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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

RENATO CÉZAR WANDERLEY CUNHA SILVA

HISTOQUÍMICA COM LECTINAS PARA Tn E

IMUNOHISTOQUÍMICA PARA c-erbB-2 NA INVESTIGAÇÃO DO

CARCINOMA DUCTAL INVASIVO DE MAMA (CDI).

Recife

2011

RENATO CÉZAR WANDERLEY CUNHA SILVA

HISTOQUÍMICA COM LECTINAS PARA Tn E

IMUNOHISTOQUÍMICA PARA c-erbB-2 NA INVESTIGAÇÃO DO

CARCINOMA DUCTAL INVASIVO DE MAMA (CDI).

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Inovação Terapêutica da

Universidade Federal de Pernambuco, como

requisito para a obtenção do Título de Mestre

em Inovação Terapêutica.

Orientador: Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão

Departamento de Bioquímica CCB-UFPE

Recife

2011

Silva, Renato Cézar Wanderley Cunha Histoquímica com lectinas para Tn e imunohistoquímica para c-erbB-2 na investigação do carcinoma ductal invasivo de mama (CDI) / Renato Cezar Wanderley Cunha Silva. – Recife: O Autor, 2011. 71 folhas, il., fig., tab.

Orientador: Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de

Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Inovação Terapêutica, 2011. Inclui bibliografia e anexos.

1. Câncer de mama 2. Lectinas 3. Histoquímica I. Título.

616.994 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2011-149

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

REITOR

Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins

VICE-REITOR

Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Prof.ª Dr.ª Ângela Maria Isidro Farias

VICE- DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Prof.ª Dr.ª Silvia Regina Arruda de Moraes

COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA

Prof.ª Dr.ª Suely Lins Galdino

VICE- COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA

Prof.ª Dr.ª Ana Cristina de Almeida Fernandes

FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome: Renato Cézar Wanderley Cunha Silva

Título: Histoquímica com lectinas para Tn e imunohistoquímica para c-erbB-2

na investigação do carcinoma ductal invasivo de mama (CDI).

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pernambuco para

obtenção do título de Mestre em Inovação Terapêutica.

Aprovada em: 15/04/2011

Banca Examinadora

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Eduardo Isidoro Carneiro Beltrão

Departamento de Bioquímica – UFPE

_______________________________________________________________

Prof.ª Dr.ª Paloma L. Medeiros

Departamento de Histologia – UFPE

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Luiz Bezerra de Carvalho Júnior

Departamento de Bioquímica – UFPE

RECIFE

2011

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Auxiliadora e

Manoel, pelo esforço que sempre

fizeram pela minha formação

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela força me dada nos momentos difíceis e iluminação nos momentos

obscuros da vida.

Ao Professor Eduardo Beltrão, um verdadeiro amigo, pela oportunidade que me

deu, pela sua orientação e apoio para o desenvolvimento desse trabalho.

A Moacyr Rêgo, pelos conselhos e ajuda durante todo o período do mestrado,

meus verdadeiros agradecimentos.

Aos Meus pais Manoel e Auxiliadora, por todo amor, educação dada, apoio

incondicional e confiança depositada na minha pessoa, meu muito obrigado,

sem eles eu nada seria.

Aos Meus irmãos Hemanuelly e Augusto, pelo companheirismo de sempre e ao

meu sobrinho Murilo, por mostrar a beleza da vida.

A todos os meus familiares, com especial a Tia Lucy, por contribuir de forma

tão próxima em minha formação.

A Carlos Santos, meu companheiro de Mestrado e um grande amigo, pelos

momentos de aprendizado e divertimento que dividimos.

Aos Amigos do BmC Amanda Lucena, Ana Rosa Galindo, Arthur Clark,

Carmelita Cavalcanti, Diego Albuquerque, Elisabete Enriqueta, Gabriela Souto,

Gilberto Tenório, Juliana Brandão, Juliana Vasconcelos, Petra Barros, Raphael

Douglas e Steffany Ferreira, pelo conhecimento dividido, pela amizade e

companheirismo.

Aos meus amigos da graduação Amanda Aliança, Douglas Holanda, Iana

Rafaela, Isabella Macário, Isabelle Viana, Jana Messias, Julliana Ribeiro, Lívia

Bandeira, Luís Cláudio, Maria Carolina, Natália Moraes, Pollyana Pessoa,

Rafael Silva, Steffany Ferreira, Veridiana Sales e Wheverton Ricardo, pelos

quatro anos de amizade, cada vem mais firme e pelo tempo que ainda

passamos juntos na UFPE.

Aos meus amigos do mestrado, principalmente Andresa Oliveira, Eryvelton

Franco e Helena Bastos, por todos os momentos de estudos e pesquisas e

mesmo no cansaço, as alegrias nos deram forças.

Aos meus amigos Armando Monteiro, Júlia Rodrigues, Marcelle Guedes e

Rosário Medeiros, pela amizade desde o tempo do Salesiano.

A todos que fazem o LIKA, que em suas diferentes atividades, tiveram

importância para o desenvolvimento deste trabalho.

As pessoas e amigos aqui não citados, mas que tiveram também importância

direta e indireta para a realização desse trabalho.

Fica Proibido

Fica proibido chorar sem aprender,

Levantar-se um dia sem saber o que fazer,

Ter medo das tuas recordações.

.

Fica proibido não sorrir ante os problemas,

Não lutar pelo que queres,

Abandonar tudo por medo, Não transformar em realidade teus sonhos.

.

Fica proibido não demonstrar o teu amor,

Fazer com que alguém pague pelas tuas

dúvidas e pelo teu mau humor.

. Fica proibido deixar os teus amigos,

Não tentar compreender aquilo que

viveram juntos,

Chamá-los somente quando precisa deles.

.

Fica proibido não seres tu perante todos, Fingir para as pessoas que não te

importas,

Esquecer todos os que te querem.

.

Fica proibido não fazeres as coisas para ti

mesmo,

Não fazeres o teu destino, Ter medo da vida e dos teus

compromissos,

Não viver cada dia como se fosse o último.

Pablo Neruda

RESUMO

O câncer de tecido mamário é o segundo tipo de câncer mais freqüente no

mundo e o mais comum entre as mulheres. Dentre os tumores malignos de

mama, o carcinoma ductal invasivo (CDI) representam o maior grupo,

constituindo cerca de 65 a 80% dos carcinomas mamários. O perfil morfológico

e molecular desse carcinoma é bastante heterogêneo, apresentando

características bastante variáveis. Uma célula cancerosa não expressa

erroneamente apenas proteínas e DNA, mas carboidratos também, o que

impulsiona a glicobiologia voltada para dignóstico, prognóstico e terapêuica,

sendo as lectinas, uma ferramenta auxiliar. Outra molécula de valor diagnóstico

e prognóstico é c-erbB-2 que tem papel chave na proliferação, adesão,

diferenciação e motilidade celular. O trabalho objetivou avaliar o perfil de N-

aceti-galactosamina em glicoconjugados celulares empregando a histoquímica

com lectinas e o perfil imunohistoquímico para c-erbB-2 no CDI. Foram

utilizadas 61 biópsias do Setor de Anatomia Patologia do Hospital das Clínicas

da Universidade Federal de Pernambuco. Na histoquímica com lectinas os

tecidos foram tratados com tripsina e incubados com as lectinas Dolichos

biflorus agglutinin (DBA) e Vicia villosa agglutinin (VVA), específicas para N-

acetilgalactosamina (GalNAc), conjugadas a biotina (de 80µg/mL). Para a

investigação da proteína c-erbB-2 foi utilizado o método da estreptavidina-

biotina-peroxidase. Para a revelação, foi utilizada uma solução de

diaminobenzidina (DAB) e H2O2. O perfil de c-erbB-2 apresentou correlação

entre a sua superexpressão e o grau histológico e a observação de invasão

linfonodal. O CDI apresentou um perfil de reconhecimento para GalNAc

diferente para as lectinas estudadas. Não se verificou nenhuma relação entre

os achados histoquímicos para VVA e DBA e imunohistoquímicos para c-erbB-

2. Resultados demonstram a histoquímica com Lectina como uma técnica

auxiliar para avaliação do perfil de glicoconjugados no câncer de mama.

