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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA DE RECURSOS NATURAIS

PROPAGAÇÃO E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE

ACESSOS DE JENIPAPEIRO

CAMILA SANTOS ALMEIDA

SÃO CRISTOVÃO-SE 2013

CAMILA SANTOS ALMEIDA

PROPAGAÇÃO E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE ACESSOS

DE JENIPAPEIRO

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação

em Biotecnologia da Universidade Federal de Sergipe

como requesito parcial à obtenção do título de Mestre

em Biotecnologia na área de concentração Biotecnologia

em Recursos Naturais.

Orientadora

Dra. Ana da Silva Lédo

SÃO CRISTÓVÃO

SERGIPE - BRASIL

2013

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

A447p

Almeida, Camila Santos Propagação e conservação in vitro de acessos de jenipapeiro /

Camila Santos Almeida ; orientadora Ana da Silva Lédo. – São Cristóvão, 2013.

70 f. : il. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de Recursos Naturais)

– Universidade Federal de Sergipe, 2013.

1. Biotecnologia. 2. Genipa americana L. - Conservação. 3. Propragação. 4. Cultura de tecidos. I. Lédo, Ana da Silva, orient. II. Título.

CDU 606:582.936.1

À minha família e a Rodrigo

por todo amor, apoio e incentivo

Dedico

Agradecimentos especiais

A Deus por estar sempre comigo, me guiando e abençoando.

Aos meus pais, Lindinalva e Orlando, pelas oportunidades e por serem os meus maiores

exemplos de vida, amor e dignidade.

Às minhas irmãs, Lorena e Thaís, companheiras de todas as horas, pela alegria e carinho e

ao meu irmãozinho, Orlandinho, que chegou inesperadamente trazendo amor e alegria para

a vida de toda a minha família.

A Rodrigo por toda a nossa história e companheirismo manifestados em todos esses anos,

me apoiando e incentivando em todas as horas difíceis e felizes da minha vida.

Aos meus avós, Antônia e Antônio (in memorian) por todo apoio, torcida e carinho.

A todos os meus tios e primos que torceram para o meu sucesso.

À Nathy e a Lú pelo carinho e atenção que sempre me deram e por fazerem parte da minha

família.

A família Pereira, em especial aos meus sogros, por me receberem com todo carinho e por

me tornarem parte de sua família.

Aos meus amigos do Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Tabuleiros Costeiros,

Jaci, Edmário, Milena, Inácio, Kícia, Zilná, Franci, Catrine e Carol, pela amizade, boa

vontade, momentos de descontração, espírito cooperativo, apoio e torcida. Obrigado a cada

um de vocês!

Aos meus amigos da graduação, Nanda, Sylvinha, Rosana, Alisson, pela atenção,

preocupação e por sempre estarem ao meu lado.

Aos meus amigos, Ruca, Leko, Adynha, Paty, Sandra e Mab Leite, pela amizade dedicada

todo esse tempo.

À Dra. Ana Lédo da Silva, pela confiança e credibilidade e preciosas contribuições e

incentivo à realização deste trabalho

Dra. Ana Veruska Cruz da Silva, pela boa vontade em participar da banca examinadora e

por ter me dado às primeiras oportunidades ainda no período da graduação.

À Dra. Aparecida Gomes de Araujo, pela boa vontade em participar da banca examinadora

e pela amizade, sugestões científicas e ensinamentos.

A Embrapa Tabuleiros Costeiros.

A CAPES pela concessão de bolsas.

A Universidade Federal de Sergipe pelas oportunidades.

A todos aqueles que contribuíram para a realização deste trabalho, o meu sincero

agradecimento.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS i

LISTA DE FIGURAS ii

LISTA DE TABELAS iv

LISTA DE ANEXOS vi

RESUMO vii

ABSTRACT viii

1. INTRODUÇÃO 01

2. REFERENCIAL TEÓRICO 02

2.1. Origem, ocorrência, botânica e importância do jenipapeiro 02

2.2. Recursos genéticos vegetais 04

2.3. Conservação in vitro de recursos genéticos 06

2.4. Propagação in vitro 09

2.4.1. Germinação in vitro de jenipapeiro 09

2.4.2. Embriogênese somática 11

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

13

CAPITULO 1: CONSERVAÇÃO IN VITRO POR CRESCIMENTO LENTO DE

JENIPAPEIRO

19

RESUMO 19

ABSTRACT 20

1. INTRODUÇÃO 21

2. MATERIAL E MÉTODOS 22

2.1. Material vegetal 22

2.2. Condições de cultivo 22

2.3. Conservação in vitro de acessos de jenipapeiro 22

2.3.1. Efeito do manitol na redução do crescimento in vitro de acessos de jenipapeiro 22

2.3.2. Efeito do ácido abscísico na redução do crescimento in vitro de acessos de

jenipapeiro

23

2.3.3. Efeito da concentração de sais MS e da sacarose na redução do crescimento in

vitro de acessos de jenipapeiro

23

2.4. Retomada do crescimento in vitro 23

2.4.1. Retomada do crescimento in vitro do acesso CZA proveniente de meio de

conservação com manitol

23


conservação com ABA

23


conservação com variações de sacarose e sais do meio MS

24

2.5. Avaliação dos experimentos 24

2.6. Delineamentos experimentais e análises estatísticas 25

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 26

3.1. Conservação in vitro de acessos de jenipapeiro 26

3.1.1. Efeito do manitol no crescimento in vitro de acessos de jenipapeiro 26

3.1.2. Efeito do ácido abscísico (ABA) no crescimento in vitro de acessos de

jenipapeiro

31

3.1.3. Efeito da concentração de sais MS e da sacarose no crescimento in vitro de

acessos de jenipapeiro

33

3.2. Retomada do crescimento in vitro 35



35



38



41

4. CONCLUSÕES 44


45

CAPITULO 2: EFEITO DO MEIO DE CULTURA NA GERMINAÇÃO IN VITRO

JENIPAPEIRO

47

RESUMO 47

ABSTRACT 48

1. INTRODUÇÃO 49



4. CONCLUSÕES 53


53

CAPITULO 3: INDUÇÃO DE EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM JENIPAPEIRO 55

RESUMO 55

ABSTRACT 56

1. INTRODUÇÃO 57


2.1. Material vegetal 58

2.2. Condições de cultivo 58

2.3. Indução de embriogênese somática in vitro de jenipapeiro 58

2.4. Avaliação do experimento 59

2.5. Delineamento experimental e análises estatísticas 59


4. CONCLUSÕES 66

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66

ANEXOS 68

i

LISTA DE ABREVIATURAS

ABA Ácido abscísico

ANA Ácido naftalenoacético

BAP 6- benzilaminopurina

BAG Banco Ativo de Germoplasma

CZA Acesso de jenipapeiro Cruz das Almas

OT1 Acesso de jenipapeiro Oiteiros

SIR Acesso de jenipapeiro Siriri

MS Meio de cultura estabelecido por Murashige e Skoog (1962)

½MS Metade da concentração de sais do meio MS

¼MS Um quarto da concentração de sais do meio MS

2,4- D

Ácido 2,4- diclorofenoxiacético

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Escala de notas para avaliação da viabilidade de plântulas de jenipapeiro sob condições de crescimento lento

25

Figura 2 Número de folhas viáveis em plântulas do acesso CZA em função da concentração de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro

26

Figura 3 Número de folhas viáveis em plântulas do acesso CZA em função do tempo de cultivo in vitro na presença de manitol

27

Figura 4 Comprimento da parte aérea em plântulas do acesso CZA em função da concentração de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro

27

Figura 5 Comprimento da parte aérea em plântulas do acesso CZA em função do tempo de cultivo in vitro na presença de manitol

28

Figura 6 Número de folhas com abscisão em plântulas do acesso CZA em função da concentração de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro

29

Figura 7 Número de folhas com abscisão em plântulas do acesso CZA em função do tempo de cultivo in vitro na presença de manitol

30

Figura 8 Viabilidade em plântulas de jenipapeiro do acesso CZA em função da concentração de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro

30

Figura 9 Viabilidade em plântulas do acesso CZA em função do tempo de cultivo in vitro na presença de manitol

31

Figura 10 Número de folhas em plântulas do acesso CZA em função da concentração de ácido abscísico aos 150 dias de cultivo in vitro

32

Figura 11 Número de folhas com abscisão em plântulas do acesso CZA em função da concentração de ácido abscísico aos 150 dias de cultivo in vitro

33

Figura 12 Porcentagem de resposta morfogenética de explantes acesso CZA (meio de retomada de crescimento) em função da concentração de manitol (meio de conservação)

36

Figura 13 Resposta morfogenética de explantes do acesso CZA na presença de manitol (meio de conservação) e na A- ausência de BAP e B- presença de 1 mg L-1 de BAP (meio de retomada de crescimento)

37

iii

Figura 14 Resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA, na presença de ABA (meio de conservação) e na ausência de BAP (A) e presença de 1 mg L-1 de BAP (B) (meio de retomada de crescimento)

40

Figura 15 Resposta morfogenética de explantes do acesso CZA em meio com redução de sais MS (meio de conservação) e na A- ausência de BAP B- presença de 1 mg L-1 de BAP (meio de retomada do crescimento)

44

Figura 16 Germinação in vitro do acesso OIT, aos 120 dias, nos meios T1: Meio MS + 30 g L-1 de sacarose; T2: MS + 15 g L-1 de sacarose; T3: ½ MS + 30 g L-1 de sacarose; T4: ½ MS + 15 g L-1 de sacarose e T5: Água + 6,0 g L-1 de ágar

52

Figura 17 Porcentagem de plântulas normais (PPN) do acesso OIT em função do tempo de cultivo in vitro

53

Figura 18 Porcentagem de resposta morfogenética de explantes do acesso SIR em função da concentração de 2,4-D aos 120 dias de cultura in vitro. A- explante foliar; B-segmento caulinar

60

Figura 19 Porcentagem de resposta morfogenética de explantes do acesso SIR em função da concentração de BAP aos 120 dias de cultura in vitro. A- explante foliar; B- explante caulinar

62

Figura 20 Respostas morfogenéticas de explantes foliares (A-calogênese e B-organogênese indireta) e caulinares (C- calogênese e D- organogêsene direta) do acesso SIR na presença de 2,4-D e BAP

65

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), número de folhas com abscisão (NFA) e viabilidade da cultura (VIB) de plântulas do acesso CZA em diferentes concentrações de sais MS e de sacarose

34

Tabela 2 Número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), número de folhas com abscisão (NFA) e viabilidade da cultura (VIB) de plântulas do acesso CZA em função do tempo de cultivo in vitro em diferentes concentrações de sais e sacarose

35

Tabela 3 Porcentagem da resposta morfogenética de explantes do acesso CZA em função da presença ou ausência de BAP (meio de retomada do crescimento)

37

Tabela 4 Valores médios da resposta morfogenética de explantes acesso CZA em função do tipo de explante e da presença e ausência de BAP (meio de retomada de crescimento) e do meio de conservação

38

Tabela 5 Porcentagem da resposta morfogenética de tipos de explantes do acesso CZA (meio de retomada de crescimento) na presença de ABA (meio de conservação)

39

Tabela 6 Porcentagem da resposta morfogenética de explantes do acesso CZA em função do ABA (meio de conservação) e do BAP (meio de retomada de crescimento)

40

Tabela 7 Valores médios da resposta morfogenética de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA em função do tipo de explante e da presença e ausência de BAP (meio de retomada de crescimento) e do meio de conservação

41

Tabela 8 Porcentagem da resposta morfogenética de explantes do acesso CZA em função do meio de conservação e da presença ou ausência de BAP (meio de retomada do crescimento)

42

Tabela 9 Valores médios da resposta morfogenética do acesso CZA em função do tipo de explante, da presença e ausência de BAP (meio de retomada do crescimento) e do meio de conservação

43

Tabela 10

Porcentagem de plântulas normais do acesso OIT em diferentes meios de cultura aos 120 dias de cultivo in vitro

51

v

Tabela 11 Comprimento da parte aérea (CPA) de plântulas do acesso OIT em diferentes meios de cultura aos 120 dias de cultivo in vitro

51

Tabela 12 Porcentagem de resposta morfogenética de expantes do acesso SIR em função do tipo de explante e da concentração de 2,4-D

61

Tabela 13 Valores médios da porcentagem de resposta morfogenética de explantes do acesso SIR em função do tipo de explante e da concentração de BAP

63

Tabela 14 Valores médios da porcentagem de resposta organogenética de explantes foliares e caulinares do acesso SIR na ausência e na presença de BAP e 2,4-D aos 120 dias de cultivo

64

vi

LISTA DE ANEXOS

Anexo A Anexo B Anexo C Anexo D Anexo E Anexo F Anexo G Anexo H Anexo I

Resumo do quadro de análise de variância do efeito do manitol e tempo de cultivo in vitro (Tempo) no número de folhas (NF), no comprimento do ponto de início da radícula até a inserção do primeiro par de folhas (PPF), no número de folhas caídas (NFC) e vigor de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA Resumo do quadro de análise de variância do efeito do ácido abscísico (ABA) e do tempo de cultivo in vitro (Tempo) no número de folhas (NF), no comprimento do ponto de início da radícula até a inserção do primeiro par de folhas (PPF), no número de folhas caídas (NFC) e vigor de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA Resumo do quadro de análise de variância do efeito de variações de sais do meio MS e sacarose (MC) e do tempo de cultivo in vitro (Tempo) no número de folhas (NF), no comprimento do ponto de início da radícula até a inserção do primeiro par de folhas (PPF), no número de folhas caídas (NFC) e vigor de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA Resumo do quadro de análise de variância da resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA na retomada do crescimento em função da concentração de manitol (MC), do BAP e do tipo de explante Resumo do quadro de análise de variância da resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA na retomada do crescimento em função da concentração do ABA (MC), do BAP e do tipo de explante Resumo do quadro de análise de variância da resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA na retomada do crescimento em função de variações de sais do meio MS e sacarose (MC), do BAP e do tipo de explante

Resumo do quadro de análise de variância da porcentagem de plântulas normais de jenipapeiro (PPN%) do acesso OIT na germinação in vitro em função de variações de sais do meio MS e sacarose (MC) e do tempo Resumo do quadro de análise de variância do comprimento da parte aérea (CPA) do acesso OIT na germinação in vitro em função de variações de sais do meio MS e sacarose (MC) aos120 dias Resumo do quadro de análise de variância da porcentagem de explantes de jenipapeiro do acesso SIR com resposta morfogenética (PRM) em função de diferentes concentrações de BAP e 2,4-D e do tipo de explante

68 68 68 69 69 69 70 70 70

vii

ALMEIDA, Camila Santos. PROPAGAÇÃO E CONSERVAÇÃO IN VITRO DE ACESSOS DE JENIPAPEIRO. 2013. 70p. (Dissertação – Mestrado em Biotecnologia em Recursos Naturais). Universidade Federal de Sergipe, São

Cristóvão, SE.

RESUMO

O jenipapeiro tem grande importância econômica tanto pela sua essência florestal, quanto pela produção de alimentos. A obtenção de protocolos de conservação é importante para a preservação de recursos genéticos. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer protocolos de conservação in vitro de jenipapeiro, além de estudos do efeito de diferentes meios de cultura na germinação in vitro de sementes dessa espécie e do efeito de diferentes meios de cultura na indução da embriogênese somática. Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros Costeiros, SE e foram utilizadas sementes de plantas matrizes de jenipapeiro provenientes de Cruz das Almas- BA; Povoado Oiteiros- SE e Povoado Siriri- SE. No experimento de conservação foram testadas diferentes concentrações de manitol- ensaio 1; de ABA- ensaio 2; e variações do meio MS e sacarose- ensaio 3. Após 150 dias, as plântulas provenientes do meio de conservação, foram segmentadas e inoculados em meio de regeneração (MS gelificado suplementado com 30 g L-1 de sacarose, BAP (0 e 1 mg L-1) e 4,5 g L-1 de Phytagel®). Para o experimento de germinação foram testadas água destilada e diferentes variações de sais MS e sacarose. Para o experimento da embriogênese somática, plântulas com 90 dias de cultivo in vitro foram segmentadas e transferidas para um novo meio MS suplementado com 30 g L-1 de sacarose e diferentes concentrações de 2,4- Diclorofenoxiacético- 2,4-D (0; 4 e 8 mg L-1) combinadas com quatro concentrações de benzilaminopurina-BAP (0; 1; 2 e 3 mg L-1). Na etapa de conservação, o manitol nas concentrações estudadas não promoveu desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro, enquanto, o ácido abscísico promoveu a redução do número de folhas. Os meios MS e ½ da concentração de sais MS na presença de 30 g L-1 de sacarose promoveram a desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro, podendo ser recomendados para protocolos de conservação por crescimento lento. Os explantes provenientes do meio de conservação contendo manitol e ácido abscísico mantidos na presença de 1,0 mg L-1 de BAP na fase de retomada, apresentaram maior resposta morfogenética. Os explantes mantidos na fase de conservação na presença de meio MS + 30 g L-1 de sacarose e ½ MS com 15 ou 30 g L-1 de sacarose, apresentaram menor resposta morfogenética na ausência de BAP quando comparado com os demais tratamentos. Na etapa de germinação in vitro, observou-se que na ausência de sais e de sacarose houve maior porcentagem de plântulas normais e menor comprimento da parte aérea. Na etapa da embriogênese somática, a presença de 2,4-D, promoveu maior porcentagem de explantes com resposta morfogenética. O segmento caulinar promoveu maior resposta que o segmento foliar na ausência e na concentração 4 mg L-1 de 2,4-D. Além disso, a presença de BAP induziu menor resposta dessa variável para o explante caulinar e maior resposta para o explante foliar.

