no lúmen que
beneficiem o hospedeiro. (SILVA, 2007; RABELO, 2008),
20
Os prebióticos não somente proporcionam aumento potencial do número de bactérias
benéficas no intestino grosso de humanos, predominantemente os lactobacilos e as
bifidobactérias, mas também aumentam sua atividade metabólica através do fornecimento de
substrato fermentável (BIELECKA et al., 2002).
2.3 Tipos de oligossacarídeos prebióticos
Oligossacarídeos de vários tipos são encontrados como componentes naturais de
frutas, vegetais, leite e mel. Muitos destes compostos têm propriedades bifidogênicas. Os
oligossacarídeos produzidos são maltooligossacarídeos, xilooligossacarídeos,
gentiooligossacarídeos, soja-oligossacarídeos, palatinose, lactosacarose, glicosil sacarose e
ciclodextrina (MAKINO, 2004). A Tabela 1 apresenta os oligossacarídeos com efeitos
bifidogênicos que são produzidos comercialmente.
Tabela 1 - Oligossacarídeos prebióticos comercialmente disponíveis (MUSSATTO e
MANCILHA, 2007)
Composto Estrutura Molecular a
Ciclodextrinas (Glu)n
Frutooligossacarídeos (Fru)n–Glu
Galactooligossacarídeos (Ga)n–Glu
Gentiooligossacarídeos (Glu)n
Glicosilsacarose (Glu)n–Fru
Isomaltooligossacarídeos (Glu)n
Isomaltulose (ou paliatinose) (Glu–Fru)n
Lactusacarose Ga–Glu–Fru
Lactulose Ga–Fru
Maltooligossacarídeos (Glu)n
Rafinose Ga–Glu–Fru
Oligossacarídeos de soja (Ga)n–Glu–Fru
Xilooligossacarídeos (Xil)na Ga, galactose; Glu, glucose; Fru, frutose; Xil, xilose.
21
A maioria dos oligossacarídeos prebióticos estudados atualmente são produtos
comerciais obtidos por hidrólise parcial, ácida ou enzimática, de polissacarídeos ou por
reações de transglicosilação (SILVA e NÖRNBERG, 2003).
Os oligossacarídeos prebióticos são encontrados naturalmente em vegetais como
alcachofra, raiz de chicória, cebola, alho, banana, aspargo, trigo, centeio e cevada. No entanto,
as concentrações presentes são baixas, exigindo consumo extremamente elevado para
obtenção dos efeitos fisiológicos desejados (PIMENTEL, et al., 2005).
Dentre os oligossacarídeos utilizados comercialmente, destacam-se os
frutooligossacarÌdeos (FOS), que são importantes principalmente por suas propriedades
funcionais, mais do que pela sua doçura (PASSOS e PARK, 2006). As diferenças químicas
entre estes oligossacarídeos são o comprimento da cadeia, a composição de monossacarídeos,
o grau de ramificação e a pureza (MUSSATTO e MANCILHA, 2007).
Os prebióticos abrangem as frutanas, que incluem a inulina natural, inulina hidrolisada
enzimaticamente ou oligofrutose e frutooligossacarídeos sintéticos, além de
galactoligossacarídeos, lactulose, isomaltoligossacarídeo, xiloligossacarídeos,
gentioligossacarídeos (GIBSON e FULLER , 2000).
2.3.1 Frutooligossacarídeo (FOS)
Entre os oligossacarídeos de ocorrência natural, os frutooligossacarídeos (FOS) são os
principais compostos reconhecidos e utilizados em alimentos aos quais atribuem-se
propriedades prebióticas (NITSCHKE, 2002). Dependendo do comprimento da cadeia,
definida pelo número de unidades de monossacarídeos e também chamada grau de
polimerização (DP), os FOS podem ser chamados de oligofrutoses (DP < 10, DP média = 4,8)
ou inulina (DP entre 2 - 60, média = 12) (GIBSON & ROBERFROID, 1995; NINESS, 1999).
Os frutooligossacarídeos são formados por uma molécula de sacarose, com uma, duas
ou três unidades de frutose unidas, mediante ligações β(1-2) à molécula de sacarose. O grau
de polimerização varia de 2 a 10 unidades, abreviados como GF2 (1-kestose), GF3 (nistose) e
GF4 (frutosilnistose) (Figura 1). Estes oligossacarídeos derivados da sacarose são encontrados
naturalmente em vegetais e plantas como alcachofra, raiz de chicória, dália, dente de leão,
22
cebola, alho e banana. São chamados açúcares não convencionais e têm tido impacto na
indústria do açúcar devido às suas excelentes características funcionais em alimentos, além de
seus aspectos fisiológicos e físicos (PASSOS e PARK, 2003).
Os frutooligossacarídeos são os principais oligossacarídeos da classe dos
bifidogênicos, açúcares formados de 1 a 3 moléculas de frutose ligadas a uma molécula de
sacarose na posição β(1-2) e as estruturas químicas estão apresentadas na Figura 1.
Apresentam propriedades físicas e fisiológicas que os tornam compostos de grande potencial
de aplicação em alimentos para nutrição humana e animal. São açúcares não digeridos pelo
organismo humano, passam através do intestino delgado sem serem absorvidos e vão direto
para o intestino grosso, onde são seletivamente utilizados pelas bifidobactérias na microflora
intestinal (MITSOUKA, 1990).
Figura 1 - Estrutura química dos principais frutooligossacarídeos(A)1- Kestose, (B) Nistose e (C) Frutofuranosil.
Fonte: PASSOS e PARK (2003).
Os frutoligossacarídeos possuem características que permitem sua aplicação em várias
áreas. Como apresentam cerca de um terço do poder adoçante da sacarose e não são calóricos,
não podem ser considerados fonte de energia para seres humanos, além de poderem ser
usados de modo seguro por diabéticos. Têm solubilidade maior que a da sacarose, não
cristalizam, não precipitam, e nem deixam sensação de secura ou areia na boca. Os
frutoligossacarídeos não são degradados durante a maioria dos processos de aquecimento,
mas podem ser hidrolisados em frutose em condições muito ácidas e em condições de
exposição prolongada de determinados binômios tempo/temperatura (BORNET, 1994).
23
2.3.2 Inulina
A inulina (Figura 2) é uma fibra solúvel, considerada um ingrediente prebiótico.
Comumente extraída da raiz da chicória, oferece uma gama de benefícios nutricionais e
tecnológicos. Pode trazer benefícios para o sistema digestivo, pois a ingestão de ingredientes
prebióticos melhora o equilíbrio da nossa microflora intestinal, aumentando
significativamente a quantidade de bifidobactérias benéficas, inibindo os patógenos. O
resultado disso é que o sistema digestivo trabalha melhor, aumentando a absorção dos
nutrientes dos alimentos ingeridos.
As diferenças no tamanho das cadeias da inulina e das oligofrutoses são também
responsáveis pelas diferenças entre suas propriedades. Devido às cadeias mais longas, a
inulina é menos solúvel que as oligofrutoses e possui capacidade de formar micro cristais
quando misturada com água e leite. Estes micro cristais interagem para formar uma mistura
cremosa e macia, promovendo a sensação de presença de gordura. (BORTOLOZO e
QUADROS, 2007).
