universidade federal de sÃo carlos adriano moraes …

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIAS PARA A SUSTENTABILIDADE

CAMPUS DE SOROCABA

PROGRAMA DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA PLENA EM FÍSICA

ADRIANO MORAES AMARANTE

ESTUDO DE ESTRUTURAS MULTIMÉRICAS DA ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE CARBOXYLTRANSFERASE 2 USANDO DINÂMICA

MOLECULAR

Sorocaba 2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIAS PARA A SUSTENTABILIDADE

CAMPUS DE SOROCABA

PROGRAMA DE GRADUAÇÃO EM LICENCIATURA PLENA EM FÍSICA



MOLECULAR

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Licenciatura Plena em Física. Orientação: Prof. Dr. Fábio de Lima

Leite Co-Orientação: Dr. Guedmiller Souza

de Oliveira

Sorocaba 2013

iv

Ficha Catalográfica

Amarante, Adriano Moraes

Estudo de Estruturas Multiméricas da Enzima Acetil-Coa

Carboxilase Carboxyltransferase 2 Usando Dinâmica

Molecular/ Adriano Moraes Amarante. – – Sorocaba, 2013

46 f. : il. ; 28 cm

Trabalho de Conclusão do Curso de Licenciatura em Física -

UFSCar, Campus Sorocaba, 2013.

Orientador: Prof. Dr. Fábio de Lima Leite.

Co-Orientador: Dr. Guedmiller Souza de Oliveira

Banca examinadora: Prof. Dr. Fábio de Lima Leite , Prof. Dr.

Tersio Guilherme de Souza Cruz e Prof. Dr. Sérgio Dias

Campos

Bibliografia

1. Dinâmica Molecular. 2 AFM. 3 Enzima ACC. I. Título. II.

Sorocaba-Universidade Federal de São Carlos.

CDD 530



MOLECULAR

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como exigência parcial para

obtenção do grau de licenciado no curso de Física – Licenciatura Plena, da

Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba.

Sorocaba, 05 de dezembro de 2013.

Orientador:________________________________

Prof. Dr. Fábio de Lima Leite

Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba

Examinador:_____________________________

Prof. Dr. Tersio Guilherme de Souza Cruz


Examinador:_______________________________

Prof. Dr. Sérgio Dias Campos


Aos meus pais Herculano e Sonia.

“May the Force be with you”

Yoda

AGRADECIMENTOS

Agradeço aos meus pais, Herculano e Sonia, e aos meus irmãos Juliano e Natália

pelo apoio incondicional e presença na minha vida a todo o momento.

Agradeço a minha querida avó Lourdes por todo apoio na vida estudantil e

carinho que teve por mim em vida.

Agradeço aos meus mentores e amigos Fábio e Guedmiller por toda confiança e

ensinamentos de vida e profissionais.

Agradeço a todo grupo de NanoNeuroBioFísica que faço parte na UFSCar-SO por

todo apoio.

Agradeço aos meus professores da UFSCar-Sorocaba pelos conhecimentos

transmitidos, apoio e confiança depositada.

Agradeço a todos os meus amigos e companheiros que estiveram comigo nesse

período tão importante da minha vida.

Agradeço, enfim, a todos aqueles que sempre estiveram por perto e que me

ajudaram a chegar aonde cheguei.

RESUMO

Nanobiossensores são sensores biológicos com a sensibilidade e a

seletividade na nanoescala (compreendidos na escala de 1-100 nm). A resolução

em detecção de forças em microscopia de força atômica (AFM, do inglês Atomic

Force Microscopy) pode ser menor do que a magnitude da ligação química mais

fraca, o que torna possível investigar interações moleculares específicas

baseadas em pontas de AFM funcionalizadas. O objetivo deste trabalho foi

descrever e elucidar as estruturas multiméricas da enzima Acetil-CoA Carboxilase

Carboxiltransferase 2 (ACC 2) utilizando metodologias de simulação

computacional. As simulações computacionais foram usadas para investigar

propriedades termodinâmicas e estruturais destes sistemas químicos complexos

para aplicação direta no desenvolvimento de nanobiossensores e novas

metodologias de funcionalização química de pontas de AFM.

Palavras Chave: Dinâmica Molecular. AFM. Enzima ACC. Estruturas multiméricas

de proteínas.

ABSTRACT

Nanobiosensors are biological with the sensitivity and selectivity at the

nanoscale sensors (included in the range of 1-100 nm). The resolution in detection

of forces in atomic force microscopy (AFM) can be smaller than the magnitude of

the weaker chemical bond, which makes it possible to investigate specific

molecular interactions based on functionalized chemical AFM tips., The aim of this

work is to describe and elucidate the multimeric structures of the enzyme acetyl -

CoA carboxylase 2 Carboxyltransferase (ACC 2) using computer simulation

methodologies. Computer simulations was used to investigate thermodynamic and

structural properties of these complex chemical systems for application in the

development of nanobiosensors and new methodologies of chemical

functionalization of AFM tips.

Keywords: Molecular Dynamics. AFM. ACC Enzyme. Multimeric protein structures.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ângulos principais da ligação peptídica numa proteína. .......................... 28

Figura 2 – Estruturas básicas formadas pelas proteínas .......................................... 28

Figura 3 – Representação geométrica do ângulo de torção entre i, j, k e l ............... 32

Figura 4 – Gráficos de Ramachandran para as estruturas multiméricas .................. 43

Figura 5 – RMSD dos átomos da ACC2 relaxada em água em relação ................... 45

Figura 6 – Potencial eletrostático do dímero da ACC2 ............................................. 49

Figura 7 – RMSD dos átomos dos dímeros ACC2 .................................................... 50

Figura 8 – RMSD dos átomos das cavidades dos sítios ativos da ACC2 ................. 51

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ACC – Acetil-coA Carboxilase

ACC1 – Acetil-coA Carboxilase 1

ACC2 – Acetil-coA Carboxilase 2

AFM – Microscópio de Força Atômica

ATP – Adenosina Trifosfato

MMC – Modelagem Molecular Computacional

RMSD – desvio quadrático médio

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 23

2 OBJETIVOS........................................................................................................... 25

2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 25

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 25

3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS ................................................................................ 27

