universidade federal de pelotas faculdade de agronomia...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Tese
Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria
monocytogenes avaliados por RT- qPCR em diferentes superfícies,
temperaturas e tempos de contato
Tatiane Kuka Valente Gandra
Pelotas, 2015
Tatiane Kuka Valente Gandra
Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria
monocytogenes avaliados por RT- qPCR em diferentes superfícies,
temperaturas e tempos de contato
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel” da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciência e Tecnologia em Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva
Co-orientador: Profª. Dra. Caroline Peixoto Bastos
Pelotas, 2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação:
Bibliotecária Daiane Schramm – CRB-10/1881
G195a Gandra, Tatiane Kuka Valente
Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria monocytogenes avaliados por RT- qPCR em diferentes superfícies, temperaturas e tempos de contato. / Tatiane Kuka Valente Gandra; Orientador: Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva. – Pelotas, 2015.
107f.
Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Faculdade de Agronomia “Eliseu Maciel” da Universidade Federal de Pelotas
1. L. monocytogenes. 2. Biofilme. 3. Superfície. 4. locus agr; prfA.
5. Expressão gênica. I. Silva, Wladimir Padilha da; orient. II. Título. CDD 600
Tatiane Kuka Valente Gandra
Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria monocytogenes
avaliados por RT- qPCR em diferentes superfícies, temperaturas e tempos de
contato
Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutorem Ciência e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de Pelotas.
Data da Defesa: 11 de maio de 2015
Banca examinadora:
___________________________________________________________________
Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva (Orientador)
Doutor em Ciência de Alimentos pela Universidade de São Paulo
___________________________________________________________________
Profª. Dra. Caroline Peixoto Bastos (Co-orientador)
Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de
Pelotas
___________________________________________________________________
Profa. Dra. Karla Sequeira Mendonça
Doutora em Ciência e Tecnologia de Alimentos pela Universidade Federal de
Pelotas
___________________________________________________________________
Profa. Dra. Marcia Magalhães Mata
Doutora em Biotecnologia pela Universidade Federal de Pelotas
___________________________________________________________________
Profa. Dra. Naciele Marini
Doutora em Fitomelhoramento pela Universidade Federal de Pelotas
Dedico ao meu marido Eliezer e ao meu filho Árthur. “Um sonho que se sonha só, é só um sonho... Mas um sonho que se sonha junto torna-se realidade...”
Agradecimentos
A Deus pela força, perseverança, sabedoria e humildade para continuar o
caminho da vida com fé.
Ao meu marido Eliezer e ao meu filho Árthur, pelo amor incondicional,
carinho, amizade, compreensão e companheirismo. Nem mesmo todas as palavras
do mundo poderiam expressar minha gratidão a vocês. Minhas razões de viver. Sem
vocês nada teria sentido...
A toda minha família, especialmente aos meus pais, Joel e Roseli, e a minha
vó Lucinda (in memorian), onde, mesmo nos momentos distantes, encontrei carinho
e segurança.
Ao meu orientador Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientação, pelo
projeto e pelos conhecimentos transmitidos.
A minha co-orientadora e amiga Caroline Peixoto Bastos, pelo carinho, apoio
e grande ajuda nos protocolos do real time, e defesa.
A Naciele Marini pela imensa ajuda durante o a execução do real time e
contribuições. Sem você com certeza tudo ficaria mais difícil.
A amiga Karla pela enorme ajuda no inicio do projeto e pelas contribuições.
A Márcia pela ajuda com protocolos iniciais e contribuições.
As amigas Isabela e a Darla, minha gratidão especial por toda parceria,
companheirismo em todos os momentos e principalmente pela amizade sincera.
As amigas Angela, Massako e Patrícia pelo apoio e palavras de incentivo.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, Ana Rita, Fábio,
Graciele, Greici, Guilherme, Janaína, Juliana, especialmente, Andréia pelo apoio nos
momentos de dúvida e Mariana pela ajuda na rotina e na molecular.
Ao Laboratório de Fitomelhoramento e ao Prof. Dr. Antônio Costa de Oliveira
pelo empréstimo do termociclador Real-Time PCR System.
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul –
FAPERGS, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -
CNPq apoio financeiro ao projeto e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior – CAPES pela bolsa de estudos.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma
gota de água no mar. Mas o que seria do mar se lhe faltassem
gotas...”
(Madre Teresa de Calcutá)
Resumo GANDRA, Tatiane Kuka Valente. Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria monocytogenes avaliados por RT- qPCR em diferentes superfícies, temperaturas e tempos de contato. 2015. 107f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015. A produção de biofilme por bactérias patogênicas tem importantes implicações em indústrias de alimentos e pode criar uma fonte persistente de contaminação do produto final. Os objetivos do trabalho foram avaliar a capacidade de produção de biofilme por isolados de Listeria monocytogenes, provenientes de diferentes fontes, sob diferentes condições de temperatura e avaliar a expressão dos genes do locus agr e do gene prfA durante a formação de biofilme, em distintas superfícies e sob diferentes temperaturas e tempos de contato. Os isolados de L. monocytogenes apresentaram grande variação na formação de biofilme havendo influência significativa das temperaturas testadas. Considerando as fontes de isolamento, não foram observadas diferenças significativas na produção de biofilme. Contudo, observou-se uma correlação positiva para produção de biofilme nos isolados de L. monocytogenes provenientes de alimentos e uma correlação negativa nos isolados provenientes do ambiente de processamento, para o aumento da temperatura. Não houve prevalência de um sorotipo produtor de biofilme nos isolados provenientes de alimentos. Porém, para os isolados provenientes do ambiente de processamento houve uma maior produção de biofilme pelo sorotipo 1/2c a 10ºC. O gene agrA, de L. monocytogenes, foi expresso em maiores níveis que os demais genes do locus agr, assim como o gene prfA. Os isolados produtores de biofilme apresentaram maiores níveis de expressão do locus agr, sendo que a maior diferença entre isolados produtores e não produtores de biofilme ocorreu nos genes agrBCD, havendo maior expressão destes genes por isolados produtores de biofilme. Não houve diferença na expressão do prfA entre os isolados, independente da capacidade de produção de biofilme. Os maiores níveis de expressão global do locus agr e do prfA foram observados a 37ºC e os menores níveis a 10ºC. Não foi verificada diferença na expressão do locus agr e do prfA entre os tempos 12 e 24h de contato. Os maiores níveis de expressão ocorreram em 24h, e o declínio de expressão do locus agr em 48h. Não houve diferença na expressão dos genes testados entre as superfícies avaliadas, independente da capacidade de produção de biofilme dos isolados. Pode-se verificar que L. monocytogenes, sob as temperaturas avaliadas, possui variabilidade na produção de biofilme. Observou-se que o locus agr possui um papel importante na adesão inicial e na formação de biofilme principalmente os genes agrBCD, independente da expressão do gene prfA. E verificou-se que o locus agr e o gene prfA são fortemente influenciados pela temperatura e pelo tempo de contato com a superfície, mas não pelas superfícies de contato. Palavras-Chave: L. monocytogenes; biofilme; superfície; locus agr; prfA, expressão gênica
Abstract
GANDRA, Tatiane Kuka Valente. Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria monocytogenes avaliados por RT- qPCR em diferentes superfícies, temperaturas e tempos de contato. 2015. 107f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015. Biofilm production capacity by pathogenic bacteria has important implications for food industry, and can create a persistent source of contamination of final product. In this context, the objective of this study was, first, evaluate the biofilm production capacity by isolates of Listeria monocytogenes, from different sources (food and food processing environments) under different temperature conditions. Then, aimed to evaluate the expression of the genes agr locus and prfA gene during biofilm formation by isolated L. monocytogenes in different surfaces, temperatures and contact times. The isolates of L. monocytogenes showed great variation in biofilm formation with significant influence of temperatures tested. Considering the isolation of L. monocytogenes sources (food and environment), there were no significant differences in biofilm production. However, there was a positive correlation for biofilm production in isolates of L. monocytogenes from food and a negative correlation in isolates from the processing environment, when assessing the interference of temperature increase. There was no prevalence of single serotype biofilm producer in L. monocytogenes isolates from food. But for the isolates from the processing environment, there was a greater biofilm production by serotype 1/2c at 10°C. agrA gene of L. monocytogenes was expressed at higher levels than the other genes of the agr locus, as well as the prfA gene. The isolated biofilm producers had largest expression levels of the agr locus, and the biggest difference between producers isolated and non-producers of biofilm occurred in agrBCD genes with higher individual expression of these genes by of biofilm producers. On the other hand, there was no difference in the expression of prfA among the isolates, regardless of biofilm production capacity. The highest overall levels of expression of the agr locus and prfA were observed at 37ºC and lower levels at 10°C. There was no difference in the expression of agr locus and prfA between 12 and 24 hours. The highest levels of expression occurred in 24 hours, and the decline of agr locus expression in 48 hours, indicates the importance of this system in the first hours of contact. There was no difference in gene expression between the tested surfaces evaluated, indiferent of biofilm production capacity of the isolates. Thus, it can be seen that L. monocytogenes in all temperatures, have variability in biofilm production, which can have a significant effect on the persistence of these microorganisms during food processing. It was observed that the agr locus represents an important role in initial adhesion and biofilm formation in L. monocytogenes, especially agrBCD genes, independent of the expression of the prfA gene. Furthermore, it was found that the agr locus and the prfA gene are strongly influenced by temperature and time of contact with the surface, but not for the contact surfaces. Key-words: L. monocytogenes; biofilm; surface; locus agr; prfA; gene expression
Lista de Figuras
Figuras - Revisão da Literatura
Figura 1 - Surto de listeriose pelo consumo de maçãs caramelizadas nos EUA, em
2014. ......................................................................................................................... 22
Figura 2 - Surto de listeriose pelo consumo de melões nos EUA, em 2011. ............. 23
Figura 3 – Etapas de formação de biofilme bacteriano. ............................................ 26
Figura 4 – Diagrama esquemático do regulon do gene prfA em Listeria
monocytogenes. ........................................................................................................ 30
Figura 5 – Diagrama esquemático do locus agr em Listeria monocytogenes. .......... 31
Figuras - Manuscrito 1
Fig. 1. Média de produção de biofilme por DOA595 dos isolados e das cepas padrão
de L. monocytogenes sob diferentes temperaturas ................................................... 56
Figuras - Manuscrito 2
Fig. 1. Variação na expressão global dos genes do locus agr e do gene prfA em
isolados de L. monocytogenes durante a formação de biofilme. ............................... 72
Fig. 2. Variação na expressão dos genes do locus agr e do gene prfA nos isolados de L. monocytogenes em diferentes temperaturas durante a formação de biofilme. .................................................................................................................................. 73 Fig. 3. Variação na expressão dos genes do locus agr e do gene prfA nos isolados de L. monocytogenes em diferentes tempos de contato durante a formação de biofilme. ..................................................................................................................... 74
Lista de Tabelas
Tabelas - Projeto de Pesquisa
Tabela 1 – Delineamento Experimental para avaliação da capacidade de adesão .. 37
Tabela 2 – Delineamento Experimental para a avaliação da interferência do tipo de
superfície, temperatura e tempo de contato na capacidade de adesão .................... 37
Tabela 3 – Delineamento Experimental para extração de RNA, síntese de cDNA e
avaliação do perfil de expressão dos genes do locus agr por RT-qPCR .................. 38
Tabela - Manuscrito 1
Tabela 1– Fonte, sorotipo e ano de isolamento de L. monocytogenes avaliadas
quanto a capacidade de produção de biofilme .......................................................... 52
Tabelas – Manuscrito 2
Tabela 1 - Isolados de L. monocytogenes selecionados para avaliação da expressão
do locus agr e do gene prfA sob condições de formação de biofilme ....................... 66
Tabela 2 – Sequências dos oligonucleotídeos utilizados para a quantificação da
expressão do locus agr e do gene prfA em L. monocytogenes ................................. 69
Lista de Abreviaturas e Siglas
Ct - Threshold Cycle
agr(ABDC) - accessory gene regulator protein (ABCD) ou gene regulador acessório
das proteínas (ABCD)
AI - aço inoxidável
AIP – autoinducing peptide ou auto-indutor maduro
ANOVA - análise de variância
ATCC - American Type Culture Collection
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
cDNA - complementary DNA ou DNA complementar
CFB – condições de formação de biofilme
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CP – condições planctônicas
DNA - desoxyribonucleic acid ou ácido desoxirribonucleico
DO - densidade ótica (DO)
DOc – ponto de corte da densidade ótica
DTA – doenças transmitidas por alimentos
ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA - Food and Drug Administration
FAPERGS - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
