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UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO STRICTU SENSU

CURSO DE MESTRADO EM EDUCAÇÃO FÍSICA

APARECIDA GABRIELA BEXIGA VELOSO

EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO NO PÂNCREAS DE

CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT OVARIECTOMIZADAS

São Paulo

2017

APARECIDA GABRIELA BEXIGA VELOSO

EFEITOS DO TREINAMENTO FÍSICO NO PÂNCREAS DE

CAMUNDONGOS FÊMEAS LDL KNOCKOUT OVARIECTOMIZADAS

Dissertação apresentada ao Programa de

Mestrado em Educação Física da

Universidade São Judas Tadeu para a

obtenção do título de Mestrado em Educação

Física.

Área de Concentração: Escola, Esporte,

Atividade Física e Saúde.

Linha de Pesquisa: Atividade Física e

Disfunções Orgânicas

Orientadora: Profª. Drª Laura Beatriz Mesiano

Maifrino.

São Paulo

2017

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca

da Universidade São Judas Tadeu Bibliotecária: Cláudia Silva Salviano Moreira - CRB 8/9237

Veloso, Aparecida Gabriela Bexiga V443e Efeitos do treinamento físico no pâncreas de camundongos fêmeas

LDL knockout ovariectomizadas / Aparecida Gabriela Bexiga Veloso. - São Paulo, 2017.

99 f. : il. ; 30 cm.

Orientadora: Laura Beatriz Mesiano Maifrino. Dissertação (mestrado) – Universidade São Judas Tadeu, São Paulo,

2017.

1. dislipidemia. 2. pancreas. 3. exercicio físico. 4. menopausa. I. Maifrino, Laura Beatriz Mesiano. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Educação Física. III. Título

CDD 22 – 796

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho ao meu esposo, MARCELO, por estar ao meu lado em todos os

momentos de minha vida, e aos meus filhos LUCAS e ARTHUR, amor incondicional.

AGRADECIMENTO

Primeiramente meu agradecimento à DEUS, que permitiu que tudo isso acontecesse,

colocando pessoas tão especiais, ao meu lado, sem as quais certamente não teria dado

conta!

Ao meu esposo, MARCELO, meu infinito agradecimento. Sempre ao meu lado,

compreendendo minhas constantes ausências. Devido ao seu companheirismo,

amizade, paciência, apoio, alegria e amor, este trabalho pôde ser concretizado.

Obrigada por ter feito do meu sonho o nosso sonho!

Aos meus filhos LUCAS e ARTHUR, que iluminam minha vida e me dão motivos para

continuar sempre buscando dar o melhor de mim.

Ao meu PAI, “in memoriam”, que sempre me apoiou aos estudos, e infelizmente não

pode compartilhar este momento tão importante.

A minha mãe LUIZA, por muitas vezes, olhou meus filhos, para que eu pudesse ir ao

mestrado a minha tia LUCY e ao meu irmão PEDRO, qυе direta оυ indiretamente

fizeram parte dа minha formação, о mеυ muito obrigado.

A minha irmã JHENIFFER e seu esposo BISCOITO, pelo carinho, pela amizade e apoio

incondicional.

Meus agradecimentos, TATIANA, MARLI, SUELI, aos amigos CEGAF, companheiros

de trabalhos e irmãos na amizade que fizeram parte da minha formação e que vão

continuar presentes em minha vida com certeza.

Agradeço os amigos, colegas, professores e funcionários da USJT, que sempre me

apoiaram

Obrigada a todos os meus familiares, por serem privados em muitos momentos da

minha companhia e atenção, e pelo profundo apoio.

A esta universidade, seu corpo docente, direção e administração, que me deram a

oportunidade de poder abrir a janela onde hoje vislumbro um horizonte superior.

Minha gratidão especial, ao Prof. Drº. LUÍS ANTÔNIO BAFFILE LEONI, um querido e

grande amigo, por ser uma inspiração profissional e de vida. Obrigada, por ter

acreditado e depositado sua confiança em mim, ainda na graduação (2002-2006), e me

dado a oportunidade de conhecer pessoas que tive o prazer de compartilhar seus

saberes e amizade.

Sou imensamente grata, à Profª. Drª. LAURA BEATRIZ MESIANO MAIFRINO, minha

orientadora, e sobretudo, uma grande amiga. Obrigada pela pessoa e profissional que

é. Sempre presente me dando todo o suporte, transmitindo incansáveis ensinamentos e

me ajudando a concluir este trabalho. E agradeço em especial, pelo acolhimento, nos

momentos mais difíceis da minha vida, no decorrer deste curso.

As minhas amigas NATÁLIA, pelo suporte dado, que compartilhou importantes

conhecimentos comigo, e a minha companheira desde à graduação BETH, que não

poupou esforços para me ajudar.

Quero agradecer também aos professores Drº. CLEVER GOMES CARDOSO e Drª.

ELIANE FLORENCIO GAMA, membros da banca de qualificação, pelos conselhos,

sugestões e interesse em contribuir para o desenvolvimento deste projeto.

Ninguém vence sozinho... OBRIGADA A TODOS!

Tudo aquilo que o homem ignora, não existe para ele. Por isso o universo de cada um, se

resume no tamanho de seu saber. Albert Einstein

BEXIGA AGV. Efeitos do treinamento físico no pâncreas de camundongos fêmeas LDL

knockout ovariectomizadas. [Dissertação]. Curso de Mestrado da Universidade São

Judas Tadeu. São Paulo, 2017.

Mulheres menopausadas, sedentárias e com maus hábitos alimentares, podem

apresentar aumento de peso e maior porcentagem de lipídios na corrente sanguínea,

resultando no acúmulo destes lipídios em tecidos periféricos, como fígado, músculo

esquelético e pâncreas. Nesta situação, o pâncreas aumenta a sua atividade,

aumentando a secreção e biossíntese da insulina, como uma tentativa de regularizar o

metabolismo. Ainda não está bem claro, a influência do treinamento físico no pâncreas

de animais dislipidêmicos associados à ovariectomia. O objetivo do presente trabalho

foi analisar os efeitos do treinamento físico sobre o pâncreas de camundongos fêmeas

LDL Knockout ovariectomizadas submetidas a treinamentos físicos aeróbios. Foram

utilizados 30 camundongos fêmeas com 9 meses de idade, sendo15 camundongos

fêmeas selvagens C57BL/6 e 15 camundongos ovariectomizados, knockout do receptor

de lipoproteína de baixa densidade, distribuídos em grupos: controle Sedentário (CS),

controle ovariectomizado sedentário (COS), controle ovariectomizado treinado (COT),

LDL sedentários (LDL-S), LDL ovariectomizado sedentário (LDL-OS) e LDL

ovariectomizado treinado (LDL-OT). Os animais exercitados realizaram um programa de

treinamento físico aeróbio moderado, uma hora por dia, 5 dias por semana, durante 4

semanas. Ao final do treinamento os animais foram decapitados, retirado o pâncreas e

o tecido adiposo visceral. As amostras foram pesadas e fixadas em formol 10% por

24hs e submetidas ao processamento histológico, sendo coradas com hematoxilina e

eosina e imunomarcadas por marcadores de insulina e glucagon. Foram realizadas

análises morfoquantitativa e estereológica através de imagens capturadas pelo

programa (AxioVision- Zeiss). Foram analisadas as densidades de volume das células

imunomarcadas alfa e beta, os diâmetros maior e menor (µm) e a área das ilhotas

pancreáticas (µm²). Os dados obtidos foram tabulados e comparados através de análise

estatística Anova (two way) e nível de significância p<0,05. Os resultados obtidos

mostraram que: a ovariectomia induziu ao aumento das massas corporal e do tecido

adiposo visceral, e que o treinamento promoveu diminuição nestes parâmetros; o grupo

dislipidêmico treinado (LDL OT) apresentou aumento significante no teste de esforço

físico; a ovariectomia acentuou de forma significante os valores das concentrações do

Triglicérides, VLDL e Colesterol total, e o treinamento apresentou uma tendência a

reversão deste processo; a ovariectomia promoveu uma tendência ao aumento da área

e diâmetro médio das ilhotas pancreáticas, da densidade de volume e apresentou um

maior número de ilhotas grandes; a dislipidemia, promoveu diminuição significante na

densidade de volume dos vasos das ilhotas, porém o treinamento, teve uma tendência

ao aumento, mas não significante; e a ovariectomia gerou uma tendência ao aumento

na imunomarcação das células-beta e uma diminuição significativa nas células-alfa

pancreáticas e que o treinamento reverteu este processo, levando os valores próximos

ao controle. Concluímos que o treinamento físico minimiza os efeitos da dislipidemia

associada a ovariectomia no tecido pancreático de animais LDL Knockout.

Palavras - chave: dislipidemia, pâncreas, treinamento físico, menopausa.

BEXIGA AGV. Effects of physical exercise on the pancreas of female ovariectomized

knockout LDL mice. [Dissertation]. Master's course at São Judas Tadeu University. São

Paulo, 2017

Menopausal women, associated with sedentary lifestyle and poor eating habits, lead to

weight gain and a higher percentage of lipids in the bloodstream, inducing the

accumulation of these lipids in peripheral tissues such as liver, skeletal muscle and

pancreatic cells. At the same time, the pancreas works by increasing the secretion and

biosynthesis of insulin, as an attempt to regulate the metabolism, leading the pancreas

to exhaustion, resulting in the abnormal reduction of beta cells by apoptosis, thereby

progressing to type 2 diabetes. Articles point out that physically active individuals enjoy

a better quality of life and lower mortality rate, resulting in greater longevity. However,

the literature consulted did not show any work evidencing the influence of dyslipidemia

associated with ovariectomy in the pancreas of LDL knockout mice. The objective of the

present work was to analyze the effects of physical exercise on the pancreas of

ovariectomized female knockout LDL mice submitted to aerobic physical exercises.

Thirty female mice at 9 months of age and initial weight ranging from 20 to 30 grams

were used, 15 female mice LDL knockout and 15 wild-type C57BL / 6 female mice was

divided in groups: Sedentary LDL (LDL-S), sedentary ovariectomized LDL (LDL-OS) and

trained ovariectomized LDL (LDL-OT). For the control group, 15 wild female mice were

used. Sedentary Control (CS), sedentary ovariectomized control (COS) and trained

ovariectomized control (TOC). The animals exercised underwent an aerobic physical

training program, with load, one hour per day, 5 days per week, for 4 weeks. At the end

of the training the animals were decapitated, removing the pancreas and visceral

adipose tissue. The samples were weighed and fixed in 10% formaldehyde for 24 h and

submitted to histological processing, stained with hematoxylin and eosin and

immunolabelled by insulin and glucagon markers. Morpho-quantitative and stereological

analyzes were performed through images captured by the program (AxioVision-Zeiss).

Volume densities of the alpha and beta immunolabellated cells, the major and minor

diameters (μm) and the area of the pancreatic islets (μm 2) were analyzed. Data were

tabulated and compared by anova (two way) and significance level (p <0.05). The

results showed: tendency, accentuated by ovariectomy, to increase body mass and

visceral adipose tissue, and that training promotes a decrease in these parameters; the

trained dyslipidemic group (LDL OT), presented a significant increase in physical

exercise test; ovariectomy significantly increased the values of the Triglyceride, VLDL

and total cholesterol analyzes, and that exercise showed a tendency to reverse this

process; ovariectomy promoted a tendency to increase the area and mean diameter of

the pancreatic islets and the volume density of the same, triggered a larger number of

large islets; dyslipidemia, promoted a significant decrease in the volume density of the

pancreatic islets vessels, but the exercise had a tendency to increase, but not

significant; and ovariectomy promoted a tendency to increase in pancreatic beta-cell

immunostaining, and a significant decrease in pancreatic alpha-cells, and that training

reversed this process, bringing values closer to control. We conclude that physical

exercise minimizes the effects of dyslipidemia associated with ovariectomy in the

pancreatic tissue of LDL Knockout animals.