3.1 MODELAGEM MOLECULAR COMPUTACIONAL ......................................... 27

3.2 ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS .................................................................... 27

3.3 DINÂMICA MOLECULAR ............................................................................... 29

3.3.1 Definição ..................................................................................................... 29

3.3.1 Potenciais Relacionados ........................................................................... 30

3.3.2 Métodos de Simulação de Dinâmica Molecular ...................................... 33

3.4 A ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE ...................................................... 36

4 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 39

4.1 SISTEMAS MOLECULARES .......................................................................... 39

4.2 SIMULAÇÕES DE DINÂMICA MOLECULAR ................................................. 40

4.3 POTENCIAL ELETROSTÁTICO E ENERGIA LIVRE DE SOLVATAÇÃO ...... 41

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 43

5.1 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE ESTEREOQUÍMICA DAS SIMULAÇÕES ...... 43

5.2 DESCRIÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS INTRÍNSECAS DA ACC2 .............. 44

5.3 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DOS DÍMEROS NAS ESTRUTURAS

MULTIMÉRICAS ............................................................................................ 50

5.4 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DAS CAVIDADES DOS SÍTIOS

ATIVOS .......................................................................................................... 51

6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................... 53

xxiv

7 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS.................................................... 55

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 57

23

1 INTRODUÇÃO

Atualmente, a cristalografia de Raios-X é uma das ferramentas mais

poderosas na determinação da estrutura molecular tridimensional de proteínas, bem

como das possíveis interações enzima-inibidores, no estado sólido. Entretanto, a

estrutura cristalina fornece informações estruturais estáticas da macromolécula, sem

levar em consideração o efeito do solvente, o qual é a principal influência na

conformação e flutuação térmica do sistema (SMITH et al., 2004). Por este motivo é

estratégico investigar as diferentes características intrínsecas das proteínas

utilizando a Modelagem Molecular.

Dentre as técnicas de Modelagem Molecular existentes atualmente, a

Dinâmica Molecular é uma das mais promissoras e merece grande destaque.

Poderosa e versátil ferramenta no estudo de macromoléculas biológicas, a Dinâmica

Molecular fornece informações sobre o comportamento dinâmico microscópico dos

átomos individuais que compõem um determinado sistema, tendo como base a

Mecânica Clássica (FRENKEL; SMIT, 2001).

A Dinâmica Molecular tem se mostrado uma ferramenta promissora no

desenvolvimento de nanobiossensores1 de ponta de Microscópio de Força Atômica

(AFM, do inglês Atomic Force Microscopy). Os modelos teóricos de usados em

Dinâmica Molecular para modelagem de superfícies de ponta de AFM

funcionalizadas com enzimas Acetil-CoA Carboxilase Carboxiltransferase (ACC),

dependem da geometria e do arranjo multimérico das mesmas (AMARANTE, 2013;

FRANCA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2013). As enzimas ACC1 e ACC2 tem a

mesma função nos organismos, sendo 75% idênticas ao nível de aminoácidos (ABU

et al., 2000), e por este motivo as propriedades e características do arranjo

tridimensional de enzimas ACC2, propriedades estas diretamente relacionadas com

a flutuação conformacional em solução ,foram estudadas no neste trabalho.

1 Sensores biológicos cuja sensibilidade e a seletividade estão na nanoescala (1-100 nm). Alguns

destes sensores podem basear-se em interações específicas similares ao mecanismo anticorpo-antígeno ou enzima-substrato para realizar suas medidas (AMARANTE, 2013; DEDA et al., 2013).

25

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

O objetivo geral deste trabalho é descrever e elucidar, a nível molecular, as

estruturas multiméricas da enzima ACC 2 utilizando técnicas de simulação

computacional.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Levantamento das estruturas cristalográficas multiméricas das enzimas ACC

1 e ACC 2 disponíveis na literatura;

• Simular pelo menos 1 ns por Dinâmica Molecular as estruturas multiméricas

propostas solvatadas em água;

• Obtenção das informações estruturais das estruturas simuladas por

Dinâmica Molecular;

• Determinação do mapa eletrostático de estruturas multiméricas específicas

antes e depois das simulações por Dinâmica Molecular e identificar possíveis

locais de interação;

• Calcular e energia livre de solvatação para as estruturas multiméricas da

enzima ACC 2 solvatadas em água nas condições termodinâmicas

estabelecidas.

27

3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS

3.1 MODELAGEM MOLECULAR COMPUTACIONAL

Com o objetivo de entender e prever o comportamento de sistemas reais, a

modelagem molecular compreende um número de ferramentas e métodos

computacionais que são usados para descrever e prever estruturas moleculares,

propriedades de reações, propriedades termodinâmicas, entre outras. Sendo assim,

a Modelagem Molecular Computacional (MMC) é a modelagem que estuda as

propriedades atomísticas por intermédio do uso de química computacional e

técnicas de visualização gráfica. (SCHLICK, 2010). Esse é um ramo no qual se

estuda sistemas químicos e biológicos mais complexos, com um número elevado de

partículas, da ordem de 1023, podendo realizar cálculos específicos e criar modelos

que seriam impossíveis de serem realizados de outra maneira (MORGON;

COUTINHO, 2007; SANT´ANNA, 2009).

Com o avanço dos recursos computacionais, tratando-se de softwares e

hardwares, a MMC se desenvolveu de maneira surpreendente nas últimas décadas.

No passado, a MMC era restrita ao grupo de pesquisadores e cientistas

responsáveis pelo desenvolvimento dos softwares utilizados. Nos dias atuais,

diversos recursos e softwares de modelagem estão disponíveis gratuitamente na

rede web (ARNOLD, 2006; HUMPHREY et al., 1996; PRONK et al., 2013), sem ter a

necessidade de ter uma pessoa em um grupo de pesquisa destinada

exclusivamente para o desenvolvimento de tais softwares.

3.2 ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS

A conformação das proteínas é definida pelos valores de três ângulos

principais, ômega (ω), fi (Φ) e psi (Ψ) (FIG. 1). Já que o valor de ω é fixo, são os

valores de Φ e Ψ que determinam a variação conformacional da cadeia principal, já

que estes dão flexibilidade à cadeia peptídica (NELSON; COX, 2011). A

representação gráfica do ângulo Ψ contra o ângulo Φ define o gráfico de

Ramachandran, o qual evidencia os resíduos em regiões energeticamente

28

favoráveis e desfavoráveis, muito importante na avaliação de modelos

tridimensionais de proteínas (SILVA, 1999).