Figura 2- Fórmula estrutural da inulinaFonte: Roberfroid, 1993
Em função do efeito benéfico no sistema digestivo, a inulina é considerada um
"Alimento Funcional". Após a ingestão, a inulina não é quebrada no sistema digestivo
humano, não resultando, portanto, em contribuição calórica neste processo. Apenas no cólon
ocorre a degradação de inulina por fermentação de bactérias, e conseqüentemente ocorre uma
baixa contribuição calórica indireta em níveis de 1,0 a 1,5 kcal/g inulina (ROBERFROID,
GIBSON & DELZENNE, 1993). Dessa forma, a ingestão de inulina resulta em um
24
significativo incremento dos benefícios das bifidobactérias. A flora bifidus estimula o sistema
imunológico, a absorção de minerais, e inibe o crescimento de bactérias nocivas ao organismo
(ROBERFROID, VAN LOO & GIBSON, 1998).
A inulina é adicionada em barras de cereais, biscoitos, bolos e cereais matinais para
aumentar o teor de fibra dietética e na formulação de alimentos prebióticos como bebidas
lácticas funcionais ou simbióticas no caso de iogurtes (NITSCHKE, 2002).
Além das frutas e hortaliças, muitos cereais também contêm inulina. Entre eles estão o
trigo, a cevada, o centeio, com concentrações variando entre 1-4% (NILSSON e
DAHLQUIST, 1986). A inulina é extraída da raiz da chicória ou produzida a partir da
sacarose através da reação enzimática com a frutose catalisada pela enzima frutosetransferase.
2.4 Propriedades funcionais e aplicações tecnológicas
A funcionalidade dos alimentos prebióticos está relacionada a uma atuação direta com:
aumento do tempo de esvaziamento do estômago; modulação no trânsito do trato
gastrointestinal (GOT); diminuição de colesterol via adsorção de ácidos biliares e por meio de
atuação indireta, modulando a fermentação microbiana pelo estímulo de bactérias bífidas
responsáveis por aumento de SCFA (ácidos graxos de cadeia curta), diminuição de pH e
diminuição na absorção da amônia (FERREIRA, 2000).
A fermentação dos prebióticos no intestino leva à produção de ácidos graxos de cadeia
curta – AGCC (acetato, propianato e butirato) que são totalmente absorvidos pelo trato
intestinal. Os AGCC têm um efeito sistêmico no metabolismo da glicose e dos lipídeos
causando diminuição da glicemia posprandial e reduzindo a concentração de triglicerídeos e
colesterol sanguíneos (PIMENTEL, FRANCKI e GOELIICKE, 2005), e conseqüentemente
uma redução do risco de arteriosclerose (KAUR e GUPTA, 2002).
Algumas propriedades dos oligossacarídeos são: baixo poder adoçante (0,3 a 0,6 vezes
em relação à sacarose); oligossacarídeos de alta massa molecular fornecem aumento na
viscosidade, levando a melhorias no paladar e textura dos alimentos; alteram a temperatura de
congelamento, e controlam o nível de escurecimento ocasionado pela reação de Maillard em
alimentos que são processados a altas temperaturas; promovem a retenção da umidade,
25
controlando a secagem excessiva e a baixa atividade de água o que favorece o controle
microbiológico (RABELO, 2008).
Testes mostraram que o aumento da ingestão de ingredientes prebióticos em apenas 5
g por dia pode melhorar o equilíbrio de nossa microflora intestinal, aumentando
significativamente a quantidade de bifidobactérias benéficas, inibindo os patógenos. O
resultado é que o nosso sistema digestivo trabalha melhor, e pode absorver os nutrientes do
alimentos de forma mais adequada. (BONDT, 2003).
Estudos “in vitro” têm indicado que a inulina e as oligofrutoses apresentam as
características de prebiótico desenvolvendo fermentação específica e melhorando a
microbiota intestinal (HIDAKA et al.,1986, WANG e GIBSON, 1993). Isso também tem sido
confirmado em ensaios com voluntários humanos, que apresentaram efeitos bifidogênicos
para inulina e oligofrutoses “in vivo” (GIBSON, 1999; BUDDINGTON et al., 1996).
O equilíbrio produzido na microbiota gastrointestinal pelo consumo de
frutooligossacarídeos estimula outros benefícios no metabolismo humano, como a redução da
pressão sanguínea em pessoas hipertensas, redução da absorção de carboidratos e lipídeos,
normalizando a pressão sanguínea e lipídeos séricos e melhoria do metabolismo de diabéticos.
Ainda pode-se observar um aumento da digestão e metabolismo da lactose, aumento de
reciclagem de compostos como o estrógeno, aumento da síntese de vitaminas (principalmente
do grupo B), aumento da produção de compostos imuno estimulantes, que possuem atividade
antitumoral, diminuição da produção de toxinas e compostos carcinogênicos e auxílio da
restauração da flora intestinal normal durante terapia com antibióticos (YAMASHITA et
al.,1984, SPIEGEL et al., 1994).
As frutanas não são cariogênicas, uma vez que não são utilizadas como substrato de
Streptococcus mutans, microrganismo responsável pelo aparecimento de cárie. Em virtude de
possuírem cadeias de diferentes tamanhos, a inulina e a oligofrutose conferem propriedades
distintas aos produtos alimentícios aos quais são adicionadas. A oligofrutose, composta de
oligômeros de cadeias curtas, possui propriedades similares às do açúcar e de xaropes de
glicose, apresentando 30 a 50% do poder adoçante e maior solubilidade que o açúcar. Sendo
assim, essa frutana é freqüentemente empregada em conjunto com edulcorantes de alto poder
adoçante, para substituir o açúcar, resultando em um perfil adoçante bem balanceado. A
26
oligofrutose também é utilizada para conferir consistência a produtos lácteos, maciez a
produtos de panificação, diminuir o ponto de congelamento de sobremesas congeladas,
conferir crocância a biscoitos com baixo teor de gordura e, além disso, também atua como
ligante em barras de cereais (SAAD, 2006).
Devido as suas características físico-químicas e bioquímicas, os oligossacarídeos têm
encontrado aplicação na indústria de alimentos, em produtos utilizados para alimentação
humana (bebidas, adoçantes, leite em pó infantil) e animal (ração), assim como aplicação em
cosméticos, produtos farmacêuticos e produtos para diabéticos (PLAYNE e CRITTENDEN,
1996).
2.5 Dextrana-sacarase
A enzima dextrana-sacarase (1,6-α-D-glucan-6-α-glucanosil transferase, EC. 2.4.1.5) é
geralmente obtida à partir do microrganismo Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F via
processo fermentativo. Trata-se de uma enzima indutiva, cujo único indutor conhecido é a
sacarose, a qual é utilizada como fonte de carbono (RODRIGUES, 2003).
A frutose é um produto natural liberado quando a enzima polimeriza a glicose obtida
da sacarose em dextrana. A mesma enzima é também responsável pela síntese de
oligossacarídeos prebióticos a partir da reação com o aceptor (MONSAN e PAUL, 1995;
MONCHOIS, WILLEMONT e MONSAN, 1999). A produção de dextrana-sacarase é afetada
por vários fatores, como temperatura, pH, aeração e concentração do substrato (CORTEZI,
MONTI e CONTIERO, 2005).
2.6 Mecanismos de síntese de oligossacarídeos prebióticos
A enzima dextrana-sacarase é tradicionalmente utilizada para a síntese de dextrana em
meio contendo sacarose como substrato. Essa enzima catalisa a quebra da sacarose em
unidades de glicose para formar dextrana. Quando além de sacarose, um aceptor (glicose,
frutose, maltose, etc) é também utilizado como substrato, parte das unidades de glicose
(proveniente da quebra da sacarose promovida pela enzima) é desviada da cadeia de dextrana
e vão sendo adicionadas ao aceptor através de ligações glicosídicas lineares do tipo -1,6
27
formando oligossacarídeos de interesse técnico. Esta reação secundária é denominada reação
do aceptor.
