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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

MÉTODO DE DIFUSÃO RADIAL: VALIDAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DO

PROCESSO DE EXTRAÇÃO PARA DOSEAMENTO DE TANINOS DE

ESPÉCIES MEDICINAIS DA CAATINGA

LUMA GOMES DOS SANTOS

RECIFE, 2012





MÉTODO DE DIFUSÃO RADIAL: VALIDAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO

DE EXTRAÇÃO PARA DOSEAMENTO DE TANINOS DE ESPÉCIES MEDICINAIS

DA CAATINGA

LUMA GOMES DOS SANTOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Ciências

Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde

da Universidade Federal de Pernambuco.

ORIENTADORA: Profa. Dra. ELBA LÚCIA CAVALCANTI DE AMORIM

RECIFE, 2012





Recife, 17 de maio de 2012.

Dissertação defendida em 17 de maio de 2012, banca Examinadora constituída pelos

seguintes profesores:

PRESIDENTE E EXAMINADOR INTERNO: Profª Drª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim

(Universidade Federal de Pernambuco).

Assinatura:___________________________________

EXAMINADOR INTERNO: Profº Dr. Pedro José Rolim Neto

(Universidade Federal de Pernambuco)

Assinatura:___________________________________

EXAMINADOR EXTERNO: Dr. Joabe Gomes de Melo

(Universidade Federal Rural de Pernambuco)

Assinatura:_________________________________




Reitor

Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Vice-Reitor

Sílvio Romero de Barros Marques

Pró-Reitor para assuntos de Pesquisas e Pós-Graduação

Francisco de Souza Ramos

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

Nicodemos Teles de Pontes Filho

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

Vânia Pinheiro Ramos

Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Dalci José Brondani

Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas

Antônio Rodolfo de Faria

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Nereide Stela Santos Magalhães

Vice-Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

Ana Cristina Lima Leite

Dedicatória

A meus avós, Geraldina Gomes dos Santos e

Juarez Carneiro dos Santos e a minha mãe,

Geraldina Maria Gomes dos Santos.

AGRADECIMENTOS

A todos aqui apresentados, agradeço a contribuição e força durante realização

deste trabalho.

INSTITUIÇÕES

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFPE

CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.

AOS PROFESSORES

Profª Drª Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim

Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

AOS COLEGAS DE LABORATÓRIO

Allan Chernichiarro Joabe Melo

Daniela Cabral Patrícia Neri

Daniel Carvalho Tadeu Peixoto

Elvis Alves Thiago Araújo

Irla França Valéria Borba

Jenifer Rodrigues Valérium Castro

AOS AMIGOS

Alan Lucena de Vasconcelos Karla Camila Barbosa Santana

Alex Lucena de Vasconcelos Laércio Brandão de Arruda

Anne Cecília Nascimento da Cruz Luciana Gomes Arrais

Diego Menelau de Almeida Marconi Coêlho Santos

Elaine Rafaelle da Silva Pâmela Tavares

Evanilson Alves Feitosa Rafaela Damasceno Sá

Flávia do Couto Grandelle Renato da Cruz Lino Salvador

Ingrid de Araújo Campos Salvana Priscylla Manso Costa

Jonatan Nunes Viana Vanessa Mendes Lira

Jouldes Matos Duarte Yvson Anderson Ferreira

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Profa. Dra. Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim, pela orientação, apoio,

paciência e compreensão em todos os momentos que necessitei.

A comunidade do sítio Carão, por sempre nos receber tão bem e por toda boa

vontade durante nossas coletas.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pelo financiamento do projeto.

Aos colegas de laboratório Thiago Araújo por ter se disponibilizado a fazer uma

viagem de 160 km para que eu pudesse fazer a coleta de plantas. E principalmente a

Daniela Cabral e Tadeu Peixoto Sobrinho, sem os quais eu NUNCA teria conseguido

concluir este trabalho, não há palavras que consigam descrever meu sentimento de

gratidão aos dois.

A Evanilson Alves Feitosa, companheiro de sala, de moradia, de trabalho e até

de autoescola, obrigada por suportar minha bagunça.

A Alan Lucena de Vasconcelos, por toda confiança e por sempre dar

importância a minha opinião.

A Diego Menelau de Almeida, companheiro de aventuras, obrigada por todos os

bons momentos de descontração, amizade e companheirismo.

A Luciana Gomes Arrais (a rainha da cromatografia), Ingrid de Araújo Campos

e Karla Camila Barbosa Santana que nem aqui poderiam estar separadas, obrigada por

toda amizade, companheirismo, confiança, risadas, conselhos, preocupações, fofocas,

confissões, puxões de orelha, por tudo que vocês têm representado pra mim durante

esses seis anos.

A Renato Lino e Jonatan Nunes os autores das piadas mais engraçadas do

planeta, obrigada por todas as risadas, sejam elas sinceras ou não.

A Salvana Costa com por toda boa vontade e ajuda com os experimentos de

validação, sem esquecer o Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto e a equipe do LTM pela

disponibilização do laboratório e equipamentos.

A toda minha família, primas, tias, tios pelo apoio e incentivo.

A minha MÃE, pelo amor, carinho e dedicação incondicionais.

“Seja a mudança que você quer ver no mundo”.

(Mahatma Gandhi)

RESUMO

As plantas sempre foram utilizadas por suas propriedades terapêuticas observadas

empiricamente através das gerações. Atualmente, sabe-se que essas propriedades são

devidas a presença de metabolitos secundários, e isso tem despertado o interesse de

pesquisadores que visam os vegetais como fonte promissora de novas moléculas úteis

ao homem para o tratamento de uma ampla gama de doenças. Há uma grande variedade

de metabólitos secundários, com diferentes estruturas químicas e diversas funções,

dentre estes estão os taninos. Diversos tipos de ensaio têm sido utilizados para a

quantificação de taninos. Os métodos mais apropriados para determinação de taninos

são os ensaios com precipitação de proteínas, porem outros métodos também são

utilizados, sendo os mais comuns os métodos de precipitação de metais e métodos

colorimétricos. Apesar de serem amplamente utilizados para análise quantitativa de

taninos de maneira geral, os métodos colorimétricos são específicos para algumas

classes de taninos. A metodologia de doseamento desenvolvida por Hagerman tem

como base a propriedade que os taninos possuem de se complexar com

macromoléculas, neste caso, as proteínas. É bastante simples, rápida e econômica, muito

útil em estudos que envolvem uma grande quantidade de amostras. Entretanto tem se

mostrado um método pouco sensível uma vez que se utiliza uma grande quantidade de

massa vegetal para extração. Este trabalho teve como objetivo realizar a otimização do

processo de extração para doseamento de taninos através da difusão radial e realizar o

estudo de validação do método. Para otimização da extração algumas variantes ao

método original foram testadas, são elas: massa vegetal, solventes, tipo e tempo de

extração. Observou-se que a redução da massa vegetal a metade pouco influenciou no

valor final do teor de taninos da espécie testada, uma melhora significativa dos

resultados quando da utilização de acetona 50% (v/v) em relação ao solvente original

metanol 50% (v/v). Resposta positiva foi também obervada com a utilização de

aparelho de ultrassom que aumentou consideravelmente o diâmetro do disco reduzindo

a metade o tempo necessário para uma extração eficiente. Para o ensaio de validação

todos os parâmetros obrigatórios foram avaliados. O método foi considerado linear e

com alta sensibilidade de quantificação (27,72 µg/poço). Mostrou-se também robusto e

com recuperação aceitável (85,96%). Os resultados obtidos para repetitividade (intra-

corrida) e precisão intermediária (inter-corridas), certificaram a precisão do método,

obtendo-se valores entre 1,89 e 7,03%. Para a exatidão valores entre 100,47 e 105,26%

foram obtidos, que se encontra dentro dos limites preconizados pela ANVISA. Sendo

assim o método foi considerado preciso, exato e reprodutível, além de ser de fácil

execução e baixo custo.

Palavras chave: taninos, difusão radial, caatinga, validação de método, otimização.

ABSTRACT

Plants always been used for its therapeutic properties empirically observed through the

generations. Currently, it is known that these properties are due to the presence of

secondary metabolites, and this has aroused the interest of researchers aimed the

vegetables as promising source of new molecules useful to man to treat a wide range of

diseases. A wide variety of secondary metabolites with different chemical structures and

several functions, among these are the tannin. Various types of assay have been used for

quantification of tannins. The most suitable methods for the determination of the tannins

are precipitated with protein assays, but other methods are also used, the most common

methods for precipitation of metals and colorimetric methods. Although widely used for

quantitative analysis of tannins in general, colorimetric methods are specific to certain

classes of tannins. The methodology developed by Hagerman assay is based on the

property that Tannins are complex with the macromolecules, in which case the proteins.

It's quite simple, fast and inexpensive, very useful in studies involving a large number

of samples. However has been a very sensitive method since it uses a large amount of

mass plant for extraction. This study aimed to perform the optimization of the extraction

process for assaying tannins by radial diffusion and perform the validation study of the

method. To optimize the extraction some variants to the original method were tested,

they are: plant mass, solvent type and extraction time. It was observed that the mass

reduction plant half little influence on the final amount of tannin content of the species

tested, significantly improved results when using 50% acetone (v / v) in relation to the

original 50% methanol solvent ( v / v). Positive response was also with the use of

ultrasonic apparatus which greatly increased the diameter of the disc reduces by half the

time required for efficient extraction. For assay validation all mandatory parameters

required by ANVISA were evaluated. The method was considered linear and with high

sensitivity quantitation (27.72 g / well). It was also shown robust and acceptable

recovery (85.96%). The results obtained for repeatability (within-run) and intermediate

precision (inter-run), certified the accuracy of the method, obtaining values between

1.89 and 7.03%. For the accuracy values between 100.47 and 105.26% were obtained,

which is within the limits recommended by ANVISA. Thus the method was considered

precise, accurate and reproducible, and is easy to perform and inexpensive.

Keywords: tannins, radial diffusion, caatinga, method validation, optimization.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Divisão dos Taninos Hidrolisáveis..................................................... 23

Figura 2. Estrutura dos taninos gálico e elágico............................................. 23

Figura 3. Taninos condensados..................................................................... 24

Figura 4. Reação da Vanilina com o 3-flavanol monomérico............................. 31

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

ANOVA – Análise de Variância

ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BSA – Albumina Sérica Bovina

CLAE/ HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CMD – Concentração Média Determinada

CT – Concentração Teórica

CTE – Concentração Total de Taninos Extraídos

CTNE – Concentração de Taninos Não Extraídos

DP – Desvio Padrão

DPa – Desvio Padrão Relativo

DPR – Precisão

HHDF – Dihexa-hidroxifênico

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana

IC – Inclinação da Curva de Calibração

LD – Limite de Detecção

LQ – Limite de Quantificação

MS – Espectrometria de Massas

NADPH - Nicotinamida-Adenina-Dinucleótido-Fosfato

PGL – Propilenoglicol

PH – Potencial Hidrogeniônico

RE – Resolução

SPE – Extração em Fase Sólida

U.V - Ultravioleta

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 15

OBJETIVOS 19

CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 20

1. Revisão Bibliográfica 21

1.1 Taninos 21

1.2 Classificação dos taninos 22

1.3 Biossíntese 25

1.4 Propriedades biológicas e farmacológicas 26

1.5 Métodos para quantificação de taninos 28

1.5.1 Métodos colorimétricos 28

1.5.2 Métodos baseados na precipitação de proteínas 34

1.5.3 Métodos cromatográficos 35

1.5.4 Outras Metodologias 36

CAPÍTULO II - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO EXTRATIVO DE

TANINOS E QUANTIFICAÇÃO POR DIFUSÃO RADIAL DE

CEDRELA ODORATA L., UMA PLANTA MEDICINAL DA

CAATINGA.

38

1. Material e Método 39

1.1 Material Botânico 39

1.2 Doseamento de taninos através do método de Difusão Radial 39

1.3 Modificações realizadas no método 40

1.4 Análise estatística 41

2. Resultados e Discussão 41

3. Conclusão 46

CAPÍTULO III - VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA

PARA DETERMINAÇÃO DE TANINOS PELO MÉTODO DE

DIFUSÃO RADIAL

47

1. Material e Método 48

1.1 Reagentes e equipamentos 48

1.2 Preparação do gel 48

1.3 Procedimentos experimentais 48

1.4 Parâmetros da validação 49

2. Resultados e Discussão 50

3. Conclusão 53

CONCLUSÃO GERAL 54

PERSPECTIVAS 56

REFERÊNCIAS 58

APENDICE

15

Introdução

16

INTRODUÇÃO

As plantas sempre foram utilizadas por suas propriedades terapêuticas

observadas empiricamente através das gerações. Atualmente, sabe-se que essas

propriedades são devidas a presença de metabolitos secundários, e isso tem despertado o

interesse de pesquisadores que visam os vegetais como fonte promissora de novas

moléculas úteis ao homem para o tratamento de uma ampla gama de doenças (CRAGG

et al., 1999).

Porém o uso medicinal não é a única função destes metabólitos, visto que, na

planta, possuem diversos propósitos. Dentre eles estão: a proteção contra raios UV,

regulação do crescimento, interações intra e interespecíficas, defesa contra predadores e

infecções (VERPOORTE, 1998; WILLS; BONE; MORGAN, 2000; GOBBO-NETO;

LOPES, 2007).

Muitos desses produtos naturais apresentam interessantes atividades biológicas e

farmacológicas, sendo utilizados como agentes anti-inflamatórios, antimicrobianos e

quimioterápicos ou servindo como ponto de partida para o desenvolvimento de novos

medicamentos (VERPOORTE, 2000). Apesar de toda importância atribuída às plantas,

o seu potencial é ainda pouco explorado, sendo que apenas cerca de 20% das plantas

encontradas no mundo estão sendo submetidas a testes biológicos e/ou farmacológicos

(SUFFREDINI et al. 2004; BARROS, 2008)

Há uma grande variedade de metabólitos secundários, com diferentes estruturas

químicas e diversas funções, dentre estes estão os taninos (CLAESON, BOHLIN,

1997). O termo taninos é muito antigo, e foi introduzido por Seguin em 1796 para

descrever os constituintes químicos de tecidos vegetais responsáveis pela transformação

da pele animal em couros maleáveis e de grande durabilidade (curtimento; tanning em

inglês,) (RIBÉREAU-GAYON, 1972; QUEIROZ et al., 2002) . Taninos são metabólitos

secundários, polímeros fenólicos solúveis em água que possuem a habilidade de formar

complexos, insolúveis em água, com proteínas, gelatinas e alcaloides. Apresentam alto

peso molecular, compreendido entre 500 e 3000 Da (MELLO; SANTOS, 2001), contém

grupos hidroxilafenólicos em quantidade suficiente para permitir a formação de ligações

cruzadas com proteínas (DESPHANDE, CHERYAN, SALUNKHE, 1986).

Os taninos possuem ampla distribuição no reino vegetal, sendo encontrados em

muitas plantas usadas pelo homem para fins medicinais, na alimentação e na fabricação

de bebidas. O teor e o tipo de tanino variam, não só de um vegetal para outro como

17

também de uma parte para outra do mesmo vegetal. Nas plantas, os taninos podem ser

encontrados em raízes, flores, frutos, folhas, cascas de caule e na madeira. Eles

contribuem para o sabor adstringente em comidas e bebidas, como aquele sentido ao se

consumir vinhos tintos, chás e frutas verdes (SANTOS, 2000).