FIGURA 1 – Representação dos três ângulos principais da ligação peptídica numa

proteína.

Fonte: (OYANEDEL, 2003).

Existem vários níveis de estrutura proteica, e para descrever e entender

essas estruturas são necessários temas que são abordados em diversos níveis de

complexidade (BROWN et al., 2005; VOET et al., 2008). Comumente são definidos

quatro níveis de estrutura básica para as proteínas (FIG. 2) (ATKINS; JONES, 2006).

FIGURA 2 – Estruturas básicas formadas pelas proteínas.

Fonte: Modelagem realizada a partir do Arquivo PDB (do inglês Protein Data Bank) referência 1V4U (“RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB,” 2013).

29

A proteína utilizada na FIG. 2 se trata da subunidade beta da hemoglobina,

proteína transportadora de oxigênio no sistema circulatório. (YOKOYAMA et al.,

2004)

As uniões das cadeias polipeptídicas nas proteínas ocorrem em sua maioria

por ligações de dissulfeto e ligações de hidrogênio. Comumente a subunidade que

forma a estrutura quaternária das proteínas é denominada monômero. Esta estrutura

tridimensional junto com a sequência de aminoácidos confere a proteína sua função

específica (NELSON; COX, 2011; VOET et al., 2008). Algumas destas funções

específicas muitas vezes consistem em catalisar reações químicas, desse modo a

proteína passa a pertencer a uma classe denominada enzima (NELSON; COX,

2011; VOET et al., 2008).

3.3 DINÂMICA MOLECULAR

3.3.1 Definição

A Dinâmica Molecular é uma poderosa e versátil técnica para estudos de

macromoléculas biológicas, tendo como base a Mecânica Clássica. Os métodos

experimentais em geral são capazes de mensurar propriedades que são resultado

da soma de todos os possíveis microestados entrópicos e energéticos que um

conjunto de moléculas pode ocupar. Entretanto, mesmo com a constante evolução

de metodologias experimentais há a necessidade da utilização de modelos teóricos

para previsão de propriedades e compreensão, a nível molecular, dos experimentos

(CORNELL et al., 1995; KALÉ et al., 1997; WOODS et al., 1995). Desta forma, o

comportamento estatístico dos dados experimentais pode ser utilizado na validação

das médias obtidas pelas metodologias teóricas desenvolvidas para realizar

predições relacionadas àquele sistema.

Para sistemas moleculares compostos por centenas, milhares e até milhões

de átomos, como proteínas, não há a possibilidade de caracterizá-los com precisão

em nível de física quântica, porém, a física clássica oferece uma boa aproximação

para a modelagem desses sistemas. Isto é feito devido ao fato dos orbitais

moleculares de tais moléculas serem bem definidos, além de fenômenos de

30

transferência de cargas serem imensuráveis na escala de tempo dos movimentos

atômicos descritos pela Dinâmica Molecular (KALÉ et al., 1997).

3.3.2 Potenciais Relacionados

A primeira aproximação da Mecânica Molecular é considerar os átomos como

esferas rígidas dotadas de carga com posições definidas no espaço por um conjunto

de potenciais harmônicos. Assim, a estrutura molecular é mantida por um campo de

força descrito por potenciais lineares (Vd), angulares (V) e torcionais (Vφ) que visam

reproduzir as interações ligadas da molécula a ser simulada. As interações não

ligadas, ou intermoleculares, são descritas pelos potenciais de Lennard-Jones (VLJ),

ou van der Waals, e de Coulomb (VC), o que permite a construção de uma

expressão completa da energia potencial (Vtotal) do sistema que depende somente

das posições atômicas (Equação 1) (DAVID VAN DER SPOEL, 2006).

φ (1)

Em outras palavras, as moléculas são descritas a partir de um modelo de

esferas indeformáveis dotadas de cargas ligadas por molas devidamente calibradas,

de modo que estas possam descrever as vibrações de ligações químicas e as

barreiras energéticas torcionais e angulares que reconstroem o comportamento da

molécula a ser mimetizada. O somatório dos potenciais ligados e não ligados

compõe o que é denominado campo de força do sistema.

Cada função de energia potencial visa descrever um comportamento

estrutural característico da molécula.

Potencial Harmônico de Ligação (ou Linear): Em métodos de mecânica molecular

as ligações covalentes são descritas como um oscilador harmônico clássico. O

estiramento entre dois átomos é descrito pelo Potencial Harmônico Linear Vd, o qual

descreve a energia associada ao desvio da distância de equilíbrio d0 (Equação 2)

(KOEHLER et al., 1987).

31

(2)

sendo d o comprimento da ligação entre dois átomos i e j (Figura 10) e kd é a

constante elástica da força.

A distância d0 e a constante de força são os parâmetros do campo de força.

Tais parâmetros podem ser obtidos experimentalmente, por intermédio dos

espectros de infravermelho, ou por intermédio da mecânica quântica. A constante kd

varia de acordo com a rigidez da ligação química. Como exemplo, a constante kd de

uma ligação simples entre carbonos C–C é 317 kcal/mol Å2, enquanto que a ligação

dupla C=C é 570 kcal/mol Å2 (CORNELL et al., 1995).

Potencial Harmônico Angular: Este descreve a energia potencial relacionada aos

desvios relativos ao ângulo de referência. Analogamente ao Potencial Harmônico

Linear o Potencial Harmônico Angular pode ser definido pela Equação 3 (CORNELL

et al., 1995).

(3)

Potencial Torcional (ou Diedral): Considerando um conjunto de quatro átomos

ligados, i, j, k e l, como mostrado na FIG. 3, o ângulo diedro φ é definido como o

ângulo entre os planos formados pelos átomos ijk e jkl.

Pode-se entender o potencial torcional Vφ como a representação explicita da

barreira energética atribuída à rotação dos átomos i e l ao redor da ligação j-k, sendo

o mesmo definido pela Equação 4 (CORNELL et al., 1995).