IOC – Instituto Oswaldo Cruz
LOGUFC – logarítimo de unidades formadoras de colônia
mRNA – messenger ribonucleic acid ou ácido ribonucleico mensageiro
MS – Ministério da Saúde
NaCl – cloreto de sódio
NCBI - National Center for Biotechnology Information
OIE - World Organisation for Animal Health
OTICIS RIO - Observatório das Tecnologias de Informação e Comunicação em
Sistemas e Serviços de Saúde da Cidade do Rio de Janeiro
PBS – phosphate buffered saline ou salina fosfato tamponado
PCR – Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase
pH - potencial hidrogeniônico
prfA - positive regulatory factor A ou fator positivo de regulação A
PS - poliestireno
QR - quantificação relativa
RNA – ribonucleic acid ou Ácido Ribonucleico
RT-qPCR – Real Time Quantitative PCR ou PCR Quantitativo em Tempo Real
TSA-YE – trypticase soy agar with yeast extract ou ágar tripticase de soja acrescido
de 0,6% de extrato de levedura
TSB - tryptic soy broth ou caldo tripticase de soja
TSB-YE – tryptic soy broth with yeast extract ou caldo tripticase de soja acrescido de
0,6% de extrato de levedura
TSB-YE+G – tryptic soy broth with yeast extract 1% glucose ou caldo tripticase de
soja acrescido de 0,6% de extrato de levedura adicionado de 1% de glicose
UFC – unidades formadoras de colônia
Sumário
1 Introdução ........................................................................................................... 15
1.1 Hipótese .............................................................................................................. 15
1.2 Objetivo Geral ..................................................................................................... 16
1.3 Objetivos Específicos.......................................................................................... 16
2 Revisão da Literatura .......................................................................................... 17
2.1 Listeria monocytogenes ...................................................................................... 17
2.1.1 Histórico ....................................................................................................... 17
2.1.2 Classificação taxonômica ............................................................................. 18
2.1.3 Características ............................................................................................. 19
2.1.4 Reservatórios ............................................................................................... 20
2.1.5 Listeriose ...................................................................................................... 20
2.1.6 Epidemiologia ............................................................................................... 22
2.2 Biofilme ............................................................................................................... 25
2.2.1 Conceito e constituição de biofilme bacteriano ............................................ 25
2.2.2 Biofilme produzido por L. monocytogenes ................................................... 27
2.2.3 Aspectos genéticos de L. monocytogenes envolvidos na produção de
biofilme ..................................................................................................................... 29
3 Projeto de Pesquisa ............................................................................................ 33
3.1 Caracterização do Problema .............................................................................. 33
3.2 Hipótese .............................................................................................................. 35
3.3 Objetivos ............................................................................................................. 35
3.4 Material e Métodos ............................................................................................. 36
3.5 Resultados e Impactos esperados ...................................................................... 42
3.6 Apoio Financeiro ................................................................................................. 43
3.7 Cronograma de Atividades ................................................................................. 44
3.8 Referências Bibliográficas .................................................................................. 44
4 Relatório de Trabalho de Campo ........................................................................ 47
5 Manuscrito 1: Produção de biofilme por isolados de Listeria monocytogenes sob
diferentes condições de temperatura ........................................................................ 49
5.1 Resumo .............................................................................................................. 50
5.2 Introdução ........................................................................................................... 51
5.3 Material e Métodos ............................................................................................. 51
5.4 Resultados .......................................................................................................... 55
5.5 Discussão ........................................................................................................... 57
5.6 Agradecimentos .................................................................................................. 59
5.7 Referências ......................................................................................................... 59
6 Manuscrito 2: Quantificação dos níveis de expressão do locus agr e do gene
prfA na produção de biofilme por isolados de Listeria monocytogenes em diferentes
superfícies e condições de temperatura e tempo ...................................................... 61
6.1 Resumo .............................................................................................................. 63
6.2 Introdução ........................................................................................................... 64
6.3 Materiais e Métodos............................................................................................ 66
6.4 Resultados .......................................................................................................... 71
6.5 Discussão ........................................................................................................... 76
6.6 Agradecimentos .................................................................................................. 82
6.7 Referências ......................................................................................................... 83
7 Considerações Finais ......................................................................................... 86
Referências ............................................................................................................... 87
Apêndices.................................................................................................................. 98
Apêndice A – Avaliação da capacidade de adesão de isolados de L.
monocytogenes ...................................................................................................... 99
Apêndice B – Cultivo dos isolados de L. monocytogenes sob CFB e CP, extração
do RNA, síntese de cDNA e avaliação do perfil de expressão do locus agr e do gene
prfA por RT-qPCR ................................................................................................... 100
Apêndice C – Validação dos primers: melt curve e cálculo do slope ...................... 104
1 Introdução
A avaliação da capacidade de aderência e de formação de biofilme por
bactérias potencialmente patogênicas é importante para a área de medicina, para
estudos relacionados ao meio ambiente e para a indústria alimentícia (CHAVANT et
al., 2007). Nessa última, o biofilme pode criar uma fonte persistente de
contaminação ao produto final (VAN HOUDT e MICHIELS, 2010).
A produção de biofilme é um processo dinâmico e diferentes mecanismos
estão envolvidos na sua fixação e desenvolvimento (KUMAR e ANAND, 1998). São
importantes nestes mecanismos as estruturas das células bacterianas, as
características das superfícies de ligação e as condições ambientais, principalmente
o tempo e a temperatura (VAN HOUDT e MICHIELS, 2010).
Embora as condições de higiene para a produção de alimentos tenham sido
continuamente melhoradas nas indústrias de processamento, casos e surtos de
doenças transmitidas por alimentos (DTA), como listeriose, salmonelose e
intoxicações alimentares, ocasionados pelo consumo de produtos contaminados,
têm sido amplamente relatados, em especial relacionados aos produtos prontos para
o consumo. Um dos aspectos importantes para o controle das DTA, cujo
entendimento e controle efetivo tem se mostrado um grande desafio, é a formação
de biofilme associada a micro-organismos patogênicos (RODRIGUES et al., 2010).
Neste sentido, Listeria monocytogenes é uma ameaça particular à indústria de
alimentos. Possui habilidade para sobreviver por longos períodos sob condições
ambientais adversas e tolera altas concentrações de sal e valores de pH
relativamente baixos. Além disso, pode se multiplicar em temperaturas de
refrigeração e persistir em equipamentos e superfícies de plantas de
processamento, através da formação de biofilme (DI BONAVENTURA et al., 2008;
LUKINMAA et al., 2004; PIETA et al., 2014; UHITIL et al., 2004).
Entretanto, L. monocytogenes varia em sua capacidade de produzir biofilme,
o que pode ocorrer devido à supressão ou superativação de genes cujos produtos
favorecem a aderência em superfícies abióticas (FOLSOM e FRANK, 2006).
15
Este micro-organismo possui um extenso repertório de proteínas de
transporte e de genes regulatórios relacionados, que a capacitam para colonizar
uma ampla variedade de ecossistemas (GLASER et al., 2001; GARMYN et al.,
2012). Entre os genes presentes nesta bactéria, estão o prfA, que é um ativador
transcricional chave, regulando a maior parte da expressão de genes de virulência
conhecidos nessa bactéria, e o locus agr (gene regulador acessório), altamente
conservado, que possui ortólogos em várias bactérias Gram-positivas (AUTRET et
al., 2003; GARMYN et al., 2012; LUO et al., 2013; PASPALIARI et al., 2014). O locus
agr é composto por quatro genes co-transcritos em um operon (agrBDCA) que
codificam quatro proteínas. Quando este sistema é ativado, regula os genes que
codificam as adesinas, necessárias para a formação de biofilme (PASPALIARI et al.,
2014; TRAVIER et al., 2013; WORTHINGTON et al., 2012,).
Além disso, pesquisas têm demonstrado que a mutação de genes do locus
agr diminui a capacidade que L. monocytogenes tem em se aderir em superfícies
abióticas e produzir biofilme (RIEU et al., 2007), bem como pode afetar a sua
capacidade de causar infecção (CHANG et al., 2012; GUARIGLIA-OPEREZA et al.,
2014;. RIEDEL et al., 2009).
Desta forma, a avaliação da capacidade de produção de biofilme por micro-
organismos patogênicos e a avaliação do perfil de expressão de genes relacionados
a formação de biofilme por um patógeno como L. monocytogenes, quando
submetidos a diferentes impactos ambientais, pode permitir a ampliação do
conhecimento científico sobre alguns parâmetros que possibilitam a persistência
desse patógeno em ambientes de processamento.
1.1 Hipótese
Os níveis de expressão dos genes do locus agr (agrB, agrD,agrC e agrA) e
do gene prfA em L. monocytogenes são alterados quando as células desse micro-
organismo são submetidas a diferentes superfícies, temperaturas de incubação e,
tempos de contato em condições de formação de biofilme.
16
1.2 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade de produção de biofilme e verificar o perfil de
expressão dos genes do locus agr (agrB, agrD, agrC e agrA) e do gene prfA em
isolados de L. monocytogenes provenientes de fontes distintas (ambientais e
alimentos) em células crescendo em condições de formação de biofilme, sob
diferentes superfícies, temperaturas de incubação e tempos de contato.
1.3 Objetivos Específicos
- Avaliar a capacidade de adesão de isolados de L. monocytogenes provenientes de
distintas fontes (ambientais e alimentos) na região de Pelotas, RS.
- Avaliar a interferência do tipo de superfícies (aço inox e poliestireno), temperaturas
de incubação (10ºC, 20ºC e 37ºC) e tempos de contato (8h, 12h, 24h, 48h) na
capacidade de adesão de isolados selecionados de L. monocytogenes.
- Extrair RNA dos isolados de L. monocytogenes nas diferentes condições
experimentais (superfícies, temperaturas de incubação e tempos de contato) e
sintetizar cDNA.
- Verificar o perfil de expressão dos genes do locus agr e do gene prfA de isolados
de L. monocytogenes nas diferentes condições experimentais (superfícies,
temperaturas de incubação e tempos de contato).
2 Revisão da Literatura
2.1 Listeria monocytogenes
2.1.1 Histórico
L. monocytogenes foi descoberta por Murray em Cambridge, Inglaterra, no
ano de 1924, em uma epidemia em coelhos que apresentavam morte súbita, sendo
descrita em 1929, como agente patogênico para animais e para humanos em casos
raros (IBUSQUIZA, 2011; MURRAY et al. 1926). O primeiro diagnóstico da doença
em humanos ocorreu em um soldado apresentando meningite, no final da primeira
Guerra Mundial (BARANCELLI, 2010; ROCOURT e BUCHRIESER, 2007). Porém,
somente a partir da década de 80, L. monocytogenes emergiu como um patógeno
humano causador de listeriose associados ao consumo de alimentos (IBUSQUIZA,
2011).
No final da década de 70, a origem das infecções humanas causadas por L.
monocytogenes eram consideradas incertas. Entretanto, no início da década de 80,
o número de isolamentos desse patógeno começou a aumentar e, em 1983, o
primeiro surto de listeriose humana diretamente relacionado a uma salada de
repolho contaminada foi relatado (SCHLECH et al., 1983).
A partir daí, ocorreram uma série de surtos de listeriose em humanos, o que
permitiu estabelecer os alimentos como a principal fonte dessa doença,
caracterizando a listeriose como uma infecção de origem alimentar grave (FARBER
e PETERKIN, 1991), e L. monocytogenes tornou-se um micro-organismo
potencialmente patogênico de origem alimentar (IBUSQUIZA, 2011).
18
2.1.2 Classificação taxonômica
L. monocytogenes percente ao gênero Listeria, à família Listeriaceae, à
ordem Bacillales, à classe Bacilli, e ao filo Firmicute. Este gênero é composto por 17
espécies: L. aquatica, L. booriae, L. cornellensis, L. fleischmannii, L. floridensis, L.
grandensis, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. marthii, L. monocytogenes, L.
newyorkensis, L. riparia, L. rocourtiae , L. seeligeri, , L. weihenstephanensis e L.
welshimeri (DEN BAKKER et al, 2014; HALTER et al., 2013; NCBI, 2015; WELLER
et al., 2015).