No mecanismo aceptor da dextrana-sacarase, a sacarose é usada como substrato, onde
o grupo glicosil é transferido por transglicosilação e o aceptor e a frutose são formados como
produtos. A dextrana é formada em maior ou menor quantidade dependendo do aceptor e das
condições da reação (DEMUTH et al., 2002). Conforme reações a seguir:
Sacarose + aceptor dextrana-sacarase oligossacarídeos prebióticos + frutose
Sacarose dextrana-sacarase Dextrana + frutose
O ajuste da proporção aceptor/sacarose permite a supressão da síntese de dextrana e a
maximização da produção de oligossacarídeos (RODRIGUES at al., 2004; RABELO et al.,
2006). Quando glicose ou frutose são utilizadas como aceptores há formação de gluco-
oligossacarídeos e leucrose, respectivamente, que estimulam o crescimento de bifidobactérias
e lactobacilos inibindo o crescimento de microrganismos daninhos (VERGARA, 2007).
Os oligossacarídeos formados pela reação do aceptor não são fermentáveis pela flora
oral humana. Além disso, há estudos indicando que estes oligossacarídeos estimulam o
desenvolvimento de bidifidobactérias e lactobacillus no intestino humano (MACHIDA et al.,
1986). As quais são benéficas ao trato digestivo sem estimular o desenvolvimento de
microrganismos indesejáveis (RODRIGUES, 2003). Estes oligossacarídeos, embora
apresentem aplicações técnicas relevantes, são considerados de difícil síntese (HEINKE et.
al., 1999; RABELO et al., 2006, RODRIGUES et al., 2006).
2.7 Leuconostoc mesenteroides B-512F
O microganismo Leuconostoc mesenteroides é uma bactéria aeróbia facultativa e,
utilizando sacarose como fonte de carbono, primeiramente produz a enzima dextrana-
sacarase, a qual é responsável pela conversão de sacarose em dextrana (RODRIGUES et al.,
2006; RABELO et al., 2006). Esse microrganismo apresenta crescimento ótimo entre 25 – 30
ºC (SANTOS et al., 2000). Essa bactéria é nutricionalmente exigente, requerendo minerais
28
(Mg+2 e Mn+2), vitaminas, em especial do complexo B e aminoácidos para seu ótimo
crescimento (GAO et al., 2006). O crescimento celular é realizado em meio tamponado,
sendo 7 o pH ótimo para esta etapa. Já o pH ótimo para a produção enzimática se encontra na
faixa de 6,0 a 6,9, enquanto que o pH ótimo para a reação enzimática é de 5,2 (RODRIGUES,
2003; VERGARA, 2007).
2.8 Caju
O cajueiro é uma planta rústica, originária do Brasil, sendo típica de regiões de clima
tropical. Na Amazônia tropical, as árvores apresentam porte bastante elevado; nos Estados do
Nordeste brasileiro, a principal espécie de ocorrência é o Anacadium occidentale L., cujas
árvores apresentam pequeno e médio porte, sendo a única espécie do gênero que é cultivada
com finalidade comercial, enquanto que as demais espécies são exploradas apenas por
extrativismo (SANCHO, 2006;).
O caju compõe-se da castanha – o verdadeiro fruto – e de um pedúnculo hipertrofiado.
A castanha, verdadeiro fruto do cajueiro, é um aquênio reniforme (3 g a 32 g), com tegumento
liso, coriáceo, cinzento ou verde acinzentado; o mesocarpo é espesso, alveolado, cheio de um
líquido viscoso, vermelho, acre, cáustico e inflamável, comumente chamado LCC (líquido da
casca da castanha). A ela está associado grande valor comercial tanto no Brasil como no
exterior, constitui-se no principal produto de utilização do cajueiro (MENEZES e ALVES,
1995).
É a castanha de caju que apresenta grande valor comercial tanto no Brasil como no
exterior, desta forma, o pseudofruto ou pedúnculo acaba por ser subutilizado. Este, que
apresenta cerca de 10 vezes o peso da castanha, representa uma quantidade enorme de matéria
prima perdida anualmente, valores que chegam a quase um milhão de toneladas anuais no
Estado do Ceará, que detém 54,4 % de quase um milhão de hectares plantados no país com
esse tipo de lavoura (SANCHO, 2006).
2.9 Suco de caju
De acordo com a legislação brasileira que estabelece o regulamento técnico para
fixação dos padrões de identidade e qualidade para suco tropical de caju, o suco de caju
29
clarificado é definido como a bebida não fermentada e não diluída, obtida da parte comestível
do pedúnculo do caju (Anacardium occidentalis, L.). O suco deve apresentar características de
odor e sabor próprios da fruta e a coloração variando da cor branca à amarelada. (BRASIL,
2000).
O suco de caju clarificado é rico em glicose e frutose e, dessa forma, funciona como
fonte de aceptores (frutose e glicose) para a síntese de oligossacarídeos prebióticos
(HONORATO et al.,2006). Segundo Honorato e Rodrigues (2010) a enzima dextrana-
sacarase apresentou estabilidade por um período mais prolongado no suco de caju do que no
meio sintético, além de apresentar uma atividade relativa mais elevada.
2.10 Aspectos da produção e economia
Em virtude da crescente demanda, esforços para a diminuição do custo de processos
produtivos tem sido alvo recente de estudos. A utilização de substratos de origem
agropecuária tais como: amido, melaço de cana, xarope de abacaxi e suco de uva tem sido
estudada como uma forma de redução de custos e, portanto, aumento da competitividade no
mercado mundial. Neste contexto, o uso de matérias-primas agrícolas regionais como
substrato de baixo custo para o desenvolvimento de processos fermentativos é uma alternativa
interessante. O caju possui pedúnculo que é desperdiçado, pois o maior valor dessa cultura
está associado à amêndoa da castanha. O processamento do pedúnculo possui segmentos em
vários setores industriais, como bebidas, doces, farinhas, condimentos e ração animal. O
produto de maior expressão econômica é a amêndoa, sendo tipicamente um produto de
exportação, enquanto os produtos obtidos a partir do processamento do pedúnculo destinam-
se basicamente ao mercado interno (LEITE, 1994; FONTES, 2009).
O Brasil é reconhecido pela qualidade de suas amêndoas e pela confiabilidade nos
fornecedores. A produção de castanha é distribuída, principalmente, nos estados do Ceará,
Piauí, Rio Grande do Norte e Bahia, com uma produção registrada, considerando a entrada da
matéria prima nas fábricas, de 325 mil toneladas (Safra 2006/2007), oriundas de 700 mil
hectares de área cultivada. As divisas geradas com as exportações representaram U$187
milhões, em 2007. Deste montante, o Ceará participou com U$ 136 milhões (72%)
(TEXEIRA, 2009). Em 2008, o Brasil exportou 35,4 mil toneladas de castanha da caju, 26 mil
30
toneladas provenientes do Ceará representando 73,4% das exportações de castanha de caju
(SINDICAJU, 2009).
