universidade federal de pernambuco centro de … · experimentos de fermentação em meio natural...
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANÁLISE DO PERFIL METABÓLICO E ORGANOLÉPTICO DA LEVEDURA Dekkera
bruxellensis VISANDO À ELABORAÇÃO DE CACHAÇAS DIFERENCIADAS
Denise Castro Silva
Recife, 2013
DENISE CASTRO SILVA
ANÁLISE DO PERFIL METABÓLICO E ORGANOLÉPTICO DA LEVEDURA Dekkera
bruxellensis VISANDO À ELABORAÇÃO DE CACHAÇAS DIFERENCIADAS
Dissertação de Mestrado apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas, área de
concentração: Biotecnologia.
Orientador: Profº Drº Marcos Antonio de Morais Júnior
Co-orientador: Drº Esteban Espinosa Vidal
Recife, 2013
Catalogação na Fonte: Bibliotecário Bruno Márcio Gouveia, CRB-4/1788
S586a Silva, Denise Castro
Análise do perfil metabólico e organoléptico da levedura Dkkera bruxellensis visando à elaboração de cachaças diferenciadas / Denise Castro Silva. – Recife: O Autor, 2013. 64 f. : il.
Orientador: Marcos Antonio de Morais Júnior Coorientador: Esteban Espinosa Vidal
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de
Ciências Biológicas. Pós-graduação em Ciências Biológicas, 2013.
Inclui bibliografia e anexos
1. Bebidas alcoólicas 2. Aguardente 3. Leveduras (Fungos) I. Morais
Júnior, Marcos Antonio de (orientador) II. Vidal, Esteban Espinosa (coorientador) III. Título.
641.21 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2013-086
DENISE CASTRO SILVA
Dissertação de Mestrado apresentada à Coordenação do
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos
requisitos à obtenção do grau de Mestre em Ciências
Biológicas, área de concentração: Biotecnologia.
Data da Aprovação______/______/_______
BANCA EXAMINADORA:
_________________________________________________
Profº Drº MARCOS ANTONIO DE MORAIS JÚNIOR
Departamento de Genética – UFPE
_________________________________________________
Profª Drª MÁRCIA VANUSA DA SILVA
Departamento de Bioquímica – UFPE
__________________________________________________
Drº WILL DE BARROS PITA
Departamento de Genética – UFPE
MEMBROS SUPLENTES:
__________________________________________________
Profª Drª. MARIA TEREZA DOS SANTOS CORREIA
Departamento de Bioquímica – UFPE
__________________________________________________
Drª CAROLINA ELSZTEIN
Departamento de Genética – UFPE
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Marcos Morais, por ter me aceitado mesmo sem me conhecer, pelo
conhecimento adquirido, pela paciência e por ser amigo.
Ao meu co-orientador Esteban, pelo conhecimento que me passou e pela boa vontade.
Ao Dr. Giuliano Elias, pela oportunidade de desenvolver os experimentos com vinhos na
EMPRAPA-SEMIÁRIDO, por ter sido sempre tão gentil e por estar sempre pronto a ajudar.
A minha mãe, pelo amor e apoio incondicional, e por ter me ensinado a viver.
A minha avó, pelo amor e dedicação constante.
À Arthur, por ser amigo, por me amar mesmo nas minhas ausências e por me fazer feliz.
A minha irmã, por ser amiga e companheira.
Aos meus tios, pelo cuidado.
A Rosivânia e Demétrio, pelo carinho e pelo apoio durante esses dois anos.
Ao Pastor Sérgio e Família, por terem me acolhido, pelo carinho e pelos bons exemplos.
Aos meus colegas do Labem, pelo apoio na pesquisa, amizade, pelo conhecimento compartilhado e
momentos de descontração.
A Anjélica, Jackeline, Carol e Josy, pelo companheirismo, pela boa convivência, e pela torcida
nesta etapa profissional.
A FACEPE pela concessão da bolsa de pós graduação.
RESUMO
A aguardente de cana-de-açúcar, também conhecida como cachaça, é uma bebida
genuinamente brasileira que vem ganhando espaço no mercado internacional de bebidas destiladas.
Os compostos voláteis são responsáveis pelo sabor característico dessa bebida e são produzidos
pelas leveduras durante o processo fermentativo. A relevância da levedura Dekkera bruxellensis no
contexto fermentativo tem despertado o interesse em analisar a viabilidade de utilização desta
levedura para a produção de cachaça. Neste trabalho, foram analisados o perfil metabólico e a
produção de compostos aromáticos pela levedura D. bruxellensis durante a fermentação no caldo de
cana e em diferentes meios sintéticos com diversas fontes de nitrogênio. Os ensaios foram
realizados em pequena escala, simulando as condições empregadas na produção de cachaça
artesanal. Os resultados mostraram que, a suplementação do meio com aminoácidos ramificados
exerce uma forte influência no metabolismo e na produção de aromas da levedura D. bruxellensis.
Foi também confirmado que essa levedura é capaz de assimilar fontes de nitrogênio alternativas
como os aminoácidos ramificados, porém, com rendimentos fermentativos menores aos observados
em meios com fontes de nitrogênio preferenciais, como o sulfato de amônio. Sendo assim, esses
resultados confirmam a grande influência da fonte de nitrogênio no metabolismo de alcoóis
superiores e ésteres, ratificam a relevância de estudar mais a fundo as necessidades de nitrogênio
para um melhor controle dos aromas que são formados no processo fermentativo e poderá abrir
perspectivas para a utilização industrial desta levedura na elaboração da cachaça.
Palavra-chave: cachaça, fermentação alcoólica, alcoóis superiores, ésteres voláteis, via de Ehrlich,
nitrogênio
ABSTRACT
The sugar cane spirit, also known as cachaça, is a genuinely Brazilian drink that has
increased its market share among international distilled beverages. The volatile compounds are
responsible for the characteristic taste of the drink and are produced by the yeast during the
fermentation process. The relevance of the yeast Dekkera bruxellensis in the fermentation context
has stimulated interest in examining the feasibility of using this yeast for the production of cachaça.
This work, were analyzed the metabolic profile and the production of aromatic compounds by yeast
D. bruxellensis during fermentation in sugar cane and in different synthetic media with different
nitrogen sources. Assays were performed on a small scale, simulating the conditions employed in
the production of craft cachaça. The results show that supplementation of the medium
with branched amino acids have a strong influence on the metabolism and production of flavors on
the yeast D. bruxellensis. It was also confirmed that this yeast is able to
assimilate alternative nitrogen sources such as branched amino acids, but with
lower fermentative yields to those observed in the media with preferential nitrogen sources such as
ammonium sulfate. As such, these results confirm the strong influence of the nitrogen source in the
metabolism of higher alcohols and esters, they confirm the relevance of studying further the
nitrogen needs for better control of scents which are formed in the fermentation process and may
open prospects for industrial use of this particular yeast in the preparation of cachaça.
Key words: cachaça, alcoholic fermentation, higher alcohols, volatile esters, Ehrlich pathway,
nitrogen.
Lista de figuras
Revisão bibliográfica
Figura 1. Linhagens da espécie Dekkera bruxellensis. (A) linhagem CBS 74;
(B) linhagem CBS 2499; (C) linhagem GDB 248 (industrial) em meio YPD
(Microscopia de contraste de fase) Retirado de (Leite, 2012).
Figura 2. Catabolismo dos aminoácidos. Via de Ehrlich (Adaptado de
Hazelwood et al.,2008).
Figura 3. Síntese de leucina e valina em S. cerevisiae (modificado de
www.biocyc.org)
Artigo
Figura 1. Variação da biomassa de Dekkera bruxellensis durante os
experimentos de fermentação em meio natural de caldo de cana (SCJ), no
meio completo (YPS) e nos meios minerais com suplemento de sulfato de
amônio (MMS) e com suplemento de aminoácidos ramificados (MMS+AA).
Os valores representam as médias de dois ensaios biológicos, com replicatas
técnicas para cada ponto
Figura 2. Perfil fermentativo da linhagem industrial GDB 248 de D.
bruxellensis nos meios SCJ, YPS, MMS e MMS + AA. O perfil metabólico
de consumo de sacarose (painel A), produção de etanol (painel B), acetato
(painel C) e glicerol (painel D) são apresentados.
Figura 3. Cinética de produção de acetato de etila (painel A), propanol
(painel B), isobutanol (painel C) e da soma de álcool amílico e isoamílico -
fração AI (Painel D) pela linhagem GDB 248 durante a fermentação dos
meios SCJ, YPS, MMS e MMS+AA
Página
19
25
26
47
49
51
Lista de tabelas
Revisão bibliográfica
Tabela 1. Composição típica da cachaça segundo o novo Regulamento
Técnico para fixação dos Padrões de Identidade e Qualidade para cachaça.
Artigo
Tabela 1. Viabilidade, composição dos meios de cultura e parâmetros
fermentativos em ensaios utilizando a linhagem GDB 248. (N = nitrogênio,
FAN = free amino nitrogen)
Tabela 2. Concentração final e produtividade máxima (Pmax) dos compostos
voláteis produzidos por Dekkera bruxellensis durante a fermentação de meio
natural SCJ, do meio completo YPS e nos meios minerais MMS e MMS+AA.
Página
15
46
50
Lista de abreviações
AATFase Álcool acetiltransferase
Aprox. Aproximadamente
AI Fração de álcool amílico e isoamílico
CO2 Dioxido de carbono
cel. Células
EUA Estados Unidos da América
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
L Litro
mg Miligramos
min Minuto
mL Mililitros
mM Milimolar
pH Potencial hidrogenionico
N Nitrogênio
w/v Massa/ volume
v/v Volume/ volume
ºBx Graus ºBrix
r.p.m Rotações por minuto
μg Micrograma
μl Microlitro
μM Micromolar
12
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 13
1. CAPÍTULO I: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................... 14
1.1. IMPORTÂNCIA DA CACHAÇA NO BRASIL ................................................................................... 14
1.2. LEGISLAÇÃO DA CACHAÇA ....................................................................................................... 14
1.3. ELABORAÇÃO DA CACHAÇA ..................................................................................................... 15
1.4. AS LEVEDURAS DO PROCESSO FERMENTATIVO ......................................................................... 17
1.5. DEKKERA BRUXELLENSIS: ASPECTOS GERAIS ............................................................................. 19
1.5.1. Fisiologia de Dekkera bruxellensis ................................................................................. 20
1.6. SUBSTÂNCIAS ORGANOLÉPTICAS ............................................................................................. 21
1.6.1 Álcoois superiores ............................................................................................................. 23
1.6.2. Via de Ehrlich .................................................................................................................. 24
1.6.3. Relação entre anabolismo e catabolismos dos aminoácidos ramificados ....................... 25
1.6.4. Ésteres .............................................................................................................................. 26
1.6.4.1. Ésteres de acetato ...................................................................................................... 26
1.6.4.2. Ésteres de ácido graxo ............................................................................................... 27
1.7 METABOLISMO DO NITROGÊNIO .................................................................................... 27
1.7.1. Aspectos gerais ................................................................................................................ 27
1.7.2. Assimilação da fonte de nitrogênio .................................................................................. 28
1.7.3. Influência do nitrogênio na formação dos compostos organolépticos ............................ 29
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................... 31
2. CAPÍTULO II: MANUSCRITO ................................................................................................ 38
ANÁLISE DO PERFIL METABÓLICO E ORGANOLÉPTICO DA LEVEDURA DEKKERA
BRUXELLENSIS COM VISTAS À ELABORAÇÃO DE BEBIDAS ALCOÓLICAS
DIFERENCIADAS .......................................................................................................................... 38
CONCLUSÃO .................................................................................................................................. 59
ANEXOS COMPLEMENTARES .................................................................................................. 60
13
INTRODUÇÃO
A cachaça é uma bebida destilada genuinamente brasileira que nos últimos anos vem
posicionando-se no mercado internacional pelo seu aroma e bouquet especial, esta aguardente é
produzida a partir da destilação do mosto fermentado de cana-de-açúcar. Durante o processo de
fermentação alcoólica, além de serem produzidos majoritariamente etanol e dióxido de carbono, são
elaborados outros compostos derivados do metabolismo secundário que são os principais
responsáveis pelo sabor particular e característico desta bebida. Entre esses, os alcoóis superiores e
os ésteres voláteis representam o maior grupo e o mais importante. Estes são responsáveis pelo
sabor e aroma floral e frutado altamente desejados nas bebidas alcoólicas. A quantidade desses
compostos no mosto fermentado e por conseqüência no destilado depende de múltiplos fatores, dos
quais se destacam as condições de fermentação, a natureza da fonte de nitrogênio e a cepa de
levedura empregada.
Muitas leveduras têm sido testadas para a produção de bebidas fermentadas pela capacidade
de produção de etanol e de substâncias aromáticas. A espécie Dekkera bruxellensis é utilizada na
produção de cervejas Belgas do tipo Lambic, embora sua principal reputação seja a de contaminar
destilarias de álcool combustível e vinícolas em todo o mundo, estando associada à queda do
rendimento em etanol e a mudanças no aroma e sabor dos vinhos. Entretanto, nos últimos anos esse
conceito tem mudado, pois trabalhos recentes mostram que isolados industriais dessa levedura
apresentam rendimentos finais de fermentação comparáveis aos de Saccharomyces cerevisie, que é
a levedura normalmente usada em processos fermentativos, embora a produtividade ainda seja
menor.
Considerando a importância da cepa de levedura na produção de cachaça e a relevância da
levedura D. bruxellensis no contexto fermentativo, tem se despertado o interesse em analisar a
viabilidade de utilização desta levedura como fermento para a produção de uma cachaça com
qualidades sensoriais diferenciadas. Sendo assim, neste trabalho foi determinado o perfil metabólico
e a produção de compostos sensoriais pela levedura D. bruxellensis GDB 248 em ensaios
fermentativos simulando condições industriais, utilizando o caldo de cana e meios sintéticos com
altas concentrações de nitrogênio na forma de sulfato de amônio ou de aminoácidos ramificados. A
influência destes parâmetros na produção de compostos importantes para o aroma e sabor das
bebidas alcoólicas foi avaliada. Desta forma, o presente estudo gerou dados sobre o comportamento
fisiológico da levedura D. bruxellensis GDB 248 em função das diferentes fontes de nitrogênio,
14
bem como poderá abrir perspectivas para a utilização industrial desta levedura na elaboração da
cachaça.
