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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

DEPARTAMENTO DE CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS

FARMACEcircUTICAS

ESTUDO FITOQUIacuteMICO E ANTIMICROBIANO DA CASCA DO CAULE

DE Hymenaea stigonocarpa MART EX HAYNE (JATOBAacute)

GUSTAVO SANTIAGO DIMECH

RECIFE 2014

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RECIFE 2014

Tese submetida ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em

Ciecircncias Farmacecircuticas do Centro de Ciecircncias da

Sauacutede da Universidade Federal de Pernambuco como

parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor

em Ciecircncias Farmacecircuticas

Aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e medicamentos

Linha de pesquisa Obtenccedilatildeo e avaliaccedilatildeo de produtos

naturais bioativos

Orientadora Profa Dra Eulaacutelia C Pde A Ximenes

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ESTUDO FITOQUIacuteMICO E ANTIMICROBIANO DA CASCA DO CAULE DE

HYMENAEA STIGONOCARPA MART EX HAYNE (JATOBAacute)

Tese submetida ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas da Universidade Federal de Pernambuco como requisito parcial para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor em Ciecircncias Farmacecircuticas

Aprovada em 19032014

BANCA EXAMINADORA

_________________________________________________________________ Profa Dra Eulaacutelia Camelo Pessoa de Azevedo Ximenes (Orientador)

Universidade Federal de Pernambuco

___________________________________________________________________ Profa Dra Mocircnica Camelo Pessoa de Azevedo Albuquerque (Examinadora Interna)


______________________________________________________________ Prof Dr Sebastiatildeo Joseacute de Melo (Examinador Interno)


______________________________________________________________ Profa Dra Ana Catarina de Souza Lopes (Examinadora Externa)


______________________________________________________________ Profa Dra Glaucia Manoella de Souza Lima (Examinadora Externa)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

REITOR

Prof Dr Aniacutesio Brasileiro de Freitas Dourado

VICE-REITOR

Prof DrSiacutelvio Romero de Barros Marques

PROacute-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E POacuteS-GRADUACcedilAtildeO

Prof Dr Francisco de Sousa Ramos

DIRETOR DO CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

Prof Dr Nicodemos Teles de Pontes Filho

VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE

Profa Dra Vacircnia Pinheiro Ramos

CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS

Prof Dr Antocircnio Rodolfo de Faria

VICE- CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS

Prof Dr Dalci Joseacute Brondani

COORDENADOR DO PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS

FARMACEcircUTICAS

Prof Dra Almir Gonccedilalves Wanderley

VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS

FARMACEcircUTICAS

Profa Dra Ana Cristina Lima Leite

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Dedico este trabalho aos professores Salvador e Naacutegela Dimech meus pais

Por sempre me ensinarem o valor da educaccedilatildeo

A minha esposa Alba e minha filha Bruna

Para que eu possa servir de exemplo

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AGRADECIMENTOS

A Deus por sempre guiar meus passos mostrando os verdadeiros valores que

devem estar presentes na caminhada

A meus pais Salvador (In memorian) e Naacutegela meus primeiros educadores

responsaacuteveis pela minha formaccedilatildeo como pessoa

A minha esposa Alba Dimech por todo companheirismo paciecircncia e amor estando

sempre do meu lado e ajudando a superar todas as dificuldades durante esta

jornada

A minha filha Bruna Dimech por sempre proporcionar os melhores momentos da

minha vida

A minha orientadora Eulalia Ximenes por aleacutem de cumprir a sua vocaccedilatildeo como

educadora demonstar sempre amizade simpatia e um carinho a todos os seus

alunos Sua presenccedila e apoio nos momentos tristes e alegres nunca seratildeo

esquecidos

Aos professores Haroudo Saacutetiro Xavier e Alexandre Goacutees pela simpatia amizade e

suas sempre importantiacutessimas colocaccedilotildees

A equipe do Herbaacuterio Daacuterdano de Andrade Lima do Instituto Agronocircmico de

Pernambuco principalmente a Dra Ana luiacuteza Du Bocage Neta Dra Bernadete costa

e a Dra Rita de Caacutessia Arauacutejo Pereira

Ao professor Sebastiatildeo Melo pelo auxilio na tarefa de identificaccedilatildeo dos flavonoides

assim como ao professor Norberto Peporine Lopes

Ao Professor Joaacutes Lucas da Silva pela disponibilidade e ajuda na realizaccedilatildeo da

microscopia eletrocircnica na USP Satildeo Paulo

Aos professores Pedro Rolim e Terezinha Gonccedilalves e Miracy Muniz pela permissatildeo

da utilizaccedilatildeo dos equipamentos em seus laboratoacuterios

As professoras Elba Lucia Cavalcanti Amorim e Claudia Sampaio minhas

orientadoras na iniciaccedilatildeo cientiacutefica e ao professor Almir Wanderley que muito

contribuiram para minha formaccedilatildeo acadecircmica

Ao Professor Luiz Alberto Lira Soares Magda Ferreira e as professoras Karina

Randau e Rejane Pimentel pelo auxilio na execuccedilatildeo deste trabalho

Aos amigos de laboratoacuterio Amanda Lucas Tiago Leacuteo Renata George

Emmanuelle Fabio Kewdma e Tacilene

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Ao Sr Joseacute Ney e seu filho Helson Neves donos da fazenda Saco na cidade de Jati-

CE e a Miro Ao contrario do que torciacuteamos tinha em suas terras uma espeacutecie

jatobaacute diferente da estudada neste trabalho poreacutem sou grato por toda a atenccedilatildeo

Ao Sr Antocircnio Severino de Paula dono fazenda Refuacutegio na cidade de Camocim de

Satildeo Feacutelix-PE ao Sr Elisiario Souza ao meu sogro Sr Luiz Carlos Serafim e ao Sr

Cacai pelo auxiacutelio na localizaccedilatildeo e coleta da amostra de Hymenaea stigonocarpa

utilizada neste estudo

A minha tia Conceiccedilatildeo Alencar pelo apoio que fez toda a diferenccedila durante a

execuccedilatildeo deste trabalho

Aos velhos amigos Carlos Fernando Brasileiro e Eduardo Gonccedilalves (BRASA E

DUDA) por serem os grandes responsaacuteveis por plantar a ideacuteia da realizaccedilatildeo desse

Doutorado

Aos novos amigos Gibson Gomes Antocircnio Pereira e Isla Bastos por serem grandes

companheiros de bancada durante a execuccedilatildeo deste trabalho

Aos colegas da Universidade Federal Rural de Pernambuco Neves Luana

Rivonilda Eroacutetildes Reginete Walter Arlindo Erica e vaacuterios outros por todo apoio

Ao Professor Jurandi David Da Silva Farmacecircutico que me ensinou os primeiros

ldquosegredosrdquo da Microbiologia Cliacutenica

Ao Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas e a Comissatildeo de Controle de Infecccedilatildeo

Hospitalar do Hospital Aeronaacuteutica de Recife casa onde iniciei na arte da

microbiologia Cliacutenica

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Eacute vocecirc olhar no espelho Se sentir Um grandessiacutessimo idiota Saber que eacute humano Ridiacuteculo limitado Que soacute usa dez por cento De sua cabeccedila animal

E vocecirc ainda acredita Que eacute um doutor Padre ou policial Que estaacute contribuindo Com sua parte Para o nosso belo Quadro social

Ouro de tolo ndash Raul Seixas

Ainda que eu tivesse

o dom da profecia e

conhecesse todos os

misteacuterios e toda a

ciecircncia se natildeo

tivesse amor nada

seria

Corintios 13-2

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Aacutervore Hymenaea stigonocarpa com cerca de 20 metros de altura 27

Figura 2 - Casca do caule de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne 28

Figura 3 - Folhas de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne 28

Figura 4 - Inflorescecircncia do jatobaacute do cerrado (Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne)

29

Figura 5 - Vista frontal do fruto de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne 29

Figura 6 - Seccedilatildeo transversal do fruto de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne

30

Figura 7 - Seccedilatildeo longitudinal do fruto de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne

30

Figura 8 - Aspectos da semente de Hymenaea stigonocarpa Martex Hayne 31

Figura 9 - Aacutecido copaacutelico isolado da resina de H courbaril 32

Figura 10 - Terpeno labd-13-em-ol 15-oato de metila isolado de H courbaril 32

Figura 11 - Terpenos isolados da resina do tronco da Hymenaea courbaril coletada na regiatildeo de Campinas

33

Figura 12 - Principais constituintes das resinas encontradas nas folhas da Hymenaea courbaril cariofileno (1) β-selineno (2) e α-selineno (3) 33 Figura 13 - Constituintes encontrados em menor escala das resinas das folhas da Hymenaea courbaril alfa-cubebeno (1) α-copaeno (2) beta-copaeno (3) alfa e beta-hemuleno (4a e 4b) γ-muroleno (5) delta-cadineno (6) e copacanfeno (7)

34

Figura 14 - Composto diterpecircnico identificado na resina proveniente da casca do fruto da Hymenaea courbaril aacutecido enatio-8(17)13(16)14-labdatrien-18-oico

34

Figura 15 - Compostos sesquiterpecircnicos identificados na resina proveniente da casca do fruto da Hymenaea courbaril ciclosativeno (1) β-bourbuneno (2) cariofileno (3) calareno (4) hemuleno22 Selina-4(14)-7-dieno (5) α-himacaleno (6) α-muroleno (7) 35

Figura 16 - Estruturas dos sesquiterpenos isolados das folhas de H courbaril b-cariofileno (1) e γ-muroleno (2) 36 Figura 17 - Estruturas dos diterpenos isolados das folhas e galhos de H courbaril aacutecido (13R)-13-hidroxi-1(10)14-ent-halimadien-18-oico (1) aacutecido (2S13R)-213-dihidroxi-1(10)-14-ent-halimadien-18-oico (2) e aacutecido (13R)-2-oxo-13-hidroxi-1(10)14-ent-halimadien-18-oico (3) 36 Figura 18 - Estruturas dos diterpenos isolados das sementes de H courbaril aacutecido (5R8S9S10R)-cleroda-313E-dien-15-oico (1) e aacutecido (5S8S9S10R)-cleroda-313E-dien-15-oico (2) 37 Figura 19 - Principais constituintes da fraccedilatildeo aacutecida da resina do tronco da Hymenaea oblongifolia aacutecido enantio-pinifoacutelico (aacutecido enantio-labd-8(20-em-1518 dioacuteico) (1) e o aacutecido guamaacuteico (aacutecido enantio-labd-8(20)13-dien-1518 dioico (2) oblongifolia 38 Figura 20 - Esqueletos estruturais do tipo laacutebdano (1) e abietano (2) e pimarano (3) da resina de Hymenaea stigonocarpa 39

9

Figura 21 - sesquiterpenos isolados da fraccedilatildeo neutra das folhas de H stigonocarpa a-copaeno (1) espatulenol (2) e oacutexido de cariofileno (3)

40 Figura 22 - Diterpenos majoritaacuterios isolados da fraccedilatildeo aacutecida das folhas de H stigonocarpa caur-16-en-19-ato de metila (4) caur-15-en-19-ato de metila (5) ozato de metila (6) e isoozato de metila (7) 40 Figura 23 - Estrutura do aacutecido enantio-13-epilabdanoacuteico isolada de H parvifolia 41

Figura 24 - Estrutura da Astilbina 42

Figura 25 - Estruturas de flavonoacuteides isolados das folhas de H palustres luteolina (1) crisoeriol (2) e palstatina (3) 42

Figura 26 - Estruturas dos flavonoacuteides isolados do cerne de H courbaril taxifolina (1) e o fisetinidol (2) 43

Figura 27 - Estruturas das cumarinas isoladas das sementes de H courbaril ipomopsina (1) e hymenaina (2) 44

Figura 28 - Localizaccedilatildeo geograacutefica do local de coleta das cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne 69

Figura 29 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando a regiatildeo do suacuteber corada com safranina e azul de astra 79

Figura 30 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando a regiatildeo do suacuteber felogecircnio feloderma e parecircnquima cortical corados com safranina e azul de astra 80

Figura 31 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando parecircnquima cortical esclerecircnquima e floema corados com safranina e azul de Astra 80 Figura 32 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando regiotildees coradas com dicromato de potaacutessio para visualizaccedilatildeo de regiotildees com conteuacutedos fenoacutelicos 81 Figura 33 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo jovem de Hymenaea stigonocarpa mostrando regiotildees coradas com vanilina cloriacutedrica visualizaccedilatildeo de regiotildees com conteuacutedos de taninos 82

Figura 34 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando regiotildees coradas com vanilina cloriacutedrica visualizaccedilatildeo de regiotildees com conteuacutedos de taninos 83

Figura 35 - Cromatograma dos extratos ciclo-hexano acetato de etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo da presenccedila de monoterpenos e sesquiterpenos 84

Figura 36 - Cromatograma dos extratos ciclohexano acetato de etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de triterpenos e esteroides 85

Figura 37 - Cromatograma dos extratos ciclohexano acetato de etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de flavonoacuteides

86

Figura 38 - Cromatograma dos extratos ciclo-hexano acetato de etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de accedilucares

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Figura 39 - Cromatograma do extrato etanoacutelico (B) para avaliaccedilatildeo de taninos hidrolisados

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10

Figura 40 - Cromatograma dos extratos ciclo-hexano acetato de etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de taninos condensados

89

Figura 41 - Cromatograma do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa para avaliaccedilatildeo de flavonoacuteides

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Figura 42 - Cromatograma do extrato hidroalcooacutelico e da fraccedilatildeo aquosa para avaliaccedilatildeo de flavonoacuteides

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Figura 43 - Cromatograma do extrato hidroalcooacutelico e da fraccedilatildeo acetato de etila para avaliaccedilatildeo de taninos

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Figura 44 - Cromatogramas obtidos por CLAEndashDAD de diferentes extratos da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa

94

Figura 45 - Imagens da microscopia eletrocircnica de transmissatildeo da cepa de S aureus ATCC-33591 tratada com diferentes concentraccedilotildees do extrato hidroalcooacutelico de H Stigonocarpa

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Figura 46 - Representaccedilatildeo do meacutetodo do tabuleiro de xadrez 121

Figura 47 - Isobolograma revelando o efeito sineacutergico do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa quando associado agrave oxacilina frente agrave Staphylococcus aureus AM24 129 Figura 48 - Microscopia eletrocircnica de transmissatildeo da cepa de S aureus AM 24 submetida a tratamento com oxacilina e o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa 131

Figura 49 - Histograma de distribuiccedilatildeo granulomeacutetrica do triturado da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa 153

Figura 50 - Curvas de retenccedilatildeo e passagem da amostra de casca do caule de Hymenaea stigonocarpa 154

Figura 51 - Teor dos resiacuteduos secos obtidos atraveacutes dos diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo 159 Figura 52 ndash Cromatogramas demonstrando a da presenccedila de flavonoides e taninos nos extratos hidroalcooacutelicos da casca do caule Hymenaea stiginocarpa obtidos a partir dos diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo 160

Figura 53 - Espectro de varredura do aacutecido gaacutelico e do extrato de Hymenaea stigonocarpa apoacutes reaccedilatildeo com Folin-Ciocalteau 161

Figura 54 - Graacutefico de pareto para efeitos padronizados do fatorial 32 162

Figura 55 - Valores de absorvacircncia da fraccedilatildeo residual do extrato de Hymenaea stigonocarpa em funccedilatildeo da quantidade de caseiacutena 163

Figura 56 - Cromatograma obtido por CLAE-DAD dos diferentes extratos hidroalcooacutelicos da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa

166

Figura 57 - Teor de polifenois totais dos extratos hidroalcooacutelicos da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa obtidos atraveacutes dos diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo 167

Figura 58 - Espectro de Ultravioleta e espectro de massa do pico A obtido compatiacutevel com taxifolina 187

11

Figura 59 - Espectro de UV e de massas dos iacuteons moleculares desprotonados do padratildeo astilbina 189

Figura 60 - Espectro de UV e de massas do pico B compatiacutevel com a astilbina (padratildeo) 190 Figura 61 - Espectro de UV e de massas do pico C compatiacutevel com o flavanonol engeletina 191 Figura 62 - Espectro de UV e de massas do pico D compatiacutevel com estereoisocircmero da astilbina 192

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Conteuacutedo de polifenois e taninos totais dos diferentes extratos e fraccedilotildees de Hymenaea stigonocarpa 93

Tabela 2 - Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima dos extratos e fraccedilotildees de Hymenaea stigonocarpa frente a cocos Gram-positivos 97 Tabela 3 - CIM e CBM do extrato hidroalcooacutelico da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa e de agentes antimicrobianos frente cepas de Staphylococcus aureus com diferentes perfis de resistecircncia 125 Tabela 4 - Avaliaccedilatildeo da associaccedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaeae stigonocarpa com agentes antimicrobianos frente a cepas de Staphylococcus aureus multidroga resistes 127

Tabela 5 - Resultados dos ensaios de perda por dessecaccedilatildeo teor de extrativos e cinzas totais das amostras de Hymenaea stigonocarpa

156 Tabela 6 - Matriz do experimental do desenho aplicado para avaliar a influecircncia da quantidade de Folin concentraccedilatildeo de Carbonato e tempo de leitura sobre a resposta do meacutetodo em absorbacircncia 162

Tabela 7 - Valores meacutedios da absorvacircncia (UA) e CV obtidos para a fraccedilatildeo natildeo tanante com caseiacutena durante anaacutelise em triplicata 164 Tabela 8 - Teor de polifenois taninos e flavonoides totais nos extratos hidroalcooacutelocos de Hymenaea stigonocarpa obtidos a partir de diferentes meacutetodos 165 Tabela 9 - Valores da Concentraccedilatildeo Bactericida Miacutenima e Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima dos extratos de Hymenaea stigonocarpa frente a cepas de bacteacuterias Gram positivas 169 Tabela 10 - Valores da Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa obtido por maceraccedilatildeo frente a diferentes espeacutecies de Candida 171 Tabela 11 - Dados cromatograacuteficos e espectrofotomeacutetricos dos componentes identificados no cromatograma da fraccedilatildeo acetato de etila de Hymenaea stigonocarpa 186

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RESUMO

A raacutepida disseminaccedilatildeo dos micro-organismos multidroga resistentes induz a pesquisa por novos agentes antimicrobianos mais ativos e menos toacutexicos Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne (Fabaceae) eacute uma planta medicinal de principal ocorrecircncia no cerrado brasileiro e conhecida popularmente como Jatobaacute-do-cerrado As cascas do seu caule satildeo amplamente utilizadas em infusatildeo ou decocccedilatildeo para tratar dor de estocircmago asma bronquite uacutelceras diarreacuteia gripe e tosse Entretanto estudos fitoquiacutemicos e antimicrobianos ainda natildeo satildeo escassos O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana de diferentes extratos da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa atraveacutes da determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima e bactericida miacutenima realizar a caracterizaccedilatildeo botacircnica e fitoquiacutemica por cromatografia de camada delgada e cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia e determinar as concentraccedilotildees dos metaboacutelitos secundaacuterios responsaacuteveis pela sua atividade e sua atividade frente a diferentes espeacutecies de Candida Aleacutem disso foi parte deste estudo a avaliaccedilatildeo da interaccedilatildeo entre o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa e agentes antimicrobianos de diferentes classes quiacutemicas a determinaccedilatildeo das alteraccedilotildees ultraestruturais decorrentes da accedilatildeo deste extrato em associaccedilatildeo bem como a caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica das cascas do caule apoacutes coleta secagem e trituraccedilatildeo Este trabalho tambeacutem avaliou a influecircncia do meacutetodo de extraccedilatildeo sobre as seguintes variaacuteveis resiacuteduo seco atividade antbacteriana e concentraccedilatildeo de taninos Staphylococcus aureus mostrou ser o micro-organismo mais sensiacutevel a accedilatildeo dos extratos Tambeacutem foi observada uma forte atividade frentes as espeacutecies Candida krusei e Candida glabrata e uma atividade moderada frente as bacteacuterias Gram negativas A anaacutelise ultraestrutural deste micro-organismo demonstrou alteraccedilotildees na parede celular bem como no citoplasma decorrentes da accedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico A associaccedilatildeo com agentes antimicrobianos resultou na maior parte das vezes em um efeito sineacutergico revertendo a multirresistecircncia de algumas cepas de Staphylococcus aureus meticilina resistentes O meacutetodos de extraccedilatildeo natildeo influecircnciaram a concentraccedilatildeo final de taninos assim como a atividade antibacteriana Entretanto houve diferenccedilas quanto ao resiacuteduo seco sendo esta a variavel utilizada para classificar a maceraccedilatildeo dinacircmica como o meacutetodo mais eficaz Quanto a presenccedila flavonoacuteides apoacutes fracionamento e anaacutelise por cromatografia liacutequida ultra raacutepida acoplada ao espectrocircmetro de massas fortes evidecircncias indicam a presenccedila de engeletina taxifolina astilbina e um diasteroisocircmero da astilbina Assim concluimos que o extrato hidroalcooacutelico da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa tem atividade antimicrobiana sendo mais ativo frente a Staphylococcus aureus como tambeacutem a cepas de Candida krusei e Candida glabrata O modo de extraccedilatildeo mais eficiente eacute a maceraccedilatildeo dinacircmica e a associaccedilatildeo do extrato com antibioacuteticos de referecircncia leva a potencializaccedilatildeo do efeito destes Palavrasndashchave Hymenaea Staphylococcus Sinergismo Taninos Ultraestrutura

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ABSTRACT

The rapid spread of multidrug resistant microorganisms induces the search for new more active and less toxic antimicrobial agents Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne (Fabaceae) is a medicinal plant of main occurrence in the Brazilian cerrado and known popularly as Jatoba-do-cerrado Its stem peels are widely used in infusion or decoction to treat stomach pain asthma bronchitis ulcers diarrhea flu and cough However phytochemicals and antimicrobial studies are still scarce The objective of this study was to evaluate the antimicrobial activity of different extracts of the stem bark of Hymenaea stigonocarpa by determining the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal perform the phytochemical and botanical characterization by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography to determine the efficiency and concentrations of secondary metabolites responsible for its activity and its activity against various Candida species In addition part of this study was to evaluate the interaction between the alcoholic extract of Hymenaea stigonocarpa and antimicrobials of different chemical classes the determination of ultrastructural changes resulting from the action of this extract in combination as well as the physicochemical characterization of the stem bark after collection drying and grinding This study also evaluated the influence of the extraction method on the following variables dry antibacteriana activity and concentration of tannins Staphylococcus aureus was found to be the most sensitive microorganism action of the extracts Strong activity fronts the species Candida krusei and Candida glabrata and moderate activity against gram-negative bacteria was also observed The ultrastructural analysis of this microorganism showed changes in the cell wall and the cytoplasm resulting from the action of the alcoholic extract Combination with antimicrobial agents resulted in most cases a synergistic effect in reversing the multidrug resistance of some strains of methicillin resistant Staphylococcus aureus The extraction methods did not influence the final concentration of tannins as well as antibacterial activity However there were differences in dry matter which is the variable used to classify the dynamic maceration as the most effective method As the flavonoids present after fractionation and analysis coupled with mass spectrometry ultra strong evidence fast performance liquid chromatography indicated the presence of engeletina taxifolina astilbin and a diastereomer of astilbin Thus we conclude that the hydroalcoholic extract of the stem bark of Hymenaea stigonocarpa has antimicrobial activity being more active against Staphylococcus aureus as well as strains of Candida krusei and Candida glabrata The most efficient way of extracting the dynamic is mashing and extracts association with antibiotics reference leads to potentiation of the effect of these Keywords Hymenaea Staphylococcus Synergism Tannins Ultrastructure

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SUMAacuteRIO

1 APRESENTACcedilAtildeO 2 O GEcircNERO Hymenaea ASPECTOS BOTAcircNICOS QUIacuteMICOS E FARMACOLOacuteGICOS 21 INTRODUCcedilAtildeO 211 Classificaccedilatildeo 2112 Famiacutelia Leguminosae 22 ASPECTOS BOTAcircNICOS DO GEcircNERO Hymenaea 221 Distribuiccedilatildeo do gecircnero Hymenaea 222 Estudos taxonocircmicos 223 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegia 224 Desenvolvimento das espeacutecies 225 Descriccedilatildeo botacircnica da espeacutecie Hymenaea stigonocarpa 23 ASPECTOS QUIacuteMICOS DAS ESPEacuteCIES DO gecircnero Hymenaea 231 Terpenos identificados no gecircnero Hymenaea 2111 Hymenaea courbaril 23111 Terpenos identificados na resina do tronco 23112 terpenos identificados nas resinas das folhas 23113 terpenos identificados na resina dos frutos 23114 terpenos identificados nas folhas 23115 terpenos identificados nas cascas dos frutos 23116 substacircncias isoladas das sementes 2312 Hymenaea oblongifolia 2313 Hymenaea verrucosa 2314 Hymenaea stigonocarpa 23141 terpenos identificados nas sementes 23142 terpenos identificados nas folhas 23143 terpenos identificados no epicarpo 23144 terpenos identificados na resina do tronco 23145 terpenos identificados no alburno 232 flavonoacuteides identificados no gecircnero Hymenaea 2321 Hymenaea parvifolia 2322 Hymenaea palustres 2323 Hymenaea courbaril 2324 Hymenaea stigonocarpa 23241 flavonoacuteides identificados na casca do caule 23242 flavonoacuteides identificados no alburno 233 cumarinas identificadas no gecircnero Hymenaea 2331 Hymenaea courbaril 234 taninos relatados no gecircnero Hymenaea 2341 Hymenaea courbaril 2342 Hymenaea stigonocarpa 24 ASPECTOS FARMACOLOacuteGICOS DOS EXTRATOS OBTIDOS A PARTIR DE DIFERENTES ESPEacuteCIES DO GEcircNERO Hymenaea 241 Estudos etnofarmacologicos

20 22 22 22 23 23 24 25 25 26 27 31 31 31 32 33 34 35 37 37 38 38 38 38 39 39 41 41 41 42 42 43 43 43 44 44 44 45 45 45 45 45

16

2411 Hymenaea courbaril 2412 Hymenaea stigonocarpa 2413 Hymenaea parvifolia 242 Avaliaccedilatildeo farmacoloacutegica 2421 Hymenaea courbaril 2422 Hymenaea stigonocarpa 2423 Hymenaea martiana 2424 Hymenaea parvifolia REFEREcircNCIAS 3 CARACTERIZACcedilAtildeO BOTAcircNICA FITOQUIacuteMICA E AVALIACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS E FRACcedilOtildeES DA CASCA DO CAULE DE Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne 31 INTRODUCcedilAtildeO 32 OBJETIVOS 321 Objetivo geral 322 Objetivos especiacuteficos 33 MATERIAIS E MEacuteTODOS 331 Coleta do material vegetal 332 Caracterizaccedilatildeo botacircnica do material vegetal 3321 Anaacutelise microscoacutepica 3322 Anaacutelise histoquiacutemica 333 Caracterizaccedilatildeo fitoquiacutemica do material vegetal 334 Quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis e taninos totais 3341 Quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis totais 3342 Determinaccedilatildeo de taninos totais 3343 Analise por cromatografia liquida de alta eficiecircncia (CLAE) 335 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana 3351 Preparaccedilatildeo das amostras 3352 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana in vitro 33521 Agentes antimicrobianos 33522 Micro-organismos e padronizaccedilatildeo dos inoacuteculos 33523 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo bactericida miacutenima (CMB) 336 anaacutelise ultraestrutural 337 anaacutelise estatiacutestica 34 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 341 Caracterizaccedilatildeo botacircnica do material vegetal 341 Anatomia 3412 Histoquiacutemica 34121 Avaliaccedilatildeo de Polifenoacuteis 34122 Detecccedilatildeo da presenccedila de taninos 341221 Caules jovens 341222 Caules adultos 342 Caracterizaccedilatildeo fitoquiacutemica do material vegetal

45 46 47 47 47 49 51 52 53 63 63 68 68 68 69 69 69 70 70 70 73 73 73 74 74 74 75 75 75 76 77 78 79 79 79 81 81 82 82 82 83

17

3421 Anaacutelise fitoquiacutemica 34211 Monoterpenos e sesquiterpenos 34212 Triterpenos e esteroacuteides 34213 Flavonoacuteides e cumarinas 34214 Accedilucares 34215 Taninos condensados e hidrolisaacuteveis 34216 Flavonoacuteides apoacutes particcedilatildeo 34217 Taninos condensados apoacutes particcedilatildeo 343 Quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis e taninos totais 3431 Determinaccedilatildeo da Curva de calibraccedilatildeo do aacutecido gaacutelico 3442 Determinaccedilatildeo do teor de polifenoacuteis e taninos totais 344 Anaacutelise por cromatografia liquida de alta eficiecircncia (CLAE-DAD) 345 Atividade antibacteriana 346 Alteraccedilotildees ultraestruturais 35 CONCLUSOtildeES REFEREcircNCIAS 4 ASSOCIACcedilAtildeO DO EXTRATO HIDROALCOOacuteLICO DA CASCA DO CAULE DE HYMENAEA STIGONOCARPA MART EX HAYNE COM AGENTES ANTIMICROBIANOS FRENTE A CEPAS DE Staphylococcus aureus RESISTENTES A METICILINA (MRSA) 41 INTRODUCcedilAtildeO 411 A evoluccedilatildeo da resistecircncia de staphylococcus aureus a agentes antimicrobianos 4111 Staphylococcus aureus resistentes a meticilina 412 Associaccedilotildees entre polifenois e agentes antimicrobianos 42 OBJETIVOS 421 Objetivo geral 422 Objetivos especiacuteficos 43 MATERIAIS E MEacuteTODOS 431 Material vegetal 432 Procedimentos extrativos 433 Determinaccedilatildeo da atividade anti- estafilocoacutecica in vitro 4331 Agentes antimicrobianos 4332 Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees 4333 Micro-organismos 4334 Preparaccedilatildeo do inoacuteculo 4335 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo bactericida miacutenima (CMB) 4336 Avaliaccedilatildeo in vitro da interaccedilatildeo entre o extrato hidroalcooacutelico de Hymeneae stigonocarpa com agentes antimicrobianos 434 Microscopia eletrocircnica de transmissatildeo 44 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 45 CONCLUSOtildeES

84 84 85 86 87 87 90 91 92 92 92 93 95 99 102 103 111 111 112 114 115 116 116 116 117 117 117 117 118 119 119 119 119 120 122 123 132

18

REFEREcircNCIAS 5 O EFEITO DE DIFERENTES MEacuteTODOS DE EXTRACcedilAtildeO SOBRE O RENDIMENTO CONCENTRACcedilOtildeES DE FENOacuteIS TOTAIS E ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA CASCA DO CAULE DE Hymenaea stigonocarpa 51 INTRODUCcedilAtildeO 52 OBJETIVOS 521 Objetivo geral 522 Objetivos especiacuteficos 53 MATERIAIS E MEacuteTODOS 531 Coleta 532 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do material vegetal 5321 Anaacutelise granulomeacutetrica por tamisaccedilatildeo 5322 Determinaccedilatildeo da perda por dessecaccedilatildeo 5323 Determinaccedilatildeo do teor de extrativos 5324 Determinaccedilatildeo de cinzas totais 533 Procedimentos extrativos 534 Descriccedilatildeo das teacutecnicas extrativas 5341 Maceraccedilatildeo 5342 Maceraccedilatildeo dinacircmica 5343 Utrassom 5344 Refluxo 5345 Turbo-extraccedilatildeo 5346 Infusatildeo 535 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica 536 Anaacutelises quantitativa de polifenois 5361 Determinaccedilatildeo de polifenoacuteis totais 53611 Desenho fatorial 32 53612 Preparaccedilatildeo da Soluccedilatildeo Padratildeo 5362 Determinaccedilatildeo de taninos totais 5363 Determinaccedilatildeo de flavonoides 53631 Anaacutelise por cromatografia liquida e alta eficiecircncia acoplada a detector de arranjo de Diodos (CLAE-DAD) 537 Determinaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de H stigonocarpa Mart ex Hayne 5371 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana 53711 Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de H stigonocarpa 53712 Micro-organismos 53713 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo bactericida miacutenima (CMB) 5372 Determinaccedilatildeo da atividade antifungica 53721 Cepas e condiccedilotildees de cultivo 53722 Susceptibilidade antifuacutengica in vitro 538 Anaacutelise estatiacutestica 54 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

133 139 139 142 142 142 143 143 143 143 144 144 145 145 145 145 146 146 146 146 146 147 147 147 147 148 148 149 149 150 150 150 150 150 151 151 152 152 153

19

541 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do material vegetal 542 Determinaccedilatildeo do rendimento 543 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica por cromatografia de camada delgada 544 Anaacutelise quantitativa dos compostos majoritaacuterios 5441 Determinaccedilatildeo do meacutetodo de doseamento de polifenoacuteis totais por espectofotometria apoacutes avaliaccedilatildeo das variaveis analiacuteticas 5442 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de polifenois totais taninos e flavonoides 545 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana de H stigonocarpa Mart ex Hayne 546 Determinaccedilatildeo da atividade antifungica de H stigonocarpa Mart ex Hayne 55 CONCLUSOtildeES REFEREcircNCIAS 6 IDENTIFICACcedilAtildeO DO FLAVONOacuteIDES PRESENTES NA FRACcedilAtildeO ACETATO DE ETILA DA CASCA DO CAULE DE Hymenaea stigonocarpa 61 INTRODUCcedilAtildeO 62 OBJETIVOS 621 objetivo geral 622 objetivos especiacutefico 63 MATERIAIS E MEacuteTODOS 631 Amostras 632 Solventes empregados 633 Sistema cromatografia liquida ultrarraacutepida acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrocircmetro de massas (UFLC-DAD-EM) 634 Anaacutelise por UFLC-DAD-EM 6341 Identificaccedilatildeo dos flavonoacuteides 64 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 65 CONCLUSOtildeES REFERENCIAS

153 156 160 160 164 164 168 170 173 174 179 179 182 182 182 183 183 183 183 184 184 186 194 195

20

1 APRESENTACcedilAtildeO

Os antibioacuteticos satildeo uma das mais importantes armas no combate agraves

infecccedilotildees bacterianas No entanto ao longo das uacuteltimas deacutecadas seus benefiacutecios agrave

sauacutede estatildeo sob ameaccedila pois muitos antibioacuteticos tornaram-se cada vez menos

eficazes devido ao aparecimento de bacteacuterias resistentes (RAKHOLIYA et al 2012)

A crescente resistecircncia bacteriana principalmente associada a utilizaccedilatildeo

extensiva de agentes antimicrobianos pode resultar na existecircncia de um arsenal de

substacircncias ineficazes para combater infecccedilotildees bacterianas (HOERLLE

BRANDELLI 2009)

Devido a raacutepida disseminaccedilatildeo dos micro-organismos multidrogas resistentes

haacute uma consideraacutevel necessidade por novos agentes antimicrobianos (GIBBONS et

al 2002) tendo sido muitas plantas avaliadas natildeo somente pela atividade

antimicrobiana direta mas tambeacutem pela modificaccedilatildeo do perfil de resistecircncia ao

agente antimicrobiano (GIBBONS 2004 HEMAISWARYA et al 2008 WAGNER

ULRICH-MERZENICH 2009)

Os principais grupos de compostos com propriedades antimicrobianas

extraiacutedos de plantas incluem terpenoacuteides (TORSSEL 1989) alcaloides

(FESSENDEN 1982) polipeptiacutedios (TERRAS et al1993 ZHANG LEWIS 1997) e

substacircncias fenoacutelicas que satildeo fenoacuteis simples aacutecidos fenoacutelicos quinonas (STERN

et al 1996) flavonas flavonoacuteis e flavonoacuteides (FESSENDEN 1982) tanino

(SCALBERT 1992) e cumarinas (OrsquoKENNEDY amp THORNES 1997)

Esses metaboacutelitos secundaacuterios satildeo considerados uma fonte promissora para

a terapia antimicrobiana seja ela combinada ou natildeo podendo atuar em pontos

especiacuteficos da ceacutelula procarioacutetica e potencializar o efeito de antimicrobianos

sinteacuteticos (CHOVANOVAacute et al 2013)

Dentro deste contexto detacamos a espeacutecie Hymenaea stigonocarpa

popularmente conhecido como jatobaacute-do-cerrado Estudos fitoquiacutemicos de

Hymenaea stigonocarpa mostraram a presenccedila de terpenos e sesquiterpenos

aacutecidos graxos flavonoacuteides e taninos metaboacutelitos reconhecidos pela atividade

bioloacutegica (LANGENHEIM HALL 1983 MATUDA NETO 1985 ORSI et al 2012)

Alguns estudos etnofarmacoloacutegicos atribuem a esta espeacutecie algumas

atividades tais como fortificante anti-inflamatoacuteria e antimicrobiana (RODRIGUES

CARVALHO 2001 VILA VERDE et al 2003 SOUZA FELFILI 2006) Existindo

21

tambeacutem alguns estudos farmacoloacutegicos jaacute realizados comprovando os efeitos

citotoacutexicos antiinfamatoacuterios e antioxidantes (GUIMARAtildeES et al 2009 BRASIL et

al 2009 ORSI et al 2012 MARANHAtildeO et al 2013)

No entanto estudos sobre a atividade antimicrobiana desta espeacutecie ainda satildeo

escassos (DIMECH 2013) devido a isso este estudo teve o objetivo de avaliar a

atividade antibacteriana da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa Mart ex

Hayne (Jatobaacute) frente agraves principais espeacutecies de bacteacuterias comumente causadoras

de infecccedilotildees nosocomiais Para isto esta tese foi dividida em cinco capiacutetulos

O primeiro reuacutene informaccedilotildees dos aspectos botacircnicos quiacutemicos e

farmacoloacutegicos do gecircnero Hymenaea avaliaccedilotildees que colaboram para um maior

entendimento da espeacutecie estudada

Em seguida foi realizada a caracterizaccedilatildeo botacircnica e fitoquiacutemica da casca do

caule de Hymenaea stigonocarpa como tambeacutem a determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees

dos metaboacutelitos responsaacuteveis pela atividade antibacteriana e avaliaccedilatildeo por

cromatografia liquida de alta eficiecircncia dos extratos mais ativos

Ainda neste capiacutetulo foi determinada a espeacutecie mais suscetiacutevel aos extratos

avaliados e a classe de metaboacutelitos mais ativa baseada na avaliaccedilatildeo das

concentraccedilotildees inibitoacuterias e bactericidas miacutenimas e da analise das alteraccedilotildees

ultraestruturais atraveacutes de microscopia eletrocircnica de transmissatildeo

Apoacutes a determinaccedilatildeo da espeacutecie mais suscetiacutevel e do extrato mais ativo

foram avaliadas as associaccedilotildees do extrato hidroalcooacutelico com agentes

antimicrobianos pertencentes a diferentes classes farmacoloacutegicas utilizadas na

rotina meacutedica Essa associaccedilatildeo visa agrave identificaccedilatildeo de possiacuteveis accedilotildees sineacutergicas

que poderiam levar tanto a reversatildeo da resistecircncia presente em algumas cepas

como a dimuiccedilatildeo da toxicidade dos agentes antimicrobianos pela utilizaccedilatildeo de

doses reduzidas

No quarto capiacutetulo foi avaliada a influecircncia de diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo

sobre a variaccedilatildeo do rendimento e do teor dos compostos majoritaacuterios do extrato

hidroalcooacutelico da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa variaccedilotildees que

poderiam influenciar na atividade antibacteriana Aleacutem disso foi realizada uma

otimizaccedilatildeo do meacutetodo de doseamento dos taninos classe de metaboacutelitos mais

ativos quanto a accedilatildeo antibacteriana nesta espeacutecie

Concluindo foram identificados os flavonoacuteides presente na fraccedilatildeo acetato de

etila sendo sugerida a presenccedila de quatro flavonoacuteides

22

2 O GEcircNERO Hymenaea ASPECTOS BOTAcircNICOS QUIacuteMICOS E

FARMACOLOacuteGICOS

21 INTRODUCcedilAtildeO

As espeacutecies pertencentes ao gecircnero Hymenaea satildeo fornecedores de boa

madeira frutos comestiacuteveis e cascas taniacuteferas (RIZZINI 1971) As resinas de cor

amarela e avermelhada produzidas pelas aacutervores do gecircnero Hymenaea L satildeo

produtos economicamente valiosos Podem ser usadas em esculturas na fabricaccedilatildeo

de joacuteias (iacutendios preacute-colombianos jaacute utilizavam para estes fins) como cimento

incenso e ateacute quando dissolvidas em xilol no preparo de lacircminas permanentes para

microscopia (LEE amp LANGENHEIM 1975)

Conhecidas como copal sul americano satildeo utilizadas na fabricaccedilatildeo de

vernizes e com fins medicinais (LANGENHEIM et al 1973) A extraccedilatildeo ocorre por

meio do processo de sangria do tronco ou por escavaccedilatildeo do solo onde a resina se

acumula Neste gecircnero a resina pode converter-se em acircmbar sendo encontradas

resinas foacutesseis na Colocircmbia Meacutexico e Brasil (CASTELENN 2005)

211 Classificaccedilatildeo

De acordo com o Sistema de Classificaccedilatildeo de Cronquist (1988) a posiccedilatildeo

taxonocircmica do gecircnero Hymenaea obedece agrave seguinte hierarquia Divisatildeo

Magnoliophyta - cujas sementes satildeo protegidas por uma estrutura denominada fruto

Angiospermae - do grego angos - urna e sperma - semente Classe

Magnoliopsida (Dicotyledonae) - plantas com flor cujo embriatildeo (semente) conteacutem

dois ou mais cotileacutedones Subclasse Rosidae Ordem Fabales - Famiacutelia

Leguminosae - caracteriacutestica tiacutepica dessa famiacutelia eacute a ocorrecircncia do fruto do tipo

legume tambeacutem conhecido como vagem exclusivo desse grupo Subfamiacutelia

Caesalpinioideae Gecircnero Hymenaea (CARVALHO 2007)

23

2112 Famiacutelia Leguminosae

A famiacutelia Leguminosae compreende 650 gecircneros e mais de 18 mil espeacutecies

mundialmente distribuiacutedas (POLHILL RAVEN 1981) representando uma das

maiores famiacutelias de angiospermas superada apenas em nuacutemero de espeacutecies pelas

famiacutelias Orchidaceae e Asteraceae (JOLY 1998) Esta famiacutelia eacute uma das mais ricas

na flora brasileira encontrando-se representada nas vaacuterias formaccedilotildees

fitogeograacuteficas do paiacutes (RIZZINI 1971)

No bioma cerrado esta eacute a famiacutelia botacircnica que comporta o maior nuacutemero de

espeacutecies e a primeira entre as mais importantes em termos de nuacutemeros de espeacutecies

lenhosas arbustos e aacutervores (SILVA et al 2001) A famiacutelia Leguminosae se

subdivide em trecircs subfamiacutelias Mimosaceae que compreende cerca de 60 gecircneros e

3000 espeacutecies sendo a menor dentre as leguminosas Caesalpiniaceae com cerca

de 150 gecircneros e 2800 espeacutecies Fabaceae maior subfamiacutelia das leguminosas com

aproximadamente 482 gecircneros e 12000 espeacutecies (JOLY 1998 BARROSO 2002)

As plantas leguminosas apresentam um grande potencial na conservaccedilatildeo de solos

pois juntamente com a microbiota do solo fixam o nitrogecircnio atmosfeacuterico atraveacutes do

processo de nodulaccedilatildeo em suas raiacutezes (POLHILL RAVEN 1981) Aleacutem disso as

leguminosas tecircm um potencial econocircmico muito grande pois satildeo fornecedores de

alimentos atraveacutes de seus frutos medicamentos ou substacircncias medicinais

pesticidas combustiacuteveis e produtos utilizados nas induacutestrias (SCHWANTES

WEBERLING 1981)

22 ASPECTOS BOTAcircNICOS DO GEcircNERO Hymenaea

A palavra Hymenaea deriva do grego Hymenrdquo e significa deus das uniotildees

em alusatildeo agraves duas folhas (foliacuteolos) unidas caracteriacutestica das plantas deste gecircnero

O nome popular jatobaacute vem da liacutengua tupi va-atatilde-yba que significa ldquoaacutervore de fruto

durordquo (BARROSO 1991)

Ceratia foi o primeiro nome dado ao gecircnero Hymenaea descrito por Bauhin

em 1623 duas deacutecadas mais tarde PISO (1642) e MARCGRAF (1648) descreveram

o gecircnero com o nome de Jaetaiacuteba (apud LEE LANGENHEIM 1975) Meio seacuteculo

depois ainda PLUMIER (1703) (apud LEE LANGENHEIM 1975) escolheu o nome

Courbaril para esse gecircnero Apenas em 1737 Linnaeus ao se referir ao mesmo

24

gecircnero escolheu o nome Hymenaea referecircncia ao deus grego Himeneu fazendo

alusatildeo aos dois foliacuteolos pareados das folhas Muitas outras espeacutecies desse gecircnero

seriam descritas mais tarde por outros botacircnicos por exemplo HAYNE BENTHAM

HUBER DUCKE LEE e LANGENHEIM (MORENO 2009)

221 Distribuiccedilatildeo do gecircnero Hymenaea

Aproximadamente 25 espeacutecies do gecircnero Hymenaea tecircm sido descritas na

literatura como originadas do continente americano Na maioria das espeacutecies a

madeira eacute de alto valor comercial (MARTIN et al 1972) Este gecircnero eacute considerado

predominantemente neotropical com 16 espeacutecies distribuiacutedas desde o Meacutexico ateacute a

Ameacuterica do Sul

No Brasil ocorrem 13 espeacutecies (KODAMA SARTORI 2007) tanto em matas

pluviais como em matas secas tambeacutem no Meacutexico Ameacuterica Central Iacutendias

Ocidentais e quase todos os paiacuteses da Ameacuterica do Sul (CORREcircA 1984 RIZZINI

1985) sendo conhecido popularmente como jatobaacute jutaiacute ou jataiacute (LEE

LANGENHEIM 1975)

As espeacutecies mais frequentes no Brasil satildeo Hymenaea stigonocarpa Mart ex

Hayne e Hymenaea courbaril L A Hymenaea courbaril podendo ser encontrada

desde a floresta amazocircnica ateacute a floresta estacional semidecidual no sudeste do

paiacutes sob a forma de diferentes variedades (CASTELEN 2005) Jaacute a Hymenaea

stigonocarpa Mart Ex Hayne tambeacutem conhecida como jatobaacute-do-cerrado jutaiacute

jatobaacute-capo jatobaacute-de-casca-fina jitaiacute ou jutaicica ocorre na Caatinga e no Cerrado

principalmente nos estados do Piauiacute Bahia Goiaacutes Minas Gerais Mato Grosso do

Sul e Satildeo Paulo (CORREcircA 1984 LORENZI 1992)

Todas as espeacutecies deste gecircnero tecircm haacutebito arboacutereo que vatildeo desde aacutervores

com 3 metros de altura como H stigonocarpa ateacute representantes com mais de 40

metros vegetando em mata atlacircntica como H courbaril Ocorrem em uma

diversidade de habitats variando desde a mata equatorial ateacute o cerrado e a

caatinga (LEE LANGENHEIM 1975)

25

222 Estudos taxonocircmicos

Devido a denominaccedilotildees diferentes (Hymenaea e Trachylobium) houve

controveacutersias quanto agrave taxonomia inicial do gecircnero Hymenaea Lee e Langenheim

(1975) realizaram uma pesquisa comparando detalhadamente a morfologia citologia

e a quiacutemica da resina de exemplares catalogados nestes dois gecircneros e optaram

pela denominaccedilatildeo taxonocircmica Hymenaea

Poreacutem ainda satildeo necessaacuterias revisotildees taxonocircmicas para agregar categorias

infraespeciacuteficas pautadas em caracteriacutesticas morfoloacutegicas inconsistentes Como

exemplo desta falta de especificidade tem-se H stigonocarpa Hayne var

brevipetiolata N Mattos que pode ser diferenciada de sua variedade tiacutepica por

apresentar foliacuteolos relativamente menores pubescentes na face adaxial e

densamente tomentosos na face abaxial e peciacuteolos curtos e densamente

tomentosos (LEE LANGENHEIM 1975)

O estudo morfoloacutegico de placircntulas pode subsidiar os procedimentos

taxonocircmicos pois fornece numerosas caracteriacutesticas que devem contribuir com a

melhor delimitaccedilatildeo das espeacutecies Aleacutem disso pode favorecer o reconhecimento de

estruturas transitoacuterias as quais desaparecem com o desenvolvimento da planta

mas que podem ser importantes no estabelecimento das relaccedilotildees filogeneacuteticas

Tambeacutem o manejo a conservaccedilatildeo e a reconstituiccedilatildeo de florestas tropicais satildeo

beneficiados com os estudos de morfologia de placircntulas que possibilitam a

identificaccedilatildeo dos taacutexons em suas fases juvenis (FLORES BENEVIDES 1990

FERREIRA 1997)

223 Avaliaccedilatildeo morfoloacutegia

Estudos da morfologia de placircntulas em Hymenaea realizados por Flores e

Benevides (1990) e Ferreira (1997) contribuiacuteram com as descriccedilotildees de semente

germinaccedilatildeo e placircntulas para H courbaril L e H stigonocarpa Mart ex Hayne

respectivamente Poreacutem esses autores natildeo estabeleceram o valor diagnoacutestico dos

caracteres morfoloacutegicos das placircntulas de Hymenaea (KODAMA SARTORI 2007)

Segundo De Carvalho et al (2005) conhecer a biometria de frutos eacute

importante para acrescentar dados morfoloacutegicos agrave espeacutecie e suas variaccedilotildees em

diferentes locais podem ser encaradas como resultado de seleccedilatildeo e adaptaccedilatildeo das

26

espeacutecies em resposta as pressotildees do ambiente em que vivem Para Vieira e

Gusmatildeo (2008) a biometria de frutos e sementes eacute importante para a identificaccedilatildeo

da variabilidade existente nas espeacutecies nativas podendo com isso segundo Cruz et

al (2001) fornecer subsiacutedios importantes para a diferenciaccedilatildeo de espeacutecies do

mesmo gecircnero

De Carvalho et al (2005) estudaram a biometria dos frutos de jatobaacute-do-

cerrado (Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne) e observaram que os frutos

apresentaram 5 a 6 sementes em meacutedia O comprimento a largura e o peso de

frutos variaram de 5 a 17 cm 30 a 67 cm e 1995 a 11006 g respectivamente

224 Desenvolvimento das espeacutecies de Hymenaea

Quanto ao desenvolvimento inicial de placircntulas alguns estudos foram

realizados com o objetivo de avaliar o desenvolvimento inicial dessa espeacutecie em

diferentes condiccedilotildees de sombreamento em viveiro Foi observado que a espeacutecie H

courbaril var stilbocarpa (Hayne) Lee amp Lang de ocorrecircncia em Matas de Galeria

apresenta aos 21 meses de idade grande plasticidade de crescimento quanto a

diferentes niacuteveis de sombreamento podendo ser utilizada na recuperaccedilatildeo dessas

matas de Galeria desde condiccedilotildees de bordas e clareiras ateacute o fechamento de dossel

(MAZZEI et al 1999)

Outra espeacutecie tambeacutem avaliada eacute H stigonocarpa que apresenta uma menor

plasticidade se comparada a espeacutecie H courbaril var stilbocarpa (Hayne) Lee amp

Lang uma vez que mostra tendecircncia de crescimento mais eficiente sob condiccedilotildees

de maior luminosidade o que coincide com a ocorrecircncia da espeacutecie em ambientes

naturais mais abertos como o cerrado (MENDONCcedilA et al 1998) Esta espeacutecie

apresenta portanto potencial para plantios a pleno sol podendo ser utilizada em

locais onde a vegetaccedilatildeo de cerrado foi removida (RAMOS et al 2004)

Ao avaliar o stress hiacutedrico a que diferentes indiviacuteduos de Hymeneae satildeo

submetidos Locosselli (2010) observou que a espeacutecie H courbaril suporta estoque

limitado de aacutegua do solo apesar destra espeacutecie apresentar raiacutezes natildeo tatildeo

profundas sendo este estresse contornado pela presenccedila de estocircmatos menores e

de raacutepido controle de abertura e fechamento

Outra espeacutecie H stignocarpa apresenta outro tipo de stress hiacutedrico por

ocorrer em regiotildees de maior irradiaccedilatildeo solar e em ambientes mais abertos

27

apresentando uma maior taxa de perda por transpiraccedilatildeo o que eacute contornado pela

existecircncia de estocircmatos maiores e de menor controle (LOCOSSELLI 2010) Aleacutem

disso foi avaliado por Gomes et al (2013) que a manifestaccedilatildeo dos eventos

reprodutivos nesta espeacutecie ocorrem em funccedilatildeo da estaccedilotildees do ano com frutificaccedilatildeo

no periacuteodo seco e floraccedilatildeo no final do periacuteodo seco e inicio do chuvoso

225 A descriccedilatildeo botacircnica da espeacutecie Hymenaea stigonocarpa

A espeacutecie avaliada no presente estudo foi Hymenaea stigonocarpa Mart ex

Hayne (Jatobaacute) pertencente ao gecircnero Hymenaea esta planta foi selecionada pois

em outras espeacutecies deste gecircnero foram isoladas vaacuterias substacircncias que

apresentaram importantes atividades farmacoloacutegicas comprovadas Aleacutem disso foi

observada uma vasta utilizaccedilatildeo popular dessa espeacutecie (SOUZA FELFILI 2006

NETO G G 2006 VILA VERDE et al 2003 RODRIGUES CARVALHO 2001)

Hymenaea stigonocarpa eacute uma aacutervore deciacutedua As aacutervores maiores atingem

dimensotildees proacuteximas de 20 m de altura e 50 cm de DAP (diacircmetro agrave altura do peito

medido a 130 m do solo) na idade adulta apresenta tronco tortuoso com fuste

curto ramificaccedilatildeo dicotocircmica e a copa baixa (Figura 1)

Figura 1 - Aacutervore Hymenaea stigonocarpa com cerca de 20

metros de altura

Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio -

Camocim de Satildeo Feacutelix ndash PE

A casca mede ateacute 3 cm de espessura sendo a superfiacutecie da casca externa

ou ritidoma profundamente sulcada de coloraccedilatildeo pardo-avermelhada com cristas

planas e duras e a casca interna apresenta-se estratificada com listras paralelas

mais claras e escuras (Figura 2)

28

Figura 2 - Casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa Mart ex Hayne

Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio - Camocim de Satildeo Feacutelix ndash PE

As folhas satildeo alternas compostas bifolioladas pecioladas com estiacutepulas

caducas foliacuteolos curtos peciolulados e subseacutesseis limbo com 6 cm a 235 cm de

comprimento e 35 cm a 7 cm de largura eliacuteptico a ovado-reniforme de

pergaminoso a coriaacuteceo (Figura 3) frequumlentemente com pontuaccedilotildees transluacutecidas

(CARVALHO 2007)

Figura 3 - Folhas de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne

Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio - Camocim de Satildeo Feacutelix ndash PEmiddot

A Inflorescecircncia apresenta-se em cimeiro terminal bracteada com ateacute 30

flores que satildeo grandes com peacutetalas pouco excedentes ao caacutelice (Figura 4)

29

Figura 4 - Inflorescecircncia do jatobaacute do cerrado (Hymenaea stigonocarpa Martex

Hayne)

