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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Danilo Silva de Macedo
Desenvolvimento de Método para Determinação de Pesticidas em
Grãos de Milho (Zea mays) in natura por Cromatografia Líquida com
Detector DAD
Development of a Method to Determine Pesticides in Corn Grains
(Zea mays) in natura by Liquid Chromatography DAD Detector
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Danilo Silva de Macedo
Desenvolvimento de Método para Determinação de Pesticidas em
Grãos de Milho (Zea mays) in natura por Cromatografia Líquida com
Detector DAD
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química, da Universidade Federal de Sergipe, para a obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Prof. Dr. Sandro Navickiene
Development of a Method to Determine Pesticides in Corn Grains
(Zea mays) in natura by Liquid Chromatography DAD Detector
Master dissertation presented to the Graduate Programm in Chemistry of the Federal University of Sergipe to obtain MSc. in Chemistry.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
M141d
Macedo, Danilo Silva de Desenvolvimento de método para determinação de pesticidas
em grãos de milho (Zea mays) in natura por cromatografia líquida com detector DAD / Danilo Silva de Macedo ; orientador Sandro Navickiene. – São Cristóvão, 2015.
70 f. : il.
Dissertação (mestrado Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2015.
1. Cromatografia a líquido. 2. Milho. 3. Pesticidas. I.
Navickiene, Sandro, orient. II. Título.
CDU 543.544
i
ii
RESUMO
O milho (Zea mays) é considerado um cereal de grande importância social e
econômica. No Brasil, a cultura do milho é cultivada em todas as regiões, tendo na
região Nordeste o estado de Sergipe como um grande produtor. Essa cultura vem
sendo atacada por diversas pragas, sendo necessária a utilização de pesticidas, os
quais acabam gerando resíduos se não forem manuseados de acordo com as
normas de boa prática agrícola. Este trabalho visa ao desenvolvimento de um
método para análise de resíduos dos pesticidas atrazina, carbofurano, ciflutrina,
parationa metílica, piraclostrobina e teflubenzurom, em grãos de milho, empregando
como técnica de extração a dispersão da matriz em fase sólida (DMFS) e
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector espectrofotométrico
com arranjo de diodos (DAD). No procedimento de extração, foram avaliados os
seguintes suportes sólidos: alumina neutra, Florisil e sílica gel, com diferentes
solventes de eluição: acetonitrila, acetato de etila, hexano, acetona, metanol,
diclorometano. Foram obtidos resultados satisfatórios utilizando 0,5 g de grãos de
milho com 1 g de alumina neutra eluído com 10 mL de acetato de etila, com
recuperações entre 93,27 a 98,32% e coeficiente de variação entre 6,19 a 15,28%
para o nível de fortificação 1,0 µg g-1. Quanto ao coeficiente de correlação os
resultados variaram entre 0,9996 a 0,9999 para os níveis de concentração entre
0,05 a 5,00 µg mL-1.
Palavras-chave: grãos de milho; pesticidas; DMFS; CLAE-DAD.
iii
Abstract
The corn (Zea mays) is considered a grain of social and economical
importance. In Brazil, which Sergipe is a big producer of Northeast, the culture
of corn is planted in all of the regions. However, this culture has been attacked
by many pests, making necessary the use of some pesticides. This project
intend to show the development of a method to analyse pesticide wastes
atrazine, carbofuran, cyfluthrin, methyl parathion, pyraclostrobin, teflubenzuron
in corn grains using as a extraction technic the matrix solid phase dispersion
(MSPD) and High performance liquid chromatography (HPLC) with a diode
array spectrophotometric (DAD). The extraction procedure evaluated the
following Adsorbents: Aluminum neutral, Florisil and sílica gel, with different
elution solventes (acetonitrila, ethyl acetate, hexane, acetone, metanol,
dicloromethane). Achieving satsfactory results using 0,5 g of corn grains with 1
g of aluminum neutral eluted with 10 mL of ethyl acetate with recovery between
93,27 and 98,32% and variation coefficient between 6,19 and 15,28% to a
fortification level 1,0 µg g-1. About the correlation coefficient the results differ
between 0,9996 and 0,9999 to the concentration level between 0,05 and 5,00
µg g-1.
Keywords: corn grains; pesticides; MSPD; HPLC-DAD.
iv
Sumário
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
1.1 Importância da produção do milho (zea mays) ..................................... 1
1.2 Estrutura física do grão do milho ........................................................... 3
1.3 Pragas que atacam o milho ................................................................... 4
1.4 Pesticidas: considerações gerais .......................................................... 4
1.5 Toxicidade dos pesticidas ..................................................................... 6
1.6 Classificação dos pesticidas ................................................................. 6
1.7 Pesticidas utilizados no estudo ............................................................. 8
1.8 Metodologia de preparo da amostra e a Química Verde ..................... 12
1.9 Dispersão da matriz em fase sólida .................................................... 13
1.10 Características dos suportes sólidos ................................................... 15
1.10.1 Alumina (Al2O3) ............................................................................. 15
1.10.2 Sílica (SiO2)n –OH......................................................................... 15
1.10.3 Florisil [Mg.Al(SiO4)n] .................................................................... 15
1.11 Cromatografia líquida .......................................................................... 16
1.11.1 Fatores que influenciam na separação dos componentes ............ 17
1.12 Validação do Método Analítico ............................................................ 19
1.12.1 Seletividade .................................................................................. 19
1.12.2 Linearidade ................................................................................... 19
1.12.3 Limite de Detecção ....................................................................... 20
1.12.4 Limite de Quantificação ................................................................ 20
1.12.5 Exatidão ........................................................................................ 21
1.12.6 Precisão ........................................................................................ 21
1.13 Revisão da Literatura .......................................................................... 22
2 Objetivos .................................................................................................... 24
2.1 Objetivo geral ...................................................................................... 24
2.2 Objetivos específicos .......................................................................... 24
3 Parte experimental ..................................................................................... 25
3.1.1 Materiais ....................................................................................... 25
3.1.2 Reagentes e padrões ................................................................... 25
3.1.3 Equipamentos ............................................................................... 25
3.1.4 Preparação das soluções padrão ................................................. 26
3.1.5 Aquisição da amostra ................................................................... 26
v
3.1.6 Fortificação da amostra de milho .................................................. 26
3.1.7 Procedimento de preparação da amostra dos pesticidas por
dispersão da matriz em fase sólida ........................................................... 27
3.1.8 Condições cromatográficas de análise ......................................... 27
3.1.9 Limpeza do material ..................................................................... 28
4 Resultados e discussão ............................................................................. 28
4.1 Otimização das condições cromatográficas de análise ....................... 28
4.2 Otimização do preparo das amostras de milho por dispersão da matriz
em fase sólida ............................................................................................... 37
4.2.1 Seleção do solvente de eluição .................................................... 37
4.2.2 Seleção do suporte sólido ............................................................ 38
4.2.3 Avaliação do efeito da variação do volume do solvente de
eluição............... ........................................................................................ 40
4.2.4 Avaliação do efeito da quantidade de suporte sólido .................... 41
4.2.5 Avaliação do efeito do tempo de homogeneização ...................... 42
5 Validação do método analítico ................................................................... 43
5.1 Seletividade ......................................................................................... 43
5.2 Linearidade ......................................................................................... 44
5.3 Limite de quantificação e detecção ..................................................... 45
5.4 Precisão e Exatidão ............................................................................ 45
6 Conclusão .................................................................................................. 47
7 Referências ................................................................................................ 47
vi
Este trabalho dedico especialmente aos
meus pais, Valícia Carvalho da Silva e José
Castro de Macedo, e a todos os meus
familiares que me ensinaram sobre a
importância da educação e me incentivara.
A vocês declaro meu amor e carinho.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pelo dom da vida e por esta oportunidade de estar
conseguindo realizar mais um dos meus sonhos.
Agradeço aos meus pais pelos seus esforços, pelo amor e carinho.
Aos meus avós, Aroldo (in memorian) e Odete, obrigado pelo amor e carinho.
Ao meu irmão Fellipe, que sempre me incentivou, e à minha cunhada Taynah.
Ao meu sobrinho Issac, por me mostrar que cada dia é um novo recomeço de
uma longa jornada.
À minha irmã Raquel, que mesmo na distância sempre acreditou no meu
potencial.
Aos meus familiares.
Aos meus amigos João, Thiago, Maicon, Ghustavo, Ruan, Wesley, Ivana,
Manoel, Maria, Débora, Leoanardo, Ricardo e Pablo.
Agradeço aos meus colegas e amigos do Departamento de Química
Fabrício, Nicaellen, Ruyane, Erivaldo, Tarciane, Mônica, Bruno, Josué, Valter,
Gabriel, Sidnei, Dayara, Ingred, Shnaider, Valéria, Carlos, Jany Hellen, Édica,
Marília, Rafael, Manuella, Tayssa, Thigna, Rhaisa, Maria, MSc. Fátima, Prof.
MSc Michel e Prof. MSc. Renan.
Aos meus mais que amigos, meus irmãos de todas as horas, Ewerton e
Otoniel.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Sandro Navickiene por toda a paciência, por todos
os conselhos ao longo destes dois anos e o apoio no momento em que tive que
recomeçar.
Aos Doutores Marcelo, Alberto, Lisiane, Luciane e Renan.
Aos professores do IFS, os Doutores Adalberto, Francisco, Conceição,
Rosanne, Cláudio, Marcelo, Sérgio, Alysson e Helena.