Palavras-chave: Genipa americana L.; crescimento mínimo; cultura de tecidos.

Comitê Orientador: Dra. Ana da Silva Lédo – Embrapa Tabuleiros Costeiros/BIOTEC-UFS (Orientadora)

viii

ALMEIDA, Camila Santos. IN VITRO PROPAGATION AND CONSERVATION OF

GENIPA ACCESSIONS. 2013. 71p. (Dissertation – Master in Biotechnology).

Federal University of Sergipe, São Cristóvão, SE.

ABSTRACT

The jenipapeiro (Genipa americana L.) has great economic importance both for its forest

essence, as the production of food. Obtaining protocols is important for conservation of

genetic resources conservation. The objectives of this study was to establish protocols for in

vitro conservation jenipapeiro, and studies of the effect of different culture media on in vitro

germination of seeds of this species and the effects of different culture media on the

induction of somatic embryogenesis from explants of this culture. The experiments were

conducted in the laboratory of Plant Tissue Culture Embrapa Coastal Tablelands, SE. To

study the in vitro conservation of plant seeds were used arrays jenipapeiro from Cruz das

Almas, Bahia; access Oiteiros, Sergipe and access Siriri, Sergipe. In the experiment of

conservation tested different concentrations of mannitol - Test 1; ABA- Test 2, and variations

of the MS and sucrose- test 3. After 150 days, the seedlings from the means of conservation,

targeted and were inoculated on regeneration medium (MS gelled supplemented with 30 g L-

1 sucrose, BAP (0 and 1 mg L-1) and 4,5 g L-1 Phytagel ®). For the germination experiment

tested distilled water and different variations of MS salts and sucrose. For the experiment of

somatic embryogenesis, seedling 90 days in vitro culture were segmented and transferred to

a new MS medium supplemented with 30 g L-1 sucrose and different concentrations of 2,4 -

2,4-D-Dichlorofenoxyacetic (0 , 4 and 8 mg L-1) combined with concentrations of four-

benzylaminopurine (BAP 0, 1, 2 and 3 mg L-1). In the stage of conservation, mannitol

concentrations studied did not promote growth slowdown seedlings jenipapeiro, while,

abscisic acid caused a reduction in the number of leaves. The means MS and ½ MS salt

concentration in the presence of 30 g L-1 sucrose promoted slowing the growth of seedlings

jenipapeiro can be recommended protocols for conservation by slow growth. The explants

from the storage medium containing mannitol and maintained abscisic acid in the presence

of 1,0 mg L-1 BAP phase of resumption showed higher morphogenetic response. Explants

kept in storage phase in the presence of MS medium + 30 g L-1 sucrose and ½ MS 15 or 30

g L-1 sucrose, had lower morphogenetic response in the absence of BAP compared with the

other treatments. In the stage of germination in vitro, it was observed that in the absence of

salts and sucrose was highest percentage of normal seedlings and lowest shoot length. In

the stage of somatic embryogenesis, the presence of 2,4-D, promoted greater percentage of

explants with morphogenetic response. The shoot segments promoted greater response

than the foliar concentration in the absence and 4 mg L-1 2,4-D. Furthermore, the presence

of BAP induced reduced response to this variable stem explants and greater response to

foliar explants.

Keywords: Genipa americana L.; minimal growth; tissue culture.

Guidance Comittee: Dra. Ana da Silva Lédo – Embrapa Coastal Tablelands/BIOTEC-UFS (Major professor)

1

1. INTRODUÇÃO

O jenipapeiro (Genipa americana L.) é uma frutífera que desperta grande interesse

econômico, tanto pela comercialização dos seus frutos que possuem diversas utilizações

(medicinal, alimentícios, cosmética, industrialização) quanto por suas características

madeireiras, utilizadas nas construções naval e civil. Essa espécie vem sendo explorada de

forma irregular, sem nenhuma medida de preservação, e é encontrada vegetando

espontaneamente em Sergipe, principalmente em áreas de Tabuleiros Costeiros e zona de

transição, onde sua preservação in situ vem sofrendo acelerado processo de erosão

genética decorrente da expansão de áreas para cultivo de outras espécies agrícolas e

pastagens.

No Brasil, essa espécie está distribuída espontaneamente em todas as regiões,

ocupando uma maior área no Nordeste. Devido a multiplicidade de usos, o jenipapeiro tem

despertado o interesse de pesquisadores e já é considerada uma frutífera entre as dez

espécies selecionadas como de altíssima prioridade pelo programa Plantas do Futuro do

CNPq/World Bank/GEF/MMA/Probio.

A Embrapa Tabuleiros Costeiros, juntamente à plataforma de recursos genéticos da

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária vem intensificando ações de coleta,

caracterização e conservação de germoplasma de Jenipapeiro no estado de Sergipe e em

outros estados do país. Encontra-se em fase de enriquecimento no campo experimental de

Nossa Senhora das Dores, Sergipe, um Banco Ativo de Germoplasma de jenipapeiro. Nesse

sentido, a aplicação de técnicas de cultura de tecidos de plantas como estratégia

complementar à conservação da variabilidade genética existente e para acelerar a

multiplicação de genótipos promissores tornam-se imprescindíveis, especialmente para

espécies que não podem ter suas sementes conservadas a baixa temperatura e umidade,

como as do jenipapeiro.

A conservação in vitro por crescimento lento vem sendo utilizada com sucesso em

muitas espécies com o intuito de se manter um grande número de acessos em um espaço

reduzido, sem influência das intempéries, reduzindo o metabolismo da planta sem, no

entanto, afetar a sua viabilidade, preservando as suas características genéticas e

contribuindo com o intercâmbio de germoplasma.

O presente trabalho teve como objetivo estabelecer protocolos de conservação in vitro

de jenipapeiro, além de estudos do efeito de diferentes meios de cultura na germinação in

vitro de sementes dessa espécie e do efeito de diferentes meios de cultura na indução da

embriogênese somática.

2

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. Origem, ocorrência, botânica e importância do jenipapeiro

Genipa americana L. é uma espécie pré-colombiana com origem no norte da América

do Sul, sendo também encontrada na Ámerica Central, nas Antilhas e no México (SOUZA et

al., 1996). Há indicações que o Brasil, a Ámerica Tropical, Porto Rico e a Índia são as

regiões de origem dessa espécie (XAVIER; XAVIER, 1976), onde aparece tanto sob cultivo

quanto em estado espontâneo. Ocorre em áreas com florestas abertas e de vegetação

secundária de várzeas situadas em locais temporário ou permanentemente inundados. Com

ampla distribuição pelas regiões tropicais úmidas e subtropicais da América Latina desde o

México até a Argentina, a espécie parece desenvolver-se melhor em áreas com

pluviosidade entre 1.200 a 4.000 mm e com temperaturas médias anuais entre 18 e 28°C.

No Brasil, vai do Amapá até os estados da região Sul (FAO, 1986; LORENZI, 1992).

O jenipapeiro pertence a família Rubiaceae, gênero Genipa, sendo também conhecida

popularmente como jenipa, jenipapinho, janipaba, janapabeiro, janipapo e janipapeiro

(LORENZI, 1992). Caracteriza-se como uma planta de porte arbóreo de 10 a 12 m de altura,

podendo alcançar 20 m de altura, caule reto de 60 cm de diâmetro, copa grande e

arredondada com ramos numerosos e fortes, sempre glabros, de casca lisa, espessa,

cinzento esverdeada e com manchas cinzas mais claras (BAHIA, 2012; CORREA, 1969;

CARVALHO, 1994; ESTRELLA,1995). As folhas são simples, opostas, pecioladas, e glabras

em ambas as faces, medindo de 20 a 42 cm de comprimento e de 9 a 16 cm de largura. As

inflorescências apresentam um aroma característico, ocorrem em rácimos axilares ou

terminais, com flores hermafroditas amarelo-ouro contendo 5 pétalas (PRANCE, 1975). Os

frutos são do tipo baga ovoide ou sub-globosa, medindo de 8 a 10 cm de comprimento e 6 a

7 cm de diâmetro; quando maduros apresentam casca mole, parda ou pardacento-

amarelada, cinzenta ou marrom, membranosa, fina e enrugada (CARVALHO,1994;

CORREA, 1969). A polpa é suculenta, adocicada e perfumada, com aroma característico

muito pronunciado, contendo numerosas sementes compridas, cinzento-escuras medindo

de 6 a 12 mm (POPENOE, 1974; PRANCE, 1975; SANTOS, 1978).

A primeira produção de frutos ocorre por volta dos seis anos após o plantio e os frutos

são colhidos diretamente na árvore ou no chão. O ponto de maturidade é percebido quando

o fruto muda da coloração verde para marrom. Uma árvore de 15 a 20 anos pode produzir

entre 400 a 600 frutos por colheita (BTFP, 2005).

A casca e o fruto verde de jenipapo produz, por oxidação, um corante azul escuro

solúvel em água e etanol (PENALBER et al., 1996). Apesar de haver relatos na literatura do

3

uso de jenipapo como fonte de corante azul, esse processo nunca foi explorado em relação

à sua viabilidade técnica, às melhores condições de extração e à coloração obtida (RENHE

et al., 2009).

Alguns autores supõem que existam muitas variedades de jenipapeiro (GOMES, 1989;

SANTOS, 1978). Segundo Bahia (2012), os seguintes tipos são conhecidos: jenipapo

grande, jenipapo médio e jenipapo pequeno; jenipapo com semente, jenipapo sem semente;

jenipapeiro semperflorens, jenipapo macho; jenipapo feminino. Há relatos que exista

também a variedade Caruto (Genipa caruto HBK), na Guiana e em outros países,

(CORREA, 1969) e a Genipa infudibuliformis, conhecido como jenipapeiro liso, no Espírito

Santo e no sul da Bahia, na mata pluvial atlântica de tabuleiro (LORENZI, 1992).

Por ser muito rústico, o jenipapeiro é pouco exigente, adapta-se a tipos variados de

solo, porém se desenvolve bem em solos permeáveis, profundos, bem drenados, areno-

argilosos, com pH 6,0 a 6,5 (GOMES, 1989). Adapta-se muito bem ao clima tropical, não

existindo restrições quanto a altas temperaturas, no entanto, não é recomendável o plantio

onde o inverno seja rigoroso e onde ocorra geada (XAVIER & XAVIER, 1976). A propagação

de jenipapo é realizada via sementes e vegetativamente por enxertia por borbulhia e

garfagem (CARVALHO, 1994; DANTAS et al., 2009; BAHIA, 2012).

A exploração dessa espécie é predominantemente extrativista, feita por pequenos

agricultores tradicionais e proprietários da terra, sem tecnologia e tratos culturais,

garantindo, assim, empregos no mercado informal. Ainda se desconhece, no Brasil, a

existência de pomares comerciais registrados desta frutífera (ROCHA, 2006; DANTAS et al.,

2009).

A Genipa americana L. é uma espécie de importância econômica, utilizada como

essência florestal, como produtora de alimentos e ainda serve de alimento para animais em

zonas tropicais da fauna brasileira (BAHIA, 2012). Apresenta grande demanda por parte do

mercado de frutas frescas, por se tratar de uma fruta saborosa, de baixa perecibilidade e

com excelentes qualidades nutricionais. Seus frutos são explorados no Estado Sergipe para

comercialização, principalmente para o consumo in natura (SANTOS et al., 2007). Nas

folhas são encontradas substâncias, como o ácido geniposídico e outros princípios ativos,

que inibem in vitro, tumores provocados por alguns tipos de vírus (SUZUKI et al., 2001).

Essa espécie pode ser usada na arborização urbana e é também uma boa opção para

pequenos agricultores, tanto pela madeira como pelos frutos de valor comercial (COSTA et

al., 2005). Sua madeira é amplamente usada em decorações de interiores e exteriores, na

fabricação de tacos de bilhar, formas de sapatos, fabricação de cabos de enxada, foice, nas

construções civil e naval, e marcenaria. Seu fruto, quando maduro, fornece polpa que pode

ser consumida in natura ou na forma de sucos e doces, como também na medicina caseira,

como forragem para animais e no curtimento do couro. O suco fermentado pode ser

4

processado em vinho e licor (LORENZI, 1992, POTT & POTT, 1994; FAO, 1986; UNALMED,

2011). Podem ainda ser usados a casca, a raiz, as folhas e as sementes, na medicina

popular (COSTA et al., 2005). Além disso, é uma espécie que apresenta grande potencial

econômico na recomposição de matas ciliares (XAVIER & XAVIER, 1976). O estado de São

Paulo é referência; já que utiliza o jenipapeiro como espécie promissora em modelos de

recuperação de áreas degradadas em ambientes de mata ciliar, por suportar longos

períodos sob condições de alagamento (BARBOSA et al., 1989 citado por ANDRADE et al,

2000).

Apesar do conhecimento do potencial produtivo e da adaptabilidade do jenipapeiro nas

diversas regiões tropicais, ainda são poucos os trabalhos sobre esta espécie, principalmente

em se tratando de estudos de exploração, produção e uso da sua madeira (BTFP, 2005;

LORENZI, 1992).

2.2. Recursos genéticos vegetais

A diversidade biológica ou biodiversidade é representada por todas as espécies de

plantas, animais e microrganismos, em interação com os ecossistemas e os processos

ecológicos dos quais essas espécies fazem parte. A manifestação física da biodiversidade é

representada pelos recursos genéticos, definidos como “espécies de plantas, animais e

microrganismos de valor atual ou potencial” (GOEDERT, 2007).

A conservação de recursos genéticos vegetais dos biomas tropicais é um tema de

importância mundial. Enquanto muitas espécies estão em risco de extinção nas regiões

temperadas, várias desaparecem todos os dias nos trópicos. A proteção de espécies frente

à iminente extinção é, portanto, uma questão prioritária. A conservação e o manejo da

biodiversidade, mesmo em áreas protegidas nos trópicos, constituem-se em desafios

complexos que requerem conhecimento básico sobre a distribuição e abundância de

espécies, suas interações mutualistícas, sua biologia reprodutiva e a estrutura genética de

suas populações (PARK et al., 1998).

Os recursos genéticos são parte essenciais da biodiversidade, onde é usada pelo

homem para promover o desenvolvimento sustentável da agricultura e produção de

alimentos, tratando da variabilidade genética entre as espécies de grupos de espécies de

plantas de interesse agrícola para as suas regiões de origem (variabilidade interespecífica).

Já variabilidade intraespecífica, maneja a variabilidade dentro de cada espécie, com fins de

utilização para pesquisa em melhoramento genético e em biotecnologia, podendo isso ser

chamado de “germoplasma” (GOEDERT, 2007).

A Rede Nacional de Recursos Genéticos, atualmente, mantém 383 Bancos Ativos de

Germoplasma de Plantas (BAGs), dos quais 140 pertencem ao sistema Embrapa e 243 à

5

outras instituições do Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuária (SNPA). Destes, 52%

conservam apenas espécies exóticas, enquanto que 32% apenas espécies nativas e os

restantes 16% ambas as categorias. A alta proporção de espécies exóticas é um indicativo

da importância para alimento e agricultura no Brasil (MARIANTE et al., 2009).

Portanto, o uso de recursos genéticos, como fonte para a obtenção de novas

variedades, é fator fundamental para alcançar uma produtividade mais elevada, como

também, para as transformações tecnológicas verificadas no processo de modernização do

agronegócio. No entanto, fortalecer as iniciativas para a conservação de espécies em seus

habitats naturais e entre as populações tradicionais de agricultores e comunidades

indígenas (conservação on farm), e de forma integrada com o sistema formal de

conservação ex situ é de grande importância para objetivar esse desenvolvimento tão

esperado pelo mundo (GOEDERT, 2007).

O jenipapeiro é uma cultura perene pela qual a conservação de seus recursos

genéticos é, sobretudo, baseada em coleções de campo, devido à sua fisiologia, já que o

comportamento das mesmas durante o armazenamento é intermediário, razão pela qual não

toleram a dessecação a níveis extremamente reduzidos (CARVALHO; NASCIMENTO, 2000

citado por OLIVEIRA et al., 2011). Segundo relatos de Vieira & Gusmão (2006) as sementes

possuem período de viabilidade relativamente curto, com ausência de germinação após 60

dias de armazenamento.