Fonte httpwwwportalsaofranciscocombralfajatobajatoba-3php

O fruto eacute um legume seco indeiscente monospeacutermico ou polispeacutermico (mais

comum) alongado aacutepice arredondado ou levemente retuso base arredondada e

margem inteira ou levemente ondulada medindo 87 cm a 20 cm de comprimento

21 cm a 65 cm de largura e 20 cm a 43 cm de espessura (Figura 5)

Figura 5 - Vista frontal do fruto de Hymenaea


ls ndash linha de sutura pd ndash peduacutenculo Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio -


A textura eacute rugosa devido agrave presenccedila de pontuaccedilotildees pequenas salientes e

arredondadas (Figura 6) Apresenta a linha de sutura proeminente circundando todo

ls

pd

30

o fruto a cor varia do marrom-claro ao marrom-escuro (quase negro) Em cada fruto

ocorrem de uma a seis sementes

Figura 6 - Seccedilatildeo longitudinal do fruto de Hymenaea


en - endocarpo ep - epicarpo me ndash mesocarpo Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio - Camocim de Satildeo Feacutelix ndash PE


ar - arilo cv - cavidade do fruto en - endocarpo ep - epicarpo me - mesocarpo ls ndash linha de sutura Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio - Camocim de Satildeo Feacutelix ndash PE

A Semente eacute globosa largo-oblonga obovada comprimida com aacutepice

arredondado ou levemente truncado e base arredondada ou afinada superfiacutecie

irregular com algumas depressotildees medindo 178 mm a 284 mm de comprimento e

93 mm a 197 mm de espessura Envolvendo as sementes haacute o arilo amarelo-

esverdeado macio fibroso-farinaacuteceo (Figura 7 e 8) com cheiro caracteriacutestico e

sabor doce constituindo a polpa (CARVALHO 2007)

cv ar

en

me ep

ls

en

mmee

ep

31

Figura 8 - Aspectos da semente de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne

A semente envolvida por arilo B Semente sem arilo Fonte Dimech GS Fazenda refuacutegio - Camocim de Satildeo Feacutelix ndash PE

23 ESTUDOS QUIacuteMICOS NAS ESPEacuteCIES DO gecircnero Hymenaea

Das espeacutecies de Hymenaea jaacute estudadas verifica-se que entre as classes de

compostos isoladas predominam os terpenoacuteides e flavonoacuteides Os flavonoacuteides

destacam-se como fitoalexinas que atuam na defesa das plantas (INGHAM 1982)

As espeacutecies do gecircnero Hymenaea tem predominacircncia de diterpenoacuteides baseados

nos esqueletos do labdano abietano e pimarano (FARIA et al 2004) sendo

diterpenos biciacuteclicos jaacute isolados de espeacutecies de Hymenaea como H verrucosa H

oblongifolia e H parvifolia

231 Terpenos identificados no gecircnero Hymenaea

Foram identificados terpenos em diferentes espeacutecies do gecircnero Hymenaea

2311 Hymenaea courbaril

Do gecircnero Hymenaea a espeacutecie H courbaril eacute a espeacutecie mais estudada

(NAKANO DJERASSI 1961) e a mais difundida (LANGENHEIM et al1973)

A B

32

23111 Terpenos identificados na resina do tronco

A investigaccedilatildeo da resina comercial da Hymenaea courbaril realizada por

Nakano e Djerassi (1961) levou ao isolamento de um composto diterpecircnico oleoso

denominado aacutecido copaacutelico (Figura 9)

Figura 9 - Aacutecido copaacutelico isolado da resina de H courbaril

COOH

A partir da resina do tronco da Hymenaea courbaril coletada na regiatildeo

amazocircnica analisada por Langenheim et al (1973) foi isolado e identificado apoacutes

metilaccedilatildeo com diazometano um composto diterpecircnico o labd-13-em-ol 15-oato de

metila (Figura 10)

Figura 10 - terpeno labd-13-em-ol 15-oato de metila isolado de H courbaril

H

HCOOH

OH

Na avaliaccedilatildeo da resina do tronco da Hymenaea courbaril coletada na regiatildeo

de Campinas (Satildeo Paulo) em 1975 Marsaioli et al isolaram os seguintes

compostos aacutecido eperua-7 13-dien-15-oico (1) aacutecido ent-labd-13-em-8beta-ol-15-

oico (2) e um composto na forma de eacutester metiacutelico apoacutes tratamento com

diazometano o ent-labdan-8beta-ol 15-oato de metila (3) (Figura 11)

13

33


23112 Terpenos identificados nas resinas das folhas

Tambeacutem em 1972 Langenheim estudando agora as resinas encontradas nas

folhas da Hymenaea courbaril constatou a presenccedila de vaacuterios compostos

sesquiterpecircnicos Foram identificados nove compostos onde o principal constituinte

foi o cariofileno (266) (1) seguido por β-selineno (184) (2) e α-selineno (176)

(3) (Figura 12)

Figura 12 - Principais constituintes das resinas encontradas nas folhas da

Hymenaea courbaril cariofileno (1) β-selineno (2) e α-selineno (3)

Os demais compostos encontrados em menor escala foram alfa-cubebeno

(1) (08) α-copaeno (2) (94) beta-copaeno (3) (57) alfa e beta-hemuleno (4a

e 4b) (57) γ-muroleno (5) (35) e delta-cadineno (6) (66) e mais um composto

natildeo identificado (34) que atraveacutes do tempo de retenccedilatildeo foi sugerido ser

copacanfeno (7) (Figura 13)

1 2 3

H H

H

COOHOH

COOMeOH

COOMe

13

1 2 3

13

15

7

15 8 15 8

aacutecido eperua-7 13-

dien-15-oico

aacutecido ent-labd-13-em-

8beta-ol-15-oico ent-labdan-8beta-ol 15-oato

de metila

34

Figura 13 ndash Constituintes encontrados em menor escala das resinas das folhas da

Hymenaea courbaril alfa-cubebeno (1) α-copaeno (2) beta-copaeno (3) alfa e

beta-hemuleno (4a e 4b) γ-muroleno (5) delta-cadineno (6) e copacanfeno (7)

23113 Terpenos identificados na resina dos frutos

Ourisson et al (1973) estudando a resina da casca do fruto da Hymenaea

courbaril isolaram quatro diterpenos biciacuteclicos os quatro compostos foram aacutecido

enatio-8(17)13(16)14-labdatrien-18-oico (1) e os outros compostos (Figura 14)

Figura 14 - Composto diterpecircnico identificado na resina proveniente da casca do

fruto da Hymenaea courbaril aacutecido enatio-8 (17)13(16)14-labdatrien-18-oico

MeOOC

18

13

16

4a 4b 5

1 2 3

H

H

H

H

6 7

H

35

Aleacutem destes compostos diterpecircnicos foram identificados compostos

sesquiterpecircnicos (Figura 15) como ciclosativeno (1) β-bourbuneno (2) cariofileno

(3) calareno (4) hemuleno22 Selina-4(14)-7-dieno (5) α-himacaleno (6) α-

muroleno (7) δ-cadileno24 Selina-4(14)-7-dieno e catorze compostos natildeo

identificados

Figura 15 - Compostos sesquiterpecircnicos identificados na resina proveniente da

casca do fruto da Hymenaea courbaril ciclosativeno (1) β-bourbuneno (2)

cariofileno (3) calareno (4) hemuleno22 Selina-4(14)-7-dieno (5) α-himacaleno (6)

α-muroleno (7)

23114 Terpenos identificados nas folhas

Em 1972 Martin et al isolaram das folhas os sesquiterpenos αndashcopaeno (1) e

α-cubebeno (2) com atividade antimicrobiana (Figura 6) Em 1986 Langenheim et

al isolaram tambeacutem das folhas da Hymenaea courbaril os sesquiterpenos β-

cariofileno e γ-muroleno (Figura 16)

H

6 7

H

H

3 4 5

1 2

H

H

36

Figura 16 - Estruturas dos sesquiterpenos isolados das folhas de H courbaril b-

cariofileno (1) e γ-muroleno (2)

1 2

Abdel-Kader et al em 2002 isolaram das folhas e galhos diterpenos do tipo

halimadieno aacutecido (13R)-13-hidroxi-1(10)14-ent-halimadien-18-oico (1) aacutecido

(2S13R)-213-dihidroxi-1(10)-14-ent-halimadien-18-oico (2) e aacutecido (13R)-2-oxo-

13-hidroxi-1(10)14-ent-halimadien-18-oico (3) (Figura 17) com atividade citotoacutexica

Figura 17 - Estruturas dos diterpenos isolados das folhas e galhos de H courbaril

aacutecido (13R)-13-hidroxi-1(10)14-ent-halimadien-18-oico (1) aacutecido (2S13R)-213-

dihidroxi-1(10)-14-ent-halimadien-18-oico (2) e aacutecido (13R)-2-oxo-13-hidroxi-

1(10)14-ent-halimadien-18-oico (3)

1 2 3

Das folhas galhos e do tronco foram isolados diterpenos do tipo halimadieno

(CUNNINGHAM et al 1974) os quais apresentaram atividade citotoacutexica frente a

ceacutelulas tumorais humanas de ovaacuterio linhagem A2780 (ABDEL-KADER et al 2002)

Tambeacutem foi avaliado o efeito repelente do jatobaacute a formigas por Wiemer e Hubbel

em 1983 apoacutes alguns ensaios os autores verificaram que o epoacutexido do cariofileno

era o composto responsaacutevel pela resistecircncia nessa espeacutecie de planta contra o

ataque de formigas

Barbosa et al 2007 estudando o extrato hidroacetocircnico de folhas de

Hcourbaril var stilbocarpa obtiveram apoacutes particcedilatildeo liacutequido-liacutequido com n-

2

COOH

HO

H

HOHO

COOH

H

HOO

COOH

H

13

18 18 18

14 14 14 13 13

2

HH

H

37

hexanoaacutegua uma fase orgacircnica (FO 2) e uma aquosa (FA 8) sendo

identificados os sesquiterpenos muuroladieno e patchuleno e um diterpeno

clerodacircnico

23115 Terpenos identificados nas cascas dos frutos

Aguiar et al (2010) avaliando a composiccedilatildeo quiacutemica dos oacuteleos essenciais

das cascas de frutos de Hymenaea courbaril identificaram a presenccedila de vaacuterios

terpenos Quanto agraves cascas dos frutos maduros os principais constituintes foram os

sesquiterpenos alfa-copaeno (111) espatulenol (101) e beta-selineno (82)

enquanto germacreno-D (319) beta-cariofileno (271) e biciclogermacreno

(65) foram os principais constituintes a partir de frutos verdes

Tambeacutem foram identificados a partir da casca de frutos maduros os

diterpenos aacutecido zanzibarico e aacutecido isoozico juntamente com o sesquiterpeno

caryolane-1 9β-diol sendo oprimeiro relato desse sesquiterpeno neste gecircnero

23116 Substacircncias isoladas das sementes

Em 2001 Nogueira et al isolaram das sementes diterpenos e entre eles dois

novos clerodanos (Figura 18)

Figura 18 - Estruturas dos diterpenos isolados das sementes de H courbaril aacutecido

(5R8S9S10R)-cleroda-313E-dien-15-oico (1) e aacutecido (5S8S9S10R)-

cleroda-313E-dien-15-oico (2)

1 2

Em (2013) em um estudo realizado por Dias et al quanto a composiccedilatildeo

nutricional das sementes e da polpa de H courbaril foi identificado que os

COOH COOH

38

componentes bioativos mais abundantes satildeo α-tocopherol (88637 e 99363 mgkg)

e β-sitosterol (6183 e 9109 mgkg) para o oacuteleo das sementes na poupa

respectivamente

2312 Hymenaea oblongifolia

A partir da anaacutelise da resina do tronco da Hymenaea oblongifolia Langenheim

et al (1973) verificaram que 75 da fraccedilatildeo aacutecida era constituiacuteda essencialmente

por dois compostos (Figura 19)

Figura 19 - Principais constituintes da fraccedilatildeo aacutecida da resina do tronco da

Hymenaea oblongifolia aacutecido enantio-pinifoacutelico (aacutecido enantio-labd-8(20-em-1518

dioacuteico) (1) e o aacutecido guamaacuteico (aacutecido enantio-labd-8(20)13-dien-1518 dioico (2)

COOH

HOOC

COOH

HOOC

2313 Hymenaea verrucosa

A partir da resina do tronco da Hymenaea verrucosa Langenhein et al

(1973) isolaram o aacutecido enantio-8(17)13 (16)14-labdatrien-18-ico28 anteriormente

estudado por Ourisson et al (1973)

2314 Hymenaea stigonocarpa

A resina produzida pela espeacutecie H stigonocarpa conhecida como jutaicica e

copal eacute utilizada na induacutestria de vernizes e como medicamento no tratamento de

cistite e problemas respiratoacuterios (ALMEIDA et al 1998)

23141 Terpenos identificados nas sementes

Na avaliaccedilatildeo quiacutemica da resina extraiacuteda das sementes desta planta

observou-se que ela conteacutem diterpenoacuteides que possuem esqueletos estruturais do

1 2

18 18

15 15

8 8

13

39

tipo labdano (1) abietano (2) e pimarano (3) conforme demonstrado na Figura 20

(FARIA et al 2004)

Figura 20 - Esqueletos estruturais do tipo laacutebdano (1) e abietano (2) e pimarano (3)

da resina de Hymenaea stigonocarpa

H

H

Em outro estudo Matuda et al (2005) avaliaram que as sementes do jatobaacute

apresentam alto teor de fibras totais baixo teor de proteiacutenas e lipiacutedios A fraccedilatildeo

lipiacutedica apresentou predominacircncia de 86 em aacutecidos graxos insaturados A

semente de jatobaacute mostrou-se pobre em macronutrinentes quando comparada a

leguminosas utilizadas na alimentaccedilatildeo mas o alto teor de fibras possivelmente

constituiacutedas de xiloglucanas e galactomananas pode levar ao aproveitamento

rentaacutevel destas sementes

Wiemer e Hubbel em (1983) pesquisaram o efeito repelente a formigas de

algumas espeacutecies de plantas como por exemplo o jatobaacute Apoacutes alguns ensaios os

autores verificaram que o epoacutexido do cariofileno era o composto responsaacutevel pela

resistecircncia nessa espeacutecie de planta contra o ataque de formigas


Das folhas desta espeacutecie foram isolados dois sesquiterpenos o -cariofileno e

α-muroleno com atividade antifuacutengica e accedilatildeo repelente contra insetos

(LANGENHEIM et al 1986) jaacute relatada por Wiemer amp Hubbel em 1983

23143 Terpenos identificados no epicarpo

Foi realizada por Giacomini et al (2006) a obtenccedilatildeo do extrato hexacircnico do

epicarpo de H stigonocarpa obtendo-se uma fraccedilatildeo aacutecida (FA) e uma neutra (FN)

1 2 3

40

Cada fraccedilatildeo correspondeu a aproximadamente 50 do total do extrato hexacircnico

Foram caracterizados trecircs sesquiterpenos da fraccedilatildeo neutra a-copaeno (1) 4

espatulenol (2) 13 e oacutexido de cariofileno (3) 9 (Figura 21)

Figura 21 - sesquiterpenos isolados da fraccedilatildeo neutra das folhas de H stigonocarpa

a-copaeno (1) espatulenol (2) e oacutexido de cariofileno (3)

Na fraccedilatildeo aacutecida observou-se a presenccedila de 4 isocircmeros diterpecircnicos

majoritaacuterios caur-16-en-19-ato de metila (4) 52 caur-15-en-19-ato de metila (5)

20 ozato de metila (6) 17 e isoozato de metila (7) 9 (Figura 22) separados

por cromatografia em siacutelica-gel

Figura 22 - Diterpenos majoritaacuterios isolados da fraccedilatildeo aacutecida das folhas de H

stigonocarpa caur-16-en-19-ato de metila (4) caur-15-en-19-ato de metila (5) ozato

de metila (6) e isoozato de metila (7)

4 5

COOMe

COOMeCOOMe

COOMe

6 7

19 19

19 19

1 2 3

O HO

41


Estudos realizados por Domeacutenech-carboacute et al (2009) para caracterizaccedilatildeo da

resina do tronco coletada de espeacutecies de Hymenaea stigonocarpa Mart Espeacutecies

coletadas da regiatildeo de Minas Gerais mostraram que o aacutecido eperuico e seus

isocircmeros juntos com acido copaacutelico satildeo os principais componentes da resina

estudada Outros componentes tais como aacutecido colavenico aacutecido iso-ozico e aacutecido

epi-pinifolico satildeo tambeacutem presentes na resina em menor proporccedilatildeo

23145 Terpenos identificados no alburno

O alburno foi submetido agrave extraccedilatildeo com o solvente etanol e particionado entre

o ciclohexano e acetato de etila e o extrato ciclohexacircnico foi submetido a

fracionamento A abordagem fitoquiacutemica revelou a presenccedila de esteroacuteides e

triterpenoacuteides Foram identificados cinco compostos no extrato ciclohexacircnico N-N-

dietildecanamida Hexadecanoato de metila Aacutecido hexadecanoacuteico Aacutecido 9-

octadecenoacuteico Aacutecido octadecanoacuteico (VALENTIN 2006)

Do extrato de acetato de etila foram identificados os aacutecidos oleico linoleico

estearico e palmiacutetico (MARANHAtildeO et al 2013)

A anaacutelise da resina do tronco da Hymenaea parvifolia por CLG mostrou que

62 dela era constituiacuteda por aacutecido enantio-13-epilabdanoacuteico (Figura 23) de acordo

com NORIN et al (1963)

Figura 23 - Estrutura do aacutecido enantio-13-epilabdanoacuteico isolada de H parvifolia

COOH

OH

232 Flavonoacuteides identificados no gecircnero Hymenaea

Foram identificados flavonoacuteides em diferentes espeacutecies do gecircnero Hymenaea

42

2321 Hymenaea parvifolia

Em 1999 Ishibashi et al isolaram tambeacutem da resina do tronco de Hymenaea

parvifolia o flavonoacuteide glicosilado astilbina (Figura 24)

Figura 24 - Estrutura da astilbina

2322 Hymenaea palustris

Pettit et al (2003) isolaram os flavonoacuteides do tipo luteolina (1) crisoeriol (2)

palstatina (3) entre outros das folhas de Hymenaea palustris (Figura 25) esses

compostos apresentaram potente atividade inibitoacuteria frente a patoacutegenos Gram-

negativos como a Neisseria gonorrhoeae A palstatina atua como inibidor do

crescimento de ceacutelulas leucecircmicas linfoacuteticas tipo P388

Figura 25 - Estruturas de flavonoacuteides isolados das folhas de H palustres luteolina

(1) crisoeriol (2) e palstatina (3)

1 2

OHO

OH O

OH

OH OHO

OH O

OCH3

OH

O

OOH

HO

O

O

OH

OH

OacuteCH3

OCH3

H

H

OCH3

3

43


Suzuki et al (2008) isolaram dois flavonoacuteides do alburno de H courbaril a

taxifolina (1) e o fisetinidol (2) ambos com atividade antioxidante (Figura 26)

Figura 26 - Estruturas dos flavonoacuteides isolados do cerne de H courbaril taxifolina

(1) e o fisetinidol (2)

1 2


Foram identificados flavonoacuteides em diferentes partes da espeacutecie Hymenaea

stigonocarpa

23241 Flavonoacuteides identificados na casca do caule

As anaacutelises cromatograacuteficas realizadas do extrato de acetato de etila da casca

de Hymenaea stigonocarpa realizadas por Lovato e Nunes em 2007 sugeriram que

este extrato conteacutem como principal componente o flavonoacuteide astilbina

(diidroquercetina-3-O-ramnosil) O fracionamento do extrato em coluna de siacutelica

levou ao isolamento de dois flavonoacuteides dos quais o mais abundante (F3442) foi

identificado como astilbina por CCD em comparaccedilatildeo com amostra autecircntica

O espectro de infravermelho obtido para a amostra isolada corresponde

exatamente ao da amostra autecircntica O comportamento cromatograacutefico e o espectro

de infravermelho do segundo flavonoacuteide isolado (F2728) sugerem fortemente que

se trata de quercetina-3-ramnosil

Em um estudo realizado por Moulari et al em 2006 foi isolado e

caracterizado nas folhas de Harungana madagascariensis o flavonoacuteide astilbina o

OH

OHO

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

44

mesmo isolado por Ishibashi et al (1999) em H parvifolia e por Lovato e Nunes

(2007) em H stigonocarpa segundo Moulari eacute a astilbina a responsaacutevel pela

atividade antibacteriana do extrato de acetato de etila de Harungana

madagascariensis

Este flavononol tambeacutem foi isolado de flores de Dimorphandra mollis Benth

(Fabaceae Caesalpinioideae) e apresentou um importante efeito inibitoacuterio sobre a

enzima mieloperoxidase enzima implicada em processos oxidativos em sistemas

bioloacutegicos (PETACCI et al 2008)

23242 Flavonoacuteides identificados no alburno


o ciclohexano e acetato de etila do extrato de acetato de etila foram identificados

quatro flavonoides Dentre os flavonoides o principal constituinte (uma flavonona) foi

identificado como hultenina os outros flavonoides identificados foram taxifolina

quercetina e 7-methoxcatequina (MARANHAtildeO et al 2013)

233 Cumarinas identificadas no gecircnero Hymenaea

Foi identificada a presenccedila de cumarinas apenas na espeacutecie Hymenaea

courbaril


Em 2009 Simotildees et al isolaram duas cumarinas (Figura 27) das sementes

de H courbaril com atividade antifuacutengica

Figura 27 - Estruturas das cumarinas isoladas das sementes de H courbaril

ipomopsina (1) e hymenaina (2)

1

O

OH

MeO

O O

MeO

O O

2

O OOH

MeO

O

O

OMe

OH

45

234 Taninos relatados no gecircnero Hymenaea

Foram identificados taninos em diferentes espeacutecies do gecircnero Hymenaea


Em estudo realizado por Caramori et al (2004) foi observado que as

sementes de H courbaril apresentam uma grande quantidade de taninos

Sasaki et al (2009) descrevem que H courbaril conteacutem compostos bioatiacutevos

tais como terpenoacuteides e accedilucares aleacutem disso haacute relatos que vaacuterios terpenoacuteides ou

compostos fenoacutelicos possuem atividade antibacteriana A casca do jatobaacute conteacutem

um grande nuacutemero de procianidinas e parece ser um bom material para investigaccedilatildeo

de sua bioatividade ela pode aliviar alguns dos sinais cliacutenicos associados com a

encefalite aleacutergica experimental (EAE) uma doenccedila desmielinizante inflamatoacuteria do

sistema nervoso central sendo os componentes ativos responsaacuteveis pela atividade

bioloacutegica as procianinas do jatobaacute


Orsi e colaboradores (2012) descrevem no extrato metanoacutelico da casca do

caule de Hymenaea stigonocarpa apoacutes a anaacutelise por CLAE-DAD a ocorrecircncia de

picos com espectros de UV caracteriacutesticos de derivados de catequinas e de aacutecido

gaacutelico aleacutem da ocorrecircncia de catequinas polimeacutericas

24 ESTUDOS FARMACOLOacuteGICOS NOS EXTRATOS OBTIDOS A PARTIR DE

DIFERENTES ESPEacuteCIES DO GEcircNERO Hymenaea

241 Estudos etnofarmacoloacutegicos

Foram realizados estudos etnofarmacoloacutegicos em diferentes espeacutecies do

gecircnero Hymenaea


46

Segundo Martins (1989) na Amazocircnia os nativos costumam ingerir a seiva

da Hymenaea courbaril para tratamento das afecccedilotildees pulmonares devendo

entretanto fazecirc-lo em pequenas doses pois como eacute adstringente causa

constipaccedilatildeo intestinal acrescenta ainda que da casca do caule pode ser feito chaacute

pelo meacutetodo de decocccedilatildeo para lavar ferimentos e para irritaccedilotildees vaginais

A casca do ramo eacute utilizada para problemas como tosse bronquite catarro

asma e fraqueza pulmonar sendo utilizada uma colher de sopa da casca do ramo

picada em uma xiacutecara (cafeacute) de aacutegua em fervura sendo fervido durante 5 minutos e

posteriormente coado acrescentando-se uma colher (cafeacute) de accediluacutecar cristal e uma

colher (sopa) de mel de abelha Deve-se ingerir uma colher (sopa) de 1 a 3 vezes

ao dia (PANIZZA 1998)

Numa discriccedilatildeo realizada por BONTEMPO (2000) a casca em cozimento eacute

aconselhada para combater hemoptises hematuacuteria (emissatildeo de urina com sangue)

diarreacuteia disenteria coacutelicas ventosas e acrescenta que o vinho de jatobaacute retirado do

caule eacute um poderoso fortificante LEONARDI (2002) relata que o chaacute da casca eacute

bom medicamento para a proacutestata podendo ser ingerido vaacuterias vezes ao dia e a

resina pode ser aplicada em forma de emplastro sobre as partes doloridas do corpo

Veiga Juacutenior (2005) descreve que em doses elevadas o jatobaacute (H courbail) satildeo

utilizadas como expectorante e fortificante mas podem desencadear reaccedilotildees

aleacutergicas


Em mais um levantamento realizado junto agraves comunidades rurais do sul do

Estado de Minas Gerais na microrregiatildeo do Alto Rio Grande sobre quais as

espeacutecies nativas eram utilizadas na medicina popular Contando-se com a

colaboraccedilatildeo de 13 raizeiros em campo foi descrito que a Hymenaea stigonocarpa

esteve entre as espeacutecies utilizadas na medicina popular sendo preparado como

decocto ou infuso as partes como casca e ramos mais velhos tendo indicaccedilatildeo para

bronquites tosses coqueluche adstringente e nas afecccedilotildees da bexiga e proacutestata

(RODRIGUES CARVALHO 2001)

Hymenaea stigonocarpa tambeacutem estaacute entre as principais plantas medicinais

do cerrado utilizadas pela populaccedilatildeo da cidade de Mossacircmedes estado de Goiaacutes

As principais formas de utilizaccedilatildeo da planta satildeo atraveacutes da decocccedilatildeo da casca do

47

caule resina e polpa da fruta que satildeo indicados como depurativas contra afecccedilotildees

pulmonares (VILA VERDE et al 2003) Em um levantamento etnobotacircnico que teve

como alvo comunidades do entorno do Parque Nacional da Chapada dos Veadeiros

e da cidade de Alto Paraiacuteso observou-se que no elenco das dez espeacutecies medicinais

mais utilizadas o jatobaacute (Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne) foi coincidente na

indicaccedilatildeo de todos os entrevistados tendo seu uso relatado como depurativo

antiinflamatoacuterio estimulante de apetite fortificante e rico em ferro (SOUZA FELFILI

2006)

Outro estudo que relatou o uso de plantas medicinais entre os habitantes do

pantanal mato-grossense a espeacutecie Hymenaea stigonocarpa Mart teve a atividade

da resina que desprende da casca do caule relatadaque quando moiacuteda e aspirada

eacute utilizada no tratamento da sinusite (NETO 2006) Quando deixada de molho

serviria para as dores de estocircmago do peito e das costas O chaacute da casca seria

utilizado nas machucaduras do corpo humano e nas fraturas Tambeacutem eacute preparado

um vinho da seiva desta espeacutecie eacute tido como fortificante


Em estudo etnobotacircnico realizado na comunidade negra de Curiauacute no estado

do Amapaacute apontam que o chaacute ou xarope da casca do caule de Hymenaea parvifolia

eacute utilizado para o tratamento de tosse bronquite febre diarreacuteia desinteria coacutelicas e

asma como tambeacutem como hemostaacutetico fortificante e vermiacutefugo (SILVA 2002)

242 Avaliaccedilatildeo farmacoloacutegica

Foram realizadas avaliaccedilotildees farmacoloacutegicas em diferentes espeacutecies do

gecircnero Hymenaea


Varios estudos farmacoloacutegicos tambeacutem ja foram realizados comprovando o

uso popular desta espeacutecie Estudos quanto agrave toxicidade da resina da Hymenaea

courbaril relatam que ela apresenta efeito toacutexico e inibidor do apetite sobre o inseto

Spodoptera exiacutegua (STUBBLEBINE LANGENHEIN 1977)

Extratos das suas cascas apresentaram atividade moluscicida (MARSTON et

al 1996) assim como atividade in vitro anti-plasmoacutedio (KOumlHLER et al 2002)

48

Quanto aos estudos relacionados a atividades inseticida trecircs diterpenos isolados

por Aguiar (2009) dos frutos de Hymenaea courbaril aacutecido zanzibaacuterico e aacutecido

isooacutezico e o sesquiterpeno caryolano-19-diol identificado pela primeira vez nesta

espeacutecie apresentaram accedilatildeo larvicida frente ao Aedes aegypti cujos valores de CL50

foram iguais a 1485 plusmn 044 ppm e 2844 plusmn 027 ppm para frutos verdes e maduros

respectivamente (AGUIAR 2009)

Quanto agrave avaliaccedilatildeo da atividade antiinflamatoacuteria o pericarpo da planta

apresentou atividade antiinflamatoacuteria 5-lipooxigenase e accedilatildeo inibitoacuteria contra

tiroquinase (TAKAGI et al1999) e inibiccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo induzida pela radiaccedilatildeo

UV (TAKAGI et al 2002)

Jayaprakasam et al (2007) isolou dos frutos de H courbaril o aacutecido

labdanoacutelico e espatulenol terpenos que possuem atividade antiinflamatoacuteria cuja

inibiccedilatildeo da ciclo-oxigenase II (COX II) foi da ordem de 43 e 54 para aacutecido

labdanoacutelico e espatulenol respectivamente

Em estudo realizado por Bezerra et al (2013) foi demonstado que a fraccedilatildeo

acetato de etila da casca do caule de Hymenaea courbaril apresenta potencial

atividade antioxidante miorelaxante aleacutem da anti-inflamatoacuteria jaacute anteriormente

descrita confirmando o uso popular no tratamento de doenccedilas inflamatoacuterias aeacutereas

tais como a asma natildeo sendo poreacutem determinadas os metaboacutelitos responsaacuteveis por

esta accedilatildeo

Quanto a atividade antioxidante Aguiar et al (2009) descreve a atividade do

extrato metanolico que apresentou valores de CI50 de 004 mgL Atividade tambeacutem

observada por Peixoto et al (2013) avaliando os extratos hidroalcooacutelico e metanoacutelico

das sementes polpa folha e casca de Hymenaea courbaril que apresentaram altos

teores de fenoacuteis totais e flavonoacuteides

Na avaliaccedilatildeo da atividade antimicrobiana foi observados que diterpenos

isolados das folhas de Hymenaea courbaril apresentam marcada atividade fungicida

(HUBBELL et al 1983) Esta espeacutecie tambeacutem foi descrita como capaz de tratar

infecccedilotildees urinaacuterias sendo observado em estudo realizado por CARAMORI et al

(2004) altos niacuteveis de atividade enzimaacuteticas do extrato etanoacutelico da semente

FERNANDES et al (2005) realizou uma avaliaccedilatildeo da atividade

antimicrobiana de extratos pela teacutecnica de difusatildeo em aacutegar empregando-se o

meacutetodo de difusatildeo em poccedilo e determinou a concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM)

para o extratos de H courbaril mediante a utilizaccedilatildeo de estreptococos do grupo

49

mutans (EGM) e Staphylococcus sp Na concentraccedilatildeo de 25 mgmL 540 dos

Staphylococcus sp foram inibidos enquanto para os estreptococos do grupo mutans

a dose de 125mgmL foi capaz de inibir apenas 35 da populaccedilatildeo

Esses extratos apresentaram atividade frente os micro-organismos Gram-

positivos principalmente contra Staphylococcus aureus mas natildeo inibiram os micro-

organismos Gram-negativos e a Candida albicans

Resultados confirmados por GONCcedilALVES et al (2005) que tambeacutem

descrevem que o extrato hidroalcooacutelico preparado a partir da casca de planta exerce

atividade contra Staphylococcus aureus e Bacillus cereus Como tambeacutem por Aleixo

et al (2013) que demonstrou a accedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico da casca frente a

isolados cliacutenicos de Staphylococcus aureus meticiclina resistente (MRSA)

apresentando uma CIM de 500microgmL

Aleixo et al (2013) ainda descreve que a associaccedilatildeo do extrato

hidroalcooacutelico de Hymenaea courbaril com o extrato de Stryphnodendron

adstringens na proporccedilatildeo de 11 levou a reduccedilatildeo da CIM para 3125microgmL

demonstrando assim a existecircncia de um efeito sineacutergico


Extratos obtidos a partir de ciclohexano acetato de etila e metanol a partir do

alburno apresentaram grupo de compostos que se mostraram toacutexicos e com

propriedades contra cupins (Nasutitermes corniger) (SANTANA et al 2010)

Maranhatildeo et al (2013) avaliando a accedilatildeo do extrato de acetato de etila do

alburno e dos flavonoides isolados a partir desta fraccedilatildeo (hultenina quercetina

taxifolina and 7-metoxcatequina) frente agrave Nasutitermes corniger observou que todos

apresentam atividade sendo o extrato de acetato de etila mais ativo que as fraccedilotildees

isoladas natildeo existindo diferenccedilas significativas entre os diferentes flavonoides

isolados

Quanto a citotoxicidade a avaliaccedilatildeo da accedilatildeo de compostos isolados do

epicarpo de Hymenaea stigonocarpa frente a ceacutelulas tumorais humanas observou-se

que de trecircs substacircncias isoladas a partir do extrato hexacircnico do epicarpo de

Hymenea stigonocarpa caur-16-en-18-ato de metila (1) caur-15-en-18-ato de metila

(2) e caur-16-en-18-ol (3) respectivamente A substacircncia caur-16-en-18-ol foi capaz

50

de inibir significativamente o crescimento das trecircs linhagens de ceacutelulas avaliadas

H460 Colo 205 e U937 (BRASIL et al 2009)

Analisando a citotoxicidade celular dos compostos medida pela quantificaccedilatildeo

de LDH (Desidrogenase laacutetica) demonstrou-se que os compostos 1 e 2

anteriormente descritos natildeo foram capazes de induzir a liberaccedilatildeo da enzima

enquanto que o 3 foi capaz de induzir a liberaccedilatildeo de LDH nas maiores

concentraccedilotildees testadas (BRASIL et al 2009)

Guimaratildees et al (2009) avaliando a toxicidade aguda do extrato metanolico

da entrecasca de Hymenaea stigonocarpa observou que o ele natildeo produz alteraccedilotildees

comportamentais ateacute a dose de 1000mgKg poreacutem a partir desta dose os

camundongos apresentam diarreacuteia e letargia reversiacuteveis em 24h Quanto ao transito

gastrointestinal o mesmo no intestino mostrou-se aumentado enquanto o

esvaziamento gaacutestrico mostrou-se reduzido

Estudos de Orsi et al (2012) mostraram que a administraccedilatildeo por via oral de

5mgKg do extrato metanolico da casca do caule natildeo produz nenhum sinal de

toxicidade aguda em animais machos ou fecircmeas (ratos) assim como natildeo leva a

mortes nem mudanccedilas de peso corporal ou de oacutergatildeos quando avaliados por um

periacuteodo de 14 dias apoacutes a administraccedilatildeo

Guimaratildees et al (2009) avaliando a atividade antiulcerogecircnica da entrecasca

observaram que o extrato metanolico possui atividade nos modelos de uacutelcera

gaacutestrica induzida por indometacina e isquemia-reperfusatildeo e sendo portente no

modelo de ulcera gastrica induzida por etanol Tambeacutem foi observado que o extrato

metanoacutelico (obtido por maceraccedilatildeo) apresenta atividade inibitoacuteria sobre a liberaccedilatildeo

induzida de histamina a partir de mastoacutecitos (FERREIRA 2011)

Aleacutem disso outros estudos demonstram que o extrato metanoacutelico da casca

apresenta efeito antidiarreico gastroprotetor contra vaacuterios agentes ulcerogecircnicos

esse efeito gastroprotetor eacute acompanhado da prevenccedilatildeo da depleccedilatildeo de GSH e

inibiccedilatildeo da atividade de mieloperoxidase na mucosa duodenal e atividade

cicatrizante Esses efeitos observados satildeo atribuiacutedos agrave accedilatildeo antioxidante devido agrave

presenccedila de taninos condensados e flavonoides (ORSI et al 2012)

O extrato de acetato de etila do alburno mostrou tambeacutem atividade

antioxidante contra radicais DPPH sendo mais ativo quando comparado a

flavonoides isolados a partir deste mesmo extrato sendo sugerida por Maranhatildeo et

al (2013) que pode ocorrer um efeito sineacutergico entre os flavonoides presentes no

51

extrato o que explicaria essa maior atividade Mesma atividade antioxidante

observada por Peixoto et al (2013) que avaliou a atividade dos extratos

hidroalcooacutelico e metanoacutelico do fruto da Hymenaea stigonocarpa

Quanto agrave accedilatildeo antimicrobiana em estudo realizado por Valentim (2006)

utilizando o alburno de Hymenaea stigonocarpa o extrato em acetato de etila

apresentou atividade antimicrobiana pelo meacutetodo de difusatildeo em disco frente ao

Staphylococcus aureus tendo tambeacutem apresentado resultado significativo frente agrave

bacteacuteria aacutelcool-aacutecido-resistente (Mycobacterium smegmatis)

Valeriano et al (2010) avaliando a atividade antimicrobiana a partir do

alburno observaram que o extrato ciclohexanico apresentou atividade frente ao

Staphylococcus aureus confirmando os resultados de Valentin (2006) deste extrato

foram identificados os compostos hexadecanoato de metila aacutecido hexadecanoacuteico

aacutecido octadecanoacuteico e aacutecido 9-octadecenoacuteico

Novamente avaliando a accedilatildeo antimicrobiana foi preparado um extrato

etanoacutelico da casca de Hymenaea stigonocarpa que apresentou uma CIM de 250

microgmL para Staphylococcus aureus Candida krusei e Criptococcus neoformans

poreacutem natildeo apresentou atividade significativa frente agrave Pseudomonas aeruginosa e

Candida albicans CIM de 1000 microgmL aleacutem de significante atividade antioxidante

provavelmente associadas agrave presenccedila de taninos (MARQUES et al 2013)

2423 Hymenaea martiana

Foram isolados a partir do extrato etanoacutelico da casca de Hymenaea martiana

β-sitosterol-3-O-glicosiacutedeo e trecircs ramnosideos (eucrypina engelitina e astilbina) O

glicosiacutedeo eucripina causou um deslocamento dependente de concentraccedilatildeo da

curva de resposta da bradicinina (BK) do uacutetero isolados de ratas Em contraste

astilbina e engeletina causaram apenas um discreto deslocamento agrave direita do BK

(antagonismo) as contraccedilotildees induzidas (CARNEIRO et al 1993)

Em outro estudo o extrato etanoacutelico da casca do caule obtido por maceraccedilatildeo

e as fraccedilotildees hexano clorofoacutermio e acetato de etila apresentam atividade

antinociceptiva observada pelo meacutetodo das contorccedilotildees abdominais induzidas pelo

aacutecido aceacutetico possivelmente pela inibiccedilatildeo da siacutentese de prostaglandinas (SILVA et

al 2011)

52

Silva et al (2010) avaliando o extrato etanoacutelico e as fraccedilotildees hexano

clorofoacutermio e acetato de etila descreveu a existecircncia de atividade antioxidante

sendo o extrato acetato de etila o mais ativo seguido pelo extrato etanoacutelico e as

fraccedilotildees hexano e clorofoacutermio

Resultados confirmados por SILVA et al (2011) onde foi observado que o

extrato etanoacutelico da casca de Hymenaea martiana e a fraccedilatildeo de acetato de etila

obtida por particcedilatildeo apresentaram uma marcada atividade antioxidante Analises

fitoquiacutemicas demonstraram que a fraccedilatildeo etanoacutelica conteacutem polifenoacuteis flavonoides

esteroides e terpenoacuteides sendo a presenccedila de polifenoacuteis nestes extratos essencial

para essa propriedade os polifenoacuteis descritos satildeo possivelmente aacutecido cinamico

flavan-3-ol ou derivados de flavanonas

Quanto a atividade antimicrobiana os extratos aquoso butanoacutelico e

hidroalcooacutelico obtidos da casca de Hymenaea martiana apresentam atividade frente

a Cryptococcus neoformans e C gatii com CIM entre 2 a 64 microgML sendo as

fraccedilotildees etanolica e hidroalcooacutelica as mais ativas Souza et al (2010) tambeacutem

demonstraram a atividade da H martiana frente agrave dermatoacutefitos (Trichophytum

rubrum Trichophytum mentagrophytes M canis) sendo os menores valores de CIM

os obtidos a partir das fraccedilotildees aquosa e butanoacutelica nas trecircs espeacutecies estudadas


Em 1999 Ishibashi et al identificaram dois dihidroflavonois rhamnosideos

isolados da casca de Hymenaea parvifolia neoastilbina e astilbina que

apresentaram efeitos inibitoacuterios sobre a caseiacutena quinase II (CK-II) de forma dose-

dependente

53

REFEREcircNCIAS ABDEL-KADER M BERGER JM SLEBODNICK C HOCH J MELONE S WISSE JH WERKHOVEN M C M MAMBER S KINGSTON D G I Isolation and absolute conFiguration of ent-halimane diterpenoids from Hymenaea courbaril from theSuriname rain forest Journal of Natural Products v65 n1 p 11-15 2002 AGUIAR J C D A Estudo fitoquiacutemico e bioloacutegico de Hymenaea Courbaril L 139p Dissertaccedilatildeo de Mestrado (Quiacutemica) ndash Departamento de Quiacutemica Orgacircnica e Inorgacircnica Fortaleza CE 2009 AGUIAR J C SANTIAGO G M LAVOR P L VERAS H N FERREIRA Y S LIMA M A ARRIAGA A M LEMOS T L LIMA JQ DE JESUS HC ALVES PB BRAZ-FILHO R Chemical Constituents and Larvicidal Activity of Hymenaea courbaril Fruit Peel Natural Product Communications v5 n12 p1977-80 2010 ALEIXO A A CAMARGOS V N ANDRADE A C S P SANTOS M CARVALHO R S MIRANDA V C HERRERA K M S MAGALHAtildeES J T LIMA L A R S FERREIRA J M S Propriedades antibioacuteticas dos extratos de Stryphnodendron adstringens E Hymenaea courbaril (Fabaceae) frente ao isolado cliacutenico Staphylococcus aureus meticicina-resistente (MRSA) Biochemistry and Biotechnology Reports v 2 n 2 p 85-88 2013 ALMEIDA S P PROENCcedilA C E B SANO S M RIBEIRO J F Cerrado espeacutecies BARBOSA M P C GIAMPIETRO G S CARDOSO-LOPES E M YOUNG M C M BARROSO G M Sistemaacutetica de angiospermas do Brasil Viccedilosa UFV Imprensa Universitaacuteria v2 1991 BARROSO G M PEIXOTO A L COSTA C G Sistemaacutetica de angiospermas do Brasil Viccedilosa UFV Imprensa Universitaacuteria 2002 BOLZANI V S TORRES L M B Sesquiterpenos e diterpeno clerodacircnico do extrato hidrocetocircnico de folhas de Hymenaea courbarilvar Stilbocarpa (Heyne) Lee amp Lang In 30a Reuniatildeo Anual da Sociedade Brasileira de Quiacutemica aacuteguas de Lindoia 2007 BONTEMPO M Medicina natural Satildeo Paulo ndash SP Nova Cultural 584p 2000 BRASIL T R ANDREAtildeO P S S MIRANDA P C M L GIACOMINI R A BORGES F V KANASHIRO M M avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica frente a ceacutelulas tumorais humanas de compostos isolados do epicarpo de Hymenaea stigonocarpa CONFICT - Congresso Fluminense de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica UENF Rio de Janeiro RJ 2009 CARAMORI S S LIMA C S FERNANDES K F Biochemical characterization of selected plant species from Brazilian savannas Brazilian Archives of Biology and Technology v 47 n 2 p 253-259 2004

54

CARNEIRO E CALIXTO J B MONACHE F D YUNES R A Isolation Chemical Identification and Pharmacological Evaluation of EucryphinAstilbin and Engelitin Obtained from the Bark of Hymenaea martiana Pharmaceutical Biology v 31 n 1 p 38-46 1993 CARVALHO P E R Jatobaacute-do-Cerrado Hymenaea stigonocarpa circular teacutecnica 133 Colombo Embrapa Paranaacute 2007 CASTELLEN M S Avaliaccedilatildeo do estado de conservaccedilatildeo de populaccedilotildees naturais de jatobaacute (Hymenaea courbaril L) por meio de analises de estrutura geneacutetica e autocorrelaccedilatildeo espacial 2005 104p Tese (Doutorado em Ecologia) ndash Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz USP Piracicaba 2005 CHOVANOVAacute R MIKULAacuteŠOVAacute M VAVERKOVAacute S In Vitro Antibacterial and Antibiotic Resistance Modifying Effect of Bioactive Plant Extracts on Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis International journal of microbiology v 2013 p 1-9 2013 CORREcircA M P Dicionaacuterio das Plantas uacuteteis do Brasil e das exoacuteticas cultivadas Rio de Janeiro Ministeacuterio da Agricultura IBDF v4 p 500-503 1984 CRONQUIST A An integrade system of classification of flowering plants New York Columbia University Press 1262p 1981 CUNNINGHAM A MARTIN S S LANGENHEIM J H Labd-13-en-8-ol-15-oic acid in the trunk resin of amazonian Hymenaea courbaril Phytochemistry v13 n1 p 294-295 1974 DE CARVALHO P S MIRANDA S C SANTOS M L Germinaccedilatildeo e dados biomeacutetricos de Hymenaea stignocarpa Mart Ex Hayne (Leguminosae salpinoideae jatobaacute do cerrado) Revista Anhanguera v 6 n 1 p101 - 116 2005 DIAS L S LUZIA D M M JORGE N Physicochemical and bioactive properties of Hymenaea courbaril L pulp and seed lipid fraction Industrial Crops and Products v 49 Pages 610-618 2013 DIMECH G S SOARES L A L FERREIRA M A DE OLIVEIRA A G V CARVALHO M D C amp XIMENES E A Phytochemical and Antibacterial Investigations of the Extracts and Fractions from the Stem Bark of Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne and Effect on Ultrastructure of Staphylococcus aureus Induced by Hydroalcoholic Extract The Scientific World Journal v 2013 p 1ndash8 2013 DOMEacuteNECH-CARBOacute M T CRUZ-CANtildeIZARES J OSETE-CORTINA L DOMEacuteNECH-CARBOacute A DAVID H Ageing behaviour and analytical characterization of the Jatobaacute resin collected from Hymenaea stigonocarpa Mart International Journal of Mass Spectrometry v 284 n 1-3 1 p 81-92 2009

55

FARIA D L A EDWARDS H GM AFONSO M C BRODY R H MORAIS J L Raman spect roscopic analysis of a tembetaacute a resin archaeological artefact in need of conservation Spectrochimica Acta v60 p1505ndash1513 2004 FERNANDES T T SANTOS A T F PIMENTA F C atividade antimicrobiana das plantas Plathymenia reticulata Hymenaea courbaril e Guazuma ulmifolia Revista de Patologia Tropical v 34 n2 p 113-122 2005 FERREIRA R A Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica de frutos sementes placircntulas e mudas de espeacutecies arboacutereas do cerrado de Minas Gerais Dissertaccedilatildeo de Mestrado Curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo em engenharia Florestal UFLA Lavras 1997 FERREIRA T L Prospecccedilatildeo de inibidores da secreccedilatildeo de histamina a partir de espeacutecies vegetais do Cerrado e da Mata Atlacircntica 81p Dissertaccedilatildeo de Mestrado - Curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Estadual Paulista Botucatu 2011 FESSENDEN R J Organic chemistry Boston Willard Grant Pres 1982

FLORES E M amp BENEVIDES C E Germinacioacuten y morfologia de la plaacutentula de Hymenaea courbaril L (Caesalpinaceae) Revista de Biologia Tropical v 38 n p 91-98 1990 GIACOMINI R A LIGIEacuteRO C B P ANDREAtildeO P S S MIRANDA P C M L BRAZ-FILHO R Estudo Fitoquiacutemico do Extrato Hexacircnico do Epicarpo de Hymenaea stigonocarpa (Jatobaacute do Cerrado) Sociedade Brasileira de Quiacutemica (SBQ) 29a Reuniatildeo Anual da Sociedade Brasileira de Quiacutemica 2006 GIBBONS S Anti-staphylococcal plant natural products Natural products reports v 21 p 263-277 2004 GIBBONS S OHLENDORF B JOHNSEN I The genus Hypericum-avaliable resource of anti-Staphylococcal Leads Fitoterapia v73 n4 p300-304 July 2002 GOMES J M CARDOSO J A PAULA T E G UCHOcircAS E G MARANGON L C Padrotildees reprodutivos e marcaccedilatildeo de aacutervores matrizes de Jatobaacute Hymenaea stigonocarpa (FABACEAE) Araccediluaiacute ndash MG In 64ordm Congresso Nacional de Botacircnica Belo Horizonte 2013 GONCcedilALVES A L ALVES FILHO A MENEZES H Estudo comparativo da atividade antimicrobiana de extratos de algumas aacutervores nativas Arquivos do Instituto Bioloacutegico Satildeo Paulo v72 n3 p353-358 2005 GUIMARAtildeES M A F PIRES R A LIMA J C S MARTINS DTO Avaliaccedilatildeo da atividade antiulcerogecircnica de Hymenaea stigonocarpa (Mart) Hayne (Caesalpinaceae) In IV simpoacutesio ibero-americano de plantas medicinais Cuiabaacute 2009

56

HEMAISWARYA S KRUTHIVENTI A K DOBLE M Synergism between natural products and antibiotics against infectious diseases(REVIEW) Phytomedicine v 15 p 639 ndash 652 2008 HOERLLE J L BRANDELLI A Antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolated from the intensive care unit of a general hospital in southern Brazil The Journal of Infection in Developing Countries v 3 n7 p 504-510 2009 HUBBELL S P WIEMER D F ADEJARE A An antifungal terpenoid defends a neotropical tree (Hymenaea) against attack by fungus-growing ants (Atta) Oecologia v60 p321-327 1983 INGHAM J L Phytoalexin production by Ononis species Biochemical Systematics and Ecology v 10 n3 p 233-237 1982 ISHIBASHI M ODA H MITAMURA M OKUYAMA E KOMIYAMA K KAWAGUCHI H WATANABE T ALVES S M MAEKAWA T OHTSUK K Casein Kinase II Inhibitors isolated from two Brazilian plants Hymenaea parvifolia and Wulffia baccata Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v9 p 2157-2160 1999 JAYAPRAKASAM B ALEXANDER-LINDO R L DEWITT D L MURALEEDHARAN N G Terpenoids from Stinking toe (Hymneae courbaril) fruits with cyclooxygenase and lipid peroxidation inhibitory activities Food Chemistry 2007 JOLY A B Botacircnica Introduccedilatildeo agrave taxonomia vegetal 12ordf ed Satildeo Paulo Companhia Editora Nacional p 371-380 1998 KODAMA M T SARTORI A L B Caracterizaccedilatildeo morfoloacutegica de placircntulas de Hymenaea stigonocarpa var stigonocarpa Mart Ex Hayne H stigonocarpa Hayne var brevipetiolata N Mattos e H courbaril L Revista Brasileira de Biociecircncias Porto Alegre v 5 supl 1 p 663-665 2007 KOumlHLER I JENETT-SIEMS K SIEMS K HERNAacuteNDEZ M A IBARRA R A BERENDSOHN W G BIENZLE U EICH E In vitro antiplasmodial investigation of medicinal plants from El Salvador Zeitschrift fur Naturforschung C v 57 p 277-281 2002 LANGENHEIM J H CONVIS C L MACEDO C A STUBBLEBINE W H Hymenaea and Copaifera leaf sesquiterpenes in relation to lepidopteran herbivory in southeastern Brazil Biochemical Systematics and Ecology v 14 n1 p 41-49 1986 LANGENHEIM J H HALL G D ldquoSesquiterpene deterrence of a leaf-tying lepidopteran Stenoma ferrocanella on Hymenaea stigonocarpa in Central Brazilrdquo Biochemical Systematics and Ecology n11 p 29ndash36 1983

57

LANGENHEIM J H LEE Y MARTIN S S An evolutionary and ecological perspective of Amazonian Hylaea species of Hymenaea (Leguminosae Caesalpinioideae) Acta amazonica v3 n1 p 5-38 1973 LANGENHEIN J H Leguminous resin-producing trees in Africa and South America Pages 89-104 in Tropical Forest Ecosystems in Africa as South America A comparative review MEGGERS B J AYENSU E S DUCKWORTH W D eds Smithsonian Press Washington DC 1972 LEE Y T amp LANGENHEIM J H Systematics of genus Hymenaea L (Leguminosae Caesalpinioideae Detarieae) University of California Publication in Botany v69 n 98 1975 LEONARDI C R Etnofitoterapia regional utilizada pela populaccedilatildeo de Paranaiacuteta MT 43f Monografia de Conclusatildeo de Curso (Licenciatura Plena em Ciecircncias Bioloacutegicas) - Universidade Estadual de Mato Grosso Campus Universitaacuterio de Alta Floresta Alta Floresta MT 2002 LIMA N N REICHER F CORREcircA J B C GANTER J L M S SIERAKOWSKI MR Oligosaccharides derived from the xyloglucan from the seeds of Hymenaea courbaril var stilbocarpa International Journal of Biological Macromolecules v 17 n 6 p 413-415 1995 LOCOSSELLI G M Anaacutelise integrada de dendrocronologia anatomia e isoacutetopos estaacuteveis de carbono a duas espeacutecies de Jatobaacute (Hymenaea LEGUMINOSAE) para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis efeitos da eleveccedilatildeo de CO2 atmosfeacuterico e mudanccedilas climaacuteticas 91p Dissertaccedilatildeo de Mestrado (Ciecircncias) - Instituto de Biociecircncias ndash Departamento de Botacircnica USP Satildeo Paulo 2010 LORENZI H Aacutervores brasileiras manual de identificaccedilatildeo e cultivo de plantas arboacutereas nativas do Brasil Nova Odessa Ed Plantarum 352p 1992 LOVATO G A amp NUNES D S Obtenccedilatildeo de astilbina de Hymenaea stigonocarpa martius In VII Encontro de Pesquisa da UEPG Ponta Grossa 2007 MARANHAtildeO C A PINHEIRO I O SANTANA A L B D OLIVEIRA L S NASCIMENTO M S amp BIEBER L W Antitermitic and antioxidant activities of heartwood extracts and main flavonoids of Hymenaea stigonocarpa Mart International Biodeterioration amp Biodegradation v 79 p9ndash13 2013 MARQUES M C S HAMERSKI L GARCEZ F RTIEPPO C VASCONCELOS M TORRES-SANTOS E C CHANG M GARCEZ W S Vitrobiological screening and evaluation of free radical scavenging activities of medicinal plants from the Brazilian Cerrado Journal of Medicinal Plants Research v 7 n15 p 957-962 2013 MARSAIOLI A J LEITAtildeO FILHO H F CAMPELLO J P Diterpenes in the bark of Hymenea courbaril Phytochemistry v 14 n 8 p1882-1883 1975