É a castanha de caju que representa grande valor comercial tanto no Brasil como no
exterior, desta forma, o pseudofruto ou pedúnculo acaba por ser subutilizado. Este, que
apresenta cerca de 10 vezes o peso da castanha, representa uma quantidade enorme de matéria
prima perdida anualmente. Valores esses, que chegam a quase um milhão de toneladas anuais
no estado do Ceará (SANCHO, 2006). Estima-se que o aproveitamento do pedúnculo para
industrialização seja inferior a 12% da produção (LIMA, 2008). Dentre os fatores de
influência estão a alta perecibilidade do pedúnculo do caju, associada ao curto período da
safra e a inexistência de métodos econômicos de preservação da matéria-prima (COSTA,
1999).
2.11 Utilização do suco de caju como substrato em processos biotecnológicos
Devido a alta disponibilidade de pedúnculos de caju, diversos estudos tem sido
voltado ao seu aproveitamento como substrato em processos biotecnológicos. A produção de
ácido lático em suco de caju utilizando uma bactéria lática homofermentativa foi estudada por
Silveira (2009). Rabelo et al. (2009) estudaram a produção da enzima dextrana-sacarase e a
síntese de oligossacarídeos utilizando a enzima bruta produzida em suco de caju e utilizando
a enzima produzida pelo Leuconostoc citreum B-742. Vergara et al. (2010) estudaram a
produção de oligossacaríedos via processo fermentativo em suco de caju. O suco de caju foi
ainda utilizado como substrato para diversas outras aplicações, tais como produção de
bioetanol (ROCHA et al., 2009), enzimas (CHAGAS et al., 2007; RODRIGUES et al., 2007),
biosurfactante (ROCHA et al., 2007; GIRO et al., 2009) e outros produtos de alto valor
agregado tal como manitol (FONTES et al., 2009, HONORATO et al. 2007).
Embora a produção de oligossacarídeos prebióticos em suco de caju por processo
fermentativo tenha se mostrado viável, a presença de contaminantes desse produto, devido ao
processo, impede o seu consumo, o que não ocorre por via enzimática. Dessa forma, o
objetivo deste trabalho foi estudar a síntese de oligossacarídeos prebióticos em suco de caju
por via enzimática utilizando a enzima dextrana–sacarase parcialmente purificada.
31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção do microrganismo
Foi utilizada uma cultura estoque do microrganismo Leuconostoc mesenteroides
B512F mantida congelada no Laboratório de Biotecnologia do Departamento de Tecnologia
de Alimentos (LABIOTEC/DETAL/UFC). Esta linhagem foi obtida liofilizada junto ao banco
de microrganismos do Departamento Estadual de Agricultura dos EUA (United States
Departament of Agricultural, Peoria, Illinois, NRRL Culture Collection).
3.2 Ativação do Leuconostoc mesenteroides B-512F liofilizado
O crescimento da cepa liofilizada foi realizado com o meio padrão otimizado por
GUIMARÃES et al. (1999), o qual é descrito na Tabela 2.
Tabela 2 - Meio padrão otimizado
Reagente Concentração (g/L)
Sacarose 50,0
Extrato de levedura 20,0
Fosfato de potássio dibásico 20,0
Sulfato de magnésio 0,20
Sulfato de manganês 0,01
Sulfato ferroso 0,01
Cloreto de cálcio 0,02
Cloreto de sódio 0,01
pH 6,5 121°C/15min
Fonte: GUIMARÃES et al. (1999).
As soluções salinas foram preparadas separadamente em concentrações superiores
(soluções estoque), sendo posteriormente diluídas para preparação do meio padrão de forma a
atingirem as concentrações da Tabela 2. Preparou-se separadamente na forma concentrada o
fosfato de potássio dibásico e esterilizou-se em Erlenmeyer de 250 mL para ser adicionado à
frio 10 mL ao meio de cultura na hora da inoculação. Ensaios anteriores constataram que,
quando este sal foi autoclavado na presença dos demais componentes do meio de
32
fermentação, ocorreu a precipitação no meio (QUEIROZ, 1987). O pH foi ajustado para 6,5
com ácido fosfórico concentrado e o meio foi dividido em Erlenmeyers contendo alíquotas de
100 mL, cada um, os quais foram esterilizados.
O microrganismo liofilizado foi então inoculado no meio, contendo fosfato, e
cultivado em shaker rotatório TECNAL, modelo TE-420 a 30°C com agitação de 150 rpm.
Este procedimento foi repicado por três vezes até a formação de uma boa quantidade de
biomassa (RODRIGUES, LONA e FRANCO, 2003). Após o crescimento, o microrganismo
foi congelado em tubos contendo 8,0 mL cada em freezer (– 20°C) em solução de glicerol 50
% (v/v) para ser usado como inóculo da fermentação.
3.3 Ativação do microrganismo congelado
O Leuconostoc mesenteroides B-512F foi ativado, inoculando-se num tubo de cultura
estoque (congelada a –20°C) em 100 mL do meio sintético padrão otimizado por
GUIMARÃES et al. (1999) o qual continha somente sacarose como fonte de carbono (indutor
da produção da enzima). A ativação foi conduzida em agitador orbital TECNAL, modelo TE-
420 a 30°C com agitação de 150 rpm por 6 horas.
3.4 Produção da enzima dextrana-sacarase
O Leuconostoc mesenteroides B-512F, foi ativado conforme descrito no item 3.3. A
ativação foi conduzida em agitador orbital TECNAL, modelo TE-420 a 30°C com agitação de
150 rpm por 6 horas. Este procedimento foi repicado por duas vezes até a formação de uma
boa quantidade de biomassa e encerrado quando o pH atingiu o valor de 5,5 para evitar a
perda de viabilidade do microrganismo.
A fermentação foi conduzida em fermentador TECNAL, modelo TECBIO com
capacidade para 1500 mL. Foi adicionado ao fermentador (contendo 500 mL de meio), 50 mL
de fosfato de potássio dibásico. O microrganismo foi ativado em meio sintético com um
volume correspondente a 3% do volume do meio de cultura. A fermentação ocorreu a 30 ºC
sob agitação de 150 rpm e controle do pH em 6,5 (± 0,1). O sistema foi alimentado com uma
solução de NaOH (120 g/L) para controle do pH durante as 6 h iniciais da fermentação e uma
solução de sacarose (300 g/L). O crescimento microbiano e a atividade enzimática foram
33
monitorados em intervalos de tempo regulares. Após este período, a alimentação foi
interrompida. A fermentação foi interrompida quando o pH atingiu o valor de 5,2 (pH ótimo
de atividade e estabilidade da enzima) e em seguida, o caldo fermentado foi centrifugado para
remoção de células (11600g por 10 minutos em 4°C) em centrífuga de marca Sigma®,
modelo 6k-15. Dessa forma, foi obtida a enzima bruta.
3.5 Purificação parcial da enzima
A purificação parcial da enzima foi realizada através da precipitação da enzima com a
adição de polietileno glicol (PEG 1500). Foi adicionada lentamente ao fermentado livre de
células o mesmo volume de uma solução de polietileno glicol (PEG) a 50 % (v/v). A mistura
foi centrifugada a 11600g por 10 minutos a 4°C e o precipitado (fase rica em dextrana-
sacarase) foi resuspenso em tampão acetato de sódio 20 mM contendo 0,05 g/L de CaCl2 com
pH ajustado para 5,2 (pH ótimo de atividade enzimática) e a enzima obtida foi estocada e
congelada em freezer à –20° C.
Esta técnica é denominada purificação parcial, pois juntamente com a enzima há
precipitação de dextrana, pois segundo Lopretti et al. (1999), ocorre uma partição entre a
dextrana produzida, sendo parte precipitada junto com a enzima e a parte remanescente no
caldo bruto da fermentação. Entretanto, a presença de dextrana é benéfica, pois auxilia na
estabilização da enzima.