1. CAPÍTULO I: REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. Importância da cachaça no Brasil
A aguardente de cana de açúcar conhecida como “cachaça” é a bebida destilada tradicional
brasileira. Esta bebida espirituosa é a mais consumida no Brasil e nos últimos anos vem
posicionando-se no mercado internacional pelo seu aroma e bouquet especial. A cachaça está
intimamente ligada à história e cultura do Brasil, presente na música, na culinária, e nas festas
populares, entre outros. O setor produtivo da cachaça desempenha importante papel na economia
nacional. O Brasil possui uma capacidade instalada de produção de 1,2 bilhão de litros por ano, com
cerca de 40.000 produtores, entretanto apenas 15% são registrados (IBRAC). O setor ainda enfrenta
muitas dificuldades, tais como, o alto índice de informalidade, falta de higiene e segurança
alimentar durante o processo de produção, falta de divulgação do produto, baixa competitividade
das cachaças de alambiques e a falta de suporte efetivo das instituições governamentais. Em Abril
de 2012 os EUA reconheceram a cachaça como um produto exclusivo e genuinamente brasileiro,
esse reconhecimento permitiu às empresas brasileiras venderem o destilado nos Estados Unidos
apenas com o nome de cachaça, ficando proibido o uso da denominação cachaça por empresas de
outros países.
1.2. Legislação da cachaça
De acordo com a Legislação Brasileira, cachaça é a denominação típica e exclusiva da
aguardente de cana produzida no Brasil, obtida pela destilação do mosto fermentado do caldo da
cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.), com teor alcoólico de 38 a 48% (v/v) em volume, a 20
ºC (BRASIL,1997 e 2005). A Tabela 1 dispõe sobre os padrões de identidade e qualidade da
aguardente de cana e cachaça mencionando especificamente os seguintes itens: grau alcoólico e
teores de açúcares totais, acidez volátil em ácido acético, alcoóis superiores (expressos pela soma
do álcool n-propílico, álcool isobutílico e álcool isoamílico), furfural somado a hidroximetilfurfural,
aldeídos em acetaldeído e ésteres totais em acetato de etila (BRASIL,1997).
Após a destilação, a cachaça está pronta para o consumo, mas pode ser envelhecida em
tonéis de madeira como parte importante do processo de sua fabricação para a melhora do sabor,
15
como ocorre com outras bebidas fermento-destiladas, tais como uísque e rum. De acordo com
Piggott e colaboradores (1989) o envelhecimento de bebidas consiste em armazená-las
adequadamente em barris de madeira por um tempo determinado, ação que produz mudanças na
composição química, no aroma, no sabor e na cor da bebida e, portanto, na qualidade sensorial. Esta
etapa, no entanto, é opcional de acordo com a Legislação Brasileira. A aguardente de cana será
denominada envelhecida, quando contiver pelo menos 50% de aguardente de cana envelhecida em
tonéis de madeira, por pelo menos um ano, podendo ser adicionado caramelo para padronização da
cor (BRASIL, 1997). As normas exigem controle sobre contaminantes como carbamato de etila,
acroleina, álcool sec-butílico, álcool n-butílico, chumbo, arsênio, cobre e metanol (BRASIL, 2005).
Tabela 1: Composição típica da cachaça segundo o novo Regulamento Técnico para fixação dos
Padrões de Identidade e Qualidade para cachaça.
1.3. Elaboração da cachaça
Como mencionado anteriormente, a cachaça é obtida através da destilação do mosto
fermentado do caldo de cana (Pataro et al., 2001). Durante a fermentação alcoólica além de
produzir-se majoritariamente etanol e dióxido de carbono, são elaborados outros metabolitos
derivados do metabolismo secundário que, junto com os compostos provenientes do processo de
envelhecimento (se este acontecer) são os principais responsáveis pelos sabores particulares e
característicos desta bebida. O início do processo de produção da cachaça ocorre com o plantio,
colheita e moagem da cana. O caldo de cana-de-açúcar é filtrado e clarificado por decantação,
retirando parte das impurezas em suspensão, seguida pela fermentação do caldo resultante da
moagem. A concentração de açúcar varia de 120-140g/L, principalmente sob a forma de sacarose, e
16
o teor de nitrogênio na forma de amônio livre assimilável varia em torno de 100 mg/L (O'connor-
Cox e Ingledew, 1989; Espinosa Vidal et al., 2012). Essas concentrações dependem diretamente da
variedade da cana empregada e das condições agronômicas de cultivo.
A produção em pequena escala ou tradicional é feita por produtores rurais em alambiques de
cobre, gerando um produto diferenciado quando comparado a produção em larga escala, que é feita
utilizando colunas contínuas de aço inoxidável (Oliveira et al., 2004). Um ciclo curto de
fermentação artesanal dura de 18-30 h, com altos teores diários de álcool, presença de uma alta
concentração de leveduras (109
células/mL, aprox.10-12% cel. w/v), alta pressão de dióxido de
carbono, temperatura elevada (entre 30 e 33 ºC) e ausência de agitação do meio (Guerra et al.,
2001; Espinosa Vidal et al., 2012). A maioria das destilarias tradicionais produz esta alta biomassa
por meio da fermentação espontânea, entanto uma minoria usa a incorporação de leveduras
industrial. O fermento caipira, espontâneo ou natural é preparado por vários métodos, incluindo o
desenvolvimento da microbiota no caldo de cana puro, ou com uma mistura de milho moído, cru ou
tostado, pó de arroz e frutas cítricas para diminuir o pH. Depois de um período de tempo que varia
de 5 a 20 dias a microbiota, majoritariamente leveduras, porém com a presença de bactérias e
fungos filamentosos, atinge níveis suficientemente altos para permitir o começo do ciclo de
fermentação, o qual consiste em adição diária de caldo de cana até a conclusão do volume da cuba
(Morais et al., 1997; Pataro et al., 2001). A população de levedura presente nessa fermentação está
em constante mudança, devido à introdução de novas cepas vindas do caldo de cana, levando em
consideração que o processo não é estéril (Pataro et al., 1998).
Na produção industrial ocorre à adição de uma linhagem selecionada de S. cerevisiae, isso
contribui para acelerar o processo e garantir a qualidade da bebida produzida (Bernardi et al., 2008).
Adicionam-se também vitaminas, substâncias nitrogenadas à base de fósforo e sais minerais para
favorecer o crescimento e a atividade da levedura; bactericidas e antibióticos para minimizar a
proliferação de bactérias contaminantes; substâncias antiespumantes para evitar a formação de
espumas e ácidos para ajuste do pH entre 4,5 e 5,0 (Pinheiro et al., 2011).
Após o término da fermentação do caldo, o chamado mosto ou vinho é transferido para
alambiques de cobre onde é destilado. Durante a destilação ocorre a separação das substâncias
voláteis, assim como algumas reações químicas dentro dos destiladores (Boza e Horii, 1998). O
destilado finalmente é diluído com água até a concentração de etanol atingir 38 a 40% (v/v), em
seguida segue-se para o engarrafamento ou para maturação em barris de carvalho por tempo
indeterminado. Como resultado, o perfil organoléptico da cachaça vai depender da qualidade da
matéria-prima, do processo de fermentação empregado e do tipo de envelhecimento selecionado. O
17
tipo de alambique e a técnica de destilação também afetam o sabor dos destilados. Por exemplo, o
cobre age de forma a reduzir o teor de compostos sulfurados voláteis no destilado, e, portanto, o
desagradável odor típico de sulfeto, produzido principalmente pela presença de dimetilsulfeto
(Oliveira et al., 2004). Entanto, as leveduras e as condições de fermentação têm sido apontadas
como os fatores que mais influenciam o sabor das bebidas alcoólicas, visto que, a maioria dos
compostos aromáticos é formada durante a fermentação (Suomalainen e Lehtonen, 1979).
1.4. As leveduras do processo fermentativo
As leveduras são fungos unicelulares, eucariontes, heterótrofos, caracteristicamente
esféricos, ovais ou cilíndricos, com fase somática ou vegetativa, reproduzem-se assexuadamente por
processo denominado brotamento multilateral ou fissão e sexuadamente por produção de esporos e
conjugação envolvendo mitose e meiose. Na classificação taxonômica, as leveduras podem ser
divididas em dois filos Ascomycota e Basidiomycota (Alexopoulos, 1996). São microrganismos
tradicionalmente envolvidos em processos fermentativos que trazem como conseqüência a
modificação, o melhoramento ou a deterioração dos alimentos açucarados.
As leveduras utilizadas na fabricação de bebidas alcoólicas geralmente são linhagens da
espécie Saccharomyces cerevisiae. Nas fermentações espontâneas, um grande número de espécies
pode estar envolvido, com predominância de S. cerevisiae (Pataro et al., 2001). O uso de linhagens
selecionadas favorece o início mais rápido do processo e os riscos de contaminação apresentados
pela fermentação espontânea podem ser evitados, favorecendo uma menor competição por
nutrientes essenciais, maior rendimento e qualidade do produto resultante (Dorneles et al., 2005).
As culturas iniciadoras conseguem dominar o processo porque são adicionadas em altas
concentrações, prevalecendo sobre a microbiota autóctone.
A condição natural das dornas de fermentação é estressante para as leveduras presente no
processo, isso pode contribuir para uma forte pressão seletiva sobre as cepas a serem utilizadas na
fermentação. Diferentes linhagens de S. cerevisiae têm sido detectadas nas cubas de fermentação
durante todos os ciclos, como resultado, esta diversidade pode ocasionar variações nas propriedades
sensoriais da cachaça (Guerra et al., 2001; Pataro et al., 2001; Vila Nova et al., 2009). Embora
bactérias e leveduras não-Saccharomyces apresentem baixa tolerância ao etanol e, ao longo do
processo sejam substituídas por linhagens de S.cerevisiae, elas desempenham um papel importante
nas características sensoriais das bebidas por produzirem compostos que contribuem com a
complexidade aromática. Estas características permanecerão no produto final, mesmo após a
18
remoção do micro-organismo (Ciani e Ferraro, 1999; Bernardi et al., 2008). Entretanto, vale
ressaltar que em vários processos essas leveduras não-Saccharomyces podem permanecer em alta
densidade celular até o final do processo fermentativo, contribuindo de forma direta para a
qualidade do produto destilado (Vila Nova et al., 2009).
Para garantir a sobrevivência nas dornas de fermentação e ter potencial para dominar o
processo, as cepas selvagens devem ter a habilidade de crescer em altas temperaturas, em altos
níveis de concentração de etanol, deve ter osmotolerância, altos níveis de atividade invertase,
acumulo de trealose, e deve produzir baixos níveis de acidez (Pataro et al., 2002). Parâmetros
fermentativos como, alto rendimento em etanol, elevada velocidade específica de crescimento e alta
produtividade também são características essenciais para um bom desempenho da levedura no
processo fermentativo (Oliveira et al., 2004).
Em estudo feito através da comparação do uso de duas linhagens de S. cerevisiae, uma
comercial e outra indígena, como fermento em uma destilaria de cachaça. Observou-se que as duas
linhagens predominaram nas dornas de fermentação por aproximadamente 30 dias e foram
promissoras para serem utilizadas como iniciadoras do processo fermentativo para a produção de
cachaça. Leveduras não Saccharomyces foram isoladas do processo tais como: Candida, Pichia,
Kloeckerae, Schizosaccharomyces, além de linhagens S. cerevisiae provenientes do substrato, mas
todas foram isoladas em menor proporção(Gomes et al., 2009). Além disso, vários estudos tem
avaliado a influência de cepas de levedura na formação de compostos aromáticos em diferentes
bebidas alcoólicas como vinho, cerveja, uísque e conhaque (Longo et al., 1992; Lurton et al., 1995;
Romano et al., 2003). Em trabalho realizado por Vila Nova e colaboradores (2009) foi identificado
a produção de metabólitos secundários por diversas leveduras isoladas do processo fermentativo de
alambiques artesanais.
A falta de controle microbiológico durante a fermentação pode levar ao aumento na
biodiversidade e por conseqüência produzir variações organolépticas nas bebidas. Essas leveduras
podem ser provenientes do mosto de alimentação ou podem ser ainda residentes do processo,
localizando-se na tubulação, nos trocadores de calor e na água de lavagem da cana e de diluição do
mosto (Silva-Filho, 2003). Episódios de contaminação ao longo da safra podem fazer com que
outras espécies de leveduras substituam o inóculo inicial, com especial atenção para levedura
Dekkera bruxellensis que foi identificada como a principal contaminante nos processos
fermentativos de produção de álcool combustível e vinho em todo mundo (Abbott et al., 2005; De
Souza Liberal et al., 2007).
19
1.5. Dekkera bruxellensis: aspectos gerais
A levedura da espécie D. Bruxellensis, anamorfo Brettanomyces bruxellensis, é o objeto do
presente estudo e pertence a Família Saccharomycetacea (Barnett et al., 1983). O gênero
Brettanomyces é conhecido desde 1904. Esta levedura foi isolada no final da fermentação de uma
cerveja inglesa e sua participação no processo estava relacionada a características aromáticas
(Claussen, 1904). Entretanto, a descrição morfológica e fisiológica só foi realizada em 1940 com a
identificação da produção de ácido acético como principal metabólito durante o crescimento celular
aeróbio e ausência de ascósporos. Mais adiante, em 1964 o gênero Dekkera foi introduzido quando
a formação de esporos foi observada em isolados de Brettanomyces (Van Der Walt, 1964). A
morfologia das células da levedura D. bruxellensis (Figura 1) é bastante diversificada,
apresentando-se principalmente na forma elíptica (Van Der Walt, 1964).
Figura 1. Linhagens da espécie Dekkera bruxellensis. (A) linhagem CBS 74; (B) linhagem CBS
2499; (C) linhagem GDB 248 (industrial) em meio YPD (Microscopia de contraste de fase).
Retirado de Leite (2012).
A espécie D. bruxellensis é utilizada na produção de cervejas Belgas do tipo Lambic
(Martens et al, 1997), embora sua principal reputação é a de contaminar destilarias de álcool
combustível no Nordeste brasileiro (De Souza Liberal et al., 2007; Basílio et al., 2008) nos EUA e
Canadá (Abbott et al., 2005) e na indústria de vinho na Europa (Loureiro e Malfeito-Ferreira,
2003). Esses trabalhos relatam a associação desta levedura à queda do rendimento em etanol e a
mudanças no aroma e sabor dos vinhos (Loureiro e Malfeito-Ferreira, 2003; De Souza Liberal et al.,
2007; Basílio et al., 2008).
Nos vinhos, esse micro-organismo converte ácidos hidroxicinâmicos em compostos
fenólicos voláteis, que em determinadas concentrações ocasionam o aparecimento de “off-flavours”,
20
ou seja, substâncias que conferem odores e sabores indesejáveis às bebidas. Entretanto a
contaminação nos vinhos geralmente não acontece durante a fermentação, sendo esta levedura
frequentemente encontrada durante a conservação nos barris ou após envase, em média de 6 a 10
meses após o armazenamento (Cocolin et al., 2004).
Recentemente foi mostrado que o genoma desta levedura possui dois genes que codificam
para a enzima responsável pela produção do fenil-acetaldeído (De Souza Liberal et al.,2012), uma
substância que confere o aroma floral aos vinhos (Verstrepen et al., 2003). A presença de dois
parálogos para este gene chamado de ARO10 no genoma de D. bruxellensis parece ser uma
característica única dentre os ascomicetos, pelo menos daqueles cujo genoma já fora sequenciado
(De Souza Liberal et al., 2012). Isto mostra o potencial que esta levedura pode ter na produção de
substâncias capazes de conferir sabores desejáveis às bebidas.