58

MARSTON A DUDAN G GUPTA M P SOLIS P N CORREA M D HOSTETTMANN K Screening of Panamanian plants for molluscicidal activity International Journal of Pharmacognosy 34 (1) 15-18 1996 MARTIN S S LANGENHEIM J H ZAVARIN E Sesquiterpenes in leaf pocket resin of Hymenaea courbaril Phytochemistry V 11 p 3049-3051 1972 MARTINS J E C Plantas medicinais de uso na Amazocircnia 2 ed Beleacutem ndash Paraacute Cultural CEJUP 107p 1989 MATUDA T G amp NETTO F M Semente de jatobaacute-do-cerrado caracterizaccedilatildeo quiacutemica Ciecircncia e Tecnologia de Alimentos Campinas v25 n2 p353-357 2005 MAZZEI L J SOUSA-SILVA J C FELFILI J M RESENDE A V FRANCO A C Crescimento de placircntulas de Hymenaea courbaril Lvar stilbocarpa (Hayne) em viveiro Boletim do Herbaacuterio Ezechias Paulo Heringer Brasiacutelia v4 p21-29 1999 MENDONCcedilA R C FELIFILI J M WALTER B M T SILVA JUNIOR M C REZENDE A V FILGUEIRAS T S NOGUEIRA P E Flora vascular do Cerrado In SANO SM ALMEIDA SPde Cerrado ambiente e flora Planaltina EMBRAPA-CPAC P289-556 1998 MORENO M A Estrutura e diversidade clonal de jatobaacute-do-cerrado (Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne) em duas populaccedilotildees no Cerrado do Estado de Satildeo Paulo 115p Dissertaccedilatildeo de Mestrado (Recursos Florestais) ndash Escola superior de Agricultura Luiz de Queiroz Piracicaba 2009 MOULARI B PELLEQUER Y LBOUTOUNNE H GIRARD C CHAUMONT J P MILLET J MUYARD F Isolation and in vitro antibacterial activity of astilbin the bioactive flavanone from the leaves of Harungana madagascariensis Lam ex Poir (Hypericaceae) Journal of Ethnopharmacology v 106 p 272ndash278 2006 NAKANO T amp DJERASSI C Terpenoids XLVI Copalic Acid Journal of Organic Chemistry v 26 p167ndash173 1961 NETO G G O saber tradicional pantaneiro as plantas medicinais e a educaccedilatildeo ambiental Revista eletrocircnica do Mestrado de Educaccedilatildeo Ambiental v 17 p 71-89 2006 NOGUEIRA R T SHEPHERD G J LAVERDE A MARSAIOLI A J amp IMAMURA P M Clerodane-type diterpenes from the seed pods of Hymenaea courbaril var stilbocarpa Phytochemistry v 58 n8 1153ndash7 2001 NORIN T APLIN R T HALSALL T G The chemistry of triterpenes and related compounds Part XLIII The constituents of the bark of Platanus x hybrida Brot and the structure of platanic acid Journal Chemical Society v 1963 p 3269-3273 1963

59

OrsquoKENNEDY R amp THORNES RD Coumarins biology applications and mode of action New York John Willey 1997 ORSI P R BONAMIN F SEVERI J A SANTOS R C VILEGAS W HIRUMA-LIMA C A DI STASI L C ldquoHymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne A Brazilian medicinal plant with gastric and duodenal anti-ulcer and antidiarrheal effects in experimental rodent modelsrdquo Journal of Ethnopharmacology no143 pp81ndash90 2012 OURISSON G KHOO S F OEHLSCHLAGER A C Structure and stereochemistry of the diterpenes of Hymenaea courbaril (Caesalpinioideae) seed pod resin Tetrahedron v29 n21 p3379-88 1973 PANIZZA S Plantas que curam (cheiro de mato) 15 ed Satildeo Paulo IBRASA 279p 1998 PEIXOTO E C M FIGUEIREDO P A SILVA L P SILVA R M Antioxidant activity and phenol content and flavonoids total of the Hymenaea stigonocarpa Mart and Hymenaea courbaril L Planta Medica v79 2013 PETACCI F FREITAS S S OLIVEIRA O M M F FERNANDES J B KHALIL N M BRUNETTI I L Efeito do flavononol astilbina sobre a atividade da mieloperoxidase In Reuniatildeo Anual da Sociedade Brasileira de Quiacutemica 31 2008 Aacuteguas de Lindoacuteia ndash SP PETTIT G MENG Y STEVENSON C DOUBEK D KNIGHT J CICHACZ Z PETTIT R CHAPUIS J SCHMIDT J Isolation and structure of palstatin from the Amazon tree Hymenaea palustris Journal of Natural Products v66 p259-262 2003 POLHILL R M amp RAVEN P H Advances in Legume Systematics Kew Royal Botanic Gardens v1 1981 RAKHOLIYA K amp CHANDA S In vitro interaction of certain antimicrobial agents in combination with plant extracts against some pathogenic bacterial strains Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine v2 n3 p1466ndash1470 2012 RAMOS K M O FELFILI J M SILVA J C S FAGG C W FRANCO A C Desenvolvimento inicial de Placircntulas de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne sob diferentes condiccedilotildees de sombreamento Brasil Florestal Brasiacutelia-DF v 1 n 1 p 1-1 2004 RIZZINI C T Plantas do Brasil - Aacutervores e madeiras uacuteteis do Brasil manual de dendrologia brasileira Satildeo Paulo Edgard Bluumlcher 296 p1971 RODRIGUES V E G amp CARVALHO D A Levantamento etnobotacircnico de plantas medicinais no domiacutenio do cerrado na regiatildeo do Alto Rio Grande ndash Minas Gerais Ciecircncia e Agrotecnologia v25 n1 p102-123 2001

60

SANTANA A L B D MARANHAtildeO O C A SANTOS J C CUNHA F M CONCEICcedilAtildeO G M BIEBER LW NASCIMENTO M S Antitermitic activity of extractives from three Brazilian hardwoods against Nasutitermes corniger International Biodeterioration amp Biodegradation v 64 p 7-12 2010 SASAKI K MATSUKURAY SHIJIMA K MIYAKE M FUJIWARA D KNISHI Y High-performace liquid chromatographic purification of oligomeric procyanidins timers up to nonamers derived from the bark of jatoba (Hymenaea courbaril) Biosci Biotechnol Biochem v73 n6 p 1274-1279 2009 SCALBERT A Quantitative methods for the estimation of tannins in plant tissues In HEMINGWAY R W LAKS P E Plant Polyphenols New York Plenum Press p 259-280 1992 SCHWANTS H O amp WEBERLING F Taxionomia vegetal Satildeo Paulo Ed Pedagoacutegica e Universitaacuteria Ltda p 72-73 1981 SILVA M E G C GUIMARAES A L OLIVEIRA A P SIQUEIRA FILHO J A FONTANA A P DAMASCENO P K F BRANCO C R C BRANCO A ALMEIDA J R G S HPLC-DAD analysis and antioxidant activity of Hymenaea martiana Hayne (Fabaceae) journal of Chemical and Pharmaceutical Research v24 n2 p1160-1166 2012 SILVA M E G C OLIVEIRA A C B BATISTA C C M ARAUJO L C RODRIGUES P S FONTANA A P ALMEIDA J R G S Fenoacuteis totais e atividade antioxidante in vitro de Hymenaea martiana Hayne (Fabaceae) In XXI Simpoacutesio de Plantas Medicinais do Brasil Joatildeo Pessoa-PB 2010 SILVA M E G C OLIVEIRA A C B GUIMARAES S P G S OLIVEIRA A L A P NUNES X P ALMEIDA J R G S Atividade antinociceptiva das fases obtidas por particcedilatildeo do extrato etanoacutelico de Hymenaea martiana (Fabaceae) In VI Jornada de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica da UNIVASF Juazeiro-BA 2011 SILVA R B L A etnobotacircnica de plantas medicinais da comunidade quilombola de Curiauacute Macapaacute - AP Dissertaccedilatildeo de Mestrado Programa de Poacutes-graduaccedilatildeo em Agronomia Universidade Federal Rural da Amazocircnia 2002 SILVA S R SILVA A P MUNHOZ C M SILVA JUNIOR M C MEDEIROS MB Guia de plantas do cerrado utilizadas na Chapada dos Veadeiros Brasilia 2001 SIMOtildeES K D U J PESSONI R A B CARDOSO-LOPES E M VIVANCO J M STERMITZ F R BRAGA M R Ipomopsin and hymenain two biscoumarins from seeds of Hymenaea courbaril Phytochemistry Letters v2 p59ndash62 2009 SOUZA A C M KATO L SILVA C CIDADE A OLIVEIRA C M A SILVA M R R Antimicrobial activity of Hymenaea martiana towards dermatophytes and Cryptococcus neoformans Mycoses Nov 53(6) 500-3 2010

61

SOUZA C D FELFILI J M Uso de plantas medicinais na regiatildeo de Alto Paraiacuteso de Goiaacutes GO Brasil Acta bot bras v 20 n1 p135-142 2006 STERN J L HAGERMAN A E STEINBERG P D MASON P K Phlorotannin-protein interactions Journal of Chemical Ecology v22 p1887-1899 1996 STUBBLEBINE W H amp LANGENHEIN JH Effects os hymenaea courbaril leaf resin on the the generalist herbivoreSpodoptera exigua (beet armyworm) J Chem Ecol 3 633-647 1977 SUZUKI R MATSUSHITA Y IMAI T SAKURAI M JESUS S J M H OZAKI K FUKUSHIMA Z F K Characterization and antioxidant activity of Amazonian Woods J Wood Sci v54 p174ndash178 2008 TAKAGI K ITOH S NASU S YAMADA S NOMURA S SHIMOMURA K ONISHI K Anti-inflammatory effect and pigmentation inhibitory effect of the pericarp of Jatoba (Hymenaea courbaril L) Nature Medicine v 56 p108-112 2002 TAKAGI K SHIMOMURA K KOIZUMI Y MITSUNAGA T ABE I Tyrosinase inhibitors from the pericarp of Jatoba (Hymenaea courbaril L) Nat Med v 53 p 15-21 1999 TERRAS F R G SCHOOFS H M E THEVISSEN H M E BROEKAERT W F Synergistic enhancement of the antifungal activity of wheat and barley thionins by radish and oilseed rape 2S albumins and by barley trypsin inhibitors Plant Physiology v103 p1311-1319 1993 TORSSEL B G Natural product chemistry A mechanistic and biosynthetic approach to secondary metabolism New York John Willey p 401 1989 VALENTIM A P T Atividade Antimicrobiana Estudo Fitoquiacutemico e Identificaccedilatildeo de Constituintes Apolares do Alburno de Hymenaea stigonocarpa Mart Ex Hayne (Jatobaacute) Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Biotecnologia de Produtos Bioativos) ndash Departamento de Antibioacuteticos Universidade Federal de Pernambuco Recife 109 f 2006 VALERIANO J J L OLIVEIRA LS NASCIMENTO M S XIMENES E A Estudo quiacutemico e atividade antimicrobiana do extrato em ciclohexano do alburno de Hymenaea stigonocarpa In 33a Reuniatildeo Anual da Sociedade Brasileira de Quiacutemica aacuteguas de Lindoacuteia 2010 VEIGA JUNIOR V F PINTO A C MACIEL M A M Plantas medicinais cura segura Quiacutemica nova Satildeo Paulo v28 n3 p519-528 2005 VILA VERDE G M PAULA J R CANEIRO D M Levantamento etnobotacircnico das plantas medicinais do cerrado utilizadas pela populaccedilatildeo de Mossacircmedes (GO) Revista Brasileira de Farmacognosia v13 p 64-66 2003 WAGNER H ULRICH-MERZENICH G Synergy research approaching a new generation of phytopharmaceuticals Phytomedicine v 16 n 2 p 97-110 2009

62

WIEMER D F amp HUBBEL S P Host plant selection by an attine ant In JAISSON P (Ed) Social insects in the tropics Paris Universiteacute Paris-Nordp 133-153 1983 ZHANG Y amp LEWIS K Fabatins new antimicrobial plant peptides FEMS Microbiological Letters v149 p59-64 1997

63

3 CARACTERIZACcedilAtildeO BOTAcircNICA FITOQUIacuteMICA E AVALIACcedilAtildeO DA ATIVIDADE

ANTIBACTERIANA DOS EXTRATOS E FRACcedilOtildeES DA CASCA DO CAULE DE

Hymenaea stigonocarpa MART EX HAYNE


A utilizaccedilatildeo de plantas medicinais tem suas raiacutezes fortemente ligadas agrave

cultura indiacutegena e a colonizaccedilatildeo europeia Essa influecircncia contribuiu para o

enriquecimento da cultura popular e serviu como alicerce para os estudos cientiacuteficos

(MARTINS et al 1994) Entretanto atualmente as pesquisas relacionadas agrave accedilotildees

terapecircuticas de plantas medicinais no Brasil ainda satildeo incipientes (VEIGA JUacuteNIOR

PINTO 2005) continuando a maioria das espeacutecies brasileiras sem qualquer

avaliaccedilatildeo principalmente referente agraves propriedades farmacoloacutegicas (PINTO et al

2002)

A criaccedilatildeo da Poliacutetica Nacional de Praacuteticas Integrativas e Complementares no

SUS criada pelo ministeacuterio da sauacutede em 2006 tendo como um dos focos a

fitoterapia como praacutetica terapecircutica levou ao aumento no consumo de medicamentos

a base de produtos naturais (KLEIN et al 2009)

Esse aumento tambeacutem pocircde ser associado ao fato de que as populaccedilotildees

questionam os perigos do uso irracional dos medicamentos alopaacuteticos associados a

seus custos muitas vezes dispendiosos e procuram substituiacute-los pelo uso de plantas

medicinais A comprovaccedilatildeo da accedilatildeo terapecircutica associada agrave insatisfaccedilatildeo da

populaccedilatildeo perante o sistema de sauacutede tem favorecido essa dinacircmica (TOMAZZONI

et al 2006)

A descoberta e o desenvolvimento dos processos de siacutentese a partir de

moleacuteculas isoladas de produtos naturais para a produccedilatildeo de faacutermacos culminaram

com a introduccedilatildeo no mercado de diversos medicamentos Entretanto devido aos

efeitos colaterais destas moleacuteculas sinteacuteticas e dos altos custos houve um resgate

incentivado pela Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede para a pesquisa e aplicaccedilatildeo de

fitoteraacutepicos (VOLAK STODOLA 1990)

As plantas tecircm uma capacidade quase ilimitada para sintetizar substacircncias

aromaacuteticas a maioria das quais satildeo fenoacuteis ou derivados oxigecircnio-substituiacutedo

(COWAN 1999) A pesquisa de novos medicamentos originados a partir de plantas

64

medicinais deve ser iniciada a partir de uma seleccedilatildeo baseada em alguns criteacuterios

Esta seleccedilatildeo pode ser baseada no conhecimento antecipado de efeitos terapecircuticos

como a pesquisa etnofarmacoloacutegica que utiliza o conhecimento preacute-existente nas

comunidades nativas por acesso a bancos de moleacuteculas disponiacuteveis ou por

pesquisa aleatoacuteria com espeacutecies existentes e disponiacuteveis em local previamente

escolhido (MARINHO 2008)

Na deacutecada de 80 em todo o mundo foram identificados 121 compostos de

origem vegetal provenientes de 95 espeacutecies os quais tecircm sido usualmente

empregados como produtos terapecircuticos nos paiacuteses ocidentais Quanto aos

medicamentos aprovados para comercializaccedilatildeo no periacuteodo de 1983-1994 6 foram

obtidos diretamente de espeacutecies vegetais 24 satildeo compostos derivados e 9

foram desenvolvidos a partir de compostos de vegetais cuja estrutura molecular

serviu como unidade precursora em processo de siacutentese (MARASCHIN e

VERPOORTE 1999)

No periacuteodo entre 2005 e 2010 um total de 19 medicamentos agrave base de

produtos naturais foram aprovados para comercializaccedilatildeo em todo o mundo entre os

quais sete satildeo classificadas como produtos naturais dez produtos naturais

semissinteacuteticos e dois como drogas derivadas de produtos naturais (MISHRA 2011)

Satildeo exemplos de medicamentos sinteacuteticos desenvolvidos a partir de

moleacuteculas oriundas do metabolismo secundaacuterio das plantas a procaiacutena cloroquina

vimblastina vincristina podofilotoxina taxol e camptotecina (PINTO et al 2002)

Dados atualizados satildeo escassos poreacutem segundo o Ministeacuterio da sauacutede

(2006) tomando como referecircncia o ano de 1996 descreve que a quarta parte dos

oito bilhotildees de doacutelares do faturamento da induacutestria farmacecircutica nacional foram

resultantes de medicamentos derivados de produtos vegetais Entretanto apenas

8 das espeacutecies botacircnicas brasileiras foram estudadas com o objetivo de obter

moleacuteculas bioativas

Apesar das vantagens relatadas anteriormente introduzir um novo

medicamento na terapecircutica eacute um processo longo e bastante oneroso Todo o

processo de pesquisa e desenvolvimento dura cerca de doze anos com

probabilidade de sucesso muito pequena (LIMA et al 2003)

As propriedades medicinais apresentadas pelas plantas se devem a

variedade e complexidade de seus metaboacutelitos Estes metaboacutelitos secundaacuterios os

quais satildeo produzidos como mecanismo de defesa dos vegetais agraves condiccedilotildees

65

ambientais e a presenccedila de micro-organismos insetos ou animais (MONTARI e

BOLZANI 2001)

Os metaboacutelitos secundaacuterios de vegetais superiores apresentam uma ampla

diversidade estrutural e distribuiccedilatildeo muito variada em vaacuterias partes da planta Por

representar uma interface quiacutemica entre a planta e o ambiente circundante sua

siacutentese eacute frequentemente influenciada por fatores relacionados agrave fisiologia da proacutepria

planta e mudanccedilas ambientais

Os metaboacutelitos secundaacuterios frequentemente estatildeo restritos a uma espeacutecie ou

gecircnero vegetal e muitas vezes podem ser ativados somente durante um

determinado estaacutegio do desenvolvimento vegetal em estaccedilotildees especiacuteficas do ano

sob condiccedilotildees de estresse ou de restriccedilatildeo hiacutedrica ou de nutrientes (LOURENCcedilO

2003 GOBBO-NETO LOPES 2007)

A pesquisa relacionada a moleacuteculas bioativas de origem vegetal constituem

uma estrateacutegia para inovaccedilatildeo farmacecircutica e competitividade neste setor tendo em

vista a singularidade estrutural das substacircncias encontradas sua importacircncia como

protoacutetipos moleculares para o desenvolvimento de novos faacutermacos e sua

perspectiva de patenteamento (OLIVEIRA 2003)

Varias atividades satildeo comprovadamente atribuiacutedas a moleacuteculas de origem

natural principalmente as obtidas a partir de plantas Sendo as atividades

antinociceptiva anti-inflamatoacuteria antioxidante anticacircncer anti-hipertensiva

antidiabeacutetica e antimicrobiana as mais frequentemente relatadas (BORGES et al

2013 ASMAWI et al 2013 LIMA et al 2012 MISHRA et al 2013)

Devido agrave raacutepida disseminaccedilatildeo dos micro-organismos multidrogas resistentes


al 2002)

Assim as pesquisas tecircm se intensificado no Brasil devido agrave diversidade de

espeacutecies presentes na flora brasileira e a necessidade de busca desses novos

agentes (ADEBAJO et al 1989 BRITO BRITO 1993 MIGUEL et al 1996 LIMA

2001) tendo sido assim muitas plantas avaliadas natildeo somente pela atividade



ULRICH-MERZENICH G 2009)

Um indicativo da efetividade dos mecanismos de defesa desenvolvido por

alguns vegetais eacute a reduzida ocorrecircncia de doenccedilas infecciosas em certas plantas

66

As plantas satildeo conhecidas por produzirem uma enorme variedade de moleacuteculas

com atividade antimicrobiana geralmente classificada como fitoalexinas Sua

composiccedilatildeo quiacutemica eacute diversificada apresentando terpenoacuteides glicosteroacuteides

flavonoacuteides e polifenoacuteis (HEMAISWARYA 2008)






(SCALBERT 1992) e cumarinas (OrsquoKENNEDY THORNES 1997)

Compostos isolados de plantas satildeo substacircncias cuja estrutura quiacutemica

muitas vezes apresentam grandes diferenccedilas estruturais em relaccedilatildeo aos

antibioacuteticos derivados de micro-organismos Estes agentes antimicrobianos isolados

de plantas podem agir como reguladores do metabolismo intermediaacuterio ativando ou

bloqueando reaccedilotildees enzimaacuteticas afetando diretamente as siacutenteses enzimaacuteticas seja

em niacutevel nuclear ou ribossomal ou mesmo alterando estruturas de membranas

(SINGH SHUKLA 1984)

O Brasil eacute um paiacutes de dimensotildees continentais e de grande biodiversidade Os

ecossistemas brasileiros respondem pela maior variedade geneacutetica vegetal do

mundo sendo que 30 das florestas tropicais mundiais estatildeo situadas em territoacuterio

brasileiro (CECHINEL FILHO YUNES 1998) Neste sentido a pesquisa relacionada

a produtos naturais apresenta um grande potencial quanto agrave descoberta de novos

agentes terapecircuticos

Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne (Leguminosae) eacute uma planta

medicinal encontrada no cerrado brasileiro e conhecida popularmente como Jatobaacute-

do-cerrado (BATISTA 2011) As suas cascas do caule satildeo amplamente utilizados

em infusatildeo ou decocccedilatildeo para tratar a dor de estocircmago asma bronquite uacutelceras

diarreia gripe e tosse (GRANDI et al 1989 VILA-VERDE et al 2003 BIESKI et

al2012)

Recentemente foi demonstrada a atividade antidiarreacuteica e accedilatildeo contra uacutelceras

gaacutestricas e duodenais experimentais do extrato metanoacutelico da casca do caule de H

stigonocarpa (ORSI et al 2012)

Estudos fitoquiacutemicos de Hymenaea stigonocarpa mostraram a presenccedila de

terpenos e sesquiterpenos aacutecidos graxos flavonoacuteides e taninos metaboacutelitos

67

reconhecidos pela atividade bioloacutegica (LANGENHEIM HALL 1983 MATUDA

NETO 1985 ORSI et al 2012) Poreacutem poucas pesquisas tem avaliado a atividade

farmacoloacutegica de cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa e estudos sobre a sua

atividade antimicrobiana ainda satildeo escassos (DIMECH et al 2013)

68

32 OBJETIVOS

Os objetivos gerais e especiacuteficos deste estudo satildeo descritos abaixo

321 Objetivo geral

Realizar o estudo fitoquiacutemico e a caracterizaccedilatildeo botacircnica da casca do caule

de Hymenaea stigonocarpa e avaliar a atividade antibacteriana de diferentes

extratos e fraccedilotildees frente a bacteacuterias Gram-positivas e Gram-negativas

322 Objetivos especiacuteficos

Realizar a caracterizaccedilatildeo botacircnica e fitoquiacutemica do material vegetal

Avaliar a atividade antibacteriana dos extratos de Hymenaea stigonocarpa

Determinar as classes de metaboacutelitos secundaacuterios responsaacuteveis pela

atividade antibacteriana e suas concentraccedilotildees

Caracterizar por meio de CLAE-DAD os extratos mais ativos

Observar as alteraccedilotildees ultraestruturais provocadas pelo extrato mais ativo

69

33 MATERIAIS E MEacuteTODOS

Os materiais e meacutetodos deste estudo satildeo descritos a seguir

331 Coleta do material vegetal

Cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne foram

coletadas em outubro de 2009 na Fazenda Refuacutegio localizada na cidade de

Camocim de Satildeo Feacutelix (figura 28) Pernambuco (localizado latitude 8deg213000S e

longitude 35deg475670O)

A identificaccedilatildeo foi realizada pela botacircnica do Instituto Agronocircmico de

Pernambuco Dra A Bocage sendo a exsicata depositada sob o nuacutemero 83563 no

Herbaacuterio Daacuterdano de Andrade Lima pertencente ao mesmo instituto

Figura 28 ndash Local da coleta das cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa

Mart ex Hayne

Fonte httpnlwikipediaorgwikiBestandCamocim_de_SC3A3o_FC3A9lixpng

Na preparaccedilatildeo da mateacuteria-prima vegetal as cascas do caule foram

submetidas agrave secagem em estufa a uma temperatura de 40degC durante 72 horas

em seguida pulverizadas em moinho de martelos (Tigre ASN5) e estocada em

frascos a temperatura ambiente

332 Caracterizaccedilatildeo botacircnica do material vegetal

Amostras de caule jovem e maduro foram coletadas em indiviacuteduo adulto de

Hymenaea stigonocarpa ocorrendo espontaneamente em uma aacuterea do agreste no

municiacutepio de Camocim de Satildeo Feacutelix

Camocim de Satildeo Feacutelix

70

Foram coletados ramos (40 cm de comprimento com ramos jovens e

adultos) os mais expostos ao sol de um indiviacuteduo adulto As amostras foram

acondicionadas em sacos plaacutesticos mantidos em caixa de isopor contendo gelo As

amostras de caule foram fixadas em formaldeiacutedo a 40 aacutecido aceacutetico e etanol 95

(FAA 50) por 48 horas (JOHANSEN 1940)

3321 Anaacutelise microscoacutepica

Secccedilotildees transversais foram obtidas agrave matildeo livre do caule jovem e adulto e da

regiatildeo mediana do peciacuteolo As secccedilotildees foram clarificadas em soluccedilatildeo comercial de

hipoclorito de soacutedio a 50 neutralizadas em aacutecido aceacutetico numa concentraccedilatildeo de

02 lavadas em aacutegua destilada coradas com safranina e azul de astra (Bukatsch

1972) Este material foi montado em glicerina a 50 (Johansen 1940) e as

lamiacutenulas foram entatildeo fixadas Todas as anaacutelises microscoacutepicas foram realizadas

em imagens digitais obtidas sob microscoacutepio oacutetico acoplado com cacircmera digital

utilizando o programa de anaacutelise de imagens Image Tool (Wilcox et al 2002)

3322 Anaacutelise histoquiacutemica

Para a anaacutelise histoquiacutemica parte das secccedilotildees histoloacutegicas jovens e adultas

de indiviacuteduo adulto foram submetidas a reagentes tradicionais para investigaccedilatildeo

histoquiacutemica (a) dicromato de potaacutessio (GABE 1968) para compostos fenoacutelicos

totais (b) vanilina cloriacutedrica (RICCO 2002) para evidenciaccedilatildeo de taninos (c)

Reagente de Neu para evidenciaccedilatildeo de flavonoacuteides (NEU 1956)

333 Caracterizaccedilatildeo fitoquiacutemica do material vegetal

Cerca de 50 g de amostra oriunda da casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa foi submetido agrave extraccedilatildeo exaustiva seriada por maceraccedilatildeo (12 pv) por

periacuteodos de 24 horas com solventes de polaridades crescentes (ciclohexano

acetato de etila etanol e aacutegua) Um extrato hidroalcooacutelico (EH) foi tambeacutem obtido

por maceraccedilatildeo de 60g (12 pv) em etanolaacutegua (11) Uma parte do resiacuteduo seco do

extrato hidroalcooacutelico (5g) foi particionada (11) em aacutegua (FA) e outra parte em

71

acetato de etila (FAE) Posteriormente todos os extratos foram filtrados em papel

Whatman No 1 e evaporados a 50degC sob pressatildeo reduzida com exceccedilatildeo do extrato

aquoso e fraccedilatildeo aquosa que foram liofilizados

Desta forma obtiveram-se cinco extratos Extrato ciclohexano (EC) extrato de

acetato de etila (EAE) extrato etanoacutelico (EE) extrato aquoso (EA) e extrato

hidroalcooacutelico (EH) e duas fraccedilotildees fraccedilatildeo aquosa (FA) e fraccedilatildeo acetato de etila

(FAE)

Todos os extratos foram analisados por cromatografia em camada delgada

(CCD) quanto agrave presenccedila de alcaloacuteides flavonoacuteides terpenoacuteides aacutecido gaacutelico

fenilpropanoglicosiacutedeos cumarinas taninos condensados e hidrolisaacuteveis accediluacutecares e

quinonas Para obtenccedilatildeo de soluccedilotildees com concentraccedilotildees padronizadas todos os

extratos foram solubilizados na concentraccedilatildeo de 05

Volumes de 15 μL de cada extrato EC EAE EE EA EH FA FAE foram

utilizados para a realizaccedilatildeo de cada CCD utilizando-se placas de gel de siacutelica

(Merck -105553) As anaacutelises foram realizadas a partir de diferentes sistemas de

eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv) EtOAcndashHCOOHndash

AcOHndashH2O (100 05 05 05 vv ) Et2O-tolueno-AcOH 10 (50 50 50 vv )

ToluenondashAcOEt (97 3 vv) n-BuOH-Me2CO-tampatildeo fosfato pH = 50 (40 50 10

vv) e AcOEt ndash MeOH ndash H2O (81 11 8 vv) e revelados utilizando diferentes

substacircncias (Quadro1)

Quadro 1 - Metaboacutelitos secundaacuterios pesquisados sistemas de eluiccedilatildeo e reveladores

utilizados na avaliaccedilatildeo fitoquiacutemica da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa

METABOacuteLITO ELUICcedilAtildeO REVELADOR RESULTADO

POSITIVO REFEREcircNCIA

Alcaloacuteides

A Dragendorff Coloraccedilatildeo Laranja (WAGNER 1996)

Monoterpenoacuteides Sesquiterpenoacuteides e

Diterpenoacuteides B Vanilina sulfuacuterica

Coloraccedilatildeo Azul escura

(WAGNER 1996)

Triterpenoacuteides e Esteroacuteides C Liebermann

Burchard Coloraccedilatildeo rosa a

vermelho (UV) (SHARMA 1991)

72

A - EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv) B - ToluenondashAcOEt (97 3 vv) C - EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 05 05 05 vv ) D - Et2O-tolueno-AcOH 10 (50 50 50 vv ) E - n-BuOH-Me2CO-tampatildeo fosfato pH = 50 (40 50 10 vv) F - AcOEt ndash MeOH ndash H2O (81 11 8 vv) Soluccedilatildeo metanoacutelica de 2- aminoetil difenilborinato 1 e soluccedilatildeo etanoacutelica de polietilenoglicol 5



Iridoacuteides

A Vanilina sulfuacuterica Coloraccedilatildeo violeta (HARBONE 1998)

Saponinas

A Anisaldeiacutedo Coloraccedilatildeo verde

escura (WAGNER 1996)

Glicosiacutedeos cardiacuteacos

F KEDD Coloraccedilatildeo Violeta

a azul-violeta (WAGNER 1996)

Cumarinas

E Anaacutelise por UV Surgimento de

fluorescecircncia azul (UV)

(WAGNER 1996)

Derivados cinacircmicos

A NEU

Surgimento de

fluorescecircncia (UV) (WAGNER 1996)

Fenilpropanoglicosiacutedeos

A NEU

Surgimento de fluorescecircncia

verde limatildeo (UV) (WAGNER 1996)

Flavonoacuteides

A NEU


laranja verde e amarela (UV)

(MARKHAM 1982)

(HARBORNE 1998)

Taninos condensados A Vanilina

Cloriacutedrica

Coloraccedilatildeo vermelha

(ROBERTSON 1955)

Taninos hidrolisaacuteveis

A NEU

Negro (Visiacutevel) Fluorescecircncia azul

(UV) (NEU 1956)

Accediluacutecares

D Cloridrato de

235 Trifeniltetrazoacutelio

Coloraccedilatildeo avermelhada

(WALLENFELS 1950)

73

334 Quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis e taninos totais

A quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis e taninos totais foram realizados como descrito

na Farmacopeacuteia Europeacuteia como descrito a seguir

3341 Quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis totais

A Quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis totais foi realizada de acordo com o meacutetodo de

Folin-Ciocalteu como descrito na Farmacopeacuteia Europeacuteia (2005) Os extratos e

fraccedilotildees da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa EAE EE EA EH FA FAE

foram solubilizados em etanol (10) para obtenccedilatildeo de uma concentraccedilatildeo final de

500 microgmL Cinco mililitros de cada soluccedilatildeo foram diluiacutedos para 25 ml com aacutegua

destilada Destas soluccedilotildees 2 mL foram transferidos para um balatildeo volumeacutetrico

contendo aacutegua destilada (10 ml) e depois foi adicionado 1mL do reagente de Folin-

Ciocalteu natildeo diluiacutedo sendo o volume finalmente completado para 25 mL com

Na2CO3 (10 vv)

A soluccedilatildeo foi mantida a temperatura ambiente (25ordmC) por 30 minutos quando

a absorbacircncia das amostras foi lida a 760 nm em um espectrofotocircmetro UVVis

(Evolution 60S Thermo Scientific) Aacutegua destilada foi usada como branco

A concentraccedilatildeo de polifenoacuteis totais foi determinada pela extrapolaccedilatildeo da

curva de calibraccedilatildeo a qual foi obtida a partir das soluccedilotildees de aacutecido gaacutelico (Sigma

Chemical Co St Louis USA) que variaram entre 20 ndash 80120583gmL A concentraccedilatildeo

polifenoacuteis totais foi calculada em triplicata foi expresso em miligramas de equivalente

de aacutecido gaacutelico por grama de amostra seca

3342 Determinaccedilatildeo de taninos totais

Com o objetivo de determinar os taninos totais 100 mg de caseiacutena (Merckreg)

foi adicionada a 10 mL de cada extrato ou fraccedilatildeo sendo a mistura homogeneizada

por 60 minutos e depois filtradas em papel de filtro Whatman No 1 O procedimento

para determinaccedilatildeo dos taninos foi similar ao descrito no item 341

O conteuacutedo de polifenoacuteis nas fraccedilotildees natildeo tanantes foi calculado pela curva

padratildeo de aacutecido gaacutelico A concentraccedilatildeo de taninos totais foi calculada como

Taninos totais = polifenois totais ndash polifenois natildeo tanantes

74

3343 Anaacutelise por Cromatografia Liquida de alta Eficiecircncia (CLAE)

Cromatogramas dos extratos e fraccedilotildees da casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa que apresentaram os maiores teores de taninos e atividade

antibacteriana (EE EH e FA) foram obtidos por Cromatografia Liquida de alta

Eficiecircncia com arranjo de diodos (CLAE-DAD)

Os extratos e o padratildeo astilbina foram solubilizados em metanol para a

obtenccedilatildeo de soluccedilotildees de concentraccedilatildeo de 400 microgmL e 25microgmL respectivamente

Essas soluccedilotildees foram filtradas em membrana de politetrafluoetileno de 020 microm

(Chromafilreg) e depois adicionadas frascos acircmbar As anaacutelises foram realizadas em

equipamento CLAE-DAD (Ultimatereg 3000 Thermo Scientificreg) equipado com bomba

binaria HPG-3x00RS 3000 (RS) detector de arranjo de diodo e coletor de amostra

automaacutetico ACC-3000

As separaccedilotildees foram realizadas com uma coluna (C18) 256 x 46 mm di 5

microm (Acclaim 120 Dionexreg) equipada com (C18 4 x 3 mm di Phenomenexreg) A fase

moacutevel foi composta por aacutegua MiliQreg (eluente A) e acetonitrila (eluente B Tediareg)

ambos acidificados com 01 de soluccedilatildeo de aacutecido trifluoroaceacutetico variando de 10-

23 em 35 min para 23ndash90 em 50 min do eluente B a um fluxo de 1mLmin O

software Chromeleon 60 (Dionexreg) foi utilizado para processamento e aquisiccedilatildeo dos

dados

335 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana

A avaliaccedilatildeo da atividade antibacteriana foi realizada a partir do estudo com

diferentes estratos e fraccedilotildees

3351 Preparaccedilatildeo das amostras

Para determinaccedilatildeo da atividade antimicrobiana da casca do caule de H

stigonocarpa foram avaliados os cinco extratos ciclohexanico (EC) acetato de etila

(EAE) etanoacutelico (EE) aquoso (EA) hidroalcooacutelico (EH) e as fraccedilotildees obtidas por

particcedilatildeo do extrato Hidroalcooacutelico o de acetato de etila (FAE) e o de Aacutegua (FA)

75

3352 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana in vitro

A determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana in vitro foi realizada como descrito

a seguir

33521 Agentes antimicrobianos

O laboratoacuterio Eurofarma forneceu oxacilina ciprofloxacina teicoplanina e o

laboratoacuterio Sanofi-Aventis a polimixina B A resistecircncia foi definida para cada caso a

oxacilina (OXA MIC ge 4μgmL) ciprofloxacina (CIP MIC ge 1μgmL) teicoplanina

(TEI ge 32 μgmL) e polimixina B (POL MIC ge 8μgmL) de acordo com os criteacuterios

estabelecidos pelo Clinical Laboratory standard Institute (2012)

Os extratos EC e EAE foram solubilizados em dimetil sulfoacutexido - Tween80 -

aacutegua (118 vv) EE EAE EH FAE e FA em etanol-aacutegua (19 vv) enquanto que os

agentes antimicrobianos foram solubilizados em aacutegua As soluccedilotildees de estoque

foram esterilizados por filtraccedilatildeo atraveacutes de uma membrana Millipore com uma

porosidade de 022 microm

33522 Micro-organismos e padronizaccedilatildeo dos inoacuteculos

Bacteacuterias (n = 28) foram obtidas de culturas estoque e mantidas em nosso

laboratoacuterio (Laboratoacuterio de Fisiologia e Bioquiacutemica de Micro-organismos - LFBM) em

meio Mueller Hinton Agar sob oacuteleo mineral Para este estudo foram usadas as

seguintes cepas bacterianas isoladas de amostras cliacutenicas Staphylococcus aureus

(LFBM05 UFPEDA 01 AM 02 AM 04 AM 05 LFBM 25 AM 13 AM 18 AM 19 and

AM 21) Enterococcus faecalis (245 272 292 e 335) Klebsiella pneumoniae LFBM

01 Pseudomonas aeruginosa LFBM 01 Proteus mirabilis LFBM 01 e LFBM 02

Salmonella enterica LFBM 01 Shigella sonnei LFBM 01 e Vibrio cholera LFBM 01

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus aureus ATCC 33591

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Escherichia coli ATCC 25922 e Escherichia coli ATCC 35218 foram usadas como

cepas padratildeo

Esses micro-organismos foram cultivados em caldo Mueller Hinton por um

periacuteodo de 18h a 37deg C e em seguida foram cultivados em agar Mueller Hinton (AMH)

76

(Acumedia Manufacturers Baltimore USA) sendo incubados a 37∘C por 18 horas

Algumas colocircnias foram selecionadas e inoculadas em caldo Mueller Hinton

(Acumedia Manufacturers Baltimore USA) para comparaccedilatildeo da turbidez com

padrotildees 05 McFarland os quais satildeo equivalentes a contagem de aproximadamente

108 UFCmL Posteriormente essas suspensotildees bacterianas foram diluiacutedas para

obtenccedilatildeo de um inoculo de 107 UFCmL

33523 - Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo

bactericida miacutenima (CMB)

A Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) foi determinada pelo meacutetodo de

microdiluiccedilatildeo em caldo seguindo as recomendaccedilotildees estabelecidas pela Clinical

Laboratory Standards Institute (CLSI 2012) com algumas modificaccedilotildees Os ensaios

foram realizados em microplacas esteacutereis de 96 poccedilos com fundo em forma de ldquoUrdquo

Inicialmente as soluccedilotildees estoque dos extratos e agentes antimicrobianos na

concentraccedilatildeo de 2048 microgmL foram esterilizadas por filtraccedilatildeo atraveacutes de membranas

de porosidade de 022 microm milipore reg em seguida um volume de 200 microL foi

adicionado nos poccedilos de 1 a 12 da linha A Os demais poccedilos foram preenchidos

inicialmente apenas com 100 microL de caldo Mueller-Hinton

Logo apoacutes foi realizada transferecircncia de 100microL do conteuacutedo dos poccedilos da

linha A para os da linha B e assim sucessivamente ateacute a linha H sendo desprezados

os uacuteltimos 100 microL obtendo-se assim concentraccedilotildees decrescentes dos extratos

(1024 a 781 gmL)

Apoacutes a diluiccedilatildeo dos extratos e agentes antimicrobianos foi acrescido em

todos os poccedilos um volume de 5 microL dos inoacuteculo microbiano padronizado As

microplacas foram incubadas em estufa bacterioloacutegica a 37degC por 24 horas

Foi considerado crescimento total (100) na placa controle onde foi

adicionado apenas caldo Muller Hinton e os inoacuteculos A reduccedilatildeo do crescimento foi

avaliado nos orifiacutecios onde foram adicionados os extratos

Para determinar a Concentraccedilatildeo Bactericida Miacutenima (CBM) os conteuacutedos

dos poccedilos que mostraram inibiccedilatildeo de crescimento foram semeados em MHA Apoacutes

24h de incubaccedilatildeo a 37degC o nuacutemero de micro-organismos viaacuteveis foi determinado A

CMB foi definida como a menor concentraccedilatildeo do extrato em que 999 da

77

populaccedilatildeo foram inviabilizadas Todos os experimentos foram realizados em

duplicata em dias diferentes

Apoacutes a realizaccedilatildeo da avaliaccedilatildeo quantitativa foi realizada a determinaccedilatildeo da

viabilidade dos micro-organismos por comprovaccedilatildeo atraveacutes da adiccedilatildeo de soluccedilatildeo

aquosa a 05 de cloridrato de 235 trifeniltetrazoacutelio (TTC)

As microplacas foram novamente incubadas por mais trecircs horas a 37degC Apoacutes

esse intervalo de tempo a leitura da placa foi realizada a presenccedila de uma

coloraccedilatildeo vermelha nos poccedilos foi interpretada como prova negativa do efeito

inibitoacuterio do extrato ou seja houve crescimento bacteriano enquanto que a

ausecircncia de cor foi considerada prova positiva da accedilatildeo antimicrobiana dos extratos

A CIM foi definida como sendo a menor concentraccedilatildeo da droga antimicrobiana que

impede o crescimento visiacutevel do micro-organismo semeado

336 Anaacutelise ultraestrutural

Staphylococcus aureus ATCC 33591 na concentraccedilatildeo de 104 UFCmL foi

cultivado em caldo Muller Hinton (grupo controle) e em caldo adicionado de extrato

hidroalcooacutelico a 256 e 128 microgmL (CIM e frac12 CIM) respectivamente Apoacutes isso as

culturas foram incubadas a 37degC por 24 horas Essas culturas foram centrifugadas e

os precipitados foram fixados em paraformaldeiacutedo 4 e glutaraldeido 25 em 01

M de tampatildeo cacodilato de soacutedio (pH 72) por 4 horas a temperatura ambiente

Os precipitados foram lavados e centrifugados por 10 minutos no mesmo

tampatildeo Sendo esse procedimento repetido por trecircs vezes Posteriormente os

precipitados foram poacutes-fixados em tetroacutexido de oacutesmio 2 ferrocianeto de potaacutessio

08 e cloreto de caacutelcio 5 mM em tampatildeo cacodilato de soacutedio 01 M por 1 hora e

lavada em tampatildeo cacodilato de soacutedio

As amostras foram desidratadas utilizando gradientes de soluccedilotildees de acetona

e depois adicionadas agrave resina Epon 812 (Sigma EUA) Em seguida seccedilotildees

ultrafinas foram obtidas atraveacutes de um ultramicrotomo (Leica UC6) coradas com

acetato de uranila e citrato de chumbo e examinado em microscoacutepio eletrocircnico de

transmissatildeo Morgani-FEIreg

78

37 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA

A anaacutelise estatiacutestica foi realizada utilizando Anova one-way e teste de

comparaccedilatildeo muacuteltiplas Newman-Keuls usando o software GraphPad Prism versatildeo

50 para Windows GraphPad Software (San Diego CA) e p lt 005 foi usado como

niacutevel de significacircncia

79

34 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

Os resultados obtidos neste estudo estatildeo descritos a seguir


A descriccedilatildeo dos aspectos anatocircmicos do material vegetal eacute um importante

passo para caracterizaccedilatildeo e padronizaccedilatildeo dos espeacutecimes vegetais que servem de

mateacuteria prima para a produccedilatildeo de medicamentos Assim apoacutes avaliaccedilatildeo

farmacobotacircnica foi possiacutevel observar que o caule de Hymenaea stigonocarpa

apresentou estrutura semelhante agravequela descrita na literatura para espeacutecies do

gecircnero (WATSON DALLWITZ 2012)

3411 Anatomia

Em uma amostra do caule de Hymeneae stigonocarpa com

aproximadamente 4 mm de diacircmetro a regiatildeo da casca apresentou mais

externamente oito camadas de suacuteber (Figura 29) constituiacutedo por ceacutelulas achatadas

periclinalmente (paralelas agrave superfiacutecie do caule)

Figura 29 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo

adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando a regiatildeo do

suacuteber corada com safranina e azul de astra

SB ndash suacuteber (aumento de 400x)

Imediatamente abaixo do suacuteber foi encontrada uma faixa estreita constituiacuteda

por apenas uma camada de ceacutelulas o felogecircnio tecido indiferenciado que origina o

suacuteber para fora e a feloderme para dentro (Figura 30) A feloderme estava

constituiacuteda por duas camadas apoacutes o feloderme foi encontrado o parecircnquima

cortical com 10 camadas de ceacutelulas O conjunto destes tecidos secundaacuterios

constitui a periderme

SB

80

Figura 30 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto

de Hymenaea stigonocarpa mostrando a regiatildeo do suacuteber

felogecircnio feloderma e parecircnquima cortical corados com

safranina e azul de astra

FG- Felogecircnio FD-Feloderme PC-Parecircnquima cortical CS- Canal secretor (aumento 100x)

Na regiatildeo da feloderme foram encontrados canais de secreccedilatildeo com

revestimento interno de ceacutelulas pequenas e achatadas periclinalmente (Figura 31)


adulto de Hymenaea stigonocarpa mostrando parecircnquima

cortical esclerecircnquima e floema corados com safranina e

azul de Astra

S- Canal secretor CP ndash ceacutelulas pequenas EC ndash esclerecircnquima FL ndash Floema Aumento 100x

Mais internamente apoacutes a feloderme foram observados grupos de fibras de

esclerecircnquima em forma de feixe Apoacutes o faixa de esclerecircnquima eacute observada a

presenccedila do floema tecido responsaacutevel pela conduccedilatildeo da seiva elaborada

Foram encontradas cavidades secretoras em maior quantidade no

parecircnquima cortical de porccedilotildees jovens dos ramos se comparadas agraves porccedilotildees

adultas Em estrutura secundaacuteria o nuacutemero dessas cavidades se mostrou bastante

FG

FD PC

CS

CS ECCC

FL

CP

81

reduzido isto pode ser devido ao esmagamento de algumas dessas cavidades em

consequecircncia da pressatildeo radial exercida pelo crescimento da feloderme e da

atividade do cacircmbio

3412 Histoquiacutemica

Na analise histoquiacutemica foi realizada a avaliaccedilatildeo da presenccedila de polifenoacuteis e

taninos

34121 Avaliaccedilatildeo de Polifenoacuteis

Foi observada a ocorrecircncia de polifenoacuteis nos elementos feloderme

parecircnquima cortical e floema regiotildees coradas em marrom (Figura 32)


de Hymenaea stigonocarpa mostrando regiotildees coradas com

dicromato de potaacutessio para visualizaccedilatildeo de regiotildees com

conteuacutedos fenoacutelicos

FG- felogecircnio FD ndash feloderme PC- Parenquima cortical EC ndash esclerecircnquima FL ndash Floema (aumento 40x)

A anaacutelise histoquiacutemica da casca do caule forneceu informaccedilotildees quanto agrave

presenccedila e localizaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos evidenciados pela reaccedilatildeo ao

dicromato de potaacutessio e vanilina cloriacutedrica que revelam a presenccedila de compostos

fenoacutelicos totais e taninos respectivamente

FD

FL

FG

EC

PC

82

34122 Detecccedilatildeo da presenccedila de taninos

A avaliaccedilatildeo da presenccedila de taninos foi realizada em caules jovens e adultos

341221 caules jovens

O caule jovem identificado pela presenccedila de pelo tector (figura 33) na regiatildeo

do coacutertex observamos a ocorrecircncia de taninos nos elementos feloderme

parecircnquima cortical e floema (FL) (regiotildees coradas em vermelho)

Figura 33 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo jovem de

Hymenaea stigonocarpa mostrando regiotildees coradas com vanilina

cloriacutedrica visualizaccedilatildeo de regiotildees com conteuacutedos de taninos

PT- Pelo tector FG ndash felogecircnio FL ndash floema (aumento de 100x)

341222 caules adultos

Na regiatildeo do coacutertex de caule adulto (presenccedila de suacuteber) observamos a

ocorrecircncia de taninos nos elementos de felogecircnio feloderme e floema (Figura 34)

FG

FLD

FL

FLD

PT

FLD

83

Figura 34 - Fotomicrografia da casca do caule de ramo adulto de



SB - Suacuteber FG ndash felogecircnio FD-feloderme FL ndash floema (aumento de 40x)

A presenccedila de taninos foi evidenciada em amostras de caule jovens e adultas

indicando a manutenccedilatildeo de sua presenccedila na estrutura no parecircnquima cortical e na

feloderme Isto indica que a produccedilatildeo de taninos eacute continuada nas ceacutelulas de

feloderme produzidas pelo felogecircnio confirmando a avaliaccedilatildeo fitoquiacutemica que

indicou a presenccedila de taninos em amostras de casca de caule

Em virtude da maior espessura de parecircnquima cortical constituiacutedo por ceacutelulas

contendo tanino em ramos mais maduros a extraccedilatildeo da casca nos mesmos implica

na possiacutevel exposiccedilatildeo do floema ao ataque de micro-organismos levando estas

ceacutelulas agrave morte aleacutem de possibilitar sua proliferaccedilatildeo ao longo dos feixes vasculares

e em casos mais extremos podendo levar agrave morte de partes da planta ou do proacuteprio

indiviacuteduo Assim a extraccedilatildeo de taninos poderia ser mais viaacutevel e eficiente atraveacutes de

podas perioacutedicas em ramos mais jovens levando a uma obtenccedilatildeo continuada de

taninos


O rendimento obtido apoacutes a extraccedilatildeo com ciclohexano acetato de etila etanol

e aacutegua foi de 035 265 1198 e 209 respectivamente

FD

SB

FLD

FL

FG

FLD

84

A extraccedilatildeo hidroalcooacutelica levou a um rendimento de 1549 As fraccedilotildees

acetato de etila e aquosa obtidas a partir da fraccedilatildeo hidroalcooacutelica tiveram

rendimentos de 2208 e 57 respectivamente

3421 Anaacutelise fitoquiacutemica

A prospecccedilatildeo fitoquiacutemica nos extratos ciclo hexano acetato de etila etanol eacute

aacutegua atraveacutes de CCD sugere a presenccedila de flavonoacuteides accedilucares redutores

taninos condensados proantocianidinas leucoantocianidinas monoterpenos

sesquiterpenos triterpenos esteroides e cumarinas nos diferentes extratos de

Hymenaea stigonocarpa devido a avaliaccedilatildeo pelo uso de reveladores e comparaccedilatildeo

com a coloraccedilatildeo dos padrotildees

34211 Monoterpenos e sesquiterpenos

A presenccedila de monoterpenos e sesquiterpenos (natildeo diferenciados entre pelo

uso do revelador) foi identificada no extrato EC (Figura 35) a partir da visualizaccedilatildeo

de vaacuterias bandas de coloraccedilatildeo variando de violeta a azul escuro as quais foram

comparadas com a coloraccedilatildeo produzida pelo padratildeo timol (Rf = 035)

Figura 35 - Cromatograma dos extratos ciclo-hexano acetato de

etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo da presenccedila de

monoterpenos e sesquiterpenos

Sistema de eluiccedilatildeo Tolueno ndash AcOEt (97 3 vv) 1 ndash Extrato ciclo hexano 2 ndash Extrato acetato de etila 3 ndash Extrato etanoacutelico 4 ndash Extrato aquoso P - Padratildeo de Timol (Rf = 035) revelador vanilina sulfuacuterica

Rf = 035

Rf = 080

Rf = 055

Rf = 014

Rf = 004

Rf = 012

85

34212 Triterpenos e esteroacuteides

A presenccedila de triterpenos e esteroides (natildeo diferenciados entre si) foram

identificados apenas no extrato EC (Figura 36) a partir da visualizaccedilatildeo de vaacuterias

bandas de coloraccedilatildeo variando de rosa a vermelho as quais foram comparadas com

a coloraccedilatildeo produzida a partir da utilizaccedilatildeo do padratildeo de β-sitosterol (Rf 012)

Figura 36 - Cromatograma dos extratos ciclohexano acetato de

etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de triterpenos e

esteroacuteides

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 05 05 05 vv ) 1 ndash Extrato ciclo hexano 2 ndash Extrato acetato de etila 3 ndash Extrato etanoacutelico 4 ndash Extrato aquoso P - Padratildeo de β-sitosterol (Rf = 012) revelador Liebermann Burchard

A ocorrecircncia de terpenos nas espeacutecies do gecircnero Hymenaea jaacute eacute

amplamente conhecida resinas de cor amarela e avermelhada produzidas pelas

aacutervores do gecircnero Hymenaea L satildeo descrita desde o periacuteodo dos iacutendios preacute-

colombianos devido a seu uso na fabricaccedilatildeo de joias (LEE LANGENHEIM 1975)

Dentre as espeacutecies do gecircnero Hymenaea a mais estudada eacute a Hymenaea

courbaril nela tambeacutem satildeo descritas a ocorrecircncia de terpenos em diferentes partes

da planta tais como folhas (MARTIN et al 1972 LANGENHEIM et al 1986) resina

das folhas (LANGENHEIM 1972 ABDEL-KADER et al 2002) resina do troco

(LANGENHEIM 1973 MARSAIOLI et al 1975 ABDEL-KADER et al 2002) resina

dos frutos (OURISSON et al 1973) e sementes (NOGUEIRA 2001)

Rf = 012

Rf = 086

Rf = 063

Rf = 035

Rf = 023

Rf = 007

86

Quanto agrave presenccedila de terpenos na casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa nossos resultados estatildeo de acordo com o que foi descrito por

Giacomini e colaboradores (2006) que relatam a presenccedila de terpenos isolados a

partir de extrato hexacircnico do epicarpo assim como o que relatam Domeacutenech-carboacute

e colaboradores (2009) que identificaram o aacutecido eperuico e seus isocircmeros juntos

com aacutecido copaacutelico como os principais componentes da resina da casca do caule de

Hymenaea stigonocarpa

Se analisarmos a presenccedila de terpenos nas diferentes partes da planta

podemos observar que eles satildeo de ocorrecircncia frequente nesta espeacutecie como

descrevem Faria e colaboradores (2004) Esses autores demonstram a presenccedila de

diterpenos nas sementes e Langenheim e colaboradores (1986) que descreve nas

folhas a ocorrecircncia de -cariofileno e α-muroleno sesquiterpenos com atividade

antifuacutengica e accedilatildeo repelente contra insetos

34213 Flavonoacuteides e cumarinas

Da casca do caule foram evidenciadas duas bandas nos extratos acetato de

etila (2) e etanoacutelico (2) com caracteriacutesticas de flavonoides (amarelo e laranja) de Rf

005 e 047 (Figura 37) Esta CCD tambeacutem indica a presenccedila de cumarinas Rf 098

e 093 (coloraccedilatildeo azul) nos extratos ciclohexano e acetato de etila


etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de flavonoides

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv ) 1 ndash Extrato ciclo hexano 2 ndash Extrato acetato de etila 3 ndash Extrato etanoacutelico 4 ndash Extrato aquoso P - Padratildeo luteolina (Rf = 047) revelador NEU