3.6 Obtenção do suco de caju
O suco de caju foi obtido a partir da prensagem mecânica do pedúnculo do caju,
seguida da clarificação. O processo de clarificação do suco consistiu na adição de gelatina
para decantação dos sólidos totais e taninos (ABREU, 2006). Neste processo, foram
adicionados 500 mL de solução de gelatina 1% (m/v) sobre 5 L de suco de caju, resultantes da
centrifugação da polpa. Após 40 minutos, as suspensões foram filtradas em papel de filtro
Whatman nº 42 (COURI et al., 2002). Este procedimento foi realizado na planta piloto da
Embrapa Agroindústria Tropical (Fortaleza –CE).
34
O suco de caju clarificado in natura é altamente perecível e foi estocado congelado (-
20°C) para evitar deterioração, uma vez que não foram utilizados aditivos por se tratar de uma
matéria prima para uso em processos fermentativos.
3.7 Caracterização físico-química do suco de caju clarificado
O suco de caju foi físico-quimicamente caracterizado quanto ao pH (potenciometria
direta), açúcares redutores pelo método DNS (MILLER, 1959) a metodologia das análises
serão descritas nos itens 3.9.1 e 3.9.2, respectivamente.
3.8 Síntese enzimática dos oligossacarídeos prebióticos
As sínteses foram realizadas com a enzima parcialmente purificada. As concentrações
de substratos (glicose, frutose e sacarose) para a síntese dos oligossacarídeos foram avaliadas
através de um planejamento fatorial, 22 central compósito com três pontos centrais
(RODRIGUES e IEMMA, 2005), onde foram realizados 11 ensaios (Tabela 3 ) tendo como
variáveis as concentrações de sacarose e açúcares redutores (glicose e frutose), segundo
RABELO et al. (2007). As concentrações de açúcares redutores utilizados no planejamento
experimental foram obtidas a partir da diluição do suco de caju clarificado que apresentou um
teor de 87,7g/L de açúcares redutores. Foram obtidos como resposta os açúcares redutores
totais consumidos (glicose e frutose), a dextrana, os oligossacarídeos prebióticos, os
rendimentos em dextrana e oligossacarídeos.
Para a realização da síntese enzimática, foram utilizados tubos de ensaio contendo o
suco de caju (açúcares redutores) e sacarose nas concentrações indicadas na Tabela 3 e 270
μL de enzima que apresentava uma atividade de 403,6 UDS/mL. Uma UDS nada mais é do
que a quantidade de enzima que converte 1 mg de sacarose em dextrana a 30°C liberando
0,52 mg de frutose em 1 hora (RODRIGUES, 2003). O pH foi ajustado para 5,2. Foram
adicionadas três gotas de azida 1% a cada tubo para evitar a contaminação microbiológica. A
síntese enzimática foi conduzida a temperatura ambiente (28°C±2) durante 24 horas, tempo
suficiente para o consumo total da sacarose (RABELO, 2006). Após o término da síntese, a
dextrana foi removida através da precipitação com três volumes de etanol 96%.
35
Tabela 3 - Planejamento experimental para a síntese enzimática dos oligossacarídeos prebióticos no suco de caju
Ensaio Sacarose (g/L) Açúcares redutores totais (g/L)1 25,00 25,002 25,00 75,003 75,00 25,004 75,00 75,005 14,64 50,006 85,35 50,007 50,00 14,658 50,00 85,359 50,00 50,0010 50,00 50,0011 50,00 50,00
Os resultados de açúcares redutores e de dextrana, no final do ensaio, foram
determinados experimentalmente conforme metodologia descrita no item 3.9. Os açúcares
redutores totais consumidos (frutose e glicose), oligossacarídeos prebióticos e os rendimentos
em dextrana e em oligossacarídeos foram calculados através de balanço de massa conforme as
equações 1 a 8:
Fi (g/L) = ART + SAC
2
(1)
FCONS (g/L) = Fi - FRT (2)
Gi (g/L) = ART + SAC
2
(3)
GCONS (g/L) = (ART + Gi) – GRT
2
(4)
OLIGO (g/L) = FCONS + GCONS (5)
AT(g/L) = SAC + ART (6)
YOLIGO (%) = OLIGO (g/L) x 100
AT (g/L)
(7)
YDXT (%) = DXT(g/L) x 100
AT (g/L)
(8)
36
Onde,
Fi frutose no início do ensaio (g/L)
SAC quantidade de sacarose no início do ensaio (g/L)
ART
FCONS
FRT
Gi
açúcares redutores totais (g/L)
frutose consumida no ensaio (g/L)
frutose residual total no final do ensaio (g/L)
glicose no início do ensaio (g/L)
GCONS glicose consumida no ensaio (g/L)
GRT glicose residual total no final do ensaio (g/L)
OLIGO Oligossacarídeos (g/L)
AT açúcares totais (g/L)
YOLIGO rendimento em oligossacarídeos
YDXT rendimento em dextrana
DXT dextrana
3.9 Métodos Analíticos
3.9.1 pH
O pH foi determinado através de leitura direta, em potenciômetro de marca Marconi®,
modelo PA200, calibrado a cada utilização com soluções tampão de pH 4,0 e pH 7,0
conforme a AOAC (1992).
3.9.2 Determinação de açúcares redutores
Os açúcares redutores foram determinados de acordo com o método de MILLER
(1959), o qual consiste na reação da amostra com o reagente DNS (ácido dinitrosalicílico) a
100°C durante 5 minutos, sendo este um método colorimétrico onde a concentração dos
açúcares redutores após a reação com DNS é proporcional a absorbância no espectro visível a
540 nm.
Para a determinação das concentrações de açúcares na amostra foi feita uma curva
padrão de calibração através de soluções padrão em concentrações conhecidas (faixa de 0,2 a
37
2,0 g/L). Esta curva de calibração é uma reta passando pela origem dos eixos, cuja equação é
determinada através de regressão linear.
A determinação da curva de calibração foi feita adicionando-se 125 µL de cada
solução padrão em um tubo de ensaio contendo 125 µL da solução de DNS. A mistura foi
aquecida à 100°C por 5 minutos e resfriada posteriormente em banho de gelo. Após atingir a
temperatura ambiente, a mistura foi diluída com 2250 µL de água destilada e a leitura da
absorbância no comprimento de onda de 540 nm foi realizada em espectrofotômetro
Spectrum®, modelo SP2000UV. Para os ensaios, foi realizado o mesmo procedimento
utilizado para a construção da curva padrão.
3.9.3 Determinação do crescimento microbiano
Segundo Rodrigues (2003), o crescimento microbiano está associado à produção da
enzima, onde no final do crescimento exponencial atinge-se a máxima atividade enzimática.
Após esse período tanto o pH como a atividade decrescem rapidamente. Dessa forma, fazer o
monitoramento do crescimento microbiano durante a produção da enzima torna-se necessário.
A determinação do crescimento microbiano foi realizada através de leitura da
absorbância a 590 nm em espectrofotômetro Spectrum®, modelo SP200UV. O procedimento
consistiu em diluir uma alíquota da suspensão contendo as células em água destilada e
realização da leitura da absorbância contra um branco com água. A massa seca celular foi
calculada através de uma curva de calibração construída com a determinação do peso seco das
células seguido de diluição (RODRIGUES et al., 2003).