1.5.1. Fisiologia de Dekkera bruxellensis
A linhagem GDB 248 (figura 1C), isolada de destilaria de álcool combustível na região
Nordeste do Brasil (De Souza Liberal et al., 2007), tem se destacado por sua alta adaptabilidade ao
processo industrial quando comparada a S. cerevisiae. Esse destaque pode estar relacionado com a
maior tolerância a pH baixo e a elevada resistência a etanol descritas para a espécie (Rozpędowska
et al., 2011). Com isso, episódios de contaminação do processo industrial têm sido relatados, nos
quais, a população de D. bruxellensis chega a substituir a de S. cerevisiae, o que correlaciona com
diminuição no rendimento em etanol, gerando significativos prejuízos econômicos (De Souza
Liberal et al., 2007). Essa capacidade de substituir a população inicial de S. cerevisiae faz da D.
bruxellensis um contaminante significativo em destilarias que fermentam o caldo da cana. Apesar
de ser considerada contaminante, já existem trabalhos mostrando que esta levedura é capaz de
produzir etanol em rendimentos muito próximos àqueles apresentados por S. cerevisiae (Passoth et
al., 2007; Blomqvist et al., 2010). Sendo o maior problema desta levedura a menor produtividade
causada pela lenta assimilação dos açucares do mosto (De Souza Liberal et al., 2007; Leite et al.,
2012; Pereira et al., 2012). O rendimento em etanol e produtividade, bem como o crescimento
dessas células são influenciados pela variação de temperatura, pH e fonte de carbono (Blomqvist et
al., 2010).
As espécies D.bruxellensis e S. cerevisiae compartilham algumas semelhanças fisiológicas,
tais como: tolerância a etanol, capacidade de crescer em anaerobiose, capacidade de fermentar
mesmo na presença de oxigênio desde que, no meio tenha elevada concentração de glicose (efeito
21
Crabtree positivo) e capacidade de sobreviver sem DNA mitocondrial (efeito petite positivo)
(Woolfit et al., 2007). D. bruxellensis é capaz de assimilar uma grande variedade de fontes de
carbono que incluem os monossacarídeos glicose, frutose e galactose, e os dissacarídeos maltose,
celobiose, trealose e sacarose (Blomqvist et al., 2010; Leite et al., 2012). Entre as fontes de
nitrogênio, esta levedura é capaz de assimilar amônia, glutamato, glutamina, prolina, arginina e
nitrato (Conterno et al., 2006; De Barros Pita et al., 2013). O fato de D. Bruxellensis ter a
capacidade de assimilar nitrogênio na forma de nitrato pode conferir uma vantagem adaptativa ao
processo de fermentação industrial quando comparada a S. cerevisiae (De Barros Pita et al., 2011).
Embora sob condições limitantes de oxigênio se verifica a produção de glicerol pelas células
de D. bruxellensis a fim de re-oxidar NADH gerado durante os processos oxidativos (Van Dijken e
Scheffers, 1986). Dados recentes mostram que esta produção é limitada quando comparado a S.
cerevisiae (Aguilar Uscanga et al., 2003; De Souza Liberal et al., 2007; Blomqvist et al., 2010).
Esta incapacidade levaria ao chamado efeito Custer, isto é, a inibição temporária de fermentação
quando o oxigênio do meio se torna limitante (Wijsman et al., 1984). Este é sem dúvida o fator
limitante mais importante na utilização de D. bruxellensis em processos fermentativos industriais.
Com essa baixa capacidade de produção de glicerol, o acetato se torna o principal metabólito
produzido durante o crescimento aeróbio, sendo produzido a partir de diferentes fontes de carbono
como glicose ou etanol (Aguilar Uscanga et al., 2003; Freer et al., 2003; Blomqvist et al., 2010), é
influenciado pela concentração de oxigênio no meio (Aguilar Uscanga et al., 2003), pela
temperatura (Castro Martinez et al., 2005) e pH (Freer et al., 2003).
Apesar de diversos estudos abordarem diferentes aspectos da fisiologia de D. bruxellensis nos
últimos anos, a produção de compostos organolépticos de interesse industrial por esta levedura ainda
permanece desconhecido.
1.6. Substâncias organolépticas
Uma multiplicidade de compostos contribui para o sabor das bebidas alcoólicas. O etanol e
dióxido de carbono são os produtos majoritários da fermentação, no entanto, o caráter essencial das
bebidas é determinado pela a variedade de metabolitos secundários que são produzidos pelas
leveduras durante a fermentação (Boulton e Quain, 2001). Os principais compostos secundários que
influenciam o aroma e sabor das bebidas fermentadas são: os ácidos orgânicos, os compostos
carbonílicos, os alcoóis superiores e os ésteres voláteis. Dentre estes, os alcoóis superiores e os
ésteres voláteis representam o maior grupo e mais importante, já que são responsáveis pelo aroma
22
floral e frutado altamente desejados nas bebidas alcoólicas (Verstrepen et al., 2003), assim como o
glicerol (Vila Nova et al 2009). A quantidade desses compostos depende de muitos fatores, mas
principalmente das condições de fermentação, a natureza da fonte de nitrogênio e da cepa de
levedura utilizada (Pisarnitskii, 2001; Carrau et al., 2008). Alguns desses compostos contribuem
positivamente para a qualidade final do produto, enquanto outros dão notas indesejáveis: “off-
flavours”.
Existe uma grande variedade de ácidos orgânicos, muitos dos quais são derivados do mosto
e outros são produzidos pelas leveduras durante a fermentação, que em geral conferem sabores
amargos ao produto. Entre os ácidos orgânicos estão o piruvato, citrato, malato, acetato,
oxoglutarato e succinato. A maioria dos ácidos orgânicos é derivada do piruvato ou a partir do ciclo
do ácido tricarboxílico (Boulton e Quain, 2001). O ácido acético é o ácido orgânico
predominantemente excretado no meio, apesar da sua proporção variar nas diferentes bebidas, na
maioria dos casos corresponde de 60 a 95% da acidez total da bebida (Nykänen e Suomalainen,
1983).
Dentre os compostos carbonílicos, os aldeídos são os mais importantes componentes do
aroma, pois, mesmo em baixas concentrações, interferem nas características sensoriais da bebida e
podem ter origem pela ação das leveduras durante estágios preliminares do processo de fermentação
(Piggott et al., 1989). Os aldeídos que são formados dentro das células das leveduras e excretados
para o meio, podem ser reabsorvidos e reduzidos ao álcool correspondente, durante os últimos
estágios da fermentação (Lea e Piggott, 2003). O acetaldeído é o maior componente, geralmente
constituindo 90% do conteúdo total de aldeídos em vinhos e bebidas destiladas sendo originado a
partir da descarboxilação do piruvato durante a fermentação alcoólica (Longo et al., 1992; Romano
et al., 2008). Este é um composto muito importante devido aos seus efeitos negativos em relação ao
consumo das bebidas fermentadas, já que está associado a problemas clínicos tais como
enxaquecas, ressacas e até problemas neurológicos (Vila Nova et al., 2009). A produção deste
composto depende da composição da população de leveduras no processo (Vila Nova et al., 2009).
O furfural é também um aldeído importante, produzido pela reação química entre compostos
aromáticos e a glicose, influenciando de forma negativa o aroma e o paladar da cachaça, sendo
assim, deve ser evitado (Pinheiro, 1999).
O glicerol é um composto produzido em decorrência do crescimento celular e tem
importância na composição do “bouquet” e textura das bebidas destiladas, devido a sua viscosidade.
Este é produzido pelas células das leveduras como subproduto do crescimento celular e da produção
23
dos aminoácidos, atuando como via de regeneração do NAD+ a partir de NADH na manutenção do
balanço redox intracelular (Berovic e Herga, 2007).
1.6.1 Álcoois superiores
São compostos secundários produzidos pelas leveduras durante o metabolismo fermentativo,
sendo formados por alcoóis de cadeia simples ou ramificadas, com número de carbono maior que
dois e peso molecular e ponto de ebulição superior ao do etanol (Bidan, 1975). Esses compostos,
também conhecidos como álcool fúsel, são muito importantes para a qualidade das bebidas
fermentadas. O nome “fusel” é derivado da palavra alemã fusel (licor ruim), o que corresponde às
frações finais pesadas do processo de destilação. Portanto, um produto enriquecido com estes
compostos pesados apresenta gosto ruim. Embora altas concentrações de álcool fúsel transmitem
sabores indesejados “off-flavours”, baixas concentrações contribuem essencialmente para os
sabores e aromas das bebidas fermentadas (Hazelwood et al., 2008). Os alcoóis superiores são
compostos por alcoóis alinfáticos e aromáticos (Nykänen e Nykänen, 1977). Os alcoóis alinfáticos
incluem propanol, isobutanol, álcool amílico ativo, álcool isoamílico, enquanto o 2-feniletanol é
considerado o alcool aromático mais importante no aroma das bebidas. O álcool isoamílico, álcool
amílico ativo e o isobutanol são conhecidos como alcoóis de cadeia ramificada porque eles são
produtos da degradação dos aminoácidos de cadeia ramificada, leucina, isoleucina e valina
(Lambrechts e Pretorius, 2000). Esses alcoóis contribuem para intensificar o sabor alcoólico das
bebidas e conferir uma característica cálida as mesmas (Boulton e Quain, 2008). Também são
conhecidos pelo seu aroma forte e pungente, sendo responsáveis pelas notas florais e frutadas que
são esperadas nas bebidas alcoólicas (Torrea et al., 2003) Como exemplos: o álcool isoamílico
(notas de banana), o álcool feniletilico (notas de rosas e jasmim), o álcool benzílico (notas de
amêndoas e nozes).
A produção desses compostos se dá durante toda a fermentação alcoólica e compõem o
maior grupo de compostos aromáticos nas bebidas alcoólicas. Os níveis de alcoóis superiores
formados durante a fermentação dependem da temperatura de fermentação, da cepa de levedura
empregada, dos nutrientes nitrogenados e das condições de aeração (Ough e Bell, 1980; Vila Nova
et al., 2009). Os alcoóis superiores podem ser formados a partir do metabolismo dos carboidratos
através do piruvato ou através do catabolismo dos aminoácidos aromáticos e de cadeia ramificada
pela chamada via de Ehrlich (Figura 2; Hazelwood et al., 2008).
24
Esta última é a mais utilizada pelas leveduras para obter nitrogênio a partir dos aminoácidos
ramificados, e será discutida adiante, embora seja mais usada somente quando fontes de nitrogênio
preferênciais estão em baixas concentrações. Assim, quando o amônio é usado como fonte de
nitrogênio, os alcoóis superiores são formados a partir do esqueleto carbonado proveniente do
catabolismo do piruvato (Derrick e Large, 1993; Espinosa Vidal, 2008). Depois de produzidos,
esses compostos são excretados para o meio, já que não podem ser utilizados como fonte de
carbono auxiliar no metabolismo principal (Espinosa Vidal, 2008).
1.6.2. Via de Ehrlich
O atual interesse científico pela via Ehrlich é suportada pelo aumento da demanda de
identificação de compostos aromáticos, bem como pela necessidade de controlar aromas produzidos
pelas leveduras em alimentos fermentados (Hazelwood et al., 2008). Em 1907, Ehrlich demonstrou
que vários alcoóis superiores procediam da degradação metabólica dos aminoácidos, mediante um
mecanismo que engloba reações subseqüentes de transaminação, descarboxilação e redução. Nessa
via (Figura 2), os aminoácidos são primeiramente transaminados a α-cetoácido, em seguida são
descarboxilados a aldeídos e finalmente reduzido para o correspondente álcool (Hazelwood et al.,
2008; Espinosa Vidal et al., 2012).
Após a reação de transaminação inicial, o α-ceto ácido resultante não pode ser redirecionado
para o metabolismo central do carbono e é pouco excretado para o meio de crescimento. Portanto,
estes compostos são convertidos aos aldeídos correspondentes pela ação de descarboxilases, e estes
são posteriormente reduzidos aos álcoois superiores pelas desidrogenases (Hazelwood et al., 2008).
Alternativamente, os α-ceto aldeídos são oxidados aos α-cetoácidos quando as células estão sob
regime oxidativo, crescendo em altas concentrações de oxigênio dissolvido no meio (Hazelwood et
al., 2008). Os aminoácidos que podem ser convertidos por meio da via de Ehrlich são quase
inteiramente convertidos em álcool fúsel, tendo a formação do ácido fusel um papel menor no
metabolismo celular (Dickinson et al., 2003). O mecanismo de exportação do álcool fúsel da célula
para o meio de cultura ainda é desconhecido. Por outro lado, a exportação do ácido fúsel ocorre
através de um transportador de membrana (Hazelwood et al., 2008).
25
Figura 2. Catabolismo dos aminoácidos. Via de Ehrlich. Adaptado de (Hazelwood et al., 2008).
1.6.3. Relação entre anabolismo e catabolismos dos aminoácidos ramificados
O aminoácido leucina é formado a partir do piruvato em vários passos biossintéticos. No
intermediário α-cetoisovalerato ocorre a integração das vias de biossíntese de valina e leucina
(Figura 3). Este intermediário pode ser convertido em α-isopropilmalato pela enzima α-
isopropilmalato sintáse e em seguida sofrer uma série de reações para produzir leucina e o seu
respectivo álcool superior: 3-metil-butanol. O outro composto produzido através do α-
cetoisovaleraro é a valina, o que acontece quando o intermediário é aminado (Espinosa Vidal,
2008).
26
Figura 3. Síntese de leucina e valina em S. cerevisiae (modificado de www.biocyc.org)
1.6.4. Ésteres
Os ésteres voláteis são responsáveis pelo caráter frutado de bebidas fermentadas (Verstrepen
et al., 2003). São formados em reações de esterificação entre um álcool e um ácido carboxílico
durante o processo de oxidação e apresentam aroma agradável e suave. Dois grupos apresentam
grande influência nas características organolépticas das bebidas fermentadas: Os ésteres de ácido
graxo e os ésteres de acetato. Suas concentrações podem variar bastante em bebidas alcoólicas
(Boulton e Quain, 2001). Tem sido relatado que a relação C/N (Palmer e Rennie, 1974) e a síntese
de lipídios (Boulton e Quain, 2001), a composição do mosto e a aeração (Verstrepen et al., 2003)
influenciam a concentração de éster no meio.
1.6.4.1. Ésteres de acetato
O principal éster da cachaça é o acetato de etila, responsável pela formação de aroma tipo
solvente; o acetato de isoamila tem aroma de banana e, em quantidades excessivas, torna a bebida
27
enjoativa; já o acetato de feniletila confere aromas florais, de rosas e mel à bebida (Pinheiro, 1999).