Palavras-chave: Histoquímica com Lectinas, c-erbB-2, CDI.

ABSTRACT

Mammary cancer is the second most prevalent female cancer in the world.

Among the malignant ones invasive ductal carcinoma (IDC) represents the

major group corresponding to 65 to 80% of all mammary carcinomas. Its

morphologic and molecular profiles are quite heterogeneous. A cancer cell does

not wrongly express its DNA and proteins but also its carbohydrate array which

brings the glycobiology to the diagnosis and prognosis application where the

lectins are used as auxiliary tools. C-erbB-2 is one protein with importance to

routine diagnosis and prognosis being a key molecule in cel proliferation,

adhesion, differentiation and motility. This work aimed to evaluate the

carbohydrate glycoconjugate cell surface profile using lectin histochemistry and

the c-erbB-2 expression in IDC. Sixty one mammary biopsies diagnosed as ICD

were obtained at the Patholocic Anatomy Service at University Hospital of

Federal University of Pernambuco. Tissue slices were treated with a trypsin and

with a methanol-hydrogen peroxidase solutions and incubated with Dolichos

biflorus agglutinin (DBA) and Vicia villosa agglutinin (VVA), specifics to N-

acetyl-Galactosamine (GalNAc), conjugated to biotin (80µg/mL). c-erbB-2 was

evaluated using the streptavidin-biotin-peroxidase method. Diaminobenzidine-

H2O2 solution was used for staining visualization in both methods. c-erbB-2

presented a correlation between its overexpression and the IDC histologic

grade of dedifferentiation and also with linfonode invasion. DBA and VVA

presented different GalNAc recognition patterns. No correlation was observed

between lectin histochemistry and c-erbB-2 immunehistochemistry. Results

indicate that lectin histochemistry is a actractive auxiliary tool for glycoconjugate

profile in mammary tumours.

Keywords: lectin histochemistry, c-erbB-2, IDC.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Estágios do crescimento anormal das células, desde as células

normais, até o câncer invasivo. (Fonte: www.cienciahoje.uol.br). 18

FIGURA 2: Capacidades adquiridas do câncer. Hanahan e Weinberg (2000)

propôseram um modelo para definir as seis propriedades que caracterizam um

tumor: ilimitado potencial de replicação, angiogênese, evasão da apoptose,

auto-suficiência na sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos

inibidores de crescimento e invasão de tecidos e metástase. Contudo estudos

indicam que este modelo deve ser revisto para incluir a inflamação como mais

uma caracteristica relacionada ao câncer (Mantovani, 2009). 19

FIGURA 3: Migração celular via corrente sanguínea. Esta capacidade de

tumores malignos permite a semeadura de tecidos distantes do tecido original

para desenvolvimento de metástase. (Fonte: www.livingmedicaltestbook.

org). 20

FIGURA 4: Esquema representativo de uma membrana celular e uma camada

rica de carboidratos, formando assim o glicocálice. Fonte:

http://www.tudomaisumpouco.com/images/dna/prot_memb3.jpg 22

FIGURA 5: Migração de células neoplásicas acompanhadas de modificações

moleculares e induções angiogênicas, que resultam em um extravasamento

das mesmas de um ponto localizado fazendo uso dos vasos para obter novos

sítios patológicos. (Thomas e Peeper, 2009). 24

FIGURA 6: Trastuzumab se ligando a dois receptores c-erbB-2, impedindo a

sua ativação. Fonte: www.livingmedicaltestbook.org. 30

http://www.cienciahoje.uol.br/

FIGURA 7: Imunohistoquímica para c-erbB-2 em CDI. A cor castanha indica a

expressão desta proteína. A seta indica área de necrose (comum neste tipo de

tumor). A: umento de 100X, B: aumento de 400X. 38

FIGURA 8: Histoquímica com Lectinas para VVA. A: marcação de membrana e

citoplasma das células transformadas (aumento de 100X). B: marcação positiva

visualizada com aumento de 400X. C: controle negativo da reação (aumento de

100x). 43

FIGURA 9: Histoquimica com Lectinas para DBA. A: marcação de membrana e

citoplasma das células transformadas (aumento de 100X), B: marcação positiva

visualizada com aumento de 400X. 44

LISTA DE TABELAS

TABELA 01: Dados clínicos e histopatológicos das biópsias usadas no

estudo. 37

Tabela 02: Histoquímica com lectinas para carcinoma ductal invasivo de

mama. 40

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

ASCO American Society of Clinical Oncology - Sociedade Americana de

Oncologia Clínica

CCB

CCS

CDI

CDis

Centro de Ciências Biológicas

Centro de Ciências da Saúde.

Carcinoma Ductal Invasivo

Carcinoma Ducta in situ

cDNA Complementary DNA – Fita complementar de DNA

CISH Chromogenic in situ Hybridization – Hibridização cromogênica in

situ

CK Citoqueratina

ConA Concavalina A

CRD Carbohydrate-Recognition Domain – Domínio de Reconhecimento

de Carboidrato

DBA Dolichos biflorus Aglutinina

DNA Deoxyribonucleic acid – Ácido desoxirribonucleico

EBIT Encontro Brasileiro de Inovação Terapêutica

EGFR Epidermal growth factor receptor – Receptor de Fator de

Crescimento Epidermal

FISH Fluorescence in situ hybridization – Hibridização Fluorescente in

situ

GalNAc N-Acetil-galactosamina

GLUT-1 Glucose transporter 1- Transportador de Glicose 1

GS-I Griffonia simplicifolia – I

HC Hospital das Clínicas

HER-2 Human Epidermal growth factor Receptor 2 – Receptor de Fator de

crescimento Epidermal Humano 2

HqL Histoquímica com Lectinas

INCA Instituto Nacional do Câncer

IHQ Imunohistoquímica

PAAF Punção Aspirativa por Agulha Fina

PBS Phosphate buffered saline – Tampão Fosfáto

PPGIT Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

RE Receptor de Estrógeno

RP Receptor de Progesterona

SBBq Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular

SBPC Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor – Receptor do Fator

de Crescimento Endotelial Vascular

VVA Vicia villosa aglutinina

SUMÁRIO

1 REVISÃO DE LITERATURA 17

1.1 Câncer: Considerações Gerais 17

1.2 Câncer: Aspectos Bioquímicos 21

1.3 Câncer de Mama 24

1.4 c-erbB-2/HER-2 28

1.5 Lectinas 30

2 OBJETIVOS 33

2.1 Geral 33

2.2 Específicos 33

3 METODOLOGIA 34

3.1 Materiais 34

3.2 Seleção de Casos 34

3.3 Aspéctos Éticos 34

3.4 Histoquímica com Lectinas 35

3.5 Imunohistoquímica 35

3.6 Controle Negativo 36

3.7 Análise de Imagens 36

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 37

5 CONCLUSÕES 47

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 48

7 ANEXOS 58

7.1 Trabalhos Apresentados em Congressos 58

7.2 Resumos Expandidos Publicados em Revistas 60

7.3 Instruções para Autores 61

Histoquímica com Lectinas para tn e Imunohistoquímica para c-erbB-2... Silva, R. C. W. C.