3.9.4 Determinação da Dextrana
A dextrana precipitada, conforme descrito no item 3.7, foi re-suspensa em água
destilada e determinada segundo o método fenol ácido sulfúrico para determinação de
carboidratos totais (DUBOIS et al., 1956).
38
3.9.5 Determinação da atividade enzimática
A atividade enzimática no caldo fermentado e na enzima parcialmente purificada foi
determinada através da quantificação da frutose liberada em meio reacional contendo sacarose
como substrato (HEINKE et al., 1999).
A atividade enzimática foi determinada em termos de unidade de dextrana-sacarase
(UDS/mL). Entretanto não é necessário que a cinética seja determinada no período de 1 hora,
pois ainda se está na faixa linear do gráfico de velocidade.
Realizou-se o cálculo da atividade enzimática utilizando a seguinte equação:
(Atividade UDS / mL) = 1 β1 60 d (9)
1 0,52
Onde:
1 coeficiente angular da curva de calibração de DNS (mg/ABS.ml)
β1 coeficiente angular da reta da curva cinética (ABS/min)
60 conversão do tempo de minutos para hora
d diluição da amostra
O coeficiente angular da curva foi calculado da seguinte forma:
β = ABS10 – ABS0 (10)
10
ABS10 valor médio das leituras de absorbância no tempo 10 minutos
ABS0 valor médio das leituras de absorbância no tempo zero
Para a determinação da atividade da enzima obtida no meio sintético, realizou-se o
seguinte procedimento:
1. Foram preparados 100 mL de uma solução reativa contendo 18,2 mL de uma solução
estoque de sacarose (300 g/L) em tampão acetato de sódio 20 mM com 0,05 g/L de
CaCl2 e 4,5 mL de solução tampão de acetato de sódio 20 mM com 1,2 g/L de CaCl2.
O pH da solução foi ajustado para 5,2;
39
2. Uma alíquota de 450 µL desta solução de atividade foi adicionada a dois tubos de
ensaio e, em seguida, uma alíquota de 50 µL do caldo fermentado centrifugado foi
adicionada a cada tubo de ensaio;
3. Os tubos foram incubados a 30°C em banho termostatizado por 10 minutos onde,
Foram adicionados 500 µL do reagente de DNS a cada um dos tubos nos tempos 0 e
10 minutos, respectivamente.
4. Os tubos foram então aquecidos por 5 minutos a 100°C e resfriados à temperatura
ambiente em banho de gelo.
5. A cada um dos tubos foram adicionados 9,0 mL de H2O destilada.
6. Os tubos foram homogeneizados e a leitura foi realizada a 540 nm contra o branco da
solução de atividade.
3.9.6 Detecção de oligossacarídeos através de cromatografia de camada delgada (CCD)
Os oligossacarídeos prebióticos foram detectados através de cromatografia de camada
delgada (CCD), em placas de sílica gel da marca Whatman, sendo utilizadas placas tipo K6
(sílica gel 60 A). Foi utilizada a técnica de múltiplas ascensões, que permite uma melhor
separação dos produtos de interesse, e placas de dimensões de 20 x 20 cm permitindo a
corrida de aproximadamente 15 amostras simultâneas. Para a separação dos oligossacarídeos
foi utilizado o sistema acetonitrila/acetato de etila/1-propanol/água (85:20:50:90), sendo
realizadas duas ascensões (RODRIGUES, 2003).
Após diluição adequada, as amostras foram aplicadas na borda inferior da placa à uma
distância de 1,5 cm da borda. Foram aplicados 10 µL de cada uma das amostras e mais os
padrões de sacarose, frutose e glicose para identificação das respectivas manchas. Para
aplicação das amostras, foram utilizadas micropipetas. As placas foram colocadas na câmara
de desenvolvimento saturada com a fase móvel. Ao término de cada ascensão a placa foi seca
com secador de cabelos para remoção completa da fase móvel.
Como sistema de detecção, foi utilizada uma solução constituída de 0,3 % (m/v) de 1-
naftiletilenodiamina e 5 % (v/v) de H2SO4 concentrado em metanol. Ao término da última
ascensão, as placas foram removidas da câmara de desenvolvimento, secas conforme
procedimento descrito acima, e mergulhadas rapidamente no reagente de detecção. Após
40
secagem natural em capela (à temperatura ambiente e sem uso do secador de cabelos), as
placas foram colocadas em uma estufa a 120°C por 10 minutos para revelação das bandas.
3.9.7 Determinação de açúcares residuais, através de cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (HPLC)
A cromatografia é uma técnica extremamente versátil, utilizada para a separação dos
componentes de uma mistura, que consiste na distribuição dos componentes da mistura entre
uma fase estacionária e uma fase móvel. A separação é resultante das diferenças de
velocidade entre os componentes arrastados pela fase móvel devido às diferentes interações
destes componentes, com a fase estacionária (SANCHO, 2006).
Equipamento
Utilizou-se um cromatógrafo líquido da marca Varian, composto por duas bombas de
alta pressão Pro Star 210, um detector de índice de refração (IR) Pro Star 355 Varian,
detector UV-Vis Pro Star de duplo canal modelo 342, um injetor Rheodyne com alça de
amostragem de 20 μL, gerenciado pelo software Star Chromatography WS versão 6.0 e forno
para termostatização da coluna.
Os açucares residuais foram analisados utilizando uma coluna para separação de
açúcares Aminex® HPX-87C (300 mm x 7,8 mm), a 85 ºC, usando água Milli-Q como fase
móvel.
Fase móvel
No desenvolvimento analítico, foram utilizados como fase móvel, água purificada pelo
sistema Milli-Q (MILLIPORE) e H2SO4 0,01M. Ambos, filtrados a vácuo, em membrana de
ester de celulose com poros de 0,45 μm e 47 mm de diâmetro (MILLIPORE) e
desgaseificados em ultra-som (MARCONI), por 15 minutos.
41
Curva de calibração
Para a elaboração da curva de calibração, foram utilizadas soluções padrão compostas
por misturas de padrões puros de glicose, frutose e sacarose, em concentrações conhecidas
(faixa de 0,1 a 10 g/L). As soluções foram preparadas com água deionizada, e posteriormente
filtradas em membrana de acetato de celulose (Whatman), com 13 mm de diâmetro e poros de
0,45 μm, e acondicionadas em frascos eppendorfs.
Preparação das amostras
Em virtude da composição do suco de caju, fez-se necessário, submetê-las a um
processo de extração em fase sólida, usando cartucho C18 (Bond Elut C18,), a fim de
promover a retirada das substâncias coloridas que, poderiam interferir na determinação do
analito de interesse. A extração foi realizada a uma velocidade média de fluxo correspondente
a uma gota a cada três segundos. (SANCHO, 2006).
Posteriormente, as amostras foram filtradas em membrana de acetato de celulose
(Whatman) com 13 mm de diâmetro e poros de 0,45 μm, acoplada a uma seringa Hamilton, e
acondicionadas em frascos eppendorfs.
Método de análise
Na metodologia utilizada para elaboração da curva de calibração e análise das
amostras empregou-se uma vazão de fase móvel de 0,6 mL/ min, com a temperatura do
detector em 35ºC. A identificação e quantificação dos açúcares residuais foi realizada por
comparação entre os tempos de retenção obtidos com padrões previamente injetados.
3.9.8 Análise dos dados
Os ensaios fermentativos foram realizados em duplicata e as determinações analíticas
em triplicata. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância com nível de 95% de
confiança, utilizando o programa estatístico Statistica (Statsoft) versão 7.0 cujos resultados
foram expressos como médias ± desvio padrão.