Estes são os principais ésteres presentes em bebidas fermentadas e a qualidade do produto final
depende das concentrações de cada um deles no mosto. O acetato de isoamila é sintetizado a partir
da condensação do álcool isoamílico e da acetil coenzima A pela enzima álcool acetiltransferase
(AATFase), mas também é hidrolisado pelas esterases (Fujii et al., 1996). Fukuda e colaboradores
(1998) sugeriram a hipótese de que o equilíbrio de ambas as atividades enzimáticas é importante
para a concentração final deste éster durante a fabricação de cerveja. Portanto, baixos níveis de
álcool isoamílico, de acetil-CoA, e baixos níveis da enzima AATFase podem resultar na produção
deficiente do éster (Verstrepen et al., 2003). O acetato de etila é formado pela condensação do
etanol com acetil-CoA também pela AATFase e na cachaça se encontra na metade da concentração
que existe normalmente em rum e uísque. O fato de que o total de ésteres presente na cachaça é
menor do que os encontrados em outras bebidas deve provavelmente ser reflexo do fato de que a
cachaça é em geral uma bebida jovem (Boscolo et al., 2000).
1.6.4.2. Ésteres de ácido graxo
Os ésteres de ácidos graxos são os que mais contribuem para o sabor das bebidas em geral
(Boscolo et al., 2000). São ésteres de cadeia média (C6-C10), produzidos pela condensação do acil-
CoA e de um álcool (geralmente etanol). Dentre os mais importantes se encontram o caproato de
etila (hexanoato de etila) e caprilato de etila (octanoato de etila), os quais apresentam aroma de
maçã e mamão, respectivamente (Meilgaard, 2001). Com relação aos níveis de ésteres de ácidos
graxo em células de leveduras, tanto a síntese como o acúmulo são dependentes da presença dos
precursores (etanol e ácido graxo) assim como pelo controle da enzimas AATases (Verstrepen et
al., 2003).
1.7 METABOLISMO DO NITROGÊNIO
1.7.1. Aspectos gerais
O nitrogênio é um nutriente essencial para os seres vivos. As leveduras podem usar quase 30
fontes de nitrogênio distintas, como: aminoácidos, uréia, amônia, bases nitrogenadas e derivados de
purina (Cooper, 1982). Essas moléculas entram na célula por meio de permeases e são
imediatamente usadas como blocos de construção em reações de biossíntese ou catalisadas para
28
liberar nitrogênio na forma de amônia (via desaminação), glutamato (via transaminação) ou ambas
(Cooper, 1982; Magasanik, 1992). As leveduras respondem metabolicamente a diferenças na
disponibilidade de nitrogênio, afetando o crescimento celular, além de alterar a eficiência da
fermentação e redistribuição das vias biosintéticas. Sendo assim, a falta de controle do nitrogênio no
meio gera diferenças na composição das bebidas (Beltran et al., 2005).
1.7.2. Assimilação da fonte de nitrogênio
Para o adequado desenvolvimento das células de levedura, é necessário monitorar a
disponibilidade dos compostos alimentares, ajustar a maquinaria enzimática e o sistema de absorção
para uma melhor eficiência da utilização das fontes alimentares (Boer et al., 2007). A membrana
plasmática das leveduras não é livremente permeável para muitos compostos, sendo assim
leveduras como a S. cerevisiae, desenvolveram um sistema de transporte para absorver várias
substâncias do meio externo, como por exemplo, os aminoácidos, sendo estes acumulados dentro da
célula contra o gradiente de concentração.
Apesar de assimilarem uma ampla variedade de fontes de nitrogênio, as leveduras
apresentam preferência na utilização de determinados compostos nitrogenados (Magasanik e
Kaiser, 2002a). Foi observado que amônia, glutamato, glutamina e asparginina, são
preferencialmente utilizadas pelas leveduras e induzem altas taxas de crescimento. Quando uma
dessas fontes está em grande quantidade, ocorre a repressão das vias catabólicas de degradação de
outros compostos nitrogenados como arginina, prolina e uréia. Esse mecanismo é chamado
Repressão Catabólica do Nitrogênio (NCR) (Cooper e Sumrada, 1983).
Todas as vias para a utilização de fontes de nitrogênio, preferenciais e não-preferenciais, se
convergem para uma via em comum, a produção de glutamato e glutamina. Estes dois aminoácidos
servem como doadores de nitrogênio para todos os outros compostos nitrogenados da célula e,
juntamente com a amônia, formam a via do Metabolismo Central do Nitrogênio (Magasanik, 2003).
Independente da fonte de nitrogênio, o primeiro passo é a liberação da amônia. Dentro da célula, a
amônia pode servir para aminação do α- cetoglutarato, sintetizado a partir do ácido tricarboxílico
para produzir glutamato ou pode aminar diretamente o glutamato para produzir glutamina. Usando
diferentes enzimas, e a glutamina como única fonte de nitrogênio, pode ser convertida em
glutamato, e o glutamato como única fonte de nitrogênio pode ser convertido em glutamina
(Magasanik e Kaiser, 2002).
29
Os aminoácidos são absorvidos pela levedura em uma sequencia que levou a categorização
dos aminoácidos em grupos ordenados. No grupo A estão os aminoácidos que são absorvidos
rapidamente do meio de cultura e desaparecem no início da fermentação, tais como glutamina,
ácido glutâmico, arginina e serina. No grupo B estão os aminoácidos que são assimilados de forma
mais lenta, tais como a valina, leucina e isoleucina. No grupo C, estão os aminoácidos absorvidos
apenas após a completa assimilação dos aminoácidos do grupo A, tais como fenilalanina, tirosina e
triptofano. O grupo D é formado apenas pela prolina, um aminoácido de baixa absorção (O'connor-
Cox e Ingledew, 1989).
Com relação à produção de cachaça, a adição de sulfato de amônio ao caldo de cana é
amplamente aceita por produtores artesanais e industriais, para ajudar a manter uma alta taxa de
fermentação e elevada população de leveduras durante o processo de fermentação (Angelis e
Mutton, 1992).
1.7.3. Influência do nitrogênio na formação dos compostos organolépticos
A natureza e disponibilidade da fonte de nitrogênio no meio de fermentação contribuem
fortemente na qualidade sensorial do fermentado (O'connor-Cox e Ingledew, 1989; Lambrechts e
Pretorius, 2000; Hazelwood et al., 2008). A deficiência de nitrogênio aumenta o tempo de
fermentação, aumenta a concentração de açúcar residual, diminui o rendimento de biomassa e gera
sub-produtos indesejáveis “off-flavours” (Mendes Ferreira et al., 2004).
No contexto da produção de aguardente, é difícil descobrir que concentração de nitrogênio
no meio é necessária para a população de leveduras presente na dorna de fermentação. A
concentração de nitrogênio irá depender de vários parâmetros, como por exemplo, o tipo de células,
que depende da cepa de levedura utilizada, o tamanho do inoculo e as condições de fermentação,
tais como aeração e a concentração de açúcar (Espinosa Vidal et al., 2012). A adição de sais de
amônio ao caldo de cana como suplemento, pode exercer uma forte influência nos parâmetros
fermentativos e no perfil aromático do fermentado, já que esse suplemento influencia no
metabolismo da levedura com relação a produção de compostos aromáticos, e na expressão dos
genes relacionados a via de Erlich (Espinosa Vidal et al., 2012).
Em estudos feitos por Mendes Ferreira e colaboradores (2004), a suplementação de
nitrogênio favoreceu o processo aumentando a biomassa, a taxa de fermentação e o rendimento em
etanol, podendo gerar um efeito positivo na qualidade sensorial que é esperada no vinho.
30
Entretanto, o excesso de compostos nitrogenados, adicionados na suplementação do mosto, pode
resultar no incremento anormal de aminoácidos e conseqüente aumento dos teores de alcoóis
superiores, podendo assim a aguardente ultrapassar o limite legal para esta classe de compostos. Um
aminoácido em excesso, gera elevadas concentrações de álcool por estimular o crescimento celular.
Entretanto, quando a concentração de nitrogênio é muito baixa, também produz uma alta
concentração de álcool superior (Szlavko, 1974). Nesse exemplo, o teor de nitrogênio limitado irá
promover a síntese endógena aumentada de aminoácidos, estimulando a rota anabólica sintética dos
alcoois superiores (Boulton e Quain, 2001). No entanto, no vinho, a produção de álcoois superior
tende a diminuir com o aumento da suplementação de nitrogênio (Carrau et al., 2008). Segundo
Espinosa Vidal e colaboradores (2012) a suplementação do caldo de cana com altas concentrações
de sais de amônio, também vai diminuir a produção de alcoois superiores e isso é explicado pela
repressão dos genes da via de Erlich. Por outro lado, isto leva ao aumento da produção de ésteres de
acetato.
Dessa forma, determinar o perfil metabólico da levedura D. bruxellensis durante a
fermentação alcoólica poderá abrir perspectivas para utilização industrial dessa levedura na
produção de bebidas diferenciadas. O presente trabalho apresenta dados metabólicos que avaliam a
influência das diferentes fontes de nitrogênio na produção de metabólitos que qualificam o produto,
tais como: alcoóis superiores, ésteres voláteis e ácidos orgânicos.
31
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBOTT, D.; HYNES, S.; INGLEDEW, W. Growth rates of Dekkera/Brettanomyces yeasts hinder
their ability to compete with Saccharomyces cerevisiae in batch corn mash fermentations. Applied
microbiology and biotechnology, v. 66, n. 6, p. 641-647, 2005. ISSN 0175-7598.
AGUILAR USCANGA, M.; DELIA, M.-L.; STREHAIANO, P. Brettanomyces bruxellensis: effect
of oxygen on growth and acetic acid production. Applied microbiology and biotechnology, v. 61,
n. 2, p. 157-162, 2003. ISSN 0175-7598.
ALEXOPOULOS, C. J. M., C.W.; BLACKWELL, M. Introductory mycology. 4. New york: John
Wiley & Sons, 1996.
ANGELIS, D.; MUTTON, M. Agentes Físicos, Químicos e Microbiológicos que Afetam a
Fermentação Etanólica. Aguardente de Cana-Produção e Qualidade. Jaboticabal: FUNEP, p.
49-66, 1992.
BARNETT, J. A.; PAYNE, R. W.; YARROW, D. Yeasts: characteristics and identification.
Cambridge University Press, 1983. ISBN 0521252962.
BASÍLIO, A. C. et al. Detection and identification of wild yeast contaminants of the industrial fuel
ethanol fermentation process. Current microbiology, v. 56, n. 4, p. 322-326, 2008. ISSN 0343-
8651.
BELTRAN, G. et al. Influence of the timing of nitrogen additions during synthetic grape must
fermentations on fermentation kinetics and nitrogen consumption. Journal of agricultural and
food chemistry, v. 53, n. 4, p. 996-1002, 2005. ISSN 0021-8561.
BERNARDI, T. L. et al. Saccharomyces cerevisiae strains associated with the production of
cachaça: identification and characterization by traditional and molecular methods (PCR, PFGE and
mtDNA-RFLP). World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 24, n. 11, p. 2705-2712,
2008. ISSN 0959-3993.
BEROVIC, M.; HERGA, M. Heat shock on Saccharomyces cerevisiae inoculum increases glycerol
production in wine fermentation. Biotechnology letters, v. 29, n. 6, p. 891-894, 2007. ISSN 0141-
5492.
BIDAN, P. Relation entre la teneur des vins en alcools superieurs et la teneur des mouts en
subtances azotees en particulier en acides amines. Bulletin de l'OIV, v. 48, 1975.
BLOMQVIST, J. et al. Fermentation characteristics of Dekkera bruxellensis strains. Applied
microbiology and biotechnology, v. 87, n. 4, p. 1487-1497, 2010. ISSN 0175-7598.
BOER, V. M. et al. Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae to preferred and
nonpreferred nitrogen sources in glucose‐limited chemostat cultures. FEMS yeast research, v. 7, n. 4, p. 604-620, 2007. ISSN 1567-1364.
32
BOSCOLO, M. et al. Identification and dosage by HRGC of minor alcohols and esters in Brazilian
sugar-cane spirit. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 11, n. 1, p. 86-90, 2000. ISSN
0103-5053.
BOULTON, C.; QUAIN, D. Brewing yeast and fermentation. Wiley Online Library, 2001.
BOZA, Y.; HORII, J. Influência da destilação sobre a composição e qualidade sensorial da
aguardente de cana-de-açúcar. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 18, n. 4, p. 391-396, 1998.
BRASIL. Decreto n° 2314 de 4 set.1997. Dispõe sobre a padronização, a classificação, o registro, a
inspeção, a produção e a fiscalização de bebidas. Regulamenta a Lei n° 8918 de 14 de julho de
1994. Diário Oficial. Brasília. 5 set. 1997.
BRASIL. Instrução Normativa n 13, de 29 de junho de 2005. Aprova o Regulamento Técnico para
Fixação dos Padrões de Identidade e Qualidade para Aguardente de Cana e para Cachaça. Publicado
no Diário Oficial da União de 30/06/2005, Seção 1, Página 3. disponível em
www.agricultura.gov.br.
CARRAU, F. M. et al. Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae
wine yeasts: effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains. FEMS yeast research, v. 8,
n. 7, p. 1196-1207, 2008. ISSN 1567-1364.
CASTRO MARTINEZ, C. et al. Effect of physical factors on acetic acid production in
Brettanomyces strains. Journal of food process engineering, v. 28, n. 2, p. 133-143, 2005. ISSN
1745-4530.
CIANI, M.; FERRARO, L. Role of oxygen on acetic acid production by Brettanomyces/Dekkera in
winemaking. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 75, n. 4, p. 489-495, 1999.
ISSN 1097-0010.
CLAUSSEN, N. H. On a method for the application of Hansen's pure yeast system in the
manufacturing of well-conditioned English stock beers. Journal of the Institute of Brewing, v. 10,
p. 308-331, 1904.
COCOLIN, L. et al. Molecular detection and identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis
and Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines. Applied and Environmental
Microbiology, v. 70, n. 3, p. 1347-1355, 2004. ISSN 0099-2240.
CONTERNO, L. et al. Genetic and physiological characterization of Brettanomyces bruxellensis
strains isolated from wines. American Journal of Enology and Viticulture, v. 57, n. 2, p. 139-
147, 2006. ISSN 0002-9254.
COOPER, T.; SUMRADA, R. What is the function of nitrogen catabolite repression in
Saccharomyces cerevisiae? Journal of Bacteriology, v. 155, n. 2, p. 623-627, 1983. ISSN 0021-
9193.
COOPER, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Cold Spring Harbor
Monograph Archive, v. 11, n. 0, p. 39-99, 1982.
33
DE BARROS PITA, W. et al. The ability to use nitrate confers advantage to Dekkera bruxellensis
over S. cerevisiae and can explain its adaptation to industrial fermentation processes. Antonie van
Leeuwenhoek, p. 1-9, 2011. ISSN 0003-6072.