Keywords: dyslipidemia; pancreas, physical exercise, menopause.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Fases do ciclo reprodutivo feminino .............................................................. 23

Figura 2- Localização do pâncreas, mostrando seus ductos, células acinares e ilhotas

pancreáticas. .................................................................................................................. 26

Figura 3- Fotomicrografias do pâncreas mostrando em A: Ilhota pancreática e vaso,

(400x) grupo COS. HE e B: Tecido pancreático mostrando em menor aumento (100x) os

ácinos , ductos e ilhota pancreática. Grupo LDL S HE ................................................... 27

Figura 4- Histologia do pâncreas exo-endócrino. Tipos de células pancreáticas. ......... 29

Figura 5 – Vias de ativação intracelular desencadeadas pela insulina.1- Ligação da

insulina ao receptor na membrana; 2- cascata molecular ativada, para a abertura da

proteína de transporte de glicose (glut4); 3- abertura da proteína glut4, permite a

entrada da glicose na célula;4- após a entrada, ocorre o armazenamento em forma de

glicogênio a glicose; 5- no fígado e no músculo esquelético; 6- ou a transformação e

deposição no tecido adiposo em forma de ácido graxo. ................................................ 31

Figura 6 – Camundongos LDL Knockout e C57BL/6 (Selvagens), no Biotério na USJT.

....................................................................................................................................... 36

Figura 7 – Delineamento do estudo, modelo dos grupos LDL Knockout e Controle. .... 37

Figura 8- Adaptação e Treinamento: A: esteira ergométrica para camundongos. B:

camundongos em treinamento ....................................................................................... 40

Figura 9-Fotomicrografia da mesma ilhota pancreática imunomarcadas em A células α

(glucagon) e B: células β (insulina) (grupo COT) IHQ (200X). ....................................... 43

Figura 10- Fotomicrografia do pâncreas aplicado o Software Image J. Grid com 200

pontos.(1) Ilhotas pancreáticas; (2) Ácinos pancreáticos; (3) Vasos. Grupo COS H&E,

400X. .............................................................................................................................. 44

Figura 11- Fotomicrografia, da ilhota pancreática, medindo sua área em µm2.Grupo LDL

S. H&E.(400X) ................................................................................................................ 45

Figura 12- Fotomicrografia, da ilhota pancreática identificando o diâmetro maior e do

diâmetro menor. Grupo COS.H&E. (400X), barra 2µm.. ................................................ 46

Figura 13- Fotomicrografia da ilhota pancreática. Imunomarcada para células α (1), na

periferia da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada. (Grupo

COS). IHQ 200X. ........................................................................................................... 47

Figura 14- Fotomicrografia da ilhota pancreática. Observar as células β imunomarcadas

(1), no centro da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada.

(Grupo COS). IHQ 200X................................................................................................ 47

Figura 15- Diferença entre a massa corporal inicial e final em gramas dos grupos. ..... 50

Figura 16- Delta percentual do Tecido Adiposo Visceral (%). ........................................ 51

Figura 17- Delta percentual da Massa do tecido do Pâncreas (%). ............................... 51

Figura 18- Diferença entre o Teste de Esforço Máximo Final (TF) e Inicial (TI), em Km/h,

nos grupos estudados. ................................................................................................... 53

Figura 19- Análise bioquímica da glicose nos grupos experimentais. ........................... 54

Figura 20- Parâmetro bioquímico Triglicérides (TG), nos grupos experimentais. .......... 55

Figura 21- Parâmetros bioquímico VLDL, nos grupos experimentais. .......................... 56

Figura 22- Parâmetro bioquímico Colesterol Total (CT), dos grupos experimentais. ..... 56

Figura 23- Área da ilhota pancreática nos grupos estudados. ..................................... 58

Figura 24- Diâmetro médio das ilhotas pancreáticas nos grupos estudados. ............... 58

Figura 25- Histograma de distribuição de frequência do tamanho das ilhotas

pancreáticas quanto sua área, nos grupos estudados. .................................................. 60

Figura 26- Fotomicrografias do tecido pancreático, ilhotas (seta branca), ácinos (seta

preta) e vasos (seta verde), dos grupos estudados. H&E, 400X. Barra 2µm ................ 61

Figura 27- Densidade de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), nos grupos

estudados. ...................................................................................................................... 62

Figura 28- Densidade de volume dos ácinos pancreáticos (Vv[ac]), nos grupos

estudados ....................................................................................................................... 63

Figura 29- Densidade de volume dos vasos pancreáticos (Vv [vasos]), nos grupos

estudados. ...................................................................................................................... 64

Figura 30- Densidade de volume das células- β (beta), das ilhotas pancreáticas, nos

grupos estudados. .......................................................................................................... 65

Figura 31- Densidade de volume das células α- pancreáticas, nos grupos estudados. 67

Figura 32- Fotomicrografias das ilhotas pancreáticas com as técnicas em H&E e

Imunohistoquímica com células alfa e beta imunocoradas, das ilhotas

pancreáticas.200X, barra 5µm. ...................................................................................... 68

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Variáveis Biométricas, Massa corpora; tecido adiposo e do pâncreas. .......... 49

Tabela 2- Resultado do Teste de Esforço Inicial (TI), Teste de Esforço Final (TF), e a

diferença entre o teste de esforço máximo final e inicial (TF – TI), nos grupos

estudados. ...................................................................................................................... 53

Tabela 3- Variáveis Bioquímicas, dos grupos experimentais. ......................................... 54

Tabela 4- Área (µm2) e diâmetro médio (µm) das ilhotas pancreáticas nos grupos

estudados. ...................................................................................................................... 57

Tabela 5- Valores representam a porcentagem das Ilhotas pancreáticas (IP) distribuídas

em tamanhos. ................................................................................................................. 60

Tabela 6- Densidades de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), ácinos (Vv[ac]) e

vasos (Vv[vas]) (%) dos animais nos grupos estudados. ............................................... 62

Tabela 7- Densidade de volume das células beta (β) e outras células: Alfa ( ), Delta (δ),

Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos grupos

estudados. ...................................................................................................................... 65

Tabela 8- Densidade de volume das células Alfa ( ) e outras células: beta (β), Delta (δ),

Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos grupos

estudados. ...................................................................................................................... 66

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AGL Ácidos Graxos Livres

COS Controle Ovariectomizado Sedentário

COT Controle Ovariectomizado Treinado

CS Controle Sedentário

CT Colesterol Total

E

EPM

Grelina

Erro Padrão da Média

H&E Hematoxilina e Eosina

HDL Hight Density Lipoprotein

HE Hematoxilina e Eosina

IGT Intolerância à glicose

IHQ Imunohistoquímica

IL Ilhotas Langerhans

IP Ilhotas pancreáticas

LDL Low Density Lipoprotein

LDL-c Low Density Lipoprotein- cholesterol

LDL-OS LDL-knokout Ovariectomizado Sedentário

LDL-OT LDL-knokout Ovariectomizado Treinado

LDL-S

M

LDL-knokout Sedentário

Média

PA Pressão Arterial

PP Polipeptídeo pancreático

TA Temperatura Ambiental

TG Triglicérides

µm Micrômetro

µm2 Micrômetro ao quadrado

VLDL Very Low Density Lipoprotein

Vv[acino] Densidade de volume dos ácinos na porção exócrina

Vv[cels.ip] Densidade de volume das células nas ilhotas pancreáticas

Vv[int.ip] Densidade de volume dos interstícios nas ilhotas pancreáticas

Vv[α] Densidade de volume das células alfa (imunomarcadas)

Vv[β] Densidade de volume das células beta (imunomarcadas)

β Beta

δ ou D Delta

α Alfa

Sumário

SUMÁRIO .......................................................................................................................................... 17

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................... 19

2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................................... 23

2.1 MENOPAUSA E PERFIL LIPÍDICO ...................................................................................................................... 23

2.2 PÂNCREAS ................................................................................................................................................. 25

2.3 TREINAMENTO FÍSICO .................................................................................................................................. 30

3. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................ 33

4 OBJETIVOS ................................................................................................................................... 34

4.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................................ 34

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................... 34

5. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................................ 36

5.1 ANIMAIS DO ESTUDO ................................................................................................................................... 36

5.1.1 Delineamento do estudo ............................................................................................................... 37

5.2 FORMAÇÃO DOS GRUPOS E SEQUÊNCIA EXPERIMENTAL ...................................................................................... 38

5.2.1 Ovariectomia .................................................................................................................................. 38

5.2.2 Colpocitologia ................................................................................................................................ 38

5.3 TREINAMENTO FÍSICO .................................................................................................................................. 40

5.3.1 Teste de Esforço Máximo ............................................................................................................... 40

5.3.2 Treinamento Físico ......................................................................................................................... 40

5.4 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E RETIRADA DO PÂNCREAS E DO TECIDO ADIPOSO ........................................................... 41

5.5. PREPARO DO MATERIAL ............................................................................................................................... 41

5.5.1 Preparo do material para a técnica H&E ........................................................................................ 41

5.5.2 Preparo do material para a técnica de imunohistoquímica ........................................................... 41

5.6. ANÁLISES ESTEREOLÓGICA E MORFOMÉTRICA .................................................................................................. 43

5.6.1 Análise Estereológica ..................................................................................................................... 44

5.6.2 Análise Morfométrica .................................................................................................................... 45

5.7. TÉCNICAS IMUNOHISTOQUÍMICA ................................................................................................................... 46

5.7.1 Análise estereológica ..................................................................................................................... 46

5.8. ANÁLISES BIOQUÍMICAS .............................................................................................................................. 48

5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................................................................... 48

6. RESULTADOS .............................................................................................................................. 49

6.1 AVALIAÇÃO DO PERFIL BIOMÉTRICO. ..................................................................................................... 49

6.1.1 Massa Corporal (g). ........................................................................................................................ 49

6.1.2 Massa Tecido Adiposo Visceral (TAV) (g). ....................................................................................... 50

6.1.3 Massa do Pâncreas (g). .................................................................................................................. 51

6.2 TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO (KM/H) ............................................................................................................. 52

6.3 AVALIAÇÃO DO PERFIL BIOQUIMICO ................................................................................................................ 54

6.3.1 Glicose ............................................................................................................................................ 54

6.3.2. Triglicérides (mg/dL) ..................................................................................................................... 55

6.3.3 VLDL (mg/dL).................................................................................................................................. 55

6.3.4 Colesterol Total .............................................................................................................................. 56

6.4 ANÁLISES MORFOMÉTRICA, ESTEREOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA. ................................................................... 57

6.4.1 ANÁLISE MORFOMÉTRICA .......................................................................................................................... 57

6.4.2 Análise estereológica ..................................................................................................................... 61

6.4.3 Imunohistoquímica ........................................................................................................................ 64

7. DISCUSSÃO ................................................................................................................................. 69

7.1. MASSA CORPORAL, DO TECIDO ADIPOSO VISCERAL E DO PÂNCREAS. .................................................................... 70

7.2 TESTE DE ESFORÇO MÁXIMO ......................................................................................................................... 72

7.3 EXAMES LABORATORIAIS ............................................................................................................................... 72

8. CONCLUSÃO ............................................................................................................................... 77

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................................. 79

19 1 INTRODUÇÃO

1 INTRODUÇÃO

O Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2010), segundo coleta

do censo de 2010, aponta que 11% da população do país, ou seja 20,5 milhões de

indivíduos, possuem 60 anos ou mais. Esse número, em 2025, deve dobrar, colocando

nosso país em sexto lugar no mundo no que se refere a população idosa (OMS, 2015).

Assim sendo, políticas públicas de prevenção e tratamento tornam-se ferramentas

necessárias.

Com o envelhecimento, os sistemas e órgãos sofrem modificações no padrão

normal do organismo, conduzindo a alterações, principalmente nos sistemas locomotor,

endócrino e cardiovascular, acentuada no sedentarismo, prejudicando sobremaneira a

qualidade de vida, e determinando muitas vezes uma perda da sua auto-independência.

(NASRI, 2008; RIBEIRO et al., 2012; DE MEDEIROS et al., 2014).