Considerando o alto potencial do jenipapeiro e a necessidade de preservação de

genótipos, alguns órgãos de pesquisa registram a existência de acessos provenientes de

sementes ou vegetativamente de Genipa americana em bancos de germoplasma, como a

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária da Universidade Estadual Paulista, em

Jaboticabal (SP); a Escola de Agronomia da Universidade Federal da Bahia, em Cruz das

Almas (BA); e a Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola S. A. (EBDA), em Conceição

do Almeida (BA) (CARVALHO, 1999; DONADIO, 1999; LUNA, 1999 citados por DANTAS

et al., 2009). A Embrapa Tabuleiros Costeiros mantém um BAG de Jenipapeiro desde 2009,

com 172 acessos oriundos de diversas regiões do país1. A perda de material genético

decorrente da exploração extrativista demanda o desenvolvimento de métodos de

conservação, para que se elimine o risco de extinção dos bancos naturais de germoplasma

dessa espécie.

1 Informações cedidas pela pesquisadora Dra. Ana Veruska Cruz da Silva, curadora do BAG jenipapo

da Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, em 12 de novembro de 2012.

6

2.3. Conservação in vitro de recursos genéticos

A erosão genética causada pela destruição de habitats, pela seleção natural e pelos

agentes bióticos e abióticos vêm aumentando o interesse pela conservação de

germoplasma vegetal. O aumento da ameaça à diversidade das plantas está associado à

perda dos habitats pela expansão das atividades da agricultura, pecuária, indústria e

estradas (GHAZANFAR, 1998).

A cultura de tecidos, é uma ferramenta que pode auxiliar diversas áreas, como

fitopatologia, fisiologia, engenharia genética, química, citogenética, bioquímica, biologia

molecular, em estudos básicos da biologia de plantas onde abrange recentes e importantes

métodos que permitem a propagação de plantas isentas de vírus e outros patógenos

sistêmicos ou não e a geração de novos genótipos em laboratório (SOUZA et al., 2006).

Permite ainda aperfeiçoar a interação entre fatores abióticos (nutricionais, luminosos,

temperatura, etc.) e bióticos (hormonais e genéticos), resultando em plantas sadias,

vigorosas e geneticamente superiores, que podem ser multiplicadas massivamente.

As atividades de cultura de tecidos são realizadas em ambiente asséptico e com

temperatura e iluminação controladas, visando, principalmente, a otimização das respostas

aos estímulos termícos e fotoperiódico aplicados ao material in vitro, além de outros fatores

(TEIXEIRA & TORRES, 1998).

A conservação ex situ de recursos genéticos encontra nos BAGs e Coleções de

germoplasma as estruturas físicas, onde são armazenadas as amostras de material vivo,

representativas de um indivíduo, ou de vários indivíduos, na forma de sementes, plantas ou

partes da planta, tecidos ou células, para a manutenção da variabilidade genética e posterior

utilização (IBPGR, 1991).

Nos últimos anos, as técnicas de cultura in vitro para conservação em Banco de

Germoplasma foram amplamente desenvolvidas e aplicadas em mais de mil espécies,

muitas das quais oriundas regiões tropicais (LATA, 1991). Para as espécies ameaçadas de

extinção e cuja conservação por sementes não é possível, este é um método considerado

altamente promissor (HOYT, 1992). Assim, as técnicas de conservação in vitro constituem-

se em métodos valiosos para a conservação de recursos genéticos vegetais (HARDING et

al., 1997). Em alguns casos, a conservação in vitro pode ser a única estratégia para

conservar certas espécies, como no caso de plantas com sementes recalcitrantes e de difícil

propagação vegetativa por métodos convencionais (ROCA et al., 1991; FERREIRA et al.,

1998)

Cada método de conservação possui vantagens e desvantagens, sendo necessárias

estratégias complementares para uma conservação máxima da diversidade genética,

variando de acordo com cada espécie (MARTIN & PRADEEP, 2003).

7

Para a conservação de espécies no campo é necessário grandes áreas para o plantio

e proteção constante contra o ataque de pragas e patógenos. Além disso, a manutenção a

longo prazo de acessos adaptados a ambientes distintos daquele onde a coleção é mantida,

nem sempre é viável e muitas vezes se torna impossível. Por essas razões, tem-se

verificado que a conservação in vitro de certas espécies reduz os custos de manutenção e

torna o processo de conservação da coleção mais eficiente (ROCA et al., 1982 citado por

FERREIRA et al., 1998).

A conservação de plantas in vitro se baseia no cultivo das coleções em laboratório, a

partir da técnica da cultura de tecidos (GEORGE, 1996). A técnica é baseada na

totipotencialidade da célula vegetal, ou seja, na sua capacidade de, por si só, originar uma

nova planta, devido às mesmas apresentarem em seu núcleo, toda informação genética

(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). No desenvolvimento desse método, dois

procedimentos têm sido adotados: o crescimento lento – que envolve a depressão do

metabolismo das plantas – e o da supressão completa do crescimento por armazenamento

em temperaturas ultra-baixas, a criopreservação (KARTHA, 1987; PRIMROSE, 1987). A

conservação in vitro, seja em condições de crescimento mínimo ou criopreservação de eixos

embrionários isolados, ou de suas partes, é o método mais promissor para a conservação a

médio e longo prazo, respectivamente (FAIAD et al., 1998).

O crescimento lento tem sido utilizado com sucesso para conservar muitas espécies

(WITHERS & WILLIAMS, 1990). Esse método consiste em reduzir o metabolismo da planta,

aumentando ao máximo os intervalos de subcultivos ou estendendo-o indefinidamente, sem

afetar a viabilidade das plântulas. Assim há redução de mão-de-obra e o espaço físico

necessários, além de proporcionar ao melhorista acesso imediato a todo o germoplasma da

coleção (ROCA et al., 1991; GEORGE, 1996).

As culturas mantidas in vitro, pelo método de crescimento lento, são submetidas a

ambientes físico-químicos que diminuem o metabolismo e reduzem o crescimento da planta,

sem afetar a viabilidade. A diminuição da atividade metabólica pode ocorrer pela redução da

intensidade de luz ou temperatura, acréscimo de retardadores de crescimento ao meio de

cultura ou diminuição da concentração dos componentes salinos e orgânicos do meio

(WITHERS & WILLIAMS, 1998). As soluções nutritivas são compostas basicamente por

macronutrientes (N, P, Ca, K, Mg e Fe); micronutrientes (Mn, Zn, B, Cu, Cl e Mb); sacarose,

como a principal fonte de carbono; fitorreguladores; e vitaminas, cuja função principal é

servir como fonte de nitrogênio (GRAÇA & TAVARES, 2000; CALDAS et al., 1998). Durante

o cultivo in vitro, as soluções de sais e açúcares, que compõem o meio de cultura, não

exercem somente um efeito puramente nutritivo, mas também influenciam o crescimento

celular e a morfogênese por meio de propriedades osmóticas (GEORGE, 1996). Nestas

condições, a conservação de germoplasma in vitro pode ser realizada a partir de mudanças

8

no ambiente de cultivo, utilizado para promover o crescimento de células, tecidos e órgãos.

Portanto, os meios de cultivos apropriados para a conservação de germoplasma possuem

composição diferente dos demais a fim de atender o objetivo de manter os acessos nos

bancos e coleções pelo maior tempo possível entre subcultivos, sem comprometer a

sobrevivência e a integridade dos materiais.

A composição e a concentração de hormônios no meio são fatores determinantes no

crescimento e no padrão de desenvolvimento na maioria dos sistemas de cultura de tecidos

(CALDAS et al., 1998). A combinação de baixas temperaturas com a adição de reguladores

vegetais ou agentes osmóticos no meio de cultura tem sido apontada como uma alternativa

eficiente para o desenvolvimento de protocolos de conservação de germoplasma in vitro. Os

agentes osmóticos como sacarose, manitol e sorbitol, agem sobre o crescimento reduzindo

o potencial hídrico do meio de cultura e consequentemente inibindo a absorção de água e

nutrientes pelo explante (CALDAS et al., 1998; ENGELMANN, 1991; LÉDO et al., 2007).

No Brasil, protocolos de conservação in vitro por crescimento lento têm sido

estabelecidos para diversas espécies, como mandioca, batatinha, batata-doce, cará,

morango, aspargo, alho, videira (GOEDERT, 2005), cana-de-acúcar (LEMOS et al., 2002),

maracujazeiro (GONÇALVES et al., 2003; FARIA et al., 2006), batata (FORTES &

PEREIRA, 2001), abacaxi (CANTO et al., 2004), mangaba (SÁ et al., 2011; SANTOS et. al,

2011), coqueiro (MACHADO, 2012; MOURA, 2012).

A aplicação de retardantes osmóticos e inibidores de crescimento nos meios de cultura

é uma estratégia vista em muitos trabalhos. Santos et al. (2011), avaliaram o efeito da

sacarose e sorbitol na conservação in vitro por crescimento lento de mangabeira e

demonstraram eficiência na conservação de segmentos nodais dessa espécie lenhosa, na

ausência de sacarose e na presença de 10 ou 20 g L-1 de sorbitol sob condições de

crescimento lento por 120 dias. Sá et al. (2011) estudando a eficiência do manitol e do ácido

abscísico na redução do crescimento de microestacas de mangabeira observaram que na

presença de manitol, houve o decréscimo do comprimento da parte aérea, mas, aos 90 dias

de cultivo in vitro, foi observado efeito deletério do manitol nas culturas. O ácido abscísico

(0,5 mg L-1) promoveu a desaceleração do crescimento de microestacas de mangabeira.

Avaliando o efeito de diversos fatores físicos e químicos na conservação in vitro de

germoplasma de cana-de-açúcar, Lemos et al. (2002) verificaram efeito positivo da

diminuição da temperatura e da sacarose como fonte de carbono na manutenção da

viabilidade de explantes sob crescimento lento. O ácido abscísico (1 mg L-1) foi essencial

para manter os explantes em crescimento mínimo por 12 meses.

Estudando o efeito da sacarose e do sorbitol na conservação in vitro de um acesso de

Passiflora giberti N. E. Brown, Faria et al. (2006) observaram ser possível conservar, por

quatro meses, microplantas de maracujazeiro em meio de cultura MS suplementado com 10

9

ou 20 g L-1 de sorbitol, na ausência de sacarose, e mantidas sob condições de fotoperíodo

de 16 horas de luz (22 μE m-2 s-1) e temperatura de 27± 1°C. Moura (2012) observou que na

presença do manitol e sorbitol, nas concentrações 0,1; 0,2 e 0,3 M, alguns acessos de

coqueiro gigante apresentaram redução do crescimento da parte aérea. Machado (2012)

demonstrou a eficiência do manitol nas concentrações 0,1 e 0,2 M; e do ácido abscísico nas

concentrações acima de 20 μΜ na inibição do comprimento da parte aérea de acessos de

coqueiro anão .

Apesar dos resultados promissores para a conservação in vitro de algumas espécies,

não existe um protocolo padrão de conservação aplicável a todas as espécies. Os

resultados podem variar em função da espécie e da estratégia de conservação in vitro

utilizada, por isso há necessidade de desenvolver ou adaptar protocolos específicos para

cada espécie de interesse (SÁ, 2009).

A possibilidade da utilização dos métodos de conservação in vitro é atrativa tanto por

motivos econômicos quanto práticos, sendo um componente adicional importante do

tratamento de recursos genéticos e, principalmente, de espécies ameaçadas de extinção

(WITHERS & WILLIAMS, 1998).

Existem poucos trabalhos sobre o comportamento de culturas submetidas a

conservação in vitro na etapa de retomada do crescimento. Santos et al. (2010) avaliando a

capacidade de retomada de crescimento de brotações adventícias de mangabeira após

conservação, observaram que brotações adventícias mantidas na ausência de sacarose ou

na presença de 10 g L-1 de sorbitol apresentaram maior viabilidade na retomada do

crescimento aos 60 dias de cultivo.

Estudos sobre tipos e posição de explantes, meios de cultura e reguladores de

crescimento são imprescindíveis para o sucesso da técnica.

Pesquisas recentes apontam a capacidade organogénetica do jenipapeiro para

propagação in vitro (ROCHA, 2006; DANTAS et al., 2009), entretanto não foram

encontrados registros na literatura sobre estratégias de conservação in vitro por crescimento

mínimo para o jenipapeiro.

2.4. Propagação in vitro

2.4.1. Germinação in vitro de jenipapeiro

A germinação é um evento fisiológico que depende da qualidade da semente e das

condições de germinação, como o suprimento de água e oxigênio e adequação de

temperatura, luz e substrato. Essas condições de germinação ou requerimentos básicos

para germinação variam entre as espécies de plantas (SALOMÃO & SOUSA-SILVA, 2003).

10

O termo germinação pode ser considerado como a reativação metabólica ou retomada de

crescimento do embrião, resultando em uma plântula com as estruturas essenciais para seu

desenvolvimento. Informações sobre a capacidade germinativa das sementes são

importantes para a programação de atividades como a comercialização, plantio e

conservação (SALOMÃO & SOUSA- SILVA, 2003).

De acordo com o critério botânico de germinação, considera-se semente germinada

quando há protusão/extrusão de qualquer parte do embrião, notadamente a radícula. Pelo

critério de tecnologia de sementes, considera-se a semente germinada, aquela que

apresenta a emergência de uma plântula normal, com as partes aérea e radicular vigorosas

(SALOMÃO & SOUSA- SILVA, 2003)

O uso de sementes como explante tem sido indicado nos casos em que a assepsia

de outros explantes se torna inviável, além de proporcionar vantagens em relação aos

demais tipos de explantes, como o rápido crescimento e, consequentemente, a

disponibilidade de material mais rapidamente para as etapas seguintes do cultivo, bem

como a facilidade de enraizamento da cultura, visto que vigor e enraizamento adventício são

caracteristicas naturais de tecidos em estado juvenil (MORAES et al., 2007; ASSIS &

TEIXEIRA, 1998; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).

Os meios nutritivos utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos vegetais

fornecem as substâncias essenciais para o seu crescimento e desenvolvimento in vitro. As

mesmas vias bioquímicas e metabólicas básicas que funcionam nas plantas ex vitro, são

conservadas em material vegetal in vitro. Por isso os meios nutritivos se baseiam nas

exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para

atender as necessidades específicas in vitro (CALDAS et al., 1998). Estudos de meios de

cultura que favoreçam a germinação in vitro de espécies intermediárias e recalcitrantes são

importantes, tanto para maximizar a taxa de germinação como para obter plântulas

uniformes com qualidade genética e fitossanitária adequada. O suprimento adequado em

água, composição de gases e temperatura convenientes, assim como a luz, são requisitos

fundamentais para a germinação (STEIN, 2007).

Alguns fatores podem influenciar as respostas obtidas, como: tipo de meio de cultura,

concentração de sais e sacarose e reguladores de crescimento. Segundo Caldas et al.

(1998) a concentração da sacarose é um fator importante para obter crescimento ótimo,

dependendo do explante.

A obtenção de plântulas assépticas como fonte de explantes para o estabelecimento

de protocolos de propagação de plantas lenhosas tem sido aplicado a diversas espécies.

Relatos de Dantas et al. (2009) indicam êxito na germinação in vitro de sementes de

jenipapeiro em meio básico MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) e meio WPM- Wood Plant

Medium (LLOYD & McCOWN, 1981) . Lédo et al. (2008) em estudos de germinação in vitro

11

de nim indiano cultivado em dois substratos (ágar e vermiculita), na ausência e presença de

½ MS e MS, observaram que a vermiculita, na ausência de meio de cultura MS, induziu

100% de germinação. Em mangabeira a redução de sais MS beneficiou o desenvolvimento

radicular de plântulas germinadas in vitro (LÉDO et al., 2007).

2.4.2. Embriogênese somática

Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente empregados

para designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem-se por

meio de diferentes estádios embriogênicos, dando origem a uma planta, sem que ocorra a

fusão de gametas (WILLIAMS & MAHESWARAN, 1986). Esse processo constitui um

exemplo da expressão da totipotencialidade das células das plantas (HABERLANDT, citado

por KRIKORIAN & BERQUAM, 1969).

O padrão de desenvolvimento de um embrião somático em dicotiledôneas apresenta

muitas características morfológicas semelhantes às do embrião zigótico. Ambos são

caracterizados pela diferenciação de uma estrutura bipolar: ápice caulinar e radicular,

passando pelos estádios de desenvolvimento pró-embrionários e embrionários: globular,

codiforme, torpedo e cotiledonar (SMITH, citado por GUERRA et al., 1999). Entre as

diferenças, os embriões somáticos desenvolvem-se livres de correlações físicas, fisiológicas

e genéticas, as quais ocorrem no desenvolvimento de um embrião zigótico (ZIMMERMANN,

1993).

A embriogênese somática é um tipo de morfogênese em que, a partir de tecidos

provenientes diretamente do explante (embriogênese direta) ou de calos (embriogênese

indireta), formam-se embriões zigóticos até a formação completa da planta (BRANDÃO et

al., 2005).