A todos da Igreja Comunidade Tempo de Vida e a Galera da Vida
Agradeço a FAPITEC pela concessão da bolsa de mestrado.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente me apoiaram em mais esta
conquista.
viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE/DAD – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector Arranjo de
Diodos
CV - coeficientes de variação
DDT - [1,1,1-tricloro-2-bis-(p-clorofenil)-etano]
DERAL - Departamento de Economia Rural
DL - Dose Letal
EFSA - Autoridade Europeia de Segurança dos Alimentos
EPA - Departamento de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry
Kow - coeficiente de partição octanol-água
LCP - Laboratório de Análise de Compostos Orgânicos Poluentes
LLE - Liquid-Liquid Extracion
LMR - Limites Máximos de Resíduos
PARA - Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos
PV - Pressão de Vapor
SPE - Solid Phase Extration
SPME - Solid Phase Micro Extration
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Importância da produção do milho (zea mays)
O milho é uma planta que pertencente à família Poacear, sub-família
Panicoideae, gênero Zea e espécie Zea mays [1]. O grão de milho possui
elevados teores de carboidratos, fibras e vitaminas do complexo A, B e E e
minerais (cálcio, potássio, fósforo e ferro).
O milho é um dos cereais mais consumidos mundialmente, com
produção em torno de 980,9 milhões de toneladas [2], sendo que cerca de 70%
são destinados para a alimentação animal, principalmente para aves e suínos.
Os outros 30% para alimentação humana e na indústria são empregados como
matéria prima para produção de amido, glicose, rações animais e nas
formulações alimentícias [3-6].
Segundo o Departamento de Economia Rural [7], os Estados Unidos
são os maiores produtores de milho, atingindo 271,94 milhões de toneladas em
2012/2013, sendo que utiliza uma parte para o programa de bioenergia e o
processamento de biocombustível. A China é o segundo maior produtor,
chegando a 200 milhões de toneladas em 2012/2013, sendo que uma grande
parte da produção fica no mercado interno. O Brasil está na terceira colocação,
com 70 milhões de toneladas em 2012/2013. Cerca de 50 milhões de toneladas
foram consumidos no mercado interno e 20 milhões de toneladas foram para
exportações.
No Brasil o milho é cultivado em todas as regiões do país, destacando-
se as regiões centro-oeste, sudeste e sul, como maiores produtores,
responsáveis por aproximadamente 87% da produção nacional, devido à
mecanização do campo e a fatores climáticos [8]. No Nordeste, o Estado de
Sergipe vem se destacando nos últimos anos na produção de milho, devido ao
clima favorável, melhoramento genético e a mecanização do campo. Os
munícipios com maior produtividade são: Simão Dias, Carira, Frei Paulo,
Pinhão e Poço Verde, conforme apresentado na Tabela 1 [3].
2
Tabela 1 - Produção de milho nos munícipios do Estado de Sergipe entre
2000 – 2010 (em toneladas). Fonte: IBGE, 2010 [9].
Munícipio 2000 2010 Taxa de
Crescimento (%)
2000-2010
Carira 6000 237600 3860
Simão Dias 8550 150150 1656
Frei Paulo 5250 86130 1541
N. Sra. Da Glória 3640 75355 1970
Monte Alegre 2016 61680 2960
Gararu 1560 52955 3295
Poço Redondo 540 46789 8565
Poço Verde 15300 43061 181
N. Sra. Aparecida 5600 41580 643
Pinhão 6201 41250 565
Porto da Folha 1170 34176 2821
Frei Nova 2080 29976 1341
Canindé de S. F. 325 27776 8446
Itabi 660 16366 2380
S. Miguel do
Aleixo
4372 15840 262
3
1.2 Estrutura física do grão do milho
O grão de milho é formado por quatro partes principais: endosperma,
gérmen, pericarpo e ponta [10]. Sua estrutura física é apresentada na Figura 1.
Figura 1 – Estrutura física do grão do milho. Fonte: MAPA, 2006.
O endosperma representa 82% do peso seco do grão, e concentra em
sua maioria amido e proteínas [11]. Enquanto que, o gérmen representa
aproximadamente 11% do peso do grão, contendo em sua maioria lipídeos,
minerais e açucares [12]. O pericarpo representa cerca de 5% do peso do grão,
sendo responsável pela proteção do grão, como umidade do ambiente, insetos
e microorganismos, e concentra a maior parte das fibras, aproximadamente
54%, e sua camada de células é constituída de polissacarídeos do tipo
hemicelulose e celulose [10]. Por fim, a ponta representa 2% do peso do grão e
concentra 7% das fibras. Sua composição é essencialmente de material
lignocelulósico [12].
4
1.3 Pragas que atacam o milho
Sendo uma rica fonte em nutrientes, o milho atrai várias pragas.
Segundo Domingos Gallo et. al.[13], as pragas que atacam a cultura do milho
podem ser divididas de acordo com órgão alvo da planta. A Tabela 2 apresenta
algumas das principais pragas presentes na cultura do milho.
Tabela 2 – Principais pragas encontradas na cultura do milho. Fonte:
Domingos Gallo et. al. 2002 [13].
Nome comum Nome científico Área de ataque na
planta
Largarta-elasmo Elasmopalpus lignosellus Folhas
Coró Phyllophaga cuyabana Semente e raiz
Percevejo barriga verde Dichelops furcatus Colmo
Lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda Folha, colmo, espiga
Lagartas-das-espigas Helicoverpa zea Espiga
Pulgão-do-milho Rhopalosiphum maidis Folhas
O milho é hospedeiro de várias pragas que provocam danos à cultura e
compromete o desenvolvimento da planta, causando desde danos leves, como
mordidas em suas folhas, até a destruição da raiz, provocando a morte [14, 15].
1.4 Pesticidas: considerações gerais
O aumento da produtividade dos alimentos deve-se a diversos fatores
[16], tais como, máquinas mais eficientes, melhoramento genético, fertilizantes
e defensivos agrícolas. Este último conhecido também com outros nomes:
agrotóxicos, praguicidas, remédios de planta, pesticidas, entre outros [17].
5
De acordo com a União Internacional de Química Pura e Aplicada
(International Union of Pure and Applied Chemistry – IUPAC)
Pesticidas são substâncias, ou mistura de substâncias,
utilizadas durante a produção, colheita ou
armazenamento de alimentos. São compostos bioativos
capazes de prevenir, combater ou exterminar espécies
que causem danos nas plantações durante as etapas de
produção de alimentos. Esta definição também
compreende as substâncias utilizadas no combate de
insetos domésticos ou agentes preventivos à ação de
vetores de doenças.
O uso de pesticidas na agricultura – como cianetos, enxofre e
compostos de cobre - já é conhecido há muito tempo [18]. Em 1872, foi
relatada pela primeira vez a síntese de pesticidas. Entretanto, apenas na
década de 1930 uma grande quantidade de compostos químicos foram
desenvolvidos, a exemplo do organoclorado DDT [1,1,1-tricloro-2-bis-(p-
clorofenil)-etano] [19].
No Brasil, após a 2ª Guerra Mundial iniciou-se a utilização de pesticidas
sintéticos, principalmente na cultura do café e algodão [18]. Na década de 1970
ocorreu a grande expansão da produção e utilização de pesticidas, o que se
deve aos incentivos à produção agrícola e à política de exportação. O Brasil é
um dos países que mais utilizam pesticidas, havendo um crescimento de 190%
entre 2000 a 2010 [20]. São comercializados mais de 2.000 tipos de pesticidas
que apresentam cerca de 300 princípios ativos [21]. Decorrente do aumento da
utilização dos pesticidas de maneira desorganizada houve a necessidade de
implantar medidas de ações a fim de minimizar os riscos causados ao
ambiente e consequentemente ao ser humano.
1.5 Toxicidade dos pesticidas
A utilização intensa de pesticidas acaba gerando produtos ou
subprodutos que se degradam no solo, água e atmosfera, apresentando
persistência e toxicidade no meio ambiente. Eles podem ser transferidos para o
6
ser humano através da cadeia alimentar, sendo altamente prejudiciais à saúde
humana, mesmo a exposição de concentrações a nível de traço [22-24].
Com a preocupação em monitorar os pesticidas, órgãos foram criados
para fiscalizar e regulamentar [25]. O órgão responsável pela fiscalização no
Brasil é a ANVISA, que em 2001 criou o Programa de Análise de Resíduos de
Agrotóxicos em Alimentos (PARA), com a finalidade de avaliar os níveis de
pesticidas em alimentos in natura, identificando os que excedem os limites
máximos de resíduos (LMR), autorizados pela legislação brasileira e
recomendados pela Codex Alimentarius e pela União Europeia [26, 27].
O limite máximo de resíduos (LMR) é a quantidade limite de resíduos
de um pesticida que pode estar legalmente presente nos alimentos em
decorrência da aplicação, expressa em mg kg-1. Para cada cultura existem
valores estabelecidos pelos órgãos responsáveis, tendo como importância que
valores abaixo do LMR respeitam a boa prática de manejo de pesticidas [28].
1.6 Classificação dos pesticidas
Os pesticidas podem ser classificados de acordo com o alvo de
atuação: acaricida (elimina ácaro), herbicida (combate plantas daninhas),
inseticida (controle de insetos), fungicida (combate fungos), raticida (age sobre
ratos), nematicida (atua sobre nematoides do solo), bactericida (controle de
bactérias), entre outras [21].
Outra maneira de classificá-los é através da toxicidade, medida por
meio da DL (Dose Letal) que representa a concentração de pesticida capaz de
matar 50% dos organismos testados. Quanto à sua classificação, divididem-se
em quatro classes de acordo com sua periculosidade, que variam de I a IV:
(Classe I) extremamente tóxico – faixa vermelha; (Classe II) altamente tóxico –
faixa amarela; (Classe III) mediamente tóxico – faixa azul e (Classe IV) pouco
tóxico – faixa verde [29]. Os efeitos causados pela toxicidade são: câncer,
tumores, abortos, inibição no crescimento, entre outros sintomas [30].