[ ] (4)

sendo kφ a constante que define a altura da barreira energética para uma possível

torção, n é o número de mínimos na curva de energia potencial pelo ângulo de

torção, φ o ângulo diedral da ligação central e em relação a quatro átomos e δ a

diferença de fase do ângulo diedral φ, que pode ser 0º e 180º, dependendo de este

valor ser um ponto de máximo ou de mínimo.

32

FIGURA 3 – Representação geométrica do ângulo de torção entre i, j, k e l.

Fonte: (CORNELL et al., 1995).

A determinação de potenciais torcionais experimentalmente está longe de ser

trivial. Na definição de tais parâmetros para moléculas ainda não descritas (na

maioria das vezes não compostas por aminoácidos), é comum se utilizar de

potenciais diedrais semelhantes aos de uma molécula conhecida e previamente

descrita. Outra estratégia para se determinar os parâmetros kφ, n, e δ é otimizar os

parâmetros para moléculas simples e extrapolar para moléculas complexas com

grupamentos de átomos semelhantes. A curva de energia potencial pode ser obtida

via mecânica quântica, o que é uma grande vantagem pela independência de

valores experimentais (DAVID VAN DER SPOEL, 2006; KOEHLER et al., 1987).

Potencial de Lennard-Jones (ou van der Waals): O potencial de Lennard-Jones é

utilizado para descrever interações intra e intermoleculares do tipo van der Waals.

Este potencial é geralmente utilizado para descrever interações de átomos de uma

mesma molécula se estes estiverem separados por três ou mais ligações

covalentes. A expressão de energia potencial que descreve este tipo de interação

entre dois átomos (i e j ) é dada pela Equação 5 (VERLET, 1966).

[

] (5)

33

sendo rij a distância entre os átomos i e j (FIG. 4), ε a profundidade do poço de

energia potencial e σ o diâmetro de Lennard-Jones, o qual depende das espécies

químicas ligadas. Existem outras formas de abordagem para a descrição deste tipo

específico de interação, no entanto o formato de equação acima apresentado é o

mais simples e geral (CORNELL et al., 1995; VERLET, 1966).

Potencial de Coulomb: As interações de carga que são puramente eletrostáticas

entre dois átomos i e j (FIG. 4) são descritas pela equação de energia potencial

Coulombiana (Equação 6) (CORNELL et al., 1995).

(6)

sendo rij a distância entre os átomos i e j, qi e qj são as cargas dos átomos, ε0 a

permissividade no vácuo e ε a constante dielétrica do meio.

Existe a necessidade de determinar vários parâmetros para a aplicação das

equações que descrevem as energias potenciais para as interações presentes em

sistemas moleculares. Como citado anteriormente, os parâmetros podem ser obtidos

via cálculos ou técnicas experimentais como cristalografia de raios-X, espectroscopia

de infravermelho, ressonância magnética nuclear e muitas outras (CORNELL et al.,

1995).

3.3.3 Métodos de Simulação de Dinâmica Molecular

As metodologias de Dinâmica Molecular são baseadas nas leis da mecânica

clássica (BROOKS et al., 1990). As forças que atuam em cada átomo são baseadas

no conjunto de parâmetros do campo de força, nas coordenadas e nas velocidades

atômicas que são mapeadas durante todo o processo. Em uma simulação por

Dinâmica Molecular, a força F atuante em determinado átomo é expressa em função

do tempo, e é igual ao negativo do gradiente da energia potencial em relação à

posição ri de cada átomo, tal como expressa na Lei de Newton (Equação 7)

(BROOKS et al., 1990).

34

(7)

Em linhas gerais, nos métodos de Dinâmica Molecular, as equações clássicas

de movimento são iterativas e numericamente integradas para cada átomo do

sistema a um determinado tempo, e a cada passo o processo de integração se

repete considerando as posições atômicas e obedecendo a um determinado

incremento no tempo (∆t) o qual é determinado pelo usuário e em geral é na escala

de femtossegundos (10-15 s). Estas escalas de tempo tão pequenas são necessárias

para que o erro relacionado à integração das equações de movimento seja

suficientemente pequeno. Em outras palavras, se o valor de ∆t for grande alguns

eventos moleculares importantes, que ocorrem em escalas de tempo pequenas, não

seriam simulados, criando artifícios computacionais que podem resultar na não

reprodução da realidade pelo modelo proposto. Tais artifícios recorrem a erros

significativos no cálculo das forças, os quais refletem nos valores dos cálculos de

energia livre e na busca dos estados conformacionais de menor energia em um

determinado tratamento termodinâmico.

Outro princípio básico por trás da Dinâmica Molecular é o que a relação entre

os dados teóricos obtidos e experimentais é feito a partir do uso da Hipótese

Ergódica de Boltzmann. Esta hipótese fundamental demonstra que o valor médio de

uma propriedade medida em um pequeno número de partículas por um longo tempo

é equivalente às médias obtidas para um sistema de muitas partículas por um curto

intervalo de tempo. Baseado nisto, as simulações de Dinâmica Molecular que

possuem poucas partículas (comparado a qualquer sistema real) tem que ser

suficientemente longas para que o sistema visite um número suficiente de

conformações representativas para satisfazer este princípio. Esta justificativa teórica

valida as médias obtidas de propriedades termodinâmicas de sistemas simulados

por tempo suficiente num sentido ergódico.

Atualmente, existem vários algoritmos disponíveis que realização a integração

numérica das equações de movimento, sendo os mais comuns os do tipo Verlet. Os

algoritmos de Verlet, Velocity-Verlet e leap-frog são os mais utilizados, pois tem um

custo computacional menor em termos de consumo de memória RAM e tempo de

processamento (ALDER, 1977; VERLET, 1966). Em geral a escolha do algoritmo a

35

ser usado se baseia em duas importantes variáveis: custo computacional e precisão

na integração numérica. O algoritmo Velocity-Verlet utiliza a aceleração, velocidade

e posição dos átomos em determinado tempo o que fornece mais precisão que o

algoritmo de Verlet. Outros algoritmos conseguem ser bem mais precisos quanto à

conservação da energia livre total do sistema, entretanto são bem mais custosos

computacionalmente, como o algoritmo de Beeman (BEEMAN, 1976). A condição

para que se escolha um algoritmo mais leve a um mais preciso é a de que com

menos custo computacional as simulações podem atingir escalas de tempo maior,

logo representam mais microestados entrópicos e energéticos do sistema permitindo

obter ergodicamente médias de propriedade que podem seguramente ser

confrontadas com valores experimentais.