Dois padrões básicos de expressão da embriogênese somática ocorrem in vitro. O

primeiro corresponde ao modelo direto, no qual os embriões somáticos originam-se dos

tecidos matrizes sem a formação de estádios intermediários de calo. O segundo padrão

corresponde ao modelo indireto no qual os embriões somáticos se formam a partir de um

calo, que apresenta células em diferentes estádios de diferenciação e, consequentemente,

com diferentes graus de determinação, as quais podem adquirir novas competências

mediadas por mensageiros químicos específicos (SHARP et al., 1980).

A grande maioria dos sistemas de embriogênese somática ocorre indiretamente

(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). A possibilidade de obtenção de um satisfatório

sistema experimental in vitro para estudos morfogenéticos e para a propagação clonal, com

a formação de calos é indesejável. A constituição cromossômica das células de um calo é

instável e a relação entre as células potencialmente meristemáticas e o total de células da

12

massa de um calo é pequena, além da falta de sincronia entre os meristemas de um calo

(HICKS, 1980; THORPE, 1980; SHERIDAN; D’AMATO, citados por GUERRA, 1989).

Dessa forma a embriogênese somática direta oferece um maior potencial para estudo

dos eventos bioquímicos e fisiológicos relacionados com a determinação. Segundo Conger

et al. (1983), a embriogênese direta é um sistema modelo para o estudo da morfologia

básica de embriões não zigóticos e da influência de fitorreguladores sobre o

desenvolvimento embrionário.

Nesse contexto, sistemas que atendem os três requisitos propostos por Williams &

Maheswaran (1986) apresentam especial interesse: 1) as células iniciais não necessitam de

desdiferenciação e são, portanto, potencialmente embriogenéticas por ocasião da

inoculação; 2) ciclos contínuos de embriogênese são possíveis; e 3) os embriões somáticos

são facilmente destacados do tecido matriz.

Independente do padrão direto ou indireto, as células-mães embriogênicas

apresentam um conjunto de características comuns ao comportamento de células

embrionárias em divisão ativa: tamanho pequeno (100 a 200 µm), conteúdo citoplasmático

denso, núcleos grandes com nucléolos proeminentes, vacúolos pequenos e presença de

grãos de amido (GUERRA et al., 1999).

Teoricamente, para a indução de calos, qualquer tecido pode ser utilizado como

explante tendo em vista a totipotência das células vegetais. Na prática, entretanto, procura-

se utilizar explantes que contenham maior proporção de tecido meristemático ou que

contenham maior capacidade de expressar totipotência (GRATTAPAGLIA & MACHADO,

1998). Segundo estes autores, explantes oriundos de tecidos jovens e com maior atividade

metabólica, são mais adequados para estimular a formação de calos.

Na embriogênese somática, in vitro ou induzida, células em diferentes estádios de

diferenciação podem ser induzidas, por estímulos ambientais ou químicos e, se

reprogramadas, adquirirem novas competências morfogenéticas (GUERRA et al., 1999). Em

geral, na maioria dos modelos de embriogênese induzida in vitro, as auxinas, em especial o

2,4-diclorofenoxiacético, são consideradas as substâncias responsáveis pelo

desencadeamento dos processos de desdiferenciação (modelo indireto) e rediferenciação

(modelo direto).

A embriogênese somática apresenta uma grande vantagem sobre os demais sistemas

de micropropagação, pois grandes quantidades de embriões podem se formar em

suspensões de células embriogênicas com mínimo de manipulação manual e espaço físico,

principais componentes do custo de uma planta micropropagada (GRATTAPAGLIA &

MACHADO, 1998).

As técnicas de micropropagação de jenipapeiro tem sido baseadas na organogênese

(ROCHA, 2006; DANTAS et al, 2009). Não existem informações na literatura sobre a

13

indução de calos embriogênicos em Genipa americana L. O estabelecimento do processo

de clonagem massal por embriogênese somática para o jenipapeiro tem grande importância

futura para a multiplicação de acessos superiores oriundos de programas de melhoramento

genético e na etapa de recuperação de acessos conservados in vitro.

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CAPÍTULO 1 – CONSERVAÇÃO IN VITRO POR CRESCIMENTO LENTO DE JENIPAPEIRO.

RESUMO

O jenipapeiro (Genipa americana L.), espécie frutífera distribuída por vários países e comumente encontrada no Nordeste brasileiro, tem grande importância econômica, tanto pela sua essência florestal, quanto pela produção de alimentos. Este trabalho teve como objetivo estabelecer protocolos de conservação in vitro de jenipapeiro. Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros Costeiros, SE. Foram utilizadas sementes de plantas matrizes de jenipapeiro provenientes de população natural localizada em Cruz das Almas- BA (acesso CZA). As sementes foram desinfestadas e posteriormente inoculadas em meio MS com 30 g L-1 de sacarose e 4,5 g L-1 de Phytagel®. Após 90 dias de cultivo, no ensaio 1, as plântulas foram transferidas para um novo meio MS suplementado com 30 g L-1 de sacarose e diferentes concentrações de manitol (0; 5; 10; 15 e 20 g L-1). No ensaio 2, as plântulas foram transferidas para meio MS gelificado com 30 g L-1 de sacarose na presença de cinco concentrações de ABA (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1). No ensaio 3 foram testados cinco tratamentos: T1- Meio MS gelificado com 30 g L-1 de sacarose; T2- ½ MS com 15 g L-1 de sacarose; T3- ½ MS com 30 g L-1 de sacarose; T4- ¼ MS com 15 g L-1 de sacarose e T5- ¼ MS com 30 g L-1 de sacarose. Em todos os experimentos foi utilizado meio gelificado com 4,5 g L-1 de Phytagel®. As culturas foram avaliadas aos 60, 90, 120 e 150 dias para número de folhas, comprimento da parte aérea, número de folhas com abscisão e viabilidade das culturas. Das plântulas de jenipapeiro conservadas in vitro por 150 dias, foram obtidos segmentos nodais que foram inoculados em meio de regeneração (MS com 30 g L-1 de sacarose, BAP (0 e 1 mg L-1) e 4,5 g L-1 de Phytagel®). Na etapa de conservação, o manitol nas concentrações estudadas não promoveu desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro, enquanto, o ácido abscísico nas concentrações estudadas promoveu a redução do número de folhas. Os meios MS e ½ MS na presença de 30 g L-1 de sacarose promovem desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro, podendo ser recomendados para protocolos de conservação por crescimento lento. Explantes mantidos na presença de altas concentrações de manitol (15 e 20 g L-1) na fase de conservação e na presença de 1,0 mg L-1 de BAP no meio de retomada de crescimento apresentaram maior resposta morfogenética. Explantes mantidos nas concentrações 0,5 e 2,0 mg L-1 de ácido abscísico na presença de 1,0 mg L-1 de BAP, apresentaram maior resposta morfogenética. Os explantes mantidos na fase de conservação em meio MS + 30 g L-1 de sacarose e ½ MS com 15 ou 30 g L-1 de sacarose, apresentaram menor resposta morfogenética na ausência de BAP quando comparado com os demais tratamentos. A presença de BAP no meio de cultura induz maior resposta morfogenética e os segmentos nodais apicais, medianos e basais apresentam potencial morfogenético na fase de retomada de crescimento. Palavras-chave: Genipa americana L.; germoplasma; regulador osmótico; ácido abscísico.

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ABSTRACT The jenipapo (Genipa americana L.), the fruit specie distributed in multiple countries and commonly found in northeastern of Brazil, has great economic importance, both for its forest essence, as the production of food. The study aimed to establish protocols for in vitro conservation of jenipapo. The experiments were conducted in the laboratory of Plant Tissue Culture Embrapa Coastal Tablelands, SE. To perform these experiments we used seeds of rip fruits of the jenipapo population from Cruz das Almas, Bahia, Brasil (acess CZA). The material was inoculated on MS culture medium with 30 g L-1 sucrose and 4,5 g L-1 Phytagel®. After 90 days of culture, the plantlets were transferred to a MS culture medium containing 30 g L-1sucrose and different concentrations of mannitol (0, 5, 10, 15 and 20 g L-1). For the second experiment the plantlets were transferred to MS culture medium containing 30 g L-1 sucrose in the presence of five concentrations of abscisc acid (0, 0,5, 1,0, 2,0 and 4,0 mg L-

1). For third experiment were evaluated five treatments: T1-gelled MS medium with 30 g L-1 sucrose, T2 ½-MS with 15 g L -1 sucrose; T3 ½-MS with 30 g L-1 sucrose, T4 ¼-MS with 15 g L-1 sucrose and T5 ¼-MS with 30 g L-1 sucrose. The explants were evaluated at 60, 90, 120 and 150 days for leaf number, shoot length, number of leaves with abscission and viability of cultures. Nodal segments were excised from the jenipapo seedlings preserved in vitro for 150 days and transferred to regeneration medium (gelled MS culture medium supplemented with 30 g L-1 sucrose and BAP 0 or 1 mg L-1). In the conservation phase, mannitol concentrations used did not cause slowing the growth of seedlings jenipapeiro while abscisic acid concentrations studied caused a reduction in the number of leaves.The MS and ½ MS salt concentration in the presence of 30 g L-1 sucrose promote slowing the growth of jenipapo seedlings and can be recommended protocols for in vitro conservation. Explants maintained in the presence of high concentrations of mannitol (15 and 20 g L-1) in the conservation phase on the recovery phase presented higher morphogenetic response in the presence of 1.0 mg L-1 of BAP. The explants maintained at levels of 0.5 and 2.0 mg L-1 of abscisic acid in the presence of 1.0 mg L-1 BAP, showed higher morphogenetic response. Explants kept in storage phase in the presence of MS medium + 30 g L-1 sucrose and ½ MS 15 or 30 g L-1

sucrose, had lower morphogenetic response in the absence of BAP compared with the other treatments. The presence of BAP in culture medium induces greater morphogenetic response and nodal segments apical, median and basal morphogenetic potential in the present phase of recovered growth. Key-words: Genipa americana L.; germplasm; osmotic regulator; abscisic acid.

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1. INTRODUÇÃO

Genipa americana L., conhecida popularmente como jenipapo ou jenipá, é originário

da América Latina, pertence à família Rubiaceae e apresenta valor madeireiro e alimentício,

sendo explorado sem estratégias de conservação (SANTOS et al., 2011). Ocorre em vários

Estados brasileiros, dentre eles Sergipe sendo utilizado em programas de restauração de

áreas degradadas (SANTOS et al., 2007), com isso despertando interesse de estudos dessa

espécie nas mais distintas áreas.

No Brasil, essa espécie está distribuída espontaneamente em todas as regiões,

ocupando uma maior área no Nordeste. Dados recentes apontam uma área de 269,30 ha

para os estados da Bahia e Sergipe (CODEVASF, 2012). Segundo Ferreira et al. (2005) a

Genipa americana L. está entre as dez espécies selecionadas como de altíssima prioridade

pelo programa Plantas do Futuro do CNPq/World Bank/GEF/MMA/Probio, sendo

considerada uma espécie frutífera.

A Embrapa Tabuleiros Costeiros junto à plataforma de recursos genéticos da

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária vem intensificando ações de coleta,

caracterização e conservação de germoplasma de Jenipapeiro, com a implantação, em

2009, de um Banco Ativo de Germoplasma de jenipapeiro no campo experimental de Nossa

Senhora das Dores, Sergipe. Nesse sentido a aplicação de técnicas de cultura de tecidos de

plantas como estratégia complementar à conservação da variabilidade genética existente e

para acelerar a multiplicação de genótipos promissores tornam-se imprescindíveis,

especialmente para espécies que não podem ter suas sementes conservadas a baixa

temperatura e umidade, como as do jenipapeiro.

As culturas mantidas in vitro, pelo método de crescimento lento, são submetidas a

ambientes físico-químicos, que diminuem o metabolismo e reduzem o crescimento da

planta, sem afetar sua viabilidade. A diminuição da atividade metabólica pode ocorrer pela

redução da intensidade de luz ou temperatura, acréscimo de retardantes de crescimento ao

meio de cultura ou diminuição da concentração dos componentes salinos e orgânicos do

meio (WITHERS & WILLIAMS, 1998).

Apesar de não existir um procedimento padrão para todos os genótipos de todas as

espécies, os sucessos obtidos têm sido animadores, e será possível desenvolver um

método adequado de crescimento lento para outras espécies que exijam menos

manipulação (WITHERS & WILLIAMS, 1998).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da concentração de sais e da sacarose

no meio de cultura MS, do manitol e do ácido abscísico na conservação in vitro do acesso

CZA de jenipapeiro.

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2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Material vegetal

Sementes extraídas de frutos maduros de acessos de jenipapeiro, de ocorrência em

população natural em Cruz das Almas, BA -CZA (12°39’10.11’’S; 39°07’19.02’’O), foram

mantidas por 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, foram submetidas a

assepsia em câmara de fluxo laminar sendo imersas em álcool 70% (v/v) por 60 segundos e

em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) com 2,5% de cloro ativo na proporção 2:1 v/v

com duas gotas de detergente por 20 minutos (ROCHA, 2006). Ao final desse tempo, foram

lavadas três vezes, em água destilada autoclavada.

Cinco sementes foram inoculadas em frascos com capacidade de 250 mL contendo 30

mL de meio de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com 30 g L-1 de sacarose e 4,5 g

L-1 de Phytagel® para obtenção de plantas sadias por um período de 90 dias, as quais foram

utilizadas em todos os experimentos.

2.2. Condições de cultivo

A condução dos experimentos foi no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju- SE. Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para

5,8 ± 0,1 e foram gelificados com 4,5 g L-1 de Phytagel® e submetidos a autoclavagem por

20 minutos a uma temperatura de 121 ± 1°C e pressão de 1,05 atm.

As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25

± 2°C, umidade relativa do ar média em torno de 70% com fotoperíodo de 12 horas de luz e

intensidade luminosa de 60 µmol m-2s-1.

2.3. Conservação in vitro de acessos de jenipapeiro

2.3.1. Efeito do manitol na redução do crescimento in vitro de acessos de jenipapeiro

Para o estudo do efeito do manitol no crescimento in vitro de jenipapeiro, plântulas

germinadas in vitro foram transferidas para o meio de conservação composto pelos sais do

meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 30 g L-1 de sacarose e

gelificado com 4,5 g L-1 de Phytagel® na presença de cinco concentrações de manitol (0; 5;

10; 15 e 20 g L-1).

23

2.3.2. Efeito do ácido abscísico na redução do crescimento in vitro de acessos de

jenipapeiro

Para o estudo do efeito do ácido abscísico (ABA) no crescimento in vitro de

jenipapeiro, plântulas germinadas in vitro foram transferidas para o meio de conservação

composto pelos sais do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 30 g

L-1 de sacarose e gelificado com 4,5 g L-1 de Phytagel® na presença de cinco

concentrações de ABA (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1) .

2.3.3. Efeito da concentração de sais MS e da sacarose na redução do crescimento in


Para o estudo do efeito da concentração de sais MS e da sacarose no crescimento in

vitro de acessos de jenipapeiro, plântulas germinadas in vitro foram transferidas para cinco

meios de conservação com variações na concentrações de sais e de sacarose do meio de

cultura, sendo: T1- Meio MS + 30 g L-1 de sacarose; T2- ½ MS + 15 g L-1 de sacarose; T3-

½ MS + 30 g L-1 de sacarose; T4- ¼ MS + 15 g L-1 de sacarose; T5- ¼ MS + 30 g L-1 de

sacarose. Todos os meios foram gelificados com 4,5 g L-1 Phytagel®.

2.4. Retomada do crescimento in vitro



Segmentos nodais (apical, mediano e basal) oriundos de brotações adventícias de

jenipapeiro conservadas in vitro por 150 dias na presença de diferentes concentrações de

manitol foram transferidos para o meio de crescimento.

Os explantes foram inoculados em frascos com capacidade de 250 mL, vedados com

tampa plástica contendo 30 mL de meio de cultura MS, suplementado com 0 e 1 mg L-1 de

BAP e 30 g L-1 de sacarose. Os meios foram gelificados com 4,5 g L-1 de Phytagel®.



Segmentos nodais (apical, mediano e basal) de jenipapeiro conservados in vitro por

150 dias, em meio de cultura MS com diferentes combinações de ácido abscísico foram

transferidos para o meio de crescimento.

24

Os explantes foram inoculados em frascos com capacidade máxima de 250 mL,

vedados com tampa plástica contendo 30 mL de meio de cultura MS, suplementado com 0 e

1 mg L-1 de BAP e 30 g L-1 de sacarose e gelificado com 4,5 g L-1 de Phytagel®.



Segmentos nodais (apical, mediano e basal) com brotações adventícias de jenipapeiro

conservados in vitro por 150 dias, em meio de cultura com diferentes variações de MS e

sacarose foram transferidos para o meio de crescimento.

Os explantes foram inoculados em frascos com capacidade máxima de 250 mL,

vedados com tampa plástica contendo 30 mL de meio de cultura MS, suplementado com 0 e

1 mg L-1 de BAP e 30 g L-1 de sacarose e gelificado com 4,5 g L-1 de Phytagel®.

2.5. Avaliação dos experimentos

As plântulas conservadas in vitro dos ensaios (2.3.1., 2.3.2. e 2.3.3.) foram avaliadas

aos 60, 90, 120 e 150 dias quanto ao comprimento da parte aérea (CPA), número de folhas

(NF), número de folhas com abscisão (NFA) e viabilidade das culturas (VIB).