Devido as suas características, os taninos possuem diversas aplicações. Dentre

elas podemos citar: curtimento de pele animal, produção de resina, estabilização do solo

na horticultura e outras (CUNHA, 2009).

Diversos tipos de ensaio têm sido utilizados para a quantificação de taninos. Os

métodos mais apropriados para determinação de taninos são os ensaios com

precipitação de proteínas (HAGERMAN; BUTLER, 1989; HAGERMAN et al., 1997).

Porem outros métodos também são utilizados, sendo mais comuns os métodos de

precipitação de metais e métodos colorimétricos. Apesar de serem amplamente

utilizados para análise quantitativa de taninos de maneira geral, os métodos

colorimétricos são específicos para algumas classes de taninos. Apesar destas críticas,

alguns autores afirmam que não há método ideal e reforçam que os métodos

colorimétricos são os mais utilizados para a análise (HAGERMAN; BUTLER, 1989;

HAGERMAN et al., 1997; MONDAL et al., 2001; MUELLER-HARVEY et al., 2001).

As técnicas de doseamentos existentes nos permitem elucidar a quantidade de

taninos presente em uma determinada espécie e aí está fundamentada sua importância,

pois esses dados somados as já conhecidas propriedades dos taninos, permitem estudos

mais direcionados e menos empíricos. A metodologia de doseamento desenvolvida por

Hagerman (1987) tem como base a propriedade que os taninos possuem de se

complexar com macromoléculas, neste caso, as proteínas. É bastante simples, rápida e

econômica, muito útil em estudos que envolvem uma grande quantidade de amostras.

Entretanto tem se mostrado um método pouco sensível uma vez que se utiliza uma

grande quantidade de massa vegetal para extração (HAGERMAN, 1987)

Em conjunto com os doseamentos os trabalhos de validações de métodos

analíticos também são de suma importância, pois estes garantem a confiabilidade do

método. De acordo com a United States Pharmacopeia XXXIII (2010), “A validação de

métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes

mencionado como o processo que fornece uma evidência documentada de que o método

realiza aquilo para o qual é indicado para fazer”. As características analíticas típicas

usadas na validação de métodos são: exatidão, precisão, especificidade, limite de

detecção, limite de quantificação, linearidade, intervalo de aceitação, robustez ou

18

resistência e conformidade do sistema (ESPIRES, 1998; PECORA, 2000; PINTO ET

AL., 2003).

A realização da validação deve ser executada: i) sempre que de forma direta ou

indireta o processo de fabricação tenha sido alterado; ii) quando a qualidade final do

produto for duvidosa; iii) em equipamentos novos e iv) em caso de implantação de um

processo ou método analítico novo (EMANUELLI, 2000; PASTEELNICK, 1993).

Apesar de a metodologia de doseamento de taninos através da difusão radial ser antiga e

amplamente utilizada, não há relatos na literatura de que esta tenha passado por um

processo de validação.

De acordo com a problemática apresentada, o objetivo deste trabalho foi realizar

a otimização do processo de extração empregada no método de difusão radial, bem

como a validação do mesmo.

19

OBJETIVOS

GERAL

Otimizar o processo de extração para aplicação na quantificação de taninos

através do método de Difusão Radial e realizar a validação do método.

ESPECÍFICOS

Verificar o efeito da utilização de diferentes solventes no processo de extração

dos taninos da Cedrela odorata L. (Cedro).

Reduzir a massa vegetal e o tempo necessários para um processo extrativo

eficiente aplicado a quantificação de taninos através do método de Difusão

Radial.

Comparar o efeito da utilização do ultrassom e da maceração na extração de

taninos da Cedrela odorata L.

Quantificar os taninos da Cedrela odorota L. através da Difusão Radial

Determinar os parâmetros de validação, linearidade, recuperação, precisão

exatidão e robustez, para o método de Difusão Radial.

20

Capítulo I

21

1- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1-Taninos

Os Taninos pertencem a um grupo de compostos fenólicos provenientes do

metabolismo secundário de plantas (BUTLER et al. 1984). Inicialmente empregou-se o

termo “tanino” para substâncias de origem vegetal utilizadas pelas suas propriedades de

curtir as peles, isto é, capazes de transformar a pele fresca dos animais em material

imputrescível e pouco permeável (CUNHA, 2009).

Taninos são polifenóis de ocorrência natural em plantas, hidrossolúveis, com

peso molecular entre 500 e 3000 Da (MANGAN, 1988), contêm grupos hidroxila-

fenólico em quantidades suficientes para permitir a formação de ligações cruzadas

estáveis (DESHPANDE et al., 1986) sendo, desta maneira capazes de precipitar

macromoléculas como alcaloides e proteínas.

Na forma não oxidada, os taninos reagem com as proteínas através das pontes de

hidrogênio e/ ou ligações hidrofóbicas. Quando oxidados, os taninos se transformam em

quinonas, as quais formam ligações covalentes com alguns grupos funcionais das

proteínas (SGARBIERI, 1996). As interações hidrofóbicas e as ligações de hidrogênio

entre os grupos fenólicos dos taninos e algumas macromoléculas explicam a

adstringência característica dos taninos e a formação de complexos com as fibras de

colágeno da pele, conferindo-lhe resistência à água e ao calor. Porém a estabilidade dos

complexos formados só é assegurada após a formação das ligações covalentes que são

resultado da oxidação dos taninos em quinonas (BRUNETON, 1991). As massas

moleculares dos taninos também são determinantes na formação e estabilidade dos

complexos se este é demasiadamente elevado, a molécula de tanino não pode se

intercalar entre os espaços interfibrilares das proteínas ou macromoléculas; se é muito

baixo, a molécula fenólica se intercala, mas não forma um número suficiente de

ligações que assegure a estabilidade do complexo (CUNHA, 2009).

Os taninos são amplamente distribuídos dentro do reino vegetal, embora em

concentrações muito variáveis, são comuns tanto em espécies de Angiospermas como

Gimnospermas. Dentro das angiospermas os taninos são mais comuns nas

dicotiledôneas que nas monocotiledôneas (CANNAS, 1999), a riqueza relativa varia

cosoante a espécie, mas também com os órgãos, a idade e o estado de desenvolvimento

(predomina nos frutos verdes).

22

Considerando a proporção da ocorrência de taninos em famílias das

Angiospermas arranjadas de acordo ao sistema de classificação de Cronquist, em um

estudo realizado por Mole (1993), somente 4% de 228 espécies testadas foram positivas

para taninos. Nas ordens Polygonales e Plumbaginales apenas uma única família de

cada apresentou taninos, e em famílias de Caryophyllales tais compostos estavam

ausentes. Nas Moraceae, os taninos estão presentes em quantidade insuficiente para

precipitar proteínas (MOLE, 1993).

Nas plantas que biossintetizam quantidades apreciáveis destes metabólitos

secundários a sua localização encontra-se confinada a certos órgãos dissolvidos nos

vacúolos, normalmente combinados sob a forma de complexos solúveis (CUNHA,

2009). Neste local eles não interferem no metabolismo da planta, somente após lesão ou

morte eles agem e têm metabolismo eficiente (CANNAS, 1999).

Estes metabólitos são biossintetizados pelas plantas para diferentes propósitos,

que incluem regulação do crescimento, interações intra e interespecíficas, proteção

contra radiação U.V e infecções. A complexação dos taninos com as proteínas confere-

lhes também uma importante função no controle de bactérias, fungos e insetos

(VERPOORTE, 1998; WILLS; BONE; MORGAN, 2000; GOBBO-NETO; LOPES,

2007).

O uso de taninos na indústria de curtume se tornou muito restrito. No entanto, o

interesse por seu estudo foi aumentado, ao ter-se associado, através de estudos

epidemiológicos, a ingestão de alimentos que os contem, a prevenção de algumas

doenças, como a aterosclerose ou certos tipos de cancro (CUNHA, 2009).

1.2 – Classificação dos taninos

Nas plantas superiores têm-se distinguido, habitualmente, dois grupos de taninos

estruturais e biogeneticamente diferentes: Taninos hidrolisáveis (galotaninos e

elagitaninos) e taninos condensados. A partir de 1985, a elucidação estrutural

evidenciou a existência de elagitaninos modificados por flavanóis, que passaram a

designar-se por taninos complexos. Tendo em conta as características estruturais dos

taninos, conhecidas atualmente, é possível classificá-los como: Galotaninos,

elagitaninos, taninos complexos e taninos condensados (Figura 1) (MUELLER-

HARVEY, 2001; AGUILAR E GUITIÉRREZ-SÁNCHEZ 2001).

23

Figura 1: Divisão dos taninos hidrolisáveis

(Mueller-Harvey, 2001)

Os taninos hidrolisáveis são unidos por ligações éster-carboxila, sendo

prontamente hidrolisáveis, em condições ácidas ou básicas (HAGERMAN E BUTLER,

1981). A unidade básica estrutural desse tipo de tanino é um poliol, usualmente D-

glucose, com seus grupos hidroxilas esterificados pelo ácido gálico (galotaninos) e pelo

ácido hexadihidroxifênico (elagitaninos) (Figura 2) (LEWIS & YAMAMOTO, 1989).

Os taninos elágicos são muito mais frequentes que os gálicos e é provável que o sistema

bifenilico do ácido hexadihidroxifênico seja resultante da ligação oxidativa entre dois

ácidos gálicos (BRUNNETON, 1991).

Figura 2 - Estrutura dos taninos gálico e elágico.

24

Os taninos condensados ou proantocianidinas (Figura 3) são constituídos por

unidade flavanol: flavan-3-ols (catequina) ou flavan-3,4-diols (leucoantocianidinas). Os

taninos condensados podem conter de duas a cinquenta unidades flavonoides; possuem

estruturação complexas; são resistentes a hidrólise, mas podem ser solúveis em

solventes orgânicos e aquosos, dependendo de sua estrutura. As proantocianidinas,

assim denominadas provavelmente pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados

da classe das antocianidinas, como cianidina e delfinidina, apresentam uma rica

diversidade estrutural, resultante de padrões de substituições entre unidades flavânicas,

diversidade de posições entre suas ligações e a estereoquímica de seus compostos

(MELO E SANTOS, 2001). Os taninos hidrolisáveis podem ligar-se ao C6 ou C8 de

uma unidade 3-flavonol, levando a formação de taninos complexos (CUNHA, 2009).

Figura 3: Taninos condensados.

(Mueller-Harvey, 2001).

Na mesma planta podem ocorrer, simultaneamente, taninos hidrolisáveis e

condensados predominando um destes tipos. Os taninos hidrolisáveis são característicos

das dicotiledôneas, herbáceas e lenhosas e tem uma distribuição taxonômica restrita a

algumas famílias. Os elagitaninos têm sido utilizados como marcadores taxonômicos,

particularmente para Hemamelidáceas, Dilenidáceas e Rosáceas. Quanto aos taninos

condensados, têm sido identificados em todos os grupos vegetais, inclusive nas

Gimnospermas e Pteridófitas (HEIL et al., 2002)

25

Com a intenção de localizar a origem intracelular da síntese de taninos

hidrolisáveis foram desenvolvidos, através de técnicas imunocitoquímicas, dois

anticorpos que reconhecem como antígenos os compostos pentagaloilglucose e a enzima

galoiltransferase, catalisadora de taninos hidrolisáveis (GRUNDHÖFER et al., 2001).

Esta técnica foi empregada por apresentar uma alta especificidade e um grande poder de

precisão, uma vez que os reagentes usualmente utilizados (como ex., Fe2+, Fe3+ ou

molibdato) não apresentam distinção entre outros compostos fenólicos vegetais.

Contrastando com a literatura vigente que prega a existência de “vacúolos tânicos”, não

foram encontrados tais compartimentos e sim regiões nos cloroplastos, nos

amiloplastos, na parede celular e em espaços intercelulares que apresentaram locais de

formação e deposição de taninos hidrolisáveis nas folhas de Quercus robus L. e Tellima

grandiflora (Pursh.) Dough.

1.3 – Biossíntese

Taninos hidrolisáveis

O ácido gálico está na gênese dos taninos hidrolisáveis. A esterificação deste

ácido fenólico pela uridina difosfoglucose (UDP-glucose) conduz a formação da β-1-O-

galoil-D-glucose (β-glucogalina) que constitui o primeiro intermediário na biossíntese

destes taninos. Ao atuar como receptor e como principal doador de grupos de ácido

gálico a β-glucogalina vai sendo sequencialmente esterificada e origina por fim o

1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glucose, que é considerado precursor da maioria dos

taninos hidrolisáveis (CUNHA, 2009).

São três as vias de biossíntese propostas para os taninos. A primeira via conduz à

formação de galotaninos típicos, que resultam da auto-esterificação entre moléculas de

ácido gálico unidas por ligações meta-depsídicas. Isto é: as unidades galoil são

esterificadas com um poliol, mas também ente si, em posição meta relativamente aos

seus grupos carboxílicos (HASLAM, 1989).

A segunda via conduz a formação de elagitaninos por acoplamento oxidativo C2-

C2 entre dois ou quatro grupos galoil vicinais, ligados a D-glucopiranose na sua

conformação mais estável. Em consequência deste processo, formam-se ésteres mono-

26

ou di-hexa-hiroxifênicos (HHDF), estes compostos podem se ligar a outros monômeros,

originando oligômeros (HASLAM, 1989)

A terceira via ocorre num grupo muito restrito de plantas, corresponde a uma

variante metabólica em que a D-glicopiranose tem uma conformação em cadeira pouco

estável, com substituintes em posição axial. Os grupos HHDF resultam do acoplamento

oxidativo de resíduos galoil adjacentes. Estes compostos podem condensar, por ligações

intermoleculares C-O-C, resultando os oligômeros (HASLAM, 1989)

Taninos condensados

São sintetizados pela via mista do chiquimato-acetato/malonato; a fenilalanina é

transformada em ácido trans-cinâmico, e este, posteriormente hidroxilado à ácido p-

cumárico. A subsequente condensação com três unidades de malonil-coenzima A

conduz à formação de uma chalcona, que, ao ciclizar, origina uma flavona. Por α ou β-

hidroxilação no C3 da flavona sintetizada formam-se os 2,3-di-hidro-3-flavonóis, que

por ação de uma enzima mediada pela NADPH são reduzidos a 3,4-flavonodiois.

Posteriormente estes compostos podem ser reduzidos a 3-flavonóis, através de uma

reação catalisada pela 3,4-flavonodiol redutase (SCHOFIELD, 2001).

A reatividade dos 3,4-flavonodióis promove a condensação entre si ou com os 3-

flavonóis. Este processo conduz a formação de oligômeros ou de polímeros designados

por proantocianidinas (SCHOFIELD, 2001).

1.4 - Propriedades biológicas e farmacológicas

As aplicações terapêuticas dos taninos estão relacionadas, principalmente, a três

propriedades destes metabolitos: complexação com íons metálicos, atividade

antioxidante e sequestradora de radicais livres e habilidade de se complexar com

macromoléculas como proteínas e polissacarídeos (SIMÕES et al, 2001).

Os taninos são usados no tratamento de diarreias, como diuréticos, em

problemas estomacais e também como anti-inflamatórios antissépticos e hemostáticos.

Visto terem a propriedade de precipitar alcaloides e metais pesados, podem ser

empregadas como antídotos no envenenamento com estes compostos (BRUNNETON,

1991).