Os pesticidas compreendem uma vasta variedade de substâncias
químicas com diferentes grupos funcionais, os quais possuem diferentes
modos de ação e biotransformação [31]. Algumas classes químicas destacam-
7
se, tais como: organoclorados, carbamatos, organofosforados, piretróides e
triazinas [32, 33].
As triazinas são utilizadas no combate de ervas. Elas possuem alta
toxicidade e persistência que podem contaminar o meio ambiente e as culturas
ao redor [34]. Podem causar danos à saúde como câncer, defeitos no
nascimento e disfunção hormonal [35, 36].
Os carbamatos são ésteres derivados de ácido carbâmico são usados
para controlar insetos, fungos e ervas daninhas [37, 34]. Esta classe apresenta
baixo potencial de bioacumulação, altas toxicidades, baixa estabilidade e são
altamente solúveis em água oferecendo um risco para os ambientes aquáticos
[39, 39].
Os piretroides são derivados das piretrinas, Geralmente usados para
combater insetos [40]. Possui baixo potencial de persistência no ambiente, fácil
biodegradação, alta estabilidade a luz e temperatura, e baixa toxicidade para
os mamíferos e aves, com exceção dos mamíferos aquáticos [41].
Os organofosforados possuem como átomo central o fósforo ligado por
dupla ligação ao oxigênio ou enxofre [42]. Esta classe apresenta elevada
persistência e toxicidade para o meio ambiente, animais e consumidores finais,
além de elevada solubilidade em água e bioacumulação [43].
1.7 Pesticidas utilizados no estudo
Para o controle das pragas no milho existe uma variedade de pesticidas que
compreendem diversos grupos químicos com diferentes grupos funcionais [21, 23].
Os grupos químicos mais conhecidos são os organofosforados, organoclorados,
piretroides, carbamatos. Cada um possui um modo de atuação diferente
dependendo da sua classe (herbicida, inseticida, acaricida e outros) e do organismo
alvo [44].
8
Atrazina
2-cloro-4etilamina-6-isopropilamino-s-
triazina é um herbicida que pertence ao
grupo químico triazina. É utilizada no pré-
plantio ou pré- emergência de ervas
daninhas nas culturas de cana-de-açúcar,
milho e sorgo.
O CH3
CH3
O
O
NH
CH3
Carbofurano
(2,3-diidro-2,2-dimetilbenzofurano-7-ilo) é
um inseticida, nematicida e acaricida que
pertence ao grupo químico
metilcarbamato de benzofuranila.
Utilizado no solo em culturas como:
algodão, milho, amendoim e arroz.
O
F
N
O
O
CH3 CH3
Cl Cl
Ciflutrina
((RS) - α- ciano - 4- fluoro - 3-
fenoxibenzil (1RS, 3RS; 1RS, 3SR)-3-
(2,2-diclorovinil)-2,2-dimetilciclopropano
carboxilato), é um inseticida que
pertence ao grupo químico piretroide.
Sua aplicação é foliar nas culturas de
algodão, amendoim, milho, arroz e café.
ON
O
O
P
S
O
O
CH3
CH3
Parationa Metílica
(O,O-dimetil-O-4-nitrofenil fosforotioato), é
um inseticida, e acaricida que pertence
ao grupo químico organofosforado. Sua
aplicação é foliar nas culturas de algodão,
milho, alho, arroz, batata e cebola.
9
N
N
Cl
O
N
O
O
O
CH3
CH3
Piraclostrobina
(metil N-{2-[1-(4-clorofenil)-1H-pirazol-3-
iloximetil] fenil} (N-metoxi) carbamato), é
um fungicida que pertence ao grupo
químico estrobulina. Sua aplicação é foliar
nas culturas de algodão, alho, amendoim,
milho, banana e batata.
Cl
Cl
F F
N
O
N
O
F
F
H H
Teflubenzurom
(1- (3,5-dicloro-2,4-difluorofenil-3-(2,6-
difluorobenzoil) ureia)), é um inseticida, e
acaricida que pertence ao grupo químico
benzoilureia. Sua aplicação é foliar nas
culturas de cana-de-açúcar, citros, couve-
flor, fumo, girassol e milho.
A Tabela 3 mostra algumas características dos pesticidas quanto à
forma de atuação, classe toxicológica, fórmula molecular, massa molecular e
LMR.
Tabela 3 - Características dos pesticidas selecionados para estudo. Fonte:
ANVISA, 2010 [45].
Pesticidas Fórmula
Molecular
Forma de
atuação
Classe
toxicológica
Massa
Molecular
(g mol-1)
LMR* (mg
kg-1)
Atrazina C8H14ClN5 Sistêmico III 215,7 0,25
Carbofurano C12H15NO3 Sistêmico I 221,3 0,1
Ciflutrina C22H18Cl2FNO3 Sistêmico II 434,3 0,1
Parationa
Metílica
C8H10NO5PS Sistêmico I 263,2 0,1
Piraclostrobina C19H18ClN3O4 Sistêmico II 387,8 0,1
Teflubenzurom C14H6Cl2F4N2O2 Não-sistêmico IV 381,1 0,1
LMR* - Limite máximo de resíduo na cultura do milho segundo a ANVISA.
10
As propriedades físico-químicas (Tabela 4) explicam as diferentes
formas de contaminação e degradação dos pesticidas no meio ambiente, que
podem ser através do solo, da água ou ar atmosférico [43]. Algumas
propriedades físico-químicas são: solubilidade em água, pressão de vapor
(PV), coeficiente de partição octanol-água (Kow) e tempo de meia vida (t1/2) [46].
O coeficiente de partição octanol-água (Kow) é definido através da
razão de distribuição de um composto em um sistema de duas fases, formadas
por dois solventes imiscíveis, água (polar) e octanol (apolar). O valor de Kow
indica a polaridade das moléculas, quanto maior o valor da constante maior
será a tendência por grupos lipofílicos [47].
A pressão de vapor (PV) é definida como a pressão exercida pela
substância em um sistema fechado em equilíbrio. Possui uma relação direta da
volatilização em seu estado puro com a temperatura, quanto maior a pressão
de vapor, maior a tendência de o contaminante estar no estado gasoso [48].
O tempo de meia-vida (t1/2) indica a persistência dos pesticidas no meio
ambiente e é definido como o tempo requerido para que a metade da
concentração do composto parental seja dissipada, independente da sua
concentração inicial no solo. Não existe um valor único para a meia-vida de um
determinado pesticida, já que sua determinação é fortemente influenciada
pelas diversas condições ambientais (solo, local, clima, atividade biológica,
entre outras). Assim, o tempo de meia-vida deve ser determinado em
condições normais de uso, na região em que o composto orgânico será
utilizado [49].
Tabela 4 - Características físico-químicas dos pesticidas selecionados para
estudo. Fonte: Barceló, 1997 [51].
Pesticidas Log Kow**
(25°C) Pressão de vapor (Pa), 25° C
Tempo de meia vida (t1/2), (dias)
Atrazina 2,5 3,9x10-5 50 Carbofurano 1,52* 3,1 x 10-5* 50 Ciflutrina 6 - - Parationa Metílica 3 2,0 x 10-4 18,5 Piraclostrobina 3,9 2,6 x 10-5 - Teflubenzurom 4,3 9,2 x10-4 -
* 20 ºC; ** coeficiente octanol-água
11
A solubilidade em água (Tabela 5) define o quanto uma determinada
substância pura pode ser dissolvida em água em uma dada temperatura.
Quanto maior a quantidade de grupos hidrofílicos a substância possuir, maior
sua afinidade por água [48]. Ela é importante para indicar o comportamento,
transporte e destino em águas superficiais ou subterrâneas. Compostos como
atrazina, carbofurano e parationa metílica apresentam elevada solubilidade em
água em relação aos demais compostos estudados neste trabalho.
Tabela 5 - Solubilidade dos pesticidas estudados. Fonte: TOMLIN, 1994 [51].
Pesticidas Água (20 °C) Solventes Orgânicos (g/L) (25 ºC)
Atrazina 33 mg/L Metanol: 15 Acetato de etila: 24
Diclorometano:28 Tolueno: 6,0
n-Hexano: 0,11
Carbofurano 320 mg/L Diclorometano > 200
Isopropanol: 20-50
Tolueno: 10-20
Ciflutrina 2,5 µg/L Diclorometano e Tolueno > 200
n-Hexano: 10-20
Isopropanol: 20-50
Parationa
Metílica
55 mg/L Diclorometano e Tolueno > 200 (g/L 20º C)
Hexano: 10-20 (g/L 20º C)
Piraclostrobina 1,9 mg/L Metanol: 1
Acetona, Acetonitrila, Diclorometano e
Acetato de Etila > 0,5
Teflubenzurom 0,019 mg/L Acetona: 10 Etanol: 1,4
Diclorometano: 1,8 Hexano: 0,05
12
1.8 Metodologia de preparo da amostra e a Química Verde
Com o crescimento por análises ambientais voltadas à quantificação de
espécies químicas nocivas ao meio ambiente em diferentes matrizes, existe a
preocupação cada vez maior da sociedade pelas questões ambientais. Porém
para comunidade científica existem alguns problemas, tais como: os descartes
produzidos na análise são mais agressivos no meio ambiente, do que os
próprios compostos examinados. [52].
Para solucionar essa questão foram realizadas tentativas quanto ao
tratamento dos resíduos gerados e a busca de reagentes e solventes menos
agressivos ao meio ambiente. Laboratórios iniciaram coletas e
armazenamentos dos descartes; contudo, essa ação não se mostrou eficaz
pela grande quantidade de reagentes e solventes utilizados [53-55].
Em 1990 estudos começaram a empregar a miniaturização no
processo de preparo da amostra, a fim de minimizar a utilização ou geração de
substâncias prejudiciais à saúde humana e ao meio ambiente. Para facilitar a
extração dos analitos foram desenvolvidos novos materiais suportes sólidos e
alterou as propriedades físicas do solvente [56, 57].