18

1 REVISÃO DE LITERATURA

1.1 CÂNCER: CONSIDERAÇÕES GERAIS

O câncer é definido como um grupo de doenças caracterizado por um

crescimento descontrolado de células anormais e, embora haja muitos tipos de

câncer, todos eles iniciam dessa mesma forma (INCA, 2010).

A carcinogênese inicia-se a partir de uma alteração do DNA celular ou

da atividade anormal de genes presentes em células sadias, como os que

coordenam a proliferação, a diferenciação, a morte celular por apoptose e

outras funções primordiais para a célula (Conde et al., 2005). Também ocorrem

mudanças da expressão de proteínas celulares que levam a alterações nas

vias de sinalização, induzindo, frequentemente, mudanças no microambiente

tumoral, causando inflamação, o que resulta em mudanças no perfil das

proteínas teciduais que podem ser secretadas (Kopf e Zharhary, 2007).

De acordo com Brevik (2005), o tempo, o meio ambiente e a herança

são os principais aspectos que devem ser unidos para formar um modelo da

carcinogênese. A formação do câncer é dependente do tempo, pois a

incidência de câncer aumenta com a idade. Em países com alta expectativa de

vida, aproximadamente 40% da população desenvolveu algum tipo de câncer

na vida.

Os tumores benignos comumente assemelham-se aos seus tecidos de

origem e as células podem apresentar ou não suas relações normais. Em


19

geral, os tumores benignos são envoltos por uma cápsula de tecido conjuntivo

fibroso que os separam do tecido normal. Apresentam um crescimento lento e

expansivo que permite uma formação de estruturas capilares em torno do

tumor para nutri-lo e adquirem um padrão morfológico do tipo nodular

(Brasileiro-Filho et al, 2000).

O desenvolvimento do câncer segue um processo de múltiplos estágios

(Figura 1), a partir da célula normal, e é caracterizado pelo acumulo de

alterações genéticas que interferem no controle normal do crescimento e

diferenciação celular, ou seja, células normais passar a serem hiperplásicas ou

displásicas que podem se transformar em um câncer localizado e talvez

posteriormente mestatizar-se (Peterson, 2005).

Figura 1: Estágios do crescimento anormal das células, desde as células normais, até o câncer invasivo. (Fonte: www.cienciahoje.uol.br).

Hanahan e Weinberg (2000) sugeriram que dentre os eventos de

transformações neoplásicas, seis alterações são consideradas essenciais e


20

que direcionam o crescimento para malignidade: 1 - alta suficiência nos sinais

de crescimento; 2 - potencial replicativo ilimitado; 3 - indução angiogênica; 4 -

insensibilidade para os sinais inibitórios do crescimento, 5 - evasão da

apoptose e 6 - invasão tecidual e metastática. No entanto Mantovani (2009)

demonstra que o aumento dessas evidências sugere o processo inflamatório

como sétimo elemento integrante das alterações causadoras do câncer (Figura

2).

Figura 2: Capacidades adquiridas do câncer. Hanahan e Weinberg (2000) propôseram um modelo para definir as seis propriedades que caracterizam um tumor: ilimitado potencial de replicação, angiogênese, evasão da apoptose, auto-suficiência na sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos inibidores de crescimento e invasão de tecidos e metástase. Contudo estudos indicam que este modelo deve ser revisto para incluir a inflamação como mais uma caracteristica relacionada ao câncer (Mantovani, 2009).


21

O que leva a malignidade no câncer é sua habilidade em quebrar a

arquitetura tecidual, invadir fronteiras teciduais e metastizar (Figura 3). Em

termos simples, câncer é uma doença de desenvolvimento, ou seja, resultante

da perda dos controles normais da célula (Ingber, 2008). Em um mesmo tumor

suas células tendem a ser heterogêneas com relação a sua capacidade

proliferativa ou metastizante, quantidade de receptores, sensibilidade à

resposta imunológica ou tratamento e grau de autonomia do crescimento. Essa

heterogeneidade genética e epigenética são elementos chave na progressão

do tumor e sua resistência às drogas (Heng et al, 2009).

Figura 3: Migração celular via corrente sanguínea. Esta capacidade de tumores malignos permite a semeadura de tecidos distantes do tecido original para desenvolvimento de metástase. (Fonte: www.livingmedicaltestbook.org).

No mundo desenvolvido, o câncer é uma das principais causas de

morte, geralmente excedido por apenas doenças cardiovasculares (De Meija et

al., 2003). A expectativa quanto ao numero de pessoas diagnosticadas com


22

câncer dentro dos próximos 30 anos é de o dobro da atual implicando um

aumento da necessidade quanto a diagnósticos e terapias. Em países com alta

expectativa de vida, aproximadamente 40% da população sofreu algum tipo de

câncer na vida (Song et al., 2010). No Brasil, as estimativas para o ano de

2010 e de 2011, apontam para a ocorrência de 489.270 casos de novos de

câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não

melanoma, serão no sexo masculino, os canceres de próstata e de pulmão, e

no sexo feminino, os canceres de mama e de colo do útero, acompanhando o

mesmo perfil da magnitude observada para a América Latina (INCA, 2010).

1.2 CÂNCER: ASPECTOS BIOQUÍMICOS

Durante o percurso de iniciação e progressão tumoral, é necessário que

as células cancerígenas reprogramem suas vias metabólicas em resposta ao

seu próprio crescimento. Esta reprogramação é acompanhada por ambas as

alterações, genéticas e epigenéticas de vários genes metabólicos. A

desregulação desses genes está diretamente envolvida na parada de

transformação inicial (célula normal-neoplasia), enquanto outros contribuem

com a manutenção e a aceleração do fenótipo maligno. A mudança no

comportamento metabólico das células cancerígenas está diretamente

relacionada com o padrão de expressão de biomoléculas responsáveis pelos

mecanismos de sinalização, adesão entre célula-célula e célula-matriz


23

extracelular, que são fundamentais no controle de vários processos fisiológicos

e patobioquímicos do organismo (Phipps et al, 2005).

Estas alterações são evidentes durante o desenvolvimento dos

processos patológicos, sendo acompanhada de modificações decorrentes do

processo de glicosilação aberrante em componentes da superfície celular, além

de ser um fator de alta relevância quanto à capacidade metastática e

prognóstico pobre em pacientes com câncer (Kawaguchi , 2005).

A superfície externa das células é composta por um glicocálice (Figura

4), uma camada rica em carboidratos, a qual está envolvida na interação

célula-célula e célula-matriz (Cazet et al., 2010), desempenhando na superfície

celular funções no controle de vários processos fisiológicos e patobioquímicos

no organismo (Phipps et al., 2005).

Figura 4 – Esquema representativo de uma membrana celular e uma camada rica de carboidratos, formando assim o glicocálice. Fonte: http://www.tudomaisumpouco.com/images/dna/prot_memb3.jpg


24

A glicosilação é uma das modificações mais importantes de proteínas e

lipídios. A estrutura dos glicanos é muito diversificada e sua biossíntese requer

uma maquinaria enzimática específica envolvendo um elevado número de

glicosiltransferases (Cazet et al., 2010).