Entre estas espécies, somente, L. ivanovii é patogênica para animais e L.
monocytogenes para animais e humanos (SCHMID et al., 2009), embora infecções
ocasionais por L. seeligeri, L. ivanovii, L. grayi e L. innocua em humanos já tenham
sido relatadas (BARANCELLI, 2010; ROCOURT e BUCHRIESER, 2007)
Os diversos sorotipos e linhagens da espécie L. monocytogenes podem ser
divididos de acordo com suas proteínas de superfície e conforme com suas
características genotípicas.
Baseada em proteínas de superfície (antígenos somáticos e flagelares), L.
monocytogenes pode ser subdividida em 13 sorotipos: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c,
4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7 (IBUSQUIZA, 2011; SEELIGER e HÖHNE, 1979;
SEELIGER e JONES, 1986). Entretanto, apesar da listeriose humana poder ser
causada por todos os sorotipos, 95% dos casos são causados pelos sorotipos 1/2a,
1/2b, 1/2c e 4b (FARBER e PETERKIN, 1991; IBUSQUIZA, 2011). Entre alimentos,
o sorotipo 1/2 é o mais frequentemente isolado (MONTERO et al., 2015).
De acordo com análises genotípicas dos genes de virulência (eletroforese de
enzima multilocus, Pulsed-Field Eletrophoresis – PFGE e ribotipagem), pode-se
agrupar L. monocytogenes em três linhagens filogenéticas: linhagem I - sorotipos
1/2b, 3b, 3c e 4b; linhagem II - sorotipos 1/2a, 1/2c e 3a; e linhagem III – sorotipos
4a e 4c. Listeriose é causada, principalmente, pela linhagem I, enquanto os isolados
da linhagem II são mais frequentemente provenientes de alimentos (BARANCELLI,
2010; IBUSQUIZA, 2011; RAGON et al., 2008).
19
2.1.3 Características
L. monocytogenes são bacilos Gram-positivos, com aproximadamente 0,4-
0,5μm de diâmetro e 1-2μm de comprimento, não formadores de esporos,
anaeróbicos falcultativos e móveis por flagelos peritríquios (VAZQUEZ-BOLAND et
al., 2001).
Possuem motilidade característica, em forma de “guarda-chuva”, a qual
apresenta sua expressão regulada acima de 25ºC e reprimida a 37°C, em sua
maioria (MATA et al., 2015; WAY et al., 2004; WILLIAMS et al., 2005). Entretanto,
alguns autores sugerem que a motilidade possa ser expressa em temperaturas
maiores ou iguais a 37ºC (BIGOT et al., 2005; DJORDJEVIC et al., 2002; GAMBLE e
MURIANA, 2007).
A principal característica desta bactéria é ser reconhecida como psicrotrófica,
pois possui a habilidade de se multiplicar em temperaturas de refrigeração, mesmo
em meios simples, sem grandes exigências nutricionais. Assim, é capaz de
multiplicar-se entre 2,5 a 44ºC, possuindo temperatura ótima de desenvolvimento
entre 30 a 37ºC (GERMANO e GERMANO, 2008).
O tempo de geração a 35ºC varia de minutos a horas, na dependência do
meio em que se encontra. O intervalo de pH ótimo é de 6,0 a 8,0, mas pode crescer
entre 4,1 e 9,6), o que torna essa bactéria extremamente resistente no ambiente e
de difícil controle. Pode sobreviver por mais de 100 dias a 4ºC, em concentrações
entre 10,5 a 30,5% de NaCl. Pode desenvolver-se em alimentos com atividade de
água (aw) baixa (0,83). Nos derivados cárneos, resiste ao tratamento habitual com
nitrato de sódio (120mg.kg-1) e NaCl a 3% (GERMANO e GERMANO, 2008;
SEELIGER e JONES, 1986; VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001).
Além disso, bioquimicamente, este micro-organismo é capaz de produzir
ácido a partir de L-rhamnose, dextrose, D-arabitol, lactose, xylitol e turanose, sendo
catalase positiva e oxidase negativa (HALTER et al., 2013).
É uma bactéria intracelular facultativa, capaz de invadir e replicar-se em
células epiteliais, hepatócitos, fibroblastos, células endoteliais e macrófagos.
Hidrolisa a esculina, é β-hemolítica e pode se desenvolver na presença de 10 a 40%
de bile (AUTRET et al., 2003; CAMARGO, 2013).
20
2.1.4 Reservatórios
L. monocytogenes é um micro-organismo ubíquo, encontrado em uma ampla
variedade de ecossistemas, onde podem sobreviver e multiplicar-se naturalmente,
incluindo solo, silagem, esterco, pastos, água e, como saprófita, em plantas em
decomposição (LUKINMAA et al., 2004). Além disso, podem estar presentes em
locais de processamento de alimentos, bem como em alimentos, fezes de humanos
e de animais (GERMANO e GERMANO, 2008; VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001).
É uma bactéria patogênica para diversas espécies de animais, além do
homem, sendo isoladas a partir de, aproximadamente, quarenta espécies de
mamíferos domésticos e selvagens, de quase vinte espécies de aves e de algumas
espécies de pescado e rãs. São relatados, também, isolamentos a partir de
artrópodes e larvas de insetos (GERMANO e GERMANO, 2008; OIE, 2014).
Em humanos, é possível se isolar esta bactéria a partir de indivíduos
assintomáticos, provavelmente, como consequência da colonização do trato
gastrointestinal. Estima-se que 1 a 10% da população sadia pode ser portadora da
bactéria (GERMANO e GERMANO, 2008).
Na indústria de alimentos L. monocytogenes é uma ameaça particular. Pode
contaminar um grande número de reservatórios presentes nas plantas
processadoras, e persistir em equipamentos e superfícies de plantas de
processamento, através da formação de biofilme (DI BONAVENTURA et al., 2008;
LUKINMAAA et al., 2004; PIETA et al., 2014; UHITIL et al., 2004). Dessa forma,
pode contaminar uma ampla variedade de alimentos por contaminação cruzada
(CAMARGO, 2013; CHEN et al., 2005 KRAMARENKO et al., 2013).
Vários estudos mostram a presença de L. monocytogenes em diversos
alimentos, como leite e derivados, carne bovina, suína, de aves, pescados,
embutidos e vegetais (CAMARGO, 2013; GERMANO e GERMANO, 2008;
KRAMARENKO et al., 2013; NALÉRIO et al, 2009; MENDONÇA et al., 2012; von
LAER et al, 2009).
2.1.5 Listeriose
A listeriose é uma doença de origem alimentar atípica, cuja maior importância
em saúde pública é sua severidade, com alta taxa de casos fatais, da ordem de 20-
21
30%. A maioria das infecções em humanos por L. monocytogenes é atribuída ao
consumo de alimentos contaminados (ALLERBERGER, 2007; GANDE e MURIANA,
2003; PONTELLO et al., 2012).
Possíveis explicações para o surgimento de listeriose humana de origem
alimentar como um grande problema de saúde pública incluem grandes mudanças
na produção de alimentos, processamento e distribuição, aumento do uso de
equipamentos de refrigeração como preservação primária, mudanças nos hábitos
alimentares das pessoas, em especial o uso de alimentos prontos para o consumo
(OIE, 2014).
Normalmente, a listeriose não apresenta sintomas clássicos de infecções
gastroentéricas. O período de incubação é muito variável, de um dia até 3 semanas,
embora se considere a possibilidade de ser tão longo quanto alguns meses. Na
forma gastrointestinal, este período pode ser superior a 12h, sendo desconhecida a
dose infecciosa de L. monocytogenes. A maioria das pessoas em boas condições de
saúde, sobretudo em relação ao seu estado imune, apresentam baixa probabilidade
de desenvolver sintomas da infecção (GERMANO e GERMANO, 2008; FRANCO e
LANDGRAF, 2002).
Afeta, de forma mais grave, indivíduos suscetíveis, como idosos, crianças,
recém-nascidos e imunocomprometidos (FELÍCIO et al., 2007; KIMURA, 2006).
Além disso, em mulheres grávidas, a listeriose pode ocasionar aborto espontâneo,
nascimento prematuro ou morte fetal, muitas vezes não sendo diagnosticada como a
causa destes casos (GANDHI e CHIKINDAS, 2007). As manifestações clínicas mais
comuns nos casos de listeriose são bastante severas, como meningites, encefalites,
septicemias, abortos e listeriose do recém-nascido, ocorrendo a doença nos grupos
mais propensos (JIANG et al., 2008).
Nestes grupos de risco, a doença pode se manifestar nas formas mais
graves, precedido por sintomas semelhantes aos da gripe, incluindo febre
persistente, dores musculares e dor de cabeça. Se a bactéria invadir o sistema
nervoso pode resultar em rigidez do pescoço, confusão, perda de equilíbrio ou
convulsões. Sinais gastrointestinais, caracterizados por náuseas, vômitos e diarreia,
também podem preceder as formas mais graves de listeriose (CDC 2014;
GERMANO e GERMANO, 2008).
Os métodos mais empregados para o diagnóstico de listeriose consistem no
isolamento do agente a partir do sangue e líquor dos pacientes, ou da placenta e
22
fetos das gestantes, em meios de cultura comuns empregados em bacteriologia,
seguidos de identificação bioquímica e/ou molecular em nível de espécie
(GERMANO e GERMANO, 2008). O tratamento empregado é a antibioticoterapia
(CDC, 2014).
2.1.6 Epidemiologia
Isolamento de L. monocytogenes, bem como surtos de listeriose têm sido
relatados em vários países, sendo sua incidência dependente de hábitos
alimentares, práticas de manipulação, uso de refrigeração e importação de alimentos
(CDC, 2014; IOC, 2014; JIANG et al. 2008, PONTELLO et al., 2012; SEIXAS et al.,
2014; UHITIL et al., 2004).
Nos Estados Unidos da América (EUA), a listeriose afeta cerca de 1.600
pessoas por ano, com cerca de 260 desses casos resultando em morte. Pelo menos
90% das pessoas que contraem infecções causadas por L. monocytogenes estão
em um grupo de risco mais elevado. Crianças e adultos saudáveis, ocasionalmente,
ficam infectados, mas eles raramente ficam gravemente doentes (CDC, 2014).
O surto mais recente de L. monocytogenes notificado para o Centers of
Disease Control and Prevention - CDC (2014) foi atribuído ao consumo de maçãs
caramelizadas pré-embaladas. Até o momento, este surto abrangeu 11 Estados, 32
pessoas ficaram doentes e 7 pessoas morreram (Figura 1) (CDC, 2014).
Figura 1 - Surto de listeriose pelo consumo de maçãs caramelizadas nos EUA, em 2014. Fonte: CDC, 2014.
23
Em 2012, 831 surtos nos EUA foram notificados para o CDC (CDC, 2014),
porém, em 2011 ocorreu o maior surto de listeriose na história dos EUA (Figura 2),
com 147 doentes, 33 mortes, e um aborto entre os moradores de 28 estados. O
surto foi associado ao consumo de melão cultivado no Colorado (CDC, 2014).
Figura 2 - Surto de listeriose pelo consumo de melões nos EUA, em 2011. Fonte: CDC, 2014.
Alimentos prontos para o consumo, como cachorros-quentes, carnes cortadas
e pré-cozidas, são altamente suscetíveis a contaminação por L. monocytogenes. Em
2002, também nos EUA, houve um surto de L. monocytogenes em carne de peru
cozida fatiada, no qual 54 pessoas foram infectadas, com oito óbitos e três mortes
fetais. Aproximadamente 30 milhões de quilos de carne de aves foram recolhidas a
partir das plantas de processamento. Este surto levou a várias mudanças na política
da Food and Drug Administration (FDA) em relação a inspeção e manuseio de
alimentos prontos para o consumo, particularmente aqueles que são baseados em
produtos de origem animal (SCHNEIDER et al., 2014).
Um dos piores surtos de listeriose envolvendo produtos prontos para o
consumo, nos EUA, ocorreu na Carolina do Norte, em 2000. Mais de 100 pessoas
apresentaram sintomas e 21 morreram pela ingestão de cachorro-quente
contaminado com a bactéria (CDC, 2014; EVANS et al, 2004; SCHNEIDER et al.,
2014)
24
No Chile, em 2013, houve um grande surto de listeriose atribuído a queijo
contaminado, com 34 casos registrados, incluindo cinco mortes. Notadamente, a
capital Santiago concentrou a maioria das notificações, sendo 18 casos, dos quais 4
foram fatais (OTICIS RIO, 2014).