Entre as alterações endócrinas-metabólicas, a menopausa, caracterizada pela

inatividade dos ovários e consequente privação do estrogênio, marca, por volta dos 45

a 55 anos, o início de uma nova etapa da vida da mulher, acompanhada por alterações

na composição corporal, diminuição de massa muscular, aumento de peso e massa de

tecido adiposo. A obesidade e consequente depósito de tecido adiposo visceral, leva ao

desenvolvimento de doenças crônicas, dentre elas, diabetes, síndrome metabólica,

dislipidemia (MARQUEZINE & MANCINI, 2006; JANSSEN et al., 2002), doença

cardiovascular e resistência à insulina. (DE KONING et al, 2007)

Na pós-menopausa, além da tendência ao ganho de massa corporal, as

mulheres também estão susceptíveis a apresentarem alterações no metabolismo

lipídico, devido à privação estrogênica, que eleva os níveis de colesterol total,

lipoproteínas e triglicerídeos, acarretando um perfil lipídico altamente favorável à

20 1 INTRODUÇÃO

aterogênese, principalmente quando associada à diabetes mellitus e hipertensão

(PASQUALI et al, 1997).

O esgotamento dos óvulos localizados no interior dos ovários, e

consequentemente privação dos hormônios ovarianos, eleva o Colesterol Total e o LDL-

c em aproximadamente 25%, podendo estar associado ao menor catabolismo das LDL

pela diminuição do número de receptores hepáticos B/E. Além disso, a menopausa

promove redução da atividade hepática da 7ª hidroxilase, diminuindo a síntese de

ácidos biliares e consequentemente, redução da excreção de colesterol. Com a

diminuição da síntese da bile, pode ocorrer elevação dos triglicérides e VLDL-colesterol,

decorrente da menor atividade da lipase lipoproteica, com menor produção de VLDL

remanescente. Essa situação leva a maior proporção das pequenas e densas LDL, que

são mais suscetíveis a sofrerem alterações oxidativas, sendo mais facilmente

reconhecidas e captadas pelos macrófagos, formando células espumosas, ponto inicial

da formação do processo aterosclerótico (STEVENSON et al., 1993; AUSTIN et

al.,1988; PAPALÉO et al., 2006).

Após a menopausa ocorre redução dos níveis de colesterol em até 25%,

representado principalmente pela subfração HDL (FALUDI & ALDRIGHI, 2003; GRAFF-

IVERSEN et al., 2008; STACHOWIAK et al., 2015). O HDL é a principal lipoproteína

dividida em subfrações HDL2-colesterol e a HDL3-colesterol, com a função de carregar

o colesterol para o fígado, resultando na diminuição do mesmo da corrente sanguínea.

É sabido que as subfrações, principalmente o HDL-3, quanto maior a sua concentração,

maior a proteção contra as doenças cardiovasculares, porém temos poucos estudos

nesta área, necessitando de mais pesquisas (KIM et al., 2014).

Trabalhos apontam que indivíduos fisicamente ativos desfrutam de uma melhor

qualidade de vida e menor taxa de mortalidade, (TRIBESS, 2016; AGUIAR et al., 2014;

ANTUNES et al., 2006, MATSUDO et al., 1992). Destarte, o treinamento físico regular

pode ser uma estratégia na prevenção e redução de diversas doenças senis como

dislipidemias, diabetes mellitus e pressão arterial, dentre outras (ROUSSEL et al., 2009;

MCLELLAN et al., 2007). Malin et al. (2013), observaram que o treinamento físico de 12

semanas em 35 adultos obesos com pré- diabetes, promoveu redução na gordura

21 1 INTRODUÇÃO

corporal total, melhorando a sensibilidade à insulina, com isso, refere aumento da

função das células- β, contribuindo para a preservação do pâncreas, e prevenção de

diversas doenças senis.

Fagherazzi et al. (2008) estudaram indivíduos em sobrepeso, onde analisaram

o impacto do treinamento associado a dieta, verificando que a prática regular de

exercícios e hábitos alimentares adequados, produzem efeitos benéficos sobre as

dislipidemias. No entanto, os valores de Colesterol total (CT), LDL-c, TG-c e HDL, não

foram significativos em todos os grupos.

Fernandes et al. (2008) estudaram indivíduos idosos do sexo feminino, com

hiperlipidemia e diabetes mellitus, e verificaram redução significativa nos níveis de LDL

colesterol, triglicérides e da glicemia, bem como da massa corporal, quando aplicado

um programa regular de treinamentos físicos.

Estudos realizados em mulheres na pré- menopausa que realizaram treinamento

de resistência por três dias na semana, durante 14 semanas, apontaram diminuição de

14% do LDL-C, tornando melhor a relação LDL-C / HDL-C (PRABHAKARAN et al.,

1999).

Mulheres menopausadas, associadas ao sedentarismo e maus hábitos

alimentares, levam ao aumento de peso e maior porcentagem de lipídios na corrente

sanguínea, induzindo o acúmulo destes lipídios em tecidos periféricos, como fígado,

músculo esquelético e células pancreáticas. Concomitante, o pâncreas trabalha mais

aumentando a secreção e biossíntese da insulina, como uma tentativa de regularizar o

metabolismo, levando o pâncreas a exaustão, resultando redução anormal das células

betas por apoptose, com isso, progredindo à Diabetes tipo 2 (SAVAGE et al., 2007).

Malin et al. (2013), estudando adultos pré-diabéticos pós treino, observaram

melhora na função das células-β pancreáticas. Em homens e mulheres de forma linear,

doses crescentes de treinamentos, parecem aumentar a perda de peso e a função das

células-β pancreáticas.

22 1 INTRODUÇÃO

Slentz et al. (2009), comparando três programas de treinamento: intensidade

baixa/moderada, baixa intensidade/ intensidade vigorosa e alta intensidade/ vigorosa,

verificou que o treinamento de intensidade moderada, foi o que apresentou melhor

resultado no índice de disposição (DI= sensibilidade à insulina x resposta insulínica

aguda à glicose - AIRg).

Solomon et al. (2013), analisando 105 adultos diabéticos tipo 2 ou tolerância à

glicose diminuída, após 12 a 16 semanas de treinamento aeróbio, observaram que 90%

destes, aumentaram a eliminação da glicose, mediada por insulina.

23 2 REVISÃO DE LITERATURA

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Menopausa e Perfil Lipídico

A menopausa é caracterizada pela interrupção fisiológica dos ciclos menstruais,

devido à privação dos hormônios ovarianos. Inicia-se por volta dos 45 a 55 anos,

promovendo diversas alterações físicas, fisiológicas e endócrinas.

A figura 1 mostra as fases do ciclo reprodutivo da mulher, onde a menarca é

caracterizada pela primeira menstruação, por volta dos 10-12 anos de idade. Deste

período até a menopausa temos o período fértil, onde os óvulos são liberados

mensalmente e a produção dos hormônios ovarianos (estrógeno e progesterona) está

em produção. A pré-menopausa é o período entre três a sete anos antes da

menopausa, sendo, a menopausa, caracterizada pela última menstruação, e a pós –

menopausa, denominada climatério. A perimenopausa engloba a pré- menopausa e o

primeiro ano da pós menopausa, fase onde a mulher passa por várias alterações

fisiológicas e endócrinas, como ondas de calor, insônia, irritabilidade e alterações do

perfil lipídico, associada ao ganho de peso e sedentarismo, favorecendo a dislipidemia,

podendo assim, progredir para a diabetes tipo 2. (PASQUALI, 1997).

Figura 1- Fases do ciclo reprodutivo feminino Fonte: mdsaude1


Os hormônios estrogênios, responsáveis pela proteção de doenças

cardiovasculares na mulher, antes da menopausa, são derivados do colesterol,

destarte, com a diminuição da formação do estrogênio incide aumento do colesterol,

consequentemente ocorre um aumento das lipoproteínas de baixa densidade (LDL),

lipoproteína muito baixa de idade (VLDL), levando a um quadro de hipercolesterolemia,

que induz ao processo aterogênico. (CHAGAS et al, 2015)

A dislipidemia é um dos fatores que leva ao desequilíbrio do metabolismo da

glicose no sangue. Associada à hiperglicemia sanguínea, ocorre uma intolerância à

glicose (IGT), pois compromete a absorção da glicose para as células e o pâncreas, na

tentativa de compensar esta hiperglicemia, secreta abusivamente o hormônio insulina,

através das células β, levando a alterações morfológicas, como aumento das ilhotas

pancreáticas, prejudicando a função das células β. (WU et al., 2013; JIMÉNEZ-

MALDONADO et al., 2014; AMARAL et al., 2015).

Mulheres menopausadas apresentam maiores riscos de alterações no

metabolismo dos lipídeos e carboidratos levando ao aumento da intolerância à glicose,

menor sensibilidade periférica a ação da insulina e instalação de um perfil lipídico mais

aterogênico. (IBGE, 2010).

O desequilíbrio entre gordura, peso corporal, lipídeos e lipoproteínas pode levar

ao aumento das reservas de gordura, promovendo aumento dos fatores de risco como

obesidade abdominal, alterações do perfil lipídico, estados pró- inflamatórios, estresse

oxidativo e aterosclerose, culminando em uma série de doenças metabólicas

(BERTOLAMI, 2004; BEVILACQUA et al., 2007; REBUGLIO et al.; 2013).

Dados da OMS (2010), apontam que a dislipidemia favorece o aumento da

mortalidade de portadores de diabetes mellitus tipos 1 e 2 e existem evidências de que

o tratamento das mesmas, colabora para a prevenção e controle de doenças

vasculares nos indivíduos diabéticos (SALLIS, 2000; GRILLO & GORINI, 2007).


2.2 Pâncreas

O pâncreas, classificado como uma glândula mista (exo-endócrina), é um órgão

alongado, amarelado e recoberto por uma cápsula de tecido conjuntivo. Está situado

na parte superior do abdomen, posteriormente ao estômago, constituído de três partes

bem definidas: cabeça, corpo e cauda.

Na maioria dos roedores, o pâncreas inclui-se totalmente no tecido adiposo

mesentérico, de forma alongada estendendo-se entre o duodeno e o baço (HEBEL &

STROMBERG, 1976).

Na figura 2 observa-se a parte exócrina do pâncreas, relacionada ao sistema

digestivo, formada por uma glândula túbulo acinar composta, que diariamente produz

cerca de 1200 ml de líquido rico em bicarbonato e enzimas digestivas.

Aproximadamente 40 a 50 células acinares formam um ácino seroso, cuja luz contem 3

células centroacinares, que dão início ao sistema de ductos pancreáticos, formando

assim o pâncreas exócrino.


Figura 2- Localização do pâncreas, mostrando seus ductos, células acinares e ilhotas pancreáticas.

Fonte: mdsaude2

Cada célula acinar tem forma de pirâmide truncada, cuja base, descansa sobre a

lâmina basal separando as células do tecido conectivo denso que rodeia o pâncreas. O

núcleo destas células é redondo e intensamente basófilo, apresenta dentre as

organelas citoplasmáticas, grande quantidade do complexo de Golgi e grânulos

secretórios, que recebem o nome de grânulos de zimogênio, responsável pela

produção de pró-enzimas digestivas do pâncreas. Estas enzimas, amilase pancreática;

quimotripsina; tripsina e carboxipeptidase permanecem nos ácinos pancreáticos, na

forma inativa, e só é ativada no intestino delgado.

A figura 3 mostra a porção endócrina do pâncreas, formada por ilhotas

pancreáticas (IP) ou ilhotas de Langerhans, espalhadas por toda a glândula, geralmente

próximas ao centro de um lóbulo. As IP são cercadas por vasos capilares, ductos e

ácinos e representam cerca de 1 a 2% do tecido pancreático (FALKMER,1995).


Figura 3- Fotomicrografias do pâncreas mostrando em A: Ilhota pancreática e vaso, (400x) grupo COS. HE e B: Tecido pancreático mostrando em menor aumento (100x) os ácinos , ductos e ilhota pancreática. Grupo LDL S HE. Fonte: BEXIGA/2016

Histologicamente, a ilhota apresenta um formato arredondado ou ovalado,

envolta por uma delicada cápsula de tecido conjuntivo frouxo, rico em fibras reticulares

e seu parênquima é constituído por cordões das células endócrinas, entremeados por

uma rica rede de capilares sanguíneos do tipo fenestrado.