Rf = 047

Rf = 093

Rf = 098

Rf = 047

Rf = 005

87

Simotildees e colaboradores (2009) descreveram a ocorrecircncia de cumarinas em

espeacutecies do gecircnero Hymenaea Estes autores isolaram duas cumarinas a

ipomopsina e hymenaina das sementes de H courbaril ambas com atividade

antifuacutengica No entanto este eacute o primeiro relato da presenccedila de cumarinas em H

stigonocarpa

34214 Accedilucares

A presenccedila de accedilucares foi observada no extrato etanoacutelico a partir da

visualizaccedilatildeo de banda de coloraccedilatildeo avermelhada a qual foi comparada com a

coloraccedilatildeo produzida a partir da utilizaccedilatildeo dos padrotildees glicose e raminose apoacutes a

revelaccedilatildeo com 235 cloridrato de trifeniltetrazoacutelio (Figura 38) Apoacutes a comparaccedilatildeo

entre os fatores de retenccedilatildeo uma das bandas foi identificada como supostamente

glicose (Rf 053)


etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de accedilucares

Sistema de eluiccedilatildeo n-BuOH-Me2CO-tampatildeo fosfato pH = 50 (40 50 10 vv) 1 ndash Extrato ciclo hexano 2 ndash Extrato acetato de etila 3 ndash Extrato etanoacutelico 4 ndash Extrato aquoso P - Padrotildees de glicose (Rf = 053) e ramnose (Rf =046) revelador 235 cloridrato de trifeniteltrazolio

34215 Taninos hidrolisaacuteveis e condensados

Nenhum tanino hidrolisado foi identificado nos extratos obtidos sendo

utilizados o aacutecido gaacutelico e o elaacutegico como padrotildees e como revelador o reagente de

Rf = 053 Rf = 053 Rf = 046

88

Neu (Figura 39) A presenccedila de taninos condensados foi identificada apoacutes revelaccedilatildeo

com vanilina cloriacutedrica (Figura 40) nos extratos de EAE EE e EA

A quantidade e o tipo de taninos sintetizados pelas plantas variam

consideravelmente dependendo da espeacutecie do cultivo do tecido e de condiccedilotildees

ambientais Geralmente a concentraccedilatildeo eacute maior em espeacutecies que prosperam em

solos agriacutecolas pobres ou de baixa calagem tal como ocorre nas regiotildees tropicais e

subtropicais (OTERO HIDALGO 2004) Aleacutem disso as concentraccedilotildees de taninos

satildeo maiores nas partes dos vegetais expostas ao sol indicando portanto uma

relaccedilatildeo entre a fase dependente de luz da fotossiacutentese com a produccedilatildeo de taninos

(HEIL et al 2002)

Tradicionalmente os taninos satildeo classificados segundo a sua estrutura

quiacutemica em dois grupos taninos hidrolisaacuteveis e taninos condensados Taninos

hidrolisaacuteveis satildeo caracterizados por um poliol central geralmente β-D-glicose cujas

funccedilotildees hidroxilas satildeo esterificadas Apoacutes a hidrolise aacutecida das ligaccedilotildees ester os

dois principais representantes gerados satildeo o aacutecido gaacutelico e o elaacutegico Os taninos

condensados proantocianidinas satildeo oligocircmeros e poliacutemeros formados pela

policondensaccedilatildeo de duas ou mais unidades flavan-3-ol e flavan-34-diol Dentre os

taninos condensados pode ser descrito outra classe as leucoantocianidinas (flavan-

34-dioacuteis) classe intermediaacuteria na via de formaccedilatildeo dos taninos condensados

(SIMOtildeES et al 2004)

Figura 39 - Cromatograma do extrato etanoacutelico (B) para

avaliaccedilatildeo de taninos hidrolisaacuteveis

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv) 1 ndash Extrato etanoacutelico P ndash aacutecido gaacutelico e elaacutegico (Rf = 053) e (Rf =060) revelador Reagente de Neu

Rf = 053

Rf = 060

89

A presenccedila de taninos condensados foi identifica nos extratos EAE EE e EA

(Figura 40) a partir da visualizaccedilatildeo de vaacuterias bandas de coloraccedilatildeo avermelhadas as

quais foram comparadas com a coloraccedilatildeo produzida a partir da utilizaccedilatildeo do padratildeo

de epicatequina (Rf 095) revelado com vanilina cloriacutedrica


etila etanol e aacutegua obtidos para avaliaccedilatildeo de taninos

condensados

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv ) 1 ndash extrato ciclo hexano 2 ndash extrato acetato de etila 3 ndash extrato etanoacutelico 4 ndash extrato aquoso P - padratildeo epicatequina (Rf = 095) revelador vanilina cloriacutedrica

Os taninos condensados em geral estatildeo amplamente distribuiacutedos em plantas

lenhosas Jaacute os taninos hidrolisaacuteveis natildeo satildeo frequentes neste tipo de plantas

Dentre os metaboacutelitos secundaacuterios presentes os taninos condensados perfazem

aproximadamente metade da mateacuteria seca constituindo a segunda fonte de

polifenoacuteis no reino vegetal perdendo apenas para a lignina (HAGERMAN et al

1997 ARGYROPOULOS 1999)

Nos extratos avaliados foram identificadas a presenccedila de

proantontocianidinas e leucoantocianidinas essas classes podem ser identificadas

atraveacutes da realizaccedilatildeo de cromatografia em camada delgada devido agrave diferenccedila das

suas polaridades onde as leucoantocianidinas apresentam diferente fator de

retenccedilatildeo em relaccedilatildeo agraves proantociandininas apresentando uma maior migraccedilatildeo em

solventes mais polares

1 2 3 4 P

Rf = 093 Rf = 083 Rf = 075 Rf = 069

Rf = 095

90

Apoacutes a anaacutelise fitoquiacutemica nos quatro extratos obtidos atraveacutes de extraccedilatildeo

exaustiva seriada por maceraccedilatildeo o extrato hidroalcooacutelico foi obtido por maceraccedilatildeo

apoacutes a identificaccedilatildeo da maior atividade antibacteriana nos extratos que continham

maiores teores dos metaboacutelitos secundaacuterios polares

Foram identificados metaboacutelitos secundaacuterios no extrato hidroalcooacutelico (EH) e

em suas fraccedilotildees aquosa (FA) e acetato de etila (FAE)

34216 Flavonoacuteides apoacutes particcedilatildeo

Foi observada uma banda no extrato EH (Figura 41) uma delas comparada

ao padratildeo de astilbina apresentou o mesmo fator de retenccedilatildeo (Rf 028) a outra

comparada ao padratildeo luteolina apresentou tambeacutem o mesmo fator de retenccedilatildeo (Rf

060)

Figura 41 - Cromatograma do extrato hidroalcooacutelico de

Hymenaea stigonocarpa para avaliaccedilatildeo de flavonoacuteides

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv ) 5 ndash Extrato Hidroalcooacutelico P1 ndash Padratildeo de astilbina (Rf = 060) P2 - Padratildeo luteolina (Rf = 028) revelador NEU

Avaliando a presenccedila de flavonoacuteides na casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa foram observadas duas bandas na anaacutelise por CCD uma apoacutes uso de

padrotildees apresentou o mesmo fator de retenccedilatildeo que o flavonoacuteide astilbina e a outra

Rf = 060

Rf = 060

Rf = 028

Rf = 028

P1 5 P2

91

o mesmo da luteolina A astilbina tem ocorrecircncia descrita para o gecircnero Hymenaea

sendo relatada nas espeacutecies Hymenaea parvifolia identificada na resina do caule

(ISHIBASHI et al 1999) e em Hymenaea stigonocarpa identificada na casca do

caule por espectro de infravermelho (LOVATO amp NUNES 2007)

34217 Taninos condensados apoacutes particcedilatildeo

Os taninos condensados estatildeo presentes no EH e nas fraccedilotildees FA e FAE No

FA (Figura 42) haacute presenccedila apenas de proantocianidinas (banda natildeo revelada pelo

reagente NEU que ficou retida no ponto de aplicaccedilatildeo) na fraccedilatildeo FAE haacute ocorrecircncia

de leucoantocianidinas (Figura 43) e flavonoacuteides

Na figura 42 apesar do uso do revelador Neu pode-se observar a presenccedila

de taninos condensados no ponto de aplicaccedilatildeo do cromatograma e a ausecircncia de

flavonoacuteides quando comparamos a FA e o EH Na figura 43 pode-se observar a

ausecircncia das proantocianidinas na FAE quando comparada ao EH

Figura 42 - Cromatograma do extrato hidroalcooacutelico e da fraccedilatildeo

aquosa para avaliaccedilatildeo de flavonoacuteides

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv ) EH ndash Extrato Hidroalcooacutelico FA ndash Fraccedilatildeo aquosa revelador de Neu

Rf = 004

Rf = 069

Rf = 047

EH FA

92


acetato de etila para avaliaccedilatildeo de taninos

Sistema de eluiccedilatildeo EtOAcndashHCOOHndashAcOHndashH2O (100 11 11 26 vv ) EH ndash Extrato Hidroalcooacutelico FAE ndash Fraccedilatildeo acetato de etila revelador vanilina cloriacutedrica


Foram quantificados polifenoacuteis e taninos nos diferentes extratos obtidos

3431 Determinaccedilatildeo da Curva de calibraccedilatildeo do aacutecido gaacutelico

A concentraccedilatildeo polifenoacuteis totais foi determinada pela extrapolaccedilatildeo da curva

de calibraccedilatildeo (y = 01037 x + 00024 R2 = 09992) a qual foi obtida a partir das

soluccedilotildees de aacutecido gaacutelico (Sigma Chemical Co St Louis USA) que variaram entre

20ndash80120583gmL

3442 Determinaccedilatildeo do teor de polifenoacuteis e taninos totais

Utilizando a equaccedilatildeo da reta foram obtidos os valores de polifenoacuteis totais em

equivalentes miligramas de aacutecido gaacutelico por grama de resiacuteduo seco conforme

expresso na tabela 1

EH FAE

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

93

Tabela 1 - Conteuacutedo de polifenois e taninos totais dos diferentes

extratos e fraccedilotildees de Hymenaea stigonocarpa

O teor de polifenois e taninos totais foi expresso em mg GAEg de resiacuteduo seco As medias marcadas com () natildeo satildeo significativamente diferentes (plt005)

O conteuacutedo de polifenois totais variou de 495 plusmn 002 a 712 plusmn 003 mg GAEg

de resiacuteduo seco Esses resultados indicam uma alta concentraccedilatildeo desses

componentes nos extratos polares Os conteuacutedos de polifenois foram ateacute cerca de

30 vezes maiores que os valores obtidos no extrato etanoacutelico da madeira de

Hymenaea stigonocarpa obtidos por Oliveira e colaboradores (2010)

344 Anaacutelise por cromatografia liquida de alta eficiecircncia (CLAE-DAD)

Os extratos e fraccedilotildees EE EH e FA com os maiores conteuacutedos de taninos

foram selecionados para serem analisados por CLAE-DAD O cromatograma desses

extratos e fraccedilotildees eacute mostrado na figura 44

Picos A B C e D presentes em todos os cromatogramas eluidos no tempo

de retenccedilatildeo 29-37 min e absorvidos em 280 nm com um braccedilo proacuteximo a 198 nm e

uma absorccedilatildeo maacutexima entre 290 e 294 nm satildeo sugestivos de derivados de

flavonoides Esses espectros estatildeo de acordo com dados da literatura (MABRY et

al 1970)

O pico B com o tempo de retenccedilatildeo de 31453 minutos foi identificado como

astilbina Essa identificaccedilatildeo foi possiacutevel devido a comparaccedilatildeo entre o espectro de

absorccedilatildeo do EE EH e EH + astilbina com absorccedilatildeo maacutexima de 2903 nm

A onda E com o tempo de retenccedilatildeo entre 39 ndash 48 min parece estar

relacionada a taninos condensados observados neste estudo na anaacutelise por CCD

ExtratosFraccedilotildees Polifenois totais Taninos totais

Ciclohexano (EC) 000 000

Acetato de etila (EAE) 663 plusmn 013 182 plusmn 017

Etanoacutelico (EE) 726 plusmn 004 276 plusmn 010

Aquoso (EA) 495 plusmn 002 146 plusmn 006

Hidroalcooacutelico (EH) 696 plusmn 009 296 plusmn 008

Aquoso (FA) 616 plusmn 003 271 plusmn 005

Acetato de etila (FAE) 712 plusmn 003 200 plusmn 004

94


Extrato Hidroalcooacutelico (EH) + Astilbina (98) Extrato Hidroalcooacutelico (EH) Extrato Etanoacutelico (EE) e Fraccedilatildeo Aquosa (FA) obtidos por

CLAE-DAD a 280nm Cada pico cromatograacutefico aparece com seu correspondente tempo de retenccedilatildeo Espectro de UV com padratildeo

derivado de flavonoides (A C e D) e identificado como astilbina (B)

C D B A Peak 4 100 at 2980 min

-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986

Peak 5 100 at 3139 min

-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932

-50 at 3634 min 99902

HE + Astilbina A

B

C D E

HE

EE

AF

Tempo (min)

Ab

so

rbacircn

cia

(m

AU

)

A

C D E

A B

C D E

E

B

94

95

Apenas monocircmeros e oligocircmeros ateacute tetracircmeros de catequinas e proantocianidinas

podem ser separadas e detectadas como um pico definido (ANDERSEN 2006 PARK

2012) Catequinas polimeacutericas presentes em muitos materiais vegetais natildeo resultam

em picos bem definidos Eles provocam uma deriva na linha de base e a formaccedilatildeo de

ondas caracteriacutesticas nos cromatogramas em CLAE

345 Atividade antibacteriana

Natildeo existe um consenso cientiacutefico sobre os valores de concentraccedilotildees inibitoacuterias

miacutenimas aceitaacuteveis para produtos naturais quando comparados com antibioacuteticos

padrotildees alguns autores consideram somente resultados similares aos de antibioacuteticos

enquanto outros consideram com eficaacutecia mesmo aqueles com niacuteveis de inibiccedilotildees

superiores

Sartoratto et al (2004) propocircs uma classificaccedilatildeo com base nos resultados da

CIM considerando como forte inibiccedilatildeo quando obtida para valores de CIM entre 50 e

500 microgml uma atividade moderada para valores de CIM entre 600 e 1500 microgml e

uma atividade fraca para valores acima de 1500 microgml

No presente estudo foi observado que a atividade antimicrobiana dos extratos

EC EAE EE e EA da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa frente agraves bacteacuterias

Gram negativas apresentaram atividade moderada A CIM para os extratos foi de 1024

microgmL frente agraves espeacutecies de bacilos Gram negativos avaliados

O extrato EC constituiacutedo por terpenos esteroacuteide e cumarina tambeacutem

apresentou moderada inibiccedilatildeo frente os Bacilos Gram negativos avaliados

apresentando valores de CMI de 1024 microgmL para as enterobacterias e bacteacuterias natildeo

fermentadoras Os extratos EAE EE e EA apresentando taninos e flavonoacuteides

apresentaram tambeacutem inibiccedilatildeo moderada sobre as bacteacuterias Gram negativas avaliadas

com valores de CMI de 1024microgmL para as enterobacterias e bacteacuterias natildeo

fermentadoras

Quanto agrave atividade antimicrobiana dos extratos frente agraves bacteacuterias Gram

negativas os extratos apresentaram atividade moderada em relaccedilatildeo a todas as

espeacutecies avaliadas devido a presenccedila de forte carga negativa na parede celular deste

tipo de bacteacuteria em decorrecircncia da presenccedila de lipopolissacariacutedeos (IKIGAI et

al1993) o que dificultaria a interaccedilatildeo dos compostos do extrato com o micro-

96

organismo Fato que natildeo ocorre em bacteacuterias Gram positivas pela diferenccedila na

caracteriacutestica eleacutetrica

Os extratos avaliados frente agrave Staphylococccus aureus e Enterococcus faecalis

apresentaram uma melhor atividade quando comparadas aos bacilos Gram negativos

(tabela 2)

O extrato EC obtido por extraccedilatildeo com ciclohexano constituiacutedo por terpenos

esteroacuteides e cumarina apresentou moderada atividade sobre as cepas de Saureus e

Enterococcus faecalis As CMI foram de 1024 microgmL para Enterococcus faecalis e S

aureus (Tabela 2)

Quanto ao extrato EAE obtido por extraccedilatildeo com acetato de etila como solvente e

constituiacutedo por flavonoacuteides e taninos condensados foi observado uma maior

atividade cujas CIM foram de 512 microgmL para Staphylococcus aureus e

Enterococcus faecalis (tabela 2)

O extrato EE obtido atraveacutes do uso de aacutelcool etiacutelico como liacutequido extrativo

constituiacutedo tambeacutem por flavonoacuteides e taninos condensados apresentou melhor

atividade quando comparada aos dois extratos anteriores cujos valores de CIM

variaram de 128 a 256 gmL para Staphylococcus aureus e foi 256 microgmL para


O extrato EA obtido a partir do uso maceraccedilatildeo utilizando aacutegua como soluccedilatildeo

extrativa foi constituiacutedo por flavonoacuteides e taninos condensados apresentou frente as

cepas avaliadas se comparada ao extrato extratos anteriormente relatados com

valores de CMB e CIM de 512 microgmL para Staphylococcus aureus

O extrato EH obtido por maceraccedilatildeo utilizando etanol aacutegua 50 vv como soluccedilatildeo

extrativa constituiacutedo por flavonoacuteides e taninos condensados natildeo apresentou diferenccedila

significativa (plt005) se comparado ao extrato EE frente agrave Staphylococcus aureus

(tabela 2)

Cepas de Staphylococcus aureus mostraram ser mais susceptiacuteveis aos extratos

EC EAE EE EA e EH sendo este micro-organismo selecionado para os estudos

posteriores

Para avaliarmos que classes de metaboacutelitos secundaacuterios poderiam apresentar

maior atividade antibacteriana frente agraves cepas de Staphylococcus aureus foram

avaliadas as fraccedilotildees FA e FAE obtidos apoacutes particcedilatildeo do extrato EH ricos em taninos

condensados e flavonoacuteides respectivamente

97

Tabela 2 - Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima dos extratos e fraccedilotildees de Hymenaea stigonocarpa frente a cocos Gram-positivos

American Type Culture Collection ATCC Extrato Ciclohexano CE Extrato Acetato de Etila EAE Extrato Etanoacutelico EE Extrato Aquoso AE extrato

Hidroalcooacutelico HE Fraccedilatildeo Aquosa FA Fraccedilatildeo Acetato de Etila FAE oxacillina OXA Teicoplanina TEI Astilbina AST Laboratoacuterio de Fisiologia e

Bioquiacutemica de Micro-organismos LFBM natildeo determinado ND

Cocos Gram positivos Origem Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (microgmL)

EC EAE EE EA EH

FA FAE AST OXA TEI

Staphylococcus aureus ATCC 25293 ATCC 512 512 256 512 128 128 128 1024 012 ND


Staphylococcus aureus AM 02 Hemocultura 1024 512 256 512 256 125 512 1024 32 ND

Staphylococcus aureus AM 04 Escarro 512 512 128 128 128 128 256 1024 10 ND

Staphylococcus aureus AM 05 Sec Vaginal 512 512 512 512 128 64 512 1024 10 ND

Staphylococcus aureus UFPEDA 01 Escarro 512 512 128 512 64 64 256 1024 012 ND


Staphylococcus aureus IC 17 Secreccedilatildeo 512 512 256 512 256 256 256 1024 256 ND



Staphylococcus aureus AM 20 Sec Traqueal 1024 512 256 512 256 256 512 1024 80 ND


Enterococcus faecalis 245 Hemocultura 1024 512 256 256 256 256 512 1024 ND 80


Enterococcus faecalis 292 Urina 1024 512 256 512 256 256 512 1024 ND 025


98

A fraccedilatildeo FA constituiacuteda apenas por taninos condensados (figura 15)

apresentou atividade estatisticamente semelhante aos extratos EE e EH cujo valor

de CMI variou entre 64 e 256 microgmL para cepas MSSA e MRSA (tabela 2)

A fraccedilatildeo FAE rica em flavonoacuteides apresentou uma menor atividade quando

comparada a fraccedilatildeo FA para as cepas MSSA e MRSA (plt005) Os valores de CIM

variaram de 128 a 512 microgmL e 256 a 512 microgmL respectivamente (tabela 2)

Com o objetivo de avaliar a influecircncia da astilbina na atividade antibacteriana

da fraccedilatildeo FAE foi realizada uma avaliaccedilatildeo utilizando um padratildeo de astilbina com

98 de pureza Quando comparada sua resposta ao extrato FAE podemos

concluir que a atividade antimicrobiana natildeo sofre grande influencia dos flavonoacuteides

pois os valores de CMI foram de 1024microgmL na maioria das cepas estudadas tanto

para MRSA como MSSA Apesar da astilbina tambeacutem apresentar atividade

antimicrobiana pois apresentou CIM entre 512microgmL para cepas MSSA e MRSA

(tabela 2)

Apoacutes a avaliaccedilatildeo de todos os extratos obtidos a partir de diferentes extraccedilotildees

foi possiacutevel agrupar os valores de CIM obtidos frente a cepas de Staphylococcus

aureus testadas assim de acordo com a atividade dos extratos observamos a

seguinte sequecircncia de quanto os valores da CMI

Os extratos EC e EAE (apolares) constituiacutedos por terpenos esteroides e

cumarinas foram os menos ativos A atividade frente agrave Staphylococcus aureus

poreacutem eacute relatada quando avaliado o oacuteleo de capim limatildeo (Cymbopogon citrates) rico

em terpenos tais como citral geraniol e myrceno (AIEMSAARD et al 2011)

O mecanismo de accedilatildeo destas substacircncias ainda natildeo eacute completamente

entendido mas especula-se que estaacute envolvido no rompimento de constituinte

lipofiacutelicos das membranas (COWAN 1999) Os terpenos perecem ter muacuteltiplos alvos

na ceacutelula bacteriana dependendo da concentraccedilatildeo utilizada assim como da

composiccedilatildeo do extrato avaliado (AIEMSAARD et al 2011)

Atividades melhores foram obtidas poreacutem pelos extratos mais polares tais

como EA e a fraccedilatildeo FAE mas as melhores atividades foram observadas apoacutes a

avaliaccedilatildeo dos extratos EE EH e FA Avaliando os constituintes destes extratos foi

possiacutevel observar que os extratos com ausecircncia de taninos condensados foram os

menos ativos sendo os mais ativos os que continham essa classe de metaboacutelitos

99

346 Alteraccedilotildees ultraestruturais

Para esta anaacutelise foi utilizado o extrato Hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa A seleccedilatildeo deste extrato natildeo foi apenas devido a sua atividade pois o

extrato etanoacutelico e a fraccedilatildeo aquosa natildeo apresentam diferenccedilas significativas em

relaccedilatildeo a este Aleacutem da atividade antibacteriana o hidroalcooacutelico apresentou mais

faacutecil obtenccedilatildeo menor toxicidade em relaccedilatildeo ao solvente utilizado aleacutem de maior

conteuacutedo de flavonoides metaboacutelitos de grande potencial farmacoloacutegico

Quanto ao micro-organismo avaliado foi utilizada cepa padratildeo de

Staphylococcus aureus ATCC 33591 resistente a meticilina As alteraccedilotildees

provocadas na cepa Staphylococcus aureus ATCC 33591 exposta ao extrato

Hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa presente na concentraccedilatildeo inibitoacuteria

miacutenima e na metade da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima podem ser observadas na

figura 45

O tratamento na metade da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (Figura 45 D a F)

levou ao aparecimento de orifiacutecios na parede celular (OPC) a aparecircncia de parede

parcialmente digerida a esfoliaccedilatildeo na superfiacutecie bacteriana ao espessamento do

septo (ES) e exposiccedilatildeo das amostras da membrana citoplasmaacutetica

O surgimento de pequenos orifiacutecios na parede celular (OPC) ocorre devido agrave

accedilatildeo enzimas bacterianas chamadas autolisinas presentes entre os peptidoglicanos

a fim de permitir a inserccedilatildeo de novas moleacuteculas Em bacteacuterias tratadas com

determinadas classes de agentes antimicrobianos a inserccedilatildeo de peptidoglicano natildeo

acontece Assim os monoacutemeros natildeo satildeo anexados agrave extremidade crescente da

parede celular bacteriana pelas as enzimas transglicosidase e transpeptidase

ocorrendo falhas na parede celular (SANTHANA 2007)

A concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima o extrato hidroalcooacutelico (256 microgml) provocou

alteraccedilotildees em vaacuterias estruturas celulares Foram observados condensaccedilatildeo dos

ribossomos (CR) desligamento parede celular (DPC) divisatildeo anormal da ceacutelula

(DAC) espessamento dos septos (ES) assim como muacuteltiplos septos (MS) presenccedila

de celulas fantasmas (CF) (Figura 45 G a L)

Tambeacutem foram observadas paredes celulares sendo rompidas e danificadas

resultando numa libertaccedilatildeo de materiais celulares para o citoplasma

100

Figura 45 - Imagens da microscopia eletrocircnica de transmissatildeo da cepa de S aureus

ATCC 33591 tratada com diferentes concentraccedilotildees do extrato hidroalcooacutelico de H

stigonocarpa

Ceacutelulas natildeo tratadas (A-C) mostram parede celular (PC) ribossomos (R) e septo (S) da bacteacuteria bem distinta Tratados com extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa na metade da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (D-F) mostram formaccedilatildeo de orifiacutecios na parede celular (OPC) Mesossomos (M) e espessamento da parede celular (EPC) assim como espessamento do septo (ES) Tratados com a concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (G-L) mostram condensaccedilatildeo dos ribossomos (CR) desprendimento da parede celular (DPC) espessamento (ES) e muacuteltiplos septos (MS) divisatildeo aberrante da ceacutelula (DAC) ceacutelulas fantasmas (CF) Mesossomos (M) e DNA coagulado (DC) Aumento de A B C E J e K de 30000X e de D F G H e L de 65120X

A B C

D E F

G H I

J L K

OPC OPC

S

R R

R

OPC

MS

M

OPC

C

OP

C

ES

EPC

CR CR

CR CR

DPC

ES

ES

ES

ES

DAC

DAC

S

DAS

CF

M

CR

OPC

OPC

OPC ES

MS

101

Polifenoacuteis podem ligar-se diretamente para parede celular e interferir com a

sua integridade (ZHAO 2001) A falha na inserccedilatildeo de peptidoglicano pode causar na

parede celular o surgimento desses pequenos orifiacutecios (OPC) que satildeo provocados

pelo movimento da moleacutecula de aacutegua a partir do ambiente externo para a regiatildeo

intracelular Isso ocorre devido agrave diferenccedila de pressatildeo osmoacutetica entre os dois

ambientes Se este evento prolongar pode causar a lise das bacteacuterias (SCHITTO

2006)

O espessamento da parede celular e a condensaccedilatildeo dos ribossomos (CR) em

bacteacuterias indica a presenccedila de mecanismos de defesa para manter a pressatildeo

osmoacutetica apoacutes accedilatildeo extrato hidroalcooacutelico Bacteacuterias tambeacutem produzem mais

peptidoglicano para se proteger e desenvolver mesossomos (ME) implicados com a

respiraccedilatildeo celular (SANTHANA 2007)

Alteraccedilotildees nos componentes intracelulares tais como aacutecidos nucleicos

proteiacutenas ribossomos agregados satildeo visualizadas nas figuras 45 G ndash L elas podem

sugerir a expressatildeo possiacuteveis efeitos sobre a funccedilatildeo do DNA girase (ROMANO et

Al 2013) que ficaria impedido de cumprir o sua funccedilatildeo durante a replicaccedilatildeo do

DNA O RNAm que seria liberado a partir do DNA super-enrolamento natildeo poderia

ser enrolado de volta porque a DNA girase estaria imobilizada

Assim as alteraccedilotildees citoloacutegicas observadas por TEM apoacutes o uso de

diferentes concentraccedilotildees do extrato hidroalcooacutelico da casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa demonstram a sua accedilatildeo antibacteriana frente a Staphylococcus

aureus

102

35 CONCLUSOtildeES

Os resultados obtidos permitem constatar que a anaacutelise fitoquiacutemica da casca

do caule de Hymenaea stigonocarpa Mart revelou a presenccedila de terpenos

esteroacuteides flavonoacuteides cumarinas e taninos condensados sendo os taninos

condensados e os flavonoacuteides os metaboacutelitos majoritaacuterios

Dentre os metaboacutelitos presentes nos extratos de Hymenaea stigonocarpa

avaliados por CLAE-DAD foram observados quatro picos correspondentes a

flavonoides um deles foi eacute sugestivo de astilbina de acordo com o tempo de

retenccedilatildeo e o espectro de UV

Quanto agrave avaliaccedilatildeo botacircnica pocircde-se observar que os siacutetios de

armazenamento dos taninos na casca do caule de Hymenaea stigonocarpa satildeo

feloderme parecircnquima cortical e floema em amostras de indiviacuteduos jovens e adultos

e que a casca do caule de ramos jovens pode servir como fonte para obtenccedilatildeo de

taninos condensados

Quanto agrave atividade antibacteriana todos os extratos obtidos apresentam

atividade moderada frente a Bacilos Gram negativos como tambeacutem a fraccedilatildeo rica em

terpenos esteroacuteides e cumarinas frente agraves bacteacuterias Gram positivas O micro-

organismo Staphylococcus aureus foi das bacteacuterias Gram positivas avaliadas a

mais suscetiacutevel agrave accedilatildeo dos extratos sendo os extratos que continham taninos

condensados os que apresentaram as melhores atividades Dentre os extratos com

maiores teores de taninos condensados a fraccedilatildeo aquosa e os extratos etanoacutelico e

hidroalcooacutelicos natildeo apresentaram diferenccedilas significativas quanto agrave atividade

antibacteriana sendo o extrato hidroalcooacutelico selecionado por ser o de mais faacutecil

obtenccedilatildeo

O extrato Hidroalcooacutelico avaliado na concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima e na

metade da CIM levou a alteraccedilotildees ultraestruturais da parede celular septo e

citoplasma de Staphylococcus aureus ATCC 33591

103

REFEREcircNCIAS ABDEL-KADER M BERGER J M SLEBODNICK C HOCH J MELONE S WISSE JH WERKHOVEN M C M MAMBER S KINGSTON D G I Isolation andabsolute configuration of ent-halimane diterpenoids from Hymenaea courbaril from theSuriname rain forest Journal of Natural Products 65(1) 11-15 2002 ADEBAJO A C OLOREK K J ALADESANMI A J Antimicrobial activities and microbial transformation of volatile oils of Eugenia uniflora Fitoterapia v 15 p 451-455 1989 AIEMSAARD J AIUMLAMAI S AROMDEE C TAWEECHAISUPAPONG S KHUNKITTI W The effect of lemongrass oil and its major components on clinical isolate mastitis pathogens and their mechanisms of action on Staphylococcus aureus DMST 4745 Research in veterinary science v 91 n 3 p 31ndash7 2011 AMORIM E L C LIMA C S A HIGINO J S SILVA L R S ALBUQUERQUE U P Fitoterapia instrumento para uma melhor qualidade de vida Infarma v 15 n1-3 66-69 2003 ANDERSEN O M MARKHAM K R Flavonoids Chemistry biochemistry and applications Floacuterida Taylor amp Francis pp17-20 2006 ARGYROPOULOS D S Advances in lignocellulosics characterization Atlanta TAPPI Press p 157-180 1999 ASMAWI M Z RIANSE U SAHIDIN I DHIANAWATY D SOEMARDJI A A Anti-hypertensive activity of Alang Imperata cylindrica (L) Beauv root methanolic extract on male Wistar rat International Journal of Research in pharmaceutical sciences 4 537ndash542 2013 BATISTA A G ESTEVES E A DESSIMONI-PINTO N A V OLIVEIRA L G PIRES S T SANTANA R C ldquoChemical composition of jatobaacute-do-cerrado (Hymenaea stigonocarpa Mart) flour and its effect on growth of ratsrdquo Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara no 2 pp173-180 2011 BIESKI G C SANTOS F R OLIVEIRA R M ESPINOSA M M MACEDO M ALBUQUERQUE U P MARTINS D T O ldquoEthnopharmacology of Medicinal Plants of the Pantanal Region (Mato Grosso Brazil)rdquo Evidence-based Complementary and Alternative Medicine no2012 pp1-36 2012 BORGES R VINIacuteCIUS M NASCIMENTO M AUGUSTTO A CARVALHO V DE VALADARES M C CARLOS L (2013) Antinociceptive and Anti- Inflammatory Activities of the Ethanolic Extract from Synadenium umbellatum Pax ( Euphorbiaceae ) Leaves and Its Fractions Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine v 2013 p 1-9 2013 BRITO A R M S BRITO A A S Forty year of brazilian medicinal plant research Journal of Ethnopharmacology v 39 n1 p 53-67 1993

104

BUKATSCH F Bemerkungen zur doppelfarbung astrablau-safranin Mikrokosmos Stuttgard v 61 n8 p255 1972 CECHINEL FILHO V amp YUNES RA Estrateacutegias para obtenccedilatildeo de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais Conceitos sobre modificaccedilatildeo estrutural para otimizaccedilatildeo da atividade Quiacutemica Nova v 21 n 1 p 99-105 1998 CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing Twenty-Second Informational Supplement M100-S22 Vol32 No 3 Wayne PA CLSI 2012 COELHO DE SOUZA G HAAS A P S VON POSER G L SCHAPOVAL E E S ELISABETSKY E Etnopharmacological studies of antimicrobial remedies in South of Brazil Journal of Ethnopharmacology v 90 p 135-143 2004 COWAN M M Plant products as antimicrobial agents Journal of Clinical Microbiology v 4 p 564-582 1999 DIMECH G S SOARES L A L FERREIRA M A DE OLIVEIRA A G V CARVALHO M D C amp XIMENES E A Phytochemical and Antibacterial Investigations of the Extracts and Fractions from the Stem Bark of Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne and Effect on Ultrastructure of Staphylococcus aureus Induced by Hydroalcoholic Extract The Scientific World Journal v 2013 p 1ndash8 2013 DOMEacuteNECH-CARBOacute M T CRUZ-CANtildeIZARES J OSETE-CORTINA L DOMEacuteNECH-CARBOacute A DAVID H Ageing behaviour and analytical characterization of the Jatobaacute resin collected from Hymenaea stigonocarpa Mart International Journal of Mass Spectrometry v 284 n1 p 81-92 2009 EUROPEAN PHARMACOPOEIA Directorate for the quality of medicines of the Council of Europe (EDQM) 5ed Strasbourg Council of Europe3000p 2005 FARIA D L A EDWARDS H GM AFONSO M C BRODY R H MORAIS J L Raman spect roscopic analysis of a tembetaacute a resin archaeological artefact in need of conservation Spectrochimica Acta v60 Part a p1505ndash1513 2004 FESSENDEN R J Organic chemistry Boston Willard Grant Pres 1982 GABE M Techniques histologiques Paris Masson amp Cie 1113p 1968 GEISSMAN T A Flavonoid compounds tannins lignins and related compounds New York Elsevier 265p 1963 GIACOMINI R A LIGIEacuteRO C B P ANDREAtildeO P S S MIRANDA P C M L BRAZ-FILHO R Estudo Fitoquiacutemico do Extrato Hexacircnico do Epicarpo de Hymenaea stigonocarpa (Jatobaacute do Cerrado) Sociedade Brasileira de Quiacutemica (SBQ) 29a Reuniatildeo Anual da Sociedade Brasileira de Quiacutemica 2006

105

GIBBONS S Anti-staphylococcal plant natural products Natural products reports v 21 p 263-277 2004 GIBBONS S OHLENDORF B JOHNSEN I The genus Hypericum-avaliable resource of anti-Staphylococcal Leads Fitoterapia v73 n4 p300-304 July 2002 GOBBO-NETO L LOPES NP Plantas medicinais fatores de influencia de metabolitos secundarios Quiacutemica Nova v 30 n 2 p 374-381 2007 GOTLIEB O New and underutilized plants in the Americas solution to problems of inventory through systematics Interciecircncia v6 n1 p22-29 1981 GRANDI T S M TRINDADE J A PINTO M J F FERREIRA L L CATELLA A C ldquoPlantas medicinais de Minas Gerais Brasilrdquo Acta Botanica Brasilica no v3 p185-2241989 GUNICS G FARKAS S MOTOHASHI N SHAH A HARSUKH G KAWASE M MOLNAacuteR J Interaction between 35-diacetyl-14-dihydropyridines and ampicillin and erythromycin on different E coli strains In Vivo v 20 n 3 p 367-372 2006 HAGERMAN A E ZHAO Y JOHNSON S E SHAHADI F Methods for determination of condensed and hydrolyzable tannins Acs Symposium Series v 662 p 209-222 1997 HARBONE JB Phytochemical methods 3 ed London Chapman amp Hall p 288 1998 HEMAISWARYA S KRUTHIVENTI A K DOBLE M Synergism between natural products and antibiotics against infectious diseases(REVIEW) Phytomedicine v 15 p 639 ndash 652 2008 HIMEJIMA M KUBO I 1991 Antibacterial agents from the cashew Anacardium occidentale (Anacardiaceae) nut shell oil Journal of Agricultural and Food Chemistry v 39 n 2 p 418-421 IKIGAI H NAKAE T HARA Y AND SHIMAMURA T (1993) Bactericidal catechins damage the lipid bilayer Biochimica et Biophysica Acta1147 132 -136 ISHIBASHI M ODA H MITAMURA M OKUYAMA E KOMIYAMA K KAWAGUCHI H WATANABE T ALVES S M MAEKAWA T OHTSUK K Casein Kinase II Inhibitors isolated from two Brazilian plants Hymenaea parvifolia and Wulffia baccata Bioorganic amp Medicinal Chemistry Letters v9 p 2157-2160 1999 JOHANSEN D A 1940 Plant Microtechnique McGraw-Hill New York523p KLEIN T LONGHINI R BRUSCHI M L MELLO J C P Fitoteraacutepicos um mercado promissor Revista Ciecircncia Farmacoloacutegica Baacutesica Aplicada 2009 30(3)241-248

106

KUBO I MUROI H HIMEJIMA M Antibacterial Activity of Totarol and its Potentiation Journal of Natural Products v 55 n10 p 1436-1440 1992 LANGENHEIM J H HALL G D ldquoSesquiterpene deterrence of a leaf-tying lepidopteran Stenoma ferrocanella on Hymenaea stigonocarpa in Central Brazilrdquo Biochemical Systematics and Ecology n11 p 29ndash36 1983 LANGENHEIM J H CONVIS C L MACEDO C A STUBBLEBINE W H Hymenaea and Copaifera leaf sesquiterpenes in relation to lepidopteran herbivory in southeastern Brazil Biochemical Systematics and Ecology v 14 p1Pages 41-49 1986 LANGENHEIM J H LEE Y MARTIN S S An evolutionary and ecological perspective of Amazonian Hylaea species of Hymenaea (Leguminosae Caesalpinioideae) Acta amazonica Manaus v3 n1 p 5-38 1973 LANGENHEIN J H Leguminous resin-producing trees in Africa and South America Pages 89-104 in Tropical Forest Ecosystems in Africa as South America A comparative review BJMeggers ES Ayensu and WD Duckworth eds Smithsonian Press Washington DC 1972 LEE Y T amp LANGENHEIM J H Systematics of genus Hymenaea L (Leguminosae Caesalpinioideae Detarieae) University of California Publication in Botany 69 98 1975 LIMA C R VASCONCELOS C F B COSTA-SILVA J H MARANHAtildeO C A COSTA J BATISTA T M WANDERLEY A G Anti-diabetic activity of extract from Persea americana Mill leaf via the activation of protein kinase B (PKBAkt) in streptozotocin-induced diabetic rats Journal of ethnopharmacology v141 n1 p517ndash25 2012 LIMA E O Plantas e suas propriedades antimicrobianas uma breve anaacutelise histoacuterica In Plantas medicinais sob a oacutetica da quiacutemica medicinal moderna Argos Chapecoacute p 479-499 2001 LIMA J S REZA D L TEIXEIRA S COSTA C Pesquisa cliacutenica fundamentos aspectos eacuteticos e perspectivas Revista da Sociedade de Cardiologia do Estado do Rio de Janeiro Rio de Janeiro v16 n4 p225-233 2003 LOURENCcedilO M V Biotecnologia de plantas medicinais produccedilatildeo de biomoleacuteculas O bioloacutegico v 65 n 1 p 63-65 2003 LOVATO G A amp NUNES D S Obtenccedilatildeo de astilbina de hymenaea stigonocarpa martius In VII Encontro de Pesquisa da UEPG Ponta Grossa 2007 MABRY T J MARKHAM K R THOMAS M B The systematic identification of flavonoids Berlin Springer-Verlag pp 151-154 1970 MARASCHIN M VERPOORTE R Engenharia do metabolismo secundaacuterio Biotecnologia Ciecircncia e Desenvolvimento v 23 p 24-28 1999

107

MARINHO V M C SEIDL P R LONGO W P The biological diversity - a potential source of competitive advantage for brazilian pharmaceutical industry Espacios v 29 n 1 p 49-67 2008 MARKHAM K R Techniques of flavonoid identification New York Academic Press p113 1982 MARSAIOLI A J LEITAtildeO FILHO H F CAMPELLO J P Diterpenes in the bark of Hymenea courbaril Phytochemistry v 14 n 8 p1882-1883 August 1975 MARTIN S S LANGENHEIM J H amp ZAVARIN E Sesquiterpenes in leaf pocket resin of Hymenaea courbaril Phytochemistry (11) 3049-3051 1972 MARTINS E R CASTRO D M CASTELLANI D C DIAS J E Plantas medicinais Viccedilosa Editora UFV p 220 1994 MATUDA T G NETTO F M Semente de jatobaacute-do-cerrado caracterizaccedilatildeo quiacutemica Ciecircncia e Tecnologia de Alimentos Campinas v25 n2 p353-357 2005 MIGUEL O G LIMA E O MORAIS V M F GOMES S T A MONACHIE F D BELLA CRUZ A BELLA CRUZ R C CECHINEL FFILHO V Antimicrobial activityos constituents isolated from Lychnophora salicifolia (Asteraceae) Phytotherapy Research v 10 p 694-696 1996 MISHRA A SHARMA A K KUMAR S SAXENA A K amp PANDEY A K Bauhinia variegata leaf extracts exhibit considerable antibacterial antioxidant and anticancer activities BioMed research International v 2013 p 1-11 2013 MISHRA B B amp TIWARI V K Natural products an evolving role in future drug discovery European journal of medicinal chemistry v 46 n10 p 4769ndash4807 2011 MOLNAR J MOLNAR A SPENGLER G MANDI Y Infectious plasmid resistance and efflux pump mediated resistance Acta microbiology immunology hungarian journal v 51 n 3 p 333-349 2004 MONTARI C A BOLZANI V S Planejamento racional de faacutermacos baseado em produtos naturais Quiacutemica Nova v 24 n 1 p 105-111 2001 NADINIC E L PENNA C SAAVEDRA C L COUSSIO J D GUTKINS G DEBENEDETTI S L Aislamiento de los compuestos com actividad antimicrobiana de extratos de Gentianella achalensis (Gilg) Ho amp Liu (Gentianaceae) Acta Farmaceutica Bonaerense v 21 n2 p 123-130 2002 NEU R A New reagent for differentiating and determining flavones of paper chromatograms Naturswissenschaften v43 n82 1956

108

NEWMANN D J CRAGG G M SNADER K M Natural products as source of new drugs over the period 1981-2002 Journal of Natural Products v 66 p 1022-1037 2003 NOGUEIRA R T SHEPHERD G J LAVERDE A MARSAIOLI A J IMAMURA P M Clerodane-type diterpenes from the seed pods of Hymenaea courbaril var stilbocarpa Phytochemistry v58 n8 p 1153ndash7 2001 OrsquoKENNEDY R amp THORNES RD Coumarins biology applications and mode of action New York John Willey 1997 OLIVEIRA A B BRAGA F C Produtos naturais bioativos de plantas brasileiras e sua contribuiccedilatildeo para o desenvolvimento da quiacutemica medicinal Arquivos Brasileiros de Fitomedicina Cientiacutefica Satildeo Paulo v1 p 49-58 2003 OLIVEIRA L S SANTANA A L B D MARANHAtildeO C A CAacuteSSIA R DE MIRANDA M DE LUacuteCIA V BIEBER L Natural resistance of five woods to Phanerochaete chrysosporium degradation International Biodeterioration amp Biodegradation v 64 n8 p711ndash715 2010 ORSI P R BONAMIN F SEVERI J A SANTOS R C VILEGAS W HIRUMA-LIMA C A DI STASI L C ldquoHymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne A Brazilian medicinal plant with gastric and duodenal anti-ulcer and antidiarrheal effects in experimental rodent modelsrdquo Journal of Ethnopharmacology no143 pp81ndash90 2012 OTERO M J HIDALGO LG Taninos condensados en especies forrajeras de clima templado efectos sobre la productividad de rumiantes afectados por parasitosis gastrointestinales (uma revisioacuten) Livestock Research for Rural Development v16 n2 p1-9 2004 OURISSON G KHOO S F OEHLSCHLAGER A C Structure and stereochemistry of the diterpenes of Hymenaea courbaril (Caesalpinioideae) seed pod resin Tetrahedron 29(21) 3379-88 1973 PARK C H TANAKA T KIM H Y PARK J C YOKOZAWA T ldquoProtective effects of Corni Fructus against advanced glycation endproducts and radical scavengingrdquo Evidence Based Complementary Alternative medicine no 2012 pp 1-7 2012 PINTO A C SILVA D H S BOLZANI V S Lopes N P EPIFAcircNIO R A Quiacutemica Nova v 25 45 2002 ROBERTSON E H CARTWRIGHT R A OLDSCHOOL M Phenolic substances of manufactured tea I Fractionation and paper chromatography of water-soluble subtances Journal of Science of Food and Agriculture v 7 p 637-640 1955 ROMANO B PAGANO E MONTANARO V FORTUNATO AL MILIC N BORRELLI F Novel Insights into the Pharmacology of Flavonoids Phytotherapy Research 27 11 p 1588ndash1596 2013

109

SANTHANA R L HING H L BAHARUDIN O TEH HZ AIDA S R NOR-ASIHA CP VIMALA B PARAMSARVARAM S SUMARI G HANJEET K ldquoUltrastructural study on the effects of antibiotics on Staphylococcus aureus ATCC 25923rdquo Annals of Microscopy no 7 109-114 2007 SARTORATTO A MACHADO A L M DELARMELINA C Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil Brazilian Journal of Microbiology 35275-280 2004 SAVI A O BREVIGLIERI E BELLA CRUZ A YUNES R CECHINEL FILHO V Antibacterial activity of Bauhinia splendens leaves (Leguminosae) Revista Biologia Tropical v 44 n3 v45 n1 p 601-603 1997 SCALBERT A Quantitative methods for the estimation of tannins in plant tissues In HEMINGWAY R W LAKS P E Plant Polyphenols New York Plenum Press p 259-280 1992 SCHITTO G ldquoThe importance of the development of antibiotic resistence in Staphylococcus aureusrdquo Clinical Microbiology and Infection no 12 pp3-8 2006 SCHLEMPER S R SCHLEMPER V SILVA D CORDEIRO F BELLA CRUZ A OLIVEIRA A E CECHINEL FILHO V Antibacterial activity of Persea cordata steam barks Fitoterapia v 72 n1 p 73-75 2001 SHARMA O P DAWRA R K Thin-layer chromagraphyc separations of lantadens the pentacyclic triterpenoids from (Lantana camara) Plant Journal of Chromatography A v 587 p 351-354 1991 SIMOtildeES C M O SCHENKEL E P GOSMAN G MELLO J C P MENTZ L A PETROVICK P R Farmacognosia da planta ao medicamento 5 ed Porto Alegre Ed Universitaacuteria UFRGSUFSC p 371-379 2004 SIMOtildeES K D U J PESSONI R A B CARDOSO-LOPES E M VIVANCO J M STERMITZ F R BRAGA M R Ipomopsin and hymenain two biscoumarins from seeds of Hymenaea courbaril Phytochemistry Letters v2 p59ndash62 2009 SINGH K V SHUKLA N P Activity on Multiple resistant bacteria of garlic (Allium sativum) extract Fitoterapia 55313-315 1984 STERN J L HAGERMAN A E STEINBERG P D MASON P K Phlorotannin-protein interactions Journal of Chemical Ecology v22 p1887-1899 1996 TERRAS F R G SCHOOFS H M E THEVISSEN H M E BROEKAERT W F Synergistic enhancement of the antifungal activity of wheat and barley thionins by radish and oilseed rape 2S albumins and by barley trypsin inhibitors Plant Physiology v103 p1311-1319 1993

110

TOMAZZONI M I NEGRELLE R R B CENTA ML Fitoterapia popular a busca instrumental enquanto praacutetica terapecircutica Texto amp Contexto Enferm Florianoacutepolis v15 n1 p115-21 2006 TORSSEL B G Natural product chemistry A mechanistic and biosynthetic approach to secondary metabolism New York John Willey p 401 1989 VEIGA JUNIOR V F PINTO A C Plantas medicinais cura segura Quiacutemica Nova v 28 p 519-528 2005 VILA VERDE G M PAULA J R CARNEIRO D M ldquoLevantamento etnobotacircnico das plantas medicinais do cerrado utilizadas pela populaccedilatildeo de Mossacircmedes (GO)rdquo Revista Brasileira de Farmacognosia n13 p 64-66 2003 VOLAK J STODOLA J Plantas medicinais Satildeo Paulo Ed Inqueacuterito p 319 1990 WAGNER H BLADT S Plant drug analisis A thin layer chromatography atlas 2ed Berlin Springer Verlag p 384 1996 WAGNER H ULRICH-MERZENICH G Synergy research approaching a new generation of phytopharmaceuticals Phytomedicine v 16 n 2 p 97-110 2009 WALLENFELS K Detection of reducing sugars in paper chromatogram and quantitative evaluation Naturwissenschaften v 37 p 491-492 1950 WATSON L AND DALLWITZ MJ onwards The families of flowering plants descriptions illustrations identification and information retrieval 1992 Disponiacutevel em lthttpdelta-intkeycomangiogt Acesso em 10 fev 2013 195350 WILCOX D DOVE B MCDAVID D GREER D Image Tool University of Texas Health Science Center San Antonio Texas 2002 ZACCHINO S A YUNES R A CECHINAL FILHO V ENRIZ R D KOUZNETSOV V RIBAS J C The need for new antifungal drugs screening for antifugal compounds with a selective mode of action with emphasis on the inhibitors of the fungal cell wall In Rai M Mares D (Editors) Plant-derived antimycotics current trends an future prospect The Haworth Press p 1-4 2003 ZHANG Y amp LEWIS K Fabatins new antimicrobial plant peptides FEMS Microbiological Letters v149 p59-64 1997 ZHAO W HU Z OKUBO S amp HARA Y (2001) Mechanism of Synergy between Epigallocatechin Gallate and β -Lactams against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Antimicrobial Agents Chemotherapy v45 n6 p1737 2001

111

4 ASSOCIACcedilAtildeO DO EXTRATO HIDROALCOOacuteLICO DA CASCA DO CAULE DE

Hymenaea stigonocarpa MART EX HAYNE COM AGENTES ANTIMICROBIANOS

FRENTE A CEPAS DE Staphylococcus aureus RESISTENTES A METICILINA

(MRSA)






Staphylococcus aureus resistente agrave meticilina (MRSA) eacute um microrganismo

patogecircnico nosocomial de ampla disseminaccedilatildeo e a sua prevalecircncia na comunidade

tem sido tambeacutem relatada Existem publicaccedilotildees abordando o surgimento de cepas

de MRSA mostrando resistecircncia a vaacuterios outros agentes antimicrobianos Desta

forma o desenvolvimento de tal multirresistecircncia resultou em uma limitaccedilatildeo

terapecircutica e num prognoacutestico desfavoraacutevel para o paciente (CATAtildeO et al 2013)

Considerando-se o fato da resistecircncia de cepas MRSA agrave muacuteltiplas drogas

estudos que buscam avaliar as propriedades antibacterianas de plantas superiores

contra microrganismos resistentes satildeo incentivados pelos oacutergatildeos puacuteblicos de todo

mundo (MANDAL et al 2010)

O sinergismo entre agentes antimicrobianos convencionais e os compostos

bioativos de plantas eacute uma metodologia que tem sido amplamente estudada para

bloquear o desenvolvimento da multirresistecircncia A terapia com associaccedilatildeo de

drogas na maior parte das vezes eacute beneacutefica para o paciente portador de infeccedilotildees de

difiacutecil tratamento (OKOYE et al 2013) Vaacuterios estudos tecircm relatado efeitos

sineacutergicos com reduccedilatildeo significativa nas concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas (CIM)

dos antibioacuteticos resultante da combinaccedilatildeo de diferentes antibioacuteticos com diferentes

extratos brutos de plantas (ADWAN et al 2010)

Diversos estudos tecircm investigado as interaccedilotildees entre antibioacuteticos e extratos

brutos contra Staphylococcus aureus multidroga resistente (GIBBONS 2004

ROCCARO et al 2004 FUJITA et al 2005 HATANO et al 2005 KITAHARA et al

2006 BETONI et al 2006 ESIMONE et al 2006 ADWAN et al 2008 PESEWU et

al 2008)

112

A abordagem natildeo eacute exclusiva para combinaccedilotildees de extratos mas tambeacutem

combinaccedilotildees entre metaboacutelitos secundaacuterios isolados e oacuteleos essenciais com

agentes antimicrobianos (HEMAISWARYA et al 2008 WAGNER MERZENICH

2009) Aleacutem de atingir efeitos sineacutergicos associaccedilotildees de dois ou mais compostos

satildeo utilizados pelas seguintes razotildees (1) para prevenir o surgimento de cepas

resistentes (2) para diminuir a dose-toxica relacionada (3) para atingir o amplo

espectro de atividade (TAMA et al 2012)

No presente estudo foi avaliada a interaccedilatildeo entre o extrato hidroalcooacutelico de

Hymenaea stigonocarpa e antibioacuteticos beta-lactacircmicos e fluoroquinolonas frente a

S aureus multidroga resistentes

411 A evoluccedilatildeo da resistecircncia de Staphylococcus aureus aos agentes

antimicrobianos

O gecircnero Staphylococcus pertencente agrave famiacutelia Micrococcaceae eacute composto

de 33 espeacutecies 17 das quais podem ser isoladas de amostra bioloacutegica humana Os

estafilococos satildeo geralmente encontrados na pele e em mucosas de humanos e de

outros animais (MENEGOTTO PICOLI 2007)

A utilizaccedilatildeo indiscriminada de antimicrobianos provocou um aumento no

aparecimento de cepas resistentes especialmente agravequelas isoladas nos ambientes

hospitalares (DAVIES DAVIES 2010)

Desde 1961 as cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina

(MRSA) vecircm sendo associado agraves infecccedilotildees relacionadas aos cuidados em sauacutede e

tem se tornado causa do aumento da relaccedilatildeo morbidademortalidade em pacientes

hospitalizados (MULLIGAN 1993 LIVERMORE et al 2003 SANTOS et al 2007)

Wang e Barrett (2007) relataram que os surtos de infecccedilatildeo por MRSA tecircm

sido frequentes em unidades de terapia intensiva e apresenta uma ameaccedila agrave

sobrevivecircncia de pacientes imunocomprometidos

Os primeiros relatos de surtos de infecccedilatildeo hospitalar provocadas por MRSA

foram documentados no Reino Unido que rapidamente emergiram em outros paiacuteses

da Europa sendo na ocasiatildeo isoladas no Japatildeo Estados Unidos e Austraacutelia (TARAI

et al 2013)