Em Sydney, na Austrália, também em 2013, um paciente morreu e outros dois
foram hospitalizados em estado grave, após terem sido infectados por L.
monocytogenes a partir de uma sobremesa contaminada, conhecida como
profiteroles. Segundo o Departamento de Saúde local, a sobremesa pode ter sido
fornecida para 13 hospitais públicos da cidade (OTICIS RIO, 2014).
No Brasil, os surtos e/ou casos de listeriose são sub diagnosticados e/ou sub
notificados. As autoridades não exigem a notificação dos casos dessa doença nem
em hospitais, nem em fábricas de alimentos, com exceção de fabricantes de queijos
de média e alta umidade (RIO TOTAL, 2014).
A recuperação de organismos envolvidos nos surtos, a falta de notificação e a
demora na realização de análises clínicas convencionais, bem como na intervenção
em situações de emergência, são algumas dificuldades encontradas no controle e
no estudo da listeriose no Brasil, que podem justificar a falta de dados oficiais no
país (RIO TOTAL, 2014).
Segundo o Guia de Vigilância Epidemiológica do Ministério da Saúde, L.
monocytogenes está entre os agentes etiológicos responsáveis pela meningite no
país. Entretanto, o Ministério da Saúde não relaciona o diagnóstico desta doença,
causada por L. monocytogenes, ao consumo de alimentos contaminados, ou a
possíveis surtos envolvendo este patógeno (MS, 2009).
Porém, no Brasil a presença de L. monocytogenes tem sido observada em
uma série de alimentos prontos para o consumo comercializados no país, o que
denota uma grande preocupação para a saúde pública, tendo em vista que estes
produtos não passarão por tratamento térmico antes do consumo. Entre estes
produtos estão: embutidos cárneos cozidos, como presunto, salsichas, apresuntado,
mortadela; queijos, como o minas frescal, coalho, colonial; produtos a base de
pescados; e vegetais minimamente processados (FOOD SAFETY BRAZIL, 2014).
Em relação às amostras clínicas no Brasil, um estudo do Instituto Oswaldo
Cruz (IOC) analisou a ocorrência de L. monocytogenes, em várias fontes de infecção
e vias de transmissão provenientes de diversas regiões do país. Foram analisadas
266 amostras de material clínico humano, coletadas entre 1969 e 2000 nos Estados
25
de Pernambuco, Bahia, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais, São Paulo, Rio de
Janeiro, Paraná e Rio Grande do Sul (IOC, 2014; RIO TOTAL, 2014).
Estas amostras tinham diagnóstico presuntivo para a presença de Listeria
spp., e em 245 amostras foram confirmadas a presença L. monocytogenes,
predominando os isolamentos em indivíduos com meningite e em pacientes com
septicemia. Na distribuição geográfica dos isolados, houve uma predominância
desse micro-organismo nas amostras das regiões sudeste e sul do país, com 87,8%,
e os estados do centro-oeste e nordeste apresentaram uma porcentagem de 10,9%
(IOC, 2014; RIO TOTAL, 2014).
2.2 Biofilme
2.2.1 Conceito e constituição de biofilme bacteriano
Os micro-organismos podem existir no ambiente, tanto como células
planctônicas (livres, em suspensão), como organizadas em comunidades de
diferentes graus de complexidade, associadas a superfícies diversas através da
formação de biofilme. O biofilme pode ser formado por populações desenvolvidas a
partir de uma única ou de múltiplas espécies microbianas (ANNOUS et al., 2009;
KASNOWSKI, et al., 2010).
Desta forma, pode-se definir biofilme como um ecossistema microbiano
complexo, formado por células bacterianas ligadas a um substrato, ou aderidas a
uma superfície biótica ou abiótica, ou ainda, células ligadas umas as outras. Esta
células são incorporadas numa matriz extracelular de substâncias poliméricas
produzidas por elas, e com um fenótipo alterado em relação a taxa de multiplicação
e a transcrição de genes (IBUSQUIZA, 2011).
Não há um consenso na literatura em relação a concentração bacteriana
presente em uma superfície para ser considerado um biofilme (KASNOWSKI et al.,
2010). Ronner e Wong (1993) consideram como biofilme um número de células
aderidas de 105UFC cm-2, porém, Wirtanen et al. (1996) relatam que uma
concetração bacteriana de 103UFC.cm-2 já é considerada biofilme.
Diversos fatores contribuem para a adesão inicial de uma bactéria à
determinada superfície. Dentre estes, se destacam: a genética, a virulência e a
resistência do micro-organismo; a disponibilidade de nutrientes; as propriedades
26
físico-químicas do material da superfície; e a presença de água (KASNOWSKI, et al.,
2010; VAN HOUDT e MICHIELS, 2010).
Segundo Annous et al. (2009) e Monroe (2007) o desenvolvimento de um
biofilme “in vitro” ocorre nas seguintes etapas (Figura 3):
1) fixação reversível de células bacterianas em uma superfície, em função do
processo de adesão ocorrer por forças de Van der Walls e por atração eletrostática;
2) ligação irreversível mediada pela formação de material extracelular;
3) formação de micro colônias e o início da maturação do biofilme;
4) a formação de um biofilme maduro, com uma estrutura tridimensional que
contém células embaladas em conjuntos com canais entre os grupos, que permitem
o transporte de água e nutrientes e a remoção de resíduos;
5) descolamento e dispersão de células planctônicas e formação de novo
biofilme.
Figura 3 – Etapas de formação de biofilme bacteriano. Fonte: Monroe, 2007.
A interação física da célula com a superfície ocorre por meio de material
extracelular de natureza polissacarídica ou proteica, produzido pela bactéria, que é
denominado matriz de glicocálix. A matriz vai fornecer condições de adesão do
peptideoglicano das bactérias Gram-positivas ou da parte externa da membrana das
27
Gram-negativas. Além disso, a matriz contêm partículas de proteínas, lipídeos,
fosfolipídios, carboidratos, sais minerais e vitaminas (MACEDO, 2006).
Um biofilme maduro pode levar de algumas horas até várias semanas para
desenvolver-se, dependendo das condições de seu meio ambiente e da capacidade
do micro-organismo. Fatores como o pH, difusão de oxigênio, fonte de carbono,
osmolaridade e tensões físicas, como pressão, calor e congelamento, interagem na
maturação do biofilme (ANNOUS et al., 2009).
Quando o biofilme está completamente maduro, as células presentes agem
menos como entidades individuais e mais como um sistema vivo coletivo (quorum
sensing), muitas vezes com canais para fornecer água e nutrientes para as células
na porção mais interna do biofilme. Organismos do biofilme são significativamente
mais resistentes aos estresses ambientais, as substâncias antimicrobianas e às
respostas do sistema imune do hospedeiro, do que as células planctônicas
(ANNOUS et al., 2009; KASNOWSKI et al., 2010, SAUER, 2003).
Nesta fase, o biofilme funciona com padrões de multiplicação celular
alterados, cooperação fisiológica e eficiência metabólica. Além disso, as células
localizadas em regiões diferentes do biofilme exibem diferentes padrões de
expressão gênica (COSTERTON et al., 1999; KASNOWSKI et al., 2010).
De acordo com Anwar et al (1992) e Chan (1999), o biofilme maduro consiste
em duas áreas principais: células de superfície e células incorporadas. As células de
superfície são encontradas nas regiões superiores. Estas células têm acesso a
nutrientes, oxigênio e têm pouca dificuldade de eliminar resíduos metabólicos e,
desta forma, são mais metabolicamente ativas. E as células de biofilme incorporadas
no glicocálix são metabolicamente menos ativas, devido escasso acesso a
nutrientes. No entanto, outro estudo afirmou que mais de 70% das células
incorporadas foram matabolicamente ativas, e as células encontradas no fundo do
biofilme, adjacente à superfíce originalmente colonizada, foram mais ativas (NICKEL
et al, 1985).
2.2.2 Biofilme produzido por L. monocytogenes
L. monocytogenes apresenta a capacidade de produzir biofilme em diferentes
superfícies tornando-se, com isso, uma das principais ameaças à seguridade
28
alimentar e uma ameaça particular na indústria de alimentos (LUKINMAA et al.,
2004, VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001, UHITIL et al., 2004).
Vários trabalhos demonstram que este patógeno se adere e forma biofilme
em superfícies de contato com os alimentos, como poliestireno, vidro e aço
inoxidável (DI BONAVENTURA et a, 2008; FOLSOM e FRANK, 2006; GANDE e
MURIANA, 2003).
Esta capacidade de adesão de L. monocytogenes a superfícies pode ser
significativamente aumentada pela indução de estresse ao frio, especialmente após
um longo período de exposição. A adaptação a baixas temperaturas durante a fase
de multiplicação pode influenciar a composição da parede celular e, assim, modificar
as propriedades da superfície, aumentando a hidrofobicidade das células e
facilitando a colonização em superfícies e sua persistência ambiental (SLAMA et al.,
2012).
Além da temperatura, o tempo de incubação, a tensão superficial, e a
natureza da superfície de aderência podem influenciar significativamente na
produção de biofilme por L. monocytogenes (COMBROUSE et al., 2013; NILSSON
et al., 2011).
Na literatura, destaca-se a ausência de um consenso sobre a diferença entre
a capacidade de produção de biofilme entre os sorotipos de L. monocytogenes.
Diferentes estudos enfatizam distintos sorotipos como maiores produtores de
biofilme: Borucki et al. (2003), destacam os sorotipos 1/2a e 1/2c; Djordjevic et
al.(2002 a Linhagem I - 1/2b, 4b, 3b e 4e; Kadam et al.(2013) e Nilsson et al. (2011),
sorotipo 1/2a; Lee et al. (2013), sorotipo 1/2c. Tais discrepâncias, frequentemente
encontradas nas pesquisas, podem estar relacionadas com diferenças
experimentais nos métodos utilizados para estudar biofilme (COMBROUSE et al.,
2013)
Um constituinte celular que tem sido descrito como um importante fator na
aderência inicial em superfícies e na formação de biofilme por L. monocytogenes é o
flagelo (LEMON et al., 2007). Segundo Lemon et al (2007) flagelos de L.
monocytogenes, e de outras bactérias, tem a função de aumentar a probabilidade
destes micro-organismos encontrarem uma superfície para fixação, atuam como
adesinas durante o primeiro contato com a superfície abiótica e fornecem estímulo
necessário para superar forças repulsivas que possam existir entre as bactérias e a
superfície.
29
Way et al. (2004) e Williams et al. (2005), descrevem que a expressão do
flagelo é regulada acima de 25ºC e reprimida a 37°C, na maioria das cepas de L.
monocytogenes. Entretanto, alguns autores sugerem que esta adesão pode ocorrer
passivamente, independente do flagelo (GAMBLE e MURIANA, 2007; TRESSE et
al., 2009) ou, ainda, que algumas cepas de L. monocytogenes expressam motilidade
em temperaturas maiores ou iguais a 37ºC (BIGOT et al., 2005; DJORDJEVIC et al.,
2002; GAMBLE e MURIANA, 2007).
2.2.3 Aspectos genéticos de L. monocytogenes envolvidos na produção de biofilme
Muito se conhece com relação aos mecanismos de patogenicidade de L
monocytogenes, entretanto, ainda pouco se sabe sobre os aspectos genéticos
envolvidos na produção de biofilme por essa bactéria, e quais mecanismos estão
envolvidos neste processo (PIETA et al., 2014).
As cepas de L. monocytogenes variam em sua habilidade para produzir
biofilme, o que pode ocorrer devido à supressão ou super ativação de genes cujos
produtos conferem vantagens adaptativas como, por exemplo, a expressão de
genes relacionados à síntese de exopolissacarídeos envolvidos na produção de
biofilme. (FOLSOM e FRANK, 2006)
Este micro-organismo possui um extenso repertório de proteínas de
transporte e de genes regulatórios relacionados à sua capacidade de colonizar uma
ampla variedade de ecossistemas (GARMYN et al., 2012; GLASER et al., 2001).
Entre os genes presentes nesta bactéria, estão o prfA (fator positivo de
regulação A), que é um ativador transcricional chave, regulando a maior parte da
expressão de genes de virulência conhecidos (LUO et al., 2013), e o locus agr (gene
regulador acessório) (AUTRET et al., 2003; GARMYN et al., 2012; PASPALIARI et
al., 2014), altamente conservado, que possui ortólogos em várias bactérias Gram-
positivas (AUTRET et al., 2003).