DE BARROS PITA, W. et al. The influence of nitrate on the physiology of the yeast Dekkera
bruxellensis grown under oxygen limitation. Yeast, 2013. ISSN 1097-0061.
DE SOUZA LIBERAL, A. et al. Identification of Dekkera bruxellensis as a major contaminant
yeast in continuous fuel ethanol fermentation. Journal of applied microbiology, v. 102, n. 2, p.
538-547, 2007. ISSN 1365-2672.
DE SOUZA LIBERAL, A. T. et al. The yeast Dekkera bruxellensis genome contains two orthologs
of the ARO10 gene encoding for phenylpyruvate decarboxylase. World Journal of Microbiology
and Biotechnology, p. 1-6, 2012. ISSN 0959-3993.
DERRICK, S.; LARGE, P. J. Activities of the enzymes of the Ehrlich pathway and formation of
branched-chain alcohols in Saccharomyces cerevisiae and Candida utilis grown in continuous
culture on valine or ammonium as sole nitrogen source. journal of General Microbiology, v. 139,
n. 11, p. 2783-2792, 1993. ISSN 1350-0872.
DICKINSON, J. R.; SALGADO, L. E. J.; HEWLINS, M. J. E. The catabolism of amino acids to
long chain and complex alcohols in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry,
v. 278, n. 10, p. 8028, 2003. ISSN 0021-9258.
DORNELES, D. et al. Influence of the use of selected and non-selected yeasts in red wine
production. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 48, n. 5, p. 747-751, 2005. ISSN
1516-8913.
ESPINOSA VIDAL, E. Análise transcricional em Saccharomyces cerevisiae associado ao
metabolismo de substâncias organolépticas no âmbito da cachaça artesanal. 2008. p.77 Dissertação
de mestrado. Recife, UFPE.
ESPINOSA VIDAL, E. Influência da fonte de nitrogênio no perfil fermentativo, transcriptômico e
na produção de álcoois Superiores em Saccharomyces cerevisiae. 2012. p.87 (Doutorado).
Genética, UFPE, Recife.
ESPINOSA VIDAL, E. et al. Influence of nitrogen supply on the production of higher
alcohols/esters and expression of flavour-related genes in cachaça fermentation. Food Chemistry,
2012. ISSN 0308-8146.
FREER, S.; DIEN, B.; MATSUDA, S. Production of acetic acid by Dekkera/Brettanomyces yeasts
under conditions of constant pH. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 19, n. 1,
p. 101-105, 2003. ISSN 0959-3993.
FUJII, T.; YOSHIMOTO, H.; TAMAI, Y. Acetate ester production by Saccharomyces cerevisiae
lacking the ATF1 gene encoding the alcohol acetyltransferase. Journal of fermentation and
bioengineering, v. 81, n. 6, p. 538-542, 1996. ISSN 0922-338X.
34
GOMES, F. D. C. O. et al. Comparison between two selected Saccharomyces cerevisiae strains as
fermentation starters in the production of traditional cachaça. Brazilian Archives of Biology and
Technology, v. 52, n. 2, p. 449-455, 2009. ISSN 1516-8913.
GUERRA, J. et al. Genetic diversity of Saccharomyces cerevisiae strains during the 24 h
fermentative cycle for the production of the artisanal Brazilian cachaça. Letters in applied
microbiology, v. 33, n. 2, p. 106-111, 2001. ISSN 1472-765X.
HAZELWOOD, L. A. et al. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of
research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Applied and Environmental Microbiology, v.
74, n. 8, p. 2259, 2008. ISSN 0099-2240.
IBRAC, Instituto Brasileiro da Cachaça. Informações setoriais: mercado interno Disponível em
http://www.ibrac.net/index.php?option=com_content&view=article&id=46&Itemid=47>. Acesso
em: 20 de dezembro de 2012.
LAMBRECHTS, M.; PRETORIUS, I. Yeast and its importance to wine aroma-a review. South
African Journal of Enology and Viticulture, v. 21, 2000.
LEA, A. G.; PIGGOTT, J. R. Fermented beverage production. Springer, 2003. ISBN
0306477068.
LEITE, F. C. B. Fisiologia molecular da levedura Dekkera bruxellensis. 2012. 105
(DOUTORADO). UFPE, Recife, PE.
LEITE, F. C. B. et al. Quantitative aerobic physiology of the yeast Dekkera bruxellensis, a major
contaminant in bioethanol production plants. FEMS yeast research, 2012. ISSN 1567-1364.
LONGO, E. et al. Production of higher alcohols, ethyl acetate, acetaldehyde and other compounds
by 14 Saccharomyces cerevisiae wine strains isolated from the same region (Salnés, NW Spain).
World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 8, n. 5, p. 539-541, 1992. ISSN 0959-
3993.
LOUREIRO, V.; MALFEITO-FERREIRA, M. Spoilage yeasts in the wine industry. International
journal of food microbiology, v. 86, n. 1, p. 23-50, 2003. ISSN 0168-1605.
LURTON, L. et al. Influence of the fermentation yeast strain on the composition of wine spirits.
Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 67, n. 4, p. 485-491, 1995. ISSN 1097-0010.
MAGASANIK, B. Regulation of nitrogen utilization. The molecular and cellular biology of the
yeast Saccharomyces: gene expression, v. 2, p. 283–317, 1992.
MAGASANIK, B.; KAISER, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene, v.
290, n. 1-2, p. 1-18, 2002. ISSN 0378-1119.
MAGASANIK, B. Ammonia assimilation by Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic cell, v. 2, n. 5,
p. 827-829, 2003. ISSN 1535-9778.
35
MARTENS,H.; ISERENTANT, D.; VERACHTERT, H. Microbiological aspects of a mixed yeast -
Bacterial fermentation in the production of a special Belgian acidic ale. Journal of the Institute of
Brewing,v. 103, n. 2, p. 85-91, 1997.
MEILGAARD, M. Effects on flavour of innovations in brewery equipment and processing: a
review. Journal of the Institute of Brewing, v. 107, n. 5, 2001.
MENDES FERREIRA, A.; MENDES FAIA, A.; LEAO, C. Growth and fermentation patterns of
Saccharomyces cerevisiae under different ammonium concentrations and its implications in
winemaking industry. Journal of applied microbiology, v. 97, n. 3, p. 540-545, 2004. ISSN 1365-
2672.
MORAIS, P. et al. Short communication: characterization and succession of yeast populations
associated with spontaneous fermentations during the production of Brazilian sugar-cane
aguardente. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 13, n. 2, p. 241-243, 1997.
ISSN 0959-3993.
NYKÄNEN, L.; NYKÄNEN, I. Production of esters by different yeast strains in sugar
fermentations. Journal of the Institute of Brewing , v. 83, p. 30-31, 1977.
NYKÄNEN, L.; SUOMALAINEN, H. Aroma of beer, wine and distilled alcoholic beverages.
Springer, 1983. ISBN 902771553X.
O'CONNOR-COX, E.; INGLEDEW, W. Their Use by Brewing: A Review. ASBC J, v. 4, p. 102-
108, 1989.
OLIVEIRA, E. S. et al. Fermentation characteristics as criteria for selection of cachaça yeast.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 20, n. 1, p. 19-24, 2004. ISSN 0959-
3993.
OUGH, C.; BELL, A. Effects of nitrogen fertilization of grapevines on amino acid metabolism and
higher-alcohol formation during grape juice fermentation. American Journal of Enology and
Viticulture, v. 31, n. 2, p. 122-123, 1980. ISSN 0002-9254.
PALMER, A.; RENNIE, H. Ester control in high gravity brewing. J. Inst. Brew, v. 80, p. 447-454,
1974.
PASSOTH, V.; BLOMQVIST, J.; SCHNÜRER, J. Dekkera bruxellensis and Lactobacillus vini
form a stable ethanol-producing consortium in a commercial alcohol production process. Applied
and Environmental Microbiology, v. 73, n. 13, p. 4354-4356, 2007. ISSN 0099-2240.
PATARO, C. et al. Physiological characterization of yeasts isolated from artisanal fermentation in
an aguardente distillery. Revista de microbiologia, v. 29, n. 2, p. 104-108, 1998. ISSN 0001-3714
PATARO, C. et al. Yeast communities and genetic polymorphism of Saccharomyces cerevisiae
strains associated with artisanal fermentation in Brazil. Journal of applied microbiology, v. 89, n.
1, p. 24-31, 2001. ISSN 1365-2672.
36
PATARO, C. et al. Trehalose accumulation, invertase activity and physiological characteristics of
yeasts isolated from 24 h fermentative cycles during the production of artisanal Brazilian cachaça.
Brazilian Journal of Microbiology, v. 33, n. 3, p. 202-208, 2002. ISSN 1517-8382.
PEREIRA, L. F. et al. The physiological characteristics of the yeast Dekkera bruxellensis in fully
fermentative conditions with cell recycling and in mixed cultures with Saccharomyces cerevisiae.
Antonie van Leeuwenhoek, p. 1-11, 2012. ISSN 0003-6072.
PIGGOTT, J. R.; SHARP, R.; DUNCAN, R. E. B. The science and technology of whiskies.
Longman Scientific & Technical, 1989. ISBN 0582044286.
PINHEIRO, P. C.; LEAL, M. C.; DE ARAUJO, D. A. Origem, produção e composição química
da cachaça. Redes. v 1: 3-8 p. 2011.
PINHEIRO, S. H. M. Perfil da qualidade da cachaça do Ceará. Fortaleza UFCE, p.133. 1999.
(DISSERTAÇÃO DE MESTRADO)
PISARNITSKII, A. Formation of Wine Aroma: Tones and Imperfections Caused by Minor
Components (Review). Applied Biochemistry and Microbiology, v. 37, n. 6, p. 552-560, 2001.
ISSN 0003-6838.
ROMANO, P. et al. Function of yeast species and strains in wine flavour. International journal of
food microbiology, v. 86, n. 1-2, p. 169-180, 2003. ISSN 0168-1605.
ROMANO, A. et al. Growth and volatile compound production by Brettanomyces/Dekkera
bruxellensis in red wine. Journal of applied microbiology, v. 104, n. 6, p. 1577-1585, 2008. ISSN
1365-2672.
ROZPĘDOWSKA, E. et al. Parallel evolution of the make–accumulate–consume strategy in
Saccharomyces and Dekkera yeasts. Nature communications, v. 2, p. 302, 2011.
SILVA-FILHO, E. A. Caracterização genetica de populações de leveduras de destilaria de alccol
combustível para otimização do processo de fermentação. tese apresentada ao departamento de
Micologia. Doutorado Em Biologia De Fungos. UFPE-RECIFE. 2003
SUOMALAINEN, H.; LEHTONEN, M. The production of aroma compounds by yeast. Journal of
the Institute of Brewing. Institute of Brewing (Great Britain), v. 85, n. 3, p. 149, 1979. ISSN
0046-9750.
SZLAVKO, C. The influence of wort glucose levels on the formation of aromatic higher alcohols.
Journal of the Institute of Brewing , v. 80, p. 534-539, 1974.
TORREA, D. et al. Production of volatile compounds in the fermentation of chardonnay musts
inoculated with two strains of< i> Saccharomyces cerevisiae</i> with different nitrogen demands.
Food Control, v. 14, n. 8, p. 565-571, 2003. ISSN 0956-7135.
VAN DER WALT, J. Dekkera, a new genus of the Saccharomycetaceae. Antonie van
Leeuwenhoek, v. 30, n. 1, p. 273-280, 1964. ISSN 0003-6072.
37
VAN DIJKEN, J. P.; SCHEFFERS, W. A. Redox balances in the metabolism of sugars by yeasts.
FEMS microbiology letters, v. 32, n. 3, p. 199-224, 1986. ISSN 0378-1097.
VERSTREPEN, K. J. et al. Flavor-active esters: adding fruitiness to beer. Journal of bioscience
and bioengineering, v. 96, n. 2, p. 110-118, 2003. ISSN 1389-1723.
VILA NOVA, M. X. et al. Yeast species involved in artisanal cachaça fermentation in three stills
with different technological levels in Pernambuco, Brazil. Food microbiology, v. 26, n. 5, p. 460-
466, 2009. ISSN 0740-0020.
WIJSMAN, M. R. et al. Inhibition of fermentation and growth in batch cultures of the yeast
Brettanomyces intermedius upon a shift from aerobic to anaerobic conditions (Custers effect).
Antonie van Leeuwenhoek, v. 50, n. 2, p. 183-192, 1984. ISSN 0003-6072.
WOOLFIT, M. et al. Genome survey sequencing of the wine spoilage yeast Dekkera
(Brettanomyces) bruxellensis. Eukaryotic cell, v. 6, n. 4, p. 721-733, 2007. ISSN 1535-9778.
38
2. CAPÍTULO II: Manuscrito
Análise do perfil metabólico e organoléptico da levedura Dekkera bruxellensis visando à
elaboração de cachaças diferenciadas
Artigo a ser submetido à revista Food Microbiology
Fator de Impacto: 3,283
39
Análise do perfil metabólico e organoléptico da levedura Dekkera bruxellensis visando à
elaboração de cachaças diferenciadas
Denise Castro Silva 1, Esteban Espinosa Vidal
3, Marcos Antonio de Morais Junior
1,2.
1Núcleo Interdepartamental de Engenharia Metabólica,
2Departamento de Genética, Universidade
Federal de Pernambuco, Recife, PE 50760-901, Brasil. 3Laboratório de Bioprocessos, Centro de
Tecnologias Estratégicas do Nordeste, Recife PE 50740-540, Brasil
Correspondência:
Marcos A. Morais Jr
Departamento de Genética - Universidade Federal de Pernambuco
Av. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária 50.670-901 Recife PE Brasil
Phone/Fax: 00-55-81-21268522
E-mail: [email protected]
Web site: www.ufpe.br/nem
40
Resumo
A cachaça é uma bebida genuinamente brasileira que vem ganhando espaço no mercado
internacional de bebidas destiladas. Os compostos voláteis produzidos pelas leveduras durante o
processo fermentativo são responsáveis pelo sabor e aroma característico dessa bebida. A relevância
da levedura Dekkera bruxellensis no contexto fermentativo tem despertado o interesse em analisar a
viabilidade de utilização desta levedura para a produção de cachaça. Neste trabalho foi analisado o
perfil metabólico e a produção de compostos aromáticos pela levedura D. bruxellensis em ensaios
fermentativos simulando condições industriais, utilizando o caldo de cana-de-açúcar e meios
sintéticos com altas concentrações de nitrogênio na forma de sulfato de amônia ou aminoácidos
ramificados. Os resultados mostraram que, a suplementação do meio com aminoácidos ramificados
exerce uma forte influência no metabolismo e na produção de aromas da levedura D. bruxellensis.