Uma das principais problemáticas envolvida nas simulações de Dinâmica

Molecular é a utilização do solvente e o modelo a ser utilizado. O uso de solvente

aumenta o custo computacional de qualquer simulação, no entanto permite a

descrição precisa de várias propriedades que são diretamente dependes da

interação com solventes. Os modelos de água mais utilizados são o SPC, TIP3P,

TIP4P e TIP5P (BERENDSEN et al., 1987; JORGENSEN et al., 1983; MAHONEY;

JORGENSEN, 2000). O aumento do número de partículas em uma simulação pode

levar a vários problemas na estimativa das forças, devido a possíveis efeitos de

superfície. Uma aproximação que contorna este problema é o uso de condições

periódicas de contorno (MAHONEY; JORGENSEN, 2000). Um espaço de simulação

se torna uma pequena parcela no centro de um número infinito de cópias idênticas

do mesmo em todas as direções. O número de partículas na caixa de simulação é

mantido constante considerando-se constante o número de moléculas que entram e

saem pela caixa. Desta forma os efeitos de superfície são cancelados e a simulação

se dá mimetizando o sistema em solução.

Em suma, simulações computacionais de sistemas com milhares de átomos

podem ser realizadas com o uso de dinâmica molecular considerando fenômenos

que ocorre em alguns nanosegundos sem a quebra ou formação de ligações

químicas. Qualquer propriedade termodinâmica do sistema em questão pode ser

obtida se a simulação considerar um número de estados energéticos

suficientemente grandes para satisfazer a Hipótese Ergódiga. A partir desta

36

poderosa técnica podem-se analisar processos de adsorção, interação e o

comportamento molecular conformacional de sistemas biológicos em geral.

3.4 A ENZIMA ACETIL-COA CARBOXILASE

Os lipídeos são formados por moléculas relativamente pequenas que podem

se associar para constituir grandes moléculas que servem, principalmente, como

componentes estruturais das membranas, como forma de armazenamento de

energia e outras funções essenciais (formação de hormônios esteroides, vitaminas,

proteção, material isolante). Os principais lipídeos encontrados em células vegetais

incluem os glicolipídeos e outros derivados de ácidos graxos. Cerca de 5 a 10% da

massa de matéria seca das células vegetais é formado por lipídeos

(CHRISTOFFOLETI et al., 2008).

Neste contexto, pode-se definir a ACC como uma enzima chave no

metabolismo dos ácidos graxos, que regula a biossíntese e oxidação dos lipídeos,

catalisando a carboxilação, dependente de Adenosina Trifosfato (ATP), da acetil-

CoA para produzir malonil-CoA (TAO et al., 2012). Essa reação catalisada pela ACC

é realizada em duas etapas, nas quais primeiramente ocorre a carboxilação

dependente de ATP e de biotina, e a consequente transferência do grupo carboxila a

partir de biotina da acetil-CoA catalisada pela carboxiltransferase (DAVIS et al.,

2000) (FIG. 5). A biotina é o cofator da enzima piruvato carboxilase e é uma

molécula especializada no transporte de dióxido de carbono. Nas células vegetais,

grandes quantidades de malonil-CoA são necessárias nos plastídeos para sustentar

a síntese dos ácidos graxos, além do alongamento de ácidos graxos para a síntese

de flavonóides e fitoalexinas no citosol (JOYARD et al., 2010).

Nos animais, a ACC também está relacionada com a síntese de ácidos

graxos. A interferência da atividade da enzima ACC em animais, seja pela utilização

de inibidores ou silenciamento da expressão genética, demonstrou ser deletéria para

vários tipos de células cancerosas (BECKERS et al., 2007). Assim, os fluxos

reduzidos de conversão da acetil-CoA para malonil-CoA pode ser um dos principais

fatores determinantes para a reprogramação metabólica de uma célula cancerígena.

Estudos recentes também sugerem que a inibição da enzima ACC em animais pode

37

estar ligada às síndromes metabólicas como diabetes tipo 2 e obesidade, bem como

uma maior probabilidade dos pacientes com esses transtornos desenvolverem

episódios de câncer (NATTER; KOHLWEIN, 2013).

A enzima ACC1 é encontrada em grande parte no citossol, sendo a principal

isoforma no tecido adiposo. A enzima ACC2 é predominante no músculo cardíaco e

tecido muscular esquelético (ABU et al., 2000). Bianchi e colaboradores também

observaram a ACC2 no citossol do fígado (BIANCHI et al., 1990). Ambas enzimas

ACC1 e ACC2 são proteínas de alto peso molecular ( ACC1 , 265 kDa ; ACC2 , 275

kDa) e são 60 % idênticas ao nível dos nucleótidos e

75% idênticas ao nível de aminoácidos (ABU et al., 2000).

A Tabela 1 mostra as estruturas cristalográficas multiméricas das enzimas

ACC1 e ACC2 disponíveis na literatura no banco internacional de dados de

estruturas de proteínas: Protein Data Bank (“RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB,”

2013).

38

Tabela 1 – Estruturas cristalográficas multiméricas das enzimas ACCs disponíveis

na literatura no bando de dados de proteínas Protein Data Bank (“RCSB Protein

Data Bank - RCSB PDB,” 2013).

Sistema Representação Enzima ACC1 Enzima ACC2

Monômero

0 0

Dímero

2 1

Trimero

14 0

Tetrâmero 0 1

39

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 SISTEMAS MOLECULARES

A estrutura inicial da enzima ACC 2 foi obtida por intermédio do modelo

experimental de cristalografia de raios-X, disponível na literatura no banco

internacional de dados de estruturas de proteínas: Protein Data Bank (“RCSB

Protein Data Bank - RCSB PDB,” 2013), arquivo PDB: 3FF6. Os resíduos de

aminoácidos não determinados por cristalografia de raios-X foram construídos por

intermédio de modelagem molecular por homologia utilizando o programa Swiss-

PdbViewer (GUEX; PEITSCH, 1997; GUEX et al., 2009). Esta estrutura foi utilizada

como ponto de partida para os cálculos de dinâmica molecular. Os parâmetros foram

implementados no campo de força CHARMM27 (BROOKS et al., 1983;

MACKERELL et al., 2000).

