Departmento de Fisiologia-Disciplina de NeurofisiologiaSP, Brasil

TELMA TIEMI SCHWINDTAGOSTO/2006

Universidade Federal de São Paulo

Escola Paulista de Medicina

CÉLULAS-TRONCO:

HISTÓRICO E CONCEITOS

O QUE SÃO CÉLULAS-TRONCO?

Células-tronco são células capazes de se auto-renovarem e de se diferenciarem em pelo menos um tipo de tecido.

Plasticidade

Totipotente: capaz de dar origem a qualquer tipo celular embrionário ou extra-embrionário

Pluripotente: capaz de dar origem a células dos três folhetos embrionários

Multipotente:capaz de dar origem a um subconjunto de linhagens celulares

Oligopotente: capaz de dar origem a um número mais restrito de linhagens celulares que as multipotentes

Unipotente: capaz de dar origem a um único tipo celular

Mecanismos de Plasticidade

Amy J. Wagers and Irving L. Weissman, Cell, vol 116, 2004

Stem cells: Cell fusion causes confusionA E Wurmser& F H Gage Nature 416, 485 - 487 (2002).

Expansão

Diferenciação

Células-tronco neurais

Células-tronco embrionárias

Células-tronco da pele e de medula

Células-tronco neurais adultas

Neurônio

Oligodendrócito

Astrócito

Modificaçãogenética

Sources of human neural stem cellsfor research and cell therapySvendsen and Smith, TINS 99

Isolamento de células-tronconeurais

?

?

?FUSÃO?

De onde vem as células-tronco?

1909 – O biologista russo Alexander Maximow fala pela primeira vez na existência de uma população de células no sangue periférico com pluripotencialidade.

1940– Experimentos mostraram que animais poderiam sobreviver após irradiação letal graças à presença de células-tronco.

1950 – Vários grupos iniciam tentativas clínicas utilizando o transplante de células-tronco hematopoiéticas extraídas da medula óssea em pacientes com leucemia.

1970 – São feitos os primeiros transplantes levando em conta a tipagem do HLA, porém ainda utilizando a medula óssea como fonte de células-tronco.

1980 – Vários grupos demonstram a presença de células-tronco hematopoiéticas no sangue periférico de doadores sadios, ainda que em menores quantidades do que na medula óssea.

1990 – É demonstrada a presença da glicoproteína CD34, um marcador de células hematopoiéticas imaturas.

HISTÓRICO I

U marks 30th anniversary of world's first successful bonemarrow transplant

John Kersey and David Stahlexchange smiles over animage from the past.

www1.umn.edu/umnnews/Feature_Stories/30_years_of_hope.html

30 Years of Hope !

1952: Robert Briggs e Thomas King, da Filadélfia, realizam a primeira clonagem de sapos a partir de células embrionárias.

1984: Steen Willadsen da Universidade de Cambridge clona uma ovelha a partir de células embrionárias jovens.

1986: pesquisadores da Universidade de Wisconsin clonam uma vaca a partir de células embrionárias jovens.

1995: Ian Wilmut e Keith Campbell, da Escócia, clonam duas ovelhas idênticas a partir de células embrionárias de nove dias.

1996: Ian Wilmut e Keith Campbell, da Escócia, clonam Dolly, a partir de células congeladas de uma ovelha adulta.

1997: nasce Dolly.

HISTÓRICO II

www.time.com/.../0,16641,7601970310,00.html

www.greenpeace.org/international/photosvideos...

On Feb. 23, 1997, a group of scientists in Scotlandmade an announcement that would forever changethe way scientists view mammalian development—they had successfully cloned Dolly, a Finn Dorsetsheep, from an adult cell.

On Feb. 14, 2003, Dolly was euthanatized afterveterinarians confirmed she had a progressive lungdisease.

PROBLEMAS ÉTICOS!

2003: O médico italiano Severino Antinorianuncia o nascimento de clones humanos, mas não apresenta provas científicas.

HISTÓRICO II

news.bbc.co.uk/2/low/science/nature/1477698.stm

Antinori (esquerda) e seu colaborador americano Dr Panos Zavos

- no Brasil, a Câmara aprova o projeto da Lei de Biossegurança (PL 2401/03) que permite pesquisas com células-tronco humanas.

- cientistas sul coreanos desenvolvem as primeiras linhagens de células-tronco a partir de embriões humanos clonados.