Foi confirmado que essa levedura é capaz de assimilar fontes de nitrogênio alternativas como os
aminoácidos ramificados, porém com rendimentos fermentativos menores aos observados em meios
com fontes de nitrogênio preferenciais, como sulfato de amônio. Sendo assim, esses resultados
confirmam a influência da fonte de nitrogênio no metabolismo de alcoóis superiores e ésteres, e
ratificam a relevância de estudar mais a fundo as necessidades de nitrogênio para um melhor
controle dos aromas que são formados no processo fermentativo, bem como poderá abrir
perspectivas reais para a utilização industrial desta levedura na elaboração da cachaça.
Palavra-chave: cachaça, fermentação alcoólica, alcoóis superiores, ésteres voláteis, via de Ehrlich,
nitrogênio
41
Introdução
A cachaça é a mais tradicional bebida alcoólica produzida no Brasil. Esta bebida espirituosa
é produzida a partir da destilação do mosto fermentado da cana-de-açúcar. A fermentação ocorre
com a presença de alta concentração de leveduras (109células /mL, aprox. 10-12% cel. w/v), alta
pressão de dióxido de carbono, temperatura elevada (entre 30 e 33 ºC) e ausência de agitação do
meio (Espinosa Vidal et al., 2012). Durante o processo de fermentação alcoólica são produzidos
majoritariamente etanol e dióxido de carbono, e em menor quantidade outros metabólitos que são
responsáveis pelo sabor particular e característico desta bebida (Nykänen e Suomalainen, 1983;
Lambrechts e Pretorius, 2000). Dentre esses, os alcoóis superiores e os ésteres voláteis representam
o maior e mais importante grupo das substâncias responsáveis pelo sabor e aroma floral e frutado
altamente desejados nas bebidas alcoólicas (Verstrepen et al., 2003).
Os alcoóis superiores podem ser formados a partir do anabolismo dos carboidratos através
do piruvato ou a partir do catabolismo dos aminoácidos aromáticos e de cadeia ramificada pela
chamada via de Ehrlich (Hazelwood et al., 2008). Entre os alcoóis superiores com propriedades
organolépticas os mais importantes são: álcool isoamílico (3-metil-1-butanol) derivado da leucina;
álcool amílico ativo (2-metil-1-butanol) derivado da isoleucina; isobutanol (2-metil-1-propanol)
derivado da valina; triptofol (3-indole etil álcool) derivado do triptofano; tirosol derivado da
tirosina; feniletanol (2-feniletanol) derivado da fenilalanina (Boulton e Quain, 2001). Já os ésteres
de acetato são formados em reações de trans-esterificação entre um álcool e um ácido carboxílico
(Meilgaard, 2001). O principal éster encontrado na cachaça é o acetato de etila, responsável pela
formação de aroma tipo solvente (Pinheiro, 1999). A quantidade desses compostos depende de
múltiplos fatores, dos quais se destacam as condições de fermentação, a natureza da fonte de
nitrogênio e a cepa de levedura empregada (Pisarnitskii, 2001; Carrau et al., 2008; Hazelwood et
al., 2008).
Durante a elaboração da cachaça artesanal utilizando fermentos caipiras ou naturais no
processo fermentativo, ocorre uma sucessão de espécies de leveduras, fungos e bactérias que em
conjunto podem definir a qualidade do produto final a partir dos metabólitos produzidos, que
podem ser desejáveis ou indesejáveis ao processo (Pataro et al., 1998; Vila Nova et al., 2009).
Muitas leveduras têm sido testadas para a produção de bebidas fermentadas pela capacidade de
produção de etanol e de substâncias sensoriais. Por exemplo, a levedura da espécie Dekkera
bruxellensis é utilizada na produção de cervejas Belgas do tipo Lambic (Martens et al, 1997),
42
embora sua principal reputação é a de contaminar destilarias de álcool combustível e vinícolas em
todo o mundo, estando associada à queda do rendimento em etanol e a mudanças no aroma e sabor
dos vinhos. (Loureiro e Malfeito-Ferreira, 2003; De Souza Liberal et al., 2007; Basílio et al., 2008).
Entretanto, esse conceito tem mudado, pois já existem trabalhos mostrando que isolados
industriais dessa levedura produzem maiores rendimentos de etanol, apesar de ter uma menor
produtividade, quando comparada a S. cerevisie, que é a levedura normalmente usada em processos
fermentativos (De Souza Liberal et al., 2007; Passoth et al., 2007; Blomqvist et al., 2010).
Com relação as propriedades fermentativas, a espécie D. bruxellensis é capaz de assimilar
uma grande variedade de fontes de carbono e nitrogênio. Dentre as fontes de carbono, estão os
monossacarídeos glicose, frutose e galactose, e dissacarídeos, como sacarose, maltose, celobiose e
trealose. As fontes de nitrogênio assimiláveis por esta levedura são: amônia, nitrato, arginina e
prolina (Conterno et al., 2006). O fato de D. Bruxellensis ter a capacidade de assimilar nitrogênio
na forma de nitrato pode conferir a esta levedura uma vantagem adaptativa no processo de
fermentação industrial de caldo de cana quando comparada a S. cerevisiae (De Barros Pita et al.,
2011).
Considerando a importância da cepa de levedura empregada na produção da cachaça e a
relevância da levedura D. bruxellensis no contexto fermentativo, foi despertado o interesse em
analisar a viabilidade de utilização desta levedura como fermento para a produção de cachaça com
qualidades sensoriais diferenciadas. Deste modo, neste trabalho foi determinado o perfil metabólico
da levedura D. bruxellensis GDB 248 em meios naturais e sintéticos com diferentes fontes de
nitrogênio e em condições similares a industriais, verificando a influência das diferentes fontes de
nitrogênio na produção de compostos importantes para a produção de aroma e sabor nas bebidas
alcoólicas. Sendo assim, este estudo ampliou o conhecimento sobre o comportamento fisiológico da
levedura D. bruxellensis GDB 248 em função das diferentes fontes de nitrogênio, bem como poderá
abrir perspectivas para a utilização industrial desta levedura na elaboração da cachaça.
Materiais e métodos
Linhagem da levedura e condições de pré-cultura
A cepa industrial da D. bruxellensis GDB 248 (De Barros Pita et al., 2011) foi utilizada
neste estudo. A linhagem foi mantida em meio YPD (1% de extrato de levedura, 2% de glicose, 2%
de peptona bacteriológica e 2% de agar) com repique constante para novas placas para manter as
43
colônias de células frescas. As células foram inoculadas em frascos de agitação de 500 ml contendo
150 ml de YPS (1% de extrato de levedura, 2% de sacarose e 2% de peptona bacteriológica) para
pré-cultura. O meio foi suplementado com ácido nalidíxico (50 mg/mL) e ampicilina (50 ug/ml)
para evitar a contaminação bacteriana. As pré-culturas foram incubadas a 30 º C e 160 rpm por 72
h.
Meios de cultura
Os ensaios de fermentação foram realizados em meios com diferentes fontes de nitrogênio.
O meio industrial utilizado foi o caldo de cana-de-açúcar (SCJ) adquirido de produtores locais.
Depois da cana-de-açúcar ser esmagada, o mosto extraído foi mantido em gelo e transportado para o
laboratório onde foi clarificado, esterilizados e armazenados, conforme descrito por Espinosa Vidal
et al. (2012). O meio YPS para fermentação apresenta a mesma composição descrita acima, com o
conteúdo de sacarose aumentado para 12% (m/v). O meio mineral MMS foi composto de YNB a
6,7 g/L com sulfato de amônio 5 g/l e sacarose a 120 g/L de sacarose. O meio sintético MMS+AA
foi composto de YNB a 1,7 g/L sem aminoácidos e sulfato de amónio, suplementado com sacarose
a 120g/L e uma mistura de leucina, isoleucina e valina a 0,40 g/L de nitrogênio cada como fontes de
nitrogênio. A ausência do íon sulfato foi compensada pela adição de uma quantidade equimolar de
sulfato de potássio (Tabela1). Todos os meios de fermentação foram suplementados com ácido
nalidíxico (50 mg / mL) e ampicilina (50 ug / ml) para evitar a contaminação bacteriana.
Ensaio de fermentação
Para cada ensaio de fermentação as células do pré-cultivo foram centrifugadas em falcons de
50 mL até se obter a biomassa de 6 g de células em peso úmido, em seguida foi complementado
com o meio de fermentação até 50 mL. Estas culturas foram transferidas para erlenmeyer de 125 ml
mL, resultando na concentração final de 120 g de células/L (109cels/ml). Os ensaios de fermentação
foram realizados em replicatas biológicas independentes a 32 º C, semi-anaerobióse, sob suave
agitação (o suficiente para prevenir a sedimentação de células). A densidade de células foi medida
por contagem de células utilizando um hemocitómetro e o nível de açúcar foi monitorizado a cada 2
h por meio de um refractómetro manual e expresso como º Brix. Amostras de 1,5 mL foram
retiradas no início, durante a fermentação (2,4,6,8,10,12) horas e no tempo de 24 h (tempo final)
como replicatas técnicas, e centrifugadas a 11000 rpm durante 1 min. a 4 º C em eppendorf. O
44
sobrenadante foi armazenado a -20 º C para posterior análise de metabolitos por cromatografia
líquida de alta performance (HPLC) e cromatografia gasosa (GC).
Viabilidade celular
A viabilidade celular foi determinada por inspeção das células coradas com azul de metileno
no microscópio óptico utilizando Câmara de Neubauer (Pereira et al., 2012)
Análise química
Determinação de sacarose, glicose, frutose, glicerol, acetato e etanol
A quantificação dos açúcares (glucose, frutose e sacarose), acetato, etanol e glicerol foi
realizada por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizando uma coluna de permuta
iônica, HPX-87H (BioRad, EUA) com temperatura do forno de 35 ° C, com 5 mM de H2SO4 como
fase móvel e fluxo a 600 µl/min. O volume de amostra injetado foi 20 µL. Os compostos foram
identificados considerando os tempos de retenção relativos e quantificados com base na comparação
direta utilizando uma curva padrão. Os valores representam a média de duas repetições biológicas
independente com, pelo menos, duas repetições técnicas. A análise dos dados determinou que o erro
na medição foi inferior a 10% em todos os casos.
Determinação de acetato de etila, 1-propanol, isobutanol, butanol, álcool amílico e isoamílico
A concentração dos compostos no meio foi determinada por cromatografia gasosa (GC),
utilizando uma coluna Restek (60 mx 0,32 mm x 1,0 mm) com hidrogênio como gás de transporte.
A temperatura de injeção foi de 250 º C, a temperatura inicial do forno de 40 ° C (6,5 min) a
temperatura final de 103 ° C. O fluxo de gás de transporte de 7 mL/min e a temperatura do detector
de 90 º C. O volume de amostra injetada foi de 10 µl. Todos os compostos foram normalizados com
o padrão interno (2-pentanol), identificadas pelos seus tempos relativos de retenção e quantificados
por meio de uma curva padrão feita com cada composto individual. Os valores representam a média
de duas repetições biológicas independente com duas repetições técnicas. A análise dos dados
determinou que o erro na medição foi inferior a 10%.
45
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise dos parâmetros fermentativos
A viabilidade de utilização da levedura D. bruxellensis GDB 248 para a produção de
cachaça foi avaliada a partir do perfil metabólico e organoléptico dessa levedura a partir de
fermentações em meios com diferentes fontes de nitrogênio em condições similares às industriais.
Quando se avalia a evolução do crescimento celular, em todos os meios é perceptível o aumento da
biomassa (Figura 1) e manutenção da viabilidade celular, com exceção do meio MMS + AA
(Tabela 1). O maior aumento da biomassa observado foi no meio MMS ( 98,5%), seguido pelo
meio SCJ, que teve um crescimento de 88,5% quando comparara a biomassa inicial (Figura 1). Vale
ressaltar que os dois meios continham amônio como fonte de nitrogênio.
46
Tabela 1. Viabilidade, composição dos meios de cultura e parâmetros fermentativos em ensaios utilizando a linhagem GDB 248. (N = nitrogênio,
FAN = free amino nitrogen)
adeterminação com nihydrina neste trabalho.
bde Barros Pita et al, 2012.
cAnnuar, et al, 2007.
47
Figura 1. Variação da biomassa de Dekkera bruxellensis durante os experimentos de fermentação
em meio natural de caldo de cana (SCJ), no meio completo (YPS) e nos meios minerais com
suplemento de sulfato de amônio (MMS) e com suplemento de aminoácidos ramificados
(MMS+AA). Os valores representam as médias de dois ensaios biológicos, com replicatas técnicas
para cada ponto.
A elevada produção de biomassa por D.bruxellensis no meio com sacarose correspondem
com os dados relatados anteriormente pelo nosso grupo em cultivos aeróbicos (Leite et al., 2012) e
em experimentos de fermentação com caldo de cana (De Souza et al., 2012; Pereira et al., 2012).
Isto reforça o fato de que a levedura D. bruxellensis apresenta maior tendência para produção de
biomassa quando comparado a S. cerevisiae (De Souza et al., 2012; Pereira et al., 2012).
Apesar do maior crescimento celular, verificou-se alta concentração de açúcar residual no
meio MMS em relação aos outros meios (Tabela 1). O consumo da sacarose foi maior no meio SCJ
(Figura 2A), sendo toda a sacarose consumida em menos de 24 h de fermentação, fato não
observado para os meios de laboratório. Isso pode ter sido influenciado pela presença do nitrato no
caldo de cana (Tabela 1). O nitrato é uma fonte de nitrogênio assimilável por D. bruxellensis e atua
aumentando a velocidade de crescimento celular, o consumo de sacarose e revertendo o efeito
“Custer” (De Barros Pita et al., 2011; Pereira et al., 2012; Galafassi et al., 2013). O imediato
consumo de sacarose no meio SCJ pela levedura D. bruxellensis GDB 248 (Figura 2A) reafirma a
habilidade dessa levedura de se adaptar ao processo industrial, como previamente reportado (De
Souza Liberal et al., 2007), embora o consumo de sacarose nos meios sintéticos tenha sido
consideravelmente mais lento quando comparado ao meio natural SCJ. A maior concentração de
açúcar residual foi verificada no meio MMS+AA, 53% em relação à sacarose inicial, e teve como
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 5 10 15 20 25
1
09x c
el/
mL
Tempo (h)
48
resultado o baixo crescimento celular, apenas 12 % em relação à biomassa inicial, além de uma
significante perda da viabilidade celular em relação aos outros meios (Figura 1 e Tabela 1). Como
consequência, neste meio foi observada a menor produção de etanol, menor rendimento e menor
produtividade quando comparada aos outros meios com diferentes fontes de nitrogênio (Tabela 1).
Desta maneira podemos concluir que a linhagem de levedura GDB 248 apresenta um menor
desempenho fermentativo quando cresce com aminoácidos ramificados como fonte de nitrogênio
(Tabela1). Segundo O’connor-Cox e Ingledew (1989), a baixa assimilação do nitrogênio é um dos
principais fatores responsáveis pelo declínio da atividade fermentativa pelas células de leveduras.