As alterações nos padrões de glicosilação são frequentes, resultantes de

modificações na atividade das glicosiltransferases e glicosidases (Blomme et

al., 2009; Rek et al., 2009). Essas alterações no padrão de glicoconjugados de

células tumorais têm sido relevantes para o reconhecimento de um

desenvolvimento anormal e metástase. Certos tipos de modificações nos

glicanos tem relação direta com o processo de agressividade em canceres de

mama, como a progressão, invasão e metástase (Kawaguchi et al., 2006). A

maioria das glicosilações aberrantes frequentemente resulta num encurtamento

das cadeias de glicanos ou uma superexpressão dessas estruturas nas células

(Guilot et al., 2004). As alterações no glicocódigo das células tumorais têm sido

relacionadas, também, com a tentativa de fuga do reconhecimento pelas

células do sistema imune e migração de seu tecido de origem para outros sítios

teciduais no corpo (Figura 5) (Chambers et al, 2002; Nangia-Makker et al,

2002; Fidler, 2003; Gupta & Massague, 2006; Eccles & Welch, 2007).

Com o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, do uso de

fármacos inteligentes, da tecnologia anticorpos monoclonais e do avanço das

pesquisas com a histoquímica com lectinas, baseado no seu potencial

biotecnológico no emprego do diagnóstico, inúmeros epítopos (tumor-

específicos), dentre os quais carboidratos, foram decifrados sendo expressos


25

em estágios de diferenciação/desdiferenciação e metástase (Beltrão et al,

2003; Campos et al, 2006). Além de que, estes eventos de glicosilação alterada

e seu prognóstico aumentam os interesses para analisar estas modificações

patobioquímicas especificas (Granovsky et al, 2000; Beltrão et al, 2001; Melo-

Júnior et al, 2006).

Figura 5: Migração de células neoplásicas acompanhadas de modificações moleculares e induções angiogênicas, que resultam em um extravasamento das mesmas de um ponto localizado fazendo uso dos vasos para obter novos sítios patológicos. (Thomas e Peeper, 2009).

1.3 CÂNCER DE MAMA

O câncer de tecido mamário é o segundo tipo de câncer mais frequente

no mundo e o mais comum entre as mulheres. A cada ano, cerca de 22% dos

novos casos de câncer em mulheres são de mama. A incidência de câncer no

Brasil vem aumentando a cada ano e as descobertas/desenvolvimento de


26

novos tratamentos não acompanham esse aumento de incidência. Este câncer

ocupa o primeiro lugar em incidência nas regiões Nordeste, Sul e Sudoeste, na

proporção de 22,84%, 24,14% e 23,83%, respectivamente (INCA, 2009).

Dentre os tumores malignos de mama, o carcinoma ductal invasivo (CDI)

representa o maior grupo, constituindo cerca de 65 a 80% dos carcinomas

mamários. A morfologia desses carcinomas é bastante heterogênea, tendo sido

caracterizadas algumas variáveis como fatores histológicos de prognóstico

(Dantas et al., 2003). O CDI se desenvolve durante longos períodos de tempo e

pode culminar em formas metastáticas. Métodos mais sensíveis de

avaliação/diagnóstico como a mamografia digital e a ressonância magnética de

imagem as quais tem proporcionado um aumento dramático no diagnóstico de

carcinomas ductais in situ e invasivos. O carcinoma ductal invasivo tem uma

taxa de progressão de 43%, estimada por oito estudos independentes de

referência (Leonard e Swain, 2004). Um risco aumentado de recorrência de

CDI foi associado ao grau de atividade nuclear moderado ou alto podendo levar

a metástase (Kerlikowske et al., 2003). O grau nuclear foi utilizado como um

determinante importante para a decisão do diagnóstico e posterior tratamento

(Chapman et al., 2007).

Apesar do aumento da incidência no Brasil e em outros países, os

grandes estudos internacionais mostram que a maior eficiência nos programas

de rastreamento, a melhor definição das imagens ao diagnóstico e o uso

adequado de terapias medicamentosas adjuvantes, melhoraram a sobrevida

das pacientes nas últimas décadas (Smigal et al., 2006).


27

Perou e colaboradores (2000) analisaram 65 amostras de 42 pacientes,

utilizando a técnica de expressão gênica de microarrays de DNA complementar

(cDNA), representando 8.102 genes humanos. Eles demonstraram que a

diversidade fenotípica dos tumores de mama estava associada a uma

diversidade na expressão gênica. Sorlie e colaboradores (2001) analisaram 85

experimentos com 78 carcinomas, três fibroadenomas e quatro tecidos

mamários normais, com a mesma estratégia para validar os primeiros achados.

Estes experimentos definiram a classificação molecular do carcinoma de

mama, dividindo os tipos em cinco grandes grupos baseados na expressão de

poucos genes. Mais importante do que isto foi que esta classificação se

mostrou de valor prognóstico e validava comportamentos clínicos bem

conhecidos. Estes tipos foram chamados de luminais (A e B), super-expressor

de HER-2, basal e aqueles semelhantes à mama normal.

Os tumores luminais representam 45% dos tumores de mama e menos

de 20% deles apresentam a proteina p53 mutada (Sotiriou et al., 2003). Os

luminais A apresentam, além da expressão de RE, podem ou não apresentar

positividade do RP, expressam as citoceratinas (CK) e têm expressão negativa

para HER-2 (Nielsen et al., 2004). São tumores que costumam apresentar

baixa expressão de ki67 e um baixo índice mitótico. São tumores usualmente

de baixo grau histológico, bem diferenciados e com poucas mitoses. O grupo

luminal B tem também o mesmo padrão de expressão de RE, RP, CK, mas co-

expressam os genes ligados à proliferação celular, podendo apresentar alta


28

expressão de ki67 e alto índice mitótico. Podem apresentar a expressão de

HER-2, embora ocorram casos com expressão negativa (Brenton et al., 2005).

Os tumores super-expressores de HER-2 são aqueles que

invariavelmente têm a expressão imunohistoquímica (IHQ) positiva para HER-2

e que, ao ter seu estado gênico avaliado por testes de hibridação in situ

fluorescente (FISH) ou cromogênica (CISH) apresentam amplificação do

número de cópias deste gene. Apresentam expressão negativa do RE e do RP

(Brenton et al., 2005). Correspondem a cerca de 20-25% dos carcinomas de

mama. Não há associação entre este subtipo com idade, raça ou outros fatores

de risco (Carey et al., 2006).

Os carcinomas mamários que super-expressam HER-2 têm um

comportamento biológico agressivo, o que resulta em uma maior taxa de

recorrência após o tratamento inicial, uma sobrevida livre de doença curta e um

pior prognóstico, além disso, este grupo de tumores costuma apresentar maior

probabilidade de metástase cerebral (Brenton et al., 2005).

O subtipo basal representa 15% dos tumores de mama. Não expressa

ou tem baixa expressão de receptores hormonais para estrógeno (RE) e

progesterona (RP) e HER-2; e expressa proteínas comumente presentes nas

células progenitoras ou células basais/luminais. Embora apresente

negatividade para os três marcadores, há tipos histológicos que são triplo-

negativos, mas não são basais (Haupt et al., 2010).

O câncer de mama triplo-negativo apresenta características patológicas

e moleculares únicas. Este termo refere-se à classificação IHQ dos tumores de


29

mama aonde não se observa a expressão de RE, RP e HER-2 (Nielsen et al.,

2004). A maioria dos estudos publicados mostra, além dos dados acima, que

este grupo de tumores apresenta expressão negativa de p-caderina e de p63,

expressão positiva de HER-1, expressão positiva das citoqueratinas (CK),

expressão positiva de c-kit e vimentina (Rakha et al., 2009). Carey e

colaboradores (2006) mostraram que os tumores triplo-negativos se associam

a um perfil tumoral mais agressivo.