As ilhotas pancreáticas são constituídas por cinco tipos celulares, que se

dispõem em diferentes regiões da ilhota. As células são secretoras de diferentes

hormônios, envolvidos direta e indiretamente na homeostase glicêmica: células beta (β)

ou B secretam insulina; célula alfa (α) ou A, secretam glucagon; célula delta (δ) ou D,

responsáveis pela secreção de somatostatina, hormônio de ação parácrina, que regula

a liberação de insulina e glucagon; célula polipeptídio pancreático (PP), que parece

exercer uma função inibidora na secreção do pâncreas exócrino e células épsilon ou E,

produtoras de grelina, estando envolvida no controle do apetite, ingestão de alimentos e

provavelmente nos gastos energéticos (EKBLAD & SUNDLER, 2002; KANNO et al.,

2002; YOSHIHARA et al, 2002; ANDRALOJC et al., 2009).


As células betas (β), responsáveis pela produção de insulina, de ação

hipoglicemiante, induz a captação de glicose da corrente sanguínea, pelos

tecidos/órgãos, para sua metabolização intracelular; são as mais abundantes. Sua

produção se inicia com a síntese de pré- proinsulina no retículo endoplasmático rugoso

(RER) das células beta, logo por segmentação enzimática da pré-proinsulina nas

cisternas do RER, esta se converte em pró- insulina. A pró-insulina, se agrupa em

vesículas de onde por auto excisão, elimina um segmento da molécula e produz a

insulina. A Insulina é liberada no espaço extracelular quando aumentam os níveis de

glicose, por ex., após uma comida rica em carboidratos.

As células alfa (α), responsáveis por sintetizar e secretar o hormônio

peptídeo glucagon, eleva os níveis de glicose no sangue. O glucagon, não tem efeito

sobre o músculo, age em adipócitos e no fígado. Promove a liberação de glicose do

fígado para o sangue, aumenta o catabolismo das gorduras e reduz os níveis de

aminoácidos (neoglicogênese). O glucagon é liberado, em situações de treinamento ou

de jejum (CANALI & KRUEL, 2001).

A citoarquitetura ou arranjo preferencial dos tipos celulares dentro da ilhota de

várias espécies, incluindo a humana, parece ser fundamental para o seu

funcionamento. A organização histológica e arranjos celulares das ilhotas modificam-se

ao longo do desenvolvimento animal, paralelamente à maturação funcional do pâncreas

endócrino, do seu funcionamento e de algumas patologias (CARVALHO et al., 2006).

Alterações na morfologia e citoarquitetura normal das ilhotas são observadas em

animais com quadro estabelecido de diabetes ou em modelos in vitro de disfunção

secretora de insulina (FU et al., 2013; HONG et al., 2002; TAK‐YING SHIU et al., 2003).

Com relação à disposição ou arranjo das células endócrinas na ilhota, em

roedores, as células- beta ocupam a região central, células alfa, delta e épsilon

localizam-se na periferia da ilhota. As células PP também estão, preferencialmente,

dispostas na periferia da ilhota (GOLDSMITH, et al., 1975; ORCI, 1976; NAKAMURA, et

al., 1980). Diferenciam-se morfologicamente pelas suas propriedades tintoriais, pelo


aspecto ultra - estrutural de seus grânulos e pelo seu conteúdo hormonal (ORCI, 1984;

BONNER-WEIR, 1988; ANDRALOJC et al., 2009). Figura 4

Figura 4- Histologia do pâncreas exo-endócrino. Tipos de células pancreáticas.

Fonte: Fisiologia Médica- Guyton et al, 20123 (Modificado pela autora)

O padrão de organização histológica das IP pode estar alterado em casos de

disfunção pancreática, como na dislipidemia, ocasionando diabetes do tipo 2. Dentre as

alterações tem-se o desenvolvimento de aspecto irregular da periferia das IP,

caracterizado pelo aparecimento de projeções das células endócrinas no parênquima

exócrino adjacente e o surgimento de fibrose progressiva do tecido pancreático

endócrino (HONG, et al., 2002; JANSSEN, et al., 2003).

A anatomia fisiológica do pâncreas de humanos e de camundongos, apresentam

as células β na porção central da ilhota, enquanto as células α, δ e PP se localizam na

periferia (GOLDSMITH, et al., 1975; HAYEK & WOODSIDE, 1979; NAKAMURA, et al.,

1980).

3 Disponível em:< http://pt-br.aia1317.wikia.com/wiki/Introdu%C3%A7%C3%A3o_%C3%A0_ Fisiopatologia _do_

Diabetes_Mellitus file=Pancreas_2.jpg


Estudos realizados em ratos obesos verificaram que as ilhotas pancreáticas

quando aumentadas, ou seja, em situação de hiperplasia, (>0,45 mm) induzem

aumento de secreção da insulina e em ilhotas pancreáticas com hipertrofia (<0,12mm),

apresentam maior secreção de glucagon, e menor de insulina (HAYEK &

WOODSIDE,1979).

Duarte et al. (2006) estudando dieta hiperlipídica em ratos Wistar machos,

administrada por 15 semanas, registraram uma diminuição no tamanho do pâncreas, e

um aumento nos números das células hipoglicemiantes betas.

Tomita & Doull, (1992), através de análises imunohistoquímicas com marcadores

para as células α, β e δ, em ratos induzidos ao Diabetes Mellitus, observaram aumento

significativo no número das células α, e uma hipertrofia das células β.

Estudos realizados por Kawano et al., (1992) diagnosticaram pela primeira vez, o

desenvolvimento morfológico de ratos OLEFT obesos, classificando as mudanças das

ilhotas pancreáticas em três fases: fase I (9 semanas) início das alterações envolvendo

uma leve inflamação; fase II (10 a 40 semanas), já com alterações morfológicas como

hiperplasia e fibroses, um aumento dos tamanhos da massa das ilhotas, e na fase III, a

fase final (mais de 40 semanas), com a diminuição das massas das ilhotas devido a

uma hipertrofia das ilhotas.

2.3 Treinamento Físico

Diversos trabalhos correlacionam o treinamento físico com as alterações dos

hormônios pancreáticos insulina, glucagon (HOWARTH et al, 2009). Amaral (2015),

estudando animais com síndrome metabólica que realizaram exercícios físicos,

observaram melhora na morfologia das ilhotas pancreáticas.


Estudos feitos por JIMENEZ-MALDONADO (2014), demostrou que o treinamento

físico crônico promoveu melhora na sensibilidade da insulina e aumento nas densidade

de volume das ilhotas pancreáticas, quando praticado exercício crônico.

Estudos relatam que o treinamento físico favorece a redução na massa corpórea,

com perda de tecido adiposo, melhorando a ação da insulina periférica aos receptores

GLUT4 (transportador de glicose insulino- sensível, cujo principal papel é a captação de

glicose insulino-mediada em tecido adiposo e muscular), prevenindo o esgotamento da

função das células betas do pâncreas (MACHADO, 1998; SLENTZ et al., 2009) e

diminuindo a secreção da insulina. (HUGHES et al.,1993; SOLOMON et al. 2013;

MALIN et al., 2012). Figura 5

Figura 5 – Vias de ativação intracelular desencadeadas pela insulina.1- Ligação da insulina ao receptor na membrana; 2- cascata molecular ativada, para a abertura da proteína de transporte de glicose (glut4); 3- abertura da proteína glut4, permite a entrada da glicose na célula;4- após a entrada, ocorre o armazenamento em forma de glicogênio a glicose; 5- no fígado e no músculo esquelético; 6- ou a transformação e deposição no tecido adiposo em forma de ácido graxo.

Fonte: medicinageriatrica.com.br 4

4

Disponível em:< http://www.medicinageriatrica.com.br/2013/05/21/transpote-de-glicose-glut-4-

nos-diabetes-e-obesidades/


Artigos relacionados a diferentes modelos de treinamento aeróbio, anaeróbio e

em ambos, os resultados mostraram melhora do perfil lipídico, perda de peso e maior

estímulo do sistema imunológico levando ao aumento da resistência cardiovascular. Os

treinamentos moderados promoveram a normalização dos níveis de glicose, mostrando-

se mais eficazes na preservação do pâncreas, evitando sua exaustão e revertendo

processos de dislipidemia e até uma possível Diabetes tipo 2. (JIMÉNEZ-MALDONADO

et al.,2014; AMARAL et al.,2015)

Estudos epidemiológicos vêm indicando que mulheres pós- menopausadas tem

um maior risco de desenvolver a dislipidemia, porém essa situação pode ser revertida

com treinamento, como verificados em mulheres asiáticas (OMIYA et al.,2015). Silva

(2013) estudando disfunção das células β em indivíduos sedentários e treinados,

observou uma progressão mais rápida para a Diabetes tipo 2 nos sedentários, e que o

treinamento físico conseguiu reverter este processo.

O treinamento moderado é considerado uma forma eficaz de combater os

radicais livres, ele tende a melhorar a capacidade do organismo de produzir enzimas do

sistema antioxidante endógeno, portanto, aumenta as defesas antioxidantes,

contribuindo para a diminuição dos radicais livres (TELESI & MACHADO, 2008), porém

o treinamento de intensidade alta, promove um aumento dos radicais livres, tendo que

associar com alimentos antioxidantes.

33 3. JUSTIFICATIVA

3. JUSTIFICATIVA

Considerando que o avanço da idade, em especial em mulheres pós-

menopausa, impõe modificações físicas e endócrinas que podem alterar o equilíbrio

metabólico do indivíduo, favorecendo a manifestação da dislipidemia e do diabetes

mellitus, como fatores de risco às doenças cardiovasculares, desarte a investigação das

alterações impostas ao pâncreas torna-se relevante no esclarecimento desse quadro

clínico.

Para tanto, a proposta é investigar as alterações das estruturas pancreáticas de

camundongos fêmeas C57BL/6 (selvagem) e LDL Knockout ovariectomizadas

submetidas a treinamentos físicos aeróbios.

34 4 OBJETIVOS

4 OBJETIVOS

4.1 Objetivo Geral

Investigar as alterações estruturais do pâncreas de camundongos fêmeas

ovariectomizadas selvagens e LDL Knockout submetidas a treinamentos físicos

aeróbios.

4.2 Objetivos Específicos

Analisar os efeitos do treinamento físico no pâncreas de camundongos fêmeas

ovariectomizadas selvagens e LDL Knockout através de análises:

Biométrica

Massas corporal, do tecido adiposo visceral e do pâncreas.

Bioquímica

Glicose, Colesterol, Triglicérides, VLDL e Colesterol total.

Estereológica

Na porção exócrina do pâncreas:

Densidade de volume dos ácinos (Vv[acino]);

35 4 OBJETIVOS

Na porção endócrina do pâncreas:

Densidade de volume das células das ilhotas pancreática (Vv[cels.ip]);

Densidade de volume dos vasos das ilhotas pancreática (Vv[vaso]);

Morfométrica

Diâmetro médio das ilhotas pancreáticas (µm);

Área das ilhotas pancreáticas (µm²).

Imunohistoquímica

Análise imunohistoquímicas foi realizada através de marcadores para as células α e β.

Densidade de volume das células alfa (α);

Densidade de volume das células beta (β)

36 5. MATERIAIS E MÉTODOS

5. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade São Judas Tadeu (COEP-USJT) de acordo com o protocolo: 058/2007.

5.1 Animais do Estudo

Foram utilizados 15 camundongos fêmeas knockout do receptor de lipoproteína

de baixa densidade, com níveis de LDL plasmático aumentados e 15 camundongos

fêmeas selvagens C57BL/6, com 5 semanas de vida, vindos do Biotério Central da

Faculdade de Medicina (FMUSP). Ambos os grupos iniciaram o experimento com 9

meses de idade e peso inicial variando entre 20 e 30 gramas.

Os camundongos foram mantidos em gaiolas, em local com temperatura

ambiente controlada entre 22 – 24ºC e com ciclo claro/escuro de 12/12 horas no

Biotério da USJT. Todos os camundongos foram alimentados com água e ração padrão

“ad libitum”. Figura 6

Figura 6 – Camundongos LDL Knockout e C57BL/6 (Selvagens), no Biotério na USJT.

Fonte: BEXIGA/2016


5.1.1 Delineamento do estudo

Figura 7 – Delineamento do estudo, modelo dos grupos LDL Knockout e Controle.


5.2 Formações dos Grupos e Sequência Experimental

Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n=5 em cada grupo):

CS - Controle não ovariectomizado sedentário;

COS - Controle ovariectomizado sedentário;

COT - Controle ovariectomizado treinado;

LDL-S - LDL Knockout não ovariectomizado sedentário;

LDL-OS - LDL Knockout ovariectomizado sedentário e

LDL-OT - LDL knockout ovariectomizado treinado.