Na deacutecada de 80 no Japatildeo os casos de infecccedilatildeo nosocomial decorrentes de

MRSA tornaram-se um problema de sauacutede puacuteblica sendo que 50 a 70 dos casos

113

de infecccedilatildeo nosocomial causados por cepas de S aureus apresentaram resistecircncia

agrave meticilina (ANDO et al 2004) acarretando na extensa utilizaccedilatildeo de cefalosporinas

de terceira geraccedilatildeo (ITO HIRAMATSU 1998) No Reino Unido MRSA eacute o agente

etioloacutegico mais frequentemente isolado de infecccedilotildees nosocomiais e eacute responsaacutevel

por 15 das infecccedilotildees hospitalares adquiridas custando cerca de 1 bilhatildeo de libras

ao Serviccedilo Nacional de Sauacutede por ano (CEPEDA et al 2005)

O programa de vigilacircncia antimicrobiana SENTRY na Ameacuterica Latina

vinculado ao laboratoacuterio Bristol-Myers Squibb revelou um aumento na prevalecircncia de

MRSA entre infecccedilotildees estafilocoacutecicas em centros meacutedicos de 338 em 1997 para

402 em 2006 sendo esses dados fortemente influenciados por paiacuteses

especiacuteficos com 41 das cepas de MRSA coletados provenientes do Brasil (MEJIacuteA

2010)

A colonizaccedilatildeo por MRSA eacute comum tanto em pacientes hospitalizados quanto

pacientes comunitaacuterios Uma determinada populaccedilatildeo satilde pode servir como

reservatoacuterio para esse micro-organismo (DURAI et al 2010) De acordo com Witte e

MIELKE (2007) cerca de 30 da populaccedilatildeo mundial pode estar hospedando cepas

de MRSA Morita et al (2007) detectaram a presenccedila de cepas de MRSA nas

fossas nasais de 3 dos pacientes analisados

As cepas de MRSA apresentam fenoacutetipo de resistecircncia natildeo somente aos

beta-lactacircmicos mas tambeacutem a fluoroquinolonas cloranfenicol clindamicina

tetraciclina e aminoglicosiacutedeos (CLSI 2012) Os glicopeptideos vancomicina e

teicoplanina satildeo utilizados para o tratamento de infecccedilotildees causadas por MRSA no

entanto modificaccedilotildees na terapecircutica mostram-se necessaacuterias devido a intoleracircncia

por parte dos pacientes ou falha no tratamento por seleccedilatildeo de cepas resistentes A

resistecircncia de MRSA aos glicopeptideos pode estar relacionada ao espessamento

da parede celular com reduccedilatildeo da permeabilidade e da atividade autoliacutetica (THATI et

al 2011)

As cepas de MRSA estatildeo se tornando resistentes a vancomicina resultando

em trecircs cepas adicionais resistentes ao antimicrobiano S aureus vancomicina

intermediaacuterio S aureus vancomicina intermediaacuterio heterogecircneo (duas

subpopulaccedilotildees uma sensiacutevel e outra resistente a vancomicina coexistindo numa

mesma cultura) S aureus vancomicina resistente (DURAI et al 2010) As cepas de

MRSA com resistecircncia intermediaacuteria e heterogecircnea a vancomicina podem se tornar

totalmente resistentes durante infecccedilotildees persistentes em que haacute falha na resposta

114

ao tratamento com glicopeptideos com significativas mudanccedilas de fenoacutetipo

(MOORE et al 2003 TENOVER et al 2005)

A uacutenica forma de se detectar uma cepa de Staphylococcus aureus com

resistecircncia intermediaacuteria agrave vancomicina eacute por meio da anaacutelise de suas

subpopulaccedilotildees em que satildeo inoculadas diferentes diluiccedilotildees de uma suspensatildeo

bacteriana em meio de cultura soacutelido adicionado de concentraccedilotildees crescentes de

vancomicina (SANTOS et al 2007)

Melo e colaboradores (2005) relataram que na cidade de Uberlacircndia Brasil

9 de 41 pacientes portadores de cepas MRSA em tratamento com vancomicina

desenvolveram resistecircncia heterogecircnea e um dos isolados apresentou uma

Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM) da ordem de 8microgmL A quantidade de cepas

MRSA tem crescido limitando as alternativas terapecircuticas para seu controle

(PESAVENTO et al 2007)

4111 Staphylococcus aureus RESISTENTES A METICILINA

Cepas de S aureus podem se tornar MRSA a partir da aquisiccedilatildeo do gene

mecA que codifica a proteiacutena ligadora de penicilina (PBP2a) presente em sua

parede celular apresentando dessa forma baixa afinidade a meticilina bem como

aos antimicrobianos betalactacircmicos (BANSAL et al 2013) Esta resistecircncia

promovida por MRSA estaacute na expressatildeo do cassete gecircnico SCCmec Esse gene eacute

definido pela combinaccedilatildeo do tipo de gene das ccrs recombinases responsaacuteveis pelo

complemento e a classe do complexo mecA (MIMICA 2011 UDO et al 2013)

O cassete gecircnico SCCmec tipos I II e III associados a infecccedilotildees

nosocomiais tecircm como caracteriacutestica a resistecircncia a muacuteltiplos antimicrobianos aleacutem

dos betalactacircmicos como os macroliacutedeos aminoglicosiacutedeos tetraciclinas

rifampicina e quinolonas (NORIEGA SEAS 2010)

Uma estrateacutegia empregada para vencer a resistecircncia bacteriana eacute a

combinaccedilatildeo de agentes antimicrobianos sendo os inibidores das beta-lactamases

satildeo administrados como co-droga Quanto a esta estrateacutegia a mais bem sucedida

que tem sido adotada para inibir as beta-lactamases eacute atraveacutes da administraccedilatildeo do

com drogas associadas a substacircncias tais como o aacutecido clavulacircnico ao sulbactam e

ao tazobactam mas a frequente utilizaccedilatildeo do clavulanato tem favorecido ao

surgimento de cepas bacterianas resistentes (WATKINS et al 2013)

115

412 Associaccedilotildees entre metaboacutelitos secundaacuterios e agentes antimicrobianos

Metaboacutelitos secundaacuterios satildeo considerados uma fonte promissora para a

terapia antimicrobiana seja ela combinada ou natildeo Vaacuterios metaboacutelitos secundaacuterios

atuam como modificadores da resistecircncia bacteriana agindo em pontos especiacuteficos

da ceacutelula procarioacutetica potencializando o efeito do antimicrobiano sinteacutetico

(CHOVANOVAacute et al 2013)

A modificaccedilatildeo no perfil da resistecircncia bacteriana apoacutes a associaccedilatildeo dos

metaboacutelitos secundaacuterios aos agentes antibacterianos pode ocorrer a partir de

diferentes mecanismos tais como a inibiccedilatildeo das bombas de efluxo (HANDZLIK et al

2013) de enzimas que degradam os antimicrobianos (SOLANKI

SELVANAYAGAM 2013) da atividade ou da produccedilatildeo de receptores que sofreram

mutaccedilotildees (HEMAISWARYA et al 2008) e aumento da permeabilidade da parede

celular permitindo que os antibioacuteticos tenham acesso a alvos citoplasmaacuteticos

(OLAJUYIGBE amp AFOLAYAN 2013)

Vaacuterios estudos comprovam que uso combinado de antibioacuteticos e polifenois

pode aumentar a atividade antimicrobiana atraveacutes de interaccedilotildees sineacutergicas

(BANSAL et al 2013)

Dentro deste contexto surge o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa espeacutecie popularmente conhecido como jatobaacute-do-cerrado que

apresenta grande concentraccedilatildeo de polifenois e comprovada atividade frente a cepas

de Staphylococcus aureus de diferentes perfis de resistecircncia

116

42 OBJETIVOS

O objetivo geral e os especiacuteficos deste estudo estatildeo descritos a seguir

421 Objetivo geral

Avaliar a interaccedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico obtido a partir da casca do caule

de Hymenaea stigonocarpa e agentes antimicrobianos frente a cepas de

Staphylococcus aureus multidroga resistentes


Determinar a concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo bactericida

miacutenima (CBM) do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa bem

como dos agentes antimicrobianos

Avaliar a interaccedilatildeo entre o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa e

agentes antimicrobianos de diferentes classes frente a cepas de

Staphylococcus aureus MRSA

Observar as alteraccedilotildees ultraestruturais causadas pela associaccedilatildeo

extratoagente antimicrobiano que apresentou maior efeito sineacutergico frente agraves

cepas de Staphylococcus aureus (extrato Oxacilina)

117


A seguir estatildeo descritos os materiais e meacutetodos utilizados para a realizaccedilatildeo

deste estudo

431 Material vegetal



Camocim de Satildeo Feacutelix Pernambuco (de latitude 8deg213000S e longitude

35deg475670O)


Pernambuco Dra A Bocage sendo a excicata depositada sob o nuacutemero 53563 no

Herbaacuterio Daacuterdano de Andrade Lima pertencente ao mesmo instituto As cascas do

caule foram submetidas agrave secagem em estufa a uma temperatura de 40degC durante

72h em seguida pulverizadas em moinho de martelos (Tigre ASN5) e estocada em


432 Procedimentos extrativos

Cerca de 20 g de amostra triturada da casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa foi submetida agrave uma extraccedilatildeo por maceraccedilatildeo em 200 mL da soluccedilatildeo

hidroalcooacutelica por um periacuteodo de 72h em frasco acircmbar e em temperatura ambiente

(23 plusmn 1 ordmC) com agitaccedilatildeo manual e ocasional a cada 12h Apoacutes este periacuteodo a

soluccedilatildeo foi filtrada em papel de filtro (Whatmann no 2)

Posteriormente o extrato foi concentrado em rota evaporador obtendo-se

assim um extrato seco que foi utilizado para avaliaccedilatildeo da atividade anti-

estafilocoacutecica

433 Determinaccedilatildeo da atividade anti- estafilocoacutecica in vitro

Para determinaccedilatildeo da atividade anti-estaficoacutecica in vitro frente foram

realizadas os procedimentos descritos a seguir

118


Os agentes antimicrobianos foram selecionados com base na publicaccedilatildeo do

manual do ano de 2012 do instituto americano Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI) que divide os agentes antimicrobianos em diferentes grupos de

acordo com os ensaios frente agraves diferentes espeacutecies de bacteacuterias e os siacutetios

corpoacutereos do isolamento

Neste estudo foram utilizadas cepas de Staphylococcus aureus com

diferentes perfis de resistecircncia previamente determinados por difusatildeo em meio

soacutelido desta forma foram selecionados antimicrobianos de diferentes classes para

realizaccedilatildeo desta avaliaccedilatildeo

Os agentes antimicrobianos penicilina oxacilina e claritromicina presentes

no grupo A satildeo indicados para os testes de rotina Aleacutem desses foram avaliados

vancomicina e linezolide pertencentes ao grupo B indicados quando os micro-

organismos satildeo resistentes aos antimicrobianos do grupo A Tambeacutem foram

avaliados agentes antimicrobianos que devem ser testados frente a cepas

endecircmicas resistentes a drogas do grupo A (grupo C) sendo entatildeo utilizados

ciprofloxacino e gentamicina

Aleacutem seguir os criteacuterios do CLSI os agentes antimicrobianos foram

selecionados de acordo com o seu mecanismo de accedilatildeo microbiano

Os agentes antimicrobianos selecionados foram β-lactacircmicos glicopeptideos

aminoglicosiacutedeos macroliacutedeos fluoroquinolonas e ozaxolidinonas Os antibioacuteticos β-

lactacircmicos e glicopeptideos inibem a siacutentese da parede celular Os aminoglicosiacutedeos

e macroliacutedeos e ozaxolidinonas inibem a siacutentese proteica sendo os

aminoglicosiacutedeos na porccedilatildeo 30S do ribossomo e os macroliacutedeos e oxazolidinonas

na porccedilatildeo 50S As fluoroquinolonas agem por inibiccedilatildeo da atividade da enzima DNA-

girase (Goodman Gilmans 2008)

Os agentes antimicrobianos foram adquiridos das seguintes empresas

Penicilina (Laboratoacuterio Teuto Brasileiro SA) oxacilina e vancomicina (Novafarma

Induacutestria Farmacecircutica) linezolida (Laboratoacuterios Pfizer LTDA) gentamicina

(Hipolabor Farmacecircutica LTDA) e claritromicina e ciprofloxacino (Eurofarma

Laboratoacuterio do Brasil LTDA)

119

4332 Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees

O extrato hidroalcooacutelico (10 mg) foi pesado e solubilizado em sistema

composto de etanolaacutegua (11 vv) obtendo-se assim soluccedilatildeo estoque padronizadas

em 1024 microgmL Os agentes antimicrobianos foram solubilizados em aacutegua destilada

esterilizada de forma a obter uma soluccedilatildeo estoque de 2048 microgmL

4333 Micro-organismos

Os micro-organismos utilizados para a realizaccedilatildeo da avaliaccedilatildeo antimicrobiana

dos extratos de Hymenaea stigonocarpa foram mantidos no Laboratoacuterio de Fisiologia

e Bioquiacutemica de Micro-organismos do Departamento de Antibioacuteticos da UFPE

Foram utilizados neste estudo os seguintes micro-organismos Staphylococcus

aureus (ATCC 25923 e ATCC 33591 LFBM13 IC17 UFPEDA 01 AM 13 AM 18

AM 19 AM 20 AM 21 e AM 24)

4334 Preparaccedilatildeo do inoacuteculo

As culturas de S aureus foram preparadas em caldo Mueller Hinton e

incubadas por 24 horas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo estas culturas foram

padronizadas em 108 UFCmL utilizando o tubo 05 da escala de Mac Farland e em

seguida diluiacutedas em soro fisioloacutegico a fim de obter um inoacuteculo final de 107 UFCmL

4335 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo


A Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (MIC) foi determinada pelo meacutetodo de




Inicialmente as soluccedilotildees estoque dos extratos e dos agentes antimicrobianos

foram esterilizadas por filtraccedilatildeo atraveacutes de membrana de porosidade de 022 microm

Miliporereg Um volume de 200 microL foi adicionado nos poccedilos de 1 a 12 referente a linha

120

A Os demais poccedilos foram preenchidos inicialmente apenas com 100 microL de caldo

Mueller-Hinton

Uma transferecircncia de 100microL foi realizada do conteuacutedo dos poccedilos da linha A

para os da linha B e assim sucessivamente ateacute a linha H sendo desprezados os

uacuteltimos 100 microL obtendo-se desta forma concentraccedilotildees decrescentes Para o extrato

foram avaliadas concentraccedilotildees de 1024 a 8 gmL e para os agentes

antimicrobianos de 2048 a 006 microgmL em placas distintas

Apoacutes a diluiccedilatildeo dos agentes antimicrobianos 5 microL das suspensotildees

bacterianas foram inoculados obtendo-se em cada poccedilo uma concentraccedilatildeo final de

104 UFCpoccedilo As microplacas foram incubadas em estufa bacterioloacutegica a 37degC por

24 horas A determinaccedilatildeo da viabilidade dos micro-organismos foi verificada atraveacutes

da adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo aquosa a 05 de cloridrato de 235 trifeniltetrazoacutelio

(TTC) As microplacas foram novamente incubadas por mais trecircs horas a 37degC

Apoacutes esse intervalo de tempo a leitura da placa foi realizada a presenccedila de uma


inibitoacuterio dos agentes antimicrobianos ou seja houve crescimento bacteriano

enquanto que a ausecircncia de cor foi considerada prova positiva da accedilatildeo

antimicrobiana dos extratos

A menor concentraccedilatildeo dos agentes antimicrobianos capaz de inibir o

crescimento visiacutevel das cepas de S aureus foi verificada e definida como

Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima (CIM)

Para a Determinaccedilatildeo da Concentraccedilatildeo Bactericida Miacutenima (CBM) as

concentraccedilotildees mais altas que a CIM foram semeadas em Mueller Hinton Agar e

incubadas por 24 horas a 37˚C

A CMB foi definida como a menor concentraccedilatildeo dos agentes antimicrobianos

em que 999 da populaccedilatildeo foram inviabilizadas Todos os experimentos foram

realizados em duplicata em dias diferentes

4336 Avaliaccedilatildeo in vitro da interaccedilatildeo entre o extrato hidroalcooacutelico de Hymeneae

stigonocarpa com agentes antimicrobianos

O estudo da interaccedilatildeo entre o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa e os agentes antimicrobianos foi realizado de acordo com o meacutetodo do

tabuleiro de xadrez (LORIAN 1996) Para este estudos foram selecionadas as

121

cepas de Staphylococcus aureus que se apresentaram mais resistentes aos

antimicrobianos avaliados (AM 13 AM 18 AM 24 ATCC 33591)

Com base nos valores da CIM foram preparadas soluccedilotildees em caldo Mueller

Hinton do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa e dos agentes

antimicrobianos de forma a obter concentraccedilotildees de 05 ateacute 0016 da CIM e de 05 a

0002da CIM respectivamente (Figura 1) Nos poccedilos das placas de microdiluiccedilatildeo

foram pipetados 100 microL do extrato e 100 microL do agente antimicrobiano

Figura 46 ndash Representaccedilatildeo do meacutetodo do tabuleiro de xadrez

Cada poccedilo foi inoculado com 5 microL da suspensatildeo bacteriana padronizada em

107 UFCmL

A interaccedilatildeo entre os agentes antimicrobianos e o extrato hidroalcooacutelico de

Hymenaea stigonocarpa foi determinada pelo Iacutendice da Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria

Fracionada (FICI) a partir da seguinte equaccedilatildeo FICI = (CIM da associaccedilatildeo do extrato

hidroalcooacutelico de H stigonocarpa com agente antimicrobianoCIM do extrato

hidroalcooacutelico de H stigonocarpa) + (CIM da associaccedilatildeo agente antimicrobiano com

extrato hidroalcooacutelico de H stigonocarpa CIM do agente antimicrobiano)

Valores do FICI le 05 foram interpretados como uma interaccedilatildeo sineacutergica total

05 lt FICI le 075 um sinergismo parcial Uma interaccedilatildeo indiferente quando os

valores do FICI foram entre 075 lt FICI le 20 e um efeito antagocircnico quando FICI foi

maior que 20 (FADLI et al 2012)

A partir dos resultados dos Iacutendices da Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Fracionada

individual foram construiacutedos isobologramas (KROGSTAD MOELLERING 1991)

122

434 Determinaccedilatildeo de alteraccedilotildees ultraestruturais por microscopia eletrocircnica

de transmissatildeo

Para esta avaliaccedilatildeo foi selecionado Staphylococcus aureus cepa 24 por ser a

mais sensiacutevel a accedilatildeo das associaccedilotildees bem como a associaccedilatildeo de maior efeito

sineacutergico

Uma suspensatildeo padronizada de Staphylococcus aureus AM 24 em 107

UFCmL foi cultivadas em caldo Muller Hinton (grupo controle) e em caldo

adicionado do extrato hidroalcooacutelico a 256 microgmL (CIM) em caldo adicionado de

oxacilina 256 microgmL (CIM) e em caldo adicionado da associaccedilatildeo extrato

hidroalcooacutelico 32 microgmL e oxacilina 64 microgmL (concentraccedilotildees sineacutergicas)

As culturas foram incubadas a 37degC por 24 horas Essas culturas foram

centrifugadas e os precipitados fixados em paraformaldeiacutedo 4 e glutaraldeido 25

em 01 M de tampatildeo cacodilato de soacutedio (pH 72) por 4 horas a temperatura de 23 plusmn

1ordmC


tampatildeo e esse procedimento repetido por trecircs vezes Posteriormente os precipitados

foram poacutes-fixados em tetroxido de oacutesmio 2 ferrocianida de potaacutessio 08 e cloreto

de caacutelcio 5M em tampatildeo cacodilato de soacutedio 01M por 1 hora e lavada em tampatildeo

cacodilato de soacutedio

As amostras foram desidratadas utilizando gradiente de soluccedilotildees de acetona

que variou de 30 a 100 em seguida adicionadas agrave resina Epon 812 (Sigma

EUA) Em seguida seccedilotildees ultrafinas foram obtidas atraveacutes de um ultramicrotomo

(Leica UC6) coradas com uranil acetato e citrato de chumbo e examinado em

microscoacutepio eletrocircnico de transmissatildeo marca Morgani-FEIreg (Eindhoven Holanda)

123


Staphylococcus aureus eacute comumente associado a infecccedilotildees hospitalares e

comunitaacuterias Atualmente medidas para controlar as infecccedilotildees por S aureus satildeo

desafiadas por um grande e continuando aumento na prevalecircncia de S aureus

resistentes a meticilina em todo mundo (ASAAD QURESHI 2013)

A maior parte da literatura mundial mostra que Staphylococcus aureus eacute um

dos principais patoacutegenos responsaacuteveis por uma seacuterie de infecccedilotildees em ambientes

hospitalares com consideraacutevel morbidade e mortalidade (VALAPERTA et al 2010)

Os valores da CIM e CBM do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa e dos agentes antimicrobianos frente agrave onze cepas de Staphylococcus

aureus estatildeo apresentados na tabela 3 O extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa mostrou atividade frente a todas as cepas de S aureus com valor de

CIM de 256 microgmL

O extrato hidroalcooacutelico eacute considerado de uma forte atividade pois de acordo

com Sartoratto e colaboradores (2004) um extrato tem uma atividade antimicrobiana

forte quando os valores da CIM estatildeo entre 50 e 500 microgmL moderada CIM entre

600 e 1500 microgmL e fraca para valores acima de 1500 microgmL

A terapia anti-MRSA eacute limitada ao uso de glicopeptideos (vancomicina

teicoplanina) oxazolidinas (linezolide) e estreptograminas (quinupristinandash

dalfopristina) (LIU et al 2011) Contudo a emergecircncia de cepas de S aureus com

resistecircncia intermediaacuteria (VISA) ou resistentes (VRSA) agrave vancomicina tem sido

descritas em todo o mundo como tambeacutem no Brasil (MIMICA et al 2006) Sendo o

primeiro caso de Staphylococcus aureus resistente agrave vancomicina descrito em junho

de 2002 nos Estados Unidos (CHANG et al 2003)

Nos uacuteltimos anos tem ocorrido um crescente interesse da comunidade

cientiacutefica pelas plantas medicinais por apresentarem potenciais terapecircuticos e

econocircmicos visados especialmente pela induacutestria farmacecircutica que realiza a

prospecccedilatildeo de novos produtos com menos efeitos indesejaacuteveis do que os faacutermacos

jaacute existentes (ROCHA et al 2013)

Todas as cepas apresentaram-se resistentes agrave penicilina com valores de CIM

variando entre 025 e 64 microgmL

As cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 AM 02 AM 05 e UFPEDA

01 mostraram-se sensiacuteveis a oxacilina (MSSA) com valores de CIM iguais a 0125

124

microgmL As cepas de Staphylococcus aureus ATCC 33591 AM 13 AM 18 AM 19

AM 20 AM 21 e AM 24 foram classificadas como MRSA pois os valores de CIM

variaram de 80 e 256 microgmL

Todas as cepas de Staphylococcus aureus avaliadas neste estudo

mostraram-se sensiacuteveis agrave vancomicina cujos valores de CIM variaram de 0125 e

025 microgmL Todas as cepas apresentaram um perfil de sensibilidade a linezolida

semelhante ao da vancomicina e a CIM variou de 025 e 20 microgmL Devido agrave

sensibilidade das cepas de Staphylococcus aureus agrave vancomicina e a linezolida

estes antimicrobianos natildeo foram selecionados para a segunda parte do nosso

estudo

De acordo com o que preconiza o CLSI 2012 antibioacuteticos β-lactacircmicos

inibidores de beta-lactamase carbapenecircmicos e cefalosporinas exceto agravequelas de

uacuteltima geraccedilatildeo) poderatildeo apresentar in vitro atividade frente a cepas MRSA mas

esta atividade natildeo se confirma in vivo Diante deste fato outros beta-lactacircmicos natildeo

foram incluiacutedos neste estudo

Plantas e seus metaboacutelitos secundaacuterios satildeo uma fonte promissora para

fornecer compostos bioativos estruturalmente diversos com potencial accedilatildeo

terapecircutica incluindo antimicrobiana (COWAN et al 1999 WINK et al 2012)

Quanto agrave espeacutecie Hymenaea stigonocarpa os extratos com maiores teores

de polifenois principalmente taninos condensados foram os que apresentam maior

atividade antibacteriana (DIMECH et al 2013)

Quando foram avaliadas as Concentraccedilotildees Inibitoacuterias Miacutenimas (CIM) dos

agentes antimicrobianos que inibem a siacutentese proteica diferentes perfis de

suscetibilidade das cepas de Staphylococcus aureus foram observados quando

comparados a linezolida Embora gentamicina e claritromicina inibam a siacutentese

proteica em receptores nas porccedilotildees 30S e 50S respectivamente os siacutetios de accedilatildeo

dessas moleacuteculas nessas subunidades satildeo diferentes dos da linezolida levando a

diferentes respostas (GOODMAN GILMANS 2008)

Gentamicina apresentou-se ativa frente agraves cepas de S aureus UFPEDA 01

AM 02 AM 20 Jaacute as cepas de S aureus AM 05 ATCC 33591 ATCC 25932 AM 13

AM 18 AM 19 AM 21e AM 24 mostraram-se resistentes a gentamicina cujos valores

de CIM variaram de 025 a 256 microgmL

125

Tabela 3 ndash CIM e CBM do extrato hidroalcooacutelico da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa e de agentes antimicrobianos frente cepas de

Staphylococcus aureus com diferentes perfis de resistecircncia

Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima CIM concentraccedilatildeo bactericida miacutenima CBM American Type Culture Collection ATCC extrato Hidroalcooacutelico EH oxacillina OXA

ciprofloxacino CIP gentamicina GET penicillina PEN Claritromicina CLA vancomicina VAN e linezolida LIN Criteacuterio de interpretaccedilatildeo CIM Penicilina (le 012

sensiacutevel ge 025 Resistente) Oxacilina (le 20 sensiacutevel ge 40 Resistente) Ciprofloxacino (le 10 sensiacutevel ge 40 Resistente) Gentamicina (le 0125 sensiacutevel ge 025

Resistente) Claritromicina (le 20 sensiacutevel ge 80 Resistente) Vancomicina (le 20 sensiacutevel ge 160 Resistente) e Linezolide (le 40 sensiacutevel ge 80 Resistente) Fonte

(CLSI 2012)

Staphylococcus aureus

CIM CBM (microgml)

EH PEN OXA CIP GEN CLA VAN LIN

ATCC 25923 256 256 025 025 0125 025 025 025 025 025 10 10 05 05 10 10

UFPEDA 01 256 256 05 10 0125 025 025 025 0125 025 05 05 025 025 025 025

AM 02 256 256 32 64 0125 0125 025 05 0125 025 20 40 05 05 05 05

AM 05 256 256 025 05 10 025 025 05 025 025 20 20 05 05 10 10

ATCC 33591 256 256 64 64 64 128 0125 0125 20 20 2048 2048 0125 025 10 10

AM 13 256 256 32 64 256 512 64 128 64 64 2048 2048 025 025 10 10

AM 18 256 256 64 64 128 256 64 128 128 256 2048 2048 025 05 10 10

AM 19 256 256 8 16 16 128 025 05 05 05 40 80 025 05 20 20

AM 20 256 256 8 16 8 16 40 80 0125 025 2048 2048 0125 025 10 10

AM 21 256 256 16 16 16 16 40 80 05 05 2048 2048 0125 0125 10 10

AM 24 256 256 32 32 256 256 64 128 256 512 2048 4096 0125 0125 10 20

12

5

126

Todas as cepas de S aureus apresentaram-se resistentes agrave claritromicina

exceto S aureus ATCC 25923 AM 02 AM 05 UFPEDA 01 e AM 19 que mostrou

resistecircncia intermediaacuteria

Ciprofloxacino foi capaz de inibir o crescimento das cepas de S aureus ATCC

25932 UFPEDA 01 AM 02 AM 05 ATCC 33591 e AM 19 mas mostrou-se ineficaz

frente a S aureus AM 13 AM 18 AM 20 AM 21 e AM 24

Estes resultados serviram de base para selecionar as cepas de S aureus

ATCC 33591 AM 13 AM 18 E AM 24 para o proacuteximo estudo

Os valores das concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas e dos iacutendices de

concentraccedilatildeo inibitoacuteria fracionada (FICI) obtidos apoacutes associaccedilatildeo do extrato

hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa com penicilina oxacilina ciprofloxacino

claritromicina ou gentamicina frente a cepas de S aureus ATCC 33591 AM 13 AM

18 e AM 24 estatildeo apresentados na tabela 4

Concentraccedilotildees sub-inibitoacuterias do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa (le 128μgmL) aumentaram a atividade de todos os agentes

antimicrobianos frente a cepas de MRSA

A atividade sineacutergica foi observada pela reduccedilatildeo dos valores da concentraccedilatildeo

inibitoacuteria miacutenima em todas as associaccedilotildees do extrato com os agentes

antimicrobianos e pelo iacutendice da Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Fracionada le 05

Vaacuterios estudos in vitro tecircm relatado efeitos sineacutergicos com reduccedilotildees

significativas nas concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas (CIM) dos antimicrobianos apoacutes

associaccedilatildeo com diversos extratos de plantas sobre cepas de Staphylococcus aureus

MRSA (ADWAN 2010 CHUNG et al 2011 AN et al 2011 CELENZA et al

2012 MACEDO 2013)

Pesquisas demonstraram agrave accedilatildeo de polifenois na potencializaccedilatildeo dos efeitos

de agentes antimicrobianos O polifenol epigalocatequina (EGCg) um tanino

condensado isolado do chaacute verde apresentou um efeito sineacutergico quando

associados agrave antibioacuteticos beta-lactacircmicos (ZHAO et al 2001) Em outro estudo Hu

e colaboradores (2002) observaram que EGCg foi capaz de inibir a penicilinase

produzida por S aureus restaurando assim a atividade antimicrobiana da penicilina

e que associaccedilatildeo de EGCg com ampicilinasulbactam foi capaz de reduzir os valores

da CIM de 16 μgmL para 4 μgmL

127

Tabela 4 - Avaliaccedilatildeo da associaccedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaeae stigonocarpa com agentes antimicrobianos frente a

cepas de Staphylococcus aureus multidroga resistes

Concentraccedilatildeo Fracionaacuteria Miacutenima FIC Concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima CIM concentraccedilatildeo bactericida miacutenima CBM American Type Culture Collection ATCC extrato Hidroalcooacutelico EH oxacillina OXA ciprofloxacino CIP gentamicina GET penicillina PEN Claritromicina CLA vancomicina VAN e linezolide LIN Reduccedilatildeo da CIM () = 100 ndash (CIM combinado times 100 CIM)

Staphylococcus Aureus

Associaccedilatildeo CIM Individual

(microgmL) Associaccedilatildeo CIM (microgmL)

FIC Individual

FICI

Efeito

Reduccedilatildeo da CIM ()

AM 13

EHPEN EHOXA EHCIP EHGEN EHCLA

256 32 256 256 256 64 256 64 256 2048

128 006 64 64 64 16 128 003 128 1

050 00020 025 02500 025 02500 050 00005 050 00005

050 050 050 050 050

Sineacutergico Sineacutergico Sineacutergico Sineacutergico Sineacutergico

500 9981 750 7500 750 7500 500 9995 500 9995

AM 18


256 64 256 128 256 64 256 128 256 2048

128 006 128 05 20 32 128 10 128 20

050 00010 050 00039 00078 050 050 00078 050 00010

050 050 051 051 050

Sineacutergico Sineacutergico S parcial S parcial Sineacutergico

500 9990 500 9961 992 5000 500 9922 500 9990

AM 24


256 32 256 256 256 64 256 256 256 2048

128 006 32 64 2 32 128 0125 128 256

050 00019 0125 0250 0008 0500 050 00005 050 01250

050 038 051 050 063

Sineacutergico Sineacutergico S parcial Sineacutergico S parcial

500 9981 875 7500 9922 500 500 9995 500 8750

ATCC 33591


256 64 256 64 256 0125 256 2 256 2048

128 006 64 16 20 006 64 05 128 10

050 00010 025 02500 0008 0500 025 02500 050 00005

050 050 051 050 050

Sineacutergico Sineacutergico S parcial Sineacutergico Sineacutergico

500 9990 750 7500 992 5000 750 7500 500 9995

12

7

128

Um mecanismos da accedilatildeo proposto para explicar a interaccedilatildeo sineacutergica entre

polifenois e antibioacuteticos β-lactacircmicos frente agrave MRSA sugere que existe uma

diminuiccedilatildeo na expressatildeo de PBP2a resultando na inibiccedilatildeo da siacutentese da parede

celular bacteriana (HUA et al 2010)

Em vaacuterias associaccedilotildees foram identificadas accedilotildees sineacutergicas exceto quando

foi avaliada a interaccedilatildeo do extrato com ciprofloxacino frente agraves cepas AM 18 AM 24

e ATCC 33591 e com gentamicina frente agrave cepa AM 18 que apresentaram valores

de FICI de 051 caracterizando um sinergismo parcial Tambeacutem foi observado esse

mesmo padratildeo de interaccedilatildeo com a associaccedilatildeo do extrato com claritromicina frente a

cepa AM 24 que apresentou valor de FICI de 063

Aleacutem de uma accedilatildeo sineacutergica a associaccedilatildeo do extrato com os agentes

antimicrobianos provocou agrave reversatildeo total da resistecircncia bacteriana frente a todas as

cepas resistentes a penicilina a trecircs cepas resistentes a claritromicina (AM 13 AM

18 e ATCC 33591) a duas cepas (AM 13 e AM 14) resistentes a gentamicina e as

cepas AM 18 e ATCC 33591 resistentes a oxacilina e ciprofloxacino

respectivamente

A associaccedilatildeo que se mostrou mais sineacutergica aquela entre o extrato e a

oxacilina frente agrave cepa de Staphylococccus aureus AM 24 com FICI de 038 (figura

47) Nesta associaccedilatildeo ocorreu uma reduccedilatildeo da CIM do extrato e do agente

antimicrobiano ambos de 256 microgmL para 32 e 64 microgmL respectivamente

Hatano e colaboradores (2005) investigando a associaccedilatildeo do polifenol

theasinensina A um isolado de frutos do gecircnero Zizyphus com a oxacilina

demonstraram que embora a CIM desses polifenoacuteis tenha sido de 256 μgmL estes

fito-compostos foram capazes de reduzir os valores da oxacilina para 4 μgmL

A accedilatildeo sineacutergica entre o extrato hidroalcooacutelico e os antibioacuteticos beta-

lactacircmicos pode ocorrer devido agrave caracteriacutestica polifenoacutelica deste extrato pois

segundo Zhao et al (2001) existe uma accedilatildeo conjunta dos polifenois e agentes β-

lactacircmicos na siacutentese de peptidoglicano da parede celular

Aleacutem disso a ligaccedilatildeo direta de polifenois com a penicilinase enzima que

inativa as penicilinas inibe a atividade enzimaacutetica da bacteacuteria e protege a penicilina

da accedilatildeo antibacteriana (ROCCARO et al 2004)

129

Figura 47 - Isobolograma revelando o efeito sineacutergico do extrato

hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa quando associado agrave

oxacilina frente agrave Staphylococcus aureus AM 24

Para esta avaliaccedilatildeo das alteraccedilotildees ultraestruturais por microscopia eletrocircnica

de transmissatildeo foi selecionada a cepa que apresentou o melhor FICI A cepa foi

cultivada de diferentes formas sem tratamento (grupo controle) apoacutes tratamento

com o extrato na CIM (256 microgml) apoacutes tratamento com oxacilina na CIM (256

microgml) e nas doses sub-inibitoacuterias associadas de acordo com os resultados obtidos

na avaliaccedilatildeo do sinergismo 32 microgml para o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa e 64 microgml para a oxacilina

Na Figura 48 (A-D) no grupo controle pode ser observada claramente a

parede celular bem definida (PM) ribossomos (R) e os septos da bacteacuteria em divisatildeo

(S)


alteraccedilotildees em vaacuterias estruturas celulares Em relaccedilatildeo agrave parede celular foram

visualizados trecircs distintos fases quanto agrave accedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico

Primeiro o espessamento da parede celular e do septo (Figuras 48 E e F) e

divisatildeo aberrante do septo devido ao aumento da produccedilatildeo de mais peptidoglicano

Isso indica a presenccedila de mecanismos de defesa para manter a pressatildeo osmoacutetica

devido agrave accedilatildeo do extrato hidroalcooacutelico

Num segundo momento a formaccedilatildeo de rupturas na parede celular (Figuras 48

F e G) que ocorre devido agrave falha na accedilatildeo de enzimas bacterianas chamadas

autolisinas presentes entre os peptidoglicanos a fim de permitir a inserccedilatildeo de novas

FIC I = 038

130

moleacuteculas (SANTHANA 2007) Por fim eacute visualizado o desligamento da parede

celular (Figuras 48 G e H) a condensaccedilatildeo do ribossomo (Figuras 48 F - H) e o

rompimento da parede celular com liberaccedilatildeo de materiais celulares do citoplasma

(Figura 48 H)

Quanto agrave accedilatildeo da oxacilina (figuras 48 I - M) foi observado o espessamento e

divisatildeo anormal do septo (figuras 48 I - L) e visualizadas formaccedilatildeo de rupturas

(figura 48 I) e destacamento da parede celular (figura 48 M) poreacutem natildeo foi

observado espessamento da parede celular assim como a coagulaccedilatildeo do DNA

como no tratamento com o extrato

Esses resultados satildeo compatiacuteveis com os observados por Santhana e

colaboradores (2007) que descrevem o destacamento da parede celular com

ausecircncia de coagulaccedilatildeo de DNA apoacutes tratamento com oxacilina

Essa ausecircncia de alteraccedilotildees no interior da ceacutelula pode ser explicada pelo

modo de accedilatildeo da oxacilina que inibe a enzima transpeptidase (tambeacutem chamadas

proteiacutenas de ligaccedilatildeo agrave penicilina PBP) (SCHITO 2006) fazendo com que a parede

celular das bacteacuterias torne-se mais fraca e a pressatildeo osmoacutetica subsequentemente

lise as bacteacuterias natildeo ocorrendo desta forma alteraccedilotildees estruturais no interior das

bacteacuterias

Quando analisamos os efeitos ultraestruturais da associaccedilatildeo de doses sub-

inibitoacuterias de oxacilina e o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa

podemos sugerir que o efeito sineacutergico ocorre tanto pela accedilatildeo das duas substacircncias

na parede celular (figuras 48 A - M) como o extrato apresenta accedilatildeo na coagulaccedilatildeo

do DNA em uma fase secundaacuteria agrave lise da parede celular O que natildeo ocorre quando

administramos apenas a oxacilina o que pode ser observado na figura 3M onde

visualizamos que mesmo apoacutes o destacamento da parede celular pela accedilatildeo da

oxacilina natildeo ocorre coagulaccedilatildeo no DNA da ceacutelula diferente ao que ocorreu nas

figuras 48 N a P onde pode ser visualizada a coagulaccedilatildeo apoacutes a accedilatildeo do extrato

Desta forma podemos sugerir que a associaccedilatildeo do extrato com os agentes

antimicrobianos apresenta efeitos sineacutergicos e em alguns casos aditivos por

diferentes motivos dependendo do mecanismo de accedilatildeo dos antimicrobianos

131

Ceacutelulas natildeo tratadas (A-D) mostram parede celular (PC) ribossomo (R) e septo (S) da bacteacuteria bem distintos Tratadas com extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa na concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (E-H) mostram formaccedilatildeo de orifiacutecios na

parede celular (OPC) espessamento da parede celular (EPC) assim como espessamento do septo (ES) condensaccedilatildeo do ribossomo (CR) desprendimento da parede celular (DPC) espessamento (ES) e divisatildeo aberrante do septo (DAS) Tratadas com oxacilina na concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (I-M) mostram espessamento (ES) e divisatildeo aberrante do septo (DAS) aparecimento de orifiacutecios (OPC) assim como destacamento da parede celular (DPC) Tratadas com oxacilina associada ao extrato (N ndash Q) mostram Coagulaccedilatildeo do DNA (CD) orifiacutecios (OPC) e destacamento da parede celular (DPC) Aumento de 30000X

Figura 48 - Microscopia eletrocircnica de transmissatildeo da cepa de S aureus AM 24 submetida a

tratamento com oxacilina e o extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa

A B C D

N O P Q

E F G H

PC

MP R

PC

MP

R

S

PC

MP

R

S

PC MP

R S

EPC MP

CR

ES

EPC

ES

CR

OPC

CD

CR ES

CR DPC

CD OPC

DPC

CD

CD

OPC CD

DAS

ES

ES

OPC DAS

OPC DPC

I J L M

OPC

DAS

J

DAS

OPC

DAS

132

45 CONCLUSOtildeES

No caso dos inibidores das subunidades 50S E 30S nos ribossomos

(Linezolide gentamicina e claritromicina) o sinergismo ocorreria pela lise da parede

celular provocada pelo extrato o que facilitaria esses agentes alcanccedilar seus siacutetios de

accedilatildeo Quanto ao ciprofloxacino aleacutem da facilitaccedilatildeo da entrada ocorreria accedilatildeo

sineacutergica na potencializaccedilatildeo da coagulaccedilatildeo do DNA

Para os inibidores da siacutentese de parede celular o sinergismo como discutido

anteriormente ocorreria pela accedilatildeo no peptidoglicano Diferenccedilas nas respostas dos

dois agentes poreacutem podem ser explicadas pelas alteraccedilotildees no sitio de accedilatildeo pois a

bacteacuteria avaliada eacute uma cepa MRSA que apresenta modificaccedilotildees na proteiacutena

ligadora de penicilina

Essa resistecircncia a oxacilina eacute associada agrave aquisiccedilatildeo de um elemento geneacutetico

moacutevel chamado SCCmec que conteacutem o gene de resistecircncia mecA (OKUMA et al

2002) O determinante mecA codifica PBP2a uma nova proteiacutena de ligaccedilatildeo agrave

penicilina com da afinidade diminuiacuteda para a oxacilina e a maioria das outras drogas

beta-lactacircmicas (TENOVER et al 2006) deste modo o sitio de accedilatildeo dos dois

agentes avaliados estaria modificado alterando a resposta de ambos

133

REFEREcircNCIAS

ADWAN M G ABU-SHANAB A B and ADWAN M K In vitro activity of certain drugs in combination with plant extracts against Staphylococcus aureus infections Pakistan Journal of Medical Science V24 p541-544 2008 ADWAN M G ABU-SHANAB B amp ADWAN M K Antibacterial activities of some plant extracts alone and in combination with different antimicrobials against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa strains Asian Pacific Journal of Tropical Medicine v3 n4 p266ndash269 2010 AN J ZUO G Y HAO X Y WANG GC LI Z S Antibacterial and synergy of a flavanonol rhamnoside with antibiotics against clinical isolates of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Phytomedicine 18 990ndash993 2011 ANDO E K MONDEN R MITSUHATA R KARIYAMA AND H KUMON Biofilm formation among methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from patients with urinary tract infection Acta Medica Okayama v58 p 207-214 2004 BANSAL S CHOUDHARY S SHARMA M KUMAR S S LOHAN S BHARDWAJ V JYOTI S Tea A native source of antimicrobial agents Food Research International v53 n2 p568ndash584 2013 BETONI J E C MANTOVANI R P BARBOSA L N DI STASI L C FERNANDES JUNIOR A Synergism between plant extract and antimicrobial drugs used on Staphylococcus aureus diseases Memoacuterias do Instituto Oswaldo Cruz v 101 p 387-390 2006 CATAtildeO R M R SILVA P M F FEITOSA R J P PIMENTEL M C PEREIRA H S Prevalence of hospital-acquired infections caused by Staphylococcus aureus and antimicrobial susceptibility profile Revista enfermagem UFPE on linev7 n8 p5257-64 2013 CELENZA G SEGATORE B SETACCI D BELLIO P BRISDELLI F PIOVANO M GARBARINO JA NICOLETTI M PERILLI M AMICOSANTE G S In vitro antimicrobial activity of pannarin alone and in combination with antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates Phytomedicine v19 p 596ndash602 2012 CEPEDA JA WHITEHOUSE T COOPER B et al Isolation of patients in single rooms or cohorts to reduce spread of MRSA in intensive-care units prospective two-centre study The Lancet v 365 p 295-304 2005 CHANG S SIEVERT D M HAGEMAN J C BOULTON M L TENOVER FC DOWNES FP Infection with vancomycin-resistant Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene New England Journal of Medicine v 348 p 1342-7 2003

134

CHOVANOVAacute R MIKULAacuteŠOVAacute M VAVERKOVAacute S In Vitro Antibacterial and Antibiotic Resistance Modifying Effect of Bioactive Plant Extracts on Methicillin-Resistant Staphylococcus epidermidis International journal of microbiology v 2013 p 1-9 2013 CHUNG P Y NAVARATNAM P CHUNG L Y Synergistic antimicrobial activity between pentacyclic triterpenoids and antibiotics against Staphylococcus aureus strains Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials v10 p1ndash6 2011 CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing Twenty-Second Informational Supplement M100-S22 Vol32 No 3 Wayne PA CLSI 2012 COWAN MM Plant products as antimicrobial agents Clinical Microbiology Rewiews v 12 n 4 p 564-582 1999 DAVIES J DAVIES D (2010) Origins and evolution of antibiotic resistance Microbiology and molecular biology reviews MMBR v 74 n 3 417ndash33 DIMECH G S SOARES L A L FERREIRA M A DE OLIVEIRA A G V CARVALHO M D C amp XIMENES E A Phytochemical and Antibacterial Investigations of the Extracts and Fractions from the Stem Bark of Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne and Effect on Ultrastructure of Staphylococcus aureus Induced by Hydroalcoholic Extract The Scientific World Journal v 2013 p 1ndash8 2013 DURAI R PHILIP C H HOQUE H Methicillin-resistant Staphylococcus aureus an update journal of Association of periOperative Registered Nurses v 91 p 599 ndash 606 2010 ELIOPOULOS G M amp MOELLERING R C Jr Laboratory methods used to assess the activity of antimicrobial combinations In Antibiotics in Laboratory Medicine 3rd edn pp 432ndash492 Edited by V Lorian Baltimore MD Williams amp Wilkins 1991 ESIMONE CO ROHA IR IBEZIM EC et al In vitro evaluation of the interaction between tea extracts and penicillin G against Staphylococcus aureus African Journal of Biotechnology v 5 p 1082-1086 2006 FUJITA M SHIOTA S KURODA T et al Remarkable synergies between baicalein and tetracycline and baicalein and beta-lactams against methicillin-resistant Staphylococcus aureus Microbiology and Immunology v 49 p 391-396 2005 GIBBONS S Anti-staphylococcal plant natural products Natural products reports v 21 p 263-277 2004 GOODMAN amp GILMANS (2008) Manual of Pharmacology and Therapeutics Nova Iorque McGraw Hill

135

HANDZLIK J MATYS A KIEĆ-KONONOWICZ K Recent Advances in Multi-Drug Resistance (MDR) Efflux Pump Inhibitors of Gram-Positive Bacteria S aureus Antibiotics v2 n1 28ndash45 2013 HATANO T KUSUDA M INADA K Effect of tannins and related polyphenols on methicillin-resistant Staphylococcus aureus Phytochemistry v 66 p 2047ndash2055 2005 HEMAISWARYA S KRUTHIVENTI A K DOBLE M Synergism between natural products and antibiotics against infectious diseases Phytomedicine v 15 p 639 ndash 652 2008 HU ZQ ZHAO WH ASANO N Epigallocatechin gallate synergistically enhances the activity of carbapenems against methicillin- resistant Staphylococcus aureus Antimicrobial agents chemotherapy v 46 p 558ndash560 2002 HUA D PENG Q HUANG Y YAO F amp QIAN Y The mechanism of synergistic antibacterial action between ECGEGCG and β-lactam antibiotics against MRSA Zhongguo Ganran Yu Hualiao Zazhi Chinese Journal of Infection and Chemotherapy v10 p123ndash126 2010 ITO T amp HIRAMATSU K Aquisition of methicilin resistance and progression of multiantibiotic resistance in methicilin-resistant Staphylococcus aureus Yonsei medical journal v 39 p 526-533 1998 KITAHARA T AOYAMA Y HIRAKATA Y et al In vitro activity of lauric acid or myristylamine in combination with six antimicrobial agents against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) International journal of antimicrobial agents v 27 n 1 p 51-57 2006 KONEMAN E W et al Diagnoacutestico microbioloacutegico texto e atlas colorido 6 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1565 p 2008 LIVERMORE DM MUSHTAQ S JAMES D et al In vitro activity of piperacillintazobactam and other broad-spectrum antibiotics against bacteria from hospitalised patients in the British Isles International journal of antimicrobial agents v 22 p 14ndash27 2003 LIU C BAYER A COSGROVE S E DAUM R S FRIDKIN SK GORWITZ R J KAPLAN S L KARCHMER A W LEVINE D P MURRAY B E RYBAK MJ TALAN DA CHAMBERS H F Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America for the Treatment of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections in Adults and Children Clinical Infectious Diseases v 52 n3 p 18-55 2011 LORIAN V Antibiotics in Laboratory Medicine 2005 4th ed pp 52ndash111 Williams amp Wilkins Co Baltimore MD USA

136

MANDAL S DEBMANDAL M PAL N K amp SAHA K Synergistic anti- Staphylococcus aureus activity of amoxicillin in combination with Emblica officinalis and Nymphae odorata extracts Asian Pacific Journal of Tropical Medicine v 3 n9 p711ndash714 2010 MENEGOTTO FR amp PICOLI SU Staphylococcus aureus oxacilina resistente (MRSA) incidecircncia de cepas adquiridas na comunidade (CA-MRSA) e importacircncia da pesquisa e descolonizaccedilatildeo em hospital Revista Brasileira de Analises Clinicas v 39 n 2 p 147- 50 2007 MEJIacuteA C ZURITA J GUZMAacuteN-BLANCO M Epidemiology and surveillance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Latin America The Brazilian journal of infectious diseases v14 n2 p79-86 2010 MELO GB MELO MC GAMA AP et al Analysis of the genetic diversity of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus Brazilian journal of microbiology v 36 p 126-130 2005 MIMICA M J Ceftobiprole  uma nova cefalosporina com accedilatildeo contra Staphylococcus aureus resistentes agrave oxacilina Arquivos Meacutedicos dos Hospitais e da Faculdade de Ciecircncias Medicas da Santa Casa Satildeo Paulo v56 n2 p107ndash111 2011 MOORE MR PERDREAU-REMINGTON F CHAMBERS HF Vancomycin treatment failure associated with heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus in a patient with endocarditis and in the rabbit model of endocarditis Antimicrobial agents chemotherapy v 47 p 1262-1266 2003 MORITA JE FUJIOKA RS TICE AD et al Survey of methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) carriage in healthy college students Hawairsquoi Hawaii medical journal v 66 n 8 p 213-215 2007 MULLIGAN ME Methicillin-resistant Staphylococcus aureus a consensus review of microbiology pathogenesis and epidemiology with implications for prevention and management American journal of medicine v 94 p 313-328 1993 OKOYE COB ASOGWA FC AGBO MO synergistic effect of Jatropha curcas root extract and ampicillin on Staphylococcus aureus and Escherichia coli isolated from clinical specimens International Journal of Biological amp Pharmaceutical Research v4 n11 p816-820 2013 OKUMA K IWAKAWA K TURNIDGE JD et al Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community Journal of Clinical Microbiology v40 p 4289-94 2002 OLAJUYIGBE O O amp AFOLAYAN A J (2013) Evaluation of combination effects of ethanolic extract of Ziziphus mucronata Willd subsp mucronata Willd and antibiotics against clinically important bacteria The Scientific World Journal v 2013 p1-9 2013

137

PESAVENTO G DUCCI B COMODO N NOSTRO AL Antimicrobial resistance profile of Staphylococcus aureus isolated from raw meat a research for methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Food Control v 18 p 196ndash200 2007 PESEWU GA CUTLER RR HUMBER DP Antibacterial activity of plants used in traditional medicines of Ghana with particular reference to MRSA Journal of Ethnopharmacology v 16 n 1 p 102-111 2008 RAKHOLIYA K amp CHANDA S In vitro interaction of certain antimicrobial agents in combination with plant extracts against some pathogenic bacterial strains Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine v2 n3 p1466ndash1470 2012 ROCCARO A S BLANCO A R GIULIANO F RUSCIANO D amp ENEA V Epigallocatechin-gallate enhances the activity of tetracycline in staphylococci by inhibiting its efflux from bacterial cells Antimicrobial Agents and Chemotherapy v48 1968ndash1973 2004 RODRIacuteGUEZ-NORIEGA E amp SEAS C The changing pattern of methicillin-resistant staphylococcus aureus clones in Latin America implications for clinical practice in the region The Brazilian journal of infectious diseases v14 n 2 p 87ndash96 2010 SANTHANA R L HING H L BAHARUDIN O TEH HZAIDA S R NOR ASIHA CP VIMALA B PARAMSARVARAM S SUMARI G HANJEET K ldquoUltrastructural study on the effects of antibiotics on Staphylococcus aureus ATCC 25923rdquo Annals of Microscopy no 7 p109-114 2007 SANTOS AL SANTOS DO FREITAS CC Staphylococcus aureus visitando uma cepa de importacircncia hospitalar Jornal Brasileiro de patologia e medicina laboratorial v 43 n 6 p 413-23 2007 SARTORATTO A MACHADO ALM DELARMELINA C ET AL Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants used in Brazil Brazilian Journal of Microbiology V 35 p275-280 2004 SCHITTO G ldquoThe importance of the development of antibiotic resistence in Staphylococcus aureusrdquo Clinical Microbiology and Infection n 12 p 3-8 2006 SOLANKI S S amp SELVANAYAGAM M Beta-Lactamase Inhibitory Potential and Antibacterial Potentiation of Certain Medicinal Plants and Extracts against Extended Spectrum Beta-Lactamase Producers Advanced BioTech v12 n7 p 06-10 2013 TAMMA P D COSGROVE S E amp MARAGAKIS L L Combination therapy for treatment of infections with gram-negative bacteria Clinical microbiology reviews v25 n3 p450ndash70 2012 TARAI B DAS P amp KUMAR D Recurrent challenges for clinicians emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus vancomycin resistance and current treatment options Journal of Laboratory Physicians v5 n2 p71 2013