O rápido consumo de sacarose no meio SCJ favoreceu a maior produtividade de etanol nessa
condição (Figura 2A e Tabela 1). Entretanto o rendimento final em etanol foi 34% menor em
relação ao meio MMS, que apresentou o maior rendimento (0,43 g/g) dentre todos os meios
analisados (Tabela 1). Por outro lado, no meio SCJ observa-se a maior produção de acetato quando
comparado com os outros meios (Figura 2C). Isto pode explicar o baixo rendimento em etanol das
células no meio SCJ pelo desvio de carbono no ponto de ramificação do acetaldeído. Mostrando
uma tendência ao metabolismo oxidativo no meio SCJ. Neste caso, a presença de nitrato no caldo
de cana aumentaria a demanda por NADH, o qual seria formado a partir da oxidação do acetaldeído
a acetato. A hipótese do metabolismo oxidativo induzido pelo nitrato tem sido comprovada
recentemente (De Barros Pita et al., 2013; Galafassi et al., 2013). Nos meios de laboratório MMS e
YPS não haveria esta demanda resultando, portanto a produção de acetato, não ultrapassou 1,23
g/L (Figura 2C e Tabela 1).
A produção de acetato esta principalmente restrita aos estágios finais da fermentação em
todos os meios com diferentes fontes de nitrogênio (Figura 2C). A formação de acetato está
associada ao crescimento aeróbio de D. bruxellensis, sendo a cadeia respiratória ativada para a re-
oxidação dos co-fatores formados durante a produção deste metabólito (Blomqvist et al., 2010).
Resultados anteriores do nosso grupo em cultivos aeróbios mostraram a alta eficiência da via de
biossíntese de acetato em D.bruxellensis, tornando-se o principal produto do metabolismo da
sacarose glicose e frutose (Leite et al., 2012). Entretanto, quando as células são cultivada com
nitrato como única fonte de nitrogênio não há produção de metabólitos de fermentação (etanol,
acetato e glicerol). Portanto, a maior produção de acetato no meio SCJ corrobora o metabolismo de
co-assimilação de amônio e de nitrato presente neste substrato (De Barros Pita et al., 2011) bem
como o efeito supressor metabólico que a amônia tem sobre os efeitos negativos do nitrato do meio
(De Barros Pita et al., 2013). Devido a essa preferência pela via de acetato, uma pequena
quantidade de oxigênio no meio pode ser suficiente pode disparar o metabolismo oxidativo nesta
49
levedura. Não foi detectado acetato na fermentação com o meio mineral MMS+AA possivelmente
devido ao declínio da atividade fermentativa (Figura 2C e Tabela 1).
Figura 2. Perfil fermentativo da linhagem industrial GDB 248 de D. bruxellensis nos meios SCJ,
YPS, MMS e MMS + AA. O perfil metabólico de consumo de sacarose (painel A), produção de
etanol (painel B), acetato (painel C) e glicerol (painel D) são apresentados.
A produção de glicerol esta associada à produção de biomassa e é um subproduto da
fermentação (Blonquevist et al.,, 2010). As leveduras produzem glicerol sob limitação de oxigênio,
a fim de re-oxidar o NADH produzido durante os processos de oxidação (Van Dijken e Scheffers,
1986). O NADH é gerado não apenas pela via glicolítica, mas também pela biossíntese de
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25
Sa
ca
ro
se (
g/L
)
Tempo (h)
A
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 5 10 15 20 25
Eta
no
l (g
/L)
Tempo (h)
B
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 5 10 15 20 25
Gli
cero
l (g
/L)
Tempo (h)
D
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0 5 10 15 20 25
Aceta
to (
g/L
)
Tempo (h)
C
50
aminoácidos. Em condições aeróbicas, a reação mais importante para a re-oxidação deste NADH
em excesso é a produção de glicerol. Alguns autores afirmam que leveduras do grupo Dekkera/
Brettanomyces não tem capacidade de produzir glicerol, e esta incapacidade levaria ao efeito
Custer, isto é, a inibição temporária de fermentação em condições de anaerobiose (Wijsman et al.,
1984). No entanto, alguns trabalhos tem relatado a produção de glicerol por células de D.
bruxellensis, mesmo que em menor proporção do que aquelas encontradas em cultivos de S.
cerevisiae (Aguilar Uscanga et al., 2003; De Souza Liberal et al., 2007; Blomqvist et al., 2010; De
Souza et al., 2012; Pereira et al., 2012). Este fato foi evidenciado no presente trabalho (Figura 2D).
O rendimento de glicerol pela linhagem GDB 248 nos meios de laboratório (YPS e MMS) foi
superior a linhagem CBS 11269 (Tabela 1; Blomqvist et al., 2010). Pode-se inferir que a linhagem
utilizada no presente trabalho possui maior capacidade de re-estabelecer o equilíbrio redox das
células. O baixo rendimento do glicerol no meio natural SCJ em relação aos meios MMS e YPS
(Tabela 1 e Figura 2D) pode ser explicado também pela presença do nitrato neste meio natural, já
que o NADH proveniente da oxidação do acetaldeido a acetato será reoxidado durante a redução do
nitrato a nitrito.
Análise dos compostos sensoriais
A Figura 3 e Tabela 2 mostram o resultado da concentração de alguns dos metabolitos de maior
importância sensorial produzidos pela levedura D. bruxellensis em diferentes fontes de nitrogênio.
Em geral, o perfil de concentração dos compostos voláteis mostrou-se diferencialmente distintos
entre meios analisados com cinéticas de produção exponencial em função do tempo (Fig. 3).
Tabela 2. Concentração final e produtividade máxima (Pmax) dos compostos voláteis produzidos
por Dekkera bruxellensis durante a fermentação de meio natural SCJ, do meio completo YPS e nos
meios minerais MMS e MMS+AA.
51
Figura 3. Cinética de produção de acetato de etila (painel A), propanol (painel B), isobutanol
(painel C) e da soma de álcool amílico e isoamílico - fração AI (Painel D) pela linhagem GDB 248
durante a fermentação dos meios SCJ, YPS, MMS e MMS+AA
Especificamente em relação às alcoóis superiores derivados do catabolismo da leucina,
isoleucina e valina, como era previsto, observou-se uma maior produção no meio suplementado
com os aminoácidos ramificados como única fonte de nitrogênio (MMS+AA). Neste meio, o álcool
superior produzido majoritariamente foi a soma de álcool amílico activo e isoamílico (fração AI)
(248 ug/L). A produção de AI foi similar nos meios YPS, MMS e SCJ, resultando em uma média de
18,6 ug/L, 11 vezes menor quando comparado ao meio MMS+AA (Tabela 2 e Figura 3D). O perfil
de produção do álcool amílico e isoamílico foi apresentado como a soma dos dois compostos (AI),
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
Aceta
to d
e e
tila
(µ
g/L
)
Tempo (h)
A
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25
1-P
ro
pa
no
l (µ
g/L
)
Tempo (h)
B
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5 10 15 20 25
Iso
bu
tan
ol (µ
g/L
)
Tempo (h)
C
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20 25
Fra
çã
o A
I (µ
g/L
)
Tempo (h)
D
52
já que não foi possível identificar estes isômeros estruturais separadamente nas condições de GC
empregadas. Interessantemente, empregando como referência o meio natural SCJ, pode-se observar
que a produção de AI foi 12 vezes menor em relação ao produzido pela levedura S.cerevisiae ao
final da fermentação nas mesmas condições de cultura (Espinosa Vidal, et al. 2012).
Ao mesmo tempo, o isobutanol derivado do metabolismo de valina, foi o terceiro composto
majoritariamente produzido no meio MMS+AA (36 ug/L) (Figura 3C), em média 2vezes mais que
nos outros meios analisados. Entretanto, de maneira similar a AI, a produção de Isobutanol pela D.
bruxellesnsis foi quase 17 vezes menor, quando comparada a produção desse álcool por S.
cerevisiae ao final da fermentação e nas mesmas condições de cultivo (Espinosa Vidal et al, 2012).
Pode-se observar que, apesar das concentrações iniciais de nitrogênio serem iguais para cada
aminoácido (0,40 g/L de N), no meio MMS+AA, a produção final de AI, provenientes do
catabolismo da leucina e da isoleucina, foi quase sete vezes maior do que a produção final de
isobutanol, proveniente do metabolismo da valina (Tabela 2). Pode-se perceber também que a
produção do álcool isoamílico no meio MMS+AA começou no início da fermentação, enquanto a
produção de isobutanol, só iniciou-se a partir de 8 horas da fermentação (Figura 3C e D). Todos
estes dados em conjunto mostram que a levedura D. bruxellensis e capaz de incorporar aminoácidos
ramificados como fonte de nitrogênio, porem com diferentes taxas assimilativas. Isto poderia ser
explicado pelos diferentes graus de afinidade das enzimas ceto-acidos decarboxilases. No contexto
da levedura S. cerevisiae, isso é explicado pelo fato de que as descarboxilases apresentam maior
afinidade pelo α-cetoisocaproato proveniente do catabolismo da leucina, enquanto menor afinidade
pelo α-cetoisovalerato proveniente da valina, e muito baixa afinidade pelo α-ceto-β-metilvalerato
proveniente da isoleucina (Vuralhan et al., 2003). Como isso, é possível supor que as propriedades
enzimáticas das descarboxilases de D. bruxellensis sejam semelhantes às de S. cerevisiae. Podendo
também explicar a menor produção do isobutanol no meio MMS+AA. Em S. cerevisiae a piruvato
descarboxilase codificada pelo gene PDC1 parece ser a principal enzima na descarboxilação dos -
cetoácidos provenientes do catabolismo dos aminoácidos ramificados (Ter Schure et al., 1998),
embora a enzima codificada pelo gene ARO10 (fenilpiruvato descarboxilase) apresente grande
atividade para esses substratos (Vuralhan et al., 2005). Surpreendentemente foi detectada a presença
de dois genes ARO10 no genoma de D. bruxellensis, fato que não ocorre em outros
hemiascomicetos (De Souza Liberal et al., 2012). Entretanto, esses dois genes apresentam-se
reprimidos ou com expressão reduzida quando as células de D. bruxellensis são cultivadas na
presença de leucina ou valina como fonte de nitrogênio (De Souza Liberal et al., 2012). Isto explica
53
o fato de que a produção desses compostos é menor em D. bruxellensis (Figura 3D) do que em S.
cerevisiae (Espinosa Vidal et al., 2012).
Outro aspecto importante que não se pode descartar na formação de alcoóis superiores é a sua
possível contribuição na manutenção do equilíbrio redox das células juntamente com o glicerol. Na
formação de glicerol, assim como na redução do aldeído de cadeia ramificada para o álcool fúsel na
via de Erlich, envolve a oxidação do NADH a NAD+
(Van Dijken e Scheffers, 1986; Lilly et al.,
2006). Desta forma, a produção de alcoóis superiores seria um nível a mais de ajuste fino para
regular o estado redox das células (Boulton e Quain, 2001).
Em relação ao escasso crescimento e à perda da viabilidade celular apresentado no meio
MMS+AA, poderia ser resultado da menor eficiência na assimilação de aminoácidos ramificados
em relação ao amônio, possivelmente devido a uma menor quantidade de transportadores
específicos ou a uma menor velocidade de assimilação devido ao maior tamanho estrutural dos
aminoacidos ramificados, somado a um gasto energético maior do transporte. Estudos similares
com aminoácidos aromáticos apresentam linhagem GDB 248 com capacidade diferencial de
crescimento em meio mineral suplementado com esses aminoácidos (dados não apresentados),
entretanto esse meio gera escasso crescimento em S. cereviseae possivelmente devido aos mesmos
fatores citados acima (Espinosa Vidal, 2012). No mesmo sentido, este menor crescimento celular
poderia associar-se à sensibilidade de D. bruxellensis aos efeitos tóxicos produzidos pelos álcoois
superiores (Tabela 2 e Figura 1). Alguns estudos já mostram que em células de S. cerevisiae o
álcool isoamílico induz a formação de pseudohifas e reduz o crescimento celular (Martínez-Anaya
et al., 2003; Kern et al., 2004). Um maior número de análises necessita ser realizada para elucidar
estes diferentes comportamentos fermentativos.
Em relação aos ésteres de acetato, foi observada uma alta taxa de produção do acetato de etila as
primeiras 7 h da fermentação no meio SCJ (112 ug/L), bem como a maior produtividade em relação
aos outros meios (Tabela 2). Neste meio, novamente observa-se maior produção de acetato de etila
por células de S. cerevisiae (Espinosa Vidal et al., 2012), embora a produção desse composto em D.
bruxellensis seja metade do que é produzido por S. cerevisiae, nas mesmas condições. Por outro
lado a menor produção desse éster foi no meio MMS+AA, que também apresentou a menor
produtividade (0,75 µg/H.L), cerca de seis vezes menor quando comparada com a produtividade do
meio SCJ (Tabela 2 e Figura 3 B). Os ésteres são formados pela condensação entre um álcool, nesse
caso o etanol, e o acetil-CoA e a concentração final deste éster durante a fabricação de cerveja por
células de S. cerevisiae está relacionada ao equilíbrio das atividades enzimáticas de acil-transferases
e esterases (Fukuda et al., 1998). Essa menor produção pelas células de D. bruxellensis precisa ser
54
estudada, mas provavelmente sua tendência fisiológica para o metabolismo oxidativo deva induzir a
maior produção de esterases, deslocando esse equilíbrio para as reações de quebra dos ésteres nos
seus componentes. Entretanto, a menor disponibilidade de acetil-CoA citosólico, como sugerido
pela grande produção de acetato pelas células de D. bruxellensis (Figura 2C), para as reações de
transcetilação seja uma hipótese mais direta.
A cinética de produção do 1-propanol foi similar á produção de acetato de etila, porem em
concentrações 10 vezes menores (Figura 3 B). A produção acetato de etila e propanol foi escassa o
nula no meio MMS+AA. Também, não foi detectada a produção de álcool n-butílico em nenhum
dos ensaios fermentativos. Diferente dos alcoóis superiores derivados do catabolismo dos
aminoácidos, o 1-propanol é formado pela condensação do ácido pirúvico e do Acetil-CoA no
metabolismo principal (Nykänen e Suomalainen, 1983). A linhagem GDB 248 produziu maiores
concentrações de 1-propanol nos meios com baixas concentração de nitrogênio (como no meio SCJ
com 171 mg N/L), e concentrações menores quando tinha maior nitrogênio presente no meio (como
no meio YPS com 5500 mg N/L). Esse mecanismo inverso na produção do 1-propanol em relação à
disponibilidade de nitrogênio já também foi observado anteriormente em linhagens de leveduras S.
cerevisiae no contexto industrial da produção do vinho (Carrau et al., 2008).