Para a visualização e produção de imagens referentes a todos os sistemas

foram utilizados os programas VMD 1.9.1 (HUMPHREY et al., 1996) e Jmol 10.0.31

(HERRAEZ, 2006).

As moléculas de água presentes na estrutura original, provenientes

cristalografia, foram removidas e átomos de hidrogênio foram adicionados para criar

um modelo atomístico fidedigno ao real, contendo todos os átomos explícitos para

realizar cálculos de Dinâmica Molecular. Os sistemas simulados por Dinâmica

Molecular estão resumidos na TABELA 2.

40

Tabela 2 – Descrição dos sistemas simulados

Sistema no de átomos

de soluto

no de

íons

no de moléculas de

solvente

no de resíduos de

aminoácidos

Monômero 12000 12 113573 755

Dímero 23951 25 134937 1510

Trimero 35812 38 355420 2265

Tetrâmero 47535 50 351703 3020

4.2 SIMULAÇÕES DE DINÂMICA MOLECULAR

Os sistemas modelados (dímero, monômero, trimero e tetrâmero) foram

solvatados preenchendo-se uma caixa com modelos de água do tipo TIP3P

(JORGENSEN et al., 1983; MAHONEY; JORGENSEN, 2000). Íons sódio foram

utilizados para equilibrar os sistemas, os quais foram minimizados utilizando-se

aproximadamente 10.000 passos do algoritmo steepest decent (PRONK et al.,

2013). Após a minimização, o solvente foi equilibrado realizando-se uma simulação

de dinâmica molecular por 100 ps à 150 e 298 K. Depois da equilibração do

solvente, uma simulação por dinâmica molecular foi realizado por 1 ns em um

ensemble isotérmico-isobárico (NPT) utilizando o algoritmo leapfrog (HOCKNEY,

1970) com um tempo de integração de 2 femtonsegundos. As configurações foram

salvas a cada 1 ps para a realização das análises. A temperatura foi mantida a 298

K acoplando o sistema ao termostato de Berendsen (BERENDSEN et al., 1984),

com um tempo de relaxação de 0,1 ps. A pressão foi mantida à 1 bar acoplando ao

barostato de Berendsen (BERENDSEN et al., 1984) via escalonamento isotrópico

com tempo de relaxação de 10 ps e compressibilidade de 4,5x10-6 (kJ.mol-1.nm-3)-1.

Os movimentos vibracionais do sistema foi fixado utilizando o algoritmo LINCS

(HESS et al., 1997). Um raio de corte de 1,4 nm foi utilizado para a caracterização

das interações de van der Waals e interações eletrostáticas de curto alcance. As

41

contribuições eletrostáticas de longo alcance foram tratadas via campo de reação

generalizada (TIRONI et al., 1995), com uma constante dielétrica = 66. Todas as

simulações foram realizadas utilizando o campo de força CHARMM27 (BROOKS et

al., 1983; MACKERELL et al., 2000) e o programa GROMACS 4.5.4 (DAVID VAN

DER SPOEL, 2006; PRONK et al., 2013).

4.3 POTENCIAL ELETROSTÁTICO E ENERGIAS LIVRES DE SOLVATAÇÃO

A distribuição de cargas para a superfície da enzima ACC 2 foi obtida por

intermédio do cálculo do potencial eletrostático resolvendo numericamente a

equação não-linear de Poisson-Boltzmann, aplicando o método de diferença-finita

(DAVIS; MCCAMMON, 1990; NIELSEN et al., 1999) no programa APBS (Adaptive

Poisson-Boltzmann Solver) (HOLST et al., 2000), em conjunto com os parâmetros do

campo de força CHARMM27 (BROOKS et al., 1983; MACKERELL et al., 2000). A

estrutura da enzima ACC 2 em solução aquosa foi obtida usando constante

dielétrica de 78,54 para o solvente e 2,00 para o soluto. O solvente tem as

especificações: tensão superficial 0,105 N/m, raio de corte de 1,4 nm e força iônica

de 100 mM. A contribuição apolar para a energia livre de solvatação foi calculada

utilizando um coeficiente de tensão superficial de 0,105 kJ/mol para o soluto. Os

potenciais tridimensionais foram obtidos utilizando 129 pontos de rede nas direções

de x, y e z.

43

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 AVALIAÇÃO DA QUALIDADE ESTEREOQUÍMICA DAS SIMULAÇÕES

As avaliações estereoquímicas dos sistemas simulados foram realizadas por

intermédio dos gráficos de Ramachandran obtidos pelo programa VMD 1.9.1

(HUMPHREY et al., 1996). A FIG. 4 mostra os gráficos de Ramachandran das

estruturas multiméricas da ACC2 obtidos durante o intervalo 0 e 1 ns de simulação.

Para serem considerados de boa qualidade, os modelos de proteínas

simulados devem possuir mais de 90% dos seus resíduos nas regiões mais

favoráveis (regiões em azul da FIG. 4) e o menor número possível de resíduos nas

regiões menos favoráveis (regiões em verde e branco da FIG. 4) (LASKOWSKI et

al., 1993). Para evidenciar que não houve a desnaturação das enzimas durante as

simulações, os gráficos de Ramachandran não sofreram alterações significativas

dentro do intervalo 0 e 1 ns, o que permite as análises posteriores.

FIGURA 4 – Gráficos de Ramachandran para as estruturas multiméricas

(monômero, dímero, trimero e tetrâmero) da ACC2 relaxadas em água no intervalo t

= 0 e t = 1 ns.

Fonte: Cálculos realizados utilizando o programa VMD 1.9.1 (HUMPHREY et al., 1996).

44

5.2 DESCRIÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS INTRÍNSECAS DA ACC2

De acordo com a literatura (YU et al., 2010), a enzima ACC1 pode existir em

solução em estruturas multiméricas, porém a atividade catalítica se dá na interface

dos dímeros (ZHANG et al., 2004). Apesar da estrutura dimérica ser a mais plausível

de existir na natureza, a proporção de monômeros/dímeros/trimeros/tetrâmeros

encontradas para as enzimas ACC1 e ACC2 (Tabela 1) sugere que a estrutura

existente em maior proporção seja o trimero, este também possuindo atividade

catalítica (YU et al., 2010). A população das estruturas multiméricas de enzimas da

mesma família da ACC pode ser controlada por mutações específicas (SHEN et al.,

2006).