Novos métodos multirresiduais têm sido desenvolvidos para
preparação de amostras, apresentando: poucas etapas, facilmente
automatizáveis, quantidade reduzida de solventes e realizada em curto período
de tempo [58]. Umas das técnicas que apresenta destaque quanto à análise de
uma grande quantidade de compostos e ao número de aplicações, remoção de
possíveis interferentes da amostra e excelentes figuras de mérito é a Dispersão
da Matriz em Fase Sólida (MSPD).
13
1.9 Dispersão da matriz em fase sólida
Em 1989, Barker e colaboradores desenvolveram uma nova técnica de
extração a Dispersão da Matriz em Fase Sólida (DMFS) [59, 60], criada com o
intuito de superar os obstáculos relacionados a amostras particuladas, quando
se utiliza a técnica de Extração em Fase Sólida (EFS) [61].
Essa técnica é aplicada em amostras sólidas, viscosas ou semissólidas
que será homogeneizada com um material abrasivo denominado suporte.
Nessa etapa ocorrerá a fragmentação da amostra proporcionando a liberação
dos analitos e por fim a eluição pode ser realizada com o solvente adequado
para extração dos analitos de interesse. Tem sido largamente empregada na
análise de grande variedade de analitos, em fármacos, alimentos, antibióticos,
entre outros em diferentes matrizes [62,63].
Quando comparada a outras técnicas de extração tradicionais a DMFS
apresenta diversas vantagens (Figura 2) quanto à sua simples execução,
flexibilidade, versatilidade. Além disso, o baixo consumo de amostra, a
possibilidade de extrair e reduzir interferentes, resultando em um rápido
tratamento de amostra com baixo consumo de solvente em um curto período
de tempo [64-67].
Figura 2 - Etapas envolvidas no procedimento da dispersão da matriz em fase
sólida. Fonte: Adaptado de Barker, 2000 [68].
14
A execução da técnica consiste em homogeneizar a amostra junto
com um suporte sólido em um almofariz com o auxílio do pistilo. Nessa etapa
ocorrerá o rompimento da estrutura da amostra, fazendo com que haja maior
interação do suporte sólido com o analito. O material homogeneizado
resultante é transferido para um cartucho que contém lã de vidro em sua
extremidade inferior, com a finalidade de evitar perda da matriz. Por fim, os
analitos são eluídos com um solvente apropriado [68-70].
1.10 Características dos suportes sólidos
A escolha do suporte sólido é um fator primordial no processo de
extração por DMFS, uma vez que diferentes suportes sólidos apresentarão
interações diferentes em relação aos analitos [68]. Analitos de maior polaridade
demandam a utilização de suportes sólidos de caráter polar, enquanto analitos
menos polares têm como uso indicado os suportes sólidos com caráter menos
polar [71]. Segundo Lagunas-Allué et.al. [72] os suportes sólidos convencionais
mais utilizados são alumina, sílica e Florisil.
1.10.1 Alumina (Al2O3)
A alumina é um dos suportes sólidos mais utilizados. Possui caráter
anfótero proporcionando característica tanto básica quanto ácida [73]. Sob
condições básicas ela exibe uma afinidade maior por espécies catiônicas [74],
e para condições ácidas exibe uma afinidade para espécies aniônicas, tendo
como consequência uma faixa ampla de aplicações [75].
1.10.2 Sílica (SiO2)n –OH
A sílica é um polímero inorgânico inerte, resistente e com alta
porosidade. A sílica possui uma superfície de caráter levemente ácido
facilitando a retenção de compostos básicos. A presença de grupos silanóis em
sua superfície permite modificar a estrutura química, podendo produzir novos
materiais mais versáteis e com propriedades especificas [76].
15
1.10.3 Florisil [Mg.Al(SiO4)n]
É um suporte sólido de caráter polar que proporciona a extração de
compostos polares, uma vez que pode provocar adsorção irreversível em sua
superfície sem que o analito de interesse não seja removido eluindo com o
solvente de interesse [76].
1.11 Cromatografia líquida
Para separação, identificação e quantificação dos resíduos dos
pesticidas uma das técnicas mais empregadas é a cromatografia. Essa técnica
analítica permite separar diversos compostos de uma mesma classe ou de
diferentes classes ao mesmo tempo [77].
Na cromatografia líquida a fase estacionária é constituída por partículas
sólidas compactadas em uma coluna, a qual é permeada pela fase móvel. Os
compostos são separados por meio dos componentes de mistura entre a fase
móvel e a fase estacionária, através das interações físicas e químicas que
ocorrem entre o soluto e a fase móvel na coluna cromatográfica [78].
O equipamento cromatográfico líquido é constituído por: reservatório de
solvente, sistema de bombeamento, válvula de injeção, coluna cromatográfica,
forno, detector, sistema de dados, como exemplificado na Figura 3.
16
Figura 3 – Esquema básico do equipamento CLAE. Fonte: Figura adaptada de
Snyder (2010) [79].
O solvente ou fase móvel é impulsionado por bombas de alta pressão
em direção à coluna. No percurso, a amostra é introduzida na fase móvel,
através de uma válvula de injeção e arrastada para a coluna onde ocorrerá a
separação dos componentes da amostra. Por fim, o eluente da coluna é
direcionado para um detector, que acusa a presença dos analitos eluídos da
coluna. O sinal gerado pelo detector é captado por um software que irá
convertê-lo em cromatograma [80].
Para identificação dos compostos podem ser utilizados diversos
detectores. Na cromatografia uns dos detectores mais conhecidos é o
espectrofotométrico, que tem como princípio a absorção da luz ultravioleta ou
visível por parte do analito, quando nele atravessa radiação eletromagnética. O
sinal que é gerado, quando o eluente sai da coluna e chega ao detector, será
diretamente proporcional a concentração do componente da amostra [79].
Existem três tipos de detectores de absorbância: o fotométrico, que
funciona com um ou dois comprimentos de onda fixos; o comprimento de onda
variável (espectrofotômetro), o qual possui uma faixa mais variada e sensível,
por fim o detector com arranjo de diodos, que detecta em vários comprimentos
de onda simultaneamente o qual possibilita uma varredura na região do UV-VIS
17
durante a corrida cromatográfica, medidas de pureza de pico e o espectro das
substâncias [79].
1.11.1 Fatores que influenciam na separação dos componentes
Na cromatografia líquida, diversos fatores influenciam na separação
dos analitos, dentre estes se destacam: composição da fase estacionária, fase
móvel, fluxo da fase móvel e temperatura da coluna analítica [79].
A escolha da fase móvel é o ponto crítico para o sucesso da separação
dos analitos [81], resultantes das propriedades físico-químicas, como
polaridade e viscosidade. Para se obter uma boa separação cromatográfica
existe uma variedade de solventes e proporções para serem utilizadas a
depender dos analitos de interesse [82]. A fase móvel geralmente é constituída
por um ou mais solventes [78], exigindo alguns pré-requisitos, tais como que a
amostra seja solúvel, deve ter alto grau de pureza, para que possa realizar
análises em baixas concentrações, pois as impurezas podem interferir nos
resultados [83].
Outro fator que influência a separação dos analitos é fluxo da fase
móvel que deve ser mantida constante, a fim de garantir reprodutibilidade,
sensibilidade e resolução da análise [82]. Ele é responsável pela velocidade de
difusão da massa do soluto entre a fase móvel e a fase estacionária. O fluxo
influência no tempo de retenção dos compostos, sendo assim o aumento da
velocidade da fase móvel diminuirá o tempo de interação do analito com a fase
estacionária, enquanto que diminuindo o fluxo da fase móvel, o tempo de
interação entre o analito e a fase estacionária irá aumentar, proporcionando um
aumento no fator de retenção do composto [79].
A temperatura tem um grande potencial de influência na resolução
cromatográfica uma vez que este parâmetro possui a capacidade de aumentar
a eficiência dos picos [84]. A viscosidade da fase móvel é reduzida com o
aumento da temperatura, resultando em uma diminuição da pressão,
permitindo o equipamento trabalhar em elevadas taxas de fluxo, o que
possibilita diminuir o tempo de análise. As temperaturas elevadas reduzirem a
viscosidade ocasionando um aumento na velocidade de transferência da
18
massa entre a fase estacionária e a fase móvel seja aumentada e como
consequência a eficiência cromatográfica [85-87].
As separações dos compostos ocorrem na coluna. O sucesso na
separação dos compostos depende de vários fatores, tais como: o tubo a ser
utilizado, as dimensões, natureza química e física da fase estacionária,
tamanho e formas de partículas. Sendo que um dos materiais mais utilizado na
composição da fase estacionária é a sílica gel, por ter elevada resistência
mecânica e poder trabalhar em uma ampla faixa de pH. Para aumentar a
eficiência da coluna emprega partículas menores, e para análises em um
menor tempo utiliza colunas menores [80].
1.12 Validação do Método Analítico
A validação do método é uma etapa que busca garantir resultados
confiáveis sem conduzir para decisões equivocadas [88]. O processo de
validação necessita ser planejado para que as informações geradas sejam
confiáveis, averiguando se o método analítico proposto é adequado [89, 90].
Os parâmetros comumente avaliados exigidos por agências de
regulamentação, tal como a ANVISA são: seletividade, linearidade, exatidão,
precisão, limite de detecção e quantificação [91].
1.12.1 Seletividade
A seletividade é um parâmetro que produz resposta para vários
analitos, distinguindo-os uns dos outros além de quantificá-los [90]. Ele avalia
de forma inequívoca o analito de interesse, a fim de que não seja afetado pela
presença de produtos de degradação ou outros interferentes que estejam na
matriz [92]. A seletividade demonstra se é possível confirmar a identidade da
substância analisada, em razão da possível presença de uma grande
quantidade de compostos que possuem propriedades semelhantes ao analito
de interesse [93].