A viabilidade das plântulas foi quantificada a partir de uma escala de notas (Figura 1)

adaptada de Lemos et al. (2002), onde as notas correspondem: 5- folhas e brotos

totalmente verdes; 4- início do secamento e morte das folhas; 3- secamento e morte das

folhas e dos brotos entre 30 e 50%; 2- mais de 50% de secamento e morte de folhas e

brotos e 1- folhas e brotos totalmente mortos.

Nos experimentos de retomada do crescimento (2.4.1., 2.4.2. e 2.4.3.) aos 120 dias após a

inoculação foi avaliada a porcentagem de explantes com resposta morfogenética. Foram

considerados como explantes com resposta morfogenética aqueles que apresentaram

organogênese e/ou calogênese.

25

5- folhas e brotos totalmente verdes; 4- início do secamento e morte das folhas; 3- secamento e

morte das folhas e dos brotos entre 30 e 50%; 2- mais de 50% de secamento e morte de folhas e

brotos e 1- folhas e brotos totalmente mortos.

Figura 1. Escala de notas para avaliação da viabilidade de plântulas de jenipapeiro sob

condições de crescimento lento.

2.6. Delineamentos experimentais e análises estatísticas

O delineamento experimental dos ensaios de conservação in vitro (2.3.1, 2.3.2 e

2.3.3) foi inteiramente casualizado com cinco tratamentos e quatro repetições, sendo cada

tratamento composto por vinte frascos com uma plântula/ frasco.

Para cada ensaio da retomada do crescimento (2.4.1., 2.4.2. e 2.4.3.), o

delineamento experimental foi inteiramente casualizado sendo considerados os fatores

aplicados na etapa de conservação in vitro (cinco tratamentos) combinados com três tipos

de explantes e duas concentrações de BAP (fatorial 5 x 3 x 2) totalizando 30 tratamentos

com duas repetições, sendo a parcela experimental composta por três frascos (1 explante/

frasco).

As variáveis dos ensaios de conservação in vitro contendo Manitol (2.3.1) e ABA

(2.3.2) foram submetidas à análise de variância pelo teste F e ajustadas equações de

regressão polinomial. As variáveis do ensaio de conservação in vitro contendo variações de

MS e sacarose (2.3.3) foram submetidas à análise de variância e comparadas pelo teste de

Scott Knott a 1 e 5% de probabilidade e dos ensaios da retomada do crescimento foram

submetidas à análise de variância e comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade

e ajustadas equações de regressão polinomial.

Para a análise estatística dos dados de todos os ensaios foi utilizado o programa

SISVAR (FERREIRA, 2011).

5 4 3 2 1

26

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Conservação in vitro de acessos de jenipapeiro

3.1.1. Efeito do manitol na redução do crescimento in vitro de acessos de jenipapeiro

Houve efeito significativo do manitol e do tempo de cultivo in vitro no número de

folhas, no comprimento da parte aérea, número de folhas com abscisão e viabilidade de

plântulas de jenipapeiro do acesso CZA (Anexo A).

O número de folhas variou segundo uma regressão polinomial cúbica (Figura 2). A

ausência do manitol, assim como as concentrações de 5 e 10 g L-1 apresentaram valores

bem próximos para a variável número de folhas, no entanto em 20 g L-1 desse regulador

observou-se uma maior resposta dessa variável. Com relação ao tempo de cultivo in vitro, o

número de folhas apresentou comportamento linear, havendo um acréscimo gradativo na

resposta dessa variável em função do período de permanência das plantas em meio

nutritivo (Figura 3).

Figura 2. Número de folhas viáveis em plântulas do acesso CZA em função da concentração

de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro.

y = 0,0021x3 - 0,0585x2 + 0,3822x + 10,259 R² = 0,901*

8

8,5

9

9,5

10

10,5

11

11,5

12

0 5 10 15 20

Núm

ero

de f

olh

as

Manitol (g L-1)

27

Figura 3. Número de folhas viáveis em plântulas do acesso CZA em função do tempo de

cultivo in vitro na presença de manitol.

A adição de manitol ao meio de cultura teve efeito negativo na redução do

crescimento quanto ao comprimento da parte aérea de plântulas de jenipapeiro,

apresentando um comportamento quadrático (Figura 4), já que a ausência desse regulador

promoveu maior redução dessa variável. Entretanto, as concentrações de 15 e 20 g L-1 de

manitol apresentaram uma redução do crescimento. Estudos com concentrações mais

elevadas desse regulador osmótico são necessários para avaliar o seu efeito sobre a

redução do crescimento de plântulas de jenipapeiro.

Figura 4. Comprimento da parte aérea em plântulas do acesso CZA em função da

concentração de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro.

y = 0,036x + 6,679 R² = 0,9877**

8

9

10

11

12

60 90 120 150

Núm

ero

de f

olh

as

Tempo de cultivo in vitro (dias)

y = -0,0063x2 + 0,1373x + 5,1024 R² = 0,7156**

5

5,1

5,2

5,3

5,4

5,5

5,6

5,7

5,8

5,9

6

0 5 10 15 20

Com

prim

ento

da p

art

e a

ére

a (

cm

)

Manitol (g L-1)

28

O manitol atua no meio de cultura removendo o excesso da água intracelular através

do gradiente osmótico, fazendo com que o crescimento da cultura ocorra de forma mais

lenta (DUMET et al., 1993). Esse regulador é utilizado com frequência na conservação in

vitro de várias espécies, como em coqueiro anão verde do Brasil de Jequi (LÉDO et al.,

2007); em batata (FORTES & PEREIRA, 2001); em mangabeira (SANTOS et al., 2011); em

coqueiro gigante (MOURA, 2012).

Entretanto, algumas fontes de carbono dependendo da concentração ou da espécie

em estudo, pode ter efeito contrário (SHIBLI et al., 2006), como o que foi observado neste

trabalho, porém se fossem utilizadas outras concentrações de manitol talvez houvesse uma

desaceleração no crescimento de jenipapeiro. Assim, fica evidenciado que as respostas da

adição de reguladores osmóticos no meio de cultura dependem da espécie (MOURA, 2012).

Possivelmente o jenipapeiro não possui mecanismos necessários para metabolizar o açúcar

álcool (manitol), como ocorre com outras espécies.

O comprimento da parte aérea em função do tempo de cultivo in vitro variou segundo

uma regressão linear (Figura 5), observando-se um acréscimo do crescimento das plântulas

com o aumento do tempo.

Figura 5. Comprimento da parte aérea em plântulas do acesso CZA em função do tempo de

cultivo in vitro na presença de manitol.

O número de folhas com abscisão variou segundo uma regressão quadrática, com

redução significativa da abscisão na presença de manitol (Figura 6). De acordo com

Rademacher (2000), os compostos que atuam inibindo o crescimento vegetal induzem

aumento de citocininas e diminuição dos níveis de etileno, por isso algumas substâncias

químicas podem interferir no processo de abscisão foliar (NEPOMUCENO et al., 2007).

y = 0,0042x + 5,0867 R² = 0,9925*

5,3

5,35

5,4

5,45

5,5

5,55

5,6

5,65

5,7

5,75

60 90 120 150

Com

prim

ento

da p

art

e a

ére

a (

cm

)


29

Figura 6. Número de folhas com abscisão em plântulas do acesso CZA em função da

concentração de manitol aos 150 dias de cultivo in vitro.

Na ausência do manitol, notou-se uma maior abscisão de folhas, sendo na presença

desse regulador osmótico observado menor número de folhas com abscisão e valores bem

próximos entre eles na resposta dessa variável. A redução da abscisão foliar em altas

concentrações de manitol foi observada por Sá (2009) em microestacas de mangabeira,

embora as mesmas tenham evidenciado seu efeito nocivo ao explante. Santos (2010),

estudando o efeito do manitol na conservação in vitro, observaram que concentrações de 15

e 20 g L-1 desse regulador osmótico induziram menor abscisão foliar nas plântulas de

mangabeira. A abscisão observada neste estudo, nas plântulas de jenipapeiro do acesso

CZA foi semelhante à observada por Santos (2010) em mangabeira.

O número de folhas com abscisão variou segundo uma regressão linear com

acréscimo em função do tempo de cultivo in vitro (Figura 7).

y = 0,0018x2 - 0,0478x + 0,3975 R² = 0,8281**

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 5 10 15 20

Núm

ero

de f

olh

as c

om

abscis

ão

Manitol (g L-1)

30

Figura 7. Número de folhas com abscisão em plântulas do acesso CZA em função do tempo

de cultivo in vitro na presença de manitol.

A viabilidade da cultura variou segundo uma regressão quadrática em função da

concentração de manitol (Figura 8) e linear para o tempo de cultivo in vitro (Figura 9). As

plântulas mantidas na presença de 20 g L-1 de manitol apresentaram maior viabilidade que

as demais. Entretanto, como todas as plântulas apresentaram viabilidade acima de 4,

indicando, segundo a escala de notas adaptada de Lemos et al. (2002), que as plântulas

mantiveram ótimo vigor na presença de manitol ao longo do tempo.

Figura 8. Viabilidade em plântulas do acesso CZA em função da concentração de manitol

aos 150 dias de cultivo in vitro.

y = 0,0032x - 0,157 R² = 0,9868**

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

60 90 120 150

Núm

ero

de f

olh

as c

om

abscis

ão


y = 0,0005x2 + 0,007x + 4,3568 R² = 0,9904**

4,3

4,35

4,4

4,45

4,5

4,55

4,6

4,65

4,7

4,75

0 5 10 15 20

Via

bili

dade d

a c

ultura

Manitol (g L-1)

31

Figura 9. Viabilidade em plântulas do acesso CZA em função do tempo de cultivo in vitro na

presença de manitol.

O manitol nas concentrações estudadas não promoveu desaceleração do

crescimento das plântulas de jenipapeiro, estudos com concentrações superiores a a 20 g L-

1 de manitol são necessários para avaliar o seu efeito sobre a redução do crescimento de

plântulas de jenipapeiro.

.

3.1.2 Efeito do ácido abscísico (ABA) na redução do crescimento in vitro de acessos

de jenipapeiro

Houve efeito significativo do ácido abscísico (ABA) no número de folhas e no número

de folhas com abscisão das plântulas de jenipapeiro do acesso CZA (Anexo B). O número

de folhas apresentou comportamento quadrático com gradativa redução em função do

aumento da concentração de ABA (Figura 10). Com relação ao número de folhas com

abscisão observa-se na Figura 11 que o aumento das concentrações do ABA promoveu um

acréscimo no número de folhas com abscisão.

y = -0,0071x + 5,253 R² = 0,9449**

4

4,1

4,2

4,3

4,4

4,5

4,6

4,7

4,8

60 90 120 150

Via

bili

dade d

a c

ultura


32

Figura 10. Número de folhas em plântulas do acesso CZA em função da concentração de

ácido abscísico aos 150 dias de cultivo in vitro.

Apesar do efeito do ABA no número de folhas e no número de folhas com abscisão,

não foi observado efeito significativo na redução do comprimento da parte aérea (cm) e na

viabilidade das plantas. Este resultado concorda com os obtidos por Machado (2012) que

relatou não existir efeito significativo entre as concentrações estudadas de ABA e o

comprimento da parte aérea de plântulas de coqueiro anão. Efeito semelhante também foi

reportado por Sá et al. (2011) no comprimento de microestacas de mangabeira, entretanto a

presença de 0,5 mg L-1 ABA promoveu boa viabilidade para a conservação in vitro de

microestacas de mangabeira por um período de 90 dias.

Apesar de não ter sido observado efeito significativo do manitol no comprimento da

parte aérea, houve uma desaceleração no crescimento de jenipapeiro, já que observou-se

uma redução considerável do número de folhas na presença do ácido abscísico.

Esse inibidor, mesmo em pequenas concentrações, pode ser fisiologicamente ativo e

desencadear vários processos, como a abscisão foliar (KERBAUY, 2004). O ABA devido a

associação com a dormência e a abscisão é sempre identificado como um inibidor, mas de

fato ele apresenta efeitos fisiológicos variados e tem ações tanto de inibição quanto

promotoras do desenvolvimento vegetal (BARRUETO CID, 2000).

y = 0,415x2 - 2,5382x + 8,5735 R² = 0,777**

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4

Núm

ero

de f

olh

as

Ácido abscísico (mg L-1)

33

Figura 11. Número de folhas com abscisão em plântulas do acesso CZA em função da

concentração de ácido abscísico aos 150 dias de cultivo in vitro.

Não houve efeito significativo do tempo de cultivo in vitro para as variáveis

analisadas (Anexo B).

O ABA nas concentrações estudadas promoveu desaceleração do crescimento das

plântulas de jenipapeiro, podendo ser promissor para a conservação in vitro.

3.1.3 Efeito da concentração de sais MS e da sacarose na redução do crescimento in


De acordo com análise de variância houve efeito significativo das concentrações de

sais MS e sacarose para as variáveis: número de folhas, comprimento da parte aérea e

viabilidade das plântulas de jenipapeiro do acesso CZA. Não houve efeito significativo do

tempo de cultivo in vitro no comprimento da parte aérea e número de folhas com abscisão

(Anexo C).

Com relação ao número de folhas, observou-se que os tratamentos com ¼ de sais

do meio MS independente da concentração de sacarose induziu maior formação de folhas

nas plântulas e apresentaram resultados superiores aos demais tratamentos.

Os meios MS e ½ MS com 30 g L-1 de sacarose promoveram redução do crescimento

da parte aérea (Tabela 1), além de manter boa viabilidade das plântulas, segundo a escala

de notas adaptada de Lemos et al. (2002).

y = -0,0288x2 + 0,1971x + 0,0194 R² = 0,9713**

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 1 2 3 4

Núm

ero

de f

olh

as c

om

abscis

ão

Ácido abscísico (mg L-1)

34

Tabela 1. Número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), número de folhas com

abscisão (NFA) e viabilidade da cultura (VIB) de plântulas do acesso CZA em diferentes

concentrações de sais MS e de sacarose.

Tratamentos NF CPA (cm) NFA VIB

MS + 30 g L-1 sacarose 8,79c 4,69b 0,08a 4,10d

½ MS + 15 g L-1 sacarose 9,46c 5,37a 0,08a 4,73b

½ MS + 30 g L-1 sacarose 10,13b 4,73b 0,05a 4,44c

¼ MS + 15 g L-1 sacarose 11,00a 5,47a 0,15a 4,63b

¼ MS + 30 g L-1 sacarose 11,20a 5,12a 0,00a 4,94a

CV (%) 13,56 10,26 17,16 8,97

Médias seguidas, na mesma coluna pela mesma letra não diferem significativamente, entre si,

ao nível de 5% pelo teste de Scott Knott.

A diminuição da concentração de sais no meio de cultura induziu um maior

desenvolvimento da plântula, em comprimento da parte aérea, sendo esse efeito, contrário

ao esperado e observado para algumas espécies como estratégias de conservação in vitro

(Tabela 2). Segundo Malaurie & Borges (2001), a redução da concentração de sais minerais

e de sacarose no meio de cultura permite a manutenção de plântulas em crescimento

mínimo. Provavelmente essa ação contrária, como observado nesse trabalho, pode ser

explicada devido ao fator endógeno de cada embrião.

Dessa forma, os meios de cultura com ¼ de sais MS combinados com 15 ou 30 g L-1

de sacarose apresentam potencial para estabelecimento de protocolos de germinação in

vitro de jenipapeiro, diminuindo os custos de produção, por demandarem menor

concentração dos sais do meio MS para o rápido crescimento de plântulas de jenipapeiro

(Tabela 2).

Além disso, a diminuição dos sais promoveu maior viabilidade das plântulas, sendo

que o meio de cultura contendo ¼ MS com 30 g L-1 sacarose apresentou valor superior aos

demais tratamentos.

35

Tabela 2. Número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), número de folhas com

abscisão (NFA) e viabilidade da cultura (VIB) de plântulas do acesso CZA em função do

tempo de cultivo in vitro em diferentes concentrações de sais e sacarose.

Tempo (dias) NF CPA (cm) NFA VIB

60 8,72c 4,916a 0,04a 4,78a

90 9,32c 4,984a 0,03a 4,64a

120 10,78b 5,127a 0,04a 4,51b

150 11,64a 5,273a 0,17a 4,33b

CV (%) 13,56 10,26 17,16 8,97

Médias na mesma coluna seguidas pela mesma letra, não diferem significativamente, entre si, ao

nível de 5% pelo teste de Scott Knott.

O tempo de cultivo in vitro influenciou significativamente o número de folhas e a

viabilidade (Anexo C). Aos 150 dias, observa-se um aumento significativo no número de

folhas com relação aos demais tempos (Tabela 2). No entanto, aos 60 e 90 dias as plântulas

de jenipapeiro do acesso CZA, apresentaram maior viabilidade que aos 120 e 150 dias.