138

TENOVER F C Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria American journal of infection control v34 n 5 Suppl 1 p 3ndash10 2006 TENOVER FC McDONALD LC Vancomycin-resistant staphylococci and enterococci Epidemiology and control Current opinion in infection disease v 18 p 300ndash305 2005 THATI V SHIVANNAVAR C T amp GADDAD S M Vancomycin resistance among methicillin resistant Staphylococcus aureus isolates from intensive care units of tertiary care hospitals in Hyderabad The Indian journal of medical research v 134 n5 p704ndash8 2011 VALAPERTA R TEJADA M R FRIGERIO M MORONI A CIULLA E CIOFFI S CAPELLI P COSTA E Staphylococcus aureus nosocomial infections the role of a rapid and low-cost characterization for the establishment of a surveillance system New Microbiologica v33 n3 p223-32 2010 WAGNER H ULRICH-MERZENICH G Synergy research approaching a new generation of phytopharmaceuticals Phytomedicine v 16 n 2-3 p 97-110 2009 WANG L BARRETT JF Control and prevention of MRSA infections Methods in Molecular Biology v 391 p 209-225 2007 WATKINS R R PAPP-WALLACE K M DRAWZ S M amp BONOMO R A (2013) Novel β-lactamase inhibitors a therapeutic hope against the scourge of multidrug resistance Frontiers in microbiology 4(December) 392 WINK M ASHOUR M L EL-READI M Z (2012) Secondary Metabolites from Plants Inhibiting ABC Transporters and Reversing Resistance of Cancer Cells and Microbes to Cytotoxic and Antimicrobial Agents Frontiers in microbiology v 3 n130 p 1-15 2012 WITTE W MIELKE M Community MRSA Zentralbl Chirurgie v 132 n 2 p 124-129 2007 ZHAO WH HU ZQ OKUBA S HARA Y SHIMAMURA T Mechanism of synergy between epigallocatechingallate and b-lactams against methicillin-resistant Staphylococcus aureus Antimicrobial agents chemotherapy v 45 p 1737ndash1742 2001

139

5 O EFEITO DE DIFERENTES MEacuteTODOS DE EXTRACcedilAtildeO SOBRE O

RENDIMENTO CONCENTRACcedilOtildeES DE FENOacuteIS TOTAIS E ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA DA CASCA DO CAULE DE Hymenaea stigonocarpa


Os fitoteraacutepicos sempre representaram uma parcela significativa no mercado de

medicamentos Dados mais recentes estimam o mercado mundial de fitoteraacutepicos

em cerca de US$ 44 bilhotildees anuais segundo a consultoria Analize and Realize

que atende algumas das maiores induacutestrias farmacecircuticas do mundo estando

este ainda em expansatildeo (DIAS et al 2013)

Apesar do Brasil apresentar um papel privilegiado no mercado mundial de

fitoteraacutepicos devido a sua extensa e diversificada flora ele natildeo tem se destacado

neste setor entre outros fatores devido a carecircncia de estudos tecnoloacutegicos capazes

de transformar plantas medicinais com potencial terapecircutico em um produto que

possa ser utilizado com exatidatildeo de dosagem garantia de eficaacutecia e seguranccedila

cliacutenica (RODRIGUES et al 2009)

A qualidade da mateacuteria-prima vegetal bem como alteraccedilotildees provenientes no

seu beneficiamento e processo extrativo tecircm grande influecircncia na composiccedilatildeo

quiacutemica das preparaccedilotildees extrativas podendo interferir na qualidade e

reprodutibilidade do produto final A padronizaccedilatildeo durante o desenvolvimento do

extrato eacute fundamental para determinar a sua utilizaccedilatildeo como mateacuteria prima para

preparaccedilotildees fitoteraacutepicas (VALANDRO et al 2007)

Para muitas espeacutecies vegetais os metaboacutelitos bioativos satildeo desconhecidos o

que natildeo se aplica agrave casca do caule de Hymenaea stigonocarpa Estudos

previamente descritos neste trabalho de tese apontam para presenccedila de compostos

fenoacutelicos principalmente taninos e flavonoides com atividade antibacteriana principal

frente a cocos Gram positivos Cepas de Staphylococcus aureus MRSA mostraram

serem sensiacuteveis aos extratos etanoacutelico hidroalcooacutelico e sua fraccedilatildeo aquosa e acetato

de etila (DIMECH et al 2013)

A extraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos em plantas eacute influenciada por sua natureza

quiacutemica pelo meacutetodo de extraccedilatildeo empregado pelo tamanho de partiacutecula da

amostra pelo tempo e condiccedilotildees de armazenamento assim como pela presenccedila de

substacircncias interferentes (SOUZA 2013)

140

Natildeo existe processo preconizado ou completamente satisfatoacuterio que seja

adequado para a extraccedilatildeo de todos os compostos fenoacutelicos ou de uma classe

especiacutefica de substacircncias fenoacutelicas em materiais de plantas Metanol etanol

acetona aacutegua acetato de etila e suas combinaccedilotildees satildeo frequentemente utilizadas

para a extraccedilatildeo de compostos fenoacutelicos (NACZKA SHAHIDI 2004)

Estudos visando o estabelecimento de paracircmetros para identificaccedilatildeo

determinaccedilatildeo das propriedades fisico-quiacutemicas da materia prima vegetal assim

como o desenvolvimento de uma soluccedilatildeo extrativa padronizada satildeo escassos

(RODRIGUES et al 2009)

O objetivo de extrair compostos fenoacutelicos a partir da planta fonte eacute a

libertaccedilatildeo destes compostos a partir das estruturas vacuolares onde eles se

encontram quer pela ruptura do tecido da planta ou por um processo de difusatildeo

(ASPEacute FERNAacuteNDEZ 2011)

Quanto aos meacutetodos de extraccedilatildeo teacutecnicas como maceraccedilatildeo aquecimento sob

refluxo infusatildeo turbo-extraccedilatildeo e sonicaccedilatildeo satildeo comumente utilizados para extrair

os metabolitos bioativos da droga vegetal (ASPEacute FERNAacuteNDEZ 2011 TIWARI et al

2011)

Aleacutem da padronizaccedilatildeo das teacutecnicas extrativas detalhes teacutecnicos a respeito do

controle desses extratos tambeacutem devem ser determinados para que exista suporte

para anaacutelises de controle de qualidade dos insumos (BORELLA et al 2012) A

padronizaccedilatildeo de fitoteraacutepicos compreende tambeacutem informaccedilatildeo e controle para

garantir a composiccedilatildeo consistente de todas os materiais vegetais incluindo

operaccedilotildees analiacuteticas para identificaccedilatildeo marcadores e doseamento de princiacutepios

ativos (CHOUDHARY SEKHON 2011)

Neste contexto os taninos tecircm sido amplamente empregados como

substacircncias marcadoras para a avaliaccedilatildeo da qualidade de diversas mateacuterias-primas

vegetais utilizadas em medicamentos (SANTOS MELLO 2003)

Os principais meacutetodos para determinaccedilatildeo a concentraccedilatildeo de taninos em

materias vegetais incluem a cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (CLAE) e a

espectrofotometria (VERZA et al 2007) As anaacutelises por CLAE podem ser

empregadas tanto para detecccedilatildeo e quantificaccedilatildeo de taninos hidrolisaacuteveis como para

taninos condensados Para os taninos condensados esta determinaccedilatildeo eacute limitada a

de poliacutemeros de taninos condensados de 7 a 8 unidades (SCHOFIELD et al 2001)

141

Um dos meacutetodos mais utilizados para o doseamento de polifenoacuteis eacute a

espectofotometria na qual se faz uso do reagente de Folin-Ciocalteu Neste meacutetodo

a reaccedilatildeo eacute inespeciacutefica para polifenoacuteis pois vaacuterias satildeo as substacircncias com

possibilidade de reaccedilatildeo (MAGALHAtildeES et al 2008) Uma forma de contornar essa

questatildeo eacute a adsorccedilatildeo dos taninos do meio com substratos proteacuteicos Assim o teor

de taninos (fraccedilatildeo adsorvida ao substrato) eacute calculado pela diferenccedila entre o teor de

polifenoacuteis totais e o da fraccedilatildeo polifenoacutelica natildeo-adsorvida (VERZA et al 2007)

Para otimizaccedilatildeo deste meacutetodo de doseamento a influecircncia de paracircmetros

reacionais como o volume do reagente de Folin-Ciocalteau concentraccedilatildeo da

soluccedilatildeo de carbonato de soacutedio e tempo de reaccedilatildeo devem ser determinados Estes

paracircmetros satildeo capazes de comprometer significativamente a reaccedilatildeo por exercerem

influecircncia sobre a resposta e a presenccedila de deslocamentos bato ou hipsocrocircmicos

(FERREIRA 2012)

Desta forma o presente estudo compara a capacidade de diferentes meacutetodos

para extraccedilatildeo de polifenoacuteis das cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa

avaliando o desempenho de cada teacutecnica pela quantificaccedilatildeo do resiacuteduo seco da

concentraccedilatildeo de fenoacuteis totais e de taninos (metaboacutelitos ativos) e a capacidade

antibacteriana dos extratos Determinando assim a teacutecnica extrativa de melhor

desempenho e estabelecendo paracircmetros de anaacutelise que podem auxiliar na

avaliaccedilatildeo da qualidade dessa droga vegetal

142

52 OBJETIVOS


521 OBJETIVO GERAL

Avaliar a Influecircncia do meacutetodos de extraccedilatildeo sobre a atividade antibacteriana

rendimento e teor dos compostos majoritaacuterios do extrato hidroalcooacutelico da casca do

caule de Hymenaea stigonocarpa

522 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS

Realizar a caracterizaccedilatildeo fisico-quiacutemica do material vegetal

Utilizar diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo e avaliar a presenccedila de variaccedilotildees

qualitativas dos metaboacutelitos secundaacuterios presentes nos diferentes extratos

atraveacutes de anaacutelise por cromatografia de camada delgada

Analisar o meacutetodo espectofotomeacutetrico para doseamento de polifenoacuteis

presentes no extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa realizando a

otimizaccedilatildeo do meacutetodo

Determinar o rendimento e as concentraccedilotildees de polifenois taninos e

flavonoacuteides totais em cada meacutetodo utilizado

Avaliar a influecircncia dos diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo sobre a atividade

antimicrobiana frente a diferentes cepas de Staphylococcus aureus

Avaliar a atividade fuacutengica do extrato de melhor rendimento frente a diferentes

especies de Candida sp

143



deste estudo

531 Coleta


coletadas em outubro de 2009 na Fa

zenda Refuacutegio localizada na cidade de Camocim de Satildeo Feacutelix Pernambuco

(de latitude 8deg213000S e longitude 35deg475670O)








532 Caracterizaccedilatildeo fiacutesico-quiacutemica do material vegetal

O material vegetal foi caracterizado atraveacutes da anaacutelise granulomeacutetrica perda

por dessecaccedilatildeo teor de extrativos e pela determinaccedilatildeo das cinzas totais para

estabelecer as caracteriacutesticas do individuo e do preparo do material vegetal que

possam influenciar avaliaccedilotildees posteriores

5321 Anaacutelise granulomeacutetrica por tamisaccedilatildeo

Amostras do material vegetal triturado (100g) foram submetidas agrave passagem

atraveacutes de tamises previamente tarados com abertura de malha de 1000 850 600

425 250 e 150microm aleacutem do coletor A tamisaccedilatildeo foi realizada durante 15 minutos em

aparelho tamisador Bertel reg calibrado para 60 vibraccedilotildees por segundo

A determinaccedilatildeo do diacircmetro meacutedio das partiacuteculas foi obtida pela curva de

distribuiccedilatildeo de retenccedilatildeo e passagem Os resultados foram expressos pela meacutedia de

144

trecircs determinaccedilotildees de acordo com o que preconiza a Farmacopeacuteia Brasileira IV

1988

5322 Determinaccedilatildeo da perda por dessecaccedilatildeo

Em pesa-filtros previamente tarados foram adicionados 20 g do material

vegetal triturado e colocados em estufa (Quimisreg) por 2 h agrave temperatura de 105 plusmn

2ordm C As amostras foram colocadas em dessecador Os pesa-filtros foram

novamente pesados em balanccedila analiacutetica (Shimadzureg) e colocados em estufa por

mais 30 min Esta operaccedilatildeo foi repetida em ciclos de uma hora ateacute peso constante

Os resultados foram expressos em percentual de perda de massa pela meacutedia de

trecircs determinaccedilotildees (Farmacopeia Brasileira 2010)

5323 Determinaccedilatildeo do teor de extrativos

Amostras contendo 10g do material vegetal triturado foram submetidas agrave

decocccedilatildeo com 100 mL de aacutegua destilada durante 10 minutos Apoacutes resfriamento os

volumes foram reconstituiacutedos e as soluccedilotildees filtradas Cerca de 200 g das soluccedilotildees

filtradas foram colocadas em pesa-filtros previamente tarados e evaporadas agrave

secura em banho-maria com agitaccedilatildeo perioacutedica para homogeneizaccedilatildeo da amostra

As amostras foram levadas a estufa por 2 h agrave 105ordmC plusmn 2ordm C resfriadas e pesadas

Em seguida estas amostras foram colocadas em estufa por 30 min e este

procedimento repetido ateacute peso constante O teor de extrativos foi calculado pela

formula descrita abaixo

Onde TE = teor de extrativos soluacuteveis em aacutegua () g = resiacuteduo seco (g) FD = fator

de diluiccedilatildeo = 5 (pesados 20 dos 100 mL totais) m = planta seca e moiacuteda (em

gramas) ppd = perda por dessecaccedilatildeo da planta seca e moiacuteda (SOUZA et al 2010)

145

5324 Determinaccedilatildeo de cinzas totais

Amostras do material vegetal triturado (3g) pesadas analiticamente foram

transferidas para cadinhos de porcelana previamente calcinados arrefecidos e

pesados

Cada uma das amostras foi distribuiacuteda uniformemente nos cadinhos e

incineradas aumentando gradativamente para 200degC por 30min 400degC por 60

minutos e 600degC por 90 minutos Apoacutes este periacuteodo os cadinhos foram transferidos

resfriados colocados em dessecador e posteriormente pesados As percentagens

de cinzas em relaccedilatildeo ao material vegetal que foi submetido ao processo de

secagem foram calculadas Os resultados foram expressos em perda de massa

percentual pela meacutedia de trecircs determinaccedilotildees (Farmacopeacuteia Brasileira V 2010)


Seis procedimentos extrativos (infusatildeo maceraccedilatildeo maceraccedilatildeo dinacircmica

refluxo turboextraccedilatildeo e ultrassom) foram realizados a partir de 20g da casca do

caule trituradas extraiacutedas com 200 mL de uma soluccedilatildeo de etanol aacutegua (11 vv) A

escolha deste sistema de solventes foi baseada em relatos etnofarmacoloacutegicos

Apoacutes a extraccedilatildeo as soluccedilotildees foram filtradas em papel de filtro (Whatmann no

2) e concentrado em rota evaporador obtendo-se assim seis extratos hidroalcooacutelicos

secos Infusatildeo (EI) maceraccedilatildeo (EM) maceraccedilatildeo dinacircmica (EMD) refluxo (ER)

turboextraccedilatildeo (ET) e ultrassom (EU) cujo rendimento foi calculado para cada caso

A teacutecnica extrativa mais eficiente foi determinada atraveacutes da avaliaccedilatildeo do

rendimento de resiacuteduo seco determinaccedilatildeo de taninos totais e da avaliaccedilatildeo da

atividade antibacteriana frente a cepas de Staphylococcus aureus

534 Descriccedilatildeo das teacutecnicas extrativas

5341 Maceraccedilatildeo

A soluccedilatildeo extrativa foi obtida por maceraccedilatildeo durante 72h Esta soluccedilatildeo foi

preparada em frasco acircmbar a temperatura 23 plusmn 1ordmC com agitaccedilatildeo ocasional a cada

12h

146

5342 Maceraccedilatildeo dinacircmica

A soluccedilatildeo extrativa foi obtida utilizando agitador magneacutetico (marca Fisatom

modelo 754A) A soluccedilatildeo foi preparada em frasco acircmbar contendo barra magneacutetica

tipo liso com anel central (14 x 76 mm) e a extraccedilatildeo se deu agrave temperatura 23 plusmn 1ordmC

Durante o processo extrativo foi aplicada uma velocidade de 300 RPM que perdurou

2 horas

5343 Ultrassom

O triturado da casca e a soluccedilatildeo extrativa foram adicionados a frasco acircmbar a

adicionados a banho de ultrassom a temperatura 23 plusmn 1ordmC sendo utilizado o

equipamento de marca Unique modelo maxiclean 1600

Natildeo foi aplicado aquecimento e o processo durou 45 minutos em frequecircncia

de 40 kHz

5344 Refluxo

O triturado da casca e a soluccedilatildeo etanol aacutegua (11 vv) foram adicionados a

um balatildeo de vidro Estes foram aquecidos em sistema de refluxo composto por uma

manta eleacutetrica (Marca Fisaton Classe 300 - Modelo 102E) como fonte de

aquecimento e balatildeo de vidro acoplado a um condensador O processo foi iniciado

apoacutes a temperatura interna de 80 ordmC e encerrado apoacutes um periacuteodo de 45 minutos

5345 Turbo-extraccedilatildeo

A soluccedilatildeo extrativa foi obtida em turbo-extrator de alta rotaccedilatildeo (marca metvisa

modelo LAR 2) consistindo de trecircs ciclos de processamento de 15 min seguidos

por uma pausa de 5 minutos para evitar aquecimento

5346 Infusatildeo

A soluccedilatildeo extrativa foi obtida apoacutes adiccedilatildeo da soluccedilatildeo etanol aacutegua (11 vv)

a temperatura de ebuliccedilatildeo ao material vegetal triturado em frasco acircmbar fechado

por um periacuteodo de 1 hora

147

535 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica

Um volume de 15 μL de cada extrato (EM EU EMD ET ER e EI) de

concentraccedilotildees padronizadas em 05 foi utilizado para a realizaccedilatildeo de

Cromatografia em Camada Delgada utilizando-se placas de gel de siacutelica (Macherey-

Nagelreg Ref 818 133)

Os sistemas de eluiccedilatildeo e reveladores apropriados para polifenoacuteis foram os

descritos por WAGNER amp BLADT 1996

536 Anaacutelises quantitativas de polifenoacuteis

A seguir estatildeo descritos os diferentes meacutetodos realizados

5361 Determinaccedilatildeo de polifenoacuteis totais

A determinaccedilatildeo de polifenois totais foi realizada apoacutes idealizaccedilatildeo do desenho

fatorial 32 a partir do meacutetodo estabelecido pela European Pharmacopoeia (2005)

53611 Desenho fatorial de 32

A fim de avaliar a influecircncia do reagente Folin-Ciocalteau da concentraccedilatildeo de

carbonato de soacutedio e do tempo de reaccedilatildeo sobre a concentraccedilatildeo de polifenois

presentes nos extratos obtidos por diferentes teacutecnicas foi idealizado um desenho

fatorial de 32 (Folin = 1 e 3 mL Carbonato = 10 e 20 Tempo = 10 e 20 min)

sendo adicionado 3 pontos centrais (Folin = 2 mL Carbonato = 15 Tempo = 15

min)

Cada ponto foi realizado em triplicata A variaacutevel dependente estudada foi agrave

absorbacircncia apoacutes reaccedilatildeo com o reagente de Folin-Ciocalteau que diretamente

refere-se agrave concentraccedilatildeo dos polifenois presentes na amostra A anaacutelise estatiacutestica

foi realizada por graacuteficos de paretos com auxiacutelio dos programas Microsoft Excel e

Statistica 60

O volume de reagente de Folin-Ciocalteu a concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo

carbonato de caacutelcio e o tempo de reaccedilatildeo foram os obtidos apoacutes o estudo de fatorial

32 sendo 3 ml e 10 e 25 minutos respectivamente

148

53612 Preparaccedilatildeo da Soluccedilatildeo Padratildeo

Foram pesados 25mg de aacutecido gaacutelico e estes solubilizados com 10 mL de

aacutegua destilada Esta soluccedilatildeo permaneceu sob agitaccedilatildeo durante 15 minutos para

completa solubilizaccedilatildeo Em seguida foi transferida para um balatildeo volumeacutetrico de 25

mL e o volume completado com aacutegua destilada Desta forma foi obtida uma soluccedilatildeo

padratildeo de concentraccedilatildeo 1000 microgmL

As condiccedilotildees experimentais para determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de aacutecido

gaacutelico (tempo de reaccedilatildeo volume do reagente de Folin-Ciocalteau e Concentraccedilatildeo de

carbonato de soacutedio) que foram utilizadas foram otimizadas por Ferreira (2012)

Desta soluccedilatildeo foram retiradas uma aliacutequota de 50 microL e transferida para uma

balatildeo volumeacutetrico (2 microgmL) ao qual foi adicionado 2 mL do reagente Folin

Ciocalteau 10 mL de aacutegua destilada e o volume completado para 25 mL com

soluccedilatildeo de carbonato de soacutedio a 10

A varredura em espectrofotocircmetro foi realizada apoacutes 15 minutos da adiccedilatildeo do

carbonato de soacutedio O comprimento de onda de 780 nm foi selecionado para leitura

apoacutes avaliaccedilatildeo da similaridade do espectro de UV entre a amostra e a substacircncia de

referecircncia

Previamente agrave determinaccedilatildeo da quantificaccedilatildeo de polifenoacuteis totais taninos e

flavonoides totais presentes nos extratos foram preparadas soluccedilotildees de

concentraccedilatildeo 20 30 40 50 60 70 e 80 microgmL de aacutecido gaacutelico (99 de pureza

Sigma Chemical Co St Louis USA) em aacutegua a fim de obter uma curva de

calibraccedilatildeo A absorbacircncia foi medida a 780nm Com os resultados da absorbacircncia

foi construiacuteda uma curva de calibraccedilatildeo

A leitura da absorbacircncia foi realizada em espectrofotocircmetro (marca Thermo

Scientific modelo Evolution 60S) em comprimento de onda de 780 nm A leitura foi

realizada apoacutes 30 min da adiccedilatildeo do reagente de oxirreduccedilatildeo (Folin-Ciocalteau)

O teor de polifenois foi determinado pela extrapolaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo

(y = 01037 x + 00024 R2 = 09992) de aacutecido gaacutelico


Foi realizada apoacutes avaliaccedilatildeo da fraccedilatildeo residual de polifenoacuteis na soluccedilatildeo

extrativa de Hymenaea stigonocarpa em funccedilatildeo da quantidade de caseiacutena

utilizando caseiacutena (Merck) como agente complexante

149

Aliacutequotas de 10 mL das soluccedilotildees extrativas foram misturadas separadamente

com quantidades crescentes de caseiacutena (50 150 250 350 450 e 500 mg) Esta

mistura foi submetida agrave agitaccedilatildeo durante 1 hora e em seguida filtrada A partir dos

filtrados aliacutequotas de 50 mL foram diluiacutedas para o volume de 25 mL com aacutegua

Dessas soluccedilotildees 20 mL foram adicionados a um balatildeo volumeacutetrico e adicionados

100 mL de aacutegua O volume de reagente de Folin-Ciocalteu a concentraccedilatildeo da

soluccedilatildeo carbonato de caacutelcio e o tempo de reaccedilatildeo foram os mesmos descritos para a

determinaccedilatildeo de polifenoacuteis totais apoacutes estudo fatorial 32 (seccedilatildeo 3511)

A concentraccedilatildeo de taninos totais foi obtida a partir da seguinte equaccedilatildeo

Onde TT = Concentraccedilatildeo de taninos Totais PT = concentraccedilatildeo de polifenoacuteis totais

e FTN = concentraccedilatildeo de polifenoacuteis na fraccedilatildeo natildeo tanante

5363 Determinaccedilatildeo de flavonoacuteides

Foram obtidos cinco niacuteveis diferentes de concentraccedilotildees (80 a 120microgmL) a

partir do padratildeo de astilbina de pureza de 99 adquirido da induacutestria Aktin

Chemicals Inc (China) Cada niacutevel de concentraccedilatildeo foi injetado no sistema

cromatograacutefico (n=3) e os valores de aacuterea maacutexima foram traccedilados contra as

concentraccedilotildees A curva foi ajustada pela regressatildeo linear atraveacutes da meacutedia das trecircs

leituras (corridas cromatograacuteficas) O teor de flavonoacuteides foi determinado entatildeo pela

extrapolaccedilatildeo da curva de calibraccedilatildeo (y = 06014 x - 05251 R2 = 09932) obtida

53631 Anaacutelise por cromatografia liquida e alta eficiecircncia acoplada a detector de

arranjo de Diodos (CLAE-DAD)

Os extratos foram solubilizados em metanol para a obtenccedilatildeo de soluccedilotildees de

concentraccedilatildeo de 400 microgMl Este concentraccedilatildeo foi selecionada apoacutes triagem previa

por gerar picos de aacutereas de valores similares as aacutereas obtidas pelas diferentes

doses de astilbina que produziram a curva de calibraccedilatildeo

Os extratos foram filtrados em membrana de politetrafluoetileno de 020 microm

(Chromafilreg) e depois adicionados frascos acircmbar As anaacutelises foram realizadas em

TT = PT - FNT

150

cromatoacutegrafo equipamento CLAE-DAD (Ultimatereg 3000 Thermo Scientificreg)

equipado com bomba binaacuteria HPG-3x00RS 3000 (RS) detector de arranjo de diodo

e coletor de amostra automaacutetico ACC-3000

As separaccedilotildees foram realizadas em uma coluna (C18) 256 x 46 mm di 5

microm (Acclaim 120 Dionexreg) equipada com (C18 4 x 3 mm di Phenomenexreg)

A fase moacutevel foi composta por aacutegua MiliQreg (eluente A) e acetonitrila (eluente

B Tediareg) ambos acidificados com 01 de soluccedilatildeo de aacutecido trifluoroaceacutetico

variando de 10-23 em 35 min para 23ndash90 em 50 min do eluente B a um fluxo

de 1mLmin

O software Chromeleon 60 (Dionexreg) foi utilizado para processamento e

aquisiccedilatildeo dos dados O teor de flavonoides em cada extrato foi determinado

utilizando a aacuterea dos picos com espectros de UV caracteriacutesticos de flavonoides

(MABRY et al 1970) obtidos no cromatograma pela extrapolaccedilatildeo da curva de

calibraccedilatildeo (y = 06014 x - 0525 R2 = 09932) obtida a partir da astilbina

537 Determinaccedilatildeo da atividade antimicrobiana de diferentes extratos

hidroalcoacuteolicos de H stigonocarpa Mart ex Hayne

A seguir satildeo descritos os meacutetodos realizados para determinaccedilatildeo da atividade

antimicrobiana


A etapa experimental foi realizada no Laboratoacuterio de Bioquiacutemica e Fisiologia

dos Micro-organismos do Departamento de Antibioacuteticos da UFPE

53711 Preparaccedilatildeo das soluccedilotildees de H stigonocarpa

Os extratos secos obtidos pelas diferentes teacutecnicas de extraccedilatildeo foram

analiticamente pesados (10 mg) e solubilizados em etanolaacutegua (19 pv) obtendo

assim soluccedilotildees estoque padronizadas de concentraccedilatildeo igual a 1000 microgmL



dos extratos de H stigonocarpa foram obtidos a partir da coleccedilatildeo de cultura do

151

Laboratoacuterio Fisiologia e Bioquiacutemica de Micro-organismos do Departamento de

Antibioacuteticos da UFPE


aureus ATCC 25923 LFBM 13 LFBM 15 LFBM 16 LFBM 11 LFBM 26 LFBM 05 LFBM

28 LFBM 29 LFBM 31 e LFBM 30



A concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima (CIM) e concentraccedilatildeo bactericida miacutenima

(CMB) foi realizada pela mesma metodologia descrita no capitulo 2

5372 Determinaccedilatildeo da atividade antifuacutengica

Os meacutetodos para determinaccedilatildeo da atividade antifuacutengica frente a diferentes

espeacutecies de Candida estatildeo descritos a seguir

53721 Candidas e condiccedilotildees de cultivo

Quatro cepas de Candida albicans (6257 4986 4606 e 4990) trecircs de

Candida krusei (5712 4263 e 934) trecircs de Candida parapsilosis (ATCC 22019 CP

4608 e 4889) duas de Candida tropicalis (4790 e ATCC 750) e uma de Candida

glabrata (Y 6094) foram oriundas da URM coleccedilatildeo do Departamento de Micologia

do Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas da Universidade Federal de Pernambuco

As cepas foram estocadas em oacuteleo mineral a 18degC Com o objetivo de obter

um inoculo contendo de 1-5 x 106 UFCmL cada cepa foi cultivada em um tubo

contendo 20 mL de Agar Sabouraud Dextrose sendo incubada a 35deg C por dois

dias Apoacutes este periacuteodo as suspensotildees de leveduras foram preparadas em soluccedilatildeo

fisioloacutegica esterilizada e depois ajustadas a 90 de transmitacircncia a 530 nm

Diluiccedilotildees seriadas de 1100 e 120 foram realizadas para obter um inoculo final

contendo 1-5 times 103 UFCmL (LIMA-NETO et al 2012)

Testes de viabilidade e subsequente confirmaccedilatildeo taxonocircmica das

caracteriacutesticas morfoloacutegicas bioquiacutemicas e fisioloacutegicas foram realizados

152

53722 Susceptibilidade antifuacutengica in vitro

Placas de microdiluiccedilatildeo contendo diluiccedilotildees seriadas de droga foram

preparadas seguindo o que determina o protocolo CLSI M27-A3 (2008) Os extratos

foram solubilizados em dimetilsulfoxido (10) as concentraccedilotildees avaliadas variaram

de 1000 a 0487μgmL Fluconazol foi usado como droga de referecircncia nas

concentraccedilotildees entre 0125 a 64 μgmL

Os 12 primeiros poccedilos (linha vertical) das placas de microdiluiccedilatildeo receberam

100 microL das soluccedilotildees duas vezes mais concentradas dos extratos e das drogas de

referecircncia Nos outros meio padratildeo RPMI 1640 (Sigma Chemical Co St Louis MO

EUA) tamponadas a pH 70 com 0165 molL de aacutecido morfolinopropanosulfonico

(MOPS Sigma) Os extratos e o padratildeo foram diluiacutedos geometricamente seguindo

uma razatildeo 2 Em seguida todos os tubos foram inoculados com 100 microL do inoculo

final contendo 1-5 times 103 UFCmL e as microplacas incubadas a 35degC em uma

incubadora de CO2

Apoacutes 48h de incubaccedilatildeo a CIM foi lida Os valores de CIM correspondem a

mais baixa concentraccedilatildeo da droga que apresentou inibiccedilatildeo do crescimento das

leveduras Todos os testes foram realizados em triplicata

538 Anaacutelises estatiacutesticas





153

54- RESULTADOS E DISCUSSAtildeO



A granulometria do material triturado eacute um paracircmetro importante a ser

estabelecido pois influencia diretamente a eficiecircncia e reprodutibilidade do processo

extrativo (MIGLIATO et al 2007) Eacute um paracircmetro com o qual se pode determinar a

superfiacutecie de contato da partiacutecula disponiacutevel para interagir com o solvente o que eacute

muito utilizado na obtenccedilatildeo de preparaccedilotildees farmacecircuticas liquidas como tinturas e

extratos (SILVA JUacuteNIOR 2006)

A Farmacopeacuteia Brasileira V (2010) classifica os poacutes pela distribuiccedilatildeo

granulomeacutetrica De acordo com os paracircmetros desta publicaccedilatildeo a distribuiccedilatildeo

granulomeacutetrica da casca do caule de H stigonocarpa apoacutes trituraccedilatildeo analisada no

presente trabalho pode ser classificada como poacute grosso visto que as partiacuteculas na

sua totalidade apresentaram uma granulometria superior a 1700μm e uma

quantidade inferior a 40 foram superiores a 355 μm (figura 1)

Figura 49 - Histograma de distribuiccedilatildeo granulomeacutetrica da casca

do caule de Hymenaea stigonocarpa apoacutes trituraccedilatildeo

Neste estudo o material mostrou distribuiccedilatildeo granulomeacutetrica bastante

variada Os pesos obtidos das partiacuteculas apoacutes tamisaccedilatildeo em malhas de 1000 850

154

600 425 250 e 150 microm foram 3907plusmn323g 421plusmn022g 1380plusmn023g 977plusmn032g

1088plusmn094g 625plusmn073g e 1501plusmn151g respectivamente

O ponto interseccedilatildeo das curvas de retenccedilatildeo e passagem partiacuteculas passa pelo

tamanho de 734 microm (tamanho meacutedio) e a sua representaccedilatildeo graacutefica estaacute

apresentada na figura 2

Figura 50 - Curvas de retenccedilatildeo e passagem das partiacuteculas de casca do caule

de Hymenaea stigonocarpa apoacutes trituraccedilatildeo

Aleacutem do meacutetodo de trituraccedilatildeo do material vegetal outros aspectos tecircm

influecircncia direta na distribuiccedilatildeo granulomeacutetrica final principalmente o teor de lignina

e de extrativos no mateacuterial vegetal Madeiras com grandes quantidades de extrativos

tendem a ser mais densas assim a quantidade de extrativos costumam variar em

torno de 3 a mais de 30 do peso seco (BOWYER et al 2003)

A reduccedilatildeo do tamanho de partiacutecula leva a um aumento da superfiacutecie de

contato entre a mateacuteria-prima e o meio de extraccedilatildeo (NORIEGA et al 2005) Poreacutem

em alguns casos poacutes de tamanho maior podem favorecer as extraccedilotildees Partiacuteculas

muito finas podem aderir agraves partiacuteculas maiores aumentando a viscosidade do meio

e criando uma barreira que impede a penetraccedilatildeo de solventes (VOIGT amp

BORNSCHEIN 1982)

734 microm

155

Eacute importante que a mateacuteria prima vegetal esteja suficientemente triturada para

que se consiga um rendimento oacutetimo no processo de extraccedilatildeo dos constituintes

quiacutemicos de interesse farmacecircutico

A composiccedilatildeo quiacutemica da madeira no que se refere ao teor de extrativos e

suas interrelaccedilotildees como a adsorccedilatildeodessorccedilatildeo de umidade e como a retraccedilatildeo

volumeacutetrica tecircm sido objeto de estudo por parte de diversos autores O termo

extrativo se refere a substacircncias de baixa ou meacutedia massa molecular que podem

ser extraiacutedas em aacutegua ou solventes orgacircnicos (SILVERIO et al 2006)

Buchanan (1963) afirmou que haacute uma consideraacutevel variaccedilatildeo na distribuiccedilatildeo

dos extrativos atraveacutes da madeira de uma aacutervore existindo uma variaccedilatildeo na

quantidade de material depositado atraveacutes da altura da aacutervore e entre o tronco e os

galhos

Nearn (1955) verificou que devido agrave accedilatildeo de enchimento dos extrativos

soluacuteveis em aacutegua espeacutecies com alto teor de extrativos apresentam maior

estabilidade dimensional menor umidade no ponto de saturaccedilatildeo das fibras e

umidades de equiliacutebrio mais baixas do que espeacutecies que possuam pequenas

quantidades de extrativos em sua composiccedilatildeo quiacutemica

A determinaccedilatildeo do teor de extrativos eacute um meacutetodo utilizado para quantificar

constituintes extratiacuteveis da droga vegetal que pode ser considerado como uma

caracteriacutestica proacutepria de cada amostra vegetal e pode auxiliar na avaliaccedilatildeo da

qualidade dessa droga vegetal (ANTONELLI-USHIROBIRA et al 2004) assim o

valor obtido para a amostra vegetal avaliada foi de 1429plusmn167

O teor de extrativos determinado neste trabalho indica a presenccedila de

compostos hidrossoluacuteveis a quente presentes no material vegetal Muito embora natildeo

seja indicativo dos constituintes ativos o teor de extrativos representa uma teacutecnica

de faacutecil execuccedilatildeo e economicamente viaacutevel relevante por estabelecer condiccedilotildees

adicionais para controle de qualidade

A determinaccedilatildeo do teor de aacutegua residual presente nas drogas vegetais

constitui um iacutendice da qualidade de sua preparaccedilatildeo e da garantia de sua

conservaccedilatildeo (COSTA 1982 SILVA JUacuteNIOR 2006) A perda por dessecaccedilatildeo do

triturado da planta indicativo do teor de material volaacutetil do vegetal e indiretamente

da umidade residual apresentou um valor obtido na anaacutelise da casca do caule de

Hymenaea stigonocarpa de 1024 O valor encontrado nesse estudo apresenta-se

156

dentro do intervalo estabelecido pela Farmacopeacuteia Brasileira V (2010) de 8 a 14

indicando uma boa conservaccedilatildeo e uma secagem eficiente da mateacuteria prima vegetal

Esta determinaccedilatildeo eacute importante para o controle de qualidade microbioloacutegico

pois um excesso de aacutegua na droga vegetal favorece o crescimento de fungos e

bacteacuterias podendo tambeacutem levar agrave hidroacutelise de seus constituintes bioativos

(SHARAPIN 2000)

A determinaccedilatildeo de cinzas totais do triturado da casca permite a quantificaccedilatildeo

do resiacuteduo natildeo volaacutetil inorgacircnico presente nas drogas vegetais como integrante

natural destas As cinzas totais constituiacutedas principalmente por carbonatos cloretos

e diversos tipos de oacutexidos pode servir como meacutetodo para avaliar a pureza do

material detectando possiacuteveis impurezas e adulteraccedilotildees do material com compostos

inorgacircnicos (COSTA 1982 SILVA JUacuteNIOR 2006) O resultado encontrado na

determinaccedilatildeo do teor de cinzas totais nas cascas do caule de H stigonocarpa foi de

828plusmn027 Considerando que natildeo existem na Farmacopeacuteia Brasileira limites

preconizados em monografia para esta espeacutecie e que em vaacuterias delas satildeo

apresentados em ensaios de pureza valores de ateacute 10 como dentro do limite

consideramos os resultados obtidos aceitaacuteveis

Os resultados obtidos para os ensaios de perda por dessecaccedilatildeo teor de

extrativos estatildeo apresentados na tabela 5

Tabela 5 - Resultados dos ensaios de perda por dessecaccedilatildeo teor de extrativos e

cinzas totais das amostras de cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa apoacutes

trituraccedilatildeo

Amostra PD plusmn dp TE plusmn dp CTplusmn dp

Triturado da casca de Hymenaea stigonocarpa

1024 plusmn 017 1429plusmn167 828plusmn027

PD ndash Perda por dessecaccedilatildeo TE ndash Teor de extrativos CT ndash Cinzas Totais dp ndash desvio padratildeo

542 Determinaccedilatildeo do rendimento

Um problema para a seleccedilatildeo dos meacutetodos de extraccedilatildeo eacute a possibilidade de

compostos de interesse apresentarem uma interaccedilatildeo significativa com a matriz

sendo necessaacuterio nestes casos um meacutetodo com elevada recuperaccedilatildeo

157

Determinadas matrizes podem reter analitos dentro de poros ou outras estruturas

(SOUZA 2013)

Uma das teacutecnicas para aumentar a recuperaccedilatildeo dos compostos de interesse

seria aumentar a temperatura do solvente pois a energia teacutermica adicionada pode

auxiliar na quebra das ligaccedilotildees da matriz e facilitar a difusatildeo do analito agrave superfiacutecie

O aumento do tempo de contato tambeacutem poderia ser outra saiacuteda para o aumento da

recuperaccedilatildeo devido a sua influecircncia na difusatildeo Deve-se avaliar poreacutem que tempos

muito longos podem promover a perda de compostos por oxidaccedilatildeo (SOUZA 2013)

A escolha de um meacutetodo em detrimento de outro eacute um ponto que deve ser bem

estudado pois uma seleccedilatildeo incorreta pode levar ao aumento do tempo de

execuccedilatildeo necessidade do uso de grande quantidade de solvente aleacutem de poder

apresentar baixa eficiecircncia na extraccedilatildeo Exemplos disso satildeo os metodos que

utilizam elevaccedilatildeo da temperatura onde substacircncias de interesse caso sejam

termicamente laacutebeis podem ser degradadas Assim deve-se considerar a

adequaccedilatildeo dos meacutetodos de extraccedilatildeo (ONG 2004) Desta forma alguns metodos

utilizados neste estudo satildeo descritos a seguir

O meacutetodo de extraccedilatildeo assistido por ultrassom envolve a forccedila de corte criada

pela implosatildeo de bolhas de cavitaccedilatildeo sobre a propagaccedilatildeo das ondas acuacutesticas no

intervalo kHz O colapso de bolhas pode produzir efeitos fiacutesicos quiacutemicos e

mecacircnicos o que resulta na ruptura das membranas bioloacutegicas para facilitar a

libertaccedilatildeo de compostos extratiacuteveis e melhorar a penetraccedilatildeo do solvente em

materiais celulares e transferecircncia de massa (DAIacute MUMPER 2010)

Uma das vantagens da extraccedilatildeo assistida por ultrassom (HSU) eacute que ela eacute uma

tecnologia potencialmente uacutetil pois natildeo necessita de instrumentos complexos e eacute

relativamente de baixo custo podendo ser usada tanto em pequena quanto em

grande escala (VINATORU 2001)

Apoacutes a obtenccedilatildeo da soluccedilatildeo extrativa e concentraccedilatildeo em rotaevaporador o

valor de rendimento obtido para o meacutetodo do ultrassom foi de 1122 (2245g)

Esta foi agrave teacutecnica que apresentou menor rendimento Aspectos como a natureza do

material e distribuiccedilatildeo da onda ultrassocircnica no liacutequido extrator podem justificar esse

menor rendimento

Amostras com grandes teores de extrativos apresentam maior estabilidade

dimensional e consequentemente maior resistecircncia a sonicaccedilatildeo Quanto agrave potecircncia

ultrassocircnica sabe-se que o maacuteximo poder eacute observado proacuteximo a superfiacutecie da

158

fonte radiante ultrassocircnica (WANG WELLER 2006) poreacutem ele diminui

proporcionalmente com aumento da distacircncia Assim os aspectos fiacutesico-quiacutemicos da

amosta estudada bem como a metodologia empregada podem ter influenciado no

reduzido rendimento desta teacutecnica

Outra teacutecnica avaliada a turbo-extraccedilatildeo apresentou um rendimento de 1296

(2593g) Estaacute teacutecnica eacute baseada na extraccedilatildeo com simultacircnea reduccedilatildeo do tamanho

de partiacutecula que eacute resultado da aplicaccedilatildeo de elevadas forccedilas de cisalhamento Essa

reduccedilatildeo draacutestica do tamanho de partiacutecula e consequente rompimento das ceacutelulas

favorece a raacutepida dissoluccedilatildeo das substacircncias ativas no liacutequido extrativo (VOIGT

1993 SONAGLIO et al 2007)

Nessas circunstacircncias a difusatildeo das substacircncias dissolvidas atraveacutes da

membrana celular fica relegada a um plano secundaacuterio resultando em extraccedilatildeo de

ateacute quase o esgotamento da droga A esse incremento da eficiecircncia somam-se a

simplicidade rapidez e versatilidade da teacutecnica que permitem a faacutecil utilizaccedilatildeo da

turboextraccedilatildeo em processamentos em pequena e meacutedia escala (HUBINGER et al

2009)

Em nosso estudo observamos que o tamanho reduzido da partiacutecula aspecto

caracteriacutestico deste meacutetodo proporciona dificuldades no processo de separaccedilatildeo da

soluccedilatildeo extrativa por filtraccedilatildeo e consequentemente perda de material Isso pode

justificar o porquecirc de um meacutetodo que leva a quase esgotamento da droga natildeo

produzir um bom rendimento

Aspectos como o aumento na temperatura podem promover uma maior

extraccedilatildeo tanto pelo aumento da solubilidade como pela taxa de transferecircncia de

massa Aleacutem disso a viscosidade e a tensatildeo superficial dos solventes satildeo

diminuiacutedas em temperaturas altas o que ajuda os solventes a atingir as matrizes de

amostras e melhoria da taxa de extraccedilatildeo (DAIacute MUMPER 2010)

Assim a teacutecnica de infusatildeo levou a um rendimento de 1377 (2755g) natildeo

apresentando diferenccedila significativa no rendimento (Plt005) quando comparado ao

meacutetodo de ultrassom

159

Figura 51 ndash Rendimentos obtidos atraveacutes dos

diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo

O meacutetodo de maceraccedilatildeo por sua natureza natildeo conduz ao esgotamento da

mateacuteria prima vegetal seja devido agrave saturaccedilatildeo do liacutequido extrator ou ao

estabelecimento de um equiliacutebrio difusional entre o meio extrator e o interior da

ceacutelula (VOIGT 2000) Desta forma para o meacutetodo de maceraccedilatildeo o rendimento foi de

1525 (3050g) Comparando este meacutetodo com os meacutetodos anteriormente

descritos o melhor rendimento da maceraccedilatildeo pode ser sugerido pela maior

influecircncia do tempo de interaccedilatildeo e difusatildeo drogasolvente o que natildeo foi observado

em meacutetodos que apenas utilizam o aumento da temperatura do solvente e

ultrassom

Meacutetodos extrativos dependem em grande parte dos fenocircmenos de difusatildeo

sendo que a agitaccedilatildeo pode influenciar na duraccedilatildeo do processo (MIGLIATO et al

2011) Baseados nesta ideia outros dois meacutetodos que empregam a agitaccedilatildeo tambeacutem

foram avaliados Um deles foi o refluxo onde ocorre o aquecimento da soluccedilatildeo ateacute agrave

ebuliccedilatildeo e o retorno dos vapores condensados para o balatildeo antes de serem

perdidas por evaporaccedilatildeo Este meacutetodo se mostrou mais eficiente com rendimento de

1775 (3550g) se comparado com as teacutecnicas anteriores Poreacutem foi observado

que o aquecimento ateacute a ebuliccedilatildeo e o refluxo do triturado durante 45min levaram a

reduccedilatildeo do tamanho das partiacuteculas que influenciou no processo de separaccedilatildeo da

soluccedilatildeo extrativa por filtraccedilatildeo Natildeo diferindo significativamente do meacutetodo de refluxo

(Plt005) a de maceraccedilatildeo dinacircmica foi o meacutetodo que apresentou o maior

rendimento 1862 (3725g)

Comparado com os outros meacutetodos podemos sugerir que sua vantagem

ocorreu pela influecircncia do agitador magneacutetico no equiliacutebrio difusional entre o meio

ULTRASSOM TURBOLISE INFUSAtildeO MACER REFLUXO MACER DIN0

1

2

3

4

Meacutetodo de extraccedilatildeo

Resiacuted

uo

seco

(g

)

160

extrator e o interior da ceacutelula assim como ruptura das membranas que aumentaram

a penetraccedilatildeo do solvente nos materiais celulares e consequentemente levaram o um

maior rendimento

543 Prospecccedilatildeo fitoquiacutemica por cromatografia de camada delgada

A prospecccedilatildeo fitoquiacutemica atraveacutes de cromatografia de camada delgada

(figura 52) demonstrou a presenccedila de flavonoides e taninos condensados em todos

os extratos avaliados

Figura 52 ndash Cromatogramas demonstrando a presenccedila de

flavonoides e taninos nos extratos hidroalcooacutelicos da casca do caule

Hymenaea stiginocarpa obtidos a partir dos diferentes meacutetodos de

extraccedilatildeo

Placa A e B fase moacutevel EtOAc ndash HCOOH ndash ACOH ndash H2O (100111126 vv) revelador da placa A - Reagente de NEU revelador da placa B ndash Vanilina cloriacutedrica Amostras adicionadas A ndash astilbina (Padratildeo) Md ndash Extrato maceraccedilatildeo dinacircmica Me ndash Extrato maceraccedilatildeo estaacutetica (Maceraccedilatildeo) I ndash Extrato infusatildeo T ndash Extrato turbolise R ndash Extrato refluxo U ndash Extrato ultrassom e P ndash Padratildeo de epicatequina

544 Anaacutelise quantitativa dos compostos majoritaacuterios

Antes de considerar o emprego da metodologia para taninos totais os perfis

de absorccedilatildeo no UV-VIS para o padratildeo de aacutecido gaacutelico e as amostras foram

estabelecidos em espectrofotocircmetro na faixa de 400 a 900 nm apoacutes reaccedilatildeo com o

A B

161

reagente de Folin-Ciocalteu Os espectros estatildeo apresentados na figura 53 e

revelam grande similaridade entre a amostra e a substacircncia de referecircncia

confirmando a compatibilidade e permitindo eleger o comprimento de onda de 780

nm para leitura

Figura 53 - Espectro de varredura de ultravioleta do aacutecido gaacutelico e

do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea stigonocarpa apoacutes reaccedilatildeo

com Folin-Ciocalteau

Um desenho fatorial do tipo 32 foi conduzido para determinaccedilatildeo da influecircncia

de paracircmetros reacionais mais importantes tal como o volume do reagente de Folin-

Ciocalteau a concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo de carbonato e o tempo de reaccedilatildeo sobre a

resposta do meacutetodo de doseamento (intensidade de absorccedilatildeo de 780 nm) e a

presenccedila de deslocamentos bato ou hipsocrocircmicos capazes de comprometer

significativamente o desempenho do procedimento

Os resultados demonstraram interferecircncia das variaacuteveis sobre a absorbacircncia

observada Para a resposta do meacutetodo de doseamento espectrofotomeacutetrico

(intensidade de absorvacircncia) os dados obtidos e apresentados na tabela 6 foram

analisados atraveacutes do graacutefico de paretos (figura 54)

nm

Linhas azul - aacutecido gaacutelico vermelha - Extrato hidroalcooacutelico

162

Tabela 6 - Matriz do experimental do desenho aplicado para avaliar a influecircncia da

quantidade de Folin-Ciocalteau concentraccedilatildeo de carbonato de soacutedio e tempo de

reaccedilatildeo sobre a absorbacircncia

Variaacutevel natural Variaacutevel codificada Resultados

Folin (mL)

Na2CO3 ()

Tempo (min)

Fator A Fator B Fator C Meacutedia DP CV

1 10 5 -1 -1 -1 0453 00040 001

3 10 5 1 -1 -1 0431 00060 001

1 20 5 -1 1 -1 0414 00055 001

3 20 5 1 1 -1 0422 00180 004

1 10 25 -1 -1 1 0501 00261 005

3 10 25 1 -1 1 0519 00031 001

1 20 25 -1 1 1 0485 00083 002

3 20 25 1 1 1 0503 00066 001

2 15 15 0 0 0 0487 00154 003

2 15 15 0 0 0 0475 00026 001

2 15 15 0 0 0 0488 00089 002

Variaacuteveis codificadas Fator A - Volume do reagente de Folin-Ciocalteau Fator B - Concentraccedilatildeo de Na2CO3 Fator C - Tempo de reaccedilatildeo DP ndash desvio padratildeo cv - Coeficiente de variaccedilatildeo

Figura 54 - Graacutefico de pareto para efeitos padronizados do fatorial 32

5943951

6638698

8595094

1261833

1627582

2724828

-433412

1570891

p=05

Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Replicat(1)

Replicat(2)

2by3

(1)Folin (mL)

1by2

1by3

(2)Na2CO3 ()

(3)Time (min)

163

O caacutelculo dos efeitos para fatores pelo graacutefico de Pareto (Figura 54)

possibilitou a observaccedilatildeo dos efeitos significativos e o seu tipo de influecircncia dobre a

resposta intensidade de absorvacircncia Considerando os termos significativos apenas

os fatores tempo e concentraccedilatildeo de carbonato de soacutedio foram significativos Natildeo foi

observada influecircncia importante para o volume do reagente de Folin-Ciocalteau

quando analisada isoladamente poreacutem houve interaccedilatildeo entre os fatores tempo e

volume de Folin-Ciocalteau

Ainda a respeito aos efeitos significativos o tempo apresentou contribuiccedilatildeo

positiva (+1570) ou seja a mudanccedila de niacutevel favorece a resposta estudada

Portanto o aumento do tempo incrementa a absorbacircncia lida Por outro lado a

concentraccedilatildeo da soluccedilatildeo de carbonato de soacutedio exerceu influecircncia negativa Assim

o aumento da concentraccedilatildeo de carbonato reduz a resposta do procedimento

Com os paracircmetros determinados foi entatildeo avaliada a quantidade de agente

precipitante sobre o doseamento de taninos totais nas cascas do caule de


Foi avaliado o agente precipitante caseiacutena adicionado nas seguintes

quantidades 50 150 250 350 450 e 500 mg Os resultados foram expressos com a

meacutedia e desvio padratildeo A figura 55 mostra o efeito das quantidades de caseiacutena

sobre o teor de taninos totais

Figura 55 - Valores de absorbacircncia da fraccedilatildeo residual do

extrato de Hymenaea stigonocarpa em funccedilatildeo da

quantidade de caseiacutena

50 150

250

350

450

500

0

1

2

3

Caseiacutena (mg)

Teo

r d

e t

an

ino

s (

mg

g)

164

Em termos de precisatildeo intermediaacuteria os melhores resultados foram obtidos

para uma quantidade de no maacuteximo 4500 mg de caseiacutena (Tabela 7) Para

quantidades acima desse valor foram observados ausecircncia de variaccedilatildeo significativa

dos valores da absorvacircncia

Tabela 7 - Valores meacutedios da absorvacircncia (UA) obtidos para a fraccedilatildeo natildeo tanante apoacutes adiccedilatildeo de diferentes quantidades de caseiacutena durante anaacutelise (triplicata)

Quantidade de caseiacutena 1 2 3 MEacuteDIA DP CV

Sem caseiacutena 0559 0535 0538 0544 0013 0024

50mg 0424 0410 0399 0411 0013 0030

150mg 0376 0371 0385 0377 0007 0019

250mg 0320 0328 0330 0326 0005 0016

350mg 0272 0313 0318 0301 0025 0084

450mg 0275 0264 0269 0269 0006 0020

500mg 0254 0280 0264 0266 0013 0049

Repeticcedilotildees das avaliaccedilotildees das absorbacircncias 1 2 e 3 DP ndash desvio padratildeo cv - Coeficiente de variaccedilatildeo

5441 Determinaccedilatildeo do meacutetodo de doseamento de polifenoacuteis totais por

espectofotometria apoacutes avaliaccedilatildeo das variaacuteveis analiacuteticas

Apoacutes a analise dos dados obtidos pelo estudo da otimizaccedilatildeo do meacutetodo de

doseamento de polifenoacuteis por espectrofotometria as variaacuteveis do meacutetodo

empregado foram volume de reagente de Folin-Ciocalteu 3 ml concentraccedilatildeo de

Carbonato de Soacutedio 10 (vv) e o tempo de reaccedilatildeo 25 minutos

Para obtenccedilatildeo da fraccedilatildeo natildeo tanante a quantidade do agente precipitante

utilizada foi de 450 mg sendo utilizada caseiacutena Merckreg purificada

5442 Determinaccedilatildeo da concentraccedilatildeo de polifenois totais taninos e flavonoides

Apoacutes a avaliaccedilatildeo das variaacuteveis analiacuteticas e da determinaccedilatildeo da fraccedilatildeo

residual da soluccedilatildeo extrativa das cascas do caule de Hymenaea stigonocarpa em

funccedilatildeo da quantidade de caseiacutena os teores de polifenois e taninos totais obtidos a

165

partir da diferentes meacutetodos de preparaccedilatildeo foram determinados e descritos na

tabela 8

Tabela 8 - Teor de polifenois taninos e flavonoides totais nos extratos

hidroalcooacutelicos de Hymenaea stigonocarpa obtidos a partir de diferentes meacutetodos

Aleacutem de polifenoacuteis e taninos totais o teor de flavonoides nos diferentes

extratos foi estimado a partir de CLAE-DAD Apoacutes a obtenccedilatildeo dos cromatogramas

dos diferentes extratos observou-se em todos eles a presenccedila de cinco picos que

foram chamados de A B C D e E (figura 56)

Os picos de A ateacute D foram identificados atraveacutes do espectro de UV com

dados da literatura (MABRY 1970) como flavonoides e assim o teor de flavonoides

totais em cada extrato foi obtido pela soma das aacutereas dos picos A B C e D atraveacutes

da equaccedilatildeo da reta

A aacuterea da banda E (TR 39-43) natildeo foi adicionada ao caacutelculo pois esta banda

estaacute relacionada agrave presenccedila de taninos condensados jaacute observados na anaacutelise por