19
1.12.2 Linearidade
Um método linear apresenta resposta diretamente proporcional à
concentração do analito na solução padrão ou amostra, em um dado intervalo
de concentração [90].
Para expressar esse parâmetro é utilizada a regressão linear, que é o
cálculo matemático estabelecido a partir dos resultados obtidos das análises de
amostras em diferentes concentrações. Recomenda-se que o cálculo contenha
no mínimo 5 pontos de concentrações diferentes que estes estejam dentro de
um intervalo a ser determinado no conjunto da amostra [89].
A Equação 1 representa a regressão linear utilizada para avaliação de
linearidade:
y = a x + b (1)
Na qual:
y = variável dependente (resposta medida)
x = variável independente (concentração)
a = coeficiente angular (sensibilidade)
b = coeficiente linear (interseção com o eixo y)
O coeficiente de regressão indica a qualidade da curva obtida, ou seja,
quanto mais próximo de 1, menor a dispersão do conjunto de pontos
experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados. O
coeficiente de correlação maior que 0,999 é considerado como evidência de
um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão. A ANVISA recomenda
um coeficiente de correlação igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima de
0,90 [90].
20
1.12.3 Limite de Detecção
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da
substância que pode ser detectada, contudo não apresenta confiabilidade na
quantificação [90]. Um dos métodos mais utilizados para os limites de detecção
de pesticidas é o método sinal-ruído, e para ser aceito deve possuir uma razão
entre 2:1 e 3:1 [89]. O ruído pode ser medido manualmente utilizando o
cromatograma ou através do integrador automático do instrumento [94].
1.12.4 Limite de Quantificação
O limite de quantificação (LQ) é a menor concentração da substância
que pode ser avaliada através da precisão e exatidão [90]. A maneira utilizada
para avaliar este parâmetro é semelhante ao LD, podendo ser estabelecido
através do sinal ruído. Porém, o limite de quantificação deve ter um fator igual a
10:1 [89].
1.12.5 Exatidão
A exatidão avalia o grau de concordância entre os resultados
individuais obtidos de um determinado experimento a um valor de referência
como verdadeiro. Este parâmetro implica uma combinação de componentes de
erros aleatórios e sistemáticos avaliados pelo grau de concordância dos
valores [89].
Para avaliação desse parâmetro a amostra é contaminada com uma
proporção da quantidade da substância de interesses, presente ou adicionada
na porção analítica do material teste que seja extraída e possível de
quantificação [90].
21
A recuperação é determinada pela Equação 2:
( ) (
) (2)
Sendo:
C1 = concentração do analito na amostra fortificada;
C2 = concentração do analito na amostra não fortificada;
C3 = concentração do analito adicionada à amostra fortificada (INMETRO,
2011).
1.12.6 Precisão
A Precisão é um parâmetro usado para avaliar a proximidade entre as
medidas experimentais na mesma amostra. Esta pode ser avaliada pelo
coeficiente de variação, utilizando diversas medições. A dispersão dos
resultados aumenta com a diminuição da concentração e a recuperação pode
diferir substancialmente a altas e baixas concentrações [90].
O coeficiente de variação relativo pode ser calculado através da
Equação 3:
CV = DP/CMD x 100 (3)
Na qual:
DP = desvio-padrão;
CMD = concentração média determinada.
22
1.13 Revisão da Literatura
Na literatura é descrito diversos trabalhos com determinação de
resíduos de pesticidas em alimentos empregando técnicas cromatográficas de
análise.
Lin et. al. [96] desenvolveram uma metodologia para determinação de
resíduos de pesticidas em milho empregando a dispersão da matriz em fase
sólida analisado por cromatografia gasosa com detector espectrometria de
massa. Foi utilizado 0,5 g de amostra de milho, 2 g de alumina neutra como
suporte sólido e 8 mL de acetona como solvente de eluição. Os pesticidas
estudados foram isoprocarb, fenobucarb, propoxur, carbofurano, pirimicarbe,
etiofencarb, acetochlor, alachlor, carbaril, metiocarbe, butaclhor, fenotiocarbe ,
carbosulfano, furatiocarbe, benfuracarbe obtendo recuperações de 75,1 à
106,3 % com desvio padrão entre 3,1 – 14,1%
Já Dórea e Sobrinho [97] desenvolveram um método para
determinação de endosulfan, parationa metílica e malationa em arroz
empregando a dispersão da matriz em fase sólida e análise por cromatografia
gasosa com detector espectrometria de massa. Na etapa de extração utilizou
1g de alumina neutra como suporte sólido e 40 mL de acetato de etila como
solvente de eluição. As recuperações obtidas foram compreendidas ente 89,7 –
104,8 % e desvio padrão relativo entre 3,9 – 10,9 %. Os limites de detecção
foram de 20 – 105 ng g-1.
Li et. al. [98] determinaram resíduos de pesticidas em cerais utilizando
como técnica de extração líquido-líquido e para identificação por cromatografia
líquida com detector espectrometria de massa. Foram valiados 19 pesticidas
obtendo recuperações entre 70,1 a 106,5% com coeficiente de variação 4,3 a
11,3%. Os limites de detecção variaram entre 0,013 a 0,987 μg kg-1.
Santos et. al. [99] desenvolveram um método determinar resíduos de
pesticidas em água-de-coco liofilizada, empregando a técnica de extração a
dispersão da matriz em fase sólida e para identificação cromatografia liquida
com detector ultravioleta visível. Foram analisados 3 pesticidas (teflubenzurom,
lufenuron e bifentrina) empregando 0,5 g da amostra, 2,5 g de C18 como
suporte sólido e 20 mL de acetonitrila como solvente de eluição. As
23
recuperações obtidas variaram ente 74-116% e desvio padrão variou 0,4-9,4%.
Os limites de detecção variaram 0,04-0,05 mg kg-1 e o limite de quantificação
foi de 0,1 mg kg-1.
24
2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Desenvolver um método para determinação de resíduos de pesticidas
em grãos de milho empregando como método de preparação de amostra a
dispersão da matriz em fase sólida e a análise através da cromatografia líquida
de alta eficiência com detector espectrofotométrico com arranjo de diodos.
2.2 Objetivos específicos
Selecionar os pesticidas utilizados na cultura do milho;
Otimizar as condições cromatográficas para análise dos pesticidas por
cromatografia líquida de alta eficiência com detector espectrofotométrico com
arranjo de diodos;
Desenvolver um método de extração por dispersão da matriz em fase
sólida para determinar resíduos de pesticidas em grãos de milho;
Validar a metodologia desenvolvida.
25
3 Parte experimental
3.1.1 Materiais
Béquer (50 e 100 mL), balão volumétrico (1 ; 5 e 25 mL), pinça, lã de
vidro, bastão de vidro, seringa de polietileno (5 mL), balão de fundo redondo
(50 mL), pipeta pasteur, micropipetas (10-100 µL e 100-1000 µL), vidro relógio,
espátula, bastão de vidro, almofariz, pistilo, vial (2 e 40 mL), coluna Luna C18(2)
com dimensões (100 mm X 3,0 mm X 2,5 µm) e membrana para filtração (0,22
µm – Nylon).
3.1.2 Reagentes e padrões
Os padrões utilizados dos pesticidas atrazina, ciflutrina, parationa
metílica, teflubenzurom (Fluka, Steinheim, Alemanha), carbofurano e
piraclostrobina (Riedel-de-Haen, Alemanha). Todos os padrões apresentaram
pureza superior a 98%.
Os solventes utilizados foram: acetona, acetonitrila, metanol e n-
hexano grau HPLC foram adquiridos da Tedia (Fairfield, EUA), acetato de etila
e diclorometano grau HPLC (J. T. Barker, EUA); os suportes sólidos foram
Florisil® 100–200 Mesh (J.T.Baker, EUA), alumina neutra (Vetec, Brasil) e Sílica
gel 70-230 Mesh; Silica Flash® G60 (Silicycle, Canadá);
3.1.3 Equipamentos
Liquidificador, balança analítica (Sartotius TE214S), sistema para SPE
Vacuum Manifold (Varian Walnut Creck, CA, EUA), lavadora (Unique),
cromatógrafo líquido de alta eficiência com detector espectrofotométrico com
arranjo de fotodiodos Shimadzu (Quioto, Japão), modelo Prominence, sistema
de ultrapurificação de água Mili-Q.
26
3.1.4 Preparação das soluções padrão
As soluções padrão estoque dos pesticidas foram preparadas
individualmente. Foi medida uma massa entre 9900 a 10000 µg de padrão de
pesticidas e solubilizadas em 10 mL de acetonitrila, resultando em
concentrações entre 990 a 1000 µg mL-1 (atrazina, carbofurano, ciflutrina,
parationa metílica, piraclostrobina e teflubenzurom). As soluções padrão foram
transferidas para vials de 40 mL e armazenadas em freezer. A partir de diluição
das soluções estoque foram preparadas as soluções intermediárias de 50 e 10
µg mL-1. Das soluções intermediárias foram preparadas as soluções de
trabalho com concentrações entre 0,05 – 5,0 µg mL-1 em acetonitrila, as quais
foram utilizadas para a obtenção das curvas analíticas.
3.1.5 Aquisição da amostra
Os grãos de milho verde utilizados foram retirados de duas espigas
envoltas por palha adquiridas no Mercado Central de Aracaju, proveniente da
região de Própria-SE. Os grãos de milho foram cortados, triturados no
liquidificador e, posteriormente, processados em um mixer até obter
consistência pastosa e armazenado em um frasco de vidro sob atmosfera de
nitrogênio. Por fim, o frasco contendo a amostra foi armazenado em um
freezer.