Como mostra a Tabela 2, a produção de compostos voláteis entre os meios com amônia como
fonte de nitrogênio foi, em geral, maior no meio SCJ, embora a concentração de amônia no meio
MMS tenha sido seis vezes maior. Esse resultado é similar ao encontrado na produção de vinho e no
mosto fermentado de caldo de cana, onde a produção de alcoóis superiores diminuiu com o aumento
da concentração total de nitrogênio (Carrau et al., 2008; Espinosa Vidal et al., 2012).
Conclusão
No presente trabalho, procurou-se analisar o comportamento fisiológico da levedura D.
bruxellensis, bem como identificar a produção dos compostos voláteis com características
organolépticas em função das diferentes fontes de nitrogênio. Com base nos resultados obtidos
neste trabalho, que simula as condições industriais, a suplementação do meio com aminoácidos
ramificados exerce uma forte influência no metabolismo e na produção de aromas da levedura D.
bruxellensis. Como era previsível por estudos anteriores, foi comprovado que D. bruxellensis e
capaz de assimilar fontes de nitrogênio alternativas como os aminoácidos ramificados, porém com
rendimentos fermentativos menores aos observados em meios com fontes de nitrogênio
55
preferenciais, como sulfato de amônio. Provavelmente isto se deva a uma menor eficiência de
assimilação dos aminoácidos ramificados ou a um efeito inibidor do crescimento por parte dos
alcoóis superiores. Baseado na capacidade das células de D. bruxellensis em produzir compostos
sensoriais e na alta adaptabilidade dessa levedura as condições industriais, o presente estudo abre
portas para uma futura aplicação industrial dessa levedura como fermento para a produção de
cachaça.
Agradecimentos
O presente estudo foi parcialmente financiado com recursos dos programas CAPES-COFECB
(nº99/2008) e PRONEM/CNPq-FACEPE e se insere no contexto das atividades da Rede de
Pesquisa, desenvolvimento e inovação na produção de etanol do estado de Pernambuco e do
programa BIOFLAVOR (ação COST-EU/2008).
Referências
AGUILAR USCANGA, M.; DELIA, M.-L.; STREHAIANO, P. Brettanomyces bruxellensis: effect
of oxygen on growth and acetic acid production. Applied microbiology and biotechnology, v. 61,
n. 2, p. 157-162, 2003. ISSN 0175-7598.
BASÍLIO, A. C. et al. Detection and identification of wild yeast contaminants of the industrial fuel
ethanol fermentation process. Current microbiology, v. 56, n. 4, p. 322-326, 2008. ISSN 0343-
8651.
BLOMQVIST, J. et al. Fermentation characteristics of Dekkera bruxellensis strains. Applied
microbiology and biotechnology, v. 87, n. 4, p. 1487-1497, 2010. ISSN 0175-7598.
BOULTON, C.; QUAIN, D. Brewing yeast and fermentation. Wiley Online Library, 2001.
CARRAU, F. M. et al. Production of fermentation aroma compounds by Saccharomyces cerevisiae
wine yeasts: effects of yeast assimilable nitrogen on two model strains. FEMS yeast research, v. 8,
n. 7, p. 1196-1207, 2008. ISSN 1567-1364.
CONTERNO, L. et al. Genetic and physiological characterization of Brettanomyces bruxellensis
strains isolated from wines. American Journal of Enology and Viticulture, v. 57, n. 2, p. 139-
147, 2006. ISSN 0002-9254.
56
DE BARROS PITA, W. et al. The ability to use nitrate confers advantage to Dekkera bruxellensis
over S. cerevisiae and can explain its adaptation to industrial fermentation processes. Antonie van
Leeuwenhoek, p. 1-9, 2011. ISSN 0003-6072.
DE BARROS PITA, W. et al. The influence of nitrate on the physiology of the yeast Dekkera
bruxellensis grown under oxygen limitation. Yeast, 2013. ISSN 1097-0061.
DE SOUZA LIBERAL, A. et al. Identification of Dekkera bruxellensis as a major contaminant
yeast in continuous fuel ethanol fermentation. Journal of applied microbiology, v. 102, n. 2, p.
538-547, 2007. ISSN 1365-2672.
DE SOUZA LIBERAL, A. T. et al. The yeast Dekkera bruxellensis genome contains two orthologs
of the ARO10 gene encoding for phenylpyruvate decarboxylase. World Journal of Microbiology
and Biotechnology, p. 1-6, 2012. ISSN 0959-3993.
DE SOUZA, R. B. et al. The consequences of Lactobacillus vini and Dekkera bruxellensis as
contaminants of the sugarcane-based ethanol fermentation. Journal of industrial microbiology &
biotechnology, p. 1-6, 2012. ISSN 1367-5435.
ESPINOSA VIDAL, E. Análise transcricional em Saccharomyces cerevisiae associado ao
metabolismo de substâncias organolépticas no âmbito da cachaça artesanal. 2008. 77 Dissertação de
mestrado. Recife, UFPE.
ESPINOSA VIDAL, E. et al. Influence of nitrogen supply on the production of higher
alcohols/esters and expression of flavour-related genes in cachaça fermentation. Food Chemistry,
2012. ISSN 0308-8146.
FUKUDA, K. et al. Balance of activities of alcohol acetyltransferase and esterase in
Saccharomyces cerevisiae is important for production of isoamyl acetate. Applied and
Environmental Microbiology, v. 64, n. 10, p. 4076, 1998. ISSN 0099-2240.
GALAFASSI, S. et al. Utilization of nitrate abolishes the" Custers effect" in Dekkera bruxellensis
and determines a different pattern of fermentation products. Journal of industrial microbiology &
biotechnology, 2013. ISSN 1476-5535.
HAZELWOOD, L. A. et al. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of
research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Applied and Environmental Microbiology, v.
74, n. 8, p. 2259, 2008. ISSN 0099-2240.
KERN, K. et al. Isoamyl alcohol‐induced morphological change in Saccharomyces cerevisiae
involves increases in mitochondria and cell wall chitin content. FEMS yeast research, v. 5, n. 1, p. 43-49, 2004. ISSN 1567-1364.
LAMBRECHTS, M.; PRETORIUS, I. Yeast and its importance to wine aroma-a review. South
African Journal of Enology and Viticulture, v. 21, 2000.
LEITE, F. C. B. et al. Quantitative aerobic physiology of the yeast Dekkera bruxellensis, a major
contaminant in bioethanol production plants. FEMS yeast research, 2012. ISSN 1567-1364.
57
LILLY, M. et al. The effect of increased yeast alcohol acetyltransferase and esterase activity on the
flavour profiles of wine and distillates. Yeast, v. 23, n. 9, p. 641-659, 2006. ISSN 0749-503X.
LOUREIRO, V.; MALFEITO-FERREIRA, M. Spoilage yeasts in the wine industry. International
journal of food microbiology, v. 86, n. 1, p. 23-50, 2003. ISSN 0168-1605.
MARTÍNEZ-ANAYA, C.; DICKINSON, J. R.; SUDBERY, P. E. In yeast, the pseudohyphal
phenotype induced by isoamyl alcohol results from the operation of the morphogenesis checkpoint.
Journal of cell science, v. 116, n. 16, p. 3423-3431, 2003. ISSN 0021-9533.
MARTENS,H.; ISERENTANT, D.; VERACHTERT, H. Microbiological aspects of a mixed yeast -
Bacterial fermentation in the production of a special Belgian acidic ale. Journal of the Institute of
Brewing,v. 103, n. 2, p. 85-91, 1997.
MEILGAARD, M. Effects on flavour of innovations in brewery equipment and processing: a
review. J. Inst. Brew, v. 107, n. 5, 2001.
NYKÄNEN, L.; SUOMALAINEN, H. Aroma of beer, wine and distilled alcoholic beverages.
Springer, 1983. ISBN 902771553X.
O'CONNOR-COX, E.; INGLEDEW, W. Their Use by Brewing: A Review. ASBC J, v. 4, p. 102-
108, 1989.
PASSOTH, V.; BLOMQVIST, J.; SCHNÜRER, J. Dekkera bruxellensis and Lactobacillus vini
form a stable ethanol-producing consortium in a commercial alcohol production process. Applied
and Environmental Microbiology, v. 73, n. 13, p. 4354-4356, 2007. ISSN 0099-2240.
PATARO, C. et al. Physiological characterization of yeasts isolated from artisanal fermentation in
an aguardente distillery. Revista de microbiologia, v. 29, n. 2, p. 104-108, 1998. ISSN 0001-3714.
PEREIRA, L. F. et al. The physiological characteristics of the yeast Dekkera bruxellensis in fully
fermentative conditions with cell recycling and in mixed cultures with Saccharomyces cerevisiae.
Antonie van Leeuwenhoek, p. 1-11, 2012. ISSN 0003-6072.
PINHEIRO, S. H. M. Perfil da qualidade da cachaça do Ceará. DISSERTAÇÃO DE
MESTRADO. Fortaleza UFCE, p.133. 1999. (DISSERTAÇÃO DE MESTRADO)
PISARNITSKII, A. Formation of Wine Aroma: Tones and Imperfections Caused by Minor
Components (Review). Applied Biochemistry and Microbiology, v. 37, n. 6, p. 552-560, 2001.
ISSN 0003-6838.
TER SCHURE, E. G. et al. Pyruvate decarboxylase catalyzes decarboxylation of branched-chain 2-
oxo acids but is not essential for fusel alcohol production by Saccharomyces cerevisiae. Applied
and Environmental Microbiology, v. 64, n. 4, p. 1303-1307, 1998. ISSN 0099-2240.
VAN DIJKEN, J. P.; SCHEFFERS, W. A. Redox balances in the metabolism of sugars by yeasts.
FEMS microbiology letters, v. 32, n. 3, p. 199-224, 1986. ISSN 0378-1097.
VERSTREPEN, K. J. et al. Flavor-active esters: adding fruitiness to beer. Journal of bioscience
and bioengineering, v. 96, n. 2, p. 110-118, 2003. ISSN 1389-1723.
58
VILA NOVA, M. X. et al. Yeast species involved in artisanal cachaça fermentation in three stills
with different technological levels in Pernambuco, Brazil. Food microbiology, v. 26, n. 5, p. 460-
466, 2009. ISSN 0740-0020.
VURALHAN, Z. et al. Physiological characterization of the ARO10-dependent, broad-substrate-
specificity 2-oxo acid decarboxylase activity of Saccharomyces cerevisiae. Applied and
Environmental Microbiology, v. 71, n. 6, p. 3276-3284, 2005. ISSN 0099-2240.
VURALHAN, Z. et al. Identification and characterization of phenylpyruvate decarboxylase genes
in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, v. 69, n. 8, p. 4534-
4541, 2003. ISSN 0099-2240.
WIJSMAN, M. R. et al. Inhibition of fermentation and growth in batch cultures of the yeast
Brettanomyces intermedius upon a shift from aerobic to anaerobic conditions (Custers effect).
Antonie van Leeuwenhoek, v. 50, n. 2, p. 183-192, 1984. ISSN 0003-6072.
59
CONCLUSÃO
- A levedura D. bruxellensis apresenta maior produção de biomassa quando comparado a S.
cerevisiae;
- A rápida assimilação da sacarose no meio SCJ, ratifica a vantagem do nitrato nesse meio e a
capacidade dessa levedura em se adaptar as condições industriais;
- Nossa linhagem possui maior capacidade de re-estabelecer o equilíbrio redox quando comparada a
outra linhagem industrial de D. bruxellensis;
- D. bruxellensis e capaz de assimilar aminoácidos ramificados com única fonte de nitrogênio,
porém com rendimentos fermentativos menores aos observados em meios com fontes de nitrogênio
preferenciais, como sulfato de amônio.
- D. bruxellensis é capaz de produzir compostos organolépticos de interesse industrial;
- Não foi detectado álcool n-butílico em nenhuma das fermentações com diferentes fontes de
nitrogênio;
- As maiores concentração de álcool superiores produzidos na presença de aminoácidos ramificados
sugerem o catabolismo destes na via de Ehrlich;
- Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para um melhor entendimento da fisiologia de D.
bruxellensis em função das diferentes fontes de nitrogênio, bem como poderá abrir perspectivas
para a utilização industrial desta levedura na elaboração da cachaça.
60
ANEXOS COMPLEMENTARES
Normas da Revista
61
62
Resultados complementares
Fermentação com aminoácidos aromáticos por Dekkera bruxelensis
Dentre os vários fatores que influenciam na produção de cachaça artesanal, a presença de
diferentes fontes de nitrogênio leva a diferentes perfis fermentativos, gerando diversos aromas e
63
sabores. Para o melhor entendimento de como as diferenças na fonte de nitrogênio influenciam no
perfil fermentativo da levedura Dekkera bruxellensis GDB 248, foi feito uma cinética durante a
fermentação dessa levedura no meio sintético MMS+ARO. Esse meio foi composto de YNB a 1,7
g/L sem aminoácidos e sulfato de amónio, suplementado com sacarose a 120g/L e uma mistura de
fenilalanina (0,40 g/L de N), triptofano (0,40 g/L de N) e tirosina (0,03 g/L de N) como fontes de
nitrogênio. A ausência do íon sulfato foi compensada pela adição de uma quantidade equimolar de
sulfato de potássio. A menor concentração de tirosina no meio é divido a sua baixa solubilidade. As
condições de fermentação foram realizadas segundo os experimentos descritos no manuscrito
acima. Foi observado o rápido consumo de sacarose nesse meio (Figura 1) quando comparado ao
consumo de sacarose no meio MMS + AA. O rendimento nesse meio com aminoácidos aromáticos
foi de 0,45 g/g, sendo 3 vezes maior do que no meio MMS+AA. Entretanto esse meio gera lento
consumo de acucar em S. cereviseae (Espinosa Vidal, 2012)
Figura 1. Parametros fisiologicos do cultivo em frasco de Dekkera bruxellensis GDB 248 em meio
mineral contendo fenilalanina, triptofano e tirosina.
Um estudo de expressão gênica envolvendo D. bruxellensis mostrou a presença de dois
genes ARO10, codificantes da enzima fenilpiruvato descarboxilase no genoma dessa levedura, uma
característica única entre os hemiascomicetos (LIBERAL et al., 2012). Em células de S. cerevisiae
esse gene (Fenilpiruvato descarboxilase) cataliza a descarboxilação do fenilpiruvato para o
fenilacetaldeído, que é o segundo passo da via de Ehrlich, sendo assim, é possível que a levedura D.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 5 10 15 20 25
G/L
TEMPO (H)
YNB + ARO
SACAROSE
ETANOL
GLICEROL
ACETATO
64
bruxellensis produz níveis maiores do álcool 2-feniletanol, conhecido por ter uma aroma de rosas,
sendo este altamente desejados nas bebidas alcoólicas Entretanto a determinação desse álcool
nesses ensaios fermentativos com a suplementação de aminoácidos aromáticos ainda será realizada.