2005

“... é o pesquisador sul-coreano Woo-Suk Hwang, um dos mais incensados cientistas da atualidade na área biomédica, por ter obtido com sua equipe células-tronco a partir de embriões humanos clonados para tratar doenças incuráveis, como diabetes, distrofias musculares, Alzheimer ou mal de Parkinson. “... Hwang destacou a submissão de sua equipe à lei de bioética em vigor na Coréia do Sul e foi categórico ao rejeitar a clonagem humana com finalidade reprodutiva.”

Revista Ciência Hoje, 2005

“A revista americana "Science", um dos maiores periódicos científicos do mundo, está enfrentando problemas para preparar o cancelamento do artigo de maio passado do sul-coreano Woo-Suk Hwang. O trabalho supostamente revolucionário com clonagem humana para fins terapêuticos foi totalmente fraudado.”Folha de S. Paulo

FRAUDE NA CIÊNCIA!

Ethics scandal could bolsterstem-cell foes

seattletimes.nwsource.com/html/nationworld/20...

U.S. biologist Gerald Schattenabruptly quit collaborating withHwang Woo-suk last week.

Hwang cloned Snuppy

REPARO CEREBRAL

O Sistema nervoso central adulto não se regenera

“Once development was ended, the fonts of growth and regeneration of the axons and dendrites dried up irrevocably. In the adult centers, the nerve paths are something fixed, and immutable: everything may die, nothing may be regenerated.”

Santiago Ramon y Cajal, 1928

Quebra de Paradigma!

História da neurogênese em adultos

1960’s J Altman: Células em divisão que podem originar novos neurônios

1970’s M. Kaplan: EM confirma novas células neuron-like

1980’s F. Nottebohm & S. Goldman: Neurogênese em pássaros

1990’s P. Barlett, B. Reynolds, S. Weiss, F. Gage: Isolamento de células-tronco neurais multipotentes do cérebro de roedores adultos

1998 P. Eriksson & F. Gage: Neurogênese em humanos adultos

2002 van Praag & F. Gage: Novos neurônios do hipocampo são

funcionais no cérebro adulto

late 1990’s E. Gould, B McEwen, E. Fuchs, P. Rakic: Neurogênese em

roedores adultos e primatas

Limites do transplante “cerebral”

• Requer tecido fetal e, portanto, envolvequestões éticas e não é prático

• É necessário encontrar uma fontealternativa de células neurais…

• CÉLULAS-TRONCO!

O QUE SÃO NEUROESFERAS?

FGF/EGF

Célula formadora de esfera/célula-tronco

Indução: IGF, BMPs, RA, etc.

Stem Cell

GRP

O2A

NRP

Reynolds, Tetzlaff and WeissJ. Neuroscience 12: 4565 (1992)

Potencialidade CelularPotencialidade Celular

Diferenciação por 7d

GFAP+ MAP2+ Gal-C +

2 wks 6 wks 20 wks

hNPCs (human neural progenitor cells)sobrevivem após transplante no cérebro

Não houve formação de tumor em maisde 1000 transplantes!

NEUROESFERAS PARAMODELAGEM DE DOENÇAS

CONT DOWNS0.0

0.5

1.0

1.5

Neu

ron

/ Glia

Rat

io

CONT DOWNS0

25

50

75

100

Neu

rite

Leng

th ( μ

m)

CONT DOWNS0

100

200

Cel

l Bod

y Vo

lum

e( μ

m)

Genes, Brain and Behavior, vol.2, 179-186, 2003A. Bhattacharyya and C.N. Svendsen

Estratégias

Neuroproteção substituição celular

CTEProgenitor não comprometido

Progenitor específico

Precursor neuronaldopaminérgico

Neuroblastodopaminérgico

Expansão

Seleção Nurr-1 Citocinas & meio cond.

Expansão bFGF, bx O2,ác. ascórbico

bx O2

bFGF + Shh +FGF8 + ác. ascórbico

Indução/diferenciação

Imortalização Expansão EGF

Glia co-culturaCTM

NEUROBLASTOS DOPAMINÉRGICOS TRANSPLANTE

Substituição Celular

PAPEL DOS FATORESDE CRESCIMENTO

Importância dos fatores de crescimentona neuro-regeneração

Desafios

Quem governa?

ProliferaçãoMigraçãoDiferenciaçãoSobrevivência

Fator deCrescimento

Função Doença Empresa

BDNF sobrevivência depressão Amgen

CTNF neuroproteção Huntington RegeneronPharmaceuticals

EGF proliferação derrame ImCloneSystems

FGFs Sobrevivência/proliferação

derrame ViaCell

*GDNF Sobrevivência/neuroproteção/

proliferação

Parkinson/ELA Amgen

Fatores de crescimento e aplicações

Importância dos fatores de crescimentona neuroregeneração

AVEFGFs e EGF regeneração pós-derrame

DepressãoProzac aumenta a neurogênese. Melhora do humor compatível com o tempo da neurogênese (30 dias)AlzheimerPouca neurogênese ou morte dos neurônios recém-nascidosFGFs podem causar melhorias

Moléculas grandes demais para transpor a barreira hemato-encefálica

CÉLULAS MODIFICADAS GENETICAMENTE!