5.2.1 Ovariectomia

Os animais aos 9 meses de idade, foram submetidos à cirurgia da ovariectomia,

do qual, foram anestesiados com uma mistura de ketamina (120:20 mg/ Kg IM) e foram

colocados em decúbito dorsal para que se realizasse uma pequena incisão mediana na

pele e na musculatura no terço inferior na região abdominal. Os ovários foram

localizados, realizada a ligadura dos cornos uterinos, incluindo os vasos sanguíneos.

Os cornos uterinos e os ovários foram seccionados e removidos e a sutura da

musculatura e da pele realizada.

5.2.2 Colpocitologia

A citologia vaginal foi realizada para confirmar a eficácia da ovariectomia. Foi

coletada a secreção vaginal dos animais, com o auxílio de uma micropipeta com

solução salina (NaCl a 0,9%), colocada em uma lâmina e observada em microscópio de


luz, em aumento de 400X, durante quatro dias consecutivos. O estado de menopausa

foi observado, quando ocorre ausência de células epiteliais (fase diestro).

(MARCONDES et al., 2002; VILELA et al., 2007).


5.3 Treinamento Físico

5.3.1 Teste de Esforço Máximo

O teste de esforço máximo foi realizado no início e no final do programa de

treinamento físico, em todos os grupos. Este teste serviu de base para prescrição do

treinamento físico para os grupos treinados, bem como verificar a capacidade aeróbia

dos animais, após o período de treinamento físico. O teste consistiu em colocar o

animal correndo na esteira ergométrica a 0,3 km/h por 3 minutos, sendo esta carga

incrementada em 0,3 km/h a cada 3 minutos até o animal atingir a exaustão. (ANGELIS

et al.,2004).

5.3.2 Treinamento Físico

Após sete dias da cirurgia de ovariectomia, os animais foram adaptados na

esteira por 10 minutos, durante três dias antes do início do treinamento. Após teve início

o treinamento físico, onde os grupos treinados foram submetidos a um protocolo de

treinamento físico em esteira ergométrica com velocidade e carga progressiva (1 hora

por dia/ 5 dias por semana de 50 a 60% da velocidade máxima de esforço) durante 4

semanas conforme protocolo padrão (ANGELIS et al.,2004). Figura 08

Figura 8- Adaptação e Treinamento: A: esteira ergométrica para camundongos. B: camundongos em

treinamento. Fonte: A: Biotério-USJT(BEXIGA, 2016); B: www.faperj.br.


5.4 Sacrifício dos Animais

Ao término do protocolo de treinamento, em igual tempo para o grupo sedentário,

os animais foram mantidos em jejum por 8 horas para a coleta de sangue, após

eutanasiados por decapitação. O sangue foi coletado em tubos de ensaio secos, com

auxílio de um funil e após heparinizados. Os animais foram submetidos à abertura da

cavidade abdominal, retirado o pâncreas e o tecido adiposo visceral, os quais foram

pesados em balança analítica digital.

5.5. Preparo do Material

5.5.1 Preparo do material para a técnica H&E

As amostras do pâncreas foram fixadas em formol tamponado 10%, para evitar o

processo de autólise. Após foram submetidos aos processos de desidratação em uma

série crescente de álcool etílico, diafanização (clareamento) em xilol, para permitir uma

melhor penetração da parafina na peça, e inclusão em parafina. Os blocos de parafina

com os fragmentos de pâncreas foram cortados em micrótomo rotativo e cortes não

seriados de 5 μm de espessura, montados em lâminas de vidro e corados pelo método

de HE (STEVENS, 1982).

5.5.2 Preparo do material para a técnica de imunohistoquímica

5.5.2.1 Imunomarcação para glucagon


Para a visualização dos antígenos utilizou-se o kit NovoLink Polymer Detection

System (RE7150K, Leica BIOSYSTEMS). Primeiramente a atividade endógena da

peroxidase foi neutralizada com aplicação de Novocastra Peroxidase Block por 10

minutos. Em seguida foi feita a incubação com Novocastra Protein Block por 5 minutos,

para reduzir a ligação não especifica do anticorpo primário e do polímero. Após

lavagem com PBS, os cortes foram incubados com o anticorpo primário anti Glucagon

(SC 1309, IgG policlonal de coelho, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) em diluição de

1:100 a 4ºC, overnight. No dia seguinte foi realizada a incubação com o Novocastra

Post Primary Block por 1 hora a temperatura ambiente (TA). Após este tempo e

lavagens em PBS, foi aplicado o NovoLink Polymer por 1 hora, TA. Depois os cortes

foram incubados com uma solução de Novocastra DAB Chromogen e NovoLink DAB

Substrate Buffer (1:20) durante 30 segundos e contrastados com Novocastra

Hematoxylin por 2 minutos. Em seguida foram desidratados em séries crescentes de

etanol, diafanizadas em xilos e montadas em Entellan® (MERK, Alemanha). (Figura 9

A)

5.5.2.2 Imunomarcação para Insulina

Após a desparafinização e a reidratação dos cortes foi realizado o bloqueio da

peroxidase endógena com solução de peróxido de hidrogênio 3% em água destilada.

Em seguida realizou-se o bloqueio dos sítios inespecíficos com solução de BS/BSA 1%

em tampão fosfato 0,01M (pH 7,4). Os tecidos foram incubados com o anticorpo

primário policlonal de coelho antiisulina na diluição de 1:100 a 4°C, overnight (SC 7839,

IgG policlonal de cabra, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) e, após lavagens em

PBS, com o anticorpo secundário anticabra conjugado à peroxidase na diluição de

1:400 por 1 hora a TA (COD 705035003, burro anti IgG de cabra, Jackson Imuno

Research labs, USA). Os controles negativos foram obtidos através da omissão do

anticorpo primário. A reação antígeno anticorpo foi revelada utilizando o cromógeno

3,3’diaminobenzidina (DAB, Ref D39391SET; Sigma Aldrich, USA) e em seguida os

cortes foram contrastados com hematoxilina, desidratados em sequências crescentes


de etanol, diafanizados em xilol e as lâminas montadas com Permount ® (Fischer

Scientific Inc). (Figura 9 B)

Figura 9-Fotomicrografia da mesma ilhota pancreática imunomarcadas em A células α (glucagon) e B:

células β (insulina) (grupo COT) IHQ (200X).

Fonte: BEXIGA/2016

5.6. Análises Estereológica e Morfométrica

As imagens dos cortes histológicos corados em H&E foram capturadas através

de um sistema digital de processamento e análise de imagens em computador, do

Laboratório de Estudos Morfológicos e Imunohistoquímicos da Universidade São Judas

Tadeu. O sistema consiste de uma microcâmera de vídeo Sony, acoplada ao

Microscópio Zeiss, que capta as imagens das lâminas histológicas e as transmite para

um computador equipado com software específico para análises quantitativas.

Para a realização das análises estereológica utilizamos o software Image J

(versão 1.47 - National Intitutes of Health; Collins, 2007) e para a morfométrica foi

utilizado o programa de análise de imagens Software Axio Vision 4.8, Zeiss.


5.6.1 Análise Estereológica

A densidade de volume expressa a fração de volume ocupada pela estrutura de

interesse pelo número total de pontos. Para ser estimada a densidade de volume de

cada estrutura analisada utiliza-se um sistema teste composto por pontos delimitados e

por linhas de exclusão e inclusão, dispostas sistemática e uniformemente sobrepostas

às imagens capturadas (MANDARIM DE-LACERDA, 1998).

Foram utilizados 5 cortes não seriados por animal, sendo analisados 4 campos

aleatórios de cada corte (20 imagens por animal totalizando 100 imagens por grupo),

em aumento de 400X, e um sistema teste dotado de 200 pontos, com auxílio do

software Image J. As densidades de volume de cada estrutura de interesse foram

expressas em porcentagens, levando em consideração, para efeito de contagem,

somente os pontos que coincidiram sobre a estrutura estudada. (Figura 10)

Figura 10- Fotomicrografia do pâncreas aplicado o Software Image J. Grid com 200 pontos.(1) Ilhotas

pancreáticas; (2) Ácinos pancreáticos; (3) Vasos. Grupo COS H&E, 400X. Fonte: BEXIGA/2016


5.6.2 Análise Morfométrica

5.6.2.1 Área e diâmetro médio das ilhotas pancreáticas

Foram capturadas 4 imagens em 5 campos aleatórios de cada animal (20

imagens por animal, 100 imagens por grupo, 600 imagens total) em aumento de 400X

utilizando para a mensuração o software Axio Vision 4.8, Zeiss.

Cada ilhota pancreática foi delimitada e sua área medida em micrômetros (µm2)

e seu diâmetro maior e menor em micrômetros (Figura 11 e 12). Seus valores foram

tabulados e utilizados no tratamento estatístico.

Figura 11- Fotomicrografia da ilhota pancreática, medindo sua área em µm2. Grupo LDL S. H&E.(400X)

Fonte: BEXIGA/2016


Figura 12- Fotomicrografia da ilhota pancreática medindo os diâmetros maior e menor. Grupo COS.

H&E. (400X), barra 2µm..

Fonte: BEXIGA/2016.

5.7. Técnicas Imunohistoquímica

5.7.1 Análise estereológica

Para a análise da densidade de volume das células alfa e beta das ilhotas

pancreáticas utilizamos um Grid individualizado (média 125 pontos) para cada ilhota e

para cada imunomarcação, conforme figuras 13 e 14.


Figura 13- Fotomicrografia da ilhota pancreática imunomarcada para células α (1), na periferia da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada. (Grupo COS). IHQ 400X.

Fonte: BEXIGA/2016.

Figura 14- Fotomicrografia da ilhota pancreática. Observar as células β imunomarcadas (1), no centro da ilhota. Foi utilizado grid individualizado para cada ilhota analisada. (Grupo COS). IHQ 400X.

Fonte: BEXIGA/2016.


5.8. Análises Bioquímicas

As análises bioquímicas avaliadas foram realizadas segundo técnicas

tradicionalmente utilizadas em laboratórios de análises clínicas (MOLINARO, 2009).

Dosagem sérica de glicose

O soro obtido após centrifugação do sangue foi utilizado para análise da glicemia

pelo método da glicose oxidase realizados no laboratório de análises clínica da

Universidade São Judas Tadeu (USJT).

Dosagem de Triglicérides, Colesterol e VLDL.

As dosagens foram realizadas por meio de Kits comerciais ELITech

EL200 (ELITechGroup vital ® científico), seguindo as recomendações do fabricante,

com utilização do analisador automatizado FLEXOR-EL200 (ELITechGroup vital ®

científico), no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de medicina do ABC

(FMABC).

5.9 Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como média e erro padrão da média. O teste

de análise de variância (ANOVA) two way, e post-hoc de Tukey foram aplicados para

análise dos dados. O nível de significância adotado foi de p< 0,05.

R E S U L T A D O S

49

6. RESULTADOS

6.1 Avaliação do perfil biométrico.

Os resultados dos parâmetros massa corporal, pancreática e tecido adiposo

visceral dos animais estudados estão apresentados na tabela 1 e figuras 15, 16 e

17. Os valores estão apresentados em média e erro padrão da média.

Tabela 1: Massas corporal, do tecido adiposo visceral e do pâncreas dos animais

estudados.

CS COS COT LDL S LDL OS LDL OT

MCI (g) 22,65±0,39 22,39±0,33 22,42±0,24 22,89±0,73 22,47±0,53 23,90±0,44

MCF(g) 24,04±0,37 23,76±0,19 23,30±0,46 23,16±0,73 24,88±1,87 25,05±0,47

MCF-MCI (g) 1,39±0,20 1,37±0,4 0,88±0,52 0,27±0,13 1,84± 0,71 1,14±0,23

MTAV (g) 1,00±0,13 0,47±0,12 0,46±0,02 0,33± 0,03 0,71±0,05 0,58±0.06

Δ% MTAV 2,36±0,06 3,62±0,03* 1,9±0,06* 2,59±0,20*

+ 3,01± 0,03

*#+1 1,62±0,07

*#12

MPANC (g) 0,27±0,02 0,28±0,04 0,31±0,02 0,19±0,01 0,32±0,03 0,25±0,02

Δ% MPANC 1,06±0,07 1,18±0,17 1,21±0,05 0,80±0,06 * 1,05±0,10 1,02±0,04

Variáveis biométricas, massa corporal Inicial (MCI), Final (MCF) e diferença entre as massas final e inicial (MCF-MCI), do tecido adiposo visceral (MTAV) e do pâncreas (MPANC) e seus respectivos deltas percentuais (Δ% MC, Δ% MTAV e Δ% MPANC).Valores representam média e erro padrão da Média (M±EPM). *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS; +p<0,05 vs COT; ¹p<0,05 vs LDL S; 2p<0,05 vs LDL OS.