27

Supõe-se que os taninos atuem segundo mecanismos relacionados, pelo menos

em parte, com as características comuns aos taninos hidrolisáveis e condensados:

atividade antioxidante e sequestradora de radicais livres e capacidade de complexar

macromoléculas de natureza proteica e íons metálicos. Ensaios in vitro sugerem que

estes compostos intervêm na modulação de processos envolvidos na divisão e

proliferação celular, na coagulação, inflamação e resposta imunológica (JEREZ et al.,

2007).

Por via externa, os taninos, através da complexação tanino-proteína,

impermeabilizam as camadas mais externas da pele e das mucosas. Desta forma limitam

a perda de fluídos e impedem as agressões externas, favorecendo a regeneração

tecidular e, consequentemente, a cura de feridas, queimaduras e inflamações. (CUNHA,

2009)

Várias doenças degenerativas como câncer, doença de Alzheimer e de

Parkinson, esclerose múltipla, arteriosclerose e o próprio processo de envelhecimento

estão associados a altas concentrações intercelulares de radicais livres. Estudos recentes

mostram que vários taninos atuam como captadores de radicais, os quais interceptam o

oxigênio ativo formando radicais estáveis (MELLO E SANTOS, 2001).

Ao precipitar proteínas, os taninos propiciam um efeito antimicrobiano e

antifúngico. Alem dessas atividades, os taninos também possuem ação antiviral e

moluscicida (BRUNNETON, 1991).

A atividade antimicrobiana dos taninos, já bem conhecida e documentada, tem

sido fundamentada em três hipóteses: modificação do metabolismo microbiano, por

ação dos taninos sob as membranas celulares de bactérias e fungos, inibição das

enzimas microbianas, complexação com íons essenciais ao metabolismo microbiano.

Uma série de bactérias são sensíveis aos taninos, dentre elas Staphylococcus aureus,

Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracis e Shigella dysenteriae e, em

concentrações mínimas (0,5 g/L), o fungo Fomes annosus teve seu crescimento inibido

(CASTRO et al., 1999).

Provavelmente, devido à habilidade de ligar-se às proteínas e outras

macromoléculas, os taninos também apresentam atividades tóxicas. A rápida

mortalidade de insetos tratados com taninos condensados foi relatada, e parece ser

devido à atividade tóxica destes compostos e não pela inibição da digestibilidade

(AYRES et al., 1997)

28

Os taninos são considerados nutricionalmente indesejáveis porque precipitam

proteínas, inibem enzimas digestivas e afetam a utilização de vitaminas e minerais

podendo, ainda, em alta concentração, desenvolver câncer de bochecha e esôfago

(CHUNG E JOHNSON, 1998).

Moléculas de taninos estão sendo testadas, com a intenção de se descobrir uma

droga eficiente contra o HIV. Galotaninos demonstraram atividade inibitória somente

em concentrações tóxicas, elagitaninos e taninos condensados inibiram fracamente a

replicação viral e os taninos complexos mostraram potente atividade contra a replicação

do HIV. Concluiu-se que a atividade anti-HIV exibida por taninos é devida à inibição da

transcriptase reversa, dificultando assim a replicação viral (KILKUSKIE et al., 1992).

1.5 - Métodos para quantificação de taninos

O doseamento de taninos é um processo complexo, não só pela dificuldade na

extração completa desses compostos, como ainda pela falta de especificidade de alguns

métodos utilizados. Muitos autores indicam, como mais favoráveis, os métodos

baseados na propriedade dos taninos em precipitar proteína, mas são bastante utilizados

também métodos baseados na capacidade destes para complexação com metais, ou

ainda a combinação entre os dois tipos. Além destes, existem também os métodos

específicos para determinados tipos de taninos, tais como galotaninos, elagitaninos e

proantocianidinas (MONDAL et al., 2001)

1.5.1 – Métodos colorimétricos

Os métodos colorimétricos são os protocolos mais comuns sensíveis e baratos

utilizados para quantificação de taninos. Todo método tem sua limitação e a escolha

específica de uma metodologia muitas vezes é baseada nas facilidades estruturais

disponíveis e no número de amostras a serem avaliadas (FULEKI & FRANCIS 1968a e,

1968b).

Os métodos colorimétricos podem ser divididos em dois grupos básicos, aqueles

em que as reações ocorrem com grupos fenólicos gerais, envolvendo as reações de

oxidorredução ou formação de complexos com íons metálicos e aqueles em que as

reações ocorrem com um grupo funcional específico, devido a uma estrutura em

particular dos taninos (GIUSTI & WROSLTAD, 2000).

29

Folin-Ciocalteau e Azul da Prussia

Os métodos de Folin-Ciocalteau, Folin-Denis e Azul da Prussia quantificam

fenóis totais e se baseiam nas reações de oxirredução entre os compostos fenólicos e os

íons metálicos (SINGLETON et al., 1999)

Os métodos de doseamentos de polifenois baseados nas reações de oxirredução

tiveram início com a utilização do reagente fosfotungstico para quantificação de ácido

úrico na urina, sendo posteriormente modificado e denominado reagente de Folin-Denis

(FOLIN; DENIS, 1912).

O reagente de Folin-Ciocalteu, inicialmente denominado reagente de fenol

modificado, difere do reagente de Folin-Denis pela presença de sulfato de lítio,

adicionado para evitar a formação de precipitados (SCALBERT, 1992)

A quantificação dos compostos fenólicos totais pela metodologia que emprega o

reagente de Folin-Ciocalteu baseia-se na redução dos ácidos fosfotungstico

(H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), presentes no reagente de Folin-Ciocalteu,

pelo íon fenolato, formado por adição do carbonato de sódio, presentes na amostra a

óxido de tungstênio (W8O23) e óxido de molibdênio (Mo8O23) em meio alcalino. Estes

óxidos formados apresentam coloração azulada, sendo possível a quantificação da

absorbância da solução na região do visível (760nm). Através de uma curva de

calibração construída utilizando-se padrão para taninos é possível correlacionar a

intensidade da cor à concentração de fenóis presentes na amostra, sendo o resultado

expresso em equivalente do padrão utilizado (FOLIN; DENIS, 1912).

H3PW12O40 + H3Mo12O40 + FENOL → W3O23 + Mo3O23

Reação de quantificação de fenólicos totais por reagente de Folin-Ciocalteu

Inicialmente faz-se a determinação de todos os compostos fenólicos presentes,

para depois, após remoção dos taninos do extrato através da precipitação destes por

proteínas, se avaliar, por diferença, o grau de redução correspondente apenas aos

taninos totais (COSTA,1994; BRUNNETON, 2001; SCALBERT, 1992)

Entretanto, o reagente de Folin-Ciocalteu não é específico para grupos fenólicos

sofrendo interferências de outras substâncias redutoras presentes na amostra, tais como

ácido ascórbico e açúcares redutores, superestimando os valores (APPEL et al., 2001).

30

Em função destes interferentes, foi proposta uma modificação na metodologia, onde se

insere uma etapa de extração em fase sólida (SPE) em coluna, capaz de reter os

compostos fenólicos. Por esta metodologia é possível quantificar os fenólicos totais e

eliminar outros interferentes (GEORGÉ et al., 2005)

O método chamado de azul da Prússia é recomendado para análise de fenóis em

uma grande variedade de substratos, pois é menos susceptível à interferência de

proteínas que o método de Folin-Ciocalteu. A base química da metodologia é a redução,

pelos grupos hidroxi-fenólicos, de íons Fe+3 a Fe+2, que formam complexos com

ferrocianeto, produzindo pigmentos de coloração azul que podem ser posteriormente

quantificados através de espectrofotometria. O padrão utilizado para o Azul da Prússia

é, geralmente, o ácido tânico. Essa metodologia apresenta uma série de vantagens em

relação ao método de Folin-Cicalteau, como, por exemplo: rapidez, simplicidade,

sensibilidade e preço baixo. Sua desvantagem, assim como o método de Folin-

Cicalteau, é a inespecificidade para taninos se utilizado isoladamente (GRAHAM,

1992).

Os métodos acima mencionados são baseados na oxidação dos polifenóis por

reações de oxidação-redução. As interferências verificadas pelo método de Folin-

Ciocalteu são superiores ao do método do Azul da Prússia, já que os compostos não

fenólicos, ascorbatos e sulfitos são substâncias potencialmente interferentes na

determinação pelo método de Folin-Ciocalteu (SINGLETON, ORTHOFER E

LAMUELA-RAVENTOS, 1999).

Método de Stevanato

A metodologia desenvolvida por Stevanato et al. (2004) para a determinação do

teor de polifenóis totais baseia-se novamente em reações de oxidação dos fenóis

catalisadas pela enzima peroxidase. Os radicais fenoxila formados reagem com

substratos aromáticos, sendo então quantificados em A500 pelos teores de quinona-

imina coloridas formadas. Quando comparado com o método de Folin-Ciocalteau,

verificou-se ser mais rápido e específico, já que não reage com interferentes comuns,

como sulfitos, ascorbatos e citratos.

No entanto, as reações redox envolvidas no método de Stevanato et al. (2004),

nem sempre são reações quantitativas, devido às reações serem reversíveis. Uma outra

desvantagem é que a reação ocorre com maior ou menor intensidade, consoante o grau

31

de substituições hidroxilas e a sua respectiva posição nos anéis dos flavan-3-ol.

Ressaltando também que os grupos hidroxilo na posição meta do anel A não estão

envolvidas nestas reações.

Apesar de o método referido, ter sido descrito apenas para doseamento de fenóis

totais, este pode vir a ser adaptado e associado a precipitação com caseína, e deste modo

aplicado a quantificação de taninos através da diferença entre fenóis totais e residuais,

assim como ocorre no método de Folin-Ciocalteau.

Método da Vanilina e do Butanol-HCl

O método da Vanilina e do Butanol-HCL detectam grupos funcionais

específicos dos taninos, os quais exploram as diferenças estruturais que ocorrem na

molécula (MONTEIRO et al., 2005).

O método da vanilina é específico para flavan-3-óis, dihidrochalconas e

proantocianidinas. Este método baseia-se na formação do radical vanilina em meio

ácido, que se liga ao anel meta substituído por grupos hidroxilo pelos carbonos 6 ou 8

do anel A, formando um cromóforo vermelho capaz de absorver luz a 500nm. Apesar de

não ser específico, o método da vanilina em metanol é mais sensível às

proantocianidinas do que aos flavan-3-óis e, portanto, muito utilizado para detecção e

quantificação dos taninos condensados. Utiliza-se para este método, a catequina como

padrão (NACZK & SHAHIDI, 2004).

Figura 4 - Reação da vanilina com 3-flavanol monomérico

.

32

O sucesso deste ensaio depende do tipo do solvente usado, da concentração e

natureza do ácido, do tempo da reação, temperatura e concentração da vanilina. O maior

problema para o método vanilina parece ser a reatividade de subunidades de polímeros

de taninos, o que caracteriza a falta de especificidade e superestimação do conteúdo

para taninos condensados. A raiz das dificuldades analíticas está na complexidade e

variabilidade das estruturas dos taninos condensados, além de ser um método laborioso

e de alto custo (SCHOFIELD, 2001).

O Butanol-HCl é específico para proantocianidina. Este é considerado o melhor

método para determinação de taninos condensados. Através dessa metodologia

subunidades do polímero tanino condensado são oxidadas para produzir antocianidinas

cromóforas(clivagem oxidativa) que assumem uma coloração vermelha com máximos

de absorção em torno de 550 nm (PORTER, HRSTICH E CHAN, 1986)

Utiliza-se como padrão o tanino purificado. A principal vantagem dessa

metodologia é que é específica para taninos condensados, enquanto que as desvantagens

são: método laborioso, custo e dificuldade em se obter o padrão, uma vez que o tanino

purificado não é comercializável, o laboratório terá que purificar seu próprio tanino para

utilizá-lo como padrão, Salienta-se que a purificação do tanino é um processo muito

difícil, uma vez que os extratos, além de conter taninos, possuem proteínas complexadas

com taninos e outros compostos (SCALBERT, 1992).

Além disso, a transformação da proantocianidinas em antocianidinas não é

completa, porque o rendimento de antocianidinas coloridas depende tanto da estrutura

como do grau de polimerização das mesmas. Outro problema é que, reações colaterais

são comuns durante a reação, o que leva à formação de polímeros vermelho-

acastanhado absorvendo a cerca de 450 nm, resultando em um erro de estimativa. E por

último, é influenciado por variações no teor de água e metal da amostra (SCALBERT,

1992).

Método do KIO3, Rodanina e NaNO2

O procedimento descrito por Bate- Smith (1977) para determinação de taninos

hidrolisáveis em plantas da espécie Aces, o qual produz uma cor rosa após a reação com

KIO3, foi posteriormente analisado por Hagerman et al. (1997), que notou que esta

análise não seria compatível com misturas complexas de taninos, já que estes tendem a

33

adquirir uma coloração marrom frente a cor rosa. Além disso, esta análise não é

considerada confiável, pois o desenvolvimento da cor é criticamente dependente da

temperatura e do tempo de reação. Tal metodologia de análise foi re-examinada por

Wilis e Alen (1998) que sugeriram um aperfeiçomento do protocolo para determinação

de galotanino e elagitanino, recomendaram a investigação de um tempo ótimo de

reação (dependendo de cada espécie estudada) não sendo necessário o resfriamento das

amostras para o teste, como se acreditava.

O método descrito por Inoue e Hagerman (1988) para determinação de

galotaninos, envolve a formação de um complexo entre rodanina e o ácido gálico,

liberado após uma etapa de hidrólise ácida do tanino. O complexo, que possui

absorbância máxima a 520 nm, resulta da reação da rodanina com os grupos hidroxil

vicinais do ácido gálico. As moléculas de rodanina que não reagiram, não apresentam

em solução básica absorbâncias em comprimentos de onda superiores a 450 nm. A

rodanina apresenta baixa ou nenhuma afinidade pelos grupos hidroxil de radicais galoil

presentes na estrutura dos taninos e também pode reagir, em soluções alcalinas, com

quinonas ou hidroquinonas, sendo que os produtos destas reações absorvem em

comprimentos de onda maiores (THIES E FISCHER, 1973). Desta forma, este método é

muito útil para análises rotineiras, pois apresenta alta especificidade (sem interferência

dos compostos vegetais fenólicos), sensibilidade e precisão.

A análise com o reagente NaNO2 que foi primeiramente descrido por Bate-Smith

para determinação de elagitaninos, foi posteriormente aperfeiçoada por Hagerman e

Wilson (1990), tornou-se seletiva somente para determinação do ácido elágico de forma

que o ácido gálico, galotaninos, elagitaninos, taninos condensados e flavonóides não

iram mais interferir na quantificação.

Uma das limitações dos métodos colorimétricos é a obtenção de substâncias

adequadas para serem utilizadas como padrão. Se a capacidade da substancia utilizada

como padrão não é precisamente a mesma do extrato analisado, a concentração

calculada a partir da curva padrão não refletirá, obviamente, o teor de fenóis da amostra,

ou seja, os padrões normalmente não fornecem o mesmo espectro de absorção dos

taninos purificados (APPEL, et al., 2001). Além disso, os métodos colorimétricos são

geralmente demorados, empregam produtos químicos que exigem condições especiais

de manipulação e, sobretudo, falta de especificidade, portanto eles só são apropriados

para análise de amostras purificadas (HERDERICH E SMITH, 2005).