1.4 c-erbB-2/HER-2

O c-erbB-2 ou HER-2 é uma glicoproteína transmembrana pertencente à

família de receptores do fator de crescimento epidermal (Gown, 2008). Essa

família é composta por quatro receptores, (HER-1 ou EGFR, HER-2, HER-3 e

HER-4), que usam a atividade da tirosinoquinase na sinalização celular. Outros

membros da família dos receptores de fator de crescimento tirosino-quinase

são o c-Kit e o receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR),

fatores que inicialmente foram estudados na avaliação do prognóstico do

câncer de mama, e hoje já se é sabido que usam as mesmas vias de ativação

que o HER-2 (Konecny et al., 2003).

O protooncogene c-erbB-2/HER-2/neu (human epidermal growth factor

receptor 2) está presente no cromossomo 17q11-21 (Duffy, 2005). Sua

expressão é regulada por fatores de crescimento e a sua transformação até

oncogene ocorre geralmente por amplificação gênica (ocorrência de 10 cópias


30

ou mais do gene por célula), o que origina a superexpressão de sua proteína

(Gown, 2008).

A expressão aumentada do HER-2 é uma das anormalidades genética

mais associada ao carcinoma de mama. Os tumores que expressam essa

proteína teriam um pior prognóstico, possivelmente pela perda de um

mecanismo de controle inibidor da proliferação celular e pelo ganho de um

ativador de potencial maligno (Eisenberg, 2001).

A Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) com o Painel de

orientação de marcadores tumorais recomenda o teste rotineiro de HER-2 no

câncer de mama metastático e recém-diagnosticados desde 2001 (Lombardo,

2007).

Diferentes técnicas têm sido utilizadas para avaliar o perfil de Her-2 em

biópsias e produtos cirúrgicos. Atualmente os métodos mais utilizados são a

imunohistoquímica (IHQ) para avaliar a superexpressão da proteína HER-2 e

hibridização in situ para avaliar a amplificação do gene HER-2 (Lambros et al.,

2006).

c-erbB-2/HER-2 é superexpresso em 10-34% dos canceres de mama e

está associado ao aumento na resistência a quimioterapia hormonal (Hussein

et al., 2008). Talvez o mais importante, é que os canceres de mama com

alteração no status de HER-2 são alvos para o tratamento com trastuzumab

(Figura 6), um anticorpo monoclonal humanizado, que tem demonstrado

melhorar sensivelmente a taxa de resposta e sobrevida quando adicionado à

quimioterapia ou utilizado como monoterapia (Gown, 2008). Estudos recentes


31

tem demonstrado que o tratamento adjuvante com trastuzumab pode reduzir o

risco de recorrência na metade e a mortalidade em um terço em estados

iniciais de canceres de mama (Romond et al., 2005).

Figura 6 – Trastuzumab se ligando a dois receptores c-erbB-2, impedindo a sua ativação. Fonte: www.livingmedicaltestbook.org.

1.5 LECTINAS

Lectinas são proteínas ligadoras de diversos carboidratos de origem não

imunologica, capazes de aglutinar células e reconhecer carboidratos livres ou

em oligossacarídeos e glicoconjugados nos quais a hidrofobicidade é a

principal força de interação (Sobral et al., 2010; Thoma et al., 2007).


32

O estudo de lectinas teve como marco inicial a descoberta de fatores

tóxicos protéicos em extrato de Ricinus communis por Stillmark (1888). Ele

constatou que tais fatores eram responsáveis por causar aglutinação em

células sangüíneas. O termo lectina (do Latim lectus que significa escolher,

selecionar) foi utilizado pela primeira vez por Boyd (1954) para enfatizar a

habilidade exibida por algumas hemaglutininas em discriminar células do grupo

sanguíneo ABO (Gabius, 2002). Outro Marco na história das lectinas ocorreu

em 1919 quando Summer em 1919 purificou e isolou em forma de cristal a

lectina concavalina A (Con-A), a partir de Canavalia ensiformeis (Sharon e Lis,

2004).

As lectinas são ubíquas. As de origem vegetal normalmente são obtidas

de sementes, principalmente nas leguminosas, as quais são acumuladas

durante a maturação e desaparecem após a germinação. Representam cerca

de 10% das proteínas totais nas sementes, porém as quantidades isoladas são

muito pequenas. Também já foram identificadas em células animais, sendo

algumas solúveis no citosol, nucleoplasma ou líquidos do corpo, e outras

presentes na membrana plasmática. As lectinas da membrana estão

envolvidas tanto no transporte celular como também no reconhecimento célula-

célula (Brooks et al., 2007).

A ligação das lectinas com os carboidratos acontece em locais

específicos. Em 1988, Kurt Drickamer chamou esses sítios de “domínio de

reconhecimento de carboidrato” (CRD – Carbohydrate-recognition domain), os

quais eram formados por uma limitada sequencia polipeptídica. Quanto à


33

estrutura molecular, as lectinas foram classificadas em merolectinas, onde só

apresenta um grupo de ligantes para carboidrato; hololectinas, as que possuem

dois ou mais ligantes homólogos para carboidratos; e quimerolectinas, que

possuem sítios de ligação distintos, com especificidade para carboidratos

diferentes (Sharon e Lis, 2004).

Por causa de sua especificidade a carboidratos de glicoconjugados de

superfície ou de organelas citoplasmáticas, as lectinas representam

ferramentas valiosas na identificação e monitoração de aberrações na

glicosilação de carboidratos durante diferenciação celular e transformação

neoplásica (Fusker & Esko, 2005). Estes biomarcadores já têm sido

empregados no auxilio de diagnóstico histopatológico, para o mapeamento dos

estágios de diferenciação/desdiferenciação, nível de malignidade e capacidade

de metástases em tecidos da cavidade oral (Rego et al., 2005; Sobral et al.

2010), cérebro humano (Beltrão et al., 2003), colo de útero (Li et al., 2010),

mama (Beltrão et al. 2001; Korourian et al., 2008; Potapenko et al., 2010), pele

(Melo-Junior et al., 2006), próstata (Lima et al., 2010), pulmão (Thoma et al.,

2007) entre outros.


34

2 OBJETIVOS

2.1 GERAL

Investigar tumores mamários diagnosticados como carcinoma ductal

invasivo (CDI) através da histoquímica com lectinas e imunohistoquímica.

2.2 ESPECÍFICOS

- Estabelecer o perfil de GalNAc em glicoconjugados de superfície

celulares empregando lectinas conjugadas a biotina;

- Estabelecer o perfil imunohistoquímico para c-erbB-2;

- Correlacionar os achados histoquímicos e imunohistoquímicos para a

caracterização de CDI;

- Avaliar o padrão de imuno e histo-marcação e correlacionar com os

dados clínico-histológicos dos tumores de CDI.


35

3 METODOLOGIA

3.1 Materiais

Lectinas Dolichos biflorus, DBA (Sigma-Aldrich, USA) e Vicia villosa,

VVA (VectorLab, USA) conjugadas à Biotina. O anticorpo policlonal anti-c-erbB-

2, o kit estreptavidina-biotina peroxidase e a diaminobenzidina foram obtidos da

DAKO (USA). Todos os demais reagentes foram obtidos em grau analítico.

3.2 Seleção de Casos

Foram selecionadas 61 biopsias de Carcinoma Ductal Invasivo de mama

(CDI) do setor de Anatomia Patológica do Hospital das Clinicas da

Universidade Federal de Pernambuco (HC-UFPE), previamente diagnósticas

pelos patologista do setor, no período entre 2006 e 2008. Os tecidos que

apresentaram apenas um bloco, e os de Punção Aspirativa por Agulha Fina

(PAAF) foram retirados da amostragem Foram utilizadas as bordas livres de

tumor como tecido normal.