6.1.1 Massa Corporal (g).

A pesagem dos animais foi realizada a cada quinze dias, desde o início do

protocolo experimental (ovariectomia) até seu término (final do protocolo de

treinamento). Os animais dos grupos controle (CS, COS e COT) não apresentaram

diferença significante entre si. Verificamos que os animais dislipidêmicos (LDLS,

50 6. RESULTADOS

LDLOS e LDLOT) mostraram aumento, não significante, com a ovariectomia e uma

tendência a diminuição com o treinamento.

Figura 15- Diferença entre a massa corporal inicial e final em gramas dos grupos.

Valores representam média ± EPM. Os grupos não apresentaram valores significantes.

6.1.2 Massa Tecido Adiposo Visceral (TAV) (g).

Ao analisarmos o delta percentual da massa do tecido adiposo visceral, nos

animais controle, observamos que a menopausa promoveu aumento de tecido

adiposo visceral (TAV) de 53% e 16% , respectivamente, nos grupos COS e LDLOS,

em comparação aos seus pares (CS e LDLS). O treinamento promoveu uma

redução de 47% e 46%, respectivamente, nos grupos COT e LDL OT, quando

comparados aos grupos COS e LDLOS, respectivamente. (Tabela 1 e Figura 18).

51 6. RESULTADOS

Figura 16- Delta percentual do Tecido Adiposo Visceral (Δ%).

Δ% da massa do tecido adiposo visceral dos grupos: controle sedentário (CS); controle

ovariectomizado sedentário (COS); controle ovariectomizado treinado (COT); LDL knockout sedentário (LDLS); LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDLOS); LDL knockout ovariectomizado treinado (LDLOT).Valores representam média ± EPM. *p<0,05 vs CS, #p<0,05 vs COS, +p<0,05 vs COT, 1p<0,05 vs LDLS, 2p<0,05 vs LDLOT.

6.1.3 Massa do Pâncreas (g).

Não foi observada diferença significante no delta percentual da massa do

pâncreas entre os animais do grupo controle. Observamos no grupo dislipidêmico

sedentário uma diminuição significativa de 25% na massa do pâncreas nos animais

LDLS, quando comparados ao grupo CS, e que a ovariectomia proporcionou uma

tendência ao aumento e que o treinamento reverteu o processo, não significativo,

quando comparado aos seus pares. Tabela 01 e Figura 19.

Figura 17- Delta percentual da Massa do tecido do Pâncreas (%).

52 6. RESULTADOS

Δ% da massa do tecido do pâncreas dos grupos sedentários (CS); controle ovariectomizado

sedentário (COS); controle ovariectomizado treinado (COT); LDL knockout sedentário (LDLS); LDL knockout ovariectomizado sedentário (LDLOS); LDL knockout ovariectomizado treinado (LDLOT).Valores representam M±EP. *p<0,05 vs CS.

6.2 Teste de Esforço Máximo (Km/h)

O Teste de Esforço Máximo Inicial foi avaliado, em todos os grupos

estudados, antes do treinamento e o teste de Esforço Máximo Final ao término do

protocolo de treinamento físico, na mesma data.

Nossos resultados mostram que o grupo controle ovariectomizado sedentário

(COS), foi o que apresentou o pior desempenho (-4,3 ± 0,6) e que o grupo

dislipidêmico treinado (LDLOT) também teve uma melhora com o treinamento (2,9 ±

0,3). Tabela 2 e Figura 18.

53 6. RESULTADOS

Tabela 2- Resultado do Teste de Esforço Inicial (TI), Teste de Esforço Final (TF), e a

diferença entre o teste de esforço máximo final e inicial (TF – TI), nos grupos

estudados.


TI (Km/h) 12,84 17,13 17,23 15,18 16,64 18,57

TF (Km/h) 11,11 12,82 18,6 15,71 16,14 21,56

TF - TI (Km/h) 1,7± 0,5 -4,3 ± 0,6 1,4 ± 1# 0,5 ± 1,5

# -0,5 ± 1,1 2,9 ± 0,3*

#

Valores representam média ± EPM. * p< 0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS.

Figura 18- Diferença entre o Teste de Esforço Máximo Final (TF) e Inicial (TI), em

Km/h, nos grupos estudados.

54 6. RESULTADOS

6.3 Avaliação do perfil bioquímico

A tabela 3 mostra o perfil bioquímico dos grupos experimentais estudados.

Tabela 3- Variáveis Bioquímicas dos grupos estudados.


Glicemia (mg/dL) 84,2±19,8 96±14 89,1±12,9 85±19,2 125±7,4 102,9±44,4

TG (mg/dL) 29,7±7,6 73,2±16,9* 26,3±15,5# 109,5±20,7

*#2 176,5±7,4

*#+ 87±19,9

*+2

VLDL 7,14±1,08 12,87±2,17 6,75±2,52 20,7±1,83*+ 23,33±2,49*

#+ 15,43±2,38

Col. Total (mg/dL) 68,3±14,7 179,6±68,9* 82,7±116,6# 220,8±53,7*

+ 243,4±5,2*

+ 157,4±32,5*

+2

Valores representam M ± EPM. *p< 0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS; +p<0,05 vs COT; 2p<0,05 vs LDLOS.

6.3.1 Glicose

Não houve diferença significante nos níveis de Glicose, nos grupos controle e

dislipidêmicos. No entanto, observamos uma tendência ao aumento dos níveis de

Glicose com a ovariectomia, e uma tendência à diminuição com o treinamento, em

ambos os grupos. Tabela 3 e Figura 19.

Figura 19- Análise bioquímica da glicose nos grupos experimentais.

Valores representam M± EPM.

55 6. RESULTADOS

6.3.2. Triglicérides (mg/dL)

Na figura 20, podemos observar que os animais dislipidêmicos (109,5±20,7 ;

176,5±7,4 e 87±19,9) apresentaram aumento significante nos valores do triglicérides,

quando comparado aos grupos controle (29,7±7,6; 73,2±16,9 e 26,3±15,5). Os níveis

se comportaram de forma semelhante tanto no grupo controle, quanto nos animais

dislipidêmicos, onde a ovariectomia promoveu aumentou significante e o treinamento

reverteu o processo, se aproximando de seus pares.

Figura 20- Parâmetro bioquímico Triglicérides (TG), nos grupos

experimentais.

Valores representam M± EPM. *p<0,05vs CS; #p<0.05 vs COS ;

+p<0,05 vs COT.

6.3.3 VLDL (mg/dL)

56 6. RESULTADOS

Observamos aumento significante no VLDL nos animais dislipidêmicos

quando comparados ao controle. Verificamos que tanto os animais controle quanto

os dislipidêmicos se comportaram de maneira semelhante, exibindo tendência ao

aumento na ovariectomia (COS e LDLOS), e redução ao treinamento (COT e

LDLOT).

Figura 21- Parâmetros bioquímico VLDL, nos grupos experimentais.

Valores representam M ± EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;

+p<0,05 vs COT.

6.3.4 Colesterol Total

Os dados do Colesterol Total, conforme figura 22, mostra resultados

semelhantes ao Triglicérides e ao VLDL, em ambos os grupos.

Figura 22- Parâmetro bioquímico Colesterol Total (CT), dos grupos experimentais.

57 6. RESULTADOS

Valores representam M ± EPM.* p<0,05 vs CS; # p<0,05 vs COS ;

+ p<0,05 vs COT ;

2p<0,05 vs LDL-

OS.

6.4 Análises morfométrica, estereológica e imunohistoquímica.

6.4.1 Análise morfométrica

6.4.1.1 Área (µm2) e diâmetro médio (µm) das Ilhotas Pancreáticas.

Os parâmetros área e o diâmetro médio das ilhotas pancreáticas estão

apresentados na Tabela 4 e figuras 23 e 24.

Tabela 4- Área (µm2) e diâmetro médio (µm) das ilhotas pancreáticas nos grupos

estudados.


Área 6797,5±506,5 8740,8±104,22 7549,4±832,1 4060,3±367,1*

#+ 9593,4±1144,8

1 6897,8±558,9

2

Diâmetro 94,5±3,9 106,0 ±6,1 99,5 ± 5,3 73,8±3,2*#+

109,8±7,11 93,7±4,0

2

58 6. RESULTADOS

Valores representam média ± erro padrão da média (M±EPM). *p<0.01 vs CS; #

p<0,001 vs COS; +p<0.01 vs COT;

1p<0.01 vs LDL S e

2p<0.05 vs LDL OS

Ao compararmos o grupo CS ao grupo LDL S, verificamos que a dislipidemia

promoveu uma diminuição significante tanto da área (-40%) quanto no diâmetro

médio (-22%) das ilhotas pancreáticas e que a ovariectomia (LDL OS), apontou um

aumento significante tanto na área (+136%) quanto no diâmetro (+40%), quando

comparado com o grupo LDL S e que o treinamento (LDL OT) reverteu este

processo (-28%) e (-15%), respectivamente, quando comparado ao grupo LDL OS,

aproximando aos resultados do grupo COT.

Figura 23- Área da ilhota pancreática nos grupos estudados.

Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS;

#p<0,05 vs COS;

+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL

S; 2p<0,05 vs LDL OS.

Figura 24- Diâmetro médio das ilhotas pancreáticas nos grupos estudados.

59 6. RESULTADOS

Valores representam M±EPM. *p<0,05 vs CS; #p<0,05 vs COS;

+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL


6.4.1.2 Distribuição de frequência da área das ilhotas

pancreáticas (%)

Na tabela 5 e figura 25 observamos os resultados da distribuição de

frequências (%) da área das ilhotas pancreáticas, para tal consideramos os

seguintes valores para o tamanho das áreas: pequena (593- 4863 µm2); média

(4864-9726 µm2) e grande (9726-20868 µm2).

Verificamos que o tamanho das ilhotas pancreáticas sofre influência da

ovariectomia (COS), nos animais do grupo controle, promovendo aumento na

frequência de ilhotas pequenas e grandes e diminuição das médias, quando

comparado ao grupo CS. Ressaltamos que o treinamento conseguiu reverter este

processo se aproximando dos valores encontrados no grupo CS.

Os animais do grupo LDL S apresentaram aumento de ilhotas pancreáticas de

tamanho pequeno e uma diminuição acentuada nos tamanhos médio e grande,

60 6. RESULTADOS

quando comparado com o grupo CS. Notamos que nestes animais, o ovariectomia

(LDL OS), diferentemente do grupo controle, promoveu diminuição no tamanho

pequeno e aumento nos tamanhos médio e grande. Já o treinamento conseguiu

reverter o processo aumentando a frequência das ilhotas pequenas, diminuindo as

médias e mantendo as de tamanho grande.

Tabela 5- Valores representam a porcentagem das Ilhotas pancreáticas (IP)

distribuídas em tamanhos.


Pequena 34,6% 40,6% 31,2% 68% 35% 44,9%

Média 40,4% 29,7% 37,5% 17% 31,7% 22,5%

Grande 25% 29,7% 31,3% 15% 33,3% 32,6%

Porcentagem das Ilhotas pancreáticas (IP) distribuídas em tamanhos pequena (593- 4863µm2), média (4864-9726 µm2) e grande (9727-20868 µm2).

Figura 25- Histograma de distribuição de frequência do tamanho das ilhotas

pancreáticas quanto sua área, nos grupos estudados.

61 6. RESULTADOS

6.4.2 Análise estereológica

6.4.2.1 Densidade de volume das ilhotas, ácinos e vasos

pancreáticos.

Os resultados da densidade de volume das ilhotas, ácinos e vasos

pancreáticos estão representados na tabela 6 e nas figuras 26, 27, 28 e 29.