34

1.5.2 Métodos baseados na precipitação de proteínas

O início dos estudos sobre complexação de polifenóis com proteínas é bastante

antigo, sendo um dos primeiros relatos realizado por Day em 1803 (HASLAM et al.,

1989). Os complexos formados entre taninos e proteínas podem ser reversíveis ou

irreversíveis. Quando são estabelecidos por ligações de hidrogênio ou interações

hidrofóbicas, formam um coplexo reversível, enquanto que os irreversíveis implicam

em reações de oxidação, via formação de ligações covalentes (LUCK et al., 1994).

Os processos de complexação e precipitação de taninos e proteínas são tidos

como específicos e estão relacionados com a estrutura de ambos. Algumas

características, tanto dos taninos quanto das proteínas, são importantes para a formação

do complexo.

A estrutura molecular das proteínas se apresenta como um dos fatores mais

relevantes na formação do complexo. Estruturas mais abertas e flexíveis têm maior

afinidade pelos taninos, por outro lado, proteínas globulares, possuem menor afinidade

pelos compostos fenólicos (HAGERMAN; BUTLER, 1981). A afinidade das proteínas

por taninos é maior no ponto isoelétrico da proteína e quando estas são ricas em

prolina, este ultimo se explica pelo fato de que os peptídeos que contém prolina

apresentam o nitrogênio adjacente a carbonila substituído porum grupamento alquila,

favorecendo a ligação tanino-proteína (HASLAM et al., 1989). Outro fator importante

para a formação do complexo é o grau de glicosilação da proteína, as não-glicosiladas

apresentam menor afinidade por taninos que as com alto grau de glicosilação (FICKEL

et al., 1999).

Em contrapartida, a estrutura e propriedades dos taninos também são

determinantes na formação de complexos e na precipitação desses. Nesse sentido o

tamanho da molécula, a flexibilidade conformacional, a solubilidade em água e a

posição dos grupos periféricos na estrutura dos taninos devem ser considerados

(FREITAS; MATEUS, 2001; KAWAMOTO et al., 1996; HASLAM et al., 1989).

Moléculas de taninos maiores, porém não tão grandes que não possam se

intercalar entre os espaços interfibrilares das proteínas, são mais eficazes na formação

de complexos (FREITAS; MATEUS, 2001). Quando existe um impedimento

conformacional no polifenol, a capacidade de complexação é drasticamente reduzida

(HASLAM et al., 1989).

35

Com relação a solubilidade em água do polifenol, esta está em relação inversa

com o grau de complexação. Normalmente, baixas solubilidades favorecem uma

complexação mais forte (LUCK et al., 1994).

A combinação dessas peculiaridades, referentes tanto ás proteínas quanto aos

taninos, explica a falta de especificidade no comportamento de taninos diferentes, ou de

diferentes extratos vegetais, frente a um mesmo substrato proteico (FREITAS;

MATEUS, 2001).

Método da Difusão Radial

O método da difusão radial desenvoldido por Hagerman (1987) tem como

fundamento a propriedade que os taninos possuem de se complexar com as proteínas.

Nesta metodologia a Albumina Sérica Bovina é incorporada a um gel de Ágar no qual

são perfurados poços onde são colocadas as amostras contendo taninos. Imediatamente

após a introdução, a amostra começa a difundir-se pelo gel incorporado de proteína, esta

em contato com o tanino precipita, formando um disco claramente visível. O diâmetro

do disco formado é diretamente proporcional à quantidade de tanino colocada no poço

(HAGERMAN, 1987)

A metodologia se mostra bastante simples e rápida, muito útil para análises em

que uma grande quantidade de amostras é testada. Contudo deve ser utilizada com

cautela, pois apresenta diferentes sensibilidades aos diferentes tipos de taninos, sendo

desta maneira, melhor recomendada para estudos que visam medir o potencial biológico

da amostra em teste e não o valor absoluto de taninos na amostra (HAGERMAN;

BUTLER, 1989).

1.5.3 Métodos Cromatográficos

As separações cromatográficas em gel, papel e camada delgada, têm sido

bastante utilizadas (SHAHIDI & NAZCK, 1995), porém, atualmente, a cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) é a técnica mais utilizada para a identificação e

quantificação de compostos fenólicos.

A cromatografia líquida de alta eficiência trouxe avanços significativos na

análise de produtos naturais. A utilização de colunas com superfície apolar (fase

36

reversa) permitiu a identificação e quantificação de substâncias polares, pouco voláteis e

termolábeis (SADECK, 2000).

As técnicas analíticas por CLAE encontram emprego na identificação e

quantificação de estruturas monoméricas dos taninos, como ácido gálico, ácidoelágico,

catequina e pirogalol; ou estruturas com até 7-8 unidades flavônicas dos taninos

condensados (HARVEY, 2001). HPLC em fase reversa permite separar somente

proantocianidinas de baixo peso molecular, enquanto olígomeros e polímeros são co-

eluídos como um largo pico sem resolução (RIGAUD et al., 1993).

Esta técnica tem sido modificada quer seja na etapa de preparo da amostra ou

extração dos compostos, quer seja na fase móvel e ou estacionária, para uma melhor

separação dos compostos. A identificação propriamente dita é dificultada devido à

grande variabilidade de compostos fenólicos possíveis na natureza, sendo realizada com

segurança porespectrometria de massas acoplada à cromatografia líquida (CLAE-MS)

(NACZK & SHAHIDI, 2004).

1.5.4 Outras Metodologias

O índice de gelatina proposto por Glories, (1984) onde os taninos são

classificados pela sua tendência para precipitarem com gelatina, apresenta falta de

reprodutibilidade, devido a variabilidade na composição e pureza da gelatina.

A metodologia de Adams-Harbertson para a quantificação de taninos - método

BSA - é uma modificação do método de Hagerman e Butler, (1978). O precipitado

tanino-proteína formando pela adição de albumina de soro bovino (BSA), volta a ser

solubilizado e quantificado indiretamente, pela adição de FeCl3 e medição da

absorvância a 510 nm.

A medição da inibição da enzima fosfatasse alcalina pela sua interação com

taninos é outro método indireto. Apresenta como desvantagens detectar somente taninos

com mais de três subunidades flavan-3-ol e as características físico-químicas do

precipitado formado não serem bem conhecidas (ITTAH, 1991; ADAMS E

HARBERTSON, 1999).

Com o objetivo de contornar as desvantagens dos métodos que utilizam

proteinas, Sarneckis et al. (2006), desenvolveram um método de precipitação por

polímeros não proteicos, baseado no método de Montedoro e Fantozzi, (1974).

37

O método baseia-se na precipitação de taninos por metil-celulose (método MCP)

e a sua determinação é feita pela subtracção da absorvância a 280 nm dos compostos

fenólicos antes e após a precipitação dos taninos. Apresenta como vantagem não sofrer

interferência de outros compostos fenólicos que absorvem a 280 nm, como as

antocianinas e catequinas.

A carência de métodos analíticos práticos, rápidos e seguros para a quantificação

de taninos e ainda metodologias que sejam capazes de discriminá-los torna necessária a

busca por técnicas ou instrumentos de medidas e alternativas mais eficientes.

38

Capítulo II

39

Otimização do processo extrativo de taninos e quantificação por difusão radial de

Cedrela odorara L., uma planta medicinal da Caatinga

1 - MATERIAL E MÉTODO

1.1 Material Botânico

Para realização do estudo de otimização foi escolhida as cascas do caule da

planta Cedrela odorata L.(Cedro).

O material vegetal foi coletado, em novembro de 2011, em uma área de

vegetação nativa. Cada amostra foi coletada de pelo menos 5 indivíduos diferentes.

Todo o material foi pulverizado em moinho de facas e padronizado com auxílio de um

tamiz de 20 Mesh.

As amostras de cascas do caule de Cedrela odorata L. foram coletadas na região

do Carão, zona rural do município de Altinho, situado no Agreste Pernambucano a 161,

8 km da cidade de Recife, com área de aproximadamente 454,5 Km2. O clima é

Tropical Chuvoso com verão seco, com temperatura anual média de 24.5°C e vegetação

classificada como Caatinga Subcaducifólia e Caducifólia (CONDEPE/FIDEM, 2008).

1.2 Doseamento de taninos através do método de difusão radial

Utilizou-se como base o método de difusão radial segundo Hagerman (1987).

Uma solução de 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico foi preparada,

sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio (CABRAL et al. 2010),

pois este é o pH ótimo para o tipo de interação tanino-proteína (LÓPEZ et al., 2004).

O gel foi preparado utilizando agarose (tipo I) (Sigma-Aldrich) 1% na solução

descrita previamente. A mistura foi aquecida sob homogeinização até entrar em

ebulição para a completa dissolução da agarose, sendo adicionada posteriormente

albumina sérica bovina (BSA) fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich) na

concentração de 0,1%, após o resfriamento da dispersão até a temperatura de 45°C.

Alíquotas de 10,0 mL desta dispersão foram distribuídas em placas de Petri com

9.,0 cm de diâmetro e deixadas em bancada que foi nivelada com auxílio de um

nivelador digital (Insize), para se obter camadas uniformes de gel até solidificação total.

40

Utilizando um perfurador de 5 mm de diâmetro foram feitos poços, distando 2,0 cm um

do outro e das bordas das placas, com capacidade para aproximadamente 32 μL. Com o

auxílio de micropipeta, uma alíquota de 24 μL de cada extrato foi aplicada aos poços.

Todas as amostras foram processadas em triplicatas autênticas. Para a obtenção

da curva padrão preparou-se uma solução aquosa de ácido tânico com concentração de

25 mg/mL. Alíquotas de 2, 4, 8, 12, 16 e 20 μL foram colocadas nos poços em

triplicata. O ensaio descrito se baseia na propriedade que os taninos possuem de

formarem complexos estáveis e insolúveis com proteínas, formando um anel claramente

visível cuja área é linearmente proporcional a quantidade de tanino que foi colocada no

poço.

As placas foram escaneadas e utilizou-se o programa Corel Draw© X3 Versão

13 para mensurar os diâmetros dos anéis. Ao redor de cada anel foi desenhado um

círculo, utilizando o modelo do programa, sendo registrados dois diâmetros

perpendiculares, obtendo-se uma média do diâmetro de cada anel. De acordo com

Hagerman (1987) para facilitar os cálculos utiliza-se, ao invés das áreas, os quadrados

das médias dos diâmetros obtidos. As leituras dos anéis da curva padrão foram plotadas

num gráfico de dispersão para obtenção da equação da reta por meio de regressão linear

com o auxílio do software Excel versão 2003 (CABRAL et al. 2010).

1.3 Modificações realizadas no método de difusão radial para otimização

Na metodologia original desenvolvida por Hagerman (1987), o material vegetal

deve ser extraído durante uma hora a temperatura ambiente utilizando metanol:água

50% (v/v), numa razão planta:solvente de 200mg por ml. As modificações propostas

para otimização da extração foram feitas de acordo com:

Tipo de extração: Além da maceração durante uma hora realizada no método

original, foram também realizadas maceração durante 2h e extração durante 30

minutos em aparelho de ultrassom com aquecimento a 60ºC.

Solvente: além do Metanol na proporção 50% (v/v), foram também utilizados

Metanol 80% (v/v), Etanol 50% (v/v), Etanol 80% (v/v), Acetona 50% (v/v) e

Acetona 70% (v/v).

41

Massa vegetal: foram utilizadas massas de 200mg como descrito na metodologia

original e de 100mg com a mesma proporção de solvente.

1.4 Análise estatística

Foi utilizado o teste Kolmogorov-Smirnov para avaliar a normalidade dos dados.

Os dados foram expressos como médias ± desvio-padrão. Foram realizadas análises de

variância ANOVA: one way seguido de comparações múltiplas pelo teste de Tukey. As

diferenças foram consideradas significativas ao nível de p<0,05. O programa BioEstat

5.0 foi utilizado para realização das análises estatísticas (PIMENTEL, BARROS NETO,

2002).

2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A planta Cedrela odorata L. foi escolhida por ter apresentado um baixo teor de

taninos em estudos anteriores (SIQUEIRA, 2011), sendo qualquer melhora mais

facilmente detectada e representativa. As cascas do caule foram utilizadas para o estudo,

pois a disponibilidade desta parte do vegetal é independente de fatores climáticos. Nas

condições testadas os teores de taninos para Cedrela odorata L. variaram de 0,63% a

3,58% sendo considerada uma variação significativa. Com relação aos solventes

testados a análise dos dados (Tabela 1) evidenciou que a acetona 50% obteve resultado,

em teores absolutos, superior aos outros solventes utilizados, em todas as condições

testadas. Para confirmação, os dados foram analisados estatísticamente, obtendo-se que

a acetona 50% é superior e estatisticamente diferente (p<0.05) quando comparada com

etanol 50 e 80 % e metanol 50% e 80%, exceto quando estes solventes são utilizados em

conjunto com o aparelho de ultrassom. Foram obtidos também resultados com diferença

não estatística, em algumas condições testadas, quando comparado com acetona 70%.

42

TABELA 1 - Análise de variância para comparação do potencial de extração dos solventes

utilizados

Solvente 100mg (1h) 100mg (2h) 200mg (1h) 200mg (2h) 100mg (UTS 30’) 200mg (UTS 30’)

Acetona 50% 2,00 a 2,16 a 2,99 a 2,94 a 3,58 a 3,39 a

Acetona 70% 1,53 b 1,76 b 2,50 a 2,86 a 2,93 ab 3,27 a

Etanol 50% 1,39 c 1,36 c 1,48 b 1,59 b 2,20 bc 2,79 ab

Etanol 80% 0,63 d 0,81 d 0,92 b 1,05 c 1,43 c 1,88 c

Metanol 50% 1,23 e 1,52 bc 1,49 b 1,55 b 2,54 b 2,03 b

Metanol 80% 0,91 f 1,21 c 1,40 b 1,50 b 2,10 bc 2,50 ab

a,b,c,d,d,e,f: Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si

(p<0,05);

Acredita-se que, a aproximação dos valores de teores de taninos encontrada

quando da utilização de metanol 80% e etanol 50% aos da acetona 50%, quando estes

são utilizados em conjunto com aparelho de ultrassom e 200mg de massa vegetal, deve-

se a saturação do solvente, devido ao método de extração por ultrassom se mostrar mais

eficiente que a maceração. Analisando-se apenas a extração com metanol 50%,

verificou-se que com a massa de 100 mg de vegetal, o método de extração por ultrassom

a 60ºC é mais eficiente que maceração à temperatura ambiente, tanto para o tempo 1

hora quanto 2 horas. A análise de variância confirma esta afirmação apresentando um

p< 0,05. Para comparação entre os métodos de extração, o mesmo resultado foi

demonstrado para acetona 50% que, como descrito previamente, apresentou os maiores

teores. Convém salientar que a diferença estatística quando da comparação entre

métodos de extração tanto para a acetona 50% quanto para o metanol 50% foi

encontrada apenas com a utilização de 100mg. Quando da utilização de 200 mg esta

diferença não foi estatística, fato este atribuído a saturação mais rápida do solvente por

ser utilizada uma maior quantidade de massa vegetal, conseguindo a maceração, com

um maior tempo de extração equivaler a extração por ultrassom.