3.3 Aspéctos Éticos

O presente projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética do Centro de

Ciências da Saúde (CCS) da Universidade federal de Pernambuco (UFPE) e

aprovado (SISNEP FR – 272931, CEP/CCS/UFPE Nº 195/09).


36

3.4 Histoquímica com Lectinas

Cortes histológicos com 4µm de expessura fixados em lâminas

albuminizadas foram desparafinizados em xilol e hidratados em álcool etílico

(100% e 70%). Em seguida os cortes foram tratados com uma solução de

tripsina 0,1% (p/v) a 37°C por 2 minutos e incubados com as lectinas (DBA e

VVA) na concentração de 80µg/mL por 2 horas à 4°C. A visualização da

ligação lectina-carboidrato foi realizada com o kit estreptavidina-biotina

peroxidase e revelada com uma solução de diaminobenzidina e peróxido de

hidrogênio (H2O2). Os cortes foram contra-corados com hematoxilina e

montados com entellan®. Todas as lavagens realizadas entre as etapas

descritas utilizaram tampão fosfato de sódio 100mM, pH 7,2, suplementado

com NaCl 150mM (PBS).

3.5 Imunohistoquímica

Lâminas silanizadas receberam cortes histológicos (4µm), que após

fixação, foram desparafinizados em xilol e hidratados em álcool etílico (100% e

70%). Em seguida foi feita a recuperação antigênica em tampão citrato 100mM,

pH6.0 em câmara de vapor d´água (STIMER) por 30 minutos. Após o

resfriamento, os cortes foram incubados em solução de peróxido de hidrogênio

(H2O2) em metanol (1:1) por 30 minutos a 25ºC seguido de incubação com

solução de leite desnatado a 10% por 1 hora a 25ºC. Foi, então, realizada a

incubação dos tecidos com o anticorpo policlonal anti-c-erbB-2 (1:400) por 16

horas à 4°C. A localização do anticorpo foi feita com o kit estreptavidina-biotina


37

peroxidase e sua revelação com DAB-H2O2. Todas as lavagens realizadas

entre as etapas descritas utilizaram tampão fosfato de sódio 100mM, pH 7,2,

suplementado com NaCl 150mM (PBS).

3.6 Controle Negativo

O controle negativo de marcação para as lectinas foi realizado com a

inibição das mesmas com N-acetil-galactosamina (100 a 300 mM) na

histoquímica com lectinas e o anticorpo anti-c-erbB-2 foi substituído por PBS na

imunohistoquímica.

3.7 Análise de Imagens

Foi usado o sistema interativo de análise de imagens com microscópio e

câmera digital da Nikon (USA), disponíveis no Setor de Patologia do LIKA. Os

parâmetros morfométricos adotados foram o número de células marcadas por

campo captado na lâmina histológica. Foram consideradas positivas as

preparações histológicas que apresentaram mais de 20% de marcação em

contagem de células por campo (1 cm2). A análise quantitativa das células das

marcadas foi feita analisando três campos em cada caso


38

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram avaliadas 61 biópsias de carcinoma ductal invasivo (CDI) de

mama puro ou associado ao carcinoma ductal in situ (CDis). Os dados clínico-

histopatológicos característicos desta amostragem são apresentados na Tabela

1.

Tabela 01: Dados clínico-histopatológicos das biópsia usadas no estudo.

Parâmetros Categoria Número Percentagem

Tamanho ≤ 4,33 cm* 35 57,38%

> 4,33 cm* 26 42,61%

Linfonodo Positivo Sim 24 39,34%

Não 37 60,66%

Grau Bloom Richardson

I 14 22,95%

II 22 36,06%

III 25 40,98%

Componente in situ Sim 16 26,23%

Não 45 73,77%

* Média do tamanho dos tumores.

Neste estudo observou-se que a proteína c-erb-2 apresentou expressão

aumentada em 14,75% dos casos de CDI (Figura 7). Essa superexpressão

ocorreu nos tumores com graus II e III de diferenciação histológica segundo a

escala de gradação de Bloom e Richardson. O sistema de graduação

histológica mais utilizado é a classificação de Bloom-Richardson, que leva em

consideração o grau nuclear, a arquitetura tumoral e o número de mitoses.

Tumores graduados como de alto grau apresentam pior sobrevida


39

(Soerjomataram et al., 2008). Em todos estes casos observou-se envolvimento

linfonodal positivo. Não foram observadas relações entre as demais

características clínico-histopatológicas e o status de c-erbB-2. Os tecidos

mamários normais (bordas livres) foram negativos para c-erbB-2.

Marcadores tumorais em câncer de mama podem ser empregados como

marcador prognóstico e como marcador preditivo de resposta a terapia

particular (Gown, 2008).

Figura 7: Imunohistoquímica para c-erbB-2 em CDI. A cor castanha indica a expressão desta proteína. A seta indica área de necrose (comum neste tipo de tumor). A: aumento de 100X, B: aumento de 400X.


40

O aumento da expressão de c-erbB-2 em lesões mamárias está

associado com um reforço na angiogênese, hipóxia e aumento na degradação

de fibrina além de ser apontado como indicador de prognóstico ruim. Pacientes

que apresentam expressão aumentada de c-erbB-2 tem uma sobrevida livre de

doença menor e também sobrevida geral menor (Almeida et al., 2007;

Blackwell et al., 2004).

Hussein (2008) observou que a amplificação do gene e/ou a

superexpressão de c-erbB-2 pacientes com câncer de mama ocorre numa taxa

variando entre 10 e 34% dos casos. A amplificação do gene de c-erbB-2 no

câncer de mama tem sido associado com o aumento da proliferação e

mobilidade celulares, invasividade, metástase regional ou distante,

angiogênese e redução da apoptose. Quando classificados pelos parâmetros

clínico-histopatológicos de rotina e comparados com tumores c-erbB-2

negativos, os cânceres mamários c-erbB-2 positivos são frequentemente

observados em tumores com os maiores graus (II e III) de diferenciação

histológica pela graduação de Bloom-Richardson, bem como com a

negatividade para os receptores de estrógeno e progesterona (Ariga et al.,

2005; Huang et al., 2005; Al-Ahwal, 2006; Hussein et al.,2008).

A invasão linfonodal também esta associada ao aumento da expressão

de c-erbB-2. Estudos tem demostrado que os níveis de expressão desta

proteína estão relacionados ao risco de metástases distantes em pacientes

com câncer de mama (Hussein, 2008; Zidan et al., 2005; Maru et al., 2005).


41

O gene do c-erbB-2 também se encontra superexpresso em outras

neoplasias humanas, como adenocarcinoma de pulmão (Almeida et al., 2007).

Esta proteína apresenta também importância no tratamento de pacientes com

câncer de mama; pacientes cujos tumores exibem expressão aumentada

desses marcadores podem ter um maior benefício com altas doses de

quimioterapia alvo-específica (Press et al., 2005).

A partir da histoquímica com lectinas empregando VVA (Figura 8)

observou-se que esta proteína marcou 31,15% dos casos de CDI analisados

enquanto a DBA (Figura 9) marcou 13,11% do total de casos (Tabela 2). Os

tecidos normais avaliados não apresentaram nenhuma positividade.

De todos de casos analisados (n=61) apenas em 3 casos foram duplo

positivos para as lectinas usadas, contudo não se observou alguma relação

entre eles quanto as sua características clínico-histopatológicas.