O que está sendo feito no mundo...

-A doença de Parkinson foi descrita pela primeira vez em 1817, pelo médico inglês James Parkinson.-É uma doença neurológica, que afeta os movimentos da pessoa, causa tremores, lentidão de movimentos, rigidez muscular, desequilíbrio, e alterações na fala e na escrita.-Não há evidências de que seja hereditária. Apesar dos avanços científicos, ainda continua incurável, é progressiva (variável em cada paciente) e a sua causa ainda continua desconhecida.

www.parkinson.org.br/

PARKINSON

-Degeneração das células situadas na substância negra.Essas células produzem a dopamina, que conduz as correntes nervosas (neurotransmissores) ao corpo. A falta ou diminuição da dopamina afeta os movimentos do paciente, provocando os sintomas acima indicados.

Afeta pessoas mais idosas. A grande maioria das pessoas tem os primeiros sintomas geralmente a partir dos 50 anos de idade. Mas pode também acontecer nas idades mais jovens, embora os casos sejam mais raros.

Tratamentos:

a) Levodopa ou L-Dopa

b) Cirurgias

c) Estimulação profunda do cérebro (marcapassocerebral)

d) Fisioterapia

e) Terapia ocupacional

f) Fonoaudiologia

www.parkinson.org.br/

www.drugdevelopment-technology.com/projects/r...

www.parkinsonsapda.org/visualguide.html

“Intraputamenal infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in PD: a two-year outcome study.”

Ann Neurol. 2005 Feb;57(2):298-302Patel NK, Bunnage M, Plaha P, Svendsen CN, Heywood P, Gill SS.

“Direct brain infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in Parkinson disease.”

Nat Med. 2003 May;9(5):589-95.Gill SS, Patel NK, Hotton GR, O'Sullivan K, McCarter R, Bunnage M, BrooksDJ, Svendsen CN, Heywood P

PARKINSONPrimeiro “Clinical trial” em humanos

5 pacientes com ParkinsonGDNF liberado diretamente através de uma bomba implantada

Resultados (após 1 ano)•efeitos colaterais clínicos severos não foram detectados•melhora de 39% no sub-score UPDRS (pacientes sem a medicação L-dopa)•61% de melhora nas atividades diárias•Discinesias devido à medicação foram reduzidas em 64% e em pacientes sem medicação L-dopa não foram observadas•aumento de 28% na estocagem de dopamina (após 18 meses)

PARKINSONPrimeiro “Clinical trial” em humanos

Roger Nelson (right) has shown dramaticimprovements

Mr Gill andcolleagues weresurprised at theresults

Two pumps in MrNelson's body feedthe drug to his brain

news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/1935593.stm

células secretandoGDNF

dissociação

TRANSPLANTE

GFPPminCMV GDNFTRETet

VP16PminCMV Tet

tTA

TetVP16

+Dox-Dox

VP16

Journal of NeuroscienceResearch 69:955–965 (2002)Thor Ostenfeld et al.

“Neurospheres Modified To ProduceGlial Cell Line-DerivedNeurotrophic Factor Increase theSurvival of Transplanted DopamineNeurons”

Neuroproteção

CONCLUSÕES

•Células-tronco neurais derivadas do cérebrohumano em desenvolvimento produzemneurônios, astrócitos e oligodendrócitos.

•Sobrevivem após transplante no cérebro lesado.

•São uma grande esperança para substituição de células nas doenças neurodegenerativas, e tratamento em Parkinson– mas temos muito a aprender!

Prof. Luiz Eugênio A. M. MelloTelma T. SchwindtCristina G. MassantGabriela F. BarnabéFabiana L. T. Motta

Universidade Federal de São Paulo Universidade Federal de São Paulo –– UNIFESPUNIFESPLaboratório de Neurofisiologia Laboratório de Neurofisiologia

WaismanWaisman CenterCenter SCRP SCRP –– UWUW

Prof. Clive N. Svendsen

Universidade de São Paulo - USPProf. Niels Olsen Saraiva Câmara

Dr. Antônio Henrique Martins

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJProf. Stevens Kastrup Rehen

Financiadores: FAPESP, CNPq