42
4.0 Resultados e Discussão
4.1 Caracterização do suco de caju
O suco de caju clarificado apresentou um teor de 87,7g/L de açúcares redutores totais,
mostrando que este pode ser utilizado como fonte de aceptores (glicose e frutose) para a
síntese de oligossacarídeos prebióticos.
Em seu estudo Vergara (2007) encontrou teor semelhante de 90,45 g/L de açúcares
redutores totais. Contudo, Rabelo (2008) encontrou valores de 65,60 g/L de açúcares
redutores totais, o que demonstra que o teor de açucares pode variar bastante de uma safra a
outra.
4.2 Síntese enzimática de oligossacarídeos prebióticos.
A síntese enzimática dos oligossacarídeos prebióticos foi realizada com a enzima parcialmente purificada no suco de caju durante o período de 24 horas tempo suficiente para que toda sacarose fosse consumida na síntese (o que foi confirmado por HPLC). A Tabela 4apresenta as condições experimentais do ensaio e os resultados com relação a dextranaproduzida e o rendimento em dextrana obtido a partir da síntese de oligossacarídeos prebióticos utilizando a enzima dextrana-sacarase e o suco de caju e sacarose como substrato. Essa dextrana foi determinada analiticamente (DUBOIS et al., 1956).
Tabela 4 - Planejamento experimental e resultados obtidos de dextrana e rendimento em dextrana no suco de caju
Ensaio Sacarose (g/L)Açúcares redutores
totais (g/L)Dextrana (g/L) YDXT(%)
1 25,00 25,00 7,21±0,312 14,422 25,00 75,00 8,17±0,290 8,173 75,00 25,00 7,44±0,118 7,444 75,00 75,00 4,85±0,108 3,235 14,64 50,00 6,71±0,183 10,386 85,35 50,00 9,63±0,065 7,117 50,00 14,65 10,64±0,000 16,468 50,00 85,35 11,21±0,011 8,289 50,00 50,00 13,60±0,108 13,6010 50,00 50,00 13,58±0,065 13,5811 50,00 50,00 13,44±0,183 13,44
43
A tabela 4 mostra que o menor rendimento em dextrana 3,23% foi obtido a partir de
concentrações de 75 g/L de sacarose e 75 g/L de açúcar redutor. O rendimento máximo em
dextrana foi de 16,46% utilizando-se uma combinação de 50 g/L de sacarose e 14,65 g/L de
açúcares redutores. Esses resultados são bastante favoráveis, pois baixos rendimentos em
dextrana favorecem a formação dos oligossacarídeos prebióticos. Como a dextrana não é um
produto de interesse neste trabalho, é indicado que sejam empregadas condições que
desfavoreçam sua síntese.
O modelo de regressão para a concentração em dextrana não foi estatisticamente
significativo no intervalo de confiança de 95%, portanto as Tabelas referentes aos efeitos das
variáveis e à análise de variância (ANOVA) são apresentadas no ANEXO 1.
A Tabela 5 apresenta os efeitos das variáveis independentes (sacarose e açúcares
redutores) no rendimento em dextrana.
Tabela 5 - Efeitos estimados de rendimento em dextrana
YDXTFator Efeito S.E.Média 13,54* 1,06*Sac(L) -4,14* 1,03*Sac (Q) -5,92* 1,55*A R(L) -5,51* 1,30*A R (Q) -2,29 1,55
Sac x A R 1,02 1,84 * Significativo em um intervalo de 95% de confiança. SAC : Sacarose, AR: Açúcar redutor
De acordo com a Tabela 5, observa-se que no intervalo de confiança de 95% o efeito
linear da sacarose e dos açúcares redutores e sacarose quadrática apresentaram-se
significativos sobre o rendimento em dextrana.
O modelo de regressão obtido para o rendimento em dextrana é expresso pela equação
11.
(11)S.ARxARxAR,SxS 32323 10110203010535,080,8(g/L)DextranaemRendimento
44
A análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão obtido para o
rendimento em dextrana é apresentado na Tabela 6.
Tabela 6 - Análise de variância para o rendimento em dextrana no suco de caju.
Fonte de variação Soma
Quadrática
Graus de
Liberdade
Média
QuadráticaValor de F
Regressão 145,81 5 29,16 8,65Residual 16,86 5 3,37
Total 162,67 10Coeficiente de determinação
0,89
F Tabelado (95%) F5,5= 5,05
De acordo com as Tabela 6 que apresenta a ANOVA para os modelos de regressão
ajustados, os valores de F calculado (8,65) para o modelo de rendimento em dextrana, foi
maior que o valor de F5,5 Tabelado (5,05) no intervalo de 95% de confiança, assim o modelo
pode ser considerado estatisticamente significativo, de acordo com o teste F.
Os resultados de rendimentos em dextrana apresentados na Tabela 4 foram analisados
através do gráfico de superfície de resposta com o auxílio do software Statistica 7.0 (Statsoft).
A Figura 3 apresenta a superfície de resposta obtida para o rendimento em dextrana (Eq.11 ).
Figura 3 - Rendimento em dextrana em função da concentração de sacarose e açúcares
redutores.
45
A Figura 3 mostra que em altas concentrações os açúcares redutores não apresentam
influência no rendimento em dextrana e que o mesmo é favorecido na combinação de baixas
concentrações de sacarose e açúcares redutores, isso se deve ao fato da enzima dextrana-
sacarase na presença de aceptores e com um ajuste da proporção aceptor/sacarose favorecer a
formação de oligossacarídeo em detrimento da síntese de dextrana.
A Tabela 7 apresenta as condições experimentais do ensaio e os resultados com relação
a concentração de oligossacarídeos prebióticos no suco de caju e o rendimento em
oligossacarídeos obtidos a partir da síntese de oligossacarídeos prebióticos utilizando a
enzima dextrana sacarase e o suco de caju como substrato.
Tabela 7 - Planejamento experimental e resultados obtidos de concentração de oligossacarídeos prebióticos e rendimentos em oligossacarídeos
Ensaio Sacarose (g/L)
Açúcares redutores totais (g/L)
Olig (g/L) YOLIG(%)
1 25,00 25,00 27,04 54,082 25,00 75,00 53,49 53,493 75,00 25,00 71,20 71,24 75,00 75,00 104,73 69,825 14,64 50,00 38,55 59,646 85,35 50,00 62,94 46,507 50,00 14,65 41,65 64,428 50,00 85,35 77,96 57,609 50,00 50,00 63,84 63,8410 50,00 50,00 59,24 59,2411 50,00 50,00 65,18 65,18
A tabela 7 mostra que em concentrações de 25 g/L de sacarose e 25 g/L de açúcar
redutor foi obtido uma baixa concentração de oligossacarídeos prebióticos. A maior
concentração de oligossacarídeos (104,73 g/L) foi obtida utilizando-se 75 g/L de sacarose em
combinação com 75 g/L de açucares redutores, sendo que nestas mesmas concentrações de
sacarose e açucares redutores foi observado o menor rendimento em dextrana (Tabela 4)
mostrando que através da reação do aceptor, a glicose proveniente da sacarose é desviada da
cadeia de dextrana e passa a ser incorporada no aceptor formando oligossacarídeos
prebióticos em detrimento da formação de dextrana.
O modelo de regressão para o rendimento em oligossacarídeos não foi estatisticamente
significativo no intervalo de confiança de 95%, portanto as Tabelas referentes aos efeitos das
variáveis e à análise de variância (ANOVA) são apresentadas no ANEXO 2.