A maioria dos genes de virulência de L. monocytogenes envolvidos nas
etapas da infecção são regulados pelo gene prfA (Figura 4). Entre eles, estão os
genes das internalinas A e B (inlA e inlB); e os genes presentes na Ilha de
Patogenicidade de Listeria 1 (LIPI-1): plcA, hlyA, mpl, actA e plcB (INSTITUT
PASTEUR, 2014).
30
Figura 4 – Diagrama esquemático do regulon do gene prfA em Listeria monocytogenes. Fonte: Institut Pasteur, 2014.
Evidências indicam que o gene prfA também exerce potencialmente efeitos
gerais sobre a homeostase de L. monocytogenes regulando a expressão de genes
envolvendo transportadores, enzimas metabólicas, reguladores, e proteínas de
função desconhecida (ZHOU et al., 2011).
O locus agr (Figura 5) é composto por quatro genes co-transcritos em um
operon (agrBDCA) que codificam quatro proteínas. O agrB é responsável pela
expressão de uma proteína de membrana, cuja função seria exportar o peptídeo de
agrD, que é transformado num peptídeo auto-indutor maduro (AIP). agrC (histidina
quinase) e agrA (auto-regulador) formam um sinal de transdução de um sistema de
dois componentes. Quando a concentração extracelular do AIP atinge certo limiar,
em quorum sensing, o sistema é ativado, através da detecção de agrC-agrA e
exerce efeitos reguladores sobre substratos alvo, bem como induz a sua própria
produção (auto-regulação positiva) (AUTRET et al, 2003; RIEDEL et al., 2009; RIEU
et al., 2007). O sistema ativado regula os genes que codificam as adesinas
necessárias para a formação de biofilme (PASPALIARI et al., 2014; TRAVIER et al.,
2013; WORHINGTON et al., 2012).
31
Figura 5 – Diagrama esquemático do locus agr em Listeria monocytogenes. As setas cinzentas indicam a orientação e o tamanho em pares de bases dos quatro genes. Os números entre parênteses indicam o tamanho dos pares de base de duas regiões intergênicas. As setas indicam as posições dos oligonucleotidos utilizados para RT-qPCR da fonte da figura e do artigo 2 da Tese. Fonte: Rieu, 2007.
Pesquisas têm demonstrado que a mutação de genes do locus agr diminui a
capacidade que L. monocytogenes tem em se aderir em superfícies abióticas e
produzir biofilme (GARMYN et al., 2012; RIEU et al., 2007), bem como pode afetar a
sua capacidade de causar infecção (CHANG et al., 2012; GUARIGLIA-OROPEZA et
al., 2014; RIEDEL et al., 2009)
Rieu et al. (2007) observaram uma diminuição de, aproximadamente, 62% no
número de células ligadas a superfícies de vidro com agrA- e agrD- mutantes, em
comparação com suas cepas parentais. Além disso, estes mutantes mostraram uma
diminuição de 33% na quantidade de formação de biofilme sobre poliestireno
durante as primeiras horas.
Riedel et al. (2009) também demonstraram que a ausência do gene agrD
pode afetar a capacidade desse micro-organismo em transcrever diversos genes de
virulência, como inlA, hlyA, actA e pclA. Neste sentido, outros autores relatam que a
supressão do gene agrA ou do agrD poderia afetar alguns genes relacionados à
virulência de L. monocytogenes, entre os quais o regulador prfA (AUTRET et al.,
2003; RIEDEL et al., 2009), bem como sugerem a participação indireta do regulador
prfA na formação de biofilme (LEMON et al., 2007; TRAVIER et al., 2013; ZHOU et
al., 2011).
No estudo conduzido por Mata et al. (2015) foi observado quantidades
significativamente maiores do gene agrB em células de L. monocytogenes aderidas
em superfície de vidro quando comparadas com as células planctônicas das
mesmas cepas. Além disso, houve influência da temperatura na expressão deste
32
gene, o qual apresentou maiores níveis nas células aderidas a 25°C. Entretanto, os
mesmos autores não observaram níveis significativos do gene agrD nestas mesmas
condições de aderência e temperatura avaliadas.
3 Projeto de Pesquisa
Aspectos genéticos envolvidos na formação de biofilme por Listeria monocytogenes:
quantificação do número de transcritos dos genes do locus agr por RT-qPCR em
diferentes condições de superfície, temperaturas de incubação e tempos de contatos
Período de elaboração do projeto: 2º sem/2010 - 1ºsem/2011
3.1 Caracterização do Problema
Listeria monocytogenes é um micro-organismo ubíquo, Gram-positivo, não
esporulado e intracelular facultativo que causa a listeriose (GILBRETH et al., 2005).
Essa bactéria é encontrada naturalmente no solo, na água e como saprófita na
decomposição de plantas (LUKINMAA et al., 2004), bem como em alimentos, fezes
de humanos e de animais (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001).
A listeriose é uma doença de origem alimentar atípica, cuja maior importância
em saúde pública é sua severidade, com alta taxa de casos fatais, da ordem de 20-
30% (ALLERBERGER, 2007; GANDE e MURIANA, 2003; PONTELLO et al., 2012).
A maioria das infecções em humanos por L. monocytogenes é atribuída ao consumo
de alimentos contaminados, afetando normalmente indivíduos suscetíveis como
idosos, crianças, recém nascidos e imunocomprometidos (FELÍCIO et al., 2007;
KIMURA, 2006). Além disso, em mulheres grávidas, a listeriose pode ocasionar
aborto espontâneo, nascimento prematuro ou morte fetal, muitas vezes não sendo
diagnosticada como a causa destes casos (GANDHI e CHIKINDAS, 2007). As
manifestações clínicas mais comuns nos casos de listeriose são bastante severas,
como meningites, encefalites, septicemias, abortos e listeriose do recém-nascido,
ocorrendo a doença nos grupos mais suscetíveis (JIANG et al., 2008). Normalmente,
a listeriose não apresenta sintomas clássicos de infecções gastroentéricas.
34
L. monocytogenes pode se reproduzir em um grande número de reservatórios
presentes nas indústrias processadoras, contaminando uma ampla variedade de
alimentos (CHEN et al., 2005). Este patógeno tolera altas concentrações de sal e
valores de pH relativamente baixos, podendo se multiplicar em temperaturas de
refrigeração (VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001).
Além disso, L. monocytogenes apresenta a capacidade de produzir
biofilme em diferentes superfícies tornando-se com isso uma das principais
ameaças à seguridade alimentar e um perigo particular na indústria de
alimentos (LUKINMAA et al., 2004, VÁZQUEZ-BOLAND et al., 2001, UHITIL et al.,
2004).
Os micro-organismos podem existir no ambiente tanto como células
planctônicas, como comunidades em biofilme, onde se encontram ligados a uma
superfície, cercados e unidos em uma matriz predominantemente composta por
material polissacarídico (GANDHI e CHIKINDAS, 2007). Vários trabalhos
demonstram que L. monocytogenes é capaz de se aderir e produzir biofilme em
superfícies de contato com os alimentos, como poliestireno, vidro e aço inoxidável
(DI BONAVENTURA et a, 2008; FOLSOM e FRANK, 2006; GANDE e MURIANA,
2003). A formação de biofilme cria problemas à indústria alimentícia uma vez que
representa uma importante fonte de contaminação dos alimentos (DI
BONAVENTURA et al., 2008). A adesão das bactérias às superfícies é influenciada
por propriedades físico-químicas do ambiente (temperatura e pH), da superfície
(hidrofobicidade), do micro-organismo (hidrofobicidade, motilidade e
presença/ausência de flagelos), e do conteúdo de nutrientes no meio, que
influenciam a adesão nas etapas iniciais de formação de biofilme (TAKHISTOV e
GEORGE, 2004). Além disso, as cepas de L. monocytogenes variam em sua
habilidade para produzir biofilme, o que pode ocorrer devido à supressão ou super
expressão de genes cujos produtos conferem vantagens adaptativas como, por
exemplo, a expressão de genes relacionados à síntese de exopolissacarídeos
envolvidos na produção de biofilme (FOLSOM e FRANK, 2006).
Para a maioria das bactérias, incluindo L. monocytogenes, as informações
disponíveis sobre o resultado da expressão gênica durante a formação de biofilme
ainda são limitadas, embora, um crescente número de trabalhos esteja sendo
publicado sobre as mudanças na expressão gênica, especialmente durante a fase
inicial do desenvolvimento do biofilme (RIEU et al., 2007; TRÉMOULET et al., 2002).
35
Neste sentido, o papel do locus agr de Staphylococcus aureus é mais
estudado, entretanto, em L. monocytogenes, pouco se conhece. Não obstante, Rieu
et al. (2007) demonstrou que esse locus, composto por quatro genes (agrB, agrD,
agrC e agrA) é organizado num operon, e que a transcrição desses genes parece
ser importante, especialmente na fase inicial da formação do biofilme. Sendo assim,
a utilização da técnica de RT-qPCR, comparando células em biofilme com células
planctônicas submetidas a condições diversas, testará o papel deste locus e, desta
forma, gatilhos ambientais podem ser determinados para um padrão singular de
expressão gênica dos biofilme.
A transcrição reversa combinada à Reação em Cadeia da Polimerase (RT-
qPCR) é uma técnica in vitro utilizada para amplificar sequências definidas de RNA
mensageiro. Pode ser empregada para avaliar a presença ou a ausência de
determinado transcrito, comparar níveis de mRNAs em diferentes amostras, e para
caracterizar padrões de expressão de mRNAs. Esta técnica apresenta ótima
sensibilidade e pode ser usada para quantificar mRNA em baixos níveis, e assim,
tem se mostrado uma poderosa ferramenta na quantificação da expressão gênica
(WONG e MEDRANO, 2005).
3.2 Hipótese
O número de transcritos dos genes do locus agr (agrB, agrD, agrC e agrA) em
L. monocytogenes é alterado quando as células desse micro-organismo são
submetidas a diferentes superfícies, tempos de contato e temperaturas de
incubação, em condições de formação de biofilme.
3.3 Objetivos
Objetivo Geral
Verificar o perfil de expressão dos genes do locus agr (agrB, agrD, agrC e
agrA) em isolados de L. monocytogenes provenientes de fontes distintas (ambientais
e alimentos), em células se multiplicando em condições de formação de biofilme,
sob diferentes superfícies, temperaturas e tempos de incubação.
36
Objetivos Específicos
- Avaliar a capacidade de adesão de isolados de L. monocytogenes provenientes de
distintas fontes (ambientais e alimentos) na região de Pelotas, RS.
- Avaliar a interferência do tipo de superfície (aço inox e polipropileno), temperaturas
de incubação (10ºC, 20ºC e 37ºC) e tempos de contato (8h, 12h, 24h, 48h) na
capacidade de adesão dos isolados selecionados de L. monocytogenes.
- Extrair RNA das cepas nas diferentes condições experimentais (superfícies,
temperaturas de incubação e tempos de contato) e sintetizar cDNA.
- Verificar o perfil de expressão dos genes do locus agr de isolados de L.
monocytogenes nas diferentes condições experimentais (superfícies, temperaturas
de incubação e tempos de contato)
3.4 Material e Métodos
O projeto será desenvolvido no Laboratório de Microbiologia de Alimentos
(DCTA/FAEM) e no Laboratório de Genômica e Fitomelhoramento (CGF/FAEM),
ambos da Universidade Federal de Pelotas.
Material
Serão selecionados isolados de L. monocytogenes provenientes de fontes
distintas (ambientais e alimentos) da região sul do Rio Grande do Sul, sorotipadas
pela FIOCRUZ (Fundação Osvaldo Cruz), e caracterizadas através de testes
bioquímicos e moleculares. A seleção dos isolados será realizada com base na
capacidade de formação de biofilme, classificando-as em não formadoras, fracas,
moderadas e fortes formadoras de biofilme, conforme descrito por Stepanovic et al.
(2007).
Os isolados armazenados a -70ºC serão recuperados e cultivados em Caldo
Tripticase de Soja acrescido de 0,6% de Extrato de Levedura (TSB-YE), a 37ºC,
sendo realizados os subcultivos sob estas mesmas condições e, sempre que
necessário, serão estriados em Ágar Cromogênio a 37ºC/48h a fim de verificar a sua
pureza. Para este estudo serão utilizados como controle positivo uma cepa padrão
ATCC de L. monocytogenes e como controles negativos para Densidade Ótica (DO)
o branco.