Apesar desse decréscimo na viabilidade das plântulas, o valor mínimo dessa variável

analisada foi de 4,33 indicando, segundo a escala de notas adaptada de Lemos et al.

(2002), que no geral as plântulas mantiveram ótimo vigor ao longo dos dias de cultivo.

Os meios MS e ½ da concentração de sais MS com 30 g L-1 de sacarose

promoveram desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro.

3.2. Retomada do crecimento in vitro



Houve efeito significativo isolado do meio de conservação (manitol) e da

benzilaminopurina (BAP) na retomada do crescimento in vitro dos explantes do acesso CZA

até os 120 dias de cultivo (Anexo D). Para os demais fatores e combinações de fatores não

houve efeito significativo na resposta morfogenética (Anexo D).

Explantes mantidos na ausência e na presença de altas concentrações de manitol

(15 e 20 g L-1) na fase de conservação (Figura 12) e na presença de 1,0 mg L-1 de BAP no

meio de retomada de crescimento (Tabela 3) apresentaram maior resposta morfogenética.

36

Como já relatado anteriormente, algumas fontes de carbono dependendo da concentração

ou da espécie em estudo, podem ter efeito contrário (SHIBLI et al., 2006).

Figura 12. Porcentagem de resposta morfogenética de explantes acesso CZA (meio de

retomada de crescimento) em função da concentração de manitol (meio de conservação).

O BAP é a citocinina sintética que, in vitro, proporciona melhores resultados dentre

as comercialmente disponíveis, sendo a mais utilizada em cultura de tecidos para induzir a

formação de grande número de brotos e estimular altas taxas de multiplicação

(GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; CALDAS et al., 1998).

A presença de 1,0 mg L-1 de BAP foi decisiva na resposta morfogenética do acesso

CZA (Tabela 3; Figura 13), demonstrando a importância desse fitorregulador na

regeneração dessa espécie in vitro. Foi observado na presença dessa citocinina uma maior

resposta morfogenética (86,21%) dos explantes (Tabela 3).

y = 6,3097x2 - 33,14x + 107,0 R² = 0,5683**

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20

Resposta

Morf

ogenética (

%)

Manitol (g L-1)

37

Tabela 3. Porcentagem da resposta morfogenética de explantes do acesso CZA em função

da presença ou ausência de BAP (meio de retomada do crescimento).

BAP (mg L-1) Resposta morfogenética (%)

0 69,54b

1 86,21a

CV(%) 37,62

Médias seguidas pela mesma letra, não diferem significativamente, entre si, ao nível de 5% pelo teste

de Tukey.

Figura 13. Resposta morfogenética de explantes do acesso CZA na presença de manitol

(meio de conservação) e na A- ausência de BAP e B- presença de 1 mg L-1 de BAP (meio

de retomada de crescimento).

A ausência de BAP na etapa de recuperação propiciou maior resposta de explantes

com organogênese direta. Efeito contrário foi observado na presença desse regulador de

crescimento, no qual 78,9% dos explantes apresentaram resposta organogenética indireta

(Tabela 4, Figura 13).

A B

38

Tabela 4. Valores médios da resposta morfogenética de explantes acesso CZA em função

do tipo de explante e da presença e ausência de BAP (meio de retomada de crescimento) e

do meio de conservação.

Tipo de explante EOS (%) CALO (%) OD (%) OI (%)

Basal 26,67 1,67 33,33 38,33

Mediano 20 0 36,67 43,33

Apical 35 0 28,33 36,67

BAP (mg L-1) EOS (%) CALO (%) OD (%) OI (%)

0 34,45 1,1 64,45 0

1 20 0 1,1 78,9

Meio de conservação EOS (%) CALO (%) OD (%) OI (%)

0 16,67 0 36,11 47,22

5 36,11 2,78 25 36,11

10 69,44 0 13,89 16,67

15 5,56 0 44,44 50

20 8,33 0 44,44 47,22

EOS - explantes oxidados, contaminados e sem resposta; CALO - calogênese; OD -

organogênese direta; OI - organogênese Indireta;

Os tipos de explantes estudados e o manitol utilizado na fase de conservação in vitro

apresentaram respostas tanto de organogênese direta quanto indireta, entretanto, notou-se

que houve maior porcentagem de explantes com organogênese indireta para os dois fatores

analisados (Tabela 4).



Houve efeito significativo do tipo de explante e da interação entre o meio de

conservação (MC) e BAP na retomada do crescimento in vitro de jenipapeiro. Não houve

39

efeito significativo do meio de conservação (ABA), do BAP e das demais interações na

resposta morforgenética (Anexo E).

Conforme a Tabela 5, o segmento apical induziu maior resposta morfogenética

(93,33%) e o segmento basal, a menor (78,34%). De modo geral, todos os explantes

apresentaram boa resposta morfogenética. Apesar efeito do ABA na desaceleração do

crescimento das plântulas, os explantes mantiveram o potencial morfogenético na etapa de

recuperação.

Tabela 5. Porcentagem da resposta morfogenética de tipos de explantes do acesso CZA

(meio de retomada de crescimento) na presença de ABA (meio de conservação).

Explantes Resposta morfogenética (%)

Basal 78,34b

Mediana 90,00ab

Apical 93,33a

CV(%) 19,11

Médias seguidas pela mesma letra, não diferem significativamente, entre si, ao nível de 5% pelo teste

de Tukey.

Considerando a resposta morfogenética dos explantes em função do ABA (no meio

de conservação) e do BAP observou-se que não houve diferença estatística entre os

explantes mantidos na presença e na ausência de BAP (Tabela 6). No entanto, os explantes

nas concentrações 0,5 e 2,0 mg L-1 de ABA na fase de conservação e subcultivados na

presença de 1,0 mg L-1 de BAP, apresentaram maior resposta morfogenética que na

ausência desse regulador. Santos (2010) observou que os explantes de mangabeira na

presença de 0,5 mg L-1 de ABA na fase de conservação apresentaram maior viabilidade na

retomada do crescimento aos 30 dias de cultivo.

40


do ABA (meio de conservação) e do BAP (meio de retomada de crescimento).

Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na coluna ou maiúscula na linha, não diferem

significativamente, entre si, ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

Os explantes mantidos na ausência de BAP na etapa de regeneração in vitro

apresentaram maior resposta organogenética direta (84,44%). Entretanto, os explantes na

presença de BAP apresentaram 81,12% de regeneração in vitro com resposta

organogenética indireta (Tabela 7, Figura 14). Resultado semelhante foi constatado no

ensaio da retomada do crescimento in vitro do acesso CZA proveniente de meio de

conservação com manitol (Tabela 6).

Figura 14. Resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA, na

presença de ABA (meio de conservação) e na ausência de BAP (A) e presença de 1 mg L-1

de BAP (B) (meio de retomada de crescimento).

Resposta morfogenética (%)

ABA (mg L-1)

BAP (mg L-1)

0 1

0 94,45aA 88,89aA

0,5 66,68aB 94,45aA

1,0 94,45aA 83,34aA

2,0 77,78aB 100,00aA

4,0 88,89aA 83,34aA

CV (%) 19,11

B A

41

Tabela 7. Valores médios da resposta morfogenética de plântulas de jenipapeiro do acesso

CZA em função do tipo de explante e da presença e ausência de BAP (meio de retomada de

crescimento) e do meio de conservação.


Basal 21,67 0 38,33 40

Mediano 10 0 45 45

Apical 6,67 1,67 55 36,67


0 15,56 0 84,44 0

1 10 1,1 7,78 81,12


0 8,33 0 55,56 36,11

0,5 19,44 0 41,67 38,89

1,0 11,11 0 47,22 41,67

2,0 11,11 0 38,89 50

4,0 13,89 2,78 47,22 36,11


organogênese direta; OI - organogênese indireta;

Para os fatores, tipo de explante e meio de conservação (ABA), observou-se

respostas morfogenéticas com organogênese direta e indireta, no entanto, houve maior

porcentagem de explantes com organogênese direta (Tabela 7).



Houve efeito significativo do meio de conservação (MC), do BAP e da interação MC x

BAP na retomada do crescimento in vitro de jenipapeiro (Anexo F), não havendo efeito

significativo do tipo de explante e das demais interações.

42

Conforme a Tabela 8, explantes mantidos na fase de conservação em meio MS + 30

g L-1 de sacarose e ½ MS com 15 de sacarose, apresentaram menor resposta

morfogenética na ausência de BAP quando comparado com os demais tratamentos. Estes

resultados reforçam que as plântulas mantidas em meios que induziram uma desaceleração

do crescimento na fase de conservação, apresentaram menor recuperação, sendo

necessário a adição de BAP na fase de retomada de crescimento.

Não houve diferença entre as respostas morfogenéticas dos explantes mantidos nos

diferentes meios de cultura na presença de BAP (1 mg L-1), sendo que os meios ½ MS com

30 g L-1 de sacarose e ¼ MS com 15 e 30 g L-1 de sacarose induziram 100% de resposta

morfogenética dos explantes.


do meio de conservação e da presença ou ausência de BAP (meio de retomada do

crescimento).

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna ou maiúscula na linha, não diferem

significativamente, entre si, ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

Os meios MS com 30 g L-1 de sacarose e ½ MS com 15 e 30 g L-1 de sacarose

promoveram menor resposta morfogenética na ausência de BAP que na presença desse

regulador (Tabela 8).

A presença de 1,0 mg L-1 de BAP influenciou positivamente na retomada de crescimento in

vitro, com aumento significativo na resposta morfogenética dos explantes mantidos no meio

de cultura contendo essa citocinina (Tabela 8).


Meio de conservação

BAP (mg L-1)

0 1

MS + 30 g L-1 sacarose 16,67cB 75,0aA

½MS + 15 g L-1 sacarose 61,11bB 94,45aA

½MS + 30 g L-1 sacarose 72,22abB 100,0aA

¼MS + 15 g L-1 sacarose 94,45aA 100,0aA

¼MS + 30 g L-1 sacarose 88,89abA 100,0aA

CV (%) 24,42

43

Tabela 9. Valores médios da resposta morfogenética do acesso CZA em função do tipo de

explante, da presença e ausência de BAP (meio de retomada do crescimento) e do meio de

conservação.


Basal 35 41,67 23,33 0

Mediano 28,34 43,33 28,33 0

Apical 26,67 16,67 38,33 18,33


0 43,33 0 56,67 0

1 16,67 67,78 3,33 12,22


MS + 30 g L-1 sacarose 58,33 27,78 8,33 5,56

½MS + 15 g L-1 sacarose 36,11 38,89 22,22 2,78

½MS + 30 g L-1 sacarose 36,11 33,33 27,78 2,78

¼MS + 15 g L-1 sacarose 13,89 36,11 47,22 2,78

¼MS + 30 g L-1 sacarose 5,56 33,33 44,44 16,67


organogênese direta; OI - organogênese indireta;

A presença de BAP combinado com sacarose e diferentes concentrações de sais MS

no meio de cultura também promoveu uma maior resposta morfogenética de explantes com

calogênese. Na sua ausência observou-se maior número de explantes com organogênese

direta (Tabela 9, Figura 15).

O tipo de explante e o meio de conservação induziu consideravelmente a

regeneração com formação de calos e explantes com resposta organogenética direta.

44

Figura 15. Resposta morfogenética de explantes do acesso CZA em meio com redução de

sais MS (meio de conservação) e na A- ausência de BAP B- presença de 1 mg L-1 de BAP

(meio de retomada do crescimento).

Estudos posteriores deverão ser realizados para o ajuste de um meio de retomada

do crescimento que promova maior regeneração de explantes mantidos nessa condição na

etapa de conservação.

4. CONCLUSÕES

- O manitol nas concentrações estudadas não induz a desaceleração do crescimento das

plântulas de jenipapeiro;

- O ácido abscísico (0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1) promove a desaceleração do crescimento das

plântulas de jenipapeiro;

- Os meios MS e ½ da concentração de sais MS na presença de 30 g L-1 de sacarose

promovem desaceleração do crescimento das plântulas de jenipapeiro;

- A presença de 1 mg L-1 de BAP no meio de retomada do crescimento induz maior resposta

morfogenética em explantes de jenipapeiro oriundos de plântulas de jenipapeiro mantidas

sob crescimento lento;

A B

45

- Segmentos nodais apicais, medianos e basais apresentam potencial morfogenético na fase

de retomada de crescimento.


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47

CAPÍTULO 2 – EFEITO DO MEIO DE CULTURA NA GERMINAÇÃO IN VITRO JENIPAPEIRO

RESUMO

A cultura de tecidos surge como uma das ferramentas biotecnológicas de maior êxito,

envolvendo um grupo heterogêneo de técnicas que abrange métodos de propagação e

conservação de germoplasma. Apesar do conhecimento do potencial produtivo e da

adaptabilidade do jenipapeiro nas diversas regiões tropicais, ainda são poucos os trabalhos

sobre esta espécie. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes meios de

cultura na germinação in vitro de sementes de jenipapeiro. O experimento foi conduzido no

Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros Costeiros, SE. Foram

utilizadas sementes de frutos maduros de jenipapeiro provenientes de população natural do

povoado Oiteiros em Nossa Senhora das Dores- SE (acesso OIT) e testadas diferentes

variações de sais MS e sacarose: T1) Meio MS + 30 g L-1 de sacarose; T2) MS + 15 g L-1 de

sacarose; T3) ½ MS + 30 g L-1 de sacarose; T4) ½ MS + 15 g L-1 de sacarose e T5) Água +

6,0 g L-1 de ágar. Os tratamentos 1, 2, 3 e 4 foram gelificados com 4,5 g L-1 de Phytagel®. O

experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado com cinco tratamentos

e quatro repetições. As plântulas foram avaliadas aos 60, 90, 120 e 150 dias e todas as

variáveis foram submetidas à análise de variância e comparadas pelo teste de Tukey a 1%

de probabilidade. Houve efeito significativo dos meios de cultura para a porcentagem de

explantes germinados in vitro, o comprimento da parte aérea e o tempo de cultivo in vitro.

Observou-se que na ausência de sais e de sacarose houve maior porcentagem de

germinação e menor comprimento da parte aérea quando comparado com os demais

tratamentos. À medida que as concentrações dos sais do meio MS foram reduzidas, houve

um acréscimo no comprimento da parte aérea e na porcentagem de germinação in vitro de

plântulas de jenipapeiro.

Palavras-chave: Genipa americana L.; propagação in vitro; cultura de tecidos

48

ABSTRACT

Tissue culture emerges as one of the most successful biotechnology techniques involving a

heterogeneous group of techniques covering methods of propagation and germplasm

conservation. Despite knowledge of the productive potential and adaptability of jenipapo in

various tropical regions, there are few studies on this species. The aim of this study was to

evaluate the effect of different culture media on in vitro germination of jenipapo seeds. The

experiment was conducted at the Laboratory of Plant Tissue Culture Embrapa Coastal

Tablelands, SE. Seeds were obtained of ripe fruit of jenipapo natural population from

Oiteiros city at Nossa Senhora do Socorro, Sergipe (acesso OIT) and tested different

variations of MS salts and sucrose: T1) MS + 30 g L-1 sucrose, T2) MS + 15 g L-1 sucrose;

T3) ½ MS + 30 g L-1 sucrose; T4) ½ MS + 15 g L-1 sucrose and T5) Water + 6.0 g L-1 agar.

Treatments 1, 2, 3 and 4 were gelled with 4.5 g L-1 Phytagel ®. The experiment was

conducted in a completely randomized design with five treatments and four replications.

Seedlings were evaluated at 60, 90, 120 and 150 days, and all variables were subjected to

analysis of variance and compared by Tukey test at 1% probability. There was a significant

effect of culture media for the percentage of sprouted explants in vitro, shoot length and time

of in vitro culture. It was observed that in the absence of salts and sucrose was higher

germination percentage and lowest shoot length compared with the other treatments. As the

concentrations of salts of MS medium were reduced, there was an increase in shoot length

and germination in vitro of jenipapo plantlets.

Key-words: Genipa americana L., in vitro propagation, tissue culture.

49

1. INTRODUÇÃO

O jenipapeiro é uma fruteira pouco exigente que adapta-se muito bem ao clima tropical

e a tipos variados de solo, sendo a exploração dessa espécie predominantemente

extrativista, feita por pequenos agricultores tradicionais e proprietários da terra, sem

tecnologia e tratos culturais. Se desconhece, no Brasil, a existência de pomares comerciais

registrados desta frutífera (ROCHA, 2006; DANTAS et al., 2009).

A germinação é um evento fisiológico que depende da qualidade da semente e das

condições de germinação. Essas condições ou requerimentos básicos para germinação

variam entre as espécies de plantas (SALOMÃO & SOUSA-SILVA, 2003; MARCOS FILHO

et al., 1987). Para isso, estudos de meios de cultura que favoreçam a germinação in vitro

são importantes para maximizar a taxa de germinação e permitir a obtenção de plântulas

sadias, vigorosas e com qualidade genética, sirvam como fonte de explante confiável para

estudos posteriores.