3.1.6 Fortificação da amostra de milho
Para a etapa de fortificação foi pesado 0,5 g em seguida foi
contaminada com de uma solução conjunta dos pesticidas, cuja concentração
50 e 10 µg mL-1. Deixando durante 20 minutos até a evaporação do solvente.
27
3.1.7 Procedimento de preparação da amostra dos pesticidas por dispersão
da matriz em fase sólida
Uma alíquota de 0,5 g de amostra do milho foi medida em um vidro
relógio e transferida para um almofariz. Foi adicionado 1 g de alumina neutra,
homogeneizando durante 5 min o milho juntamente com o suporte sólido. O
material homogeneizado foi transferido para o cartucho, que é composto por
uma pequena camada de lã de vidro, em seguida foi eluída com 10 mL de
acetato de etila para um tubo de ensaio de 15 mL. O tubo de ensaio foi
armazenado no ultrafreezer durante 1 h e transferido para um freezer
permanecendo durante 23 h. Após, o tubo de ensaio foi retirado do freezer
coletando 2 mL do sobrenadante, que posteriormente foi filtrado em uma em
um filtro 0,22 μm e transferido para um balão de 2 mL. Por fim o solvente é
evaporado no nitrogênio para um volume aproximado de 0,1 mL e retomado
em um balão de 1 mL com acetonitrila, em seguida transferido para um vial de
2 mL para ser analisado no CLAE-DAD.
3.1.8 Condições cromatográficas de análise
As condições cromatográficas foram obtidas em cromatógrafo líquido
modelo Prominence da marca Shimadzu composto por um degaseificador
(DGU-20A), sistema binário de bombeamento (LC-6AT), um auto injetor (SIL-
20A), por um forno (CTO-20A), por um módulo comunicação (CBM-20A) e um
detector espectrofotométrico com arranjos de diodos (SPD-M20A). Os analitos
da amostra foram separados usando a coluna cromatográfica Luna C18(2) com
dimensões (100 mm X 3,0 mm X 2,5 µm).
A condição de análise por CLAE-DAD foi realizada utilizando fase
móvel composta por gradiente binário acetonitrila:água, com programação do
gradiente de eluição (Tabela 6) e vazão 0,5 mL min-1. O tempo de análise foi de
40 minutos, com injeção de 20 µL da amostra. Os dados foram tratados através
28
do Software LCSolution e o comprimento de onda selecionado para o estudo
foi de 210 nm.
Tabela 6 - Programação do gradiente binário de eluição em CLAE/DAD.
Tempo (min) Porcentagem de ACN na fase
móvel (%)
0 20
25 80
30 20
40 20
3.1.9 Limpeza do material
A vidraria foi enxaguada em água corrente por três vezes, deixando em
solução de detergente 2% por 24 horas, e realizado um novo enxágue em água
corrente por três vezes, lavado com água destilada e, em seguida, com
acetona, secando em estufa ou a temperatura ambiente, sendo guardado com
as extremidades cobertas com papel filme ou laminado.
4 Resultados e discussão
Para o desenvolvimento do método analítico empregando DMFS e
CLAE/DAD foram inicialmente otimizadas as condições cromatográficas para
análise simultânea dos pesticidas selecionados. Em seguida, no procedimento
por dispersão da matriz em fase sólida foram realizados experimentos para
seleção do suporte sólido e do solvente de eluição.
29
4.1 Otimização das condições cromatográficas de análise
As soluções padrão dos pesticidas foram preparadas individualmente e
analisadas por CLAE-DAD, a fim de obter os tempos de retenção de cada
composto, possibilitando avaliar previamente a separação, e observar os
espectros de absorção dos pesticidas. As concentrações analisadas foram
preparadas de acordo com o LMR dos pesticidas que variaram de 0,05 a 5 µg
mL-1.
As separações analíticas são realizadas utilizando geralmente a fase
C18 [83], a coluna cromatográfica avaliada foi a Luna C18(2) 100 Å. A coluna
cromatográfica Luna possui caráter apolar, por apresentar em sua constituição
C18 [100] os quais, cobrem os grupos silanóis que não estão ligados ao C18,
para minimizar interações com compostos básicos [101].
O gradiente exploratório (Tabela 7) (Figura 4) foi utilizado inicialmente
no processo de otimização das condições cromatográfica [101]. Essa etapa
tem como objetivo de obter: a resposta de cada pesticida frente ao
equipamento e o tempo de retenção para viabilizar análises simultâneas dos
mesmos.
Tabela 7 – Condições analisadas com a coluna cromatográfica Luna C18(2) 100
Å.
Condição Fase móvel Fluxo
(mL min-1
)
Volume de
injeção (µL)
Temperatura
do forno (ºC)
Tempo
(min)
Proporção
de ACN (%)
1 ACN:H2O 0,5 20 45
0 5
60 100
70 5
80 5
30
Figura 4 - Comparação dos cromatogramas de forma individual dos padrões
de pesticidas obtidas com a coluna cromatográfica Luna C18(2) - 100 Å.
1 - carbofurano, 2 - atrazina, 3 - parationa metílica,
4 - piraclostrobina, 5 - teflubenzurom, 6 - ciflutrina
Os pesticidas responderam de forma satisfatória na coluna
cromatográfica Luna C18(2), obtendo separação dos picos cromatográficos. A
partir da análise de uma solução de 5 µg mL-1, foram avaliados os tempos de
retenção de cada composto e o comprimento de onda adequado para análise.
Os tempos de retenção para esta análise foram carbofurano (tr: 19,3), atrazina
(tr: 21,7), parationa metílica (tr: 29,5), piraclostrobina (tr: 37,1), teflubenzurom
(tr: 37,8) e ciflutrina (tr: 36,4). Este último apresentou dois picos
correspondentes aos isômeros do composto [103]. Dos comprimentos de onda
avaliados, o que apresentou melhor resultado foi o de 210 nm, por apresentar
maior intensidade para todos os compostos avaliados.
O carbofurano foi o primeiro composto a ser eluído da coluna
cromatográfica por apresentar uma maior interação com a água, de acordo
com a Tabela 3, quanto menor o valor da constante de partição octanol/água
maior será a tendência do pesticida por compostos hidrofílicos, tal como a
água. A ciflutrina foi o último composto a ser eluído, devido à baixa solubilidade
em água, ou seja, tem uma maior tendência por compostos hidrofílicos.
31
Para avaliar o grau de pureza das soluções padrão foram injetados
padrões individuais de 10 μg mL-1 no intervalo de comprimento de onda ente
200 a 800 nm. Obtendo os seguintes espectros da absorção apresentados na
Figura 5.
32
Figura 5 – Espectros de absorção dos pesticidas.
Pesticidas Espectro de absorção (nm) Pesticidas Espectro de absorção (nm)
Carbofurano
Parationa Metílicaa
Atrazina
Piraclostrobina
33
Teflubenzurom
Ciflutrina
34
Após as injeções individuais foi preparada uma solução conjunta dos
pesticidas, a fim de aprimorar o modo gradiente de eluição. Parâmetros que
influenciam a separação dos analitos foram avaliados, tais como: fase móvel,
fluxo e temperatura. Na Tabela 8 são apresentadas condições avaliadas para
obtenção das melhores condições cromatográficas e na Tabela 9 apresenta os
tempos de retenção dos analitos de acordo com as condições. Sendo a Figura
6 referente aos cromatogramas obtidos em cada condição avaliada.
Tabela 8 – Condições cromatográficas para otimização de método com coluna
cromatográfica Luna C18(2) - 100 Å.
Condição Fase móvel Fluxo
(mL min-1
)
Volume de
injeção (µL)
Temperatura
do forno (ºC)
Tempo
(min)
Proporção de
ACN (%)
2 ACN:H2O 0,5 20 45
0 20
30 80
40 20
50 20
3 ACN:H2O 0,5 20 45
0 20 30 90
40 20
50 20
4 ACN:H2O 0,5 20 45
0 20
25 80
30 20
40 20
5 MeOH:H2O 0,5 20 45
0 20
25 80
30 20
40 20
6 ACN:H2O 0,4 20 45
0 20
25 80
30 20
40 20
7 ACN:H2O 0,6 20 45
0 20
25 80
30 20
40 20
8 ACN:H2O 0,5 20 40
0 20
25 80
30 20
40 20
35
Figura 6 - Cromatogramas da solução conjunta dos padrões de pesticidas
obtidas com a coluna cromatográfica Luna C18(2) - 100 Å.
36
O modo gradiente foi aprimorado testando três condições distintas
(condição 2, 3 e 4), obtendo na condição 4 os melhores tempos de retenção
para os analitos. A condição 4 foi utilizada para comparar com outros
parâmetros de separação, tais como: fase móvel (condição 5), fluxo (condição
6 e 7) e temperatura do forno (condição 8). Quanto à escolha da fase móvel,
foram avaliados acetonitrila/água e metanol/água, sendo observada perda de
sensibilidade dos compostos para este último, permanecendo a utilização da
fase acetonitrila/água.
Em relação ao fluxo foram avaliadas três condições distintas, sendo
elas 0,4; 0,5; 0,6 mL min-1. No cromatograma do fluxo 0,4 mL min-1, a ciflutrina
eluiu no tempo de retorno, o que inviabiliza essa condição. Comparando os
fluxos 0,5 e 0,6 mL min-1 não houve diferença significativa quanto à área dos
analitos, mas em relação ao tempo de retenção dos analitos, observou-se que
no fluxo de 0,6 mL min-1 foi obtida uma análise em menor tempo. Entretanto,
quanto ao tempo de equilíbrio em ambas as condições foi necessário
permanecer com o tempo de 40 minutos, optando assim pelo fluxo de 0,5 mL
min-1, o qual emprega um menor volume de solvente obtendo resultados
similares.