Não se verificou correlação entre os dados clínico-histopatológicos e o

padrão de positividade de ambas as lectinas estudadas.

Tabela 02: Histoquímica com lectinas para carcinoma ductal invasivo de mama.

Lectina Número Percentagem

DBA

Positiva 8 13,11%

Negativa 53 86,89%

VVA

Positiva 19 31,15%

Negativa 42 68,85%


42

Os tecidos normais (bordas livres) foram negativos para amarcação com

as lectinas e o protocolo de inibição, com N-acetil-galactosamina, aboliu a

marcação das mesmas na concentração de 300 mM.

Glicosilação é uma modificação pós-tradução importante em muitas

moléculas biológicas relevantes. Uma mudança na estrutura de glicanos

adicionadas a glicoproteínas e glicolipídios é uma característica comum na

malignidade. A maioria das glicoproteínas que carregam glicanos O-ligados

envolvem a adição de N-acetil-galactosamina (GalNAc) a resíduos de serina ou

treonina na cadeia peptídica. Este resíduo é observado, e recebe destaque, no

determinante antigênico Tn (GalNAc-α-O-Ser/Thr), normalmente oculto no core

do peptídeo de O-glicoproteínas, é expresso de forma desmascarada em torno

de 90% dos carcinomas humanos. Uma relação direta tem sido demonstrada

entre a agressividade do carcinoma e a densidade desse antígeno, inclusive da

propagação do tecido e invasão dos vasos. Dessa forma o Antígeno Tn foi

considerado a estrutura associada a tumor humano mais específico (Burchel et

al, 2001).

Segundo Korourian (2008) a iniciação do tumor e o crescimento está

associada a modificações na estrutura de glicanos pertencentes as

glicoproteínas, glicolipídeos e proteoglicanos presentes na membrana celular.

Glicosilações aberrantes, oriundas de uma disfunção de glicosiltransferases

e/ou glicosidases, resultam em uma diminuição na cadeia de glicanos ou de

uma superexpressão dessas estruturas na membrana celular, que nas células


43

normais são escassas ou inexistentes, sendo a alteração na expressão de

carboidratos relevante para a metástase tumoral e para um prognóstico ruim

para pacientes com câncer (Kawaguchi, 2006).

Em estudos com pacientes com carcinoma ductal in situ (CDIS) de

mama, Korourian (2008) observou correlação positiva entre a marcação de

VVA e GS-I, ambas específicas para GalNac, com a estrutura e o grau deste

tumor. Essa correlação positiva sugere um fenótipo da doença relacionada a

possibilidade de progressão do CDIS para o CDI.


44

Figura 8: Histoquímica com Lectinas para VVA. A: marcação de membrana e citoplasma das células transformadas (aumento de 100X). B: marcação positiva visualizada com aumento de 400X. C: controle negativo da reação (aumento de 100x).


45

Figura 9: Histoquimica com Lectinas para DBA. A: marcação de membrana e citoplasma das células transformadas (aumento de 100X), B: marcação positiva visualizada com aumento de 400X.


46

A VVA reconhece os resíduos terminais α-GalNac e β-GalNac

(Kawaguchi et al., 2006), enquanto a DBA o faz para α-GalNac (Zhanq et al.,

2009). Em nosso estudo estas duas lectinas marcaram diferentemente os

mesmos tumores de CDI. A diferença de marcação pode ser relacionada tanto

a disponibilidade de uma ou ambas as formas, α e β, dos resíduos de GalNAc

quanto a acessibilidade das lectinas a estes carboidratos. Observe-se que a

VVA foi positiva para mais do que o dobro dos casos de CDI marcados pela

DBA.

Poucos estudos correlacionam a expressão de c-erbB-2 e a marcação

com lectinas. Korourian (2008) observou uma correlação entre a expressão da

proteína c-erbB-2 e a marcação positiva para a VVA em tumores

diagnosticados com CDIS, contudo ele não observou este comportamento para

CDI.

Nossos resultados apresentaram uma marcação de VVA e DBA para o

carcinoma ductal invasivo também. Este resultado pode ser interpretado a luz

de que a expressão de GalNAc esteja relacionada a uma condição de

malignidade (CDI em relação a CDIS) de um tumor. Ao mesmo tempo não se

observou um padrão de correlação entre a expressão de c-erbB-2 e a

marcação com as lectinas usadas.

A histoquímica com lectinas é uma ferramenta experimental que se

mostra auxiliar no diagnóstico e prognóstico de tumores mamários humanos

(Rêgo et al, 2010, Rêgo et al, 2009). Desta forma ela agrega informações

quanto a arquitetura dos glicoconjugados de superfície celular podendo ser


47

utilizadas no screening por modificações bioquímicas no ambiente extracelular

formado pelo glicocálice.


48

5 CONCLUSÕES

- A proteína c-erbB-2 apresentou correlação entre a sua

superexpressão, o grau histológico e a invasão linfonodal;

- O carcinoma ductal invasino de mama, apresentou um perfil de

positividade diferente para VVA e DBA utilizadas na histoquímica com lectinas;

- A imunohistoquímica para c-erbB-2 e a histoquímica com lectinas para

VVA e DBA não apresentou correlação entre si nem com os dados clínico-

histopatológicos.


49

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59

7 ANEXOS

7.1 Trabalhos Apresentados em Congressos

Silva, R. C. W. C.; Santos, C. A. S.; Rêgo, M. J. B. M.; Beltrão, E. I. C.

Expressão de Glicoconjugados e p53 no Carcinoma Ductal in situ Associado ao

Invasivo na Mesma Mama. In: 62ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de

Pesquisa Científica - SBPC, 2010, Natal, RN, Brasil.

Santos, C. A. S.; Silva, R. C. W. C.; Rêgo, M. J. B. M.; Beltrão, E. I. C.

Histoquímica com Lectinas para PNA e UEA-I no Carcinoma Ductal in situ da

Mama. In: 62 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Pesquisa Científica -

SBPC, 2010, Natal, RN, Brasil.

Silva, R. C. W. C.; Santos, C. A. S.; Rêgo, M. J. B. M.; Cavalcanti, C. L. B.;

Beltrão, E. I. C. Invasive Ductal Carcinama Glycoconjugates Evaluation Using

Lectin Histochemistry. In: XXXIX Annual Meeting of the Brazilian Society for

Biochemistry and Molecular Biology (SBBq), 2010, Foz do Iguaçu, PR, Brasil.

Santos, C. A. S.; Silva, R. C. W. C.; Rêgo, M. J. B. M.; Cavalcanti, C. L. B.;

Beltrão, E. I. C. Lectin Histochemistry of Cell Surface Glycocode of in situ

Ductal Carcinoma in Patients with Invasive Ductal Carcinoma. In: XXXIX Annual

Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq),

2010, Foz do Iguaçu, PR, Brasil.

Silva, R. C. W. C.; Rêgo, M. J. B. M.; Cordeiro, M. F.; Santos, C. A. S.; Beltrão,

E. I. C. Avaliação do Valor Diagnóstico e Prognóstico da Histoquímica com

Lectinas no carcinoma ductal invasivo mamário. In: 1° Encontro Brasileiro de

Inovação Terapêutica - EBIT, 2009, Recife, PE, Brasil.


60

Santos, C. A. S.; Silva, R. C. W. C.; Rêgo, M. J. B. M.; Beltrão, E. I. C.

Histoquimica com UEA - I e Imunohistoquimica para p53 no Carcinoma Ductal

in situ da Mesma Mama. In: 1° Encontro Brasileiro de Inovação Terapêutica -

EBIT, 2009, Recife, PE, Brasil.