37
Métodos
Delineamentos Experimentais
O experimento constará de 30 amostras iniciais decorrentes de um
delineamento inteiramente casualizado em três etapas conforme as Tabelas 1, 2 e 3.
Tabela 1 – Delineamento Experimental para avaliação da capacidade de adesão
Tratamentos Variáveis Independentes (Isolados)
Variável dependente
1 1 DO: não produtora de biofilme, fraca produtora de biofilme, moderada produtora de biofilme, forte produtora de biofilme Anova e Tukey (p<0,05)
2 2
3 3
(...) (...)
30 30
Controle Negativo(1) Controle Positivo (1)
31 32
32 tratamentos x 3 avaliações = 96 amostras x 3 repetições = 288 determinações de DO. Tabela 2 – Delineamento Experimental para a avaliação da interferência do tipo de superfície, temperatura e tempo de contato na capacidade de adesão
Tratamentos Variáveis Independentes Variável dependente
Isolados Superfície Temperaturas de Incubação
Tempos de contato
1 1 Aço inoxidável (AI)
10ºC 8h Concentração
microbiana
(LOG UFC.cm-2
) Anova e Tukey (p<0,05)
2 2 12h
3 3 20ºC
(...) (...)
Poliestireno (PS)
24h Y Y
37ºC Controle Negativo(1) Controle Positivo (1)
Y + 2
48h
(Y+2) isolados X 2superfícies X 3 temperaturas X 4 tempos x 2 repetições = (Y+2) X 48 determinações.
38
Tabela 3 – Delineamento Experimental para extração de RNA, síntese de cDNA e avaliação do perfil de expressão dos genes do locus agr por RT-qPCR
Tratamentos Variáveis Independentes Variável dependente Isolado
s Superfícies Temperaturas
de Incubação Tempos de contato
Genes
1 2
Células sob CFB* 1 (...)
Aço inoxidável (AI) Poliestireno (PS)
10ºC 20ºC 37ºC
8h 12h 24h 48h
agrA agrB agrC agrD 16S
QR (quantificação relativa) – RT-qPCR Anova e Tukey (p<0,05)
Células sob CP* 1 (...)
2 células CP X 3 temperaturas X 4 tempos x 5 genes X 3 repetições = 360 determinações. 2 células CFB X 2 superfícies X 3 temperaturas X 4 tempos x 5 genes X 3 repetições = 720 determinações. CFB = condições de formação de biofilme; CP = condições planctônicas
Avaliações
Avaliação da capacidade de adesão de isolados de L. monocytogenes
provenientes de distintas fontes (ambientais e alimentos) na região de Pelotas,
RS.
Os isolados de L. monocytogenes serão avaliados quanto à capacidade de
adesão, a fim de associar essa característica com perfis genéticos e bioquímicos. A
metodologia proposta será padronizada de acordo com as recomendações de
Stepanovic et al. (2007), utilizando-se placas para microtitulação, com três
repetições.
Uma colônia de cada isolado será semeada em TSB-YE e incubada a 37ºC
por 24h. Em seguida, será diluída a fim de se obter uma turbidez semelhante à
escala 0,5 da escala de MacFarland, o que corresponde a, aproximadamente,
1,5x108 UFC.mL-1. Como controle, cada isolado será diluído em escala seriada
decimal até 1:10.000, e 20µL das duas últimas diluições serão semeadas pour plate,
em duplicata em ágar Tripticase de Soja acrescido de 0,6% de Extrato de Levedura
(TSA-YE) com incubação a 30ºC por 48h, para enumeração da quantidade exata
que será testada para verificação da capacidade de adesão. Após 16 a 18h de
incubação, as colônias formadas serão enumeradas e os resultados serão
expressos em UFC.20µL-1.
39
Placas utilizadas para microtitulação (ELISA) com 96 cavidades serão
usadas para verificação de formação de biofilme pelas culturas bacterianas. As
placas utilizadas serão cobertas com uma membrana para oclusão adequada das
cavidades. Sessenta microlitros de cada uma das culturas obtidas e preparadas
previamente serão inoculadas em triplicata nas placas (20µL em cada cavidade, o
que equivale a uma inoculação por cavidade com cerca de 3,0x106 UFC.mL-1), e em
seguida cada cavidade será completada com adicionais 180µL de TSB-YE
adicionado de 1% de glicose (TSB-YE+G). Uma solução de glicose a 10% será
preparada separadamente, esterilizada por filtração, e adicionada em TSB-YE
previamente autoclavado, para atingir a concentração final de 1% (10mL da solução
de glicose a 10% em 90mL de TSB). Em cada placa, um grupo de 3 cavidades
(triplicata) será utilizado como controle negativo, inoculando-se, em cada um, 20µL
de TSB-YE e 180µL de TSB-YE+G.
Dessa forma, em cada placa serão avaliados 31 culturas e um controle
negativo. Após a inoculação de todas as culturas e meios de cultura, a placa será
fechada com sua membrana e incubada a 37ºC por 24 h.
Após o período de incubação, o conteúdo das cavidades das placas de
microtitulação será retirado e descartado, com posterior lavagem com solução
esterilizada de salinafosfato tamponado (PBS, pH 7,2), utilizando-se 300µL dessa
solução por cavidade, em 3 repetições. Essa etapa tem como objetivo remover as
células não aderidas nas placas, as quais não formaram biofilme.
Em seguida, o biofilme formado será fixado adicionando-se 150µL de
metanol em cada cavidade por 20 minutos. Posteriormente, as placas serão
invertidas para retirada do metanol adicionado e mantidas dessa forma por 18h, para
sua secagem completa. Após secagem completa, 150µL de cristal violeta serão
adicionados em cada cavidade, e as placas mantidas em temperatura ambiente por
15 minutos. Então, as placas serão lavadas em água corrente para retirada de todo
excesso de corante e secas com ar quente. Em seguida, 150µL de etanol 95% serão
adicionados em cada cavidade e as placas cobertas com suas películas e mantidas
em temperatura ambiente por 30 minutos.
Após esse tempo, a densidade óptica (DO) das soluções resultantes em
cada cavidade será mensurada por espectrofotometria a 595nm.
O resultado final de DO de cada cultura será obtido pela média entre as três
repetições realizadas. Esses resultados serão comparados com a leitura média de
40
DO de corte (cutt-off -DOc), que será obtido a partir dos resultados de DO das 3
repetições do controle negativo, corrigido de acordo com o desvio padrão:
DOc = média de DO controle negativo x desvio padrão controle negativo
Considerando o DOc obtido em cada placa, as leituras de DO médias
obtidas de cada uma das culturas serão comparadas e classificadas quanto a
capacidade de formação de biofilme considerando a seguinte interpretação:
DO ≤ DOc = não produtor de biofilme
DOc< DO ≤ 2DOc = fraco produtor de biofilme
2DOc< DO ≤ 4DOc = moderado produtor de biofilme
4DOc< DO = forte produtor de biofilme
Avaliação da interferência do tipo de superfície, temperatura e tempo de
contato na capacidade de adesão de isolados selecionados de L.
monocytogenes
Antes de cada utilização, os cupons de aço inox (AI) serão tratados para
remoção de eventuais micro-organismos e resíduos, que podem interferir nos
resultados. Para isso, os cupons serão inicialmente lavados com escovas de cerdas
macias, detergente neutro e água destilada. Após enxágue, mergulhados em
acetona durante 24h para remoção de resíduos de gorduras. Em seguida, os cupons
serão mergulhados em solução de NaOH 0,1 N por uma hora, enxaguados com
água destilada (3 vezes) e submetidos a banho de ultra-som por 1hora. Por fim,
antes de serem utilizados os cupons serão embalados individualmente e
esterilizados em autoclave a 121ºC por 15 min.
Os isolados serão testados em duas repetições quanto a formação de
biofilme em superfícies de AI e PS, seguindo o protocolo proposto por Rieu et al.
(2007). Para avaliação da aderência em AI, cupons de 8cm de diâmetro serão
inseridos em placas de Petri contendo TSB-YE+G, e para a avaliação da aderência
em PS, serão utilizadas placas de Petri de poliestireno. Os isolados serão
inoculados na concentração 0,5 da escala de MacFarland (1/10) seguidos de cultivo
a 37ºC, 20ºC e 10ºC por 8h, 12h, 24h e 48h. Após este período o meio de cultivo
41
será retirado e os cupons ou o fundo da placa lavados com 10mL PBS, por duas
vezes, para a retirada das células fracamente aderidas e submetidos a secagem a
37ºC.
Em seguida, as células aderidas serão retiradas através de esfregaço em
superfície com o auxílio de suabes esterilizados e, após, inseridos em solução salina
e homogeneizados em vórtex. Para a enumeração das células aderidas serão
realizadas diluições seriadas seguidas de espalhamento em superfície de 0,1mL de
inóculo, em duplicata, em TSA-YE por 24h a 37ºC.
Extração de RNA e sintetize de cDNA dos isolados nas diferentes condições
experimentais (superfície, temperatura de incubação e tempo de contato)
Será extraído RNA a partir de células sob condições planctônicas (CP) e sob
condições de formação de biofilme (CFB). Cada isolado será submetido a estas
duas condições (CP e CFB), em três temperaturas (37°C, 20°C e 10°C) e diferentes
tempos de incubação (8h, 12h, 24h e 48h) e ainda, sob CFB os isolados também
serão avaliados em duas superfícies (AI e PS).
O RNA será extraído e purificado com o RiboPure™-Bacteria Kit (Ambion®),
de acordo com o protocolo recomendado pelo Kit. O RNA extraído de cada amostra
será quantificado e sua pureza verificada através do cálculo da razão A260/A280 em
espectrofotômetro, com o objetivo de indicar possíveis contaminações da amostra
por proteínas e compostos fenólicos. Assim, os RNAs extraídos serão considerados
bons para a síntese de cDNA quando apresentaram pureza na razão (A260/A280) de
1,8 – 2,0.
A síntese de cDNA será realizada com o High Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (Applied BiosystemsTM), de acordo com as instruções do fabricante.
Validação dos primers do locus agr e do gene 16S
Os primers serão desenhados utilizando-se recursos de bioinformática a
partir de sequências obtidas do Banco de Dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), ou serão pesquisados em artigos já publicados. A
eficiência de cada par de primers será calculada utilizando-se a curva padrão de
diluição seriada de mix de cDNA (1:1; 1:5; 1:25; 1:125), como descrito no protocolo
42
da Applied BiosystemsTM e, tanto a validação como a avaliação da expressão, serão
realizadas em termociclador 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied
BiosystemsTM).
Avaliação do perfil de expressão dos genes do locus agr de isolados de L.
monocytogenes nas diferentes condições experimentais (superfície,
temperatura de incubação e tempo de contato)
O perfil de expressão dos genes do locus agr e do gene referência (16S) nas
diferentes superfícies, temperaturas de incubação e tempos de contato, em CFB
(superfície com TSB-YE+G) e, em CP (microtubo com TSB-YE) será efetuada
utilizando-se a técnica de RT-qPCR.
A RT-qPCR constará de 12,5μL de SYBR Green PCR Master Mix (Applied
BiosystemsTM), 1μL do cDNA (diluído), 1,5µL de primers forward e 1,5µL reverse
(diluído em 100pMol.µL-1), e água livre de nuclease. As amostras serão colocadas
em triplicata, em placas com capacidade para 96 reações, e cobertas com adesivo
óptico. O nível de expressão gênica será calculado baseado no threshold cycle
(Ct), onde o gene 16S rRNA será utilizado como normalizador (endógeno) e,
como controle de expressão, será utilizado a Quantificação Relativa (QR) do
crescimento dos isolados sob CP.
Análise dos Resultados:
Os resultados de DO, concentrações bacterianas e as quantificações
Relativas (QR) dos isolados submetidos a diferentes condições serão comparados
por Análise de Variância (ANOVA) (p<0,05). Em seguida será aplicado o teste de
média de Tukey, para cada experimento, para verificar diferenças significativas entre
capacidade de formação de biofilme e entre as expressões gênicas,
respectivamente, utilizando o software Statistica 7.0 (STATSOFT, 2004).
3.5 Resultados e Impactos esperados
Essa proposta se caracteriza como um projeto de pesquisa científica, na
qual objetiva-se avaliar a produção de biofilme por L. monocytogenes em diferentes
43
superfícies, temperaturas e tempos de incubação, bem como a influência dessas
variáveis sobre o acúmulo de transcritos dos genes do locus agr, em isolados desse
micro-organismo provenientes de distintas fontes (ambientais e alimentos) no sul do
Rio Grande do Sul.