A dinâmica estrutural da ACC2 foi avaliada calculando o desvio quadrático

médio (RMSD, do inglês Root-mean-square deviation) com relação à sua estrutura

inicial durante a simulação por dinâmica molecular. A FIG. 5 mostra a diferença na

flutuação estrutural entre o monômero, dímero, trimero e o tetrâmero em solução

aquosa. O monômero e o trimero ainda não alcançaram uma condição inicial de

equilíbrio estrutural após 1 ns de simulação, e perdem mais de sua estrutura inicial

quando comparados ao dímero e tetrâmero. Por outro lado, o dímero e o tetrâmero

exibiram flutuação conformacional em torno de 0,25 nm, mostrando uma relativa

rigidez estrutural em solução aquosa, cujo aparente equilíbrio foi alcançado somente

após 400 ps. Com estes resultados, pode-se supor que conjuntos de estruturas

monoméricas e diméricas exibem flutuação conformacional mais elevadas devido à

presença do monômero, e estruturas diméricas tendem a ser mais estáveis.

45

Figura 5 – Evolução temporal do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos da

ACC2 relaxada em água em relação à estrutura inicial.

Fonte: Cálculos realizados utilizando o programa GROMACS 4.5.4 (DAVID VAN DER

SPOEL, 2006; PRONK et al., 2013).

A flutuação estrutural e a diferença entre as estruturas multiméricas da

ACCase podem ser atribuídos a dois fatores principais. A primeira é a interação

eletrostática entre grupos carregados de aminoácidos como a arginina (ARG), lisina

(LYS), ácido aspártico (ASP) e ácido glutâmico (GLU). A segunda é a solvatação de

aminoácidos polares, contribuindo para a mobilidade da proteína.

O efeito da solvatação é melhor ilustrado pela análise do número de ligações

de hidrogênio entre moléculas de água as estruturas da ACC2 na TABELA 3. Os

aminoácidos carregados induzem a formação de novas ligações de hidrogênio entre

as moléculas de água e as estruturas da ACC2, resultando na flutuação estrutural

enzimática. A característica intrínseca do monômero de ACC2 em possuir uma área

superficial mais acessível ao solvente por resíduo de aminoácido do que as demais

estruturas implica em um grande número de aminoácidos carregados expostos as

moléculas de água, que estão sobre elevado movimento térmico. Portanto, o efeito

do solvente é o principal fator na explicação da flutuação estrutural da enzima ACC2.

46

Para o dímero e o tetrâmero, a área acessível ao solvente por resíduo de

aminoácido calculadas antes e após a simulação se mantiveram maiores em relação

ao monômero e trimero, tendo as moléculas de água se difundido em maior

proporção nestes. Tendo menor área acessível ao solvente por resíduo de

aminoácido, o dímero e tetrâmero adquirem maior estabilidade em relação às outras

estruturas.

Tabela 3 – Número de moléculas de água realizando ligações de hidrogênio com a

enzima por resíduo de aminoácido e área acessível ao solvente (nm²) por resíduo de

aminoácidos de cada estrutura.

Sistema Tempo Área acessível

ao Solvente por resíduo de

aminoácido (nm²)

Nº de

ligações de

H

Monômero 0 ns 0,197 1479

1 ns 0,196 1520

Dímero 0 ns 0,165 2724

1 ns 0,166 2876

Trimero 0 ns 0,172 3985

1 ns 0,172 4368

Tetrâmero 0 ns 0,160 5340

1 ns 0,161 5732

47

Para descrever detalhadamente o efeito da solvatação na flutuação e na

estabilização conformacional da ACC2 por moléculas de água, a contribuição

eletrostática e polar para a energia livre de soltavatação das estruturas multiméricas

foram calculados via eletrostática de Poisson-Boltzmann, usando o programa APBS

(Holst et al., 2001). As estruturas iniciais, provenientes da cristalográfica, e as

estruturas finais do último 1 ns de simulação, foram selecionadas e calculadas as

energias de solvatação TABELA 4. Apesar de não existir valores experimentais na

literatura para comparar com os valores calculados de energia livre de solvatação,

os resultados podem ser potencialmente utilizados para prever estabilidade de

solvatação relativa das diferentes estruturas multiméricas da ACC2. De acordo com

a TABELA 4, a energia livre de solvatação é principalmente governada pela

contribuição eletrostática, a qual é consistente com o número relativo de

aminoácidos carregados na estrutura enzimática. O aumento (em módulo) da

contribuição eletrostática, de 0 a 1 ns, de 1500, 2800, 6100 e 6100 kJ/mol para o

monômero, dímero, trimero e tetrâmero respectivamente. Em virtude, o aumento do

número de moléculas de água que fazem ligações de hidrogênio com grupos

carregados durante a simulação por Dinâmica Molecular. Por outro lado, a

contribuição apolar apresentou somente uma pequena variação durante a

simulação, de aproximadamente 50, 50, 0 e 100 kJ/mol para o monômero, dímero,

trimero e tetrâmero respectivamente.

48

Tabela 4 – Energia livre de solvatação (kJ/mol) para as estruturas multiméricas da

enzima ACC2 no intervalo t = 0 e t = 1 ns de simulação de dinâmica molecular.

Normalização realizada pela razão entre a G total e o número de resíduos de

aminoácidos de cada estrutura.