Por fim, foram avaliadas dois níveis de temperatura, sendo elas de 40 e
45 °C. Observou-se uma diferença irrelevante nos tempos de retenção para os
compostos iniciais, sendo eles carbofurano e atrazina. Em relação aos demais
pesticidas, ocorreu uma diferença maior nos tempos de retenção. Desta forma
optou-se em permanecer com a temperatura de 45ºC, pois foi possível realizar
análise em um menor tempo. Este efeito está relacionado à diminuição da
viscosidade [79].
A condição que foi desenvolvida a que apresentou melhor separação
em um menor tempo de análise foi a quatro comparando com os outros
parâmetros. Essa condição desenvolvida foi utilizada para análises posteriores
nos extratos de milho.
37
Tabela 9 - Tempos de retenção dos pesticidas na coluna cromatográfica Luna
C18(2) - 100 Å.
Pesticidas Condição
2 3 4 5 6 7 8
Tempo de Retenção (min)
Carbofurano 10,7 9,9 9,4 13,4 10,8 8,40 9,5
Atrazina 11,8 11,4 10,5 16,1 11,9 9,60 10,7
Parationa metílica 17,9 16,4 14,9 18,2 16,3 13,8 15,3
Piraclostrobina 23,4 21,4 18,7 22,9 20,1 17,8 18,9
Teflubenzurom 24,1 21,9 19,3 25,5 20,6 18,2 19,6
Ciflutrina 30,8 27,8 24,2 27,1 25,8 23,8 24,5
4.2 Otimização do preparo das amostras de milho por dispersão da
matriz em fase sólida
Na técnica de extração por DMFS, o suporte sólido e o solvente de
eluição são parâmetros essenciais que estão diretamente relacionados à
polaridade e solubilidade dos analitos [104], de modo que o isolamento dos
analitos mais polares é realizado com solventes polares e, daqueles menos
polares com os solventes apolares [71].
4.2.1 Seleção do solvente de eluição
Inicialmente foram avaliados na etapa de eluição dois solventes,
acetonitrila e metanol, para extração de pesticidas. Após a realização do
procedimento completo de extração da amostra, os vails foram armazenados
no freezer, observando a presença de um precipitado gelatinoso na
extremidade inferior supostamente o amido, devido ao milho, em sua
constituição, apresentar maior porcentagem do mesmo.
Devido a esse problema, houve a necessidade de acrescentar uma
etapa no procedimento de preparo por DMFS. Na literatura trabalhos relatam a
etapa de congelamento a fim de precipitar carboidratos e lipídeos. Com isso,
38
foram realizados testes com diversos solventes na etapa de eluição
(acetonitrila, acetona, diclorometano, metanol, acetato de etila e n-hexano), e
todos foram armazenados no freezer durante 1, 2 e 3 dias. A separação do
solvente e do amido só teve êxito apenas com acetato de etila ao 3° dia, porém
esse procedimento não seria conveniente pelo longo tempo de extração.
Sendo assim, testes no ultrafreezer foram realizados para acelerar a
precipitação do amido com o solvente de eluição acetato de etila, porém sem
êxito. Por fim, a solução foi colocada inicialmente no ultrafreezer por 1 h para
acelerar a formação do amido. Em seguida, foi transferida para o freezer,
permanecendo durante 23 h. Prosseguiu-se com o processo de extração até a
obtenção da amostra com pouca interferência do amido.
4.2.2 Seleção do suporte sólido
Decidido o solvente de eluição (aceteto de etila), foram realizados
testes com os brancos dos extratos de milho, empregando diferentes suportes
sólidos. Na Figura 7 são apresentados os cromatogramas dos extratos de
grãos de milho obtidos com a utilização dos suportes sólidos alumina neutra,
Florisil e sílica gel, eluindo com 20 mL acetato de etila, utilizando como
proporção da matriz/suporte sólido 0,5:1,0 (g/g).
39
Figura 7 – Cromatogramas obtidos na comparação dos brancos do extrato do
milho obtido com o suporte sólido da alumina neutra, Florisil e sílica gel eluido
com acetato de etila, utilizando a coluna cromatográfica Luna C18(2) - 100 Å,
eluição por gradiente (tabela 8, condição 4), e detecção em 210 nnm.
Avaliando os cromatogramas obtidos dos brancos dos extratos de
milho, foi possível notar que o suporte sólido sílica gel e Florisil eluiram alguns
interferentes no tempo de retenção dos analitos atrazina, piraclostrobina,
teflubenzurom e ciflutrina, enquanto no extrato com a utilização de alumina
neutra não foram notados picos significativos referentes aos componentes da
matriz nos respectivos tempos de retenção dos analitos estudados.
Após a avaliação dos brancos dos suportes sólidos, foram realizados
testes de recuperação utilizando os suportes sólidos alumina neutra, Florisil e
sílica gel, e para avaliar os valores de recuperação, extratos foram preparados
a partir de uma solução padrão de comparação de concentração 1,0 µg g-1. A
Tabela 10 apresenta os valores percentuais de recuperação e os coeficientes
de variação (CV) obtidos para os suportes sólidos avaliados.
40
Tabela 10 – Recuperações médias obtidas na avaliação da eficiência dos
suportes sólidos utilizados na extração dos pesticidas por DMFS.
Pesticidas Suporte Sólido
Recuperações Médias ± CV(%)
Alumina neutra Florisil Sílica gel
Atrazina 98,32 ± 10,85 85,75 ± 8,61 81,71 ± 13,93
Carbofurano 97,64 ± 9,34 62,81 ± 12,80 54,12 ± 6,04
Ciflutrina 95,00 ± 13,88 85,82 ± 7,46 83,51 ± 17,51
Parationa Metilica 93,27 ± 6,19 93,68 ± 3,07 82,59 ± 13,63
Piraclostrobina 96,12 ± 15,28 52,02 ± 11,67 48,42 ± 7,28
Teflubenzurom 94,57 ± 8,85 80,67 ± 6,18 75,87 ± 13,64
Segundo Ribani et. al. [90] para matrizes complexas a faixa de
recuperação aceitável varia entre 70-120% e o coeficiente de variação ± 20%.
Para os resultados obtidos com os diferentes suportes sólidos, o que
apresentou uma melhor faixa de recuperação foi com alumina neutra. Além
disso, esse suporte sólido mostrou uma menor quantidade de interferentes
quando comparado aos demais suportes sólidos e não foi verificada a presença
de interferentes nos tempos de retenção dos analitos. Além de permitir com
que o acetato de etila, que possui uma moderada polaridade consiga eluir os
pesticidas da matriz [105].
Diante dos resultados observados, utilizando 0,5 g de amostra de milho
eluindo com 10 mL de acetato de etila e homogeneizando com 1 g de alumina
neutra proporcionou bons níveis de recuperação, sendo a alumina neutra
escolhida para ser utilizada como material dispersante nos ensaios posteriores
de extração.
4.2.3 Avaliação do efeito da variação do volume do solvente de eluição
O volume do solvente é um dos fatores que influência na recuperação
dos pesticidas no procedimento de extração [68]. Os volumes de eluição
41
avaliados foram 5, 10 e 15 mL de acetato de etila no teste de recuperação,
realizado em triplicata no nível de fortificação de 1 µg g-1. A tabela 11 apresenta
os valores médios de recuperação para os volumes avaliados com acetato de
etila.
Tabela 11 – Recuperações médias obtidas na avaliação da eficiência do
volume utilizado na extração dos pesticidas por DMFS.
Pesticidas Volume (mL)
Recuperações Médias ± CV(%)
5 10 15
Atrazina 70,65 ± 5,31 98,32 ± 10,85 91,22 ± 8,39
Carbofurano 66,64 ± 8,81 97,64 ± 9,34 86,00 ± 4,63
Ciflutrina 73,43 ± 16,85 95,00 ± 13,88 92,65 ± 18,69
Parationa Metilica 69,43 ± 2,68 93,27 ± 6,19 91,41 ± 9,55
Piraclostrobina 57,49 ± 8,20 96,12 ± 15,28 90,08 ± 4,92
Teflubenzurom 62,01 ± 1,54 94,57 ± 8,85 91,97 ± 6,73
Avaliando os volumes observa-se que os valores de 5 mL não
apresentou uma recuperação satisfatória. Já em relação ao volumes de 10 e 15
mL não houve diferenças significativas na recuperação dos pesticidas
analisados (Tabela 10). Desta forma, visando a geração de poucos resíduos,
optou-se em utilizar o volume de 10 mL de acetato de etila nos demais ensaios.
4.2.4 Avaliação do efeito da quantidade de suporte sólido
A quantidade de massa de suporte sólido é outro fator que influência
nas recuperações dos pesticidas no procedimento de extração. As quantidades
avaliadas foram de 0,5; 1,0 e 1,5 g de alumina neutra eluida com 10 mL de
acetato de etila no teste de recuperação realizado em triplicata no nível de
fortificação de 1 µg g-1. A tabela 12 apresenta os valores médios de
recuperação para as massas avaliadas com alumina neutra.
42
Tabela 12 – Recuperações médias obtidas na avalição da eficiência da massa
do suporte sólido utilizando na extração dos pesticidas por DMFS.
Pesticidas Massa do suporte sólido (g)
Recuperações Médias ± CV(%)
0,5 1,0 2,0
Atrazina 82,01 ± 13,69 98,32 ± 10,85 99,54 ± 7,92
Carbofurano 76,99 ± 10,98 97,64 ± 9,34 97,25 ± 6,59
Ciflutrina 65,30 ± 8,31 95,00 ± 13,88 93,70 ± 4,98
Parationa Metilica 69,13 ± 5,89 93,27 ± 6,19 99,43 ± 13,67
Piraclostrobina 68,54 ± 7,35 96,12 ± 15,28 97,874 ± 10,85
Teflubenzurom 71,81 ± 10,55 94,57 ± 8,85 99,09 ± 13,02
Dentre as proporções de massa de suporte sólido avaliada, a melhor
recuperação foi obtida com a razão de 1 para 2 (0,50 g de grão de milho para 1
g de alumina neutra) e 1 para 4 (0,50 g de grão de milho para 2 g de alumina
neutra), os quais apresentaram valores de recuperação entre 93,27- 99,54% e
coeficiente de variação entre 6,19 a 15,28%. Em estudos comparativos em
diversas matrizes realizados por Barker [61], foi sugerida a extração com a
proporção 1 para 4 como sendo a melhor razão de massa de matriz e suporte
sólido. Porém, a massa do suporte sólido escolhida neste trabalho foi de 1,0 g
por obter resultados satisfatórios quanto ao de 2,0 g. A proporção de 1 para 1
(0,50 g de grão de milho para 0,5 g de alumina neutra) apresentou valores de
recuperação insatisfatórios.