A acetona 50-70% também foi indicada como melhor solvente para extração de

taninos em estudo realizado por Agostini-Costa, Lima e Lima. (2003). Nele foram

comparadas extrações em pedúnculo de cajú por diversos solventes: metanol puro, HCl

1%, metanol 50%, etanol 50%, etanol 70%, água destilada, acetona 50% e acetona 70%

para emprego dos extratos em diferentes metodologias para quantificação de taninos. Os

43

resultados obtidos com acetona 50 e 70% se mostraram superiores em relação aos

demais solventes e semelhantes entre si.

Resultados semelhantes foram obtidos por Queiroz e colaboradores (2002), que

comparou a extração de taninos da Astronium urundeuva entre acetona 70% e metanol

80%, para doseamento por diferentes metodologias. Foi demonstrado que a Acetona

70% aumenta em 3,7% o rendimento da extração quando comparado ao metanol 80%.

Na tabela 1 pode-se também observar que, comparando-se o mesmo solvente

com diferentes teores de água os resultados tem uma relação diretamente proporcional

ao aumento do teor de água. O mesmo foi constatado em estudo realizado por Ardisson

e colaboradores (2002) onde foram comparados os teores de taninos em extratos

glicólicos que diferiam entre si apenas pelo teor de água. Foi observado que o extrato

PGL 70 se apresentou mais rico em taninos quando comparado com o PGL 80 e 90, tal

fato foi atribuído à acidez dos taninos, que justificaria sua afinidade por solventes com

maior proporção de água.

Os bons resultados provenientes da extração pela metodologia de ultrassom se

devem, provavelmente, as peculiaridades deste método, que utiliza a energia das ondas

sonoras geradas em frequência superior à capacidade auditiva do ser humano. Estas

ondas criam uma variação de pressão do líquido empregado no processo, gerando

cavitação. A utilização de ondas ultra-sônicas de alta frequência, causa mudanças físicas

e químicas permanentes por conduzirem cavitação e microfluxos nos líquidos,

aquecimento e ruptura nos sólidos (BERLAN et al., 1992)

A eficiência desta técnica de extração é citada como sendo igual ou melhor do

que a obtida com o extrator Soxhlet, apresentando as vantagens de alta

reprodutibilidade, possibilidade de utilização para uma ampla gama de tamanhos de

amostras, rapidez de processamento e baixo custo (SARGENTI et al., 2000)

O aumento do teor de taninos quando extraídos por esta metodologia pode ser

explicado por 3 fatores: O aumento da permeabilidade da parede celular vegetal,

permitindo deste modo uma maior liberação dos taninos, a produção de cavitação, o que

resulta no aumento da superfície de contato entre a amostra e o solvente extrator e o

aumento da tensão mecânica das células, que por sua vez ficam mais permeáveis ao

solvente (LIST E SCHMIDT, 1989).

Resultados semelhantes com a utilização de ultrassom em comparação com a

técnica de maceração foram obtidos por Melecchi e colaboradores (2005). No presente

estudo foram empregadas comparativamente técnicas extrativas: Soxhlet, maceração,

44

ultrassom, líquido supercrítico, entre outros. para caracterização química de extratos de

Hibiscus tiliaceus L. e foi observado um rendimento superior das amostras extraídas a

partir do método de ultrassom em relação à maceração.

A comparação estatística entre os estudos realizados com diferentes massas, 100

e 200 mg revelou que para o metanol 50% há diferença estatística apenas para o tempo

de 1h de extração (Tabela 2). Com a acetona 50% essa diferença é também detectada

com o tempo de 2h de extração (Tabela 3). Tal fato não é observado quando da

utilização do ultrassom em nenhum dos solventes.

TABELA 2. Comparação entre massas para valores fixos de tempo e mesmo tipo de extração utilizando metanol 50%

Condição Valor de p Valor de F

Cedro 100mg (1h) x Cedro

200mg (1h)

< 0,05

16.0891


200mg (2h)

> 0,05

0.0926

Cedro 100mg (ultrassom

30’) x Cedro 200mg

(ultrassom 30’)

> 0,05

1.5199

TABELA 3. Comparação entre massas para valores fixos de tempo e mesmo tipo de

extração utilizando acetona 50%



200mg (1h)

< 0,05

22.4233


200mg (2h)

< 0,05

32.9424

Cedro 100mg (ultrassom

30’) x Cedro 200mg

(ultrassom 30’)

> 0,05

0.3864

Estas diferenças podem ser explicadas pela saturação do solvente durante a

extração. Para o metanol 50%, utilizando-se uma maior quantidade de massa vegetal

(200 mg) haverá uma maior quantidade de taninos disponíveis, isto somado ao aumento

45

da superfície de contato entre o solvente e o material vegetal causa uma rápida saturação

do solvente. Com 1h de extração o extrato de 200 mg atinge o seu ponto de saturação,

contudo este tempo não é suficiente para o saturar o solvente com a massa de 100mg e é

observada uma diferença estatística entre eles (Tabela 2). Com 2h de extração o extrato

que utiliza 100mg de massa vegetal também atinge o ponto de saturação e ambos

passam a ser estatisticamente semelhantes.

Na utilização de acetona 50% com o tempo de duas horas de extração, esta

diferença continua a ser observada. Supõe-se que isto se deva ao maior poder extrativo

deste solvente, sendo necessária uma maior quantidade de compostos extraídos para que

haja saturação, isto é, o tempo de 2h de extração ainda não é suficiente para que o

sistema que utiliza 100mg de massa vegetal se iguale ao que utiliza 200mg, pois

supostamente, com uma menor massa vegetal, todos os compostos que haviam para ser

extraídos o foram, e esta quantidade não foi suficiente para saturação do solvente. Esta

diferença passa a não existir com a extração por ultrassom, pois o fenômeno da

cavitação torna a parede celular mais permeável e aumenta a quantidade de compostos

disponíveis para extração, com isso o extrato de 100mg consegue atingir o ponto de

saturação.

A afirmação acima pode ser confirmada pela comparação entre os tempos de

extração, tanto para acetona quanto para o metanol 50% só foi observada diferença

estatística entre 1 e 2h de extração quando a massa de 100mg foi utilizada (Tabelas 4 e

5).

TABELA 4. Comparação entre tempos para valores fixos de massa e mesmo tipo de extração com metanol 50%



100mg (2h)

< 0,05

13.5956


200mg (2h)

> 0,05

0.6403

46

TABELA 5. Comparação entre tempos para valores fixos de massa e mesmo tipo de

extração com acetona 50%

Reafirmando que, para o metanol 50%, com a utilização de 200mg o tempo para

se atingir a saturação do solvente é menor, 1h torna-se suficiente, para o extrato de

100mg não, e por isso o tempo de extração torna-se relevante. Já para acetona 50%,

devido ao seu maior poder extrativo, com 1h de extração utilizando-se 200mg,

consegue-se atingir o nível de saturação do solvente, já com a utilização de 100mg

ocorre o esgotamento dos compostos extraídos, não havendo saturação, mesmo com o

tempo de 2h de extração.

3.CONCLUSÃO

Os resultados apresentados nos permitem concluir que a utilização do aparelho

de ultrassom frente à maceração e a substituição do metanol 50%, originalmente

utilizado no método descrito por Hagerman (1987), pela acetona 50%, tornará os

resultados das quantificações de taninos feitas por Difusão Radial superiores, mais

precisos e confiáveis. O aparelho de ultrassom além de ser mais eficiente, reduz o

tempo e a massa vegetal necessária, e elimina as possíveis diferenças que podem vir a

ocorrer diante das variações das condições da extração por maceração (tempo de

extração, massa vegetal, etc.) somado isto ao fato de a acetona 50% ter se mostrado o

solvente com maior capacidade extrativa para taninos.



100mg (2h)

< 0,05

13.5956


200mg (2h)

> 0,05

0.5279

47

Capítulo III

48

Validação de metodologia analítica para determinação de taninos pelo método de

difusão radial

1. MATERIAL E MÉTODO

1.1 Reagentes e equipamentos

O solvente usado foi metanol (Vetec Química Fina, 99,8%). Os reagentes foram

ácido acético glacial (Merck, 99,8%), hidróxido de sódio (Vetec Química Fina, 99%),

ácido ascórbico 99,5% (Vetec Química Fina), agarose tipo I (Sigma-Aldrich) e

albumina sérica bovina fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich). Como padrão

para taninos foi utilizado ácido tânico 99,5% (Vetec Química Fina).

As pesagens foram realizadas em balança analítica Shimadzu AX200 e as

diluições com micropipetas monocanal de volume variável HTL Lab Solutions. A

bancada de vidro foi nivelada com inclinômetro Insize C7. As análises de pH foram

realizadas em pHmetro de bancada Tecnopon mPA210.

1.2 Preparação do gel

Foi preparada uma solução 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico,

sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio em pérolas pois este é o

pH ideal para a interação tanino-proteína (López et al., 2004). O gel foi preparado

utilizando agarose (1%, p/v) na solução descrita previamente. A mistura foi

homogeneizada sob aquecimento e, após o resfriamento a 45°C, foi adicionada

albumina sérica bovina (0,1%, p/v). Alíquotas de 10 mL do gel foram distribuídas em

placas de Petri (90 mm x 15 mm) nas quais foram feitos poços com o auxílio de um

perfurador de 5 mm de diâmetro. As amostras foram aplicadas nos poços com

micropipetas.

1.3 Procedimentos experimentais

Para avaliar a robustez e a recuperação do método, 100 mg da amostra seca e

pulverizada de cedro (Cedrela odorata L.), foram pesados e transferidos para tubos de

penicilina, sendo adicionado 1 mL de acetona 50% para extração durante 60 minutos.

49

Os extratos foram filtrados por aspirados. Deste filtrado, 24 µL foram aplicados nos

poços.

As placas contendo os halos com amostras vegetais e padrão ácido tânico foram

escaneadas e foi utilizado o programa Corel Draw© X3 Versão 13 para mensuração dos

diâmetros dos halos.

1.4 Parâmetros da validação

Para a linearidade foi usada a média de três intervalos com repetições autênticas,

que contemplavam seis concentrações da solução de ácido tânico 25 mg/mL (100 - 600

μg/poço) Após relação linear visual, os resultados foram analisados estatisticamente

para definir o coeficiente de determinação, a equação de regressão, o ajuste linear e o

desvio padrão relativo (Barros Neto et al., 2002; Brasil, 2003). Os limites de detecção e

quantificação foram estimados (em μg/poço) considerando o desvio padrão em razão ao

coeficiente angular (inclinação da reta) obtidos pela linearidade, nos quais foram

utilizadas as equações 1 e 2 para determinar o limite de detecção e quantificação,

respectivamente (Brasil, 2003).

LD = DPa × 3/IC (1)

LQ = DPa × 10/IC (2)

Onde o LD é o limite de detecção; LQ é o limite de quantificação; DPa é o desvio-

padrão relativo; IC é a inclinação de curva de calibração.

O parâmetro recuperação foi realizado com três amostras em triplicata e o

resultado foi obtido através da equação 3. Os fatores a serem considerados para analisar

a robustez foram: tempo de extração (60 e 120 minutos) e estabilidade de leitura (3 e 4

dias), o que está de acordo com o preconizado pela ANVISA (Brasil, 2003). Os

resultados foram avaliados mediante comparação através da análise de variância.

R(%) = CTE/CTNE × 100 (3)

50

Onde CTE compreende a concentração total de taninos extraídos (simulação do

processo extrativo) e CTNE é a concentração de taninos não extraídos. R (%) é a

recuperação obtida (Brasil, 2003).

Os ensaios de repetitividade e precisão intermediária foram determinados por

seis amostras de mesma concentração, executados no mesmo dia (intra-corrida), e em

dois dias consecutivos por analistas diferentes (inter-corrida) (Brasil, 2003). Os

resultados foram expressos como desvio padrão relativo (Equação 4). A exatidão foi

avaliada por três controles (em sextuplicata) de concentração baixa, média e alta. A

exatidão (Equação 5) foi calculada, individualmente para cada controle.

DPR(%) = DP/CMD × 100 (4)

E(%) = CME/CT × 100 (5)

Onde o DPR (%) é a precisão; DP é o desvio-padrão; CMD é a concentração média

determinada; E (%) é a exatidão; CME é a concentração média experimental; e CT é a

concentração teórica.

2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O método validado apresentou linearidade para as concentrações estudadas (100

a 600 µg/poço). A equação da regressão linear média obtida a partir de três curvas de

calibração foi y = 0,646x + 36,664, onde y é o diâmetro quadrado (mm2) e x a

concentração (µg/poço) em equivalentes de ácido tânico. Como mostrado na Figura 1,

o coeficiente de determinação obtido foi R² = 0,9965, comprovando a adequação do

método ao intervalo avaliado (Brasil, 2003). Os dados de precisão (DPR) e exatidão (E)

do intervalo do método são apresentados na Tabela 1.

51

FIGURA 1. Curva de calibração construída com padrão ácido tânico (100 a 600 µg/poço)

onde a equação linear média obtida foi y = 0,646x + 36,664 e R² = 0,9965.

TABELA 1. Resultados do teste de linearidade por difusão radial para taninos, utilizando-se

ácido tânico como padrão.

Concentração teórica

(µg/mL) C (n=3) DP DPR (%) E (%)

100 93,95 2,81 2,99% 93,95%

200 191,92 6,29 3,28% 95,96%

300 298,22 10,25 3,44% 99,41%

400 406,94 7,14 1,76% 101,74%

500 517,95 23,58 4,55% 103,59%

600 586,56 39,93 6,81% 97,76%

C = Concentração média (µg/poço) de três determinações; DP = Desvio-padrão; DPR

(%) = Desvio-Padrão Relativo (Precisão); E (%) = Exatidão.

Os valores dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) estimados pelas

equações 1 e 2, foram 8,32 e 27,72 µg/poço, respectivamente. Com esses resultados,

verificamos que o método possui alta sensibilidade para detectar e quantificar o padrão,

sem sofrer alteração de fatores intrínsecos do método.

52

A análise de variância ANOVA confirmou que o método proposto foi

considerado linear e indica que não há falta de ajuste (p<0,05) (Pimentel, Barros Neto,

2002), como pode ser visto na Tabela 2.

TABELA 2. Resultados da Análise de Variância (ANOVA) e teste de ajuste linear (p<0,05) do

parâmetro linearidade da validação.

ANOVA

Fonte SQ gL MQ F FCrítico

Modelo 540053,86 1 540053,86 1317,33 4,49

Residual 6559,38 16 409,96 Curva Linear

Falta de ajuste 1851,31 4 462,83 1,18 3,26

Erro puro 4708,07 12 392,34 Não há falta de ajuste

Total 546613,24 17 32153,72

SQ: soma de quadrados; gL:graus de liberdade; MQ: quadrado

médio; F: distribuição de Fisher-snedecor.

A recuperação que mede a eficiência do procedimento de extração do método

proposto foi 85,96% (Brasil, 2003). A análise de variância ANOVA confirmou que o

método proposto foi considerado robusto (p=0,095) (Pimentel, Barros Neto, 2002).

Os dados da repetitividade, precisão intermediária (intradia e interdia) e exatidão

do método encontram-se na Tabela 3.

TABELA 3. Resultados da repetitividade, precisão intermediária e exatidão do método de

quantificação de taninos por difusão radial.