CCD Esses taninos satildeo possivelmente catequinas polimeacutericas o que pode ser

sugerido devido ao aparecimento de deriva na linha de base e da formaccedilatildeo de

bandas caracteriacutesticas no cromatograma Apenas monoacutemeros e oligocircmeros ateacute o

tetracircmero de catequinas e proantocianidinas pode ser separado e detectado como

um pico definido (ANDERSEN MARKHAM 2006 PARK et al 2012)

Quanto ao teor de polifenois (figura 57) os extratos com maior concentraccedilatildeo

foram os obtidos por turbolise infusatildeo e maceraccedilatildeo dinacircmica com 686plusmn09

617plusmn015 e 660plusmn024 mg GAEg respectivamente natildeo havendo diferenccedila

significativa eles (Plt005) Um menor teor 543 plusmn 011 mg GAEg foi observado no

extrato obtido por maceraccedilatildeo o qual mostrou um rendimento significativo se

Extratos Polifenoacuteis totais Taninos Flavonoacuteides

Ultrassom (EU) 476 plusmn 008 140 plusmn 023 056 plusmn 005

Turbolise (ET) 686 plusmn 009 164 plusmn 027 058 plusmn 007

Infusatildeo (EI) 672 plusmn 014 175 plusmn 010 062 plusmn 003

Maceraccedilatildeo (EM) 543 plusmn 011 179 plusmn 014 060 plusmn 004

Refluxo (ER) 456 plusmn 041 164 plusmn 028 066 plusmn 006

Maceraccedilatildeo dinacircmica (EMD) 660 plusmn 024 176 plusmn 031 059 plusmn 003

166

comparado aos extratos obtidos por ultrassom e refluxo com 476 plusmn 009 e 456 plusmn

041 mg GAEg respectivamente que natildeo diferiram entre si (Plt005)

Figura 56 - Cromatograma obtido por CLAE-DAD dos diferentes extratos

hidroalcooacutelicos da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa

Extrato obtido por ultrassom (EU) Extrato obtido por turbolise (ET) Extrato obtido por infusatildeo (EI) Extrato obtido por maceraccedilatildeo (EM) Extrato obtido por refluxo (ER) e Extrato obtido por Maceraccedilatildeo dinacircmica (EMD) Espectro obtido por UV com padratildeo sugestivo de flavonoacuteides (A C and D) identificado como astilbina (B) e relacionado agrave catequinas polimeacutericas (E)

C D B

EU

ET

EI

EM

ER

EMD

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

Astilbina = pico B


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932

-50 at 3634 min 99902A Peak 4 100 at 2980 min

-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995

167

Figura 57 - Teor de polifenois totais dos extratos


obtidos atraveacutes dos diferentes meacutetodos de extraccedilatildeo

Tempos de extraccedilatildeo prolongados e temperatura elevada levam ao aumento

da possibilidade de oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos o que diminuem o

rendimento de destes compostos nos extratos (DAIacute MUMPER 2010)

A reduccedilatildeo do rendimento de polifenois no meacutetodo de refluxo empregado em

nosso estudo onde o material vegetal tem contato com o solvente em temperatura

de ebuliccedilatildeo e na maceraccedilatildeo onde o contato material vegetal e solvente ocorre por

um periacuteodo de tempo estendido podem ser sugeridos pela ocorrecircncia de possiacutevel

oxidaccedilatildeo dos compostos fenoacutelicos

Uma das desvantagens do meacutetodo de extraccedilatildeo assistida por ultrassom eacute o

efeito deleteacuterio ocasional de energia de ultrassom (mais de 20 kHz) sobre os

constituintes ativos de plantas medicinais que pode levar a formaccedilatildeo de radicais

livres e consequentemente alteraccedilotildees indesejaacuteveis (TIWARI et al 2011) Aleacutem

disso um tempo de sonicaccedilatildeo prolongado (mais de 40 minutos) pode levar a

degradaccedilatildeo dos componentes ativos (ANNEGOWDA et al 2010) Desta forma a

ocorrecircncia destes efeitos pode ser sugerida para explicar o teor reduzido de

polifenois na extraccedilatildeo assistida por ultrassom

Os meacutetodos que obtiveram concentraccedilotildees estatisticamente semelhantes de

polifenois (turboacutelise infusatildeo e maceraccedilatildeo dinacircmica) parecem natildeo terem sofrido

degradaccedilatildeo de seus constituintes em decorrecircncia do tempo de extraccedilatildeo ou

temperatura de extraccedilatildeo Nessas amostras o processo ocorreu em no maacuteximo 60

minutos

TURBOLISE INFUSAtildeO MACER DIN MACER ULTRASOM REFLUXO

0

2

4

6

8

Meacutetodos de extraccedilatildeo

Po

life

no

is (

mg

GA

Eg

)

168

Quanto agrave temperatura podemos sugerir que a ocorrecircncia de temperatura de

ebuliccedilatildeo durante um periacuteodo prolongado eacute que parece induzir a degradaccedilatildeo de

polifenois dos extratos de Hymenaea stigonocarpa o que natildeo acontece no meacutetodo

de infusatildeo onde a temperatura de ebuliccedilatildeo soacute eacute alcanccedilada no inicio do processo

Diferente do que ocorreu na determinaccedilatildeo do teor de polifenois natildeo foram

observadas diferenccedilas significativas tanto em relaccedilatildeo ao teor de taninos quanto ao

de flavonoides Isso sugere que apesar da degradaccedilatildeo de alguns polifenois em

decorrecircncia do meacutetodo extrativo haacute uma ldquocompensaccedilatildeordquo entre a degradaccedilatildeo e

capacidade extrativa

Isso eacute evidenciado quando observamos alguns meacutetodos refluxo por

exemplo a pesar de degradaccedilatildeo motivada pelo aumento da temperatura esta

tambeacutem leva a uma maior capacidade extrativa Outro exemplo eacute a extraccedilatildeo

assistida por ultrassom que mesmo apresentando teores semelhantes aos outros eacute

o meacutetodo que apresenta o menor teor de absoluto de taninos e flavonoides Neste

caso o baixo rendimento de resiacuteduo seco motivado pela ineficiecircncia do ultrassom na

lise da parede celular eacute associado ao efeito da degradaccedilatildeo dos polifenois natildeo

levando a uma compensaccedilatildeo e consequentemente reduccedilatildeo do teor absoluto de

taninos e flavonoides

545 Determinaccedilatildeo da atividade antibacteriana de H stigonocarpa Mart ex

Hayne

Com o objetivo de avaliar a influecircncia do meacutetodo de extraccedilatildeo sobre a

atividade antibacteriana do extrato hidroalcooacutelico da casca do caule de Hymenaea

stigonocarpa frente a diferentes cepas de Staphylococcus aureus foram

determinadas a concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima e bactericida miacutenima dos extratos

obtidos

Staphylococcus aureus foi selecionado por ser o micro-organismo mais

susceptiacutevel ao extrato hidroalcooacutelico de acordo com estudos anteriores (DIMECH et

al 2013) Os valores das concentraccedilotildees inibitoacuterias e bactericidas miacutenimas natildeo

variaram quando correlacionadas as teacutecnicas de extraccedilatildeo utilizadas tabela 9

169

Tabela 9 - Valores da Concentraccedilatildeo Bactericida Miacutenima e Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima dos extratos de Hymenaea stigonocarpa frente a cepas de bacteacuterias Gram positivas

CBM Concentraccedilatildeo bactericida miacutenima CIM concentaccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima OXAR Oxacilina com CIM ge 40microgmL OXA

S Oxacilina com CIM le 20microgmL

Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima Concentraccedilatildeo bactericida miacutenima (microgmL)

Cepas de Staphylococcus aureus Refluxo Infusatildeo Ultrassom Turbolise Maceraccedilatildeo (estaacutetica)

Maceraccedilatildeo dinacircmica

Oxacilina (padratildeo)

Staphylococcus aureus ATCC 25923 250500 250250 250250 250250 250250 250500 01250250

Staphylococcus aureus AM 02 625125 625125 625125 625625 625625 625625 01250125



Staphylococcus aureus UFPEDA 01 500500 250500 250500 250500 250500 250500 01250250


Staphylococcus aureus IC 17 500500 500500 250500 250250 250500 250500 3264





169

Estudos anteriores indicaram que os taninos satildeo os metaboacutelitos secundaacuterios

de Hymenaea stigonocarpa responsaacuteveis pela atividade antibacteriana (DIMECH et

al 2013) A seleccedilatildeo do meacutetodo extrativo mais eficiente foi baseada nos criteacuterios

atividade bioloacutegica frente agrave Staphylococcus aureus teor de taninos totais (metaboacutelito

secundaacuterio responsaacutevel pela accedilatildeo antibacteriana) e teor de resiacuteduo seco

Devido a natildeo terem ocorrido diferenccedilas significativas na atividade bioloacutegica e

no teor de taninos quando comparamos todos os extratos obtidos a partir dos

diferentes meacutetodos o teor de resiacuteduo seco foi o criteacuterio utilizado para determinar o

meacutetodo de maceraccedilatildeo dinacircmica como o melhor

546 Determinaccedilatildeo da atividade antifungica de H stigonocarpa Mart ex

Hayne

Aleacutem da accedilatildeo antibacteriana dos taninos observada em nosso estudo sabe-

se que eles podem apresentar atividade frente fungos Vasconcelos et al (2003)

descreve que os taninos apresentam a capacidade de inibir o crescimento de

espeacutecies de Candida devido a sua accedilatildeo na ceacutelula especialmente na membrana

celular precipitando proteiacutenas

Os dois principais agentes utilizados na terapia antifuacutengica satildeo a anfotericina

B um antibioacuteticos polienico e o fluconazol agente antifuacutengico pertencente a classe

dos azoacuteis Eles tecircm atividade especialmente contra C albicans No entanto jaacute

existem relatos de surgimento de algumas cepas de Candida albicans resistentes a

estes antifuacutengicos aleacutem disso estes apresentaram efeitos colaterais (HIRASAWA

TAKADA 2004)

Os principais mecanismos de desenvolvimento de resistecircncia das cepas em

relaccedilatildeo aos azoacuteis alteraccedilotildees no siacutetio alvo da droga (14 α-demetilase) impedindo a

sua inibiccedilatildeo que levaria a depleccedilatildeo do ergosterol e consequente formaccedilatildeo da

membrana plasmaacutetica com alteraccedilotildees na funccedilatildeo e estrutura alteraccedilatildeo na

biossiacutentese de esteroacuteis resultando na acumulaccedilatildeo de 14 α-metil fecosterol ao inveacutes

de ergosterol presenccedila de bombas de efluxo e Superexpressatildeo do siacutetio alvo (14 α-

demetilase) impedindo a reduccedilatildeo da siacutentese de ergosterol pela inibiccedilatildeo provocada

pelos azoacuteis (GHANNOUM RICE 1999)

Desta forma a descoberta de um agente antibioacutetico que seja eficaz e seguro

podem ser importantes para a erradicaccedilatildeo de ambas as cepas de Candida sensiacuteveis

e resistentes Existem vaacuterios relatos que mostram atividade antifuacutengica de produtos

170

171

naturais (RUKAYADI et al 2013 ADEME et al 2013 ALRAJHI et al 2013

SENHAJI et al 2013)

Alguns estudos realizados em espeacutecies do gecircnero Hymenaea relatam a

presenccedila de atividade antifuacutengica em diferentes extratos

Quanto agrave espeacutecie Hymenaea martiana os extratos aquoso etanoacutelico

butanoacutelico e hidroalcooacutelico da casca apresentam atividade frente agrave Cryptococcus

neoformans e C gatii com CIM entre 2 a 64 microgmL sendo as fraccedilotildees etanoacutelica e

hidroalcooacutelica as mais ativas Tambeacutem foi demonstrada a atividade da H martiana

frente agrave dermatoacutefitos (T rubrum T mentagrophytes M canis) sendo os menores

valores de CIM obtidos a partir das fraccedilotildees aquosa e butanoacutelica nas trecircs espeacutecies

estudadas Souza e colaboradores (2010)

Os valores das Concentraccedilotildees inibitoacuterias miacutenimas para o extrato

Hidroalcooacutelico e o fluconazol frente a diferentes cepas de Candida estatildeo

sumarizados na tabela 10

Tabela 10 - Concentraccedilatildeo Inibitoacuteria Miacutenima do extrato hidroalcooacutelico de Hymenaea

stigonocarpa obtido por maceraccedilatildeo dinacircmica frente a diferentes espeacutecies de

Candida

Micro-organismos Cepa Extrato

hidroalcooacutelico CIM (microgml)

FLU CIM (microgml)

Perfil sensibilidade

Candida parapsilosis ATCC 22019 250 80 S

Candida parapsilosis CP 4608 250 16 SD-D

Candida parapsilosis4889 125 20 S

Candida glabrata 6094 781 gt64 R

Candida krusei 5712 195 32 SD-D

Candida krusei 4263 195 64 R


Candida tropicalis 4790 125 32 SD-D

Candida tropicalis ATCC 750 250 40 S

Candida albicans 6257 390 ND -

Candida albicans 4986 250 16 SD-D

Candida albicans 4606 250 20 S

Candida albicans 4990 250 gt64 R

CIM concentraccedilatildeo inibitoacuteria miacutenima FLU ndash Fluconazol ND Natildeo Determinado Perfil Sensiacutevel CIM le 80microgmL Sensibilidade dose-dependente 16 ndash 32 resistente CIM ge 640microgmL Extrato Hidroalcooacutelico obtido por maceraccedilatildeo dinacircmica

172

Quanto agrave atividade antifuacutengica foram empregadas cepas de diferentes perfis

de resistecircncia frente ao fluconazol

As espeacutecies que apresentaram as maiores sensibilidades de acordo com os

valores da CIM foram Candida krusei e Candida glabrata Segundo o CLSI M27-A3

(2008) os isolados de C krusei satildeo intrinsecamente resistentes ao fluconazol poreacutem

essas espeacutecies foram susceptiacuteveis ao extrato em valores ateacute cinco diluiccedilotildees

menores quando comparados agraves substacircncias de referecircncia

Aleacutem destas cepas o extrato mostrou atividade frente agrave cepa de Candida

albicans 6257 com CIM de 39 microgml como tambeacutem a Candida glabrata 6094 com

CIM de 781 microgml Com valores mais elevados da CIM mas ainda apresentando

uma consideraacutevel atividade foi observada a accedilatildeo do extrato frente agraves espeacutecies C

parapsilosis e C tropicalis com valores variando entre 125 e 250 microgml

A presente investigaccedilatildeo poreacutem representa um estudo preliminar para

atividade antifuacutengica e aponta para a necessidade de uma maior investigaccedilatildeo

bioloacutegica uma vez que Hymenaea stigonocarpa apresenta um grande potencial

farmacoloacutegico

173

55 CONCLUSOtildeES

Os resultados obtidos nos permitem concluir que a secagem do material

vegetal em estufa a 40degC durante 72h foi suficiente para obtenccedilatildeo de um triturado

com valor de perda por dissecaccedilatildeo (teor de umidade) dentro das especificaccedilotildees o

material vegetal obtido apoacutes a trituraccedilatildeo pocircde ser classificado como poacute grosso

Quanto ao rendimento de extrativos a teacutecnica que levou a obtenccedilatildeo do melhor

teor de resiacuteduo seco foi a de maceraccedilatildeo dinacircmica seguido por refluxo maceraccedilatildeo

infusatildeo turbolise e por fim extraccedilatildeo ultrassocircnica natildeo havendo diferenccedilas quanto agraves

classes de metaboacutelitos secundaacuterios identificados em funccedilatildeo do meacutetodo de extraccedilatildeo

empregado

A otimizaccedilatildeo do meacutetodo de doseamento por Folin Ciocalteu para a

determinaccedilatildeo do teor de polifenois em Hymenaea stigonocarpa demonstrou que o

aumento do tempo de reaccedilatildeo da quantidade do reagente de Folin-Ciocalteu e a

adiccedilatildeo de 450mg de caseiacutena na complexaccedilatildeo com os polifenoacuteis satildeo as variaacuteveis da

metodologia de doseamento de polifenoacuteis que apresentaram contribuiccedilatildeo positiva

para o estudo

Quanto a atividade antimicrobiana natildeo houve diferenccedilas significativas nos

teores de taninos e flavonoides totais e na atividade frente a diferentes cepas de

Staphylococcus aureus em funccedilatildeo do meacutetodo de extraccedilatildeo utilizado O meacutetodo de

extraccedilatildeo mais eficiente de acordo com as variaacuteveis avaliadas foi a maceraccedilatildeo

dinacircmica devido ao maior teor de resiacuteduo seco obtido

A triagem do extrato hidroalcooacutelico obtido por maceraccedilatildeo para atividade

antifuacutengica demonstra que este extrato apresenta forte atividade frente a cepas de

Candida krusei e Candida glabrata

174

REFEREcircNCIAS

ADEME A AYALEW A WOLDETSADIK K Evaluation of Antifungal Activity of Plant Extracts against Papaya Anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides) Journal of Plant Pathology and Microbiology v 4 n10 p 4-10 2013

ALRAJHI A M H Antifungal activity of plant extracts against fungal pathogens of Piper Nigrum International Journal of Traditional and Herbal Medicine v1 n4 p116-123 2013 ANDERSEN O M MARKHAM K R Flavonoids chemistry biochemistry and applications Floacuterida Taylor amp Francis 1212 p 2006 ANNEGOWDA H V ANWAR L N MORDI M N RAMANATHAN S amp MANSOR S M Influence of sonication on the phenolic content and antioxidant activity of Terminalia catappa L leaves Pharmacognosy research 2(6) 368ndash73 2010 ANTONELLI-USHIROBIRA T M YAMAGUTI E UHEMURA L M e PALAZZO DE MELLO J C Controle de Qualidade de Amostras de Paullinia cupana HBK var sorbilis (Mart) Ducke Acta Farmaceutica Bonaerense v23 n3 p383-386 2004 ASPEacute E amp FERNAacuteNDEZ K The effect of different extraction techniques on extraction yield total phenolic and anti-radical capacity of extracts from Pinus radiata Bark Industrial Crops and Products v 34 n1 p 838ndash844 2011 BORELLA J C CARVALHO D M A TEIXEIRA J C L RIBEIRO N S Influecircncia do processo extrativo nas propriedades fiacutesico-quiacutemicas dos extratos de Calendula officinalis L (ASTERACEAE) Revista Eletrocircnica de Farmaacutecia v 9 n2 p25 - 36 2012

BOWYER J L SHMULSKY R HAYGREEN J G Forest products and wood Blackwell Publishing New York 2003 BROWNING BL - Methods of wood chemistry New York John Wiley 1967 384p BUCHANAN MA - Extraneous components of wood In BROWNING BL ed The chemistry of wood New York John Wiley 1963 p313-68 BUNDESVEREINIGUNG Deutscher Apothekervebaumlnde (Hgrs) Deutscher Arzneimittel-Codex 2 Frankfurt Stuttgart p1-3 1986 CHOUDHARY N amp SEKHON B S An overview of advances in the standardization of herbal drugs Journal of Pharmaceutical Education and Research v2 n 2 p 55-70 2011 CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts approved standard-third edition CLSI document M27-A3 Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne 2008

175

CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing Twenty-Second Informational Supplement M100-S22 Vol32 No 3 Wayne PA Clinical and Laboratory Standards Institute Wayne 2012 COSTA A F 1982 Farmacognosia Lisboa Calouste Gulbenkian DAI J amp MUMPER R J Plant Phenolics Extraction Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties Molecules v15 n 10 p 7313ndash7352 2010

DIAS EGE VALENZUELA VCT ALVES MR DUARTE MGR GARCIA EF Qualidade e autenticidade de folhas de chapeacuteu-de-couro (Echinodorus grandiflorus) oriundas de fornecedores de Satildeo Paulo Brazilian Journal of Medicinal Plants v15 n2 p250-256 2013 DIMECH G S SOARES L A L FERREIRA M A DE OLIVEIRA A G V CARVALHO M D C amp XIMENES E A (2013) Phytochemical and Antibacterial Investigations of the Extracts and Fractions from the Stem Bark of Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne and Effect on Ultrastructure of Staphylococcus aureus Induced by Hydroalcoholic Extract The Scientific World Journal 2013 1ndash8 EUROPEAN PHARMACOPOEIA Directorate for the quality of medicines of the Council of Europe (EDQM) 5ed Strasbourg Council of Europe 2005 3000p FARMACOPEacuteIA Brasileira 4 ed Satildeo Paulo Atheneu 1988

FARMACOPEacuteIA Brasileira 5 ed ANVISA 2010 Disponiacutevel em 06 de fevereiro de 2011 httpwwwanvisagovbrhotsitecd_farmacopeiaindexhtm FERREIRA M R A Triagem antifuacutengica de extratos obtidos de espeacutecies vegetais do nordeste brasileiro 2012 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Ciecircncias Farmacecircuticas) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas Universidade Federal do Rio Grande do Norte Natal 2012 GHANNOUM M A amp RICE L B Antifungal agents mode of action mechanisms of resistance and correlation of these mechanisms with bacterial resistance Clinical Microbiology Reviews v12 n4 p501ndash17 1999 GOSMANN G PALAZZO de MELLO J C MENTZ L A ROS PETROVICK P Farmacognosia da planta ao medicamento 6 ed Porto Alegre Florianoacutepolis Ed Universidade UFRGS ed Universidade UFSC p 577-611 2007 HARBONE JB Phytochemical methods 3 ed London Chapman amp Hall p 288 1998 HIRASAWA M TAKADA K 2004 Multiple effects of green tea catechin on the antifungal activity of antimycotics against Candida albicans Journal of Antimicrobial Chemotherapy v53 n2 p225-229 2004

176

HUBINGER S Z SALGADO H R N amp MOREIRA R R DControles fiacutesico fiacutesico-quiacutemico quiacutemico e microbioloacutegico dos frutos de Dimorphandra mollis Benth Fabaceae Revista Brasileira de Farmacognosia v19 p 690ndash696 2009 LIMA-NETO R G CAVALCANTE N N M SRIVASTAVA R M et al Synthesis of 123-triazole derivatives and in vitro antifungal evaluation on Candida strains Molecules (Basel Switzerland) v 17 n 5 p 5882ndash92 2012 MAGALHAtildeES L M SEGUNDO M A REIS S LIMA J L F C Methodological aspects about in vitro evaluation of antioxidant properties Analytica Chimica Acta v 613 p1-19 2008 MARKHAM K R Techniques of flavonoid identification New York Academic Press 113 p 1982 MIGLIATO K F MOREIRA R R D MELLO J C P SACRAMENTO L V S CORREA M A SALGADO H R N Controle de Qualidade do Fruto de Syzygium cumini (L) Skeels Revista Brasileira de Farmacognosia v 17 n 1 2007 MIGLIATO KF CORREcircA MA SALGADO HRN TOGNOLLI JO SACRAMENTO LVS MELLO JCP MENDES GIANNINI MJS ALMEIDA SMF PIZZOLITTO AC 2011 Planejamento experimental na otimizaccedilatildeo da extraccedilatildeo dos frutos de Syzygium cumini (L) SKEELS Quiacutemica Nova v 34 n 4 p 695-699 2011 NACZK M amp SHAHIDI F Extraction and analysis of phenolics in food Journal of Chromatography A v1054 n1-2 p95-111 2004 NORIEGA P ROumlPKE C D CAMILO C M FREITAS P C D BARROS SB M Avaliaccedilatildeo por anaacutelise fatorial das condiccedilotildees da extraccedilatildeo do 4-nerolidilcatecol de Pothomorphe umbellata (L) Miq Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences v 41 n 2 p 261-269 2005 ONG E S Extraction methods and chemical standardization of botanicals and herbal preparations Journal of chromatography B Analytical technologies in the biomedical and life sciences v 812 v1-2 p23ndash33 2004 PARK C H TANAKA T KIM H Y PARK J C YOKOZAWA T ldquoProtective effects of Corni Fructus against advanced glycation endproducts and radical scavengingrdquo Evidence Based Complementary Alternative medicine n 2012 p 1-7 2012 ROBERTSON E H CARTWRIGHT R A WOOD J J Sci Food Agr v 7 p 637-640 1955 RODRIGUES I C FERNANDES J S SOUZA L A G VASCONCELLOS M C LIMA E S SOUZA T P Influecircncia de fatores tecnoloacutegicos sobre OS CONSTITUINTES QUIacuteMICOS PRESENTES EM soluccedilotildees de Caesalpinia ferrea Martius In 61a Reuniatildeo Anual da Sociedade Brasileira Para o Progresso da Ciecircncia Manaus 2009

177

SANTOS S C amp MELL O J C P Taninos In SIMOtildeES C M O SCHENKEL E P GOSMANN G MELLO J C P de MENTZ L A PETROVICK P R (org) Farmacognosia da Planta ao Medicamento 5 Ed Porto Alegre UFRGS Florianoacutepolis UFSC 2003 Cap 24 p 615-656 2010 SENHAJI B HMAMOU D BEN SALGHI R ZARROUK A CHEBLI B ZARROK H WARAD I HAMMOUTI B AL-DEYAB S S Asteriscus Imbricatus Extracts Antifungal Activity and Anticorrosion Inhibition International Journal of Electrochemical Science v 8 p 6033-6046 2013 SCHOFIELD P MBUGUA D M PELL A N Analysis of condensed tannins a review Animal Feed Science and Technology v 91 p 21-40 2001 SHARAPIN N Fundamentos de tecnologia de produtos fitoteraacutepicos Santafeacute de Bogotaacute Convenio Andreacutes Bello 2000 SHARMA O P DAWRA R K Thin-layer chromagraphyc separations of lantadens the pentacyclic triterpenoids from (Lantana camara) Plant Journal of Chromatography A v 587 p 351-354 1991 SILVA JUacuteNIOR J O C Obtenccedilatildeo e avaliaccedilatildeo de forma farmacecircutica semi-soacutelida fitoteraacutepica contendo extrato seco por nebulizaccedilatildeo de Simphytum officinale L(confrei) Satildeo Paulo Tese de doutorado Programa de Poacutes graduaccedilatildeo em Faacutermacos e Medicamentos Universidade de Satildeo Paulo 2006 SILVEacuteRIO F O BARBOSA L C A GOMIDE J L REIS F P PILOacute-VELOSO D Metodologia de extraccedilatildeo e determinaccedilatildeo do teor de extrativos em madeiras de eucalipto Revista Aacutervore v 30 n 6 p 1009-1016 2006 SONAGLIO D ORTEGA GG PETROVICK PR BASSANI VL Desenvolvimento tecnoloacutegico e produccedilatildeo de fitoteraacutepicos In SIMOtildeES C M O SCHENKEL E P GOSMANN G MELLO J C P de MENTZ L A PETROVICK P R (org) Farmacognosia da Planta ao Medicamento 5 ed rev ampl Porto Alegre UFRGS Florianoacutepolis UFSC 2003 Cap 24 p 615-656 2010 SOUZA ACM KATO L SILVA C CIDADE A OLIVEIRA CMA SILVA MRR Antimicrobial activity of Hymenaea martiana towards dermatophytes and Cryptococcus neoformans Mycoses v 53 n 6 p 500-503 2010 SOUZA A P T B BARNI S T FERREIRA R A COUTO A G Desenvolvimento Tecnoloacutegico de Soluccedilotildees Extrativas Hidroetanoacutelicas das Flores de Calendula officinalis L Empregando Planejamento Fatorial Latin America Journal of Pharmacy v29 n1 p 13-21 2010 SOUZA A D Otimizaccedilatildeo da extraccedilatildeo de taninos da casca do cajueiro 2013 Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Engenharia Quiacutemica) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Engenharia Quiacutemica Universidade Federal do Cearaacute Fortaleza 2013

178

TIWARI P KUMAR B KAUR M KAUR G amp KAUR H Phytochemical screening and Extraction A Review Internationale Pharmaceutica Sciencia v1 n1 p98-106 2011

VALANDRO J BASSO G RODRIGUES P O BUDAL R SONAGLIOD Padronizaccedilatildeo do processo extrativo de soluccedilotildees hidroalcooacutelicas de Passiflora edulis Sims in 6ordf Semana de Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal de Santa Catarina Florianoacutepolis 2007

VASCONCELOS L C SAMPAIO M C SAMPAIO F C HIGINO J S Use of Punica granatum Linn as an antifungal agent against Antifungal activity of P granatum candidosis associated with denture stomatitis Mycoses v 46 p192-196 2003 VERZA S G PAVEI C amp ORTEGA G G Study of the Specificity of Cross-Povidone (PVPP) as binding agent in the quantification of polyphenolic compounds Journal of the Brazilian Chemical Society v19 n8 p1627ndash1633 2008 VERZA S G KREINECKER M T REIS V HENRIQUES A T ORTEGA G G Avaliaccedilatildeo das variaacuteveis analiacuteticas do meacutetodo de Folin-Ciocalteau para determinaccedilatildeo do teor de taninos totais utilizando como modelo o extrato aquoso de folhas de Psidium guajava L Quiacutemica Nova v30 n 4 p 815-820 2007 VINATORU M (2001) An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive principles from herbs Ultrasonics sonochemistry 8(3) 303ndash13 VOIGT R BORNSCHEIN M Tratado de tecnologia farmacecircutica 3ordm ed Zaragoza Editorial Acribia 1982 VOIGT R Pharmazeutische Technologie 7 uumlberarb Aufl Ullstein Mosby Berlin 1993 VOIGT R Pharmazeutische Technologie 9 Ausgabe Stuttgart Deutscher Apotheker 2000

WAGNER H BLADT S Plant drug analisis A thin layer chromatography atlas 2ed Berlin Springer Verlag 1996 p 384

WALLENFELS K Detection of reducing sugars in paper chromatogram and quantitative evaluation Naturwissenschaften v 37 p 491-492 1950

WANG L amp WELLER C L (2006) Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants Trends in Food Science amp Technology v17 n6 p300ndash312 2006 XAVIER H S Lavandula stoechas L (Lamiaceae) Etude Botanique Chimique et Pharmacodynamique (Tese de doutorado) Monpellier Universiteacute de Monpellier-I 1988

RUKAYADI Y LAU K Y ZAININ N S ZAKARIA M ABAS F Screening antimicrobial activity of tropical edible medicinal plant extracts against five standard microorganisms for natural food preservative International Food Research Journal v 20 n 5 p 2905-2910 2013

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6 IDENTIFICACcedilAtildeO DO FLAVONOacuteIDES PRESENTES NA FRACcedilAtildeO ACETATO DE

ETILA DA CASCA DO CAULE DE Hymenaea stigonocarpa


Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne o jatobaacute-do-cerrado apresenta

distribuiccedilatildeo homogecircnea e ocorre predominantemente em aacutereas de cerrado sendo

uma espeacutecie lenhosa tiacutepica deste bioma (PAIVA amp MACHADO 2006)

As suas cascas do caule satildeo amplamente utilizadas na medicina popular em

infusatildeo ou decocccedilatildeo para tratar a dor de estocircmago asma bronquite uacutelceras


al2012)

Estudos farmacoloacutegicos tem revelado que os extratos de Hymenaea

stigonocarpa apresentam vaacuterias atividades bioloacutegicas tais como antiulcerogecircnica

(GUIMARAtildeES 2009) inibitoacuteria sobre o crescimento das linhagens de ceacutelulas

tumorais H460 Colo 205 e U937 (BRASIL et al 2009) inibitoacuteria sobre a liberaccedilatildeo

induzida de histamina a partir de mastoacutecitos (FERREIRA 2011) antidiarreica

gastroprotetor e cicatrizante (ORSI 2012) antioxidante (MARANHAtildeO et al 2013) e

antibacteriana (DIMECH et al 2013)

Avaliaccedilotildees fitoquiacutemicas de Hymenaea stigonocarpa demonstram a presenccedila

de terpenos sesquiterpenos aacutecidos graxos flavonoacuteides e taninos metaboacutelitos

secundaacuterios reconhecidos por suas atividades bioloacutegicas (LANGENHEIM et al

1983 MATUDA amp NETTO 2005 ORSI et al 2012)

Quanto aos metaboacutelitos Hymenaea stigonocarpa mais ativos Dimech e

colaboradores (2013) descrevem que aqueles extratos e fraccedilotildees ricos em taninos

satildeo os mais ativos quanto agrave atividade antibacteriana Apesar destes apresentarem

em sua composiccedilatildeo taninos os flavonoides tambeacutem estatildeo presentes e apesar de

aparentemente natildeo influenciarem a na accedilatildeo antimicrobiana tem um grande

potencial farmacoloacutegico

Vaacuterios estudos demonstram as atividades farmacoloacutegicas jaacute atribuiacutedas aos

flavonoacuteides tais como antitromboacutetica (MILLS amp BONE 2000) anti-hipertensiva

(BLUMENTHAL 2003) antiespasmoacutedica (ROBBERS amp TYLER 2000) e antialeacutergica

(MILLS amp BONE 2000)

180

Esses efeitos estatildeo ligados agrave sua capacidade de atuar como antioxidantes e

sequestrantes de radicais livres quelando metais e interagindo com enzimas

receptores e membranas (BEHLING et al 2004)

Alguns flavonoacuteides jaacute identificados nas diferentes espeacutecies do gecircnero

Hymenaea A astilbina foi identificada na resina do tronco de Hymenaea parvifolia

(ISHIBASHI et al 1999) Pettit et al (2003) isolaram os flavonoacuteides luteolina

crisoeriol palstatina entre outros das folhas de Hymenaea palustre Lovato e Nunes

(2007) sugeriu que o extrato de acetato de etila da casca de Hymenaea

stigonocarpa conteacutem o flavonoacuteide astilbina Suzuki et al (2008) isolaram dois

flavonoacuteides do alburno de H courbaril a taxifolina e o fisetinidol e foram isolados no

alburno de Hymenaea stigonocarpa quatro flavonoides identificados como hultenina

taxifolina quercetina e 7-methoxcatequina (MARANHAtildeO et al 2013)

A anaacutelise da impressatildeo digital cromatograacutefica pode refletir o perfil quiacutemico e

tem sido amplamente aceita para avaliaccedilatildeo da qualidade e espeacutecies diferenciaccedilatildeo

(ZHANG 2012) Desta forma cromatogramas de extratos hidroalcooacutelicos da casca

do caule de Hymenaea stigonocarpa obtidos atraveacutes de CLAE-DAD por Dimech et

al (2013) sugerem a natureza polifenoacutelica desta parte da planta sugerindo a

presenccedila de catequinas polimeacutericas e relatando a partir da avaliaccedilatildeo por CCD

associada anaacutelise dos espectros de UV a presenccedila de substacircncias sugestivas de

flavonoacuteides

Com o desenvolvimento das teacutecnicas de analiacuteticas as impressotildees digitais

cromatograacuteficas que fornecem caracterizaccedilatildeo sisteacutemica de produtos agrave base de

plantas tecircm sido aceitas por muitos paiacuteses e organizaccedilotildees (LONG et al 2012)

Vaacuterios meacutetodos cromatograacuteficos tecircm sido amplamente utilizados para a

obtenccedilatildeo dessas impressotildees digitais tais como cromatografia em camada delgada

(CCD) cromatografia gasosa (CG) cromatografia liacutequida de alta eficiecircncia (CLAE) e

eletroforese capilar (EC) (ZHONG et al 2009 PENG et al 2011)

No entanto estes meacutetodos geralmente demandam periacuteodos de anaacutelises

longos Nos uacuteltimos anos a cromatografia liacutequida de ultrarraacutepida (UFLC) que

emprega partiacuteculas porosas submicromeacutetricas como fase estacionaacuteria tem sido

aplicada com ecircxito na raacutepida obtenccedilatildeo de perfis de produtos agrave base de plantas (OZ

2011) UFLC DAD demonstrou ser uma potente teacutecnica de impressatildeo digital

181

cromatograacutefica com as vantagens de tempo curto de anaacutelise de alta resoluccedilatildeo e um

bom desempenho de separaccedilatildeo (LONG et al 2012)

182

62 OBJETIVOS


621 OBJETIVO GERAL

Identificar os flavonoides presentes na fraccedilatildeo acetato de etila da casca do caule de

Hymenaea stigonocarpa atraveacutes de cromatografia liacutequida ultrarraacutepida associada a

espectrocircmetria de massas


Determinar atraveacutes de Anaacutelise por cromatografia liquida ultrarraacutepida acoplada

a detector de arranjo de Diodos e espectrocircmetro de massas o perfil

cromatograacutefico e espectros de Ultravioleta (UV) do extrato acetato de etila

Sugerir atraveacutes das anaacutelises dos cromatogramas de UV dos espectros de

massas dados da literatura eou comparaccedilatildeo com o padratildeo astilbina os

flavonoides presentes na fraccedilatildeo acetato de etila

183



deste estudo

631 AMOSTRAS

Fraccedilatildeo acetato de etila da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa obtida

atraveacutes do resiacuteduo seco do extrato hidroalcooacutelico (5g) particionada em aacutegua e

acetato de etila (11) e padratildeo de astilbina (98 de pureza Aktin Chemicals Inc

China)

632 SOLVENTES EMPREGADOS

Metanol (MeOH) grau HPLC (marca JT Baker) H2O deionizada (18mΩ Milli-

Q Millipore) foram utilizados como solventes Esses foram filtrados e

posteriormente desgaseificados em banho de ultrassom

633 SISTEMA CROMATOGRAFIA LIQUIDA ULTRARRAacutePIDA ACOPLADA A

DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS E ESPECTROcircMETRO DE MASSAS

(UFLC-DAD-EM)

A anaacutelise cromatograacutefica foi realizada em UFLC Shimadzureg Proeminence

equipado com bombas LC-20AD injetor automaacutetico modelo Sil-20A HT detector de

DAD SPD-M20A controlador CBM-20A forno para coluna CTO-20A

Aliacutequotas de 20μL das amostras (1mgml) foram injetadas via um auto injetor

com um fluxo de 10mL min em coluna analiacutetica CLC-ODS (C-18) Shimadzureg de

250 x 46 mm 5micro Os cromatogramas na regiatildeo de UV gerados pelo DAD foram

registrados em 200 a 700nm

Para a anaacutelise de massas o cromatoacutegrafo foi acoplado espectrocircmetro de

massas UltrOTOF (Bruker-daltonics Billarica USA) com ionizaccedilatildeo por IES com

monitoramento de iacuteons negativos e positivos

184

634 ANAacuteLISE POR UFLC-DAD-EM

As condiccedilotildees para UFLC-DAD foram obtidas usando um gradiente de eluiccedilatildeo

composto por aacutegua (bomba A) e MeOH (bomba B) (73) que variou de 0 min 30

B 15 min 30 B 30 min 40 B 40 min 60 B 45 min 100 B 50 min 100 B

51 min 30 B 65 min 30 B

Os cromatogramas gerados por espectro de massas foram registrados na

regiatildeo entre mz 50 e mz 1200 e os paracircmetros do espectrocircmetro de massas

listados a seguir foram mantidos os mesmos em todas as anaacutelises 1000 scans por

segundo intervalo entre espectros 2 segundos fluxo do gaacutes de secagem 80Lmin

temperatura do gaacutes de secagem 220degC pressatildeo do gaacutes de nebulizaccedilatildeo 4 bar

6341 Identificaccedilatildeo dos flavonoacuteides

Os picos cromatograacuteficos foram identificados com base em seus espectros no

UV massa acurada obtida para os iacuteons moleculares (moleacutecula protonada [M+H]+

eou moleacutecula desprotonada [M-H]-) em alta resoluccedilatildeo e tempos de retenccedilatildeo no

sistema utilizado

A utilizaccedilatildeo de cada tipo de dados obtidos e o procedimento para a

identificaccedilatildeo dos picos ocorreu conforme a necessidade As informaccedilotildees disponiacuteveis

na literatura e a obtenccedilatildeo de padrotildees no laboratoacuterio foram conduzidos

principalmente com base nos resultados de estudos fitoquiacutemicos anteriores de


Em estudo anterior apoacutes avaliaccedilatildeo atraveacutes de CLAE-DAD Dimech et al

(2013) sugeriu apoacutes a contaminaccedilatildeo do extrato avaliado com o padratildeo de Astilbina

onde um dos picos apresentou mesmo tempo de retenccedilatildeo aleacutem de aumento de sua

aacuterea e semelhanccedila quanto ao espectro de UV que um dos flavonoacuteides tratava-se da

astilbina

Deste modo alguns picos foram identificados por comparaccedilatildeo de tempos de

retenccedilatildeo e espectros de UV com os de padrotildees no caso a astilbina aleacutem de

posterior confirmaccedilatildeo pelas massas moleculares acuradas obtidas

Poreacutem outros soacute puderam ter sua identidade definida apoacutes anaacutelise e

comparaccedilatildeo pelas massas moleculares acuradas obtidas e espectro de UV com

aqueles jaacute relatados na literatura

185

No caso dos flavonoacuteides em que os espectros podem revelar o tipo de

flavonoacuteide (por exemplo flavona flavonol flavanona diidroflavonol chalcona) e agraves

vezes ateacute dar indiacutecios sobre o padratildeo de substituiccedilatildeo tambeacutem foram utilizados os

dados e discussotildees publicados por Gattuso et al (2006) Markham (1982) e Mabry

et al (1970)

186


Os resultados que estatildeo apresentados na tabela 11 satildeo baseados nos

paracircmetros tempo de retenccedilatildeo espectro de UV espectro de massas dos iacuteons

moleculares desprotonados [M-H]- em dados da literatura e no tempo de retenccedilatildeo

do padratildeo astilbina Os picos A B C e D satildeo sugestivos de serem taxifolina (285

nm) astilbina (290 nm) engeletina (289 nm) e um estereoisocircmero da astilbina

(290nm) respectivamente

Tabela 11 - Dados cromatograacuteficos e espectrofotomeacutetricos dos componentes

identificados no cromatograma da fraccedilatildeo acetato de etila de Hymenaea

stigonocarpa

Pico Tempo de retenccedilatildeo

λmax (nm) [M-H]- (mz) Foacutermula Estrutura proposta

A 505 min 285 nm 3030878 C15H12O7 Taxifolina

B 507 min 290 nm 4491106 C21H22O11 Astilbina

C 510 min 289 nm 4331154 C21H22O10 Engeletina

D 516 min 290 nm 4491132 C21H22O11 Estereoisocircmero

de astilbina

Todos os picos apresentaram nos espectros de UV uma banda com absorccedilatildeo

maacutexima em torno de 198nm (capiacutetulo II) e um ombro com maacuteximo proacuteximo a 290nm

sinais caracteriacutesticos de flavanonois (MARKHAM 1982)

A massa molecular obtida para o composto representado pelo pico A de

tempo de retenccedilatildeo 505 min eacute similar com a massa no modo de ionizaccedilatildeo negativa

[M-H]- calculada para a taxifolina de formula molecular C15H12O7 de 3030878 mz

(figura 1) compatiacuteveis com valores descritos na literatura para taxifolina (Zhang et al

2013)

187

Figura 58 - Espectro de Ultravioleta e espectro de massa do pico A obtido

compatiacutevel com taxifolina

(1) Espectro de UV com um ombro com absorccedilatildeo maacutexima proacutexima a 280nm espectro compatiacutevel com flavononoacuteis (MARKHAM 1982) (2) Massa do pico A no modo de ionizaccedilatildeo negativa sugestivo de taxifolina [M-H]

- 3030878

1

1

2

188

Dados obtidos anteriormente (capitulo II) sugerem ser astilbina um dos

flavonoacuteides presentes na casca do caule de Hymenaea stigonocarpa apoacutes

avaliaccedilatildeo por CCD e HPLC-DAD onde os tempos de retenccedilatildeo e o espectro de UV

foram idecircnticos apoacutes contaminaccedilatildeo da amostra com o padratildeo astilbina

A comparaccedilatildeo dos cromatogramas obtidos apoacutes anaacutelise com UFLC-DAD a

partir da fraccedilatildeo acetato de etila e do padratildeo astilbina confirmam esses resultados

sugerindo fortemente a presenccedila de astilbina desta fraccedilatildeo

Para a atribuiccedilatildeo da astilbina como sendo a substacircncia representada pelo

pico B (figura 3) foram comparados tempo de retenccedilatildeo (509 min) espectro de UV

(λmax 290 nm) e espectro de massas deste pico aos do padratildeo de astilbina

(C21H22O11) um flavanonol de massa molecular obtida no modo de ionizaccedilatildeo

negativa [M-H] de valor 4491132 (figura 2)

Aleacutem da semelhanccedila entre as variaacuteveis tempo de retenccedilatildeo (507 min) e

espectro de UV (λmax 290 nm) o valor da massa molecular obtida no modo de

ionizaccedilatildeo negativa [M-H]- para o pico B da fraccedilatildeo acetato de etila foi de valor

4491106 valor compatiacutevel com a astilbina

Os λmax do espectro de UV e massa no modo de ionizaccedilatildeo negativa para o

pico D tambeacutem satildeo similares aos apresentados pelo padratildeo astilbina e pico B (figura

5) todos apresentam um ombro com λmax proacuteximo a 290nm e massa molecular

compatiacutevel com o padratildeo astilbina C21H22O11 [M-H]- 4491125 Devido a diferenccedilas

no tempo de retenccedilatildeo deste pico D em relaccedilatildeo ao pico B e ao padratildeo de astilbina

utilizado sugerimos ser este um estereoisocircmero da astilbina

Quanto ao pico C (figura 4) a massa molecular obtida estaacute em conformidade

com a massa exata calculada para engeletina (C21H22O10) no modo de ionizaccedilatildeo

negativa [M-H]-- 4331154 sendo tambeacutem o espectro de UV apresentando ombro

com λmax proacuteximo a 290nm compatiacutevel com valores descritos na literatura para

engeletina (ZHANG et al 2013 MABRY et al 1970)

Os flavonoacuteides relatados neste trabalho jaacute foram descritos em espeacutecies do

gecircnero Hymenaea e em todos os casos satildeo atribuiacutedas atividades bioloacutegicas a estas

substacircncias A taxifolina foi identificada no alburno de Hymenaea courbaril (SUZUKI

et al 2008) sendo descrita por apresentar atividade antioxidante Aleacutem disso

tambeacutem foi identificada no alburno de Hymenaea stigonocarpa (MARANHAtildeO et al

2013) apresentando atividade antitermitica frente agrave Nasutitermes corniger

189

Figura 59 - Espectro de UV e de massas dos iacuteons moleculares desprotonados do

padratildeo astilbina

(1) Espectro de UV com ombro de absorccedilatildeo maacutexima proacutexima a 290nm e espectro de massas do no modo de ionizaccedilatildeo negativa [M-H]

- mz 4491132

1

2

190

Figura 60 - Espectro de UV e de massas do pico B compatiacutevel com a astilbina

(padratildeo)

(1)Espectro de UV com um ombro com absorccedilatildeo maacutexima proacutexima a 290nm (2) Massa do pico B no modo de ionizaccedilatildeo negativa com o padratildeo de astilbina [M-H]

- 4491132

1

2

191

Figura 61 - Espectro de UV e de massas do pico C compatiacutevel com o flavanonol

engeletina

(1) Espectro de UV com um ombro com absorccedilatildeo maacutexima proacutexima a 293 nm compatiacutevel com flavononoacuteis (MABRY et al 1970) (2) Massa do pico C no modo de ionizaccedilatildeo negativa sugestivo de engeletina [M-H]

- 4331154

1

2

192

Figura 62 - Espectro de UV e de massas do pico D compatiacutevel com

estereoisocircmero da astilbina

(1) Espectro de UV com um ombro com absorccedilatildeo maacutexima proacutexima a 290nm (2) Massa do pico D no modo de ionizaccedilatildeo negativa com o padratildeo de astilbina [M-H]

- 4491132 e pico A [M-H]

-

4491106

1

2

193

A engeletina assim como a astilbina foram identificada no extrato etanoacutelico da

casca de Hymenaea martiana (CARNEIRO et al 1993) apresentando resposta

antagocircnica a accedilatildeo de bradicinina (BK) no musculo liso uterino de ratas inibindo

assim as contraccedilotildees

A presenccedila do flavononol astilbina aleacutem de ser observada na casca de H

martiana (CARNEIRO et al 1993) como descrito anteriormente tambeacutem foi

relatada na resina do tronco da espeacutecie H parvifolia (ISHIBASHI et al1999) onde foi

descrita a ocorrecircncia de um estereoisocircmero da astilbina a neoastilbina que juntos


dependente

A presenccedila de astilbina foi tambeacutem relatada em Hymenaea stigonocarpa

onde Lovato e Nunes (2007) isolaram este flavonoacuteide e o sugeriram por comparaccedilatildeo

do espectro de infravermelho com amostra autecircntica a sua presenccedila

Os dados obtidos por cromatografia liacutequida ultrarraacutepida espectros de massas

e a utilizaccedilatildeo do padratildeo astilbina associados aos relatos da ocorrecircncia desses

flavonoacuteides em diversas espeacutecies do gecircnero Hymenaea sugerem fortemente a

presenccedila de astilbina e um estereoisocircmero taxifolina e engeletina na fraccedilatildeo acetato

de etila da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa sendo este o primeiro relato

da ocorrecircncia de taxifolina engeletina e de um estereoisomero de astilbina

194

65 CONCLUSOtildeES

Os resultados obtidos permitem constatar que o cromatograma obtido por

UFLC-DAD-EM no modo de ionizaccedilatildeo negativa apresenta valores de espectro de

massas e UV caracteriacutesticos de quatro flavonoacuteides com diferentes tempos de

retenccedilatildeo (Picos A B C e D) Uma dessas substacircncias (pico A) apresenta massa

molecular obtida em conformidade com a massa no modo de ionizaccedilatildeo negativa

calculada para a taxifolina e com dados da literatura

Jaacute o pico B apresenta tempo de retenccedilatildeo dados de espectro de UV e de

massas similares ao padratildeo astilbina utilizado dados que sugerem fortemente ser

este o flavonoide astilbina

O pico C apresenta massa molecular obtida em conformidade com a massa

no modo de ionizaccedilatildeo negativa calculada para a engeletina e com dados da

literatura Como tambeacutem o pico D apresenta as mesmas caracteriacutesticas do espectro

de UV e de massas que o pico B e do padratildeo apresentando poreacutem tempo de

retenccedilatildeo diferente dados que sugerem ser este um estereoisocircmero da astilbina

195

REFEREcircNCIAS BATISTA A G ESTEVES E A DESSIMONI-PINTO N A V OLIVEIRA L G PIRES S T SANTANA R C ldquoChemical composition of jatobaacute-do-cerrado (Hymenaea stigonocarpa Mart) flour and its effect on growth of ratsrdquo Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara n 2 p173-180 2011 BEHLING E V SENDAtildeO M C FRANCESCATO H D C ANTUNES L M G BIANCHI M L P Flavonoacuteide quercetina aspectos gerais e accedilotildees bioloacutegicas Alimentos e Nutriccedilatildeo Araraquara Vol 15 No 3 2004 BIESKI G C SANTOS F R OLIVEIRA R M ESPINOSA M M MACEDO M ALBUQUERQUE U P MARTINS D T O ldquoEthnopharmacology of Medicinal Plants of the Pantanal Region (Mato Grosso Brazil)rdquo Evidence-based Complementary and Alternative Medicine n 2012 p1-36 2012 BLUMENTHAL M The ABC Clinical Guide to Herbs Austin American Botanical Council p239 2003 BRASIL T R ANDREAtildeO P S S MIRANDA P C M L GIACOMINI R A BORGES F V KANASHIRO M M avaliaccedilatildeo in vitro da atividade citotoacutexica frente a ceacutelulas tumorais humanas decompostos isolados do epicarpo de Hymenaea stigonocarpa In CONFICT - Congresso Fluminense de Iniciaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica UENF Rio de Janeiro 2009 CARNEIRO E CALIXTO J B MONACHE F D YUNES R A Isolation Chemical Identification and Pharmacological Evaluation of Eucryphin Astilbin and Engelitin Obtained from the Bark of Hymenaea martiana Pharmaceutical Biology v31 n1 p 38-46 1993 DIMECH G S SOARES L A L FERREIRA M A DE OLIVEIRA A G V CARVALHO M D C amp XIMENES E A Phytochemical and Antibacterial Investigations of the Extracts and Fractions from the Stem Bark of Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne and Effect on Ultrastructure of Staphylococcus aureus Induced by Hydroalcoholic Extract The Scientific World Journal p1ndash8 2013 FERREIRA T L 2011 Prospecccedilatildeo de inibidores da secreccedilatildeo de histamina a partir de espeacutecies vegetais do Cerrado e da Mata Atlacircntica81p (Dissertaccedilatildeo de Mestrado) - Curso de Poacutes-Graduaccedilatildeo Ciecircncias Bioloacutegicas Universidade Estadual Paulista Botucatu GRANDI T S M TRINDADE J A PINTO M J F FERREIRA L L CATELLA A C ldquoPlantas medicinais de Minas Gerais Brasilrdquo Acta Botanica Brasilica n3 p185-2241989 GUIMARAtildeES M A F PIRES R A LIMA J C S MARTINS D T O Avaliaccedilatildeo da atividade antiulcerogecircnica de Hymenaea stigonocarpa (Mart) Hayne (Caesalpinaceae) In IV simpoacutesio ibero-americano de plantas medicinais Cuiabaacute 2009

196

ISHIBASHI M ODA H MITAMURA M OKUYAMA E KOMIYAMA K KAWAGUCHI H WATANABE T ALVES SM MAEKAWA T OHTSUK K Casein Kinase II Inhibitors isolated from two Brazilian plants Hymenaea parvifolia and Wulffia baccata Bioorganic amp MedIcinal ChemIstry Letters v9 p 2157-2160 1999 LANGENHEIM J H HALL G D ldquoSesquiterpene deterrence of a leaf-tying lepidopteran Stenoma ferrocanella on Hymenaea stigonocarpa in Central Brazilrdquo Biochemical Systematics and Ecology n11 p 29ndash36 1983 LONG T YU J HUANG Y SHI Z XU L Rapid fingerprint analysis of Radix Scutellariae by UFLC-DAD Journal of Chromatografic Science v51 n10 p 939-42 2013 LOVATO G A amp NUNES D S Obtenccedilatildeo de astilbina de hymenaea stigonocarpa martius In VII Encontro de Pesquisa da UEPG Ponta Grossa 2007 MABRY T J MARKHAM K R THOMAS M B The systematic identification of flavonoids Berlin Springer-Verlag p151-154 1970 MARANHAtildeO C A PINHEIRO I O SANTANA A L B D OLIVEIRA L S NASCIMENTO M S amp BIEBER L W Antitermitic and antioxidant activities of heartwood extracts and main flavonoids of Hymenaea stigonocarpa Mart International Biodeterioration amp Biodegradation v79 p 9ndash13 2013 MATUDA T G NETTO F M Semente de jatobaacute-do-cerrado caracterizaccedilatildeo quiacutemica Ciecircncia e Tecnologia de Alimentos v25 n2 p353-357 2005 MILLS S BONE K Principles and Practice of Phytotherapy Modern Herbal Medicine New York Churchill Livingstone 200031-34 ORSI P R BONAMIN F SEVERI J A SANTOS R C VILEGAS W HIRUMA-LIMA C A DI STASI L C ldquoHymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne A Brazilian medicinal plant with gastric and duodenal anti-ulcer and antidiarrheal effects in experimental rodent modelsrdquo Journal of Ethnopharmacology n143 p81ndash90 2012 OZ F Quantitation of heterocyclic aromatic amines in ready to eat meatballs by ultra fast liquid chromatography Food Chemistry v126 p 2010ndash2016 2011 PAIVA E A S amp MACHADO S R Ontogecircnese anatomia e ultraestrutura dos nectaacuterios extraflorais de Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne (Fabaceae - Caesalpinioideae) Acta Botacircnica Brasilica vol20 n2 pp 471-482 2006 PENG L WANG Y Z ZHU H B CHEN Q M Fingerprint profile of active components for Artemisia selengensis Turcz by HPLCndashPAD combined with chemometrics Food Chemistry v 125 p1064ndash1071 2011 ROBBERS J E TYLER V E Tylerrsquos Herbs of Choice ndash The Therapeutic Use of Phytomedicinals Binghamton New York Haworth Herbal Press v69 n89 2000