Conparison of Lectin Histochemistry with HER-2 Status in Patients with Breast

Invasive Ductal Carcinomas. In: II Simpósio Nacional em Diagnóstico e

Terapêutica Experimental, V Jornada Científica do LIKA e II Fórum Brasileiro

de Genética em Neuropsiquiatria, 2009, Recife, PE, Brasil.


61

7.2 Resumos Expandidos Publicados em Revistas

Santos, C. A. S.; Silva, R. C. W. C.; Rêgo, M. J. B. M.; Cavalcanti C. B. L.; Lima

M. C. C. A.; Beltrão, E. I. C. Analysis of Cell Surface Carbohydrate Expression

of in situ Ductal Carcinoma Using Lectin Histochemistry and

Immunohistochemistry for p53., Applied cancer research, 2010:16.

Santos, C. A. S.; Silva, R. C. W. C.; Rêgo, M. J. B. M.; Beltrão, E. I. C. Análise

Histológica da Expressão de L-fucose e p53 no Carcinoma Ductal in situ e

Invasivo da Mesma Mama. Revista Brasileira de Mastologia, 2009; 19: 49-53.


Histoquimica com Lectinas e Imunohistoquimica para c-erbB-2 em Carcinoma

Ductal Invasivo de Mama. Revista Brasileira de Mastologia, 2009; 19: 49-53.


62

7.3 Instruções para Autores

Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia

The Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia (Rev Bras Ginecol Obstet.

ISSN 0100 7203), a monthly publishing of scientific diffusion by Federação das

Sociedades de Ginecologia e Obstetrícia (Febrasgo), is directed to obstetricians,

gynaecologists and kindred professionals, with the purpose of publishing original contributions on relevant themes about Gynaecology, Obstetrics and related areas.

It is open to national and international contributions.

The material sent to analysis cannot be concurrently submitted for publication to

other journals, or been previously published. Originality, theme relevance and quality of methodology, besides the adequacy to editorial instructions adopted by

the journal, are assessed in the selection of manuscripts. Material of declined

articles will not be returned to the authors.

All the submitted articles are assessed by anonymous reviewers and confidentiality

is maintained throughout the review process. Copies of the reviewers’ assessment are sent to the authors. The accepted and conditionally accepted manuscripts are

sent back to the authors, so that they get acquainted with the alterations that

should be made; only then the paper will be accepted for publication. The authors

must return the paper with the required changes as soon as possible, accompanied by a letter that justifies, when needed, the non-acceptance of the suggestions. If

the paper is not returned within a period of three months, it is assumed that the

authors have no longer interest in publishing it. If the answer is sent after this time

limit, it will be considered a new submission and, therefore, the paper will be submitted to a new analysis.

The concepts and declarations stated in the articles are the authors’ responsibility,

and the submitted paper should be written in Portuguese.

This journal publishes contributions in the following categories:

1. Original Articles, complete prospective, experimental and retrospective studies. Manuscripts containing original results of clinical or experimental researches have

priority in publication;

2. Previous Notes of studies in final phase of data collection, but with original and

relevant results which justify the publication;

3. Case Reports of great interest and well documented from the clinical and

laboratorial points of view. The text must be based on updated bibliographical

review, and the number of references may be the same of complete studies;

4. Techniques and Equipment, which are presentations of innovations in diagnosis, surgery and treatment techniques, as long as they are not, clearly or subtly,


63

merchandise of drugs or other products;

5. Review and Updating Articles, including critical and systemized literature

assessment. The selection of themes is based on established planning of associated

editors; the chosen authors must have previous publications about the referred theme. The number of review authors may vary from one to four, depending on the

type of text and on the applied methodology. The methods and procedures adopted

for the preparation of the paper must be described, and techniques to obtain

updating, meta-analysis or systematic reviews can be employed. The text must be

based on updated literature review. When the theme is still under investigation, the review must discuss all current tendencies and lines of investigation and present,

besides the review text itself, abstract in Portuguese and in English, and

conclusions. See the section “Preparing the manuscript” for more information on the

text, cover page and abstracts. Spontaneous contributions may be accepted. In this case, a summary or draft of the paper must be sent primarily, as well as the list of

authors and respective publications on the theme. If the journal is interested, the

authors are invited to write and submit the final text. In the case of spontaneous

contributions, the abovementioned requirements are applied to the invited authors;

6. Editorial Comments, when invited by the editor;

7. Thesis Abstracts presented and approved in the last 12 months, counting from

the submission date. It must contain approximately 250 words, following the

requirements of the journal concerning structure and content. Titles in Portuguese and English should be included and, at least, three keywords. The abstract must be

sent in CD or DVD with a printed copy. In a separated file, it should be informed the

complete name of the author and advisor, members of the assessment table, date

of presentation and identification of the service or department where the research

was carried out and presented;

8. Letters to the editor about editorial material or not, but with information that is

relevant to the reader. The letters can be summarized by the editors, being

highlighted the mains passages. When the letters are critical to publish articles,

they are sent to the authors so that their answers are published together.

General information

1. This journal does not accept editorial material with commercial objectives.

2. Conflict of interest: situations that may interfere inadequately in the

development and conclusions of the study must be mentioned. Among these

situations, it is emphasized the participation in companies that produce drugs or equipment cited or used in the study, as well as in contestant companies. Financial

supports, subordination relations at work, consultancy, among others, are also

considered as conflict sources.

3. In the text, the submission and approval by the Ethics Committee of the


64

institution where the study was carried out must be mentioned.

4. Articles that cover clinical researches on human beings must include a

declaration that assures the signature of informed consent by the participants.

5. From August 2007, the journals indexed in the database Lilacs and SciELO started to demand that randomized controlled and clinical trials submitted to

publication have a registration in a database of clinical trials. This decision was due

to the orientations of International Clinical Trial Registry Platform (ICTRP) from

World Health Organization (WHO), of the International Committee of Medical

Journal Editors (ICMJE). The instructions for the registration are available at the electronic address of ICMJE (http://www.icmje.org/clin_trialup.htm), and can be

made through the baseline of clinical trials of National Library of Medicine, available

at http://clinicaltrials.gov/ct/gui.

6. The number of authors in each manuscript is limited to seven. Papers of collective authorship (institutional researches) must have the responsible authors

indicated. Multicentric works and studies may have the number of authors

compatible with the number of participant institutions (each case is assessed by

the editors and reviewers). The investigators that are responsible for the applied protocols must be indicated at the end of the article. The co-authorship concept is

based on substantial contribution for the outset and planning of the research,

analysis and interpretation of data, or for the production and critical review of the

text. The inclusion of names whose contribution does not comply with the cited criteria is not justifiable. All the authors should approve the final version of the

paper for publication.

7. The authors are informed, by letter, of the receiving of the papers and the

protocol number of the journal. The articles that are in concordance with the

Instructions to the Authors and comply with the editorial politics of the journal are submitted to analysis by reviewers indicated by the authors.

8. The manuscripts that do not respond to the requirements are returned to the

authors for the necessary adaptations before the assessment of the Editorial

Counseling.

9. Together with the original, the submission letter, signed by all the authors on

separate letters, must be sent by each author. In this letter, the authors should

explicit the agreement with the editorial requirements, the process of review and

the conveyance of copyright to the journal. The published material will be property of Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia and of Febrasgo, and its total or

partial reproduction will only be made with acquiescence of such entities.

10. The original man

universidade federal de pernambuco - ufpe · a todos os meus familiares, com especial a tia lucy,...

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