L. monocytogenes com habilidade para formação de biofilme, portanto, com
capacidade de persistirem nos ambientes das indústrias de alimentos apresentam
grande potencial para causar infecções alimentares, sendo necessária a adoção de
medidas efetivas para seu controle nas indústrias. Os resultados obtidos permitirão a
ampliação do conhecimento científico sobre alguns parâmetros que possibilitam a
persistência desse patógeno nesses ambientes, disponibilizando dados que visam
auxiliar no seu controle, através de medidas direcionadas e reconhecidas
cientificamente.
3.6 Apoio Financeiro
O projeto de tese tem apoio financeiro do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Processo 482524/2010-3) e da
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul – FAPERGS
(Processo 11/1271-9)
44
3.7 Cronograma de Atividades
3.8 Referências Bibliográficas
ALLENBERGER, Frans. Listeria monocytogenes. In: SIMJEE, Shabbir (Org). Food Born Diseases,. New Jersey: Humana Press, 2007. p. 27-28. Disponível em: < https://books.google.com.br/books?id=ed1tNVs_xTcC&printsec=frontcover&hl=pt-BR#v=onepage&q&f=false>. Acesso em: 30 nov. 2014. CHEN, Y.; ZHANG, W.; KNABEL, S. J. Multi-Virulence-Locus Sequence Typing Clarifies Epidemiology of Recent Listeriosis Outbreaks in the United States. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n. 10, p. 5291-5294, 2005.
Atividades Ano/Trimestre
2011 2012 2013 2014 2015
1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º/2º
Atualização Bibliográfica X X X X X X X X X X X X X X
Organização e seleção dos isolados
X X X
Padronização de protocolos para avaliação da
capacidade de formação de biofilme
X X
Avaliação da formação da capacidade de formação de
biofilme dos isolados
X X X X X
Padronização de protocolos para avaliação da
interferência do tipo de superfície, temperatura e
tempo de contato na capacidade de adesão dos
isolados
X X X
Avaliação da interferência do tipo de superfície,
temperatura e tempo de contato na capacidade de
adesão dos isolados
X X X
Extração do RNA e síntese do cDNA dos isolados sob
CP e sob CFB em diferentes superfícies, temperaturas e
tempos
X X X X
Validação dos primers e
padronização do programa de RT-qPCR
X X X
Perfil de expressão por qPCR dos isolados sob CP e
sob CFB em diferentes superfícies, temperaturas e
tempos
X X X
Testes Complementares X X
Análise dos resultados
Elaboração de Artigos e Relatórios para Publicação
X X X X
Exame de Qualificação X
Defesa de Tese X
45
DI BONAVENTURA, G.; PICCOLOMINI, R.; PALUDI, D.; D’ORIO, V.; VERGARA, A.; CONTER, M.; IANIERI, A. Influence of temperature on biofilm formation by Listeria monocytogenes on various food-contact surfaces: relationship with motility and cell surface hydrophobicity. Journal of Applied Microbiology, v. 104, p. 1552-1561, 2008. FELÍCIO, M. T. S.; HOGG, T.; GIBBS, P.; TEIXEIRA, P.; WIEDMANN, M. Recurrent and Sporadic Listeria monocytogenes Contamination in Alheiras Represents Considerable Diversity, Including Virulence-Attenuated Isolates. Applied and Environmental Microbiology. v. 73, n. 12, p. 3887-3895, 2007. FOLSOM, J. P.; FRANK, J. F. Chlorine Resistance of Listeria monocytogenes Biofilms and Relationship to Subtype, Cell Density, and Planktonic Cell Chlorine Resistance. Journal of Food Protection, v. 69, n. 6, p. 1292-1296, 2006. GANDE, N.; MURIANA, P. Prepackage surface pasteurization or ready-to-eat meats with a radiant heat oven for reduction of Listeria monocytogenes. Journal of Food Protection, v. 66, n. 9, p. 1623-1630, 2003. GANDHI, M.; CHIKINDAS, M. L. Listeria: A foodborne pathogen that knows how to survive. International Journal of Food Microbiology, v. 113, p. 1-15, 2007. GILBRETH, S. E.; CALL, J. E.; WALLACE, F. M.; SCOTT, V. N.; CHEN, Y.; LUCHANSKY, J. D. Relatedness of Listeria monocytogenes Isolates Recovered from Selected Ready-To-Eat Foods and Listeriosis Patients in the United States. Applied and Environmental Microbiology, v. 71, n. 12, p. 8115-8122, 2005. JIANG, L.; CHEN, J.; XU, J.; ZHANG, X.; WANG, S.; ZHAO, H.; VONGXAY, K.; FANG, W. Virulence characterization and genotypic analyses of Listeria monocytogenes isolates from food and processing environments in eastern China. International Journal of Food Microbiology, v. 121, p. 53–59, 2008. KIMURA, B. Recent Advances In the Study of the Genotypic Diversity and Ecology of Listeria monocytogenes. Microbes and Environments. v. 21, n. 2, p. 69-77, 2006. LUKINMAA, S.; AARNISALO, K.; SUIHKO, M. L.; SIITONEN, A. Diversity of Listeria monocytogenes isolates of human and food origin studied by serotyping, automated ribotyping and pulsed-field gel electrophoresis. Clinical Microbiology and Infections, v. 10, n. 6, p. 563-568, 2004. PONTELLO, M., GUAITA, A., SALA, G., MICAELA CIPOLLA, M., GATTUSO, A., SONNESSA, M., GIANFRANCESCHI, M. V. Listeria monocytogenes serotypes in human infections (Italy, 2000-2010). Annali dell'Istituto Superiore di Sanità, v. 48, n. 2, p. 146-150, 2012. RIEU, A., WEIDMANN, S., GARMYN, D., PIVETEAU, P., GUZZO, J. agr system of Listeria monocytogenes EGD-e: Role in adherence and differential expression pattern. Applied and Environmental Microbiology, p. 6125-6133, 2007.
46
STATSOFT, Statistica 7,0 for Windows, Computer Program Manual. Tulsa: StatSoft, Inc., 2004. STEPANOVIC, S.; VUKOVIC, D.; HOLA, V.; BONAVENTURA, G.; DJUKIC, S.; IRKOVIC, I.; RUZICKA, F. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci Journal Compilation, 115: 891–9, 2007. TAKHISTOV, P.; GEORGE, B.Early events and pattern formation in Listeria monocytogenes biofilms. Biofilms, v. 1, p. 351–359, 2004. TRÉMOULET, F.; DUCHÉ, O.; NAMANE, A.; MARTINIE, B.; THE EUROPEAN Listeria GENOME CONSORTIUM; LABADIE, J. C. Comparison of protein patterns of Listeria monocytogenes grown in biofilm or in planktonic mode by proteomic analysis. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Letters, v. 210, p. 25-31, 2002. UHITIL, S.; JAKSIC, S.; PETRAK, T.; MEDIC, H.; GUMHALTER-KAROLYI, L. Prevalence of Listeria monocytogenes and the other Listeria spp. in cakes in Croatia. Food Control, v. 15, n. 3, p. 213-216, 2004. VÁZQUEZ-BOLAND, J. A.; KUHN, M.; BERCHE, P.; CHAKRABORTY, T.; DOMÍNGUEZ-BERNAL, G.; GOEBEL, W.; GONZÁLEZ-ZORN, B.; WEHLAND, J.; KREFT, J. Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants. Clinical Microbiology Reviews, v. 14, n. 3, p. 584-640, 2001. WONG, M. L. E MEDRANO, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation: Review. BioTechniques 39:75-85, 2005.
4 Relatório de Trabalho de Campo
Inicialmente haviamos proposto a avaliação de 30 isolados de L.
monocytogenes a fim de verificar a capacidade de produção de biofilme em uma
única temperatura. No entanto, surgiu a possibilidade de realizarmos uma avaliação
mais ampla, incluindo outros isolados de L. monocytogenes pertencentes a
bacterioteca do Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de
Ciência e Tecnologia Agroindustrial, da Universidade Federal de Pelotas (UFPel).
Desta forma, para o primeiro experimento, 73 isolados de L. monocytogenes
(provenientes de alimentos e de ambientes de processamento, de diferentes
sorotipos e datas de isolamento), foram avaliados quanto a capacidade de formação
de biofilme, sob 3 diferentes temperaturas de incubação (10ºC, 20ºC e 37ºC).
E, além destes isolados, também avaliou-se a capacidade de produção de
biofilme das cepas padrão L. monocytogenes ATCC 7644 sorotipo 1/2c, L.
monocytogenes Scott A sorotipo 4b, L. monocytogenes ATCC 19117 sorotipo 4d.
Optou-se por realizarmos o experimento em triplicata biológica, porém, em
duplicata técnica, conforme a metodologia descrita por Stepanovic et al. (2007) e
Djordjevic et al (2002), com adaptações (Apêndice A).
A análise dos isolados a partir dos resultados da DOA595 quanto a
classificação de produção de biofilme foi simplificada. Os isolados foram, então,
classificados em produtores e não produtores de biofilme, corrigindo o desvio padrão
a partir do cálculo:
DOc = média de DO controle negativo + (desvio padrão controle negativo)
E considerando a seguinte interpretação:
DO ≤ DOc = não produtor de biofilme
DOc ≤ DO = produtor de biofilme
Para o experimento onde se avaliou o perfil de expressão de genes de L.
monocytogenes envolvidos na formação de biofilme, selecionaram-se os isolados
baseados nos resultados da DOA595 do primeiro experimento e na concentração
bacteriana encontrada nas superfícies do segundo experimento.
48
Foram utilizados quatro isolados de L. monocytogenes, selecionados por sua
capacidade de produzir biofilme (2 formadores de biofilme e 2 não formadores de
biofilme) e por sua origem (2 provenientes de alimentos e 2 de ambiente de
processamento) (Apêndice B).
O gene prfA, que é um regulador de virulência conhecido em L.
monocytogenes, também foi incluído neste experimento a fim de relacionar seu perfil
de expressão ao do locus agr durante a produção de biofilme nos isolados, nas
mesmas superfícies, tempos e temperaturas previstos no projeto de pesquisa.
Os primers do locus agr e do gene prfA foram baseados na literatura
publicada (FRANÇA et al, 2012; RIEU et al, 2007), e mesmo havendo referência na
avaliação do perfil de expressão destes genes foi realizada a sua validação por meio
de curvas de dissociação (Apêndice C).
5 Manuscrito 1: Produção de biofilme por isolados de Listeria
monocytogenes sob diferentes condições de temperatura
Manuscrito elaborado para o periódico: International Journal of Food
Microbiology.
Fator de Impacto: 3,155.