Figura 26- Fotomicrografias do tecido pancreático, ilhotas (seta branca), ácinos

(seta preta) e vasos (seta verde), dos grupos estudados. H&E, 400X. Barra 2µm

Na tabela 6 e figuras 26 e 27 podemos observar que a ovariectomia, nos

animais do grupo controle, mostrou uma tendência ao aumento na densidade de

volume das ilhotas e uma diminuição nos vasos, e o treinamento conseguiu reverter,

chegando próximo aos valores do grupo CS.

62 6. RESULTADOS

Nos animais dislipidêmicos constatamos que o sedentarismo (LDLS)

promoveu diminuição de (-46,3%) na densidade de volume das ilhotas, a

ovariectomia (LDLOS) aumento, de forma expressiva (+266%) e o treinamento

(LDLOT) redução (-37,7%), quando comparado aos seus pares. Verificamos que a

densidade de volume dos vasos diminui significantemente nos animais

dislipidêmicos e que o treinamento conseguiu reverter o processo, quando

comparado aos seus pares.

Quanto aos ácinos verificamos que os animais do grupo controle não

apresentaram alterações significantes em relação à ovariectomia e ao treinamento.

Os animais dislipidêmicos sedentários (LDLS) mostraram aumento significante

(+18,3%), a ovariectomia promoveu diminuição significante (-29,65%) em relação ao

LDLS e o treinamento (LDLOT) conseguiu reverter (+21%) este parâmetro, quando

comparado ao grupo LDLOS.

Tabela 6- Densidades de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), ácinos (Vv[ac]) e

vasos (Vv[vas]) (%) dos animais nos grupos estudados.


Vv[ip] % 18,66 ± 1,31 23,82 ± 2,55 18,70 ± 2,2 17,70 ± 2,18 28,17 ± 2,731 22,18 ± 2,39

Vv[ac]% 73,88 ± 2,07 69,39 ± 2,97 71,31 ± 2,63 79,3± 2,13 69,67 ± 2,72

1 74,49 ± 2,67

Vv[vas]% 7,44± 1,68 6,80±1,56 9,98± 1,94 3,01± 0,58*+

2,15 ± 0,45*#+

3,32 ± 0,77+

Valores representam M±EPM. Densidade de volume das Ilhotas, dos ácinos e dos vasos pancreáticos

(IP), nos grupos estudados. * p<0,05 vs CS; #p<0,05vs COS;

+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL S.

Figura 27- Densidade de volume das ilhotas pancreáticas (Vv[ip]), nos grupos

estudados.

63 6. RESULTADOS

Valores representam M±EPM. Densidade de volume das Ilhotas pancreáticas, nos grupos estudados. 1p<0,05 vs LDL S

Figura 28- Densidade de volume dos ácinos pancreáticos (Vv[ac]), nos grupos

estudados

Valores representam M±EPM. Densidade de volume dos ácinos pancreáticos, nos grupos estudados. 1p<0,05 vs LDL S.

Observamos que houve uma diminuição significante (-21%) quanto a

densidade de volume dos vasos nos animais dislipidêmicos e que o ovariectomia

apresentou uma tendência a redução e o treinamento a um aumento, não

significante, quando comparado os dados a seus pares. Figura 28 e 31 e tabela 6

64 6. RESULTADOS

Figura 29- Densidade de volume dos vasos pancreáticos (Vv [vasos]), nos grupos

estudados.

Valores representam média ± erro padrão da média (M±EPM). * p<0.05 vs CS; #p<0.05 vs COS; +p<0,05 vs COT.

6.4.3 Imunohistoquímica

6.4.3.1- Densidade de Volume das células-β (insulina)

imunomarcadas das ilhotas pancreáticas (Vv[cels β]) %

A tabela 7 e a figura 30 mostram os resultados da densidade de volume das

células β insulina das ilhotas pancreáticas.

65 6. RESULTADOS

Tabela 7- Densidade de volume das células beta (β) e outras células: Alfa ( ), Delta

(δ), Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos

grupos estudados.


Células-β(%) 73,7±1,8 82,4±3,1 74,5±1,7 71,6±1,2# 86±1,6

*+1 60,4±3,3

*#+12

Outras Cels(%) 26,3±1,8 17,6±3,1 25,5±1,7 28,4±1,2

# 14±1,6*

+1 39,6±3,3

*#+12


+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL

S; 2p<0,05 vs LDL OS

Verificamos que a ovariectomia, no grupo controle, apresenta uma tendência

ao aumento na densidade de volume das células β e que o treinamento consegue

reverter este processo, quando comparamos os dados aos seus pares. Nos animais

dislipidêmicos, resultados semelhantes foram encontrados, mas de forma

significante. Tabela 07 e figura 32, 34.

É importante, ressaltar que a células não marcadas foram consideradas

células alfa, delta, PP e épsilon, encontradas nas ilhotas pancreáticas, onde suas

porcentagens foram consideradas em conjunto, como pode ser observada na tabela

7.

Figura 30- Densidade de volume das células- β (beta), das ilhotas pancreáticas, nos

grupos estudados.


+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL


66 6. RESULTADOS

6.4.3.2- Densidade de volume das células-α (glucagon) da Ilhota

pancreática (Vv[cels α]) %.

A tabela 8 e a figura 31 mostra os resultados da densidade de volume das

células Alfa (α) (glucagon) das ilhotas pancreáticas.

Tabela 8- Densidade de volume das células Alfa ( ) e outras células: beta (β), Delta

(δ), Polipeptídeo (PP) e Épsilon (E), que compõem as ilhotas pancreáticas nos

grupos estudados.


Células α (%) 32,7±1,6 18,2±1,2* 43,3±2

*# 30,4±3,8

*+ 29,1±2,3*

+ 47,1±18,3

*#12

Outras Cels (%) 67,3±1,6 81,8±1,2* 56,7±2

*# 69,6±3,8

#+ 71±2,3*

+ 52,9±2,9

*#1


+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL


Verificamos que no grupo controle a ovariectomia (COS) promoveu

diminuição significante da porcentagem das células-α e que o treinamento (COT)

promoveu sua recuperação, ao compararmos a seus pares. (Tabela 08 e figura 31).

Nos animais dislipidêmicos, a ovariectomia (LDL OS), não mostrou alterações

nas células-α, quando comparamos ao grupo LDL S, mas verificamos aumento

significante das mesmas, quando comparamos com o grupo controle

ovariectomizado (COS). Já o treinamento (LDL OT) se apresentou de forma positiva

conseguindo reverter o processo, chegando próximo ao grupo COT. (Tabela 08 e

figura 31).

67 6. RESULTADOS

Figura 31- Densidade de volume das células α- pancreáticas, nos grupos estudados.


+p<0,05 vs COT;

1p<0,05 vs LDL


68 6. RESULTADOS

Figura 32- Fotomicrografias das ilhotas pancreáticas com as técnicas em H&E e

Imunohistoquímica com células alfa e beta imunocoradas, das ilhotas pancreáticas.200X,

barra 5µm.

69 7. DISCUSSÃO

7. DISCUSSÃO

Com o evento da menopausa, alterações endócrino-metabólicas, causadas

pela privação dos hormônios estrogênios, promovem aumento de lipoproteínas de

baixa densidade sanguínea (LDL), diminuição da lipoproteína de alta densidade

(HDL), associados a um quadro de hipercolesterolemia, acarretando diversas

doenças senis, como Síndrome Metabólica, aterosclerose, doenças

cardiovasculares e principalmente diabetes (GRAFF-IVERSEN et al., 2008), levando

à disfunções morfológicas pancreáticas, induzindo um quadro dislipidêmico pré-

diabéticos (SILVA et al.; 2013).

Diabetes tipo 2 (T2D) e resistência periférica à insulina é causado por uma

combinação da incapacidade do corpo em produzir insulina suficiente. A American

Diabetes Association (ADA), 2008, enfatiza que, isto leva a uma deficiência da

homeostase da glicose com subsequente hiperglicemia crônica, associada a danos

em longo prazo e a disfunção de vários órgãos, incluindo olhos, rins, nervos,

coração e vasos sanguíneos.

O treinamento físico vem sendo apontado como uma intervenção eficaz, não

farmacológica, pois induz a uma maior tolerância à glicose aumentando a

sensibilidade à insulina e melhorando o perfil lipídico, circulação, massa muscular,

taxa metabólica e capacidade antioxidante, reduzindo assim os riscos de

complicações diabéticas (SARACENI & BRODERICK, 2007; GOLBIDI et. al, 2012).

Além disso, foi demonstrado que o treinamento voluntário aumenta a quantidade de

insulina pancreática e previne a falência de células beta, em modelos animais

diabéticos (SLENTZ et al, 2009; DELGHINGARO-AUGUSTO et. al, 2011; HUANG et.

al, 2011; MALIN et al, 2012; OMIYA et al, 2015).

Portanto, o objetivo deste estudo foi evidenciar o efeito do treinamento físico

sobre as ilhotas pancreáticas em modelo camundongos femeas LDL Knockout

ovariectomizadas.

70 7. DISCUSSÃO

7.1. Massas corporal, Tecido Adiposo Visceral e Pâncreas.

Nossos resultados mostram que após 5 semanas de treinamento, não

obtivemos resultados significativos quanto a massa corporal, no entanto, nota-se

que,os grupos ovariectomizados treinados apresentaram uma tendência à

diminuição de massa corporal. Essa diminuição, nestes animais, é semelhante as

observadas por SLENTZ (2009), em mulheres menopausadas que realizaram

treinamento físico.

O treinamento físico, tem sido um tratamento eficaz não farmacológico, para a

redução de peso corporal, (MALIN et al, 2013; OMIYA et al, 2015) tanto em

humanos, quanto em modelos experimentais (MARQUES et al., 2010; TRAISAENG

et al.,2014).

Também observamos aumento do tecido adiposo visceral, no grupo LDL OS,

provavelmente associado à dislipidemia e a menopausa. Cabe citar os trabalhos de

Gaspard (2009) e Meirelles (2014), destacam que a obesidade visceral favorece a

resistência insulínica, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares. Com a

diminuição do acúmulo de gordura abdominal, é possível reverter à resistência a

insulina, aumentando a absorção da glicose dos tecidos, prevenindo o pâncreas do

excesso de secreção da insulina (AFONSO et al., 2003).

Um estudo transversal, com 118 mulheres pós- menopáusicas, foi apontado

que 30% destas mulheres apresentavam síndrome metabólica concomitante à

obesidade abdominal (JOUYANDEH et al, 2013). Este aspecto também é comentado

por Veras (2014), em estudo com ratas Wistar ovariectomizadas alimentadas com

dieta hipercalórica, onde observou aumento significativo no peso corporal e redução

na sensibilidade e secreção da insulina. Dados semelhantes foram encontrados por

Figueiredo-Neto, (2010) em 323 mulheres, pré e pós-menopausa, evidenciando que

a prevalência da obesidade abdominal e síndrome metabólica, foi maior em

mulheres menopausadas do que as não menopausadas.

Ao mencionar tal assunto, Meirelles (2014) relata que uma das funções do

hormônio estrogênio, é conduzir a deposição da gordura nas regiões femoral e

71 7. DISCUSSÃO

glútea (gordura diferente da visceral) e apresentar um perfil glicídico não tão

agressivo, como a do tecido adiposo visceral, porém, após a menopausa, sem a

função estrogênica, o corpo passa a depositar a maior parte da gordura para a

região abdominal.

Estudos demonstram que a pós-menopausa, acentua a deposição de gordura

abdominal em aproximadamente em 40%. O excesso da gordura visceral aumenta a

atividade lipolítica celular, resultando em um aumento na liberação dos ácidos

graxos livres (AGL) pela veia porta, desembocando uma parte deste substrato, no

fígado, músculo e no pâncreas (CESARIO & NAVARRO, 2008).

Vários autores relatam que durante o treinamento físico moderado, ocorre o

efeito do ciclo glicose-ácido graxo, que representa a preferência do tecido muscular

pelos ácidos graxos e os carboidratos para a produção de energia muscular,

favorecendo a lipólise do tecido adiposo (RANDLE et al.,1963, BONADONNA et al.,

1994; HABER et al., 2001; HUE et al., 2009; SILVEIRA et al., 2011).