197

SUZUKI R MATSUSHITA Y IMAI T SAKURAI M DE JESUS SALETE J M H OZAKI K FUKUSHIMA Z F K Characterization and antioxidant activity of Amazonian Woods Journal of Wood Science v54 p174ndash178 2008 VILA VERDE G M PAULA J R CARNEIRO D M ldquoLevantamento etnobotacircnico das plantas medicinais do cerrado utilizadas pela populaccedilatildeo de Mossacircmedes (GO)rdquo Revista Brasileira de Farmacognosia n13 p 64-66 2003 ZHANG Q F CHEUNG H Y amp ZENG L B Development of HPLC fingerprint for species differentiation and quality assessment of Rhizoma Smilacis Glabrae Journal of natural medicines v67 n1 p207ndash11 2013 ZHONG X K LI D C JIANG J G Identification and quality control of Chinese medicine based on the fingerprint techniques Current Medicinal Chemistry v16 p 3064ndash307 2009

1




RECIFE 2014

Tese submetida ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em

Ciecircncias Farmacecircuticas do Centro de Ciecircncias da

Sauacutede da Universidade Federal de Pernambuco como

parte dos requisitos para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Doutor

em Ciecircncias Farmacecircuticas

Aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e medicamentos

Linha de pesquisa Obtenccedilatildeo e avaliaccedilatildeo de produtos

naturais bioativos

Orientadora Profa Dra Eulaacutelia C Pde A Ximenes

1

2






BANCA EXAMINADORA










3


REITOR


VICE-REITOR













FARMACEcircUTICAS



FARMACEcircUTICAS


4





5

AGRADECIMENTOS







jornada


minha vida




esquecidos



















6












Doutorado










7





o dom da profecia e

conhecesse todos os



tivesse amor nada

seria

Corintios 13-2

8

LISTA DE FIGURAS





29



30


30





33


34


34



9















86


87


88

10


89


90


91


92


94


100










166



11



12

LISTA DE TABELAS






13

RESUMO


14

ABSTRACT


15

SUMAacuteRIO


20 22 22 22 23 23 24 25 25 26 27 31 31 31 32 33 34 35 37 37 38 38 38 38 39 39 41 41 41 42 42 43 43 43 44 44 44 45 45 45 45 45

16


45 46 47 47 47 49 51 52 53 63 63 68 68 68 69 69 69 70 70 70 73 73 73 74 74 74 75 75 75 76 77 78 79 79 79 81 81 82 82 82 83

17


84 84 85 86 87 87 90 91 92 92 92 93 95 99 102 103 111 111 112 114 115 116 116 116 117 117 117 117 118 119 119 119 119 120 122 123 132

18


133 139 139 142 142 142 143 143 143 143 144 144 145 145 145 145 146 146 146 146 146 147 147 147 147 148 148 149 149 150 150 150 150 150 151 151 152 152 153

19


153 156 160 160 164 164 168 170 173 174 179 179 182 182 182 183 183 183 183 184 184 186 194 195

20









BRANDELLI 2009)

























21


























doses reduzidas









22


FARMACOLOacuteGICOS
























23





















WEBERLING 1981)











24










Ameacuterica do Sul





LANGENHEIM 1975)














25






















FERREIRA 1997)










26





mesmo gecircnero













(MAZZEI et al 1999)















27


















metros de altura







28








(CARVALHO 2007)





29


Hayne)












ls

pd

30














cv ar

en

me ep

ls

en

mmee

ep

31
















A B

32






COOH




metila (Figura 10)


H

HCOOH

OH






13

33







(3) (Figura 12)








1 2 3

H H

H

COOHOH

COOMeOH

COOMe

13

1 2 3

13

15

7

15 8 15 8


dien-15-oico



de metila

34










MeOOC

18

13

16

4a 4b 5

1 2 3

H

H

H

H

6 7

H

35





identificados




α-muroleno (7)






H

6 7

H

H

3 4 5

1 2

H

H

36



1 2









1 2 3







ataque de formigas



2

COOH

HO

H

HOHO

COOH

H

HOO

COOH

H

13

18 18 18

14 14 14 13 13

2

HH

H

37



clerodacircnico

















1 2



COOH COOH

38



respectivamente








COOH

HOOC

COOH

HOOC












1 2

18 18

15 15

8 8

13

39


(FARIA et al 2004)



H

H



















1 2 3

40













4 5

COOMe

COOMeCOOMe

COOMe

6 7

19 19

19 19

1 2 3

O HO

41





















COOH

OH



42













1 2

OHO

OH O

OH

OH OHO

OH O

OCH3

OH

O

OOH

HO

O

O

OH

OH

OacuteCH3

OCH3

H

H

OCH3

3

43






1 2



stigonocarpa














OH

OHO

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

44




madagascariensis













courbaril






1

O

OH

MeO

O O

MeO

O O

2

O OOH

MeO

O

O

OMe

OH

45























gecircnero Hymenaea


46




















aleacutergicas













47








2006)















gecircnero Hymenaea








48




















esta accedilatildeo















49


























isolados






50



































51































al 2011)

52























dependente

53


54


55



56


57


58


59


60


61


62


63












2002)










et al 2006)










64














VERPOORTE 1999)





















65


BOLZANI 2001)























al 2002)










66

















(SINGH SHUKLA 1984)












al2012)






67





68

32 OBJETIVOS


321 Objetivo geral











69












Mart ex Hayne











70




























71







(FAE)


















Alcaloacuteides





(WAGNER 1996)




72




Iridoacuteides


Saponinas






Cumarinas



(WAGNER 1996)


A NEU

Surgimento de



A NEU



Flavonoacuteides

A NEU



(MARKHAM 1982)

(HARBORNE 1998)


Cloriacutedrica


(ROBERTSON 1955)


A NEU


(UV) (NEU 1956)

Accediluacutecares

D Cloridrato de



(WALLENFELS 1950)

73













Na2CO3 (10 vv)

















74



















dados









75



a seguir
























cepas padratildeo



76





















(1024 a 781 gmL)











77






























78






79










3411 Anatomia















SB

80











azul de Astra








FG

FD PC

CS

CS ECCC

FL

CP

81






taninos













FD

FL

FG

EC

PC

82














FG

FLD

FL

FLD

PT

FLD

83

















taninos




FD

SB

FLD

FL

FG

FLD

84




















Rf = 035

Rf = 080

Rf = 055

Rf = 014

Rf = 004

Rf = 012

85








esteroacuteides












Rf = 012

Rf = 086

Rf = 063

Rf = 035

Rf = 023

Rf = 007

86






















Rf = 047

Rf = 093

Rf = 098

Rf = 047

Rf = 005

87





stigonocarpa

34214 Accedilucares






glicose (Rf 053)







Rf = 053 Rf = 053 Rf = 046

88










(HEIL et al 2002)














Rf = 053

Rf = 060

89







condensados














1 2 3 4 P

Rf = 093 Rf = 083 Rf = 075 Rf = 069

Rf = 095

90











060)







Rf = 060

Rf = 060

Rf = 028

Rf = 028

P1 5 P2

91

















Rf = 004

Rf = 069

Rf = 047

EH FA

92










20ndash80120583gmL





EH FAE

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

93

















al 1970)














94






-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932

-50 at 3634 min 99902

HE + Astilbina A

B

C D E

HE

EE

AF

Tempo (min)

Ab

so

rbacircn

cia

(m

AU

)

A

C D E

A B

C D E

E

B

94

95











superiores















fermentadoras






96





(tabela 2)




aureus (Tabela 2)

















(tabela 2)



posteriores





97






EC EAE EE EA EH

FA FAE AST OXA TEI

















98














(tabela 2)



















99













figura 45



















100



stigonocarpa


A B C

D E F

G H I

J L K

OPC OPC

S

R R

R

OPC

MS

M

OPC

C

OP

C

ES

EPC

CR CR

CR CR

DPC

ES

ES

ES

ES

DAC

DAC

S

DAS

CF

M

CR

OPC

OPC

OPC ES

MS

101







2006)















aureus

102

35 CONCLUSOtildeES













taninos condensados










obtenccedilatildeo




103


104


105


106


107


108


109


110


111




(MRSA)




























al 2008)

112












antimicrobianos


















et al 2013)



113












2010)















al 2011)








114

































115

















(BANSAL et al 2013)





116

42 OBJETIVOS


421 Objetivo geral














117



deste estudo





35deg475670O)















estafilocoacutecica




118
































119












AM 19 AM 20 AM 21 e AM 24)















120


Mueller-Hinton































121










107 UFCmL













122


de transmissatildeo



sineacutergico









1ordmC











123













CIM de 256 microgmL





















124










estudo























125







(CLSI 2012)


CIM CBM (microgml)


ATCC 25923 256 256 025 025 0125 025 025 025 025 025 10 10 05 05 10 10

UFPEDA 01 256 256 05 10 0125 025 025 025 0125 025 05 05 025 025 025 025

AM 02 256 256 32 64 0125 0125 025 05 0125 025 20 40 05 05 05 05

AM 05 256 256 025 05 10 025 025 05 025 025 20 20 05 05 10 10

ATCC 33591 256 256 64 64 64 128 0125 0125 20 20 2048 2048 0125 025 10 10

AM 13 256 256 32 64 256 512 64 128 64 64 2048 2048 025 025 10 10

AM 18 256 256 64 64 128 256 64 128 128 256 2048 2048 025 05 10 10

AM 19 256 256 8 16 16 128 025 05 05 05 40 80 025 05 20 20

AM 20 256 256 8 16 8 16 40 80 0125 025 2048 2048 0125 025 10 10

AM 21 256 256 16 16 16 16 40 80 05 05 2048 2048 0125 0125 10 10

AM 24 256 256 32 32 256 256 64 128 256 512 2048 4096 0125 0125 10 20

12

5

126
























2012 MACEDO 2013)









127







FIC Individual

FICI

Efeito


AM 13


256 32 256 256 256 64 256 64 256 2048

128 006 64 64 64 16 128 003 128 1

050 00020 025 02500 025 02500 050 00005 050 00005

050 050 050 050 050


500 9981 750 7500 750 7500 500 9995 500 9995

AM 18


256 64 256 128 256 64 256 128 256 2048

128 006 128 05 20 32 128 10 128 20

050 00010 050 00039 00078 050 050 00078 050 00010

050 050 051 051 050


500 9990 500 9961 992 5000 500 9922 500 9990

AM 24


256 32 256 256 256 64 256 256 256 2048

128 006 32 64 2 32 128 0125 128 256

050 00019 0125 0250 0008 0500 050 00005 050 01250

050 038 051 050 063


500 9981 875 7500 9922 500 500 9995 500 8750

ATCC 33591


256 64 256 64 256 0125 256 2 256 2048

128 006 64 16 20 006 64 05 128 10

050 00010 025 02500 0008 0500 025 02500 050 00005

050 050 051 050 050


500 9990 750 7500 992 5000 750 7500 500 9995

12

7

128
















respectivamente
















129













(S)











FIC I = 038

130




(Figura 48 H)














bacteacuterias













131





A B C D

N O P Q

E F G H

PC

MP R

PC

MP

R

S

PC

MP

R

S

PC MP

R S

EPC MP

CR

ES

EPC

ES

CR

OPC

CD

CR ES

CR DPC

CD OPC

DPC

CD

CD

OPC CD

DAS

ES

ES

OPC DAS

OPC DPC

I J L M

OPC

DAS

J

DAS

OPC

DAS

132

45 CONCLUSOtildeES

















133

REFEREcircNCIAS


134


135


136


137


138


139

































140

















2011)

















141













(FERREIRA 2012)








142

52 OBJETIVOS


521 OBJETIVO GERAL


















143



deste estudo

531 Coleta
























144


1988






















145




pesados
























12h

146






2 horas

5343 Ultrassom





de 40 kHz

5344 Refluxo










5346 Infusatildeo




147



















min)





Statistica 60




148

















referecircncia
















149




























TT = PT - FNT

150









de 1mLmin









antimicrobiana











151




























152














incubadora de CO2









153




















154


















BORNSCHEIN 1982)

734 microm

155












galhos






















156






(SHARAPIN 2000)

























157


(SOUZA 2013)





























menor rendimento




158
















2009)














159











ultrassom
















1

2

3

4


Resiacuted

uo

seco

(g

)

160



maior rendimento








extraccedilatildeo






A B

161




nm para leitura














nm


162





Folin (mL)

Na2CO3 ()

Tempo (min)


1 10 5 -1 -1 -1 0453 00040 001

3 10 5 1 -1 -1 0431 00060 001

1 20 5 -1 1 -1 0414 00055 001

3 20 5 1 1 -1 0422 00180 004

1 10 25 -1 -1 1 0501 00261 005

3 10 25 1 -1 1 0519 00031 001

1 20 25 -1 1 1 0485 00083 002

3 20 25 1 1 1 0503 00066 001

2 15 15 0 0 0 0487 00154 003

2 15 15 0 0 0 0475 00026 001

2 15 15 0 0 0 0488 00089 002



5943951

6638698

8595094

1261833

1627582

2724828

-433412

1570891

p=05


Replicat(1)

Replicat(2)

2by3

(1)Folin (mL)

1by2

1by3

(2)Na2CO3 ()

(3)Time (min)

163























50 150

250

350

450

500

0

1

2

3

Caseiacutena (mg)

Teo

r d

e t

an

ino

s (

mg

g)

164








50mg 0424 0410 0399 0411 0013 0030

150mg 0376 0371 0385 0377 0007 0019

250mg 0320 0328 0330 0326 0005 0016

350mg 0272 0313 0318 0301 0025 0084

450mg 0275 0264 0269 0269 0006 0020

500mg 0254 0280 0264 0266 0013 0049














165


tabela 8






























166






C D B

EU

ET

EI

EM

ER

EMD

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

Astilbina = pico B


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995

167
























minutos


0

2

4

6

8


Po

life

no

is (

mg

GA

Eg

)

168




















Hayne





obtidos





169



















169











Hayne











TAKADA 2004)












170

171


SENHAJI et al 2013)















Candida



FLU CIM (microgml)
















172
















farmacoloacutegico

173

55 CONCLUSOtildeES









empregado






para o estudo









174

REFEREcircNCIAS




175




176


177


178








179










al2012)






















180




















flavonoacuteides













181



182

62 OBJETIVOS


621 OBJETIVO GERAL











183



deste estudo

631 AMOSTRAS




China)







(UFLC-DAD-EM)











184





51 min 30 B 65 min 30 B










sistema utilizado










astilbina







185





et al (1970)

186










stigonocarpa







de astilbina








2013)

187




- 3030878

1

1

2

188


































189




- mz 4491132

1

2

190


(padratildeo)


- 4491132

1

2

191


engeletina


- 4331154

1

2

192




- 4491132 e pico A [M-H]

-

4491106

1

2

193










dependente










194

65 CONCLUSOtildeES















195


196


197


1

2






BANCA EXAMINADORA










3


REITOR


VICE-REITOR













FARMACEcircUTICAS



FARMACEcircUTICAS


4





5

AGRADECIMENTOS







jornada


minha vida




esquecidos



















6












Doutorado










7





o dom da profecia e

conhecesse todos os



tivesse amor nada

seria

Corintios 13-2

8

LISTA DE FIGURAS





29



30


30





33


34


34



9















86


87


88

10


89


90


91


92


94


100










166



11



12

LISTA DE TABELAS






13

RESUMO


14

ABSTRACT


15

SUMAacuteRIO


20 22 22 22 23 23 24 25 25 26 27 31 31 31 32 33 34 35 37 37 38 38 38 38 39 39 41 41 41 42 42 43 43 43 44 44 44 45 45 45 45 45

16


45 46 47 47 47 49 51 52 53 63 63 68 68 68 69 69 69 70 70 70 73 73 73 74 74 74 75 75 75 76 77 78 79 79 79 81 81 82 82 82 83

17


84 84 85 86 87 87 90 91 92 92 92 93 95 99 102 103 111 111 112 114 115 116 116 116 117 117 117 117 118 119 119 119 119 120 122 123 132

18


133 139 139 142 142 142 143 143 143 143 144 144 145 145 145 145 146 146 146 146 146 147 147 147 147 148 148 149 149 150 150 150 150 150 151 151 152 152 153

19


153 156 160 160 164 164 168 170 173 174 179 179 182 182 182 183 183 183 183 184 184 186 194 195

20









BRANDELLI 2009)

























21


























doses reduzidas









22


FARMACOLOacuteGICOS
























23





















WEBERLING 1981)











24










Ameacuterica do Sul





LANGENHEIM 1975)














25






















FERREIRA 1997)










26





mesmo gecircnero













(MAZZEI et al 1999)















27


















metros de altura







28








(CARVALHO 2007)





29


Hayne)












ls

pd

30














cv ar

en

me ep

ls

en

mmee

ep

31
















A B

32






COOH




metila (Figura 10)


H

HCOOH

OH






13

33







(3) (Figura 12)








1 2 3

H H

H

COOHOH

COOMeOH

COOMe

13

1 2 3

13

15

7

15 8 15 8


dien-15-oico



de metila

34










MeOOC

18

13

16

4a 4b 5

1 2 3

H

H

H

H

6 7

H

35





identificados




α-muroleno (7)






H

6 7

H

H

3 4 5

1 2

H

H

36



1 2









1 2 3







ataque de formigas



2

COOH

HO

H

HOHO

COOH

H

HOO

COOH

H

13

18 18 18

14 14 14 13 13

2

HH

H

37



clerodacircnico

















1 2



COOH COOH

38



respectivamente








COOH

HOOC

COOH

HOOC












1 2

18 18

15 15

8 8

13

39


(FARIA et al 2004)



H

H



















1 2 3

40













4 5

COOMe

COOMeCOOMe

COOMe

6 7

19 19

19 19

1 2 3

O HO

41





















COOH

OH



42













1 2

OHO

OH O

OH

OH OHO

OH O

OCH3

OH

O

OOH

HO

O

O

OH

OH

OacuteCH3

OCH3

H

H

OCH3

3

43






1 2



stigonocarpa














OH

OHO

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

44




madagascariensis













courbaril






1

O

OH

MeO

O O

MeO

O O

2

O OOH

MeO

O

O

OMe

OH

45























gecircnero Hymenaea


46




















aleacutergicas













47








2006)















gecircnero Hymenaea








48




















esta accedilatildeo















49


























isolados






50



































51































al 2011)

52























dependente

53


54


55



56


57


58


59


60


61


62


63












2002)










et al 2006)










64














VERPOORTE 1999)





















65


BOLZANI 2001)























al 2002)










66

















(SINGH SHUKLA 1984)












al2012)






67





68

32 OBJETIVOS


321 Objetivo geral











69












Mart ex Hayne











70




























71







(FAE)


















Alcaloacuteides





(WAGNER 1996)




72




Iridoacuteides


Saponinas






Cumarinas



(WAGNER 1996)


A NEU

Surgimento de



A NEU



Flavonoacuteides

A NEU



(MARKHAM 1982)

(HARBORNE 1998)


Cloriacutedrica


(ROBERTSON 1955)


A NEU


(UV) (NEU 1956)

Accediluacutecares

D Cloridrato de



(WALLENFELS 1950)

73













Na2CO3 (10 vv)

















74



















dados









75



a seguir
























cepas padratildeo



76





















(1024 a 781 gmL)











77






























78






79










3411 Anatomia















SB

80











azul de Astra








FG

FD PC

CS

CS ECCC

FL

CP

81






taninos













FD

FL

FG

EC

PC

82














FG

FLD

FL

FLD

PT

FLD

83

















taninos




FD

SB

FLD

FL

FG

FLD

84




















Rf = 035

Rf = 080

Rf = 055

Rf = 014

Rf = 004

Rf = 012

85








esteroacuteides












Rf = 012

Rf = 086

Rf = 063

Rf = 035

Rf = 023

Rf = 007

86






















Rf = 047

Rf = 093

Rf = 098

Rf = 047

Rf = 005

87





stigonocarpa

34214 Accedilucares






glicose (Rf 053)







Rf = 053 Rf = 053 Rf = 046

88










(HEIL et al 2002)














Rf = 053

Rf = 060

89







condensados














1 2 3 4 P

Rf = 093 Rf = 083 Rf = 075 Rf = 069

Rf = 095

90











060)







Rf = 060

Rf = 060

Rf = 028

Rf = 028

P1 5 P2

91

















Rf = 004

Rf = 069

Rf = 047

EH FA

92










20ndash80120583gmL





EH FAE

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

93

















al 1970)














94






-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932

-50 at 3634 min 99902

HE + Astilbina A

B

C D E

HE

EE

AF

Tempo (min)

Ab

so

rbacircn

cia

(m

AU

)

A

C D E

A B

C D E

E

B

94

95











superiores















fermentadoras






96





(tabela 2)




aureus (Tabela 2)

















(tabela 2)



posteriores





97






EC EAE EE EA EH

FA FAE AST OXA TEI

















98














(tabela 2)



















99













figura 45



















100



stigonocarpa


A B C

D E F

G H I

J L K

OPC OPC

S

R R

R

OPC

MS

M

OPC

C

OP

C

ES

EPC

CR CR

CR CR

DPC

ES

ES

ES

ES

DAC

DAC

S

DAS

CF

M

CR

OPC

OPC

OPC ES

MS

101







2006)















aureus

102

35 CONCLUSOtildeES













taninos condensados










obtenccedilatildeo




103


104


105


106


107


108


109


110


111




(MRSA)




























al 2008)

112












antimicrobianos


















et al 2013)



113












2010)















al 2011)








114

































115

















(BANSAL et al 2013)





116

42 OBJETIVOS


421 Objetivo geral














117



deste estudo





35deg475670O)















estafilocoacutecica




118
































119












AM 19 AM 20 AM 21 e AM 24)















120


Mueller-Hinton































121










107 UFCmL













122


de transmissatildeo



sineacutergico









1ordmC











123













CIM de 256 microgmL





















124










estudo























125







(CLSI 2012)


CIM CBM (microgml)


ATCC 25923 256 256 025 025 0125 025 025 025 025 025 10 10 05 05 10 10

UFPEDA 01 256 256 05 10 0125 025 025 025 0125 025 05 05 025 025 025 025

AM 02 256 256 32 64 0125 0125 025 05 0125 025 20 40 05 05 05 05

AM 05 256 256 025 05 10 025 025 05 025 025 20 20 05 05 10 10

ATCC 33591 256 256 64 64 64 128 0125 0125 20 20 2048 2048 0125 025 10 10

AM 13 256 256 32 64 256 512 64 128 64 64 2048 2048 025 025 10 10

AM 18 256 256 64 64 128 256 64 128 128 256 2048 2048 025 05 10 10

AM 19 256 256 8 16 16 128 025 05 05 05 40 80 025 05 20 20

AM 20 256 256 8 16 8 16 40 80 0125 025 2048 2048 0125 025 10 10

AM 21 256 256 16 16 16 16 40 80 05 05 2048 2048 0125 0125 10 10

AM 24 256 256 32 32 256 256 64 128 256 512 2048 4096 0125 0125 10 20

12

5

126
























2012 MACEDO 2013)









127







FIC Individual

FICI

Efeito


AM 13


256 32 256 256 256 64 256 64 256 2048

128 006 64 64 64 16 128 003 128 1

050 00020 025 02500 025 02500 050 00005 050 00005

050 050 050 050 050


500 9981 750 7500 750 7500 500 9995 500 9995

AM 18


256 64 256 128 256 64 256 128 256 2048

128 006 128 05 20 32 128 10 128 20

050 00010 050 00039 00078 050 050 00078 050 00010

050 050 051 051 050


500 9990 500 9961 992 5000 500 9922 500 9990

AM 24


256 32 256 256 256 64 256 256 256 2048

128 006 32 64 2 32 128 0125 128 256

050 00019 0125 0250 0008 0500 050 00005 050 01250

050 038 051 050 063


500 9981 875 7500 9922 500 500 9995 500 8750

ATCC 33591


256 64 256 64 256 0125 256 2 256 2048

128 006 64 16 20 006 64 05 128 10

050 00010 025 02500 0008 0500 025 02500 050 00005

050 050 051 050 050


500 9990 750 7500 992 5000 750 7500 500 9995

12

7

128
















respectivamente
















129













(S)











FIC I = 038

130




(Figura 48 H)














bacteacuterias













131





A B C D

N O P Q

E F G H

PC

MP R

PC

MP

R

S

PC

MP

R

S

PC MP

R S

EPC MP

CR

ES

EPC

ES

CR

OPC

CD

CR ES

CR DPC

CD OPC

DPC

CD

CD

OPC CD

DAS

ES

ES

OPC DAS

OPC DPC

I J L M

OPC

DAS

J

DAS

OPC

DAS

132

45 CONCLUSOtildeES

















133

REFEREcircNCIAS


134


135


136


137


138


139

































140

















2011)

















141













(FERREIRA 2012)








142

52 OBJETIVOS


521 OBJETIVO GERAL


















143



deste estudo

531 Coleta
























144


1988






















145




pesados
























12h

146






2 horas

5343 Ultrassom





de 40 kHz

5344 Refluxo










5346 Infusatildeo




147



















min)





Statistica 60




148

















referecircncia
















149




























TT = PT - FNT

150









de 1mLmin









antimicrobiana











151




























152














incubadora de CO2









153




















154


















BORNSCHEIN 1982)

734 microm

155












galhos






















156






(SHARAPIN 2000)

























157


(SOUZA 2013)





























menor rendimento




158
















2009)














159











ultrassom
















1

2

3

4


Resiacuted

uo

seco

(g

)

160



maior rendimento








extraccedilatildeo






A B

161




nm para leitura














nm


162





Folin (mL)

Na2CO3 ()

Tempo (min)


1 10 5 -1 -1 -1 0453 00040 001

3 10 5 1 -1 -1 0431 00060 001

1 20 5 -1 1 -1 0414 00055 001

3 20 5 1 1 -1 0422 00180 004

1 10 25 -1 -1 1 0501 00261 005

3 10 25 1 -1 1 0519 00031 001

1 20 25 -1 1 1 0485 00083 002

3 20 25 1 1 1 0503 00066 001

2 15 15 0 0 0 0487 00154 003

2 15 15 0 0 0 0475 00026 001

2 15 15 0 0 0 0488 00089 002



5943951

6638698

8595094

1261833

1627582

2724828

-433412

1570891

p=05


Replicat(1)

Replicat(2)

2by3

(1)Folin (mL)

1by2

1by3

(2)Na2CO3 ()

(3)Time (min)

163























50 150

250

350

450

500

0

1

2

3

Caseiacutena (mg)

Teo

r d

e t

an

ino

s (

mg

g)

164








50mg 0424 0410 0399 0411 0013 0030

150mg 0376 0371 0385 0377 0007 0019

250mg 0320 0328 0330 0326 0005 0016

350mg 0272 0313 0318 0301 0025 0084

450mg 0275 0264 0269 0269 0006 0020

500mg 0254 0280 0264 0266 0013 0049














165


tabela 8






























166






C D B

EU

ET

EI

EM

ER

EMD

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

Astilbina = pico B


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995

167
























minutos


0

2

4

6

8


Po

life

no

is (

mg

GA

Eg

)

168




















Hayne





obtidos





169



















169











Hayne











TAKADA 2004)












170

171


SENHAJI et al 2013)















Candida



FLU CIM (microgml)
















172
















farmacoloacutegico

173

55 CONCLUSOtildeES









empregado






para o estudo









174

REFEREcircNCIAS




175




176


177


178








179










al2012)






















180




















flavonoacuteides













181



182

62 OBJETIVOS


621 OBJETIVO GERAL











183



deste estudo

631 AMOSTRAS




China)







(UFLC-DAD-EM)











184





51 min 30 B 65 min 30 B










sistema utilizado










astilbina







185





et al (1970)

186










stigonocarpa







de astilbina








2013)

187




- 3030878

1

1

2

188


































189




- mz 4491132

1

2

190


(padratildeo)


- 4491132

1

2

191


engeletina


- 4331154

1

2

192




- 4491132 e pico A [M-H]

-

4491106

1

2

193










dependente










194

65 CONCLUSOtildeES















195


196


197


2






BANCA EXAMINADORA










3


REITOR


VICE-REITOR













FARMACEcircUTICAS



FARMACEcircUTICAS


4





5

AGRADECIMENTOS







jornada


minha vida




esquecidos



















6












Doutorado










7





o dom da profecia e

conhecesse todos os



tivesse amor nada

seria

Corintios 13-2

8

LISTA DE FIGURAS





29



30


30





33


34


34



9















86


87


88

10


89


90


91


92


94


100










166



11



12

LISTA DE TABELAS






13

RESUMO


14

ABSTRACT


15

SUMAacuteRIO


20 22 22 22 23 23 24 25 25 26 27 31 31 31 32 33 34 35 37 37 38 38 38 38 39 39 41 41 41 42 42 43 43 43 44 44 44 45 45 45 45 45

16


45 46 47 47 47 49 51 52 53 63 63 68 68 68 69 69 69 70 70 70 73 73 73 74 74 74 75 75 75 76 77 78 79 79 79 81 81 82 82 82 83

17


84 84 85 86 87 87 90 91 92 92 92 93 95 99 102 103 111 111 112 114 115 116 116 116 117 117 117 117 118 119 119 119 119 120 122 123 132

18


133 139 139 142 142 142 143 143 143 143 144 144 145 145 145 145 146 146 146 146 146 147 147 147 147 148 148 149 149 150 150 150 150 150 151 151 152 152 153

19


153 156 160 160 164 164 168 170 173 174 179 179 182 182 182 183 183 183 183 184 184 186 194 195

20









BRANDELLI 2009)

























21


























doses reduzidas









22


FARMACOLOacuteGICOS
























23





















WEBERLING 1981)











24










Ameacuterica do Sul





LANGENHEIM 1975)














25






















FERREIRA 1997)










26





mesmo gecircnero













(MAZZEI et al 1999)















27


















metros de altura







28








(CARVALHO 2007)





29


Hayne)












ls

pd

30














cv ar

en

me ep

ls

en

mmee

ep

31
















A B

32






COOH




metila (Figura 10)


H

HCOOH

OH






13

33







(3) (Figura 12)








1 2 3

H H

H

COOHOH

COOMeOH

COOMe

13

1 2 3

13

15

7

15 8 15 8


dien-15-oico



de metila

34










MeOOC

18

13

16

4a 4b 5

1 2 3

H

H

H

H

6 7

H

35





identificados




α-muroleno (7)






H

6 7

H

H

3 4 5

1 2

H

H

36



1 2









1 2 3







ataque de formigas



2

COOH

HO

H

HOHO

COOH

H

HOO

COOH

H

13

18 18 18

14 14 14 13 13

2

HH

H

37



clerodacircnico

















1 2



COOH COOH

38



respectivamente








COOH

HOOC

COOH

HOOC












1 2

18 18

15 15

8 8

13

39


(FARIA et al 2004)



H

H



















1 2 3

40













4 5

COOMe

COOMeCOOMe

COOMe

6 7

19 19

19 19

1 2 3

O HO

41





















COOH

OH



42













1 2

OHO

OH O

OH

OH OHO

OH O

OCH3

OH

O

OOH

HO

O

O

OH

OH

OacuteCH3

OCH3

H

H

OCH3

3

43






1 2



stigonocarpa














OH

OHO

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

44




madagascariensis













courbaril






1

O

OH

MeO

O O

MeO

O O

2

O OOH

MeO

O

O

OMe

OH

45























gecircnero Hymenaea


46




















aleacutergicas













47








2006)















gecircnero Hymenaea








48




















esta accedilatildeo















49


























isolados






50



































51































al 2011)

52























dependente

53


54


55



56


57


58


59


60


61


62


63












2002)










et al 2006)










64














VERPOORTE 1999)





















65


BOLZANI 2001)























al 2002)










66

















(SINGH SHUKLA 1984)












al2012)






67





68

32 OBJETIVOS


321 Objetivo geral











69












Mart ex Hayne











70




























71







(FAE)


















Alcaloacuteides





(WAGNER 1996)




72




Iridoacuteides


Saponinas






Cumarinas



(WAGNER 1996)


A NEU

Surgimento de



A NEU



Flavonoacuteides

A NEU



(MARKHAM 1982)

(HARBORNE 1998)


Cloriacutedrica


(ROBERTSON 1955)


A NEU


(UV) (NEU 1956)

Accediluacutecares

D Cloridrato de



(WALLENFELS 1950)

73













Na2CO3 (10 vv)

















74



















dados









75



a seguir
























cepas padratildeo



76





















(1024 a 781 gmL)











77






























78






79










3411 Anatomia















SB

80











azul de Astra








FG

FD PC

CS

CS ECCC

FL

CP

81






taninos













FD

FL

FG

EC

PC

82














FG

FLD

FL

FLD

PT

FLD

83

















taninos




FD

SB

FLD

FL

FG

FLD

84




















Rf = 035

Rf = 080

Rf = 055

Rf = 014

Rf = 004

Rf = 012

85








esteroacuteides












Rf = 012

Rf = 086

Rf = 063

Rf = 035

Rf = 023

Rf = 007

86






















Rf = 047

Rf = 093

Rf = 098

Rf = 047

Rf = 005

87





stigonocarpa

34214 Accedilucares






glicose (Rf 053)







Rf = 053 Rf = 053 Rf = 046

88










(HEIL et al 2002)














Rf = 053

Rf = 060

89







condensados














1 2 3 4 P

Rf = 093 Rf = 083 Rf = 075 Rf = 069

Rf = 095

90











060)







Rf = 060

Rf = 060

Rf = 028

Rf = 028

P1 5 P2

91

















Rf = 004

Rf = 069

Rf = 047

EH FA

92










20ndash80120583gmL





EH FAE

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

93

















al 1970)














94






-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932

-50 at 3634 min 99902

HE + Astilbina A

B

C D E

HE

EE

AF

Tempo (min)

Ab

so

rbacircn

cia

(m

AU

)

A

C D E

A B

C D E

E

B

94

95











superiores















fermentadoras






96





(tabela 2)




aureus (Tabela 2)

















(tabela 2)



posteriores





97






EC EAE EE EA EH

FA FAE AST OXA TEI

















98














(tabela 2)



















99













figura 45



















100



stigonocarpa


A B C

D E F

G H I

J L K

OPC OPC

S

R R

R

OPC

MS

M

OPC

C

OP

C

ES

EPC

CR CR

CR CR

DPC

ES

ES

ES

ES

DAC

DAC

S

DAS

CF

M

CR

OPC

OPC

OPC ES

MS

101







2006)















aureus

102

35 CONCLUSOtildeES













taninos condensados










obtenccedilatildeo




103


104


105


106


107


108


109


110


111




(MRSA)




























al 2008)

112












antimicrobianos


















et al 2013)



113












2010)















al 2011)








114

































115

















(BANSAL et al 2013)





116

42 OBJETIVOS


421 Objetivo geral














117



deste estudo





35deg475670O)















estafilocoacutecica




118
































119












AM 19 AM 20 AM 21 e AM 24)















120


Mueller-Hinton































121










107 UFCmL













122


de transmissatildeo



sineacutergico









1ordmC











123













CIM de 256 microgmL





















124










estudo























125







(CLSI 2012)


CIM CBM (microgml)


ATCC 25923 256 256 025 025 0125 025 025 025 025 025 10 10 05 05 10 10

UFPEDA 01 256 256 05 10 0125 025 025 025 0125 025 05 05 025 025 025 025

AM 02 256 256 32 64 0125 0125 025 05 0125 025 20 40 05 05 05 05

AM 05 256 256 025 05 10 025 025 05 025 025 20 20 05 05 10 10

ATCC 33591 256 256 64 64 64 128 0125 0125 20 20 2048 2048 0125 025 10 10

AM 13 256 256 32 64 256 512 64 128 64 64 2048 2048 025 025 10 10

AM 18 256 256 64 64 128 256 64 128 128 256 2048 2048 025 05 10 10

AM 19 256 256 8 16 16 128 025 05 05 05 40 80 025 05 20 20

AM 20 256 256 8 16 8 16 40 80 0125 025 2048 2048 0125 025 10 10

AM 21 256 256 16 16 16 16 40 80 05 05 2048 2048 0125 0125 10 10

AM 24 256 256 32 32 256 256 64 128 256 512 2048 4096 0125 0125 10 20

12

5

126
























2012 MACEDO 2013)









127







FIC Individual

FICI

Efeito


AM 13


256 32 256 256 256 64 256 64 256 2048

128 006 64 64 64 16 128 003 128 1

050 00020 025 02500 025 02500 050 00005 050 00005

050 050 050 050 050


500 9981 750 7500 750 7500 500 9995 500 9995

AM 18


256 64 256 128 256 64 256 128 256 2048

128 006 128 05 20 32 128 10 128 20

050 00010 050 00039 00078 050 050 00078 050 00010

050 050 051 051 050


500 9990 500 9961 992 5000 500 9922 500 9990

AM 24


256 32 256 256 256 64 256 256 256 2048

128 006 32 64 2 32 128 0125 128 256

050 00019 0125 0250 0008 0500 050 00005 050 01250

050 038 051 050 063


500 9981 875 7500 9922 500 500 9995 500 8750

ATCC 33591


256 64 256 64 256 0125 256 2 256 2048

128 006 64 16 20 006 64 05 128 10

050 00010 025 02500 0008 0500 025 02500 050 00005

050 050 051 050 050


500 9990 750 7500 992 5000 750 7500 500 9995

12

7

128
















respectivamente
















129













(S)











FIC I = 038

130




(Figura 48 H)














bacteacuterias













131





A B C D

N O P Q

E F G H

PC

MP R

PC

MP

R

S

PC

MP

R

S

PC MP

R S

EPC MP

CR

ES

EPC

ES

CR

OPC

CD

CR ES

CR DPC

CD OPC

DPC

CD

CD

OPC CD

DAS

ES

ES

OPC DAS

OPC DPC

I J L M

OPC

DAS

J

DAS

OPC

DAS

132

45 CONCLUSOtildeES

















133

REFEREcircNCIAS


134


135


136


137


138


139

































140

















2011)

















141













(FERREIRA 2012)








142

52 OBJETIVOS


521 OBJETIVO GERAL


















143



deste estudo

531 Coleta
























144


1988






















145




pesados
























12h

146






2 horas

5343 Ultrassom





de 40 kHz

5344 Refluxo










5346 Infusatildeo




147



















min)





Statistica 60




148

















referecircncia
















149




























TT = PT - FNT

150









de 1mLmin









antimicrobiana











151




























152














incubadora de CO2









153




















154


















BORNSCHEIN 1982)

734 microm

155












galhos






















156






(SHARAPIN 2000)

























157


(SOUZA 2013)





























menor rendimento




158
















2009)














159











ultrassom
















1

2

3

4


Resiacuted

uo

seco

(g

)

160



maior rendimento








extraccedilatildeo






A B

161




nm para leitura














nm


162





Folin (mL)

Na2CO3 ()

Tempo (min)


1 10 5 -1 -1 -1 0453 00040 001

3 10 5 1 -1 -1 0431 00060 001

1 20 5 -1 1 -1 0414 00055 001

3 20 5 1 1 -1 0422 00180 004

1 10 25 -1 -1 1 0501 00261 005

3 10 25 1 -1 1 0519 00031 001

1 20 25 -1 1 1 0485 00083 002

3 20 25 1 1 1 0503 00066 001

2 15 15 0 0 0 0487 00154 003

2 15 15 0 0 0 0475 00026 001

2 15 15 0 0 0 0488 00089 002



5943951

6638698

8595094

1261833

1627582

2724828

-433412

1570891

p=05


Replicat(1)

Replicat(2)

2by3

(1)Folin (mL)

1by2

1by3

(2)Na2CO3 ()

(3)Time (min)

163























50 150

250

350

450

500

0

1

2

3

Caseiacutena (mg)

Teo

r d

e t

an

ino

s (

mg

g)

164








50mg 0424 0410 0399 0411 0013 0030

150mg 0376 0371 0385 0377 0007 0019

250mg 0320 0328 0330 0326 0005 0016

350mg 0272 0313 0318 0301 0025 0084

450mg 0275 0264 0269 0269 0006 0020

500mg 0254 0280 0264 0266 0013 0049














165


tabela 8






























166






C D B

EU

ET

EI

EM

ER

EMD

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

Astilbina = pico B


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995

167
























minutos


0

2

4

6

8


Po

life

no

is (

mg

GA

Eg

)

168




















Hayne





obtidos





169



















169











Hayne











TAKADA 2004)












170

171


SENHAJI et al 2013)















Candida



FLU CIM (microgml)
















172
















farmacoloacutegico

173

55 CONCLUSOtildeES









empregado






para o estudo









174

REFEREcircNCIAS




175




176


177


178








179










al2012)






















180




















flavonoacuteides













181



182

62 OBJETIVOS


621 OBJETIVO GERAL











183



deste estudo

631 AMOSTRAS




China)







(UFLC-DAD-EM)











184





51 min 30 B 65 min 30 B










sistema utilizado










astilbina







185





et al (1970)

186










stigonocarpa







de astilbina








2013)

187




- 3030878

1

1

2

188


































189




- mz 4491132

1

2

190


(padratildeo)


- 4491132

1

2

191


engeletina


- 4331154

1

2

192




- 4491132 e pico A [M-H]

-

4491106

1

2

193










dependente










194

65 CONCLUSOtildeES















195


196


197


3


REITOR


VICE-REITOR













FARMACEcircUTICAS



FARMACEcircUTICAS


4





5

AGRADECIMENTOS







jornada


minha vida




esquecidos



















6












Doutorado










7





o dom da profecia e

conhecesse todos os



tivesse amor nada

seria

Corintios 13-2

8

LISTA DE FIGURAS





29



30


30





33


34


34



9















86


87


88

10


89


90


91


92


94


100










166



11



12

LISTA DE TABELAS






13

RESUMO


14

ABSTRACT


15

SUMAacuteRIO


20 22 22 22 23 23 24 25 25 26 27 31 31 31 32 33 34 35 37 37 38 38 38 38 39 39 41 41 41 42 42 43 43 43 44 44 44 45 45 45 45 45

16


45 46 47 47 47 49 51 52 53 63 63 68 68 68 69 69 69 70 70 70 73 73 73 74 74 74 75 75 75 76 77 78 79 79 79 81 81 82 82 82 83

17


84 84 85 86 87 87 90 91 92 92 92 93 95 99 102 103 111 111 112 114 115 116 116 116 117 117 117 117 118 119 119 119 119 120 122 123 132

18


133 139 139 142 142 142 143 143 143 143 144 144 145 145 145 145 146 146 146 146 146 147 147 147 147 148 148 149 149 150 150 150 150 150 151 151 152 152 153

19


153 156 160 160 164 164 168 170 173 174 179 179 182 182 182 183 183 183 183 184 184 186 194 195

20









BRANDELLI 2009)

























21


























doses reduzidas









22


FARMACOLOacuteGICOS
























23





















WEBERLING 1981)











24










Ameacuterica do Sul





LANGENHEIM 1975)














25






















FERREIRA 1997)










26





mesmo gecircnero













(MAZZEI et al 1999)















27


















metros de altura







28








(CARVALHO 2007)





29


Hayne)












ls

pd

30














cv ar

en

me ep

ls

en

mmee

ep

31
















A B

32






COOH




metila (Figura 10)


H

HCOOH

OH






13

33







(3) (Figura 12)








1 2 3

H H

H

COOHOH

COOMeOH

COOMe

13

1 2 3

13

15

7

15 8 15 8


dien-15-oico



de metila

34










MeOOC

18

13

16

4a 4b 5

1 2 3

H

H

H

H

6 7

H

35





identificados




α-muroleno (7)






H

6 7

H

H

3 4 5

1 2

H

H

36



1 2









1 2 3







ataque de formigas



2

COOH

HO

H

HOHO

COOH

H

HOO

COOH

H

13

18 18 18

14 14 14 13 13

2

HH

H

37



clerodacircnico

















1 2



COOH COOH

38



respectivamente








COOH

HOOC

COOH

HOOC












1 2

18 18

15 15

8 8

13

39


(FARIA et al 2004)



H

H



















1 2 3

40













4 5

COOMe

COOMeCOOMe

COOMe

6 7

19 19

19 19

1 2 3

O HO

41





















COOH

OH



42













1 2

OHO

OH O

OH

OH OHO

OH O

OCH3

OH

O

OOH

HO

O

O

OH

OH

OacuteCH3

OCH3

H

H

OCH3

3

43






1 2



stigonocarpa














OH

OHO

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

O

44




madagascariensis













courbaril






1

O

OH

MeO

O O

MeO

O O

2

O OOH

MeO

O

O

OMe

OH

45























gecircnero Hymenaea


46




















aleacutergicas













47








2006)















gecircnero Hymenaea








48




















esta accedilatildeo















49


























isolados






50



































51































al 2011)

52























dependente

53


54


55



56


57


58


59


60


61


62


63












2002)










et al 2006)










64














VERPOORTE 1999)





















65


BOLZANI 2001)























al 2002)










66

















(SINGH SHUKLA 1984)












al2012)






67





68

32 OBJETIVOS


321 Objetivo geral











69












Mart ex Hayne











70




























71







(FAE)


















Alcaloacuteides





(WAGNER 1996)




72




Iridoacuteides


Saponinas






Cumarinas



(WAGNER 1996)


A NEU

Surgimento de



A NEU



Flavonoacuteides

A NEU



(MARKHAM 1982)

(HARBORNE 1998)


Cloriacutedrica


(ROBERTSON 1955)


A NEU


(UV) (NEU 1956)

Accediluacutecares

D Cloridrato de



(WALLENFELS 1950)

73













Na2CO3 (10 vv)

















74



















dados









75



a seguir
























cepas padratildeo



76





















(1024 a 781 gmL)











77






























78






79










3411 Anatomia















SB

80











azul de Astra








FG

FD PC

CS

CS ECCC

FL

CP

81






taninos













FD

FL

FG

EC

PC

82














FG

FLD

FL

FLD

PT

FLD

83

















taninos




FD

SB

FLD

FL

FG

FLD

84




















Rf = 035

Rf = 080

Rf = 055

Rf = 014

Rf = 004

Rf = 012

85








esteroacuteides












Rf = 012

Rf = 086

Rf = 063

Rf = 035

Rf = 023

Rf = 007

86






















Rf = 047

Rf = 093

Rf = 098

Rf = 047

Rf = 005

87





stigonocarpa

34214 Accedilucares






glicose (Rf 053)







Rf = 053 Rf = 053 Rf = 046

88










(HEIL et al 2002)














Rf = 053

Rf = 060

89







condensados














1 2 3 4 P

Rf = 093 Rf = 083 Rf = 075 Rf = 069

Rf = 095

90











060)







Rf = 060

Rf = 060

Rf = 028

Rf = 028

P1 5 P2

91

















Rf = 004

Rf = 069

Rf = 047

EH FA

92










20ndash80120583gmL





EH FAE

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

Rf = 089 Rf = 083 Rf = 074 Rf = 069

93

















al 1970)














94






-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932

-50 at 3634 min 99902

HE + Astilbina A

B

C D E

HE

EE

AF

Tempo (min)

Ab

so

rbacircn

cia

(m

AU

)

A

C D E

A B

C D E

E

B

94

95











superiores















fermentadoras






96





(tabela 2)




aureus (Tabela 2)

















(tabela 2)



posteriores





97






EC EAE EE EA EH

FA FAE AST OXA TEI

















98














(tabela 2)



















99













figura 45



















100



stigonocarpa


A B C

D E F

G H I

J L K

OPC OPC

S

R R

R

OPC

MS

M

OPC

C

OP

C

ES

EPC

CR CR

CR CR

DPC

ES

ES

ES

ES

DAC

DAC

S

DAS

CF

M

CR

OPC

OPC

OPC ES

MS

101







2006)















aureus

102

35 CONCLUSOtildeES













taninos condensados










obtenccedilatildeo




103


104


105


106


107


108


109


110


111




(MRSA)




























al 2008)

112












antimicrobianos


















et al 2013)



113












2010)















al 2011)








114

































115

















(BANSAL et al 2013)





116

42 OBJETIVOS


421 Objetivo geral














117



deste estudo





35deg475670O)















estafilocoacutecica




118
































119












AM 19 AM 20 AM 21 e AM 24)















120


Mueller-Hinton































121










107 UFCmL













122


de transmissatildeo



sineacutergico









1ordmC











123













CIM de 256 microgmL





















124










estudo























125







(CLSI 2012)


CIM CBM (microgml)


ATCC 25923 256 256 025 025 0125 025 025 025 025 025 10 10 05 05 10 10

UFPEDA 01 256 256 05 10 0125 025 025 025 0125 025 05 05 025 025 025 025

AM 02 256 256 32 64 0125 0125 025 05 0125 025 20 40 05 05 05 05

AM 05 256 256 025 05 10 025 025 05 025 025 20 20 05 05 10 10

ATCC 33591 256 256 64 64 64 128 0125 0125 20 20 2048 2048 0125 025 10 10

AM 13 256 256 32 64 256 512 64 128 64 64 2048 2048 025 025 10 10

AM 18 256 256 64 64 128 256 64 128 128 256 2048 2048 025 05 10 10

AM 19 256 256 8 16 16 128 025 05 05 05 40 80 025 05 20 20

AM 20 256 256 8 16 8 16 40 80 0125 025 2048 2048 0125 025 10 10

AM 21 256 256 16 16 16 16 40 80 05 05 2048 2048 0125 0125 10 10

AM 24 256 256 32 32 256 256 64 128 256 512 2048 4096 0125 0125 10 20

12

5

126
























2012 MACEDO 2013)









127







FIC Individual

FICI

Efeito


AM 13


256 32 256 256 256 64 256 64 256 2048

128 006 64 64 64 16 128 003 128 1

050 00020 025 02500 025 02500 050 00005 050 00005

050 050 050 050 050


500 9981 750 7500 750 7500 500 9995 500 9995

AM 18


256 64 256 128 256 64 256 128 256 2048

128 006 128 05 20 32 128 10 128 20

050 00010 050 00039 00078 050 050 00078 050 00010

050 050 051 051 050


500 9990 500 9961 992 5000 500 9922 500 9990

AM 24


256 32 256 256 256 64 256 256 256 2048

128 006 32 64 2 32 128 0125 128 256

050 00019 0125 0250 0008 0500 050 00005 050 01250

050 038 051 050 063


500 9981 875 7500 9922 500 500 9995 500 8750

ATCC 33591


256 64 256 64 256 0125 256 2 256 2048

128 006 64 16 20 006 64 05 128 10

050 00010 025 02500 0008 0500 025 02500 050 00005

050 050 051 050 050


500 9990 750 7500 992 5000 750 7500 500 9995

12

7

128
















respectivamente
















129













(S)











FIC I = 038

130




(Figura 48 H)














bacteacuterias













131





A B C D

N O P Q

E F G H

PC

MP R

PC

MP

R

S

PC

MP

R

S

PC MP

R S

EPC MP

CR

ES

EPC

ES

CR

OPC

CD

CR ES

CR DPC

CD OPC

DPC

CD

CD

OPC CD

DAS

ES

ES

OPC DAS

OPC DPC

I J L M

OPC

DAS

J

DAS

OPC

DAS

132

45 CONCLUSOtildeES

















133

REFEREcircNCIAS


134


135


136


137


138


139

































140

















2011)

















141













(FERREIRA 2012)








142

52 OBJETIVOS


521 OBJETIVO GERAL


















143



deste estudo

531 Coleta
























144


1988






















145




pesados
























12h

146






2 horas

5343 Ultrassom





de 40 kHz

5344 Refluxo










5346 Infusatildeo




147



















min)





Statistica 60




148

















referecircncia
















149




























TT = PT - FNT

150









de 1mLmin









antimicrobiana











151




























152














incubadora de CO2









153




















154


















BORNSCHEIN 1982)

734 microm

155












galhos






















156






(SHARAPIN 2000)

























157


(SOUZA 2013)





























menor rendimento




158
















2009)














159











ultrassom
















1

2

3

4


Resiacuted

uo

seco

(g

)

160



maior rendimento








extraccedilatildeo






A B

161




nm para leitura














nm


162





Folin (mL)

Na2CO3 ()

Tempo (min)


1 10 5 -1 -1 -1 0453 00040 001

3 10 5 1 -1 -1 0431 00060 001

1 20 5 -1 1 -1 0414 00055 001

3 20 5 1 1 -1 0422 00180 004

1 10 25 -1 -1 1 0501 00261 005

3 10 25 1 -1 1 0519 00031 001

1 20 25 -1 1 1 0485 00083 002

3 20 25 1 1 1 0503 00066 001

2 15 15 0 0 0 0487 00154 003

2 15 15 0 0 0 0475 00026 001

2 15 15 0 0 0 0488 00089 002



5943951

6638698

8595094

1261833

1627582

2724828

-433412

1570891

p=05


Replicat(1)

Replicat(2)

2by3

(1)Folin (mL)

1by2

1by3

(2)Na2CO3 ()

(3)Time (min)

163























50 150

250

350

450

500

0

1

2

3

Caseiacutena (mg)

Teo

r d

e t

an

ino

s (

mg

g)

164








50mg 0424 0410 0399 0411 0013 0030

150mg 0376 0371 0385 0377 0007 0019

250mg 0320 0328 0330 0326 0005 0016

350mg 0272 0313 0318 0301 0025 0084

450mg 0275 0264 0269 0269 0006 0020

500mg 0254 0280 0264 0266 0013 0049














165


tabela 8






























166






C D B

EU

ET

EI

EM

ER

EMD

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

D A B C E

Astilbina = pico B


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1975

1931

2939

50 at 3520 min 99658

-50 at 3545 min 99665


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1981

19102943

50 at 3609 min 99932


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1983

2902

50 at 2967 min 99984

-50 at 2993 min 99986


-100

200

400

600

190 250 300 350 400

nm

1984

1912 2905

50 at 3126 min 99977

-50 at 3152 min 99995

167
























minutos


0

2

4

6

8


Po

life

no

is (

mg

GA

Eg

)

168




















Hayne





obtidos





169



















169











Hayne











TAKADA 2004)












170

171


SENHAJI et al 2013)















Candida



FLU CIM (microgml)
















172
















farmacoloacutegico

173

55 CONCLUSOtildeES









empregado






para o estudo









174

REFEREcircNCIAS




175




176


177


178








179










al2012)






















180




















flavonoacuteides













181



182

62 OBJETIVOS


621 OBJETIVO GERAL











183



deste estudo

631 AMOSTRAS




China)







(UFLC-DAD-EM)











184





51 min 30 B 65 min 30 B










sistema utilizado










astilbina







185





et al (1970)

186










stigonocarpa







de astilbina








2013)

187




- 3030878

1

1

2

188


































189




- mz 4491132

1

2

190


(padratildeo)


- 4491132

1

2

191


engeletina


- 4331154

1

2

192




- 4491132 e pico A [M-H]

-

4491106

1

2

193










dependente










194

65 CONCLUSOtildeES















195


196


197


universidade federal de pernambuco centro de … gusta… · 1 gustavo santiago dimech estudo...

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