Ensaio Concentração

teórica (µg/poço) C DP DPR (%) E (%)

Repetitividade 200,0 203,37 8,41 4,14 101,68

Precisão

intermediária

Analista 1 200,0 203,39 8,39 4,13 101,70

200,0 200,94 14,12 7,03 100,47

Analista 2 200,0 203,33 13,89 6,83 101,67

200,0 210,53 6,79 3,23 105,26

Exatidão

100,0 103,56 2,37 2,28 103,56

200,0 206,24 3,90 1,89 103,12

300,0 309,85 9,80 3,16 103,28

53

C = Concentração média (µg/poço) das n determinações; DP = Desvio-Padrão; DPR

(%) = Desvio-Padrão Relativo; E (%) = Exatidão.

Os ensaios de repetitividade (intradia) e precisão intermediária (interdia) estão

dentro dos parâmetros exigidos, com valores compreendidos entre 1,89 e 7,03%. Para o

ensaio de exatidão foram encontrados resultados entre 100,47 e 105,26%. A ANVISA

regulamenta que os resultados da exatidão não devem ser inferiores a 95% (Brasil,

2003). Estes dados confirmam que o método proposto encontra-se em conformidade

com a legislação vigente e apresenta confiabilidade dos resultados. O teste t de Student

apontou que não há diferenças estatísticas entre as concentrações determinadas e as

concentrações teóricas (µg/poço).

Esta metodologia vem sendo amplamente utilizada em laboratórios de estudos

de fitoterápicos, pois representa uma maneira simples e rápida de determinação do teor

de taninos de uma determinada espécie ou gênero (Melo et al., 2010)., em comparação

com outras metodologias já existentes, que geralmente são laboriosas, demoradas,

empregam produtos químicos que exigem condições especiais de manipulação e,

sobretudo, são inespecíficas.

A maior aplicabilidade do método de difusão radial encontra-se quando da

necessidade de análise de um grande número de amostras, requisitada principalmente

em estudos de triagem para seleção de plantas com potenciais atividades terapêuticas, e

os que visam comparação de determinadas condições a que a espécie vegetal está

submetida e como estas condições são refletidas no metabolismo secundário da planta

(Cabral et al., 2010; Siqueira et al., 2011).

3. CONCLUSÃO

O método proposto apresenta linearidade. A recuperação mostra que

aproximadamente 85% dos taninos presentes na amostra podem ser quantificados por

este método. Os resultados de precisão e exatidão obtidos atestam confiabilidade

necessária para o uso desta metodologia em laboratórios de controle de qualidade. O

método de quantificação por difusão radial mostrou-se preciso, exato e reprodutível,

aliado a acessibilidade e facilidade de execução.

54

Conclusão Geral

55

CONCLUSÃO

A quantificação de taninos através da metodologia de Difusão Radial se mostrou

bastante rápida, segura, econômica e muito útil em estudos onde uma grande quantidade

de amostras precisa ser analisada. Fato este devido a sua simplicidade quando

comparada as outras metodologias que na maioria das vezes são métodos laboriosos e

empregam reagentes específicos. Entretanto o método deve ser usado com cautela, não

sendo recomendada para determinação do valor do teor total de taninos e sim como uma

medida do potencial biológico destas moléculas.

Foi demonstrado neste trabalho que algumas alterações no processo de extração

da metodologia original, ocasionam a otimização deste método, uma vez que aumentam

sua sensibilidade, reduzindo o tempo e a quantidade de material vegetal empregado na

análise.

A substituição do metanol 50%, utilizado na metodologia original, pela acetona

50% acarretou em aumento do diâmetro dos discos em todas as condições testadas,

propondo um maior poder extrativo deste solvente nas condições testadas. A

combinação do emprego da acetona 50% com a utilização do ultrassom reduziu a

metade o tempo necessário para extração e quantidade de massa vegetal, eliminando as

divergências de resultados devido a não saturação dos solventes observadas com a

maceração.

Através do estudo de validação, o método foi considerado linear, preciso,

robusto e exato, uma vez que os valores encontrados para estes parâmetros estão dentro

do intervalo aceitável. O estabelecimento dos limites de detecção e quantificação

revelou um método bastante sensível.

Com os resultados obtidos no estudo de validação pode-se confirmar que o

método é ideal para o doseamento de taninos, podendo ser utilizado com segurança para

as aplicações analíticas. A validação do método, por sua vez, aumenta a credibilidade

nos resultados dos ensaios de quantificação por ele já realizados.

56

Perspectivas

57

PERSPECTIVAS

O doseamento de taninos através da difusão radial tem se mostrado um método

promissor, pois é simples rápido e eficiente. Contudo há a necessidade de

aprimoramento da técnica para obtenção de resultados padronizados e consequente

aumento da credibilidade destes.

A otimização do processo de extração e a validação do método foram um passo

importante para o alcance desse objetivo, uma vez que a utilização do ultrassom aliado à

pesquisa por um solvente com maior capacidade extratora para taninos minimiza as

disparidades nos resultados decorrentes de um processo extrativo ineficiente.

Por sua vez a validação do método é a prova documentada de que este satisfaz os

requisitos para as aplicações analíticas praticadas, essencial a qualquer metodologia.

Muito ainda pode ser feito, existem ainda várias etapas do método que podem

ser estudadas e melhoradas a fim de tornar a difusão radial uma ferramenta eficiente e

confiável para os laboratórios de análises.

58

Referências

59

REFERÊNCIAS

ADAMS, D. O., E HARBERTSON, J. F. Use of alkaline phosphatase for the analysis of

tannins in grapes and red wines. American Journal of Enology and Viticulture, v.50,

p.247–252, 1999.

AGOSTINI-COSTA, T.S.; LIMA A.; LIMA M. V. Determinação de tanino em

pedúnculo de caju: método da vanilina versus método do butanol ácido. Química Nova,

v.26, n.5, p. 763-765, 2003.

AGUILAR, C.N. GUITIÉRREZ-SÁNCHEZ, G. Review: sources, properties,

applications and potential uses of tannin acly hydrolase. Food Science and Technology

International, v.5, p.373-382, 2001.

APPEL, H.M.; GOVERNOR, H.L.; D’ASCENZO, M. SISKA, E.; SCHULTZ, J.C.

Limitations of folin assays of foliar phenolics in ecological studies. Journal of

Chemical Ecology, v.27, p.761-778, 2001.

ARDISSON, L.; GODOY, J. S., FERREIRA, L. A. M., STEHMANN, J. R.,

BRANDÃO, M. G. L. Preparação e caracterização de extratos glicólicos enriquecidos

em taninos a partir das cascas de Stryphnodendron adstringens (mart.) Coville

(Barbatimão). Revista Brasileira de Farmacognosia, v.12, n.1, p. 27-34, 2002.

AYRES, M. P.; CLAUSEN, T. P.; MACLEAN, S. F.; REDMAN, A. M.;

REICHARDT, P.B. Diversity of structure and antiherbivore activity in condensed

tannins. Ecology, v.78, p.1696-1712, 1997.

BARROS C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, São Paulo, v.64, n.2,

p.175-177, jul./dez., 2002.

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=food%20sci.%20tech.%20int&source=web&cd=1&ved=0CGQQFjAA&url=http%3A%2F%2Ffst.sagepub.com%2F&ei=qYqmT_7NO4ag8gTKrOWrCg&usg=AFQjCNH1HcBLtts-dEG_FHqtuIww50dMFg

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=food%20sci.%20tech.%20int&source=web&cd=1&ved=0CGQQFjAA&url=http%3A%2F%2Ffst.sagepub.com%2F&ei=qYqmT_7NO4ag8gTKrOWrCg&usg=AFQjCNH1HcBLtts-dEG_FHqtuIww50dMFg

60

BARROS, F. M. C. Variabilidade sazonal, atividade amtimicrobiana,

fracionamento bio-guiado, isolamento e elucidação estrutural dos principais

constituintes do óleo essencial de Lippia Alba (MILL.) N. E. Brown. Santa Maria:

UFSM, 2008. 162p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2008.

BARROS NETO, B.; PIMENTEL, M. F.; ARAÚJO, M. C. U. Recomendações para

calibração em química analítica- Parte I. Fundamentos e calibração com um

componente (calibração univariada). Quim. Nova, v.25, n.5, p.856- 865, 2002.

BATE-SMITH, E.C. Astringent tannins of Acer species. Phytochemistry, v.16, p.

1421- 1426, 1977.

BERLAN, J.; TIMOTHY, J. M. Sonochemistry: form research laboratories to industrial

plants. Ultrasonic. v.30, n.4, p.203-212. 1992.

BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). R. E, nº 899 de 29 de

maio de 2003 – Guia para validação de métodos qualitativos e bioanalíticos.

BRUNETON, J. Elementos de Fitoquímica y de Farmacognosia. Ed. Acribia, SA:

Espanha, 1991.

BUTLER, L.G.; RIEDL, D.J.; LEBRYK, D.G.; BLYTT, H.J. Interaction of proteins

with sorghum tannin: mechanism, specificity and significance. Journal of American

Oil Chemistry Society, v.61, n.5, p.916-920, 1984.

CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM, E.L.C.;

ALBUQUERQUE, U.P. Relationship of biometric parameters on the concentration of

tannins in two medicinal plants – a case study. Boletín Latinoamericano y del Caribe

de Plantas Medicinales y Aromáticas, v.9, n.5, p.368-376, 2010.

61

CANNAS, A. Tannins: fascinating but sometimes dangerous molecules. Itaka, 1999.

Disponivel em: PESSINI, G. L. et al. Neolignanas e análise do oleo essencial das folhas

de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var pallescens (C. DC.) Yunck. Revista Brasileira de

Farmacognosia, v. 15, n. 3, p. 199-204, jul/set 2005.

CASTRO, H. G.; CASALI, V. W. D.; BARBOSA, L. C. A.; CECON, P. R.

Rendimento de tanino em dois acessos de carqueja (Baccharis myriocephala ), em

diferentes épocas de colheita em viçosa-MG. Revista Brasileira de Plantas

Medicinais, v.1, n.29, p. 1-6 1999.

CHUNG, K.; WEI, C.; JOHNSON, M.G. Are tannins a double-edged sword in biology

and healt. Trends in Food Science and Technology, v.9, n.4, p.168-175, 1998.

CLAESON, P.; BOHLIN, L. Some aspects of bioassay methods in natural-product

research aimed at drug lead discovery. Trends in Biotechnology. v. 15, n. 7, p. 245-

248, 1997.

CONDEPE/FIDEM - Agência Estadual de Planejamento e Pesquisas de Pernambuco,

2008. Disponível em:

<http://www.condepefidem.pe.gov.br/perfil_municipal/municipios.asp?cod=2>. Acesso

em: 26 de janeiro de 2012.

COSTA, A. F. Farmacognosia. 5. Ed. Lisboa: Calouste Gulbenkian, 1994, v. I.

CRAGG, G. M.; BOYD, M. R.; KHANNA, R.; KNELLER, R.; MAYS, T. D.;

MAZAN, K. D.; NEWMAN D. J.; SAUSVILLE E. A. International collaboration in

drug discovery and development: the NCL experience. Pure and Applied Chemistry,

v. 71, p. 1619-1633, 1999.

62

CUNHA, A. P. Farmacognosia e Fitoquímica. Ed. Fundação Calouste Gulbenkian:

Lisboa, 2009.

DESPHANDE, S.S. CHERYAN, M.SALUNKHE, D.K. Tannin analysis of foods

products. CRC Critical Reviews in Food Science & Nutrition, v.24, p. 401-449, 1986.

DESHPANDE, S.S., SALUNKHE, D.K. Interactions of tannic acid and catechin with

legume starches. Journal of Food Science, v.47, n.6, p.2080-2083, 1982.

EMANUELLI T, SCANDIUZZI M. Validação de processos na indústria farmacêutica.

In: Congresso de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos. 2000; Rio Grande do Sul:

Universidade do Rio Grande do Sul. Anais. 2000. p.57.

ESPIRES RC. Aspectos da metodologia analítica do metronidazol. São Paulo: USP,

1998. 136 p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas. Universidade de São Paulo, São Paulo, 1998.

FICKEL, J.; PITRA, C.; JOEST, B. A.; HOFMANN, R. R. A novel method to evaluate

the relative tannin-binding capacities of salivary proteins. Comparative Biochemistry

and Physiology, v.122,p.225-229, 1999.

FOLIN, O.; DENIS, W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color

reagents. The Journal of Biological Chemistry, v XII, p.239-243, 1912.

FREITAS, V. de. MATEUS, N. Structural features of procyanidin interactions with

salivary proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.738-743,

1981.

FULEKI, T. & FRANCIS, F.J. Quantitative methods for anthocyanins 1. Extraction and

determination of total anthocyanin in cranberries. Journal of Food Science, v.33, p. 72-

77, 1968.

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=crc%20crit.%20rev.%20food%20sci.%20nutr&source=web&cd=1&ved=0CGsQFjAA&url=http%3A%2F%2Fjournalseek.net%2Fcgi-bin%2Fjournalseek%2Fjournalsearch.cgi%3Ffield%3Dissn%26query%3D0099-0248&ei=yqCmT5OnE4mo8gT55-i-Aw&usg=AFQjCNFabiwLP-Sxd5KT0cuz32XfW0m_Nw

63

FULEKI, T. & FRANCIS, F.J. Quantitative methods for anthocyanins 2.

Determination of total anthocyanin and degradation index for cranberry juice,

Journal of Food Science, v.33, p. 78-83, 1968.

GEORGÉ, S.; BRAT, P.; ALTER, P.; AMIOT, M.J. Rapid determination of

polyphenols and vitamin C in plant-derived products. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, v.53, p.1370-1373, 2005.

GIUSTI, M. M. & WROLSTAD, R. E. Characterization and mesasurement of

anthocyanins by UV-visible spectroscopy. In WROLSTAD, R.E. (Ed.). Current

Protocols in Food Analytical Chemistry. New York: Wiley, 2001.

GLORIES, Y. La couleur des vins rouges, 2eme partie. Mesure, origine et

interpretation. Connaissance de la Vigne et du Vin , v.18, p.253–271, 1984.

GOBBO-NETO, L., LOPES, N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no

conteúdo de metabólitos secundários. Química Nova, v. 30, p. 374-381, 2007.

GRAHAM, H. D. Stabilization of the Prussian Blue color in the determination of

polyphenols. Journal of Agricuture Food Chemistry, v. 40, n. 5, p. 801-805, 1992.

GRUNDHÖFER, P.; NIEMETZ, R.; SCHILLING, G.; GROSS, G. G. Biosynthesis and

subcellular distribution of hydrolyzable tannins. Phytochemistry, v.57, p.915- 927,

2001.

HAGERMAN, A.E.; BUTLER, L.G. Choosing appropriate methods and standards for

assaying tannin. Journal of Chemical Ecology, v.15, p.1795-1810, 1989.

HAGERMAN, A., E BUTLER, L. Protein precipitation method for the quantitative

determination of tannins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.26, p.809–

812, 1978.

HAGERMAN, A. E.; BUTLER, L. G. The specificity of proanthocyanidin-protein

interaction. Journal of Biological Chemistry, v.256, p.4494-4497, 1981.

64

HAGERMAN, A.E. Radial difusion method for determining tannin in plant extrats.

Journal of Chemical Ecology, v.13, n.3, p.437-448, 1987

HAGERMAN, A.E.; ZHAO, Y.; JOHNSON, S. Methods for determination of

condensed and hydrolysable tannins. Antinutrients and phytochemicals in foods.