O uso de sementes como explante proporciona algumas vantagens em relação aos

demais tipos de explantes, como o rápido crescimento e, consequentemente, a

disponibilidade de material mais rapidamente para as etapas seguintes do cultivo, bem

como a facilidade de enraizamento da cultura, visto que vigor e enraizamento adventício são

características naturais de tecidos em estado juvenil (MORAES et al., 2007; ASSIS &

TEIXEIRA, 1998; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).

A obtenção de plântulas assépticas para o estabelecimento de protocolos de

propagação de plantas lenhosas tem sido aplicado a diversas espécies (COELHO et al.,

2001; NOGUEIRA et al., 2004; FREIRE et al., 2008; LÉDO et al., 2007; 2008) . Dessa

forma, a germinação de sementes in vitro possui relevante importância para a

micropropagação, tendo em vista a obtenção de plântulas sadias como fonte de explantes.

Técnicas de propagação in vitro bem desenvolvidas ou adaptadas para o jenipapeiro

são de grande importância para programas de conservação de recursos genéticos e

melhoramento genético dessa espécie. Portanto, o objetivo do trabalho foi avaliar diferentes

meios de cultivo para a germinação in vitro de jenipapeiro.


Sementes extraídas de frutos maduros de acessos de jenipapeiro de ocorrência em

população natural do povoado Oiteiros- SE (acesso OIT) (9°40'52.10"S; 37°05'12.45"O),

foram mantidas por 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, foram submetidas a

50


em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) com 2,5% de cloro ativo na proporção 2:1 com

duas gotas de detergente por 20 minutos (ROCHA, 2006). Ao final desse tempo, foram

lavadas, três vezes, em água destilada e autoclavada.

Para estudo da germinação in vitro foram avaliados cinco meios de cultura: T1: Meio

MS + 30 g L-1 de sacarose; T2: MS + 15 g L-1 de sacarose; T3: ½ MS + 30 g L-1 de sacarose;

T4: ½ MS + 15 g L-1 de sacarose e T5: Água + 6,0 g L-1 de ágar. Os tratamentos 1, 2, 3 e 4

foram gelificados com 4,5 g L-1 de Phytagel®.

Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para 5,8 ± 0,1 foram gelificados com

Phytagel® e submetidos a autoclavagem por 15 minutos a uma temperatura de 121 ± 1°C e

pressão de 1,05 atm. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura

controlada de 25 ± 2°C, umidade relativa do ar média em torno de 70% com fotoperíodo de

12 horas de luz e intensidade luminosa de 60 µmol m-2s-1.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com cinco tratamentos e

quatro repetições, sendo cada tratamento composto por vinte frascos (5 sementes/frasco). A

avaliação foi realizada a cada 30 dias durante quatro meses, sendo observada aos 120 dias

a porcentagem de plântulas normais e comprimento da parte aérea. Foi considerada como

plântula normal as que apresentaram formação de parte aérea e raiz.

As médias das variáveis foram submetidas à análise de variância e comparadas pelo

teste de Tukey a 1% de probabilidade, utilizando o programa estatístico SISVAR

(FERREIRA, 2011).


Conforme a análise de variância houve efeito significativo dos meios de cultura para

a porcentagem de plântulas normais e para o comprimento da parte aérea (Anexos G, H).

Observou-se que na ausência de sais e no meio ½ MS com 30 g L-1 de sacarose houve

maior porcentagem de germinação de plântulas normais (Tabela 10, Figura 16).

51

Tabela 10. Porcentagem de plântulas normais do acesso OIT em diferentes meios de cultura

aos 120 dias de cultivo in vitro.

Tratamentos Plântulas normais (%)

Água + ágar 91,25a

MS + 15 g L-1 sacarose 34,02c

MS + 30 g L-1 sacarose 54,75b

½ MS + 15 g L-1 sacarose 64,13b

½ MS + 30 g L-1 sacarose 78,69a

CV (%) 21,67

Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, entre si, ao nível de 1% pelo teste

de Tukey.

Na ausência de sais e da sacarose (meio T5) houve mais de 90% de germinação

(Tabela 10), não diferindo estatisticamente do meio composto por ½ MS + 30 g L-1 sacarose

(78%). No entanto, observou-se um menor comprimento da parte aérea dos explantes

mantidos na ausência de sais e sacarose (Tabela 11) quando comparado com o meio ½

MS com 30 g L-1 de sacarose (T3). Apesar do baixo custo proporcionado pelo meio T5 o

meio T3 também é promissor pela excelente vigor apresentado pelas plântulas (Figura 16).

Tabela 11. Comprimento da parte aérea (CPA) de plântulas do acesso OIT em diferentes

meios de cultura aos 120 dias de cultivo in vitro.

Tratamentos CPA (cm)

Água + Agar 4,54c

MS + 15 g L-1 sacarose 5,16bc

MS + 30 g L-1 sacarose 6,78ab

½MS + 15 g L-1 sacarose 5,85abc

½MS + 30 g L-1 sacarose 7,31a

CV (%) 18,84

Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, entre si, ao nível de 1% pelo teste

de Tukey.

52

Figura 16. Germinação in vitro do acesso OIT, aos 120 dias, nos meios T1: Meio MS + 30 g

L-1 de sacarose; T2: MS + 15 g L-1 de sacarose; T3: ½ MS + 30 g L-1 de sacarose;

T4: ½ MS + 15 g L-1 de sacarose e T5: Água + 6,0 g L-1 de ágar.

Durante o cultivo in vitro, as soluções de sais e açúcares que compõem os meios de

cultura não exercem efeito puramente nutritivo, mas também influenciam o crescimento

celular e na morfogênese por meio de propriedades osmóticas (GEORGE, 1996).

Considerando que os cotilédones têm a função de armazenar substâncias de reservas até a

plântula tornar-se autotrófica (LÉDO et al., 2008), a presença de solução nutritiva no meio

externo torna-se dispensável para o crescimento inicial de plântulas de jenipapeiro

cultivadas in vitro. Provavelmente, por apresentar concentrações de nutrientes acima

daquelas requeridas para o jenipapeiro, o meio MS pode ter influenciado à germinação.

Houve efeito significativo do tempo de cultivo in vitro na porcentagem de plântulas

normais (ANEXO G). A porcentagem de explantes germinados em função do tempo de

cultivo in vitro variou segundo uma regressão linear (Figura 17), sendo observadas aos 90 e

120 dias as maiores porcentagens de germinação in vitro.

T1 T2 T3 T4 T5

53

Figura 17. Porcentagem de plântulas normais (PPN) do acesso OIT em função do tempo de

cultivo in vitro.

4. CONCLUSÕES

- A ausência de sais e de sacarose induz maior porcentagem de germinação de plântulas

normais e menor comprimento da parte aérea de plântulas do acesso OIT;

- A metade da concentração de sais MS na presença de 30 g L-1 sacarose favorece o

desenvolvimento da parte aérea das plântulas do acesso OIT;

- O tempo de cultivo in vitro influencia a porcentagem de germinação in vitro de jenipapeiro

até os 120 dias.


ASSIS, T. F.; TEIXEIRA, S. L. Enraizamento de plantas lenhosas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. v.1. Brasília: EMBRAPA Produção de Informação/ Centro Brasileiro Argentino de Biotecnologia, p.261- 296, 1998.

y = 0,341x + 38,98 R² = 0,9767

40

50

60

70

80

90

30 60 90 120

PP

N (

%)

Tempo (dias)

54

COELHO, M. C. F.; PINTO, J. E. B. P.; MORAIS, A. R. de; CID, L. P. B.; LAMEIRA, O. A. Germinação. Germinação de sementes de sucupira-branca [ Pterodon pubescens (Benth.) Benth.] in vitro e ex vitro. Ciência e Agrotecnologia, v.25, n.1, p.38-48, 2001. DANTAS, A. C. V. L.; COSTA, M. A. P. C.; SOUZA, F. V. D.; SANTOS, R. O. S.; SANTOS, L. S. L. In: SANTOS- SEREJO, J. A.; DANTAS, J. L. L.; SAMPAIO, C. V.; COELHO, Y. S. (Eds.). Fruticultura Tropical: espécies regionais e exóticas. EMBRAPA, p. 275-291, 2009. FERREIRA, D. F. SISVAR: a computer statistical analysis system. Ciência e Agrotecnologia, v.35, n.6, p.1039- 1042, 2011. FREIRE, K. C. S.; MACHADO, C. A.; LEDO, A. da S.; OLIVEIRA, L. F. M. Assepsia e germinação in vitro de Moringa (Moringa oleifera Lam.). Cadernos de graduação, v.8, p.9-19, 2008. GEORGE, E. F. Plant propagation by tissue culture. The technology. Edington: Exegetics, 574p. 1996. GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. v.1. Brasília: EMBRAPA Produção de Informação/ Centro Brasileiro Argentino de Biotecnologia, p.183- 260, 1998. LEDO, A. S.; VIEIRA, G. S. S.; BARBOZA, S. B. S. C.; SILVA JUNIOR, J. F. Crescimento inicial de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) em diferentes meios de germinação in vitro. Ciência e Agrotecnologia, v.31, p.989-993, 2007. LEDO, A. da S.; BLANK, A. F.; BARBOZA, S. B. S. C.; RANGEL, M. S. A.; LEDO, C. A. S. Germinação in vitro de embriões zigóticos e sementes de nim indiano (Azadirachta indica A. Juss). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v.10, p.1- 5, 2008. MARCOS FILHO, J.; CICERO, S. M.; SILVA, W. R. Avaliação da qualidade das sementes. FEALQ, 230p. 1987. MORAES, R.M.; CALDAS, L.S.; SILVEIRA, C.E.S.; SOUZA, A.V.; BERTONI, B. W.; PEREIRA, A.M.S. Micropropagação e Banco de Germoplasma in vitro para produção e conservação de plantas nativas do Cerrado. In: PEREIRA, A.M.S. (org). Recursos genéticos e conservação de plantas medicinais do Cerrado. Ribeirão Preto, p. 185-212, 2007. NOGUEIRA, R. C.; PAIVA, R.; CASTRO, A. H. de.; VIEIRA, C. V.; ABBADE, L. C.; ALVARENGA, A. A. Germinação in vitro de murici-pequeno (Byrsonima intermedia A. Juss.). Ciência e Agrotecnologia, v.28, n 5, p.1053-1059, 2004. ROCHA, M. A. C. Morfogênese in vitro em jenipapeiro (Genipa americana L.). 2006, 66 f. (Dissertação, Mestrado em Ciências Agrárias). Universidade Federal da Bahia, Cruz das Almas, BA. SALOMÃO, A. N; SOUSA-SILVA, J. C. Germinação, análise e armazenamento de sementes. In: SALOMÃO, A. N. et al. (Eds) Germinação de sementes e produção de mudas e plantas do Cerrado. Rede de Sementes do Cerrado, p.3-10, 2003.








55

CAPÍTULO 3 – INDUÇÃO DE EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM JENIPAPEIRO

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes meios de cultura na indução da embriogênese somática de explantes de jenipapeiro. O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da Embrapa Tabuleiros Costeiros, SE. Foram utilizadas sementes de frutos maduros de jenipapeiro provenientes de população natural do povoado Siriri, Sergipe (acesso SIR). Sementes extraídas dos frutos foram desinfestadas e posteriormente inoculadas em meio MS com 30 g L-1 de sacarose e 4,5 g L-1 de Phytagel®. Após 90 dias de cultivo, as plântulas foram segmentadas (explante caulinar e foliar) e transferidas para um novo meio MS suplementado com 30 g L-1 de sacarose e diferentes concentrações de 2,4- Diclorofenoxiacético- 2,4-D (0; 4 e 8 mg L-1) combinadas com quatro concentrações de benzilaminopurina-BAP (0; 1; 2 e 3 mg L-1). Aos 120 dias, foram avaliados a porcentagem de explantes com resposta morfogenética (PRM). O delineamento estatístico foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 4 x 2 (três concentrações de 2,4-D combinadas com quatro concentrações de BAP e dois tipos de explantes). As médias das variáveis foram submetidas à análise de variância pelo teste F, as médias qualitativas comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância e, para variáveis quantitativas, ajustadas equações de regressão polinomial utilizando o programa estatístico SISVAR. Houve efeito significativo isolado do 2,4-D, BAP e do explante e das interações: 2,4-D x explante e BAP x explante; na porcentagem de explantes com resposta morfogenética (PRM). O aumento das concentrações de 2,4-D propiciou um acréscimo gradativo da porcentagem de explantes com resposta morfogenética. O tipo de explante utilizado também influenciou na resposta dessa variável, sendo que o segmento caulinar induziu maior resposta morfogenética que o segmento foliar na ausência e na concentração 4 mg L-1 de 2,4-D. Além desse regulador de crescimento, o BAP também influenciou significativamente na resposta morfogenética dos explantes estudados, havendo uma redução gradativa na resposta dessa variável em função do aumento das concentrações de BAP, para o explante caulinar e efeito positivo na resposta morfogenética para o explante foliar. O explante caulinar apresentou maior resposta morfogenética na presença de 2,4-D.

Palavras-chave: Genipa americana L.; organogênese; calogênese

56

ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate the effect of different culture media on the

induction of somatic embryogenesis from explants jenipapeiro. The experiment was

conducted at the Laboratory of Plant Tissue Culture Embrapa Coastal Tablelands, SE.

Seeds of ripe fruit of jenipapo natural population from the Siriri, Sergipe, Brazil (acess SIR).

The material was inoculated on MS medium with 30 g L-1 sucrose and 6 g L-1 Phytagel ®.

After 90 days of cultivation, the plants were segmented and transferred to a new MS medium

supplemented with 30 g L-1 sucrose and different concentrations of 2,4 -

Dichlorofenoxyacetic-2,4-D (0, 4 and 8 mg L- 1) combined with concentrations of four-

benzylaminopurine (BAP 0, 1, 2 and 3 mg L-1). At 120 days was to evaluate the percentage

of explants with morphogenetic response (PRM). The statistical design was a completely

randomized factorial 3 x 4 x 2 (three concentrations of 2,4-D combined with four

concentrations of BAP and two types of explants) averages of variables were subjected to

analysis of variance by F test means were compared by Tukey test at 5% significance level,

and for quantitative variables, equations of polynomial regression using the statistical

program SISVAR. Significant effect isolated from 2,4-D, BAP and the explant and

interactions: 2,4-D x explant; BAP x explant, 2.4-D x BAP explant percentage of explants

with morphogenetic response (PRM). Increasing concentrations of 2,4-D provided a gradual

increase percentage of explants with morphogenetic response. The type of explant used also

influence the response of this variable, with the largest stem segment induced

morphogenetic response to the foliar concentration in the absence and 4 mg L-1 2,4-D.

Besides this plant regulator, the BAP also significantly influenced the response of

morphogenetic explants studied, with a gradual reduction in the response of this variable as

a function of increasing concentrations of BAP to the stem explant and positive effect on

morphogenetic response to foliar explants. The stem explant showed greater response in the

presence of morphogenic plant regulator.

Key words: Genipa americana L.; organogenesis in vitro; callogenesis

57

1. INTRODUÇÃO

A Genipa americana L. é uma espécie indígena de importância econômica por sua

multiplicidade de uso, sendo aproveitada para diversos fins: é uma espécie utilizada como

essência florestal, como produtora de alimentos, na recomposição de matas ciliares, em

atividades medicinais e ainda para repovoamento de animais em zonas tropicais da fauna

brasileira (BAHIA, 2012). Apresenta grande demanda por parte do mercado de frutas

frescas, por se tratar de uma fruta saborosa, de baixa perecibilidade e com excelentes

qualidades nutricionais.

Usualmente o jenipapeiro tem sido propagado por sementes, entretanto estudos

preliminares indicam a possibilidade de propagação assexuada por enxertia por borbulhia e

garfagem, com predominância da via sexuada (DANTAS et al., 2009). Dessa forma, o

aprimoramento de métodos de propagação vegetativa torna-se imprescindível para a

multiplicação e a conservação da espécie.

A propagação de espécies florestais normalmente é via sementes, entretanto a

micropropagação é uma ferramenta que vem auxiliando na multiplicação de diversas

espécies. Técnicas baseadas na micropropagação de plantas podem ser empregadas com

sucesso para a obtenção massal de genótipos selecionados (THORPE & KUMAR, 1993).

O estudo de respostas morfogenéticas in vitro tem sido aplicado para diversas

espécies de importância econômica como a banana, mamão, tomate (BORGES et al.,

2005; BORGES et al., 2006; COSTA et al., 2011). A embriogênese somática tem se

mostrado importante para a micropropagação de plantas em larga escala. Essa técnica

apresenta uma grande vantagem sobre os demais sistemas de micropropagação, pois

grandes quantidades de embriões podem se formar em suspensões de células

embriogênicas com um mínimo de manipulação manual e espaço físico, principais

componentes do custo de uma planta micropropagada (GRATTAPAGLIA & MACHADO,

1998).

As técnicas de micropropagação de jenipapeiro tem sido baseadas na organogênese

(ROCHA, 2006) com o uso de cotilédones, folhas e hipocótilo na presença de reguladores

como BAP e ANA.