Sistema Tempo Gsolv

(ELETROSTATICO)

Gsolv

(APOLAR)

Gsolv

(TOTAL)

Gsolv

(NORMALIZADA)

Monomero 0 ns -2,87x104 4,03x103 -24,67x103 -32,67

1 ns -2,72x104 4,08x103 -23,12x103 -30,62

Dimero 0 ns -4,99x104 6,37x103 -43,53x103 -28,83

1 ns -4.71x104 6.42x103 -40.68x103 -26,94

Trimero 0 ns -6,91x104 1,02x104 -58,90x103 -26,00

1 ns -6,30x104 1,02x104 -52,80x103 -23,31

Tetramero 0 ns -8,65x104 1,24x104 -74,10x103 -24,54

1 ns -8,04x104 1,25x104 -67,90x103 -22,48

As energias livres de solvatação totais mostradas na TABELA 4 confirmaram

que a estrutura enzimática relaxada é energeticamente estabilizada em solução

aquosa, reforçando a hipótese de que a solvatação é o efeito mais importante para a

flutuação estrutural. Isto sugere que as cargas expostas na superfície da ACC 2

foram amplamente solvatadas por moléculas de água, as quais difundiram dentro

das estruturas proteicas, reduzindo a repulsão eletrostática de grupos com cargas

similares, e induzindo mudanças conformacionais na estrutura da proteína.

A dinâmica estrutural da enzima ACC2 evidenciou as flutuações

conformacionais mostradas na FIG. 5, em virtude da solvatação das cadeias polares

49

internas e possíveis repulsões eletrostáticas entre cadeias laterais. Estes efeitos são

responsáveis pela flutuação de cargas ao longo da superfície das estruturas da

ACC2. Espera-se, de acordo com o ponto isoelétrico 6,23 (CHENG et al., 2011), que

a enzima seja levemente carregada negativamente e, ao analisar os potenciais

eletrostáticos das estruturas antes e depois das simulações, foram encontradas

distribuições uniformes de cargas ao longo das superfícies, com exceção das

cavidades dos sítios ativos (FIG. 6), corroborando a hipótese das estruturas

multiméricas serem sintetizadas desta forma.

Figura 6 – Potencial eletrostático do dímero da ACC2.

Nota: kB é a constante de Boltzmann, T a temperatura e e a carga elementar

Fonte: Modelagem realizada a partir do Arquivo PDB 1FF6 (“RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB,” 2013).

50

5.3 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DOS DÍMEROS NAS ESTRUTURAS

MULTIMÉRICAS

A dinâmica estrutural dos dímeros da ACC2 presentes nas estruturas

multiméricas foram avaliadas da mesma forma do item 5.2 calculando o desvio

quadrático médio (RMSD) com relação à sua estrutura inicial. A FIG. 7 mostra as

flutuações estruturais dos dímeros presentes no trimero e no tetrâmero em

comparação com a estrutura dimérica solvata unicamente. Na figura nota-se que os

dímeros tendem a permanecer estáveis em solução aquosa, mesmo que embutidos

em estruturas multiméricas com mais monômeros, validando estudos da enzima

ACC2 que tomam como base a estrutura dimérica (AMARANTE, 2013; OLIVEIRA et

al., 2013).

Figura 7 – Evolução temporal do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos dos

dímeros presentes nas estruturas multiméricas da ACC2 relaxada em água em

relação à estrutura inicial.



51

5.4 FLUTUAÇÃO CONFORMACIONAL DAS CAVIDADES DOS SÍTIOS ATIVOS

Fazendo o mesmo tipo de análise dos itens 5.3 e 5.4, foram estudadas as

flutuações das cavidades do sítio ativo presentes na interface dos dímeros das

estruturas multiméricas (FIG. 8). A relativa estabilidade observada está de acordo

com o resultado esperado, corroborando a hipótese das diferentes estruturas

multiméricas possuírem atividade catalítica (SHEN et al., 2006; YU et al., 2010).

Figura 8 – Evolução temporal do desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos das

cavidades dos sítios ativos presentes nas estruturas multiméricas da ACC2 relaxada

em água em relação à estrutura inicial.



53

6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS

Dado o objetivo geral deste trabalho o qual descrever e elucidar as estruturas

multiméricas da enzima ACC 2 utilizando metodologias de simulação computacional,

foi realizado inicialmente um levantamento completo na literatura das estruturas

cristalográficas e informações disponíveis sobre as enzimas da família ACC.

Os resultados apresentados neste trabalho demonstraram que técnicas de

modelagem molecular são extremamente úteis para a realização de previsões de

propriedades estruturais e elétricas de biomoléculas que podem ser utilizadas como

nanobiossensores. Devido ao tamanho das biomoléculas, foram utilizados métodos

de mecânica clássica. As simulações de Dinâmica Molecular foram realizadas

durante 1 ns, com o intuito de relaxar as estruturas enzimáticas em água. Foi

possível mostrar uma primeira evidência de que a enzima ACC2 é mais estável em

solução aquosa na forma de dímeros, permitindo assim o aperfeiçoamento dos

modelos de nanobiossensores de ponta de AFM existentes. O potencial

eletrostático da distribuição de cargas das superfícies diméricas calculado mostrou

uma distribuição uniforme de cargas uniforme, exceto nas cavidades dos sítios

ativos, na superfície da ACC2, o que corrobora modelos existentes (AMARANTE,

2013; OLIVEIRA et al., 2013).

Um dos resultados mais importantes que foram obtidos por este trabalho foi a

confirmação de que a menor estrutura a ser estudada, para a ACC2, no

desenvolvimento de modelos teóricos foi a estrutura dimérica. As estruturas

multiméricas e possíveis “encaixes” entre os dímeros devem ser considerados,

dependendo do modelo tratado, pois, como foi evidenciado, estas estruturas quando

compostas apenas por dímeros, tem relativa estabilidade sendo solvatadas em

água. As análises das flutuações conformacionais também evidenciaram que os

dímeros da ACC2 não perdem atividade catalítica quando embutidos em estruturas

multiméricas com mais monômeros.

Em suma, o uso de métodos de modelagem molecular permitem um ganho de

tempo e esforço na previsão de condições otimizadas para a continuidade dos

estudos e desenvolvimento dos modelos teóricos de novos nanobiossensores de

ponta de AFM que envolvem as enzimas ACC.

55

7 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS

Segue abaixo os possíveis trabalhos futuros:

Extensão das simulações de Dinâmica Molecular para 10 ns.

Parametrização de campos de força de novas superfícies e ligantes ainda não

estudados por simulações de Dinâmica Molecular.

Estudar e desenvolver novos sistemas e modelos atomísticos e, disposto dos

roteiros de simulação de Dinâmica Molecular apresentados, entender os estudos

para outras proteínas, ligadas a doenças autoimunes e neurodegenerativas.

57

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