46
A Tabela 8 apresenta os efeitos das variáveis independentes (sacarose e açúcares
redutores) na concentração de oligossacarídeos.
Tabela 8 - Efeitos estimados de concentração de oligossacarídeos
Oligossacarídeos
Fator Efeito S.E.Média 62,75* 6,58*Sac(L) 32,47* 8,05*Sac (Q) -7,58 9,59A R(L) 27,83 8,05A R (Q) 1,47 9,59
Sac x A R 3,54 11,39* Significativo em um intervalo de 95% de confiança.SAC : Sacarose, AR: Açúcar redutor
De acordo com a Tabela 8, observa-se que no intervalo de confiança de 95% o efeito
linear da sacarose apresentou-se significativo sobre os oligossacarídeos.
O modelo de regressão obtido para concentração em oligossacarídeos é expressos pela
equação 12:
32323 10210130,010611,169,2)/( xARxARSxSLgrídeosOligossaca (12)
A análise de variância (ANOVA) para o modelo de regressão obtido para a
concentração em oligossacarídeos é apresentado na Tabela 9.
Tabela 9 - Análise de variância para concentração de oligossacarídeos no suco de caju.
Fonte de variação Soma
QuadráticaGraus de
LiberdadeMédia
QuadráticaValor de F
Regressão 3773.21 5 754.64 5,82Residual 648,71 5 129,74Total 4421,93 10Coeficiente de determinação
0,85
F Tabelado (95%) F5,5= 5,05
47
De acordo com a Tabela 9 que apresenta a ANOVA para os modelos de regressão
ajustados, os valores de F calculado (5,82) foi maior que o valor de F5,5 Tabelado (5,05) no
intervalo de 95% de confiança, assim os modelos pode ser considerado estatisticamente
significativo, de acordo com o teste F.
O resultado de oligossacarídeos prebióticos apresentado na Tabela 7 foi analisado
através de gráficos de superfície de resposta que é apresentado na Figura 4 (Eq. 12).
Figura 4 - Oligossacarídeos prebióticos obtidos em função da concentração de sacarose e
açúcares redutores.
A análise de superfície de resposta para os oligossacarídeos prebióticos mostra que o
efeito da sacarose e do açúcar redutor, isoladamente, não têm influência sobre os
oligossacarídeos prebióticos. Entretanto, a combinação de elevadas concentrações de
sacarose e açúcares redutores favorece a formação de oligossacarídeos, pois a enzima
dextrana-sacarase quando em meio contendo um aceptor (glicose ou frutose) e a sacarose
como substratos, produz oligossacarídeos prebióticos.
Os oligossacarídeos prebióticos formados, detectados através de cromatografia de
camada delgada (CCD), são apresentados na Figura 5.
48
Figura 5 – Oligossacarídeos prebióticos em suco de caju detectados através de cromatografia de camada delgada.
De acordo com a Figura 5, verifica-se que houve formação de oligossacarídeos
prebióticos com graus de polimerização de 5 a 12. Estudos anteriores têm mostrado que o
grau de polimerização (entre 2 e 10) dos oligossacarídeos tem sido considerado fator chave
para o estabelecimento de efeitos de saúde (RABELO, 2008).
No ensaio 2 (25,0 g/L de sacarose e 75,0 g/L de açúcares redutores), verificou-se uma
maior variedade de oligossacarídeos formados, com indicação de formação de
oligossacarídeos com grau de polimerização 12 (GP12). Além disso, foi obtido um
rendimento em oligossacarídeos acima de 50% (Tabela 7). Uma melhor eficiência dos
oligossacarídeos está associada ao comprimento de sua cadeia, visto que oligossacarídeos
prebióticos de cadeia curta são parcialmente absolvidos no intestino delgado, os de cadeia
GP2
GP3
GP4
GP6
GP10
GP9
GP11
GP7
GP5
GP8
GP12
49
longa são absolvidos em grau muito menor e vão permanecer por mais tempo no colón (LEE,
et al., 2008)
No ensaio 4 foi observado elevadas concentrações de oligossacarídeo prebióticos e
uma boa variedade de oligossacarídeos formados com indicação de formação de
oligossacarídeos com grau de polimerização 7 (GP7), segundo Rabelo (2008)
Oligossacarídeos com grau de polimerização entre 2 e 10 são extremamente importantes para
várias aplicações nutricionais e farmacêuticas.
O uso da enzima parcialmente purificada permite o alongamento da cadeia dos
oligossacarídeos. Rabelo et al. (2009) e Vergara (2009) observaram oligossacarídeos com
grau de polimerização 7 em suco de caju.
.
50
5 CONCLUSÕES
O suco de caju clarificado pode ser empregado como uma alternativa de substrato de
baixo custo para a síntese de oligossacarídeos prebióticos, por via enzimática utilizando a
enzima dextrana-sacarase.
O rendimento em dextrana é favorecido na combinação de baixas concentrações de
sacarose e açúcares redutores. O rendimento máximo em dextrana obtido foi de 16,46%
Utilizando-se uma combinação de 50 g/L de sacarose e 14,65 g/L de açúcares redutores.
A formação de oligossacarídeos é favorecida pelo aumento da concentração dos
açúcares redutores e pela combinação de elevadas concentrações de sacarose e açúcares
redutores. Nas concentrações de 75 g/L de sacarose em combinação com 75 g/L de açucares
redutores observou-se a maior concentração de oligossacarídeos que foi de 104,73 g/L e o
menor rendimento em dextrana que foi de 3,23%.
A análise qualitativa mostrou que em concentrações de 25 g/l e 75g/l de sacarose e
açúcar redutor, respectivamente, foi possível obter oligossacarídeos de grau de polimerização
até 12.
51
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
ANEXO 01 - Tabela de efeitos das variáveis independentes e resultados de análise de
variância (ANOVA) referentes à produção de dextrana do planejamento experimental.
a) Efeitos estimados referentes a produção de dextrana
DextranaFator Efeito S.E.Média 13,54* 1,19*Sac(L) 0,26 1,45Sac (Q) -6,68* 1,73*A R(L) -0,21 1,45A R (Q) -3,93 1,73
Sac × A R -1,77 2,05* Significativo em um intervalo de 95% de confiança.
b) Análise de variância referentes a produção de dextrana
Fonte de variação Soma QuadráticaGraus de
LiberdadeMédia
QuadráticaValor de F
Regressão 72,44 5 14,49 3,43Residual 21,09 5 4,22Total 93,53 10Coeficiente de determinação
0,77
F Tabelado (95%) 5,05
61
ANEXO 02 - Tabela de efeitos das variáveis independentes e resultados de análise de
variância (ANOVA) referentes ao rendimento em oligossacarídeos prebióticos do
planejamento experimental.
a) Efeitos estimados de rendimento em oligossacrídeos
* Significativo em um intervalo de 95% de confiança.
b) Análise de variância para o rendimento em oligossacarídeos no suco de caju.
Fonte de variação Soma
QuadráticaGraus de
LiberdadeMédia
QuadráticaValor de F
Regressão 129,45 5 25,89 0,31Residual 417,34 5 83,47Total 546,79 10Coeficiente de determinação
0,23
F Tabelado (95%) F5,5= 5,05
YOligFator Efeito S.E.Média 62,75* 5,27*Sac(L) 3,72 6,46Sac (Q) -7,13 7,69A R(L) -2,91 6,46A R (Q) 0,81 7,70
Sac x A R -0,39 9,14
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