Washington, DC: F. Shahadi: American Chemical Society, v.12, p.12, 209, 1997.

HARVEY, I. M. Analysis of hydrolysable tannins. Animal Feed Science and

Technology, v.91, p.3-20, 2001.

HASLAM, E. Plant polyphenois-vegetable tannins revisited. Cambridge: Cambridge

University Press, 1989.

HEIL, M.; BAUMANN, B.; ANDARY, C.; LINSENMAIR, K.E.; MCKEY, D.

Extraction and quantification of “condensed tannins” as a measure of plant anti-

herbivore defence? Revisiting an old problem. Naturwissenschaften, v.89, p.519-524,

2002.

HERDERICH, M. J., E SMITH, P. A. Analysis of grape and wine tannins: Methods,

applications and challenges. Australian Journal of Grape and Wine Research , v.11,

p.205–214, 2005.

INOUE, K.H., HAGERMAN, A.E. Determination of gallotannin with rhodanine.

Analytical Biochemistry, v. 169, p. 363-369; 1988.

ITTAH, Y. Titration of tannin via alkaline-phosphatase activity. Analytical

Biochemistry, v.192, p.277–280, 1991.

65

JEREZ, M., TOURINO, S., SINEIRO, J., TORRES, J. L., E NUNEZ, M. J.

Procyanidins from pine bark: Relationships between structure, composition and

antiradical activity. Food Chemistry, v.104, p. 518 –527, 2007.

KAWAMOTO, H.; NAKATSUBO, F.; MURAKAMI, K. Stoichiometric studies of

tannin co-precipitation. Phytochemistry, v.41, p.1427-1431, 1996.

KILKUSKIE, R. E.; KASHIWADA, Y.; NONAKA, G.; NISHIOKA, I.; BODNER, A.;

CHENG, Y.; LEE, K. HIV and reverse transcriptase inhibition by tannins. Bioorganic

& Medicinal Chemistry Letters, v.2, n.12, p.1529-1534, 1992.

LEWIS, N.G.; YAMAMOTO, E. Tannins: their place in plant metabolism. In:

HEMINGWAY, R.W.; KARCHESY, J.J (Ed) Chemistry and significance of condensed

tannins. New York: Plenum Press, 1989. P.23-46

LIST, P. H.; SCHMIDT, P. C. Phytopharmaceutical Technology. Boca Raton: CRC,

1989. 374 p.

LÓPEZ, J.; TEJADA, I.; VÁSQUEZ, C.; DE DIOS GARZA, J.; SHIMADA, A.

Condensed tannins in tropical fodder crops and their in vitro biological activity: Part 2.

Journal of the Science and Food Agriculture, v.84, p.295–299, 2004.

LUCK, G.; LIAO, H.; MURAY, N. J.; GRIMMER, H. R.; WARMINSKI, E. E.;

WILLIAMSON, M. P.; LILLEY, T. H.; HASLAM, E. Polyphenols, astringency and

proline-rich proteins. Phytochemistry, v.37, p.357-371, 1994.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X00804229

66

MANGAN, J.L. Nutritional effects of tannins in animal feeds. Nutrition Research

Reviews, v.1, p.209-231, 1998.

MELECCHI, M.I.S. Caracterização química de extratos de Hibiscus tiliaceus L:

estudo comparativo de métodos de extração. Porto Alegre: UFRGS, 2005.197 p.

Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Química, Instituto de Química,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2005.

MELLO, J.P.C.; SANTOS, S.C. Taninos. In: Farmacognosia: da planta ao

medicamento ;Simões, C.M.O.; Schenckel, E.P. (Orgs.). Ed. UFSC: Porto Alegre; 3ª

ed., p. 527-554, 2001

MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALMEIDA E CASTRO, V.T.N.; CABRAL, D.L.V.;

RODRIGUES, M.D.; NASCIMENTO, S.C.; AMORIM, E.L.C.; ALBUQUERQUE,

U.P. Antiproliferative Activity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of

Semi-Arid Northeastern Brazil. Molecules, v.15, p.8534-8542, 2010.

MOLE, S.; ROGLER, J.C.; BUTLER, L. G. Growth reduction by dietary tannins:

different effects due to different tannins. Biochemical Systematics and Ecology, v.21,

p.667-677, 1993.

MONDAL, K.C.; BANERJEE, D.; JANA, M.; PATI, B.R. Colorimetric assay method

for determination of the tannin acyl hidrolase activity. Analytical Biochemistry, v.295,

p.168-171, 2001.

MONTEDORO, G., E FANTOZZI, P. Dosage des tannins dans les moûts et les vins à

l’aide de la methyl cellulose et evolution d’autres fractions phenoliques. Lebensmittel-

Wissenschaft und -Technologie , v.7, p.155–161, 1974.

67

MONTEIRO, J. M.; ALBUQUERQUE, U. P.; ARAÚJO, E. DE L.; AMORIM, E. L. C.

Taninos: uma abordagem da química à ecologia. Química Nova, v. 2, p. 892-896, 2005.

MUELLER-HARVEY, I. Analysis of hydrolysable tannins. Animal Feed Science and

Technology, v. 91, p. 3 - 20, 2001.

NBR ISO/IEC 17025. Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de

Calibração e de Ensaios. 2001 ABNT. RJ. Brasil.

PASTEELNICK LA. Analytical methods validation. In: Berry IR, Nash RA.

Pharmaceutical process validation. New York: Marcel Dekker; 1993. p.411-28.

PECORA M. Validação de métodos analíticos. São Paulo: UNIFAR, 2000. 45p.

Apostila (Curso de Validação) – União Farmacêutica de São Paulo; 2000.

PINTO, T. J. A.; FERRARINI, M.; GATTI, R. M.; Proposta de roteiro prático para a

validação de métodos analíticos. Farmácia & Química, v.36, p. 26-36, 2003.

PORTER, L. J., HRSTICH, L. N., E CHAN, B. G. The conversion of

proanthocyanidins and prodelphenidins to cyanidins and delphenidins. Phytochemistry,

v.25, p.223-230, 1986.

QUEIROZ, C.R.A.A.; MORAIS, S.A.L.; NASCIMENTO, E.A. Caracterizaçao dos

taninos da aroeira-preta (myracrodruon urundeuva). Revista Árvore, v.26, n.4, 2002.

RIBÉREAU-GAYON, P., 1972. Plant Phenolics, Cap. 7, Oliver & Boyd, Edinburgh, p.

169-197.

RIGAUD, J.; ESCRIBANO-BAILON, M. T.; PRIEUR, C.; SOUQUET, J. M.;

CHEYNIER, V. (1993). Normal-phase high-performance liquid chromatographic

68

separation of procyanidins from cacao beans and grape seeds. Journal of

Chromatographic, v.654, p. 255-260, 1993.

SADECK, P. C. Troubleshooting HPLC Systems. New York: Willey, 2000.

SANTOS, M.A.T. Caracterização química das folhas de brócolis e couve- flor

(Brassica oleracea L.) para utilização na alimentação humana. 2000. Dissertação

(Mestrado), UFLA, Lavras, 2000.

SARGENTI, S. R.; VICHNEWSI, W. Sonication and Liquid Chromatography as a

rapid technique. For extraction and fraction of plant material. Phytochemical Analysis.

v.11, n.2, p.69-73. 2000.

SARNECKIS, C. J., DAMBERGS, R. G., JONES, P., MERCURIO, M., HERDERICH,

M. J., E SMITH, P. A. Quantification of condensed tannins by precipitation with

methyl cellulose: development and validation of an optimised tool for grape and wine

analysis. Australian Journal of Grape and Wine Research, v.12, p.39–49, 2006.

SCALBERT, A. Quantitative methods for the estimation of tannins in plant tissues. In

R. W. HEMINGWAY, e P. S. LAKS, Plant Polyphenols: Synthesis, Properties,

Significance. New York: Plenum Press, p.259-280, 1992.

SCHOFIELD, P.; PELL, A.N.; MBUGUA, D.M. Analysis of condensed tannins: a

review. Animal Feed Science and Technology, v. 91, p.21-40, 2001.

69

SGARBIERI, V.C. Proteínas em alimentos proteicos: propriedades – degradações –

modificações. São Paulo: Varela, 1996. Cap.5: Deterioração e modificações químicas,

físicas e enzimáticas de proteínas.

SHAHIDI, F. e NAZCK, M. Extration and analysis of phenolics in food Review.

Journal of Chromatography A, v. 1054, p. 95-111, 2004

SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ,

L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 3ªed. rev. –

Porto Alegre/Florianópolis: Ed. Universidade/UFRGS/Ed. da UFSC, 2001.

SINGLETON, V.; ORTHOFER, R.; E LAMUELA-RAVENTOS, R. M. Analysis of

total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-

Ciocalteau reagent. Methods Enzymol , v. 299, p.152-178, 1999.

SIQUEIRA, C.F.Q.; CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM,

E.L.C.; MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALBUQUERQUE, U.P. Level of Tannins and

Flavonoids in Medicinal Plants: Evaluating Bioprospecting Strategies. Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, v.2012, n.2012, p.1-7, 2011.

STEVANATO, R.; FABRIS, S.; MOMO, F. Enzymatic method for the determination of

total phenolic content in tea and wine. Journal of Agricultural and Food Chemistry,

v.52, p. 6287−6293, 2004.

SUFFREDINI, I.B.; SADER, H.S.; GONÇALVES, A.G.; REIS, A.O.; GALES, A.C.;

VARELLA, A.D.; YONES, R.N. Screening of antibacterial extracts from plants native

to the Brazilian Amazon Rain Forest and Atlantic Forest. Brazilian Journal of Medical

and Biological, v. 37, p.379-84, 2004.

http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=agric.%20food%20chem&source=web&cd=1&sqi=2&ved=0CGMQFjAA&url=http%3A%2F%2Fpubs.acs.org%2Fjournal%2Fjafcau&ei=t9GmT-CmDpGbtwf4x8GBBQ&usg=AFQjCNH5PAfTp8G3y2WT0pD14ztU8PQzEg

70

SUN, B.; RICARDO-DA-SILVA, J. M.; SPRANGER, I. Critical Factors of Vanillin

Assay for Catechins and Proanthocyanidins. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, v.46, p. 4267-4274, 1998.

THIES, M.; FISCHER, R. Photometric bestimmug von gallassäuredurch farbreaktion

mitrhodanine. Mikrochimica Acta, v. 5, p.809-814, 1973.

UNITED STATES PHARMACOPEIA. 33.ed. Rockville U.S.:Pharmacopeial

Convention; 2010.

VERPOORTE, R. Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary

metabolites as leads in drug development. Drug Development Trends, v.3, p.232-238,

1998.

VERPOORTE, R. Pharmacognosy in the new millennium: leadfinding and

biotechnology. Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 52, p. 253-262, 2000.

WILLIS, R. B.; ALLEN, P. R., Improved method for measuring hydrolysable tannins

using potassium iodate. Analyst, v. 123, p. 435-439, 1998.

WILLS, R. B. H.; BONE, K.; MORGAN, M. Herbal products: active constituents

modes of action and quality control. Nutrition Research Reviews, v. 13, p. 47-77,

2000.

WILSON, T.C., HAGERMAN, A.E. Quantitative determination of ellagic acid Journal

of Agricultural and Food Chemistry, v.38, p. 1678-1683, 1990.





APÊNDICE – Artigo enviado para Revista Brasileira de Plantas Medicinais

Validação de metodologia analítica para determinação de taninos pelo método de

difusão radial

Validation of analytical methodology for determination of tannins by radial

diffusion method

LGSantos1*; TJSPeixoto Sobrinho

1; DLVCabral

1; ELCAmorim

1

1Laboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas - Centro

de Ciências da Saúde Universidade Federal de Pernambuco - Av. Prof Arthur de Sá, s/n,

Cidade Universitária 54740-521 - Recife - PE, Brasil

* Corresponding author: [email protected]

RESUMO

A metodologia para doseamento de taninos através de difusão radial desenvolvido por

Hagerman (1987) vem sendo utilizada em laboratórios de fitoterápicos devido

principalmente a sua simplicidade de execução, rapidez e baixo custo, contudo não há

relatos na literatura da submissão desta metodologia a um estudo de validação.

Baseando-se neste fato, o presente estudo visou validar a metodologia de Difusão

Radial para o doseamento de taninos. Todos os parâmetros obrigatórios exigidos pela

RE 899 de 2003 foram avaliados. O método foi considerado linear e com alta

sensibilidade de quantificação (27,72 µg/poço). Mostrou-se também robusto e com

recuperação aceitável (85,96%). Os resultados obtidos para repetitividade (intra-corrida)

e precisão intermediária (inter-corridas), certificaram a precisão do método, obtendo-se

valores entre 1,89 e 7,03%. Para a exatidão valores entre 100,47 e 105,26% foram

obtidos, que se encontra dentro dos limites preconizados pela ANVISA. Sendo assim o

método foi considerado preciso, exato e reprodutível, além de ser de fácil execução e

baixo custo.

Palavras-chave: difusão radial, doseamento de taninos, validação de método,

quantificação.

ABSTRACT

The methodology for determination of tannins by radial diffusion developed by

Hagerman (1987) has been explicitly used in herbal laboratories due mainly to its

simplicity of implementation, speed and low cost, yet there are no reports in the

literature of the submission of this methodology to a study validation. Based on this

fact, this study sought to validate the methodology of Radial Diffusion in the tannins

determination. All mandatory parameters required by ANVISA were evaluated. The

method was considered linear and with high sensitivity quantitation (27.72 g / well). It

was also shown robust and acceptable recovery (85.96%). The results obtained for

repeatability (within-run) and intermediate precision (inter-run), certified the accuracy

of the method, obtaining values between 1.89 and 7.03%. For the accuracy values

between 100.47 and 105.26% were obtained, which is within the limits

recommended by ANVISA. Thus the method was considered precise, accurate

and reproducible, and is easy to perform and inexpensive.

Key words: radial diffusion, tannins content, method validation, quantification.

INTRODUÇÃO

Milhões de medições analíticas são efetuadas a cada dia em laboratórios ao redor

do mundo e, verifica-se a necessidade progressiva de dados analíticos comparáveis e

consistentes, para a eliminação de barreiras técnicas entre os vários países. Para atingir

este processo de reconhecimento mútuo a nível internacional, em que uma vez efetuada

a medição, esta é aceita em qualquer país, requisitos legais, de certificação e de

credenciamento devem ser observados. As normas internacionais, nacionais e sistemas

da qualidade destacam a importância da validação de métodos analíticos e a

documentação do trabalho de validação, para a obtenção de resultados confiáveis e

adequados ao uso pretendido (Barros, 2002).

De acordo com a United States Pharmacopeia XXXIII (2010), “A validação de

métodos assegura a credibilidade destes durante o uso rotineiro, sendo algumas vezes

mencionado como o processo que fornece uma evidência documentada de que o método

realiza aquilo para o qual é indicado para fazer”, ou seja, é a confirmação por exame e

fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um

determinado uso pretendido são atendidos (NBR ISO/IEC 17025, 2001). As

características analíticas típicas usadas na validação de métodos são: exatidão, precisão,

especificidade, limite de detecção, limite de quantificação, linearidade, intervalo de

aceitação, robustez ou resistência e conformidade do sistema (Brasil, 2003; Espires,

1998; Pecora, 2000; Pinto et al., 2003). Portanto, a validação de metodologias analíticas

necessita ser especifica, robusta, sensível, precisa e exata, constituindo fundamental

importância para o controle de qualidade dos produtos e sendo parte das normas de

Boas Práticas de Fabricação e Controle (Barros Neto et al., 2002).