4.2.5 Avaliação do efeito do tempo de homogeneização
O tempo de maceração do suporte sólido é outro fator que influencia
nas recuperações dos pesticidas no procedimento de extração, pois irá
influenciar diretamente na interação dos analitos com o material suporte sólido.
O desenvolvimento de uma metodologia com tempo ótimo de extração permite
ao analista a redução do tempo de extração sem a perda de eficiência no
processo de recuperação.
43
Os tempos de homogeneizações avaliados foram 3,0; 5,0 e 7,0 min
utilizando o suporte sólido alumina neutra eluido com 10 mL de acetato de etila.
Sendo realizados ensaios de recuperação em triplicata no nível de fortificação
de 1 µg g-1. A Tabela 12 apresenta os valores médios de recuperação para o
tempo de maceração.
Tabela 13 – Recuperações obtidas na avaliação da eficiência do tempo de
homogeneização utilizado na extração dos pesticidas por DMFS.
Pesticidas Tempo de maceração (min)
Recuperações Médias ± CV(%)
3,0 5,0 7,0
Atrazina 65,65 ± 12,63 98,32 ± 10,85 91,06 ± 8,23
Carbofurano 64,72 ± 16,32 97,64 ± 9,34 93,70 ± 14,67
Ciflutrina 72,19 ± 11,71 95,00 ± 13,88 90,75 ± 10,95
Parationa Metilica 73,40 ± 8,91 93,27 ± 6,19 91,66 ± 7,33
Piraclostrobina 59,19 ± 15,66 96,12 ± 15,28 91,72 ± 4,86
Teflubenzurom 69,82 ± 10,15 94,57 ± 8,85 97,76 ± 8,34
Dentre os ensaios de avaliação o tempo de maceração a proposta pelo
tempo de 3 minutos apresentou os valores mais baixos de recuperação, com
variação de recuperação entre 59,19 – 73,40%, com coeficiente de variação
estando entre 8,91 – 16,32%. Os demais tempos de maceração apresentaram
valores de recuperação semelhantes, contudo, a escolha do tempo de
maceração de 5,0 min apresentou-se mais eficiente, além de demonstrar não
ser necessária a utilização de maceração mais prolongada. A recuperação para
o tempo de maceração variou entre 93,27 – 98,32 %, com variação entre 6,19
– 15,28. Enquanto que o tempo de maceração de 7,0 min apresentou
recuperação entre 90,75 – 97,76, com coeficiente de variação de 4,86 – 14,67
%.
Assim a metodologia otimizada empregou 0,5 g da amostra de milho
eluida com 10 mL de acetato de etila e homogeneizando durante 5 min com 1 g
de alumina neutra.
44
5 Validação do método analítico
No desenvolvimento do método analítico é fundamental garantir a
confiabilidade dos resultados, os quais devem ser representados por
parâmetros estabelecidos na validação. Os parâmetros de validação avaliados
foram: seletividade, limite de detecção, limite de quantificação, exatidão e
precisão.
5.1 Seletividade
Para avaliar a seletividade foi realizada a injeção de um branco obtido da
matriz, observando na região do tempo de retenção dos analitos de interesse a
presença de algum pico interferente (Ribani et. al. [90]).
Dessa forma a metodologia desenvolvida mostrou-se seletiva para os
pesticidas carbofurano, atrazina, parationa metílica, teflubenzurom, ciflutrina e
piraclostrobina, não sendo observadas interferentes no tempo de retenção dos
pesticidas avaliados. Comparando o cromatograma (Figura 8) obtido do branco
da amostra (livres de pesticidas) com uma solução padrão de concentração de
5 μg mL-1 avaliou a seletividade dos analitos no milho.
Figura 8 – Cromatograma resultante da análise por CL-DAD da solução padrão
5 μg mL-1 e do branco do extrato do milho.
45
5.2 Linearidade
A curva analítica foi construída utilizando 7 níveis de concentração
entre 0,05 e 5 µg mL-1 para atrazina, parationa metílica, teflubenzurom e
cifltrina, já para o carbofurano e piraclostrobina a construção foi entre 0,1 e 1
µg mL-1. As análises para cada nível de concentração foi realizada triplicata. A
Tabela 14 mostra as curvas obtidas da equação da reta, o coeficiente de
correlação.
Tabela 14 – Valores dos coeficientes de correlação e equação da reta dos
pesticidas.
Pesticidas Coeficiente de correlação (r) Equação da reta
Carbofurano 0,9996 y = 12838 x – 288,51
Atrazina 0,9999 y = 40851 x – 104,9
Parationa metílica 0,9999 y = 24707 x – 535,44
Piraclostrobina 0,9997 y = 19990 x – 422,63
Teflubenzurom 0,9998 y = 44317 x – 165,78
Ciflutrina 0,9996 y = 15777x – 374,3
5.3 Limite de quantificação e detecção
Para o estudo do limite de detecção (LD) foi calculado considerando o
desvio padrão do ruído analítico de 2:1. Enquanto o limite de quantificação (LQ)
foi obtido pelos valores da razão sinal ruído 10:1. Os valores obtidos para LQ
foram próximos ao menor nível de concentração obtido na curva de calibração,
considerando assim a menor concentração. Para análises de ambos os limites
foram realizados experimentos em triplicata. A Tabela 15 mostra os valores de
LD e LQ.
46
Tabela 15 – Valores do Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
obtidos por CLAE-DAD.
Pesticida LD (mg Kg-1) LQ (mg Kg-1) LMR (mg Kg-1)
Carbofurano 0,04 0,1 0,25
Atrazina 0,02 0,05 0,1
Parationa Metílica 0,02 0,05 0,1
Piraclostrobina 0,06 0,1 0,1
Teflubenzurom 0,03 0,05 0,1
Ciflutrina 0,02 0,05 0,1
O limite máximo de resíduo (LMR) dos analitos em estudo deve ser
levado em consideração. Os valores encontrados no LD foram comparados
com o LMR segundo a ANVISA. Os níveis de concentração avaliados no
presente trabalho foram: 0,04; 0,02; 0,02; 0,06; 0,03; 0,02 mg Kg-1, todos eles
estão abaixo dos valores estabelecidos pela ANVISA.
5.4 Precisão e Exatidão
Para avaliação da exatidão foram injetadas amostras em triplicata de
concentração de 0,10; 0,25 e 0,50 μg g-1, durante 3 dias consecutivos. A
Tabela 16 mostra as recuperações obtidas para o nível de fortificação de 0,1 μg
g-1com variação média de 81,57 a 98,35 %, com CV médio entre 5,19 a 16,23
%. Para o nível de fortificação de 0,25 μg g-1 as recuperações apresentaram
variação média de 75,20 a 92,85 %, com CV médio entre 4,16 a 10,74 %. Para
o nível de fortificação de concentração de 0,50 μg g-1, as recuperações
apresentaram variação média de 78,42 a 96,39 %, com CV médio entre 1,76 a
9,61 %.
47
Tabela 16 – Recuperações obtidas para o nível de fortificação de 0,10; 0,25 e
0,50 μg g-1.
Pesticida Fortificação de
0,10 mg mL-1
Fortificação de
0,25 mg mL-1
Fortificação de 0,50 mg mL-1
Recuperação ±
C.V (%)
Recuperação ±
C.V (%)
Recuperação ± C.V
(%)
Carbofurano 85,16 ± 12,11 87,95 ± 4,16 93,85 ± 9,61
Atrazina 98,35 ± 11,20 92,14 ± 10,74 78,42 ± 5,46
Parationa Metílica
84,32 ± 10,68 81,34 ± 8,22 96,37 ± 2,62
Piraclostrobina 90,98 ± 16,23 92,85 ± 5,98 89,95 ± 1,76
Teflubenzurom 81,57 ± 8,68 87,04 ± 3,63 90,65 ± 6,57
Ciflutrina 90,39 ± 5,19 75,20 ± 7,29 96,39 ± 8,49
48
6 Conclusão
Neste trabalho foi otimizada e validada a metodologia por dispersão da
matriz em fase sólida (DMFS) empregando-se CLAE-DAD para determinação
de resíduos de pesticidas atrazina, carbofurano, ciflutrina, parationa metílica,
piraclostrobina, teflubezurom em grãos de milho.
O método proposto por dispersão da matriz em fase sólida (DMFS),
empregando 0,5 g de alumina neutra como suporte sólido e 10 mL de acetato
de etila homogeneizando por um período de 5 min mostrou-se eficiente para
extrair os pesticidas em grãos de milho. Além disso, as condições
cromatográficas de análise aplicadas permitiram a obtenção de bons resultados
de separação dos compostos em estudo.
A validação do método apresentou recuperações entre 93,27 a 98,32% e
coeficiente de variação inferior a 20%. Os limites de detecção variaram entre
0,02 a 0,06 µg g-1 e quantificação 0,05 a 0,1 µg g-1. Foi averiguada a
linearidade através do coeficiente de correlação superior a 0,9996. Assim,
também como a seletividade para os pesticidas estudados na matriz do milho.
49
7 Referências
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