Neste sentido, evidenciamos em nosso estudo diminuição significante na

porcentagem da gordura visceral no grupo dislipidêmico treinado (LDL OT), quando

comparado ao grupo controle. A despeito disso, Cesário (2008) comenta que o

treinamento físico de intensidade moderada, induz o aumento da atividade

simpática, estimulando a atividade da enzima lipase, cuja função é catalisar a

liberação de glicerol e ácidos graxos.

O papel endócrino do tecido adiposo, afeta a função de órgãos, como o

fígado, músculo, sistema nervoso central e pâncreas (ESTEVES, 2013). Viola

(1998), estudando camundongos com restrição alimentar verificou diminuição do

peso do fígado, rins, trato gastrintestinal e pâncreas. Em nosso estudo verificamos

nos grupos controle, uma tendência ao aumento da massa do pâncreas com a

ovariectomia, e diminuição com o treinamento.

72 7. DISCUSSÃO

7.2 Teste de Esforço Máximo

Quanto ao teste de esforço físico, observamos que no grupo controle houve

uma diminuiu sua capacidade com a ovariectomia, e uma tendência a com o

treinamento. Já os animais dislipidêmicos apresentaram tendência a redução do

seu esforço físico quando comparado ao grupo CS. A ovariectomia promoveu nos

grupos dislipidêmicos (LDLOS) uma piora, onde o treinamento (LDL OT) conseguiu

reverter positivamente o resultado do teste de esforço físico, quando comparado ao

grupo LDLS. Corroboram com nossos resultados os pesquisadores Solomon et al.

(2013), onde observaram, em indivíduos com diabetes tipo 2 ou intolerância à

glicose, melhora na aptidão aeróbica, após treinamento físico.

Alves et al., (2004), estudando mulheres acima de 60 anos, incluídas em um

programa de aulas de hidroginástica por 12 semanas, observaram uma melhora na

aptidão física. O American College Of Sports Medicine (ACSM), 2003; sugere que o

treinamento físico para o idoso deve ser de intensidade moderada, três vezes por

semana, frequência cardíaca máxima 55 a 85%. (FCmax).

7.3 Exames Laboratoriais

Sabe-se que o treinamento físico estimula a liberação dos hormônios

catecolaminas (norepinefrina e epinefrina), do crescimento GH, glucagon,

glicocorticoide cortisol, entre outros, atuando na glicogenólise hepática, com isso, a

degradação dos ácidos graxos do fígado, aumentam a liberação de glicose, sem a

necessidade da secreção da insulina, sendo assim a a glicose sofre alterações de

acordo com as concentrações destes hormônios (POWERS, 2009; AFONSO et al.,

2003; LIMA et al., 2010).

No presente estudo, o treinamento, tanto nos animais controle (COT) quanto

nos dislipidêmicos (LDLOT) mostraram uma diminuição nos resultados bioquímicos

73 7. DISCUSSÃO

realizados, pois o treinamento moderado está relacionado com o gasto energético,

corroboram com nossos resultados Solomon et al., (2013) e Omiya et al., (2015).

Nossos resultados mostram que a ovariectomia (COS e LDL OS) promoveu

aumento significante, no TG, VLDL e Colesterol total, e que o treinamento (COT e

LDL OT) conseguiu reverter estes resultados, quando comparados aos seus pares.

Neste contexto corroboram com nossos resultados Cheik, et al., (2006), onde

utilizando ratos com dieta hipercolesterolêmica que realizaram treinamento físico,

verificaram diminuição significativa no colesterol e a TG e aumento da fração lipídica

HDL-c.

Cabe citar o trabalho de Solomon et al., (2013), mostrando que o treinamento

físico obteve melhoras na sensibilidade à insulina, aumentando a absorção da

glicose nos tecidos periféricos, reduzindo a função das células-beta do pâncreas.

Este aspecto também é comentado por Amaral et al.; (2015), concluindo que o

treinamento físico reduz os níveis de triglicérides e promove aumento de Glut4,

melhorando o transporte de glicose para os músculos.

7.4 Análises Morfométrica, estereológica e Imunohistoquímica.

Os parâmetros área e o diâmetro médio das ilhotas pancreáticas, nos animais

controle, apresentaram uma tendência ao aumento com a ovariectomia (COS) e

diminuição com o treinamento (COT). Já os animais dislipidêmicos sedentários (LDL

S), apresentaram diminuição significante de -40% na área e -22% no diâmetro médio

das ilhotas pancreáticas, quando comparados ao grupo CS. Dados semelhantes

foram encontrados por Huang et al., (2007) onde demonstraram que o excesso de

lipídios, colesterol e triglicérides, contribuem ao estresse oxidativo, favorecendo o

quadro de apoptose, reduzindo a área das ilhotas pancreáticas. Silva et al., (2011),

estudando ratos diabéticos, também mostraram, diminuição no tamanho das ilhotas

pancreáticas, quando comparados ao grupo controle.

74 7. DISCUSSÃO

O grupo dislipidêmico ovariectomizado (LDL OS) obteve aumento significante

e de forma expressiva, tanto na área (+136%), quanto no diâmetro médio (+40%).

Dados semelhantes foram encontrados por Veras et. al (2014) em ratas e com Silva

(2013) em camundongos C57BL/6, submetidos à ovariectomia combinados com

dieta hiperlipídica.

Verificamos que o treinamento, é um fator preponderante para a reversão

deste processo, corroboram com nossos resultados Traisaeng et al., (2014);

Delghingaro-Augusto et al., (2011); Huang et al., (2011). Na mesma direção, Pauli et

al. (2009) e Speretta et. al. (2014) mostraram que o treinamento físico contribui para

efeito anti-inflamatório, promovendo diminuição na produção de TNF-alfa e outras

adipocinas pró- inflamatórias.

Hayek & Woodside (1979), consideram, que o tamanho da ilhota está

relacionado à secreção da insulina, portanto, ilhotas grandes secretam mais insulina.

Isto explica os resultados encontrados no grupo LDL OS, com aumento significativo

da densidade das ilhotas e a diminuição dos ácinos, promovendo também aumento

significativo na densidade das células-beta β, (insulina) imunomarcadas, quando

comparados ao grupo CS.

Poitout & Robertson (2002) e Kim & Yoon (2011) ponderam que a

glicotoxicidade e a hiperglicemia exercem efeitos prejudiciais as células-beta,

levando a apoptose, prejudicando sua função e consequentemente levando a um

quadro pré- diabético tipo 2.

Já os animais dislipidêmicos sedentários (LDL S), apresentaram uma

tendência à diminuição na densidade de volume das ilhotas pancreáticas, aumento

dos ácinos e uma diminuição significante dos vasos, quando comparados seus

pares. Vale notar que este grupo foi o que apresentou maior porcentagem de ilhotas

pequenas e tendência ao aumento na densidade das células-beta quando

comparado ao grupo CS. Mais estudos estão sendo realizados por nosso grupo para

tentar explicar a causa da diminuição das ilhotas pequenas sugerindo ser devido ao

75 7. DISCUSSÃO

quadro de dislipidemia que compromete a ação da insulina (LEAL et al., 2010)

levando a apoptose ou a formação de ilhotas novas, das quais, em caso de

hiperglicemia crônico, aumentariam de tamanhos, para a adaptação do ambiente

(BEAUDRY & RIDDELL, 2012). Já a ovariectomia promove um aumento significativo

das densidades de volume das células- beta, das ilhotas, e a presença de um maior

número de ilhotas grandes, sugerindo o esgotamento das células- beta pancreáticas.

Com o treinamento físico, diminuiu tanto a densidade das células- beta, quanto das

ilhotas pancreáticas, tendenciado as características do grupo controle (CS).

Verificamos que a dislipidemia, promove diminuição significativa na densidade

de volume dos vasos, quando comparados aos seus pares, no entanto, o

treinamento (LDL OT), apresenta uma tendência ao aumento. Cabe citar o trabalho

de Iwase et al., (2002), em ratos OLEFT com 12 semanas, pré-diabético, pré- obeso,

onde concluíram que hiperglicemia a longo prazo, diminui o fluxo sanguíneo das

ilhotas e destaca também que, a restrição alimentar, melhorou o fluxo sanguíneo.

Vale lembrar que as ilhotas, diminuem com o envelhecimento, potencializando

esta redução em casos crônicos de hiperglicemia, dislipidemia, onde o pâncreas

pode ser levado à exaustão, resultando em uma diminuição da secreção de insulina

a longo prazo (IWASE et al., 2002; HAYEK et al.,1979). Estudos demonstraram

correlação das ilhotas pancreáticas expostas em níveis elevados de glicose, por um

tempo crônico, resultam em ineficácias da funcionalidade das células betas (insulina)

(ROCHA et al., 2006).

Em nosso trabalho, o grupo treinado (COT), apresentou uma tendência à

diminuição das ilhotas e um pequeno aumento dos ácinos, quando comparados aos

grupos COS. Os nossos estudos estão de acordo com Amaral et al., (2015), do qual,

a corrida com ratos Wistar, mostrou diminuição também da área das ilhotas e um

aumento dos ácinos.

Nossos experimentos mostraram que o treinamento promoveu aumento da

densidade de volume das células- alfa pancreáticas (glucagon), tanto nos animais

76 7. DISCUSSÃO

controle (COT), quanto os dislipidêmicos (LDL OT). Corroboram com nossos

resultados, os pesquisadores Lima et al., (2010); Afonso et al., (2003); Canali &

Kruel (2001), mostrando que o glucagon é estimulado por jejum ou treinamento.

Quanto maior o tempo de treinamento, maior a liberação do glucagon

(FERNANDEZ-PASTOR et al., 1992). Porém, a densidade das células-beta

pancreáticas (insulina), aumentaram com a ovariectomia, mas o treinamento

conseguiu reverter. O Glucagon, estimula a degradação do glicogênio no fígado, e a

quebra dos triglicérides no tecido adiposo, facilitando a captação de glicose e

diminuindo os níveis de insulina (FERNANDEZ-PASTOR et al., 1992; CANALI &

KRUEL, 2001). Com isso, observamos nos grupos treinados, uma tendência à

diminuição das densidades de volume das ilhotas (Vv[ip]), se aproximando aos

valores do CS.

77 8. Conclusão

8. Conclusão

Ao analisarmos os dados obtidos neste trabalho, sugerimos que a ovariectomia,

promoveu aumento na massa corporal, no tecido adiposo e também na massa do

pâncreas, tanto no grupo controle COS, quanto no grupo dislipidêmico LDLOS. Este

aumento é devido as alterações promovidas pelo envelhecimento, menopausa e

sedentarismo, levando ao aumento na Glicemia, no Triglicérides, VLDL e no Colesterol

Total, indo ao encontro de que o aumento de peso eleva os níveis bioquímicos,

resultando na diminuição do fluxo sanguíneo.

Diante de um quadro de alteração nos níveis bioquímicos, levando a dislipidemia,

alterações como aumento na área e no diâmetro das ilhotas, na densidade de volume

das ilhotas pancreáticas de 17% no grupo LDL S, para 28% no grupo LDLOS, foram

observadas.

O histograma de frequência do tamanho das ilhotas pancreáticas evidencia aumento

das ilhotas grandes (33,3%) no grupo LDL OS, quando comparados ao grupo LDL S

(15%). Isto explica o aumento das células beta, como tentativa de reverter o quadro da

dislipidemia, com o aumento da secreção da insulina, também observada na

ovariectomia, evidenciando uma tendência ao aumento na densidade de volume das

células-beta.

Observamos na imuno-histoquímica, que houve um aumento na densidade das

células-alfa (glucagon) e diminuição das células-beta (insulina), isso explica a

diminuição da área, do diâmetro e da densidade das células-beta (insulina), e o

aumento das células alfa (glucagon), que vai ao encontro de que o treinamento físico

moderado, promove a liberação do hormônio glucagon e o aumento de Glut4.

Ou seja, o hormônio glucagon promove a liberação de glicose do fígado e do tecido

adiposo para o sangue (por isso a diminuição do tecido adiposo), e o Glut4 melhora o

78 8. Conclusão

transporte de glicose para os músculos, não havendo a necessidade do hormônio da

insulina, assim, prevenindo o pâncreas.

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