Não existem relatos científicos sobre a indução de calos embriogênicos em Genipa

americana L. O objetivo do presente trabalho foi o de estudar as respostas morfogenéticas

de diferentes explantes de jenipapeiro do acesso SIR submetidos a várias condições de

cultura in vitro.

58


2.1. Material vegetal

Sementes obtidas de frutos maduros de acessos de jenipapeiro de população natural

do povoado Siriri, Sergipe (acesso SIR) (10°36'50.79"S; 37°07'36.05"O), após a extração

foram mantidas por 24 horas em temperatura ambiente. Em seguida, foram submetidas a


em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) com 2,5% de cloro ativo na proporção 2:1 com

duas gotas de detergente por 20 minutos (ROCHA, 2006). Ao final desse tempo, foram

lavadas, três vezes, em água destilada e autoclavada.

2.2. Condições de cultivo

O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas da

Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju- SE. Os meios de cultura com o pH ajustado para

5,8 ± 0,1 foram gelificados com Phytagel® e submetidos a autoclavagem por 15 minutos a

uma temperatura de 121 ± 1°C e pressão de 1,05 atm.

As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25

± 2°C, umidade relativa do ar média em torno de 70%, na ausência de luz por 90 dias e

depois transferidas para fotoperíodo de 12 horas de luz e intensidade luminosa de 60 µmol

m-2s-1.

2.3. Indução de embriogênese somática in vitro de jenipapeiro

Para o estudo da indução de embriogênese somática utilizou-se segmentos caulinares

e foliares excisados de plântulas assépticas de jenipapeiro com 90 dias de cultivo in vitro.

Os explantes foram inoculados em frascos de vidro com capacidade de 250 mL, contendo

30 mL de meio de cultura básico MS 30 g L-1 de sacarose e gelificados com 4,5 g L-1 de

Phytagel®. Foram avaliadas três concentrações de 2,4- diclorofenoxiacético- 2,4-D (0; 4 e 8

mg L-1) combinadas com quatro concentrações de benzilaminopurina-BAP (0; 1; 2 e 3 mg L-

1).

59

2.4. Avaliação do experimento

Aos 90 e 120 dias foram avaliados a porcentagem de explantes com resposta

morfogenética (PRM). Foram considerados explantes com resposta morfogenética os que

apresentaram a formação de calos friáveis com ou sem regeneração.

2.5. Delineamento experimental e análises estatísticas

O delineamento estatístico foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 4 x

2 (três concentrações de 2,4-D combinadas com quatro concentrações de BAP e dois tipos

de explantes) totalizando 24 tratamentos com duas repetições. Cada parcela experimental

foi composta de três frascos contendo 2 explantes/frasco.

As médias das variáveis foram submetidas à análise de variância pelo teste F, e

comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância e, para variáveis quantitativas,

ajustadas equações de regressão polinomial utilizando o programa estatístico SISVAR

(FERREIRA, 2011).


Não foi observada, até os 120 dias a indução de calos embriogênicos nos diferentes

tratamentos testados. Verificaram-se diferentes respostas morfogenéticas como a

calogênese e a organogênese direta e indireta. Resultados semelhantes foram observados

por Ledo et al. (2002), em explantes de cupuaçuzeiro. A ausência de indução de calos

embriogênicos observada nas culturas pode estar relacionada com diversos fatores como

tipo e o estádio de desenvolvimento dos explantes, meio de cultura, reguladores de

crescimento e outros. O estádio fisiológico do explante é um fator importante, conforme

relatado por Guerra et al. (1999) e está relacionado com o número de receptores das células

responsivas para os reguladores de crescimento presentes no meio de cultura.

Houve efeito significativo isolado do 2,4-D, BAP e do explante e das interações: 2,4-

D x explante e BAP x explante; na porcentagem de explantes com resposta morfogenética

(PRM). Não houve efeito significativo para as demais combinações de fatores (Anexo I).

A porcentagem de explantes com resposta morfogenética variou segundo uma

regressão polinomial linear para o explante foliar havendo um acréscimo gradativo na

resposta dessa variável em função do aumento das concentrações de 2,4-D (Figura 18).

Para o segmento caulinar, observou-se um comportamento linear em resposta a

60

porcentagem de explantes com o aumento da resposta morfogenética em função do

aumento das concentrações de 2,4- D. Observou-se uma diferença considerável entre os

explantes foliares e caulinares na ausência do 2,4-D. Enquanto no explante foliar foi

observada 30,43% de resposta morfogenética na ausência de 2,4-D, no explante caulinar

houve 85,42% de resposta morfogenética (Figura 18, Tabela 12).

Figura 18. Porcentagem de resposta morfogenética de explantes do acesso SIR em função

da concentração de 2,4-D aos 120 dias de cultura in vitro. A - explante foliar; B-segmento

caulinar.

Conforme a Tabela 12, o tipo de explante influenciou na resposta morfogenética,

sendo o segmento caulinar responsável por uma maior resposta dessa variável quando

y = 8,4352x + 34,737 R² = 0,9535

20

40

60

80

100

0 4 8

Resposta

Morf

ogenética (

%)

2,4-D (mg L-1)

y = 1,3421x + 87,794 R² = 0,6297

80

85

90

95

100

0 4 8

Resposta

Morf

ogenética (

%)

2,4-D (mg L-1)

A

B

61

comparado com o foliar na ausência e na concentração 4 mg L-1 de 2,4-D. No entanto, na

presença de 8 mg L-1 não houve diferença estatística entre os explantes.

Tabela 12. Porcentagem de resposta morfogenética de expantes do acesso SIR em função

do tipo de explante e da concentração de 2,4-D.

Médias seguidas pela mesma letra na linha, não diferem significativamente, entre si, ao nível de 5%

pelo teste de Tukey.

O BAP influenciou significativamente na resposta morfogenética dos explantes

estudados (Figura 19). Para o explante caulinar, observou-se um comportamento

quadrático na resposta morfogenética, havendo uma pequena redução gradativa na

resposta dessa variável em função do aumento das concentrações de BAP. A sua adição ao

meio de cultura teve efeito positivo na resposta morfogenética do explante foliar, já que na

ausência dessa citocinina notou-se o desenvolvimento morfogenético de apenas 47,22%,

resultado bem inferior aos observados na presença desse regulador (Figura 19A, Tabela

13). A presença de citocinas no meio de cultura tem sido reportada por vários autores como

indutor de maior resposta morfogenética in vitro. Segundo Borges et al. (2005) a adição de

thiadizuron (TDZ) no meio de cultura promoveu maior formação de calos basais nas

cultivares de tomateiro Diva, Carmem e Thomas. Em explantes de mamoeiro, Borges et al.

(2006) obtiveram maior formação de calos friáveis e vários brotos regenerados na

presença de 1 µM TDZ.


2,4-D (mg L-1)

Tipo de explante

Foliar Caulinar

0 30,43B 85,42A

4 77,08B 97,92A

8 97,92A 96,15A

CV (%) 28,13

62

Figura 19. Porcentagem de resposta morfogenética de explantes do acesso SIR em função

da concentração de BAP aos 120 dias de cultura in vitro. A- explante foliar; B- explante

caulinar.

O tipo e a sanidade do explante são extremamente importantes para o sucesso de

qualquer protocolo de multiplicação in vitro. Observou-se nesse estudo que houve diferença

estatística entre os explantes foliar e caulinar na ausência e na presença de BAP nas

concentrações 1 e 3 mg L-1 (Tabela 13). De modo geral, o explante caulinar apresentou

maior resposta morfogenética na ausência e presença do BAP, sendo observada de modo

geral maior resposta da variável estudada para esse tipo de explante do que o explante

foliar. Somente na concentração de 2 mg L-1 de BAP, os segmentos caulinar e foliar não

diferiram entre si. Resultados semelhantes foram observados por Borges et al. (2005) em

y = -12,295x2 + 43,472x + 47,067 R² = 0,9994

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3

Resposta

Morf

ogenética (

%)

BAP (mg L-1)

y = -2,9729x2 + 5,1308x + 95,05 R² = 0,8607

80

85

90

95

100

0 1 2 3

Resposta

Morf

ogenética (

%)

BAP (mg L-1

A

B

63

hipocótilo de diferentes cultivares de tomateiro e por Jordan Z. (2011) em segmentos nodais

de Vasconcellea chilensis Planch quando comparado com segmentos foliares.

Tabela 13. Valores médios da porcentagem de resposta morfogenética de explantes do

acesso SIR em função do tipo de explante e da concentração de BAP.

Médias seguidas pela mesma letra na linha, não diferem significativamente, entre si, ao nível de 5%

pelo teste de Tukey.

Os explantes foliares mantidos em meio de cultura MS na presença de 2,4-D nas

concentrações 4 e 8 mg L-1 e na ausência de BAP, apresentaram maior porcentagem de

calos organogênicos (Tabela 14). No entanto, observou-se que os explantes caulinares

tiveram uma maior resposta de calos organogênicos na ausência de BAP e na ausência e

nas concentrações estudadas de 2,4-D, apresentando resultados superiores aos

observados para os explantes foliares (Tabela 14).


BAP (mg L-1)

Tipo de explante

Foliar Caulinar

0 47,22B 94,12A

1 77,78B 100,0A

2 85,29A 90,63A

3 66,67B 84,62A

CV (%) 28,13

64

Tabela 14. Valores médios da porcentagem de resposta organogenética de explantes

foliares e caulinares do acesso SIR na ausência e na presença de BAP e 2,4-D aos 120

dias de cultivo.

Considerando a porcentagem de explantes com resposta organogenética, verificou-

se que no geral, os explantes foliares apresentam maior número de explantes com

calogênese e organogênese indireta e os segmentos caulinares maior resposta de calos e

organogênese direta (Figura 20).

Organogênese (%)

BAP (mg L-1)

Explante

Foliar Caulinar

0 15,27 37,5

1 1,39 2,79

2 0 0

3 0 0

2,4- D (mg L-1)

0 0 9,38

4 4,17 10,42

8 8,33 10,42

65

Figura 20. Respostas morfogenéticas de explantes foliares (A- calogênese e B-

organogênese indireta) e caulinares (C- calogênese e D- organogêsene direta) do acesso

SIR na presença de 2,4-D e BAP.

A capacidade apresentada por diversos explantes de jenipapeiro em formar calos,

em meio suplementado com diversos reguladores de crescimento, preconiza um estudo

mais aprofundado, como a avaliação do estádio fisiológico e dos níveis endógenos de

fitormônios nos explantes, para melhor controle da expressão morfogenética in vitro.

Estudos posteriores deverão ser conduzidos com outras concentrações de BAP e

2,4-D e outros reguladores que promovam a indução da embriogênese somática. Segundo

Barros (1999), dentre os processos de micropropagação, a embriogênese somática é,

teoricamente, a melhor opção para a propagação in vitro de frutíferas por apresentar

algumas vantagens, tais como: alta taxa de multiplicação comparada a qualquer outro

processo de propagação; produção em larga escala pela manutenção da cultura em meio

A B

C D

66

líquido; plantio direto da muda obtida via embriogênese somática sem necessidade de

enxertia, com menor custo de produção, além de a planta ser geneticamente semelhante à

planta mãe, sem as influências do porta-enxerto, como acontece com as plantas obtidas por

métodos de propagação vegetativa convencionais.

4. CONCLUSÕES

- A presença de 2,4-D e do BAP promovem maior resposta morfogenética dos explantes do

acesso SIR;

- O segmento caulinar apresenta maior calogênese na ausência de BAP e nas

concentrações estudadas de 2,4-D;

- A presença de 8 mg L-1 de 2,4-D e a ausência de BAP induz a formação de 100% de calos

organogenéticos;

- As concentrações de 2,4-D e BAP estudadas não induzem a embriogênese somática nos

explantes do acesso SIR.

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67

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ANEXOS ANEXO A. Resumo do quadro de análise de variância do efeito do manitol e tempo de cultivo in vitro (Tempo) no número de folhas (NF), no comprimento do ponto de início da radícula até a inserção do primeiro par de folhas (PPF), no número de folhas caídas (NFC) e vigor de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA.

QM

FV GL NF CPA NFA1 VIB

Manitol 4 5,9625* 2,648616** 0,114539** 0,410312**

Tempo 3 49,297292** 0,653875* 0,121307** 2,000625**

Manitol x Tempo 12 0,45875 ns 0,019682 ns 0,010289 ns 0,107396 ns

Erro 80 2,3975 0,225469 0,017478 0,084375

CV (%) 14,80 8,60 16,28 6,44 1 Dados transformados para√x+0,5; **significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; *significativo a 5% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. ANEXO B. Resumo do quadro de análise de variância do efeito do ácido abscísico (ABA) e do tempo de cultivo in vitro (Tempo) no número de folhas (NF), no comprimento do ponto de início da radícula até a inserção do primeiro par de folhas (PPF), no número de folhas caídas (NFC) e vigor de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA.

QM


ABA 4 57,891563** 0,2839 ns 0,111643** 0,46625 ns

Tempo 3 4,496667 ns 0,066456 ns 0,00324 ns 0,254167 ns

ABA x Tempo 12 3,525313 ns 0,019363 ns 0,004356 ns 0,010417 ns

Erro 80 1,927188 0,611509 0,022124 0,490625

CV (%) 21,26 14,25 18,18 16,35 1 Dados transformados para√x+0,5; **significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. ANEXO C. Resumo do quadro de análise de variância do efeito de variações de sais do meio MS e sacarose (MC) e do tempo de cultivo in vitro (Tempo) no número de folhas (NF), no comprimento do ponto de início da radícula até a inserção do primeiro par de folhas (PPF), no número de folhas caídas (NFC) e vigor de plântulas de jenipapeiro do acesso CZA.

QM


MC 4 20,742813** 2,528187** 0,01186 ns 2,002187**

Tempo 3 44,549167** 0,628917 ns 0,021869 ns 0,9175**

MC x Tempo 12 1,419479 ns 0,042938 ns 0,008943 ns 0,074271 ns

Erro 80 1,88 0,271191 0,016329 0,167813

CV (%) 13,56 10,26 17,16 8,97 1 Dados transformados para√x+0,5; **significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F.

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ANEXO D. Resumo do quadro de análise de variância da resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA na retomada do crescimento em função da concentração de manitol (MC), do BAP e do tipo de explante.

FV GL QM

MC 4 8398,071297**

BAP 1 3129,581482*

Explante (E) 2 1129,637040 ns

MC x BAP 4 120,354636 ns

MC x E 8 759,285190 ns

BAP x E 2 18,525927 ns

MC x BAP x E 8 342,590743 ns

Erro 30 648,174078

CV (%) 34,98

**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; *significativo a 5% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. ANEXO E. Resumo do quadro de análise de variância da resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA na retomada do crescimento em função da concentração do ABA (MC), do BAP e do tipo de explante.

FV GL QM

MC 4 212,812069 ns

BAP 1 462,759282 ns

Explante (E) 2 1240,664832*

MC x BAP 4 971,902819*

MC x E 8 476,727338 ns

BAP x E 2 685,087062 ns

MC x BAP x E 8 430,431968 ns

Erro 30 277,711132

CV (%) 19,11

*significativo a 5% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. ANEXO F. Resumo do quadro de análise de variância da resposta morfogenética de explantes de jenipapeiro do acesso CZA na retomada do crescimento em função de variações de sais do meio MS e sacarose (MC), do BAP e do tipo de explante.

FV GL QM

MC 4 5143,445372**

BAP 1 11115,831482**

Explante (E) 2 615,648152 ns

MC x BAP 4 1301,062969*

MC x E 8 424,745372 ns

BAP x E 2 476,820372 ns

MC x BAP x E 8 575,232409 ns

Erro 30 384,262965

CV (%) 24,42

**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; *significativo a 5% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F.

70

ANEXO G. Resumo do quadro de análise de variância da porcentagem de plântulas normais de jenipapeiro (PPN%) do acesso OIT na germinação in vitro em função de variações de sais do meio MS e sacarose (MC) e do tempo.

FV GL QM

MC 4 7764,083549**

Tempo 3 3574,220075**

MC x Tempo 12 99,118512 ns

Erro 60 195,685417

CV (%) 21,67

**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. ANEXO H. Resumo do quadro de análise de variância do comprimento da parte aérea (CPA) do acesso OIT na germinação in vitro em função de variações de sais do meio MS e sacarose (MC) aos120 dias.

FV GL QM

MC 4 6,451346**

Erro 20 1,246516

CV (%) 18,84

**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F. ANEXO I. Resumo do quadro de análise de variância da porcentagem de explantes de jenipapeiro do acesso SIR com resposta morfogenética (PRM) em função de diferentes concentrações de BAP e 2,4-D e do tipo de explante.

FV GL QM

2,4-D 2 17736,884007**

BAP 3 2880,457804**

Explante (E) 1 18287,928640**

2,4-D x BAP 6 386,924481ns

2,4-D x E 2 11225,433978**

BAP x E 3 2548,532370**

2,4-D x BAP x E 6 968,582290 ns

Erro 108 450,617284

CV (%) 26,56

**significativo a 1% de probabilidade pelo teste F; ns- não significativo a 5% de probabilidade pelo teste F.

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