A realização da validação deve ser executada: i) sempre que de forma direta ou

indireta quando o processo de fabricação tenha sido alterado; ii) quando a qualidade

final do produto for duvidosa; iii) em equipamentos novos e iv) em caso de implantação

de um processo ou método analítico novo (Emanuelli, 2000; Pasteelnick, 1993).

O método de difusão radial desenvolvido por Hagerman (1987) para o

doseamento de taninos se fundamenta na propriedade que estes metabólitos secundários

possuem de se complexar com as proteínas. No ensaio, o tanino difunde por um gel

contendo proteína e o precipitado desenvolve uma forma de disco visível à medida que

o tanino interage com a proteína. O método é simples, sensível e específico, e deve ser

especialmente aplicado para estudos nos quais um grande número de amostras será

analisado. Apesar de já bastante utilizado e difundido na comunidade acadêmica, não há

relatos de que a metodologia tenha passado por um processo de validação, estudo este

de extrema importância para se garantir a confiabilidade do método. Neste sentido, o

objetivo deste trabalho foi realizar a validação da metodologia analítica de quantificação

de taninos por difusão radial.

MATERIAL E MÉTODO

Reagentes e equipamentos

O solvente usado foi metanol (Vetec Química Fina, 99,8%). Os reagentes foram

ácido acético glacial (Merck, 99,8%), hidróxido de sódio (Vetec Química Fina, 99%),

ácido ascórbico 99,5% (Vetec Química Fina), agarose tipo I (Sigma-Aldrich) e

albumina sérica bovina fração V livre de ácidos graxos (Sigma-Aldrich). Como padrão

para taninos foi utilizado ácido tânico 99,5% (Vetec Química Fina).

As pesagens foram realizadas em balança analítica Shimadzu AX200 e as

diluições com micropipetas monocanal de volume variável HTL Lab Solutions. A

bancada de vidro foi nivelada com inclinômetro Insize C7. As análises de pH foram

realizadas em pHmetro de bancada Tecnopon mPA210.

Preparação do gel

Foi preparada uma solução 50 mM de ácido acético e 60 μM de ácido ascórbico,

sendo o pH ajustado para 5,0 pela adição de hidróxido de sódio em pérolas pois este é o

pH ideal para a interação tanino-proteína (López et al., 2004). O gel foi preparado

utilizando agarose (1%, p/v) na solução descrita previamente. A mistura foi

homogeneizada sob aquecimento e, após o resfriamento a 45°C, foi adicionada

albumina sérica bovina (0,1%, p/v). Alíquotas de 10 mL do gel foram distribuídas em

placas de Petri (90 mm x 15 mm) nas quais foram feitos poços com o auxílio de um

perfurador de 5 mm de diâmetro. As amostras foram aplicadas nos poços com

micropipetas.

Procedimentos experimentais

Para avaliar a robustez e a recuperação do método, 100 mg da amostra seca e

pulverizada de cedro (Cedrela odorata L.), foram pesados e transferidos para tubos de

penicilina, sendo adicionado 1 mL de acetona 50% para extração durante 60 minutos.

Os extratos foram filtrados por aspirados. Deste filtrado, 24 µL foram aplicados nos

poços.

As placas contendo os halos com amostras vegetais e padrão ácido tânico foram

escaneadas e foi utilizado o programa Corel Draw© X3 Versão 13 para mensuração dos

diâmetros dos halos.

Parâmetros da validação

Para a linearidade foi usada a média de três intervalos com repetições autênticas,

que contemplavam seis concentrações da solução de ácido tânico 25 mg/mL (100 - 600

μg/poço) Após relação linear visual, os resultados foram analisados estatisticamente

para definir o coeficiente de determinação, a equação de regressão, o ajuste linear e o

desvio padrão relativo (Barros Neto et al., 2002; Brasil, 2003). Os limites de detecção e

quantificação foram estimados (em μg/poço) considerando o desvio padrão em razão ao

coeficiente angular (inclinação da reta) obtidos pela linearidade, nos quais foram

utilizadas as equações 1 e 2 para determinar o limite de detecção e quantificação,

respectivamente (Brasil, 2003).

LD = DPa × 3/IC (1)

LQ = DPa × 10/IC (2)

Onde o LD é o limite de detecção; LQ é o limite de quantificação; DPa é o desvio-

padrão relativo; IC é a inclinação de curva de calibração.

O parâmetro recuperação foi realizado com três amostras em triplicata e o

resultado foi obtido através da equação 3. Os fatores a serem considerados para analisar

a robustez foram: tempo de extração (60 e 120 minutos) e estabilidade de leitura (3 e 4

dias), o que está de acordo com o preconizado pela ANVISA (Brasil, 2003). Os

resultados foram avaliados mediante comparação através da análise de variância.

R(%) = CTE/CTNE × 100 (3)

Onde CTE compreende a concentração total de taninos extraídos (simulação do

processo extrativo) e CTNE é a concentração de taninos não extraídos. R (%) é a

recuperação obtida (Brasil, 2003).

Os ensaios de repetitividade e precisão intermediária foram determinados por

seis amostras de mesma concentração, executados no mesmo dia (intra-corrida), e em

dois dias consecutivos por analistas diferentes (inter-corrida) (Brasil, 2003). Os

resultados foram expressos como desvio padrão relativo (Equação 4). A exatidão foi

avaliada por três controles (em sextuplicata) de concentração baixa, média e alta. A

exatidão (Equação 5) foi calculada, individualmente para cada controle.

DPR(%) = DP/CMD × 100 (4)

E(%) = CME/CT × 100 (5)

Onde o DPR (%) é a precisão; DP é o desvio-padrão; CMD é a concentração média

determinada; E (%) é a exatidão; CME é a concentração média experimental; e CT é a

concentração teórica.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O método validado apresentou linearidade para as concentrações estudadas (100

a 600 µg/poço). A equação da regressão linear média obtida a partir de três curvas de

calibração foi y = 0,646x + 36,664, onde y é o diâmetro quadrado (mm2) e x a

concentração (µg/poço) em equivalentes de ácido tânico. Como mostrado na Figura 1,

o coeficiente de determinação obtido foi R² = 0,9965, comprovando a adequação do

método ao intervalo avaliado (Brasil, 2003). Os dados de precisão (DPR) e exatidão (E)

do intervalo do método são apresentados na Tabela 1.

FIGURA 1. Curva de calibração construída com padrão ácido tânico (100 a 600 µg/poço)

onde a equação linear média obtida foi y = 0,646x + 36,664 e R² = 0,9965.

TABELA 1. Resultados do teste de linearidade por difusão radial para taninos, utilizando-se

ácido tânico como padrão.

Concentração teórica

(µg/mL) C (n=3) DP DPR (%) E (%)

100 93,95 2,81 2,99% 93,95%

200 191,92 6,29 3,28% 95,96%

300 298,22 10,25 3,44% 99,41%

400 406,94 7,14 1,76% 101,74%

500 517,95 23,58 4,55% 103,59%

600 586,56 39,93 6,81% 97,76%

C = Concentração média (µg/poço) de três determinações; DP = Desvio-padrão; DPR

(%) = Desvio-Padrão Relativo (Precisão); E (%) = Exatidão.

Os valores dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) estimados pelas

equações 1 e 2, foram 8,32 e 27,72 µg/poço, respectivamente. Com esses resultados,

verificamos que o método possui alta sensibilidade para detectar e quantificar o padrão,

sem sofrer alteração de fatores intrínsecos do método.

A análise de variância ANOVA confirmou que o método proposto foi

considerado linear e indica que não há falta de ajuste (p<0,05) (Pimentel, Barros Neto,

2002), como pode ser visto na Tabela 2.

TABELA 2. Resultados da Análise de Variância (ANOVA) e teste de ajuste linear (p<0,05) do

parâmetro linearidade da validação.

ANOVA

Fonte SQ gL MQ F FCrítico

Modelo 540053,86 1 540053,86 1317,33 4,49

Residual 6559,38 16 409,96 Curva Linear

Falta de ajuste 1851,31 4 462,83 1,18 3,26

Erro puro 4708,07 12 392,34 Não há falta de ajuste

Total 546613,24 17 32153,72

A recuperação que mede a eficiência do procedimento de extração do método

proposto foi 85,96% (Brasil, 2003). A análise de variância ANOVA confirmou que o

método proposto foi considerado robusto (p=0,095) (Pimentel, Barros Neto, 2002).

Os dados da repetitividade, precisão intermediária (intradia e interdia) e exatidão

do método encontram-se na Tabela 3.

TABELA 3. Resultados da repetitividade, precisão intermediária e exatidão do método de

quantificação de taninos por difusão radial.

Ensaio Concentração

teórica (µg/poço) C DP DPR (%) E (%)

Repetitividade 200,0 203,37 8,41 4,14 101,68

Precisão

intermediária

Analista 1 200,0 203,39 8,39 4,13 101,70

200,0 200,94 14,12 7,03 100,47

Analista 2 200,0 203,33 13,89 6,83 101,67

200,0 210,53 6,79 3,23 105,26

Exatidão

100,0 103,56 2,37 2,28 103,56

200,0 206,24 3,90 1,89 103,12

300,0 309,85 9,80 3,16 103,28

C = Concentração média (µg/poço) das n determinações; DP = Desvio-Padrão; DPR

(%) = Desvio-Padrão Relativo; E (%) = Exatidão.

Os ensaios de repetitividade (intradia) e precisão intermediária (interdia) estão

dentro dos parâmetros exigidos, com valores compreendidos entre 1,89 e 7,03%. Para o

ensaio de exatidão foram encontrados resultados entre 100,47 e 105,26%. A ANVISA

regulamenta que os resultados da exatidão não devem ser inferiores a 95% (Brasil,

2003). Estes dados confirmam que o método proposto encontra-se em conformidade

com a legislação vigente e apresenta confiabilidade dos resultados. O teste t de Student

apontou que não há diferenças estatísticas entre as concentrações determinadas e as

concentrações teóricas (µg/poço).

Esta metodologia vem sendo amplamente utilizada em laboratórios de estudos

de fitoterápicos, pois representa uma maneira simples e rápida de determinação do teor

de taninos de uma determinada espécie ou gênero (Melo et al., 2010)., em comparação

com outras metodologias já existentes, que geralmente são laboriosas, demoradas,

empregam produtos químicos que exigem condições especiais de manipulação e,

sobretudo, são inespecíficas.

A maior aplicabilidade do método de difusão radial encontra-se quando da

necessidade de análise de um grande número de amostras, requisitada principalmente

em estudos de triagem para seleção de plantas com potenciais atividades terapêuticas, e

os que visam comparação de determinadas condições a que a espécie vegetal está

submetida e como estas condições são refletidas no metabolismo secundário da planta

(Cabral et al., 2010; Siqueira et al., 2011).

CONCLUSÃO

O método proposto apresenta linearidade. A recuperação mostra que

aproximadamente 85% dos taninos presentes na amostra podem ser quantificados por

este método. Os resultados de precisão e exatidão obtidos atestam confiabilidade

necessária para o uso desta metodologia em laboratórios de controle de qualidade. O

método de quantificação por difusão radial mostrou-se preciso, exato e reprodutível,

aliado a acessibilidade e facilidade de execução.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado

de Pernambuco (FACEPE) pela bolsa de Doutorado concedida a D.L.V. Cabral e a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES) pela bolsa

de Pós-Doutorado concedida a T.J.S. Peixoto Sobrinho e de Mestrado concedida a L. G.

Santos, ao Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto e sua equipe do Laboratório de Tecnologia

dos Medicamentos (LTM-UFPE) pelo apoio dado durante todo o estudo.

REFERÊNCIAS

ATHAIDE A. Validação comprova e documenta qualidade dos produtos e

equipamentos. Controle de Contaminação. 2000; maio/jun.:16-22.

BARROS NETO, B.; PIMENTEL, M. F.; ARAÚJO, M. C. U. Recomendações para

calibração em química analítica- Parte I. Fundamentos e calibração com um

componente (calibração univariada). Quim. Nova, v.25, n.5, p.856- 865, 2002.

BARROS C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, São Paulo, v.64, n.2,

p.175-177, jul./dez., 2002

BRASIL, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). R. E, nº 899 de 29 de

maio de 2003 – Guia para validação de métodos qualitativos e bioanalíticos.

CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM, E.L.C.;

ALBUQUERQUE, U.P. Relationship of biometric parameters on the concentration of

tannins in two medicinal plants – a case study. Boletín Latinoamericano y del Caribe de

Plantas Medicinales y Aromáticas, v.9, n.5, p.368-376, 2010.

EMANUELLI T, SCANDIUZZI M. Validação de processos na indústria farmacêutica.

In: Congresso de Produtos Farmacêuticos e Cosméticos. 2000; Rio Grande do Sul:

Universidade do Rio Grande do Sul. Anais. 2000. p.57.

ESPIRES RC. Aspectos da metodologia analítica do metronidazol. São Paulo: USP,

1998. 136 p. [Dissertação – Mestrado em Ciências Farmacêuticas]. Universidade de São

Paulo; 1998.

HAGERMAN, A.E. Radial difusion method for determining tannin in plant extrats.

Journal of Chemical Ecology, 13(3): 437-448, 1987.

LÓPEZ, J.; TEJADA, I.; VÁSQUEZ, C.; DE DIOS GARZA, J.; SHIMADA, A.

Condensed tannins in tropical fodder crops and their in vitro biological activity: Part 2.

Journal of the Science and Food Agriculture, 84: 295-29, 2004.

MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALMEIDA E CASTRO, V.T.N.; CABRAL, D.L.V.;

RODRIGUES, M.D.; NASCIMENTO, S.C.; AMORIM, E.L.C.; ALBUQUERQUE,

U.P. Antiproliferative Activity, Antioxidant Capacity and Tannin Content in Plants of

Semi-Arid Northeastern Brazil. Molecules, v.15, p.8534-8542, 2010.

NBR ISO/IEC 17025. Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de

Calibração e de Ensaios. 2001 ABNT. RJ. Brasil.

PASTEELNICK LA. Analytical methods validation. In: Berry IR, Nash RA.

Pharmaceutical process validation. New York: Marcel Dekker; 1993. p.411-28.

PECORA M. Validação de métodos analíticos. São Paulo: UNIFAR, 2000. 45p.

Apostila (Curso de Validação) – União Farmacêutica de São Paulo; 2000.

PINTO TJA, FERRARINI M, GATTI RM. Proposta de roteiro prático para a validação

de métodos analíticos. Farmácia & Química. 2003;36:26-36.

SIQUEIRA, C.F.Q.; CABRAL, D.L.V.; PEIXOTO SOBRINHO, T.J.S.; AMORIM,

E.L.C.; MELO, J.G.; ARAÚJO, T.A.S.; ALBUQUERQUE, U.P. Level of Tannins and

Flavonoids in Medicinal Plants: Evaluating Bioprospecting Strategies. Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine, v.2012, n.2012, 2011.

UNITED STATES PHARMACOPEIA. 33.ed. Rockville U.S.:Pharmacopeial

Convention; 2010.

universidade federal de pernambuco centro de … · apesar de serem amplamente utilizados para...

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