50
Produção de biofilme por isolados de Listeria monocytogenes, sob diferentes 1 condições de temperatura 2
3
Tatiane Kuka Valente Gandraa, Darla Silveira Volcana, Isabela Schneida, Wladimir 4 Padilha da Silvaa* 5
6 a Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, 7
Universidade Federal de Pelotas, Campus Capão do Leão, caixa postal 354, Pelotas, Rio Grande do 8 Sul, Brasil. 9
* Autor para correspondência: [email protected] (Silva, W. P.) 10
11
5.1 Resumo 12
A capacidade de produção de biofilme por bactérias patogênicas tem importantes implicações nas 13 indústrias de alimentos, onde podem criar uma fonte persistente de contaminação do produto final. 14 Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a influência de distintas condições de 15 temperatura (10ºC, 20ºC e 37ºC) na capacidade de produção de biofilme por isolados de Listeria 16 monocytogenes provenientes de diferentes fontes (alimentos, manipuladores e ambientes de 17 processamento de alimentos). Os isolados de L. monocytogenes apresentaram variação na produção 18 de biofilme, havendo influência significativa (p<0,05) das temperaturas testadas. Considerando as 19 fontes de isolamento de L. monocytogenes (alimentos, manipulador e ambiente), não foram 20 observadas diferenças significativas na capacidade de produção de biofilme (p>0,05). Contudo, 21 observou-se uma correlação r=0,99 com o aumento da temperatura para produção de biofilme nos 22 isolados provenientes de alimentos, e uma correlação r= -0,63 para o aumento da temperatura nos 23 isolados provenientes do ambiente de processamento. Com base nos valores de DOA595 pode-se 24 observar que não houve prevalência de um sorotipo produtor de biofilme entre os isolados de L. 25 monocytogenes provenientes de alimentos. Porém, para os isolados provenientes do ambiente de 26 processamento, houve uma maior produção de biofilme pelo sorotipo 1/2c a 10ºC. Dessa forma, 27 pode-se verificar que a variabilidade na produção de biofilme obtida pelos isolados de L. 28 monocytogenes, sob as temperaturas avaliadas, é crítica e denota a importância do controle da 29 temperatura nos alimentos e no ambiente de processamento a fim de evitar a persistência deste 30 micro-organismo. 31
32
Palavras-chave: temperatura, aderência, poliestireno 33
51
5.2 Introdução 34
35
A avaliação da capacidade de aderência e de produção de biofilme por 36 bactérias potencialmente patogênicas é importante para a área de medicina, para 37 estudos relacionados ao meio ambiente e para a indústria alimentícia (Chavant et 38 al., 2007). Nesta última, o biofilme pode criar uma fonte persistente de contaminação 39 ao produto final (Van Houdt e Michiels, 2010). 40
As bactérias formadoras de biofilme são mais resistentes a antibióticos e à 41 resposta imune do hospedeiro que as suas homólogas planctônicas. Biofilme é cada 42 vez mais reconhecido como de grande significância nas doenças humanas, estando 43 envolvidos em 80% das infecções bacterianas, incluindo infecções pulmonares, 44 colite, uretrite, conjuntivite, otite, endocardite e periodontite (Worthington et al., 45 2012). 46
Embora as condições de higiene para a produção de alimentos tenham sido 47 continuamente melhoradas nas indústrias de processamento, casos e surtos de 48 doenças como listeriose, salmonelose e intoxicações alimentares, ocasionados pelo 49 consumo de produtos contaminados, têm sido amplamente relatados, sendo ainda 50 um grande desafio o entendimento e controle efetivo de micro-organismos 51 patogênicos associados a biofilme, como Listeria monocytogenes, Salmonella spp. e 52 Staphylococcus aureus. (Rodrigues et al., 2010). 53
A produção de biofilme é um processo dinâmico e diferentes mecanismos 54 estão envolvidos na sua fixação e desenvolvimento (Kumar e Anand, 1998). São 55 importantes nestes mecanismos as estruturas das células bacterianas, como 56 flagelos, apêndices e polissacarídeos, que atuam na ligação e na colonização de 57 micro-organismos em superfícies de contato com alimentos. Bem como as 58 características das superfícies de ligação e as condições ambientais (principalmente 59 a temperatura), em especial para bactérias associadas a ambientes de 60 processamento de alimentos (Slama et al., 2012; Van Houdt e Michiels, 2010). 61
Desta forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a influência de distintas 62 condições de temperatura na capacidade de produção de biofilme por isolados de 63 Listeria monocytogenes provenientes de diferentes fontes. 64
65
5.3 Material e Métodos 66
67
5.3.1 Isolados bacterianos 68
Setenta e seis isolados de L. monocytogenes, pertencentes à bacterioteca do 69 Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia 70 Agroindustrial, da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), provenientes de 71 alimentos e de ambientes de processamento, de diferentes sorotipos e datas de 72 isolamento (Tabela 1), foram avaliados quanto a capacidade de produção de 73 biofilme sob diferentes temperaturas de incubação. E além destes, as cepas padrão 74 L. monocytogenes ATCC 7644 sorotipo 1/2c, L. monocytogenes Scott A sorotipo 4b 75 e L. monocytogenes ATCC 19117 sorotipo 4d também foram avaliadas quanto a 76 capacidade de produção de biofilme, nas mesmas condições dos isolados. 77
52
Tabela 1 – Fonte, sorotipo e ano de isolamento de L. monocytogenes avaliadas 78 quanto a capacidade de produção de biofilme 79
Micro-organismo
Codificação Fonte Sorotipo Ano isolamento
L. m
onocyto
genes
LA001 Superfície de carcaça ovina 4b 2001 LA002 Superfície de carcaça ovina 3c 2001 LA003 Superfície de carcaça ovina 1/2a 2001 LA004 Superfície de carcaça ovina 1/2c 2001 LA005 Superfície de carcaça ovina 4b 2001 LA006 Superfície de carcaça ovina 1/2b 2001 LA007 Superfície de carcaça ovina 1/2b 2001 LA008 Superfície de carcaça ovina 1/2c 2001 LA009 Queijo colonial 1/2c 2004 LA010 Queijo colonial 1/2b 2004 LA011 Queijo colonial 4b 2004 LA012 Queijo colonial 1/2b 2004 LA013 Queijo colonial 4b 2004 LA014 Queijo colonial 1/2c 2004 LA015 Queijo colonial 1/2b 2004 LA016 Queijo colonial 1/2b 2004 LA017 Queijo colonial 1/2c 2004 LA018 Massa-misturador embutidos 4b 2004 LA019 Massa moedor produtos cárneos 1/2c 2004 LA020 Embutido cárneo 1/2c 2004 LA021 Embutido cárneo 1/2c 2004 LA022 Embutido cárneo 1/2b 2004 LA023 Massa-misturador 1/2c 2004 LA024 Embutido cárneo 4b 2004 LA025 Embutido cárneo 1/2c 2004 LA026 Embutido cárneo 1/2b 2004 LA027 Embutido cárneo 1/2c 2004 LA028 Água de lavagem pré-chiller 1/2b 2006 LA029 Água de lavagem chiller 1/2b 2006 LA030 Carcaça de frango 1/2b 2006
LA031 Água de lavagem evisceração frango
1/2b 2006
LA032 Carcaça de frango 1/2b 2006 LA033 Frango após pré-resfriamento 1/2b 2006 LA034 Frango após evisceração 1/2b 2006 LA035 Frango após evisceração 4e 2006 LA036 Frango após pré-resfriamento 4e 2006 LA037 Frango após pré-resfriamento 1/2b 2006 LA038 Suabe cloacal de frango 4e 2006 LA039 Frango varejo 1/2a 2006 LA040 Frango varejo 1/2b 2006 LA041 Frango varejo 1/2c 2006 LA042 Frango varejo 1/2b 2006 LA043 Frango varejo 1/2a 2006 LA044 Frango varejo 1/2b 2006
LA045 Superfície de carcaça bovina após a etapa de lavagem pré-resfriamento
1/2a 2010
LA046 Superfície de carcaça bovina após a etapa de lavagem pré-resfriamento
4b 2010
LA047 Superfície de carcaça bovina após a etapa de lavagem pré-resfriamento
1/2a 2011
LA048 Superfície de carcaça bovina após a etapa de sangria
1/2a 2011
53
LA049 Superfície de carcaça bovina após a etapa de sangria
1/2a 2011
LA050 Superfície de carcaça bovina após a etapa de sangria
1/2a 2011
LA051 Superfície de carcaça bovina após a etapa de sangria
1/2a 2011
LA052 Superfície de carcaça bovina após a etapa de sangria
1/2a 2011
LA053 Superfície de carcaça bovina após a etapa de sangria
1/2a 2011
LS001 Moedor produtos cárneos 1/2b 2004 LS002 Misturador produtos cárneos 1/2c 2004 LS003 Caixas produtos cárneos 1/2c 2004 LS004 Carrinhos produtos cárneos 1/2c 2004 LS005 Moedor produtos cárneos 1/2c 2004 LS006 Caixas produtos cárneos 1/2c 2004 LS007 Amarrador produtos cárneos 1/2c 2004 LS008 Embutideira 1/2c 2004 LS009 Amarrador produtos cárneos 1/2c 2004 LS010 Carrinhos produtos cárneos 1/2c 2004 LS011 Manipulador (superfície mãos) 1/2c 2004 LS012 Embutideira 1/2c 2004 LS013 Escovas depenagem frango 4b 2006
LS014 Mesa separação de miúdos antes do abate de frangos
4b 2006
LS015 Estrado da mesa de transpasse de frangos
1/2b 2006
LS016 Cantos piso evisceração frango 1/2b 2006
LS017 Esteira de cortes antes do abate de frangos
1/2b 2006
LS018 Esteira de cortes final do abate de frangos
1/2b 2006
LS019 Cantos piso evisceração frangos 1/2b 2006
LS020 Dreno da sala de resfriamento frangos
1/2b 2006
LS021 Facas de corte de bovinos antes do início das atividades
1/2a 2010
LS022 Mesas das operações de corte de bovinos durante as atividades
1/2a 2010
LS023 Mesas das operações de corte de bovinos antes do inicio das atividades
1/2a 2010
80
5.3.2 Recuperação e preparo dos isolados 81
Os isolados foram recuperados em caldo Triptona de Soja (TSB, Oxoid 82 CM0129), acrescido de 0,6% de Extrato de Levedura (YE, Oxoid LP0021), com 83 incubação a 37ºC por 24h. A pureza dos mesmos foi verificada em ágar seletivo 84 para L. monocytogenes (ágar base Listeria Cromogênico, Oxoid CM1084), com 85 incubação a 37ºC por 48h. 86
Uma colônia pura de cada isolado foi semeada em ágar Triptona de Soja 87 (TSA, Oxoid CM0131), acrescido de 0,6% de Extrato de Levedura incubando-se a 88 37ºC por 24h. A partir deste cultivo, uma alíquota de cada um foi transferida para 89 tubos de ensaio contendo solução salina 0,85% (Vetec) e padronizou-se o inóculo 90 para a avaliação do biofilme, na escala 0,5 de MacFarland (Laborclin), o que 91 corresponde aproximadamente a 1,5 x 108 UFC/mL. 92
54
5.3.3 Efeito da temperatura na produção de biofilme 93
A produção de biofilme foi avaliada em três temperaturas de incubação, em 94 triplicata biológica e duplicata técnica, para cada um dos isolados bacterianos, 95 utilizando-se microplaca de titulação de poliestireno (PS) de 96 cavidades, conforme 96 a metodologia descrita por Stepanovic et al. (2007) e Djordjevic et al (2002), com 97 adaptações para L. monocytogenes. 98
Inóculos de 20µL com a concentração padronizada de cada micro-organismo 99 foram transferidos para três cavidades da microplaca contendo 180µL de TSB-YE 100 com 1% de glicose e incubados a 10ºC, 20ºC e 37ºC por 24h, estaticamente. Como 101 controle negativo foi utilizado TSB-YE 1% de glicose. Após este período, o meio de 102 cultura foi descartado. E cada cavidade foi lavada 3 vezes com 270µL de tampão 103 fosfato salino (PBS, pH 7,3 ± 0,2) (Laborclin) para a retirada das células 104 planctônicas, seguido de fixação com 150µL de metanol por 20min. O excesso de 105 metanol foi retirado e a microplaca contendo as células aderidas foi seca a 25ºC, por 106 18h. Após a secagem, as cavidades foram corados com 150μL de cristal violeta por 107 15min. As microplacas foram, então, lavadas com água esterilizada para retirada do 108 excesso de corante e secas com ar quente por 1h. Em seguida, foram adicionados 109 150μL de etanol 95% e, após 30 min, a densidade óptica (DO) a 595nm foi 110 mensurada por espectrofotometria, utilizando-se uma leitora de microplaca de Elisa 111 (Modelo ReadwellTouch Plate - Robonik®). 112
113
5.3.4 Cálculo da DO e análise estatística 114
O resultado final de DO de cada cultura foi obtido pela média entre as 115 repetições realizadas e comparado com a leitura média de DO de corte (cutt-off -116 DOc), que foi obtido a partir dos resultados de DO das 3 repetições do controle 117 negativo, corrigido de acordo com o desvio padrão (Stepanovic et al., 2007): 118
119
DOc = média de DO controle negativo + (desvio padrão controle negativo) 120
121
Dessa forma cada uma das culturas foram comparadas e classificadas quanto 122 a capacidade de produção de biofilme considerando a seguinte interpretação: 123
DO ≤ DOc = não produtor de biofilme 124
DOc ≤ DO = produtor de biofilme 125
126
Os resultados das DO calculados foram submetidos a análise de variância 127 ANOVA seguido do teste de média de Tukey (p<0,05). Também foram feitos 128 cálculos de correlação linear entre a DO dos isolados e as temperaturas avaliadas. A 129 análise estatística foi realizada com o auxílio do software STATISTICA 7.0 130 (STATSOFT, 2004). 131
55
5.4 Resultados 132
133
As médias de DO obtidas pela produção de biofilme por L. monocytogenes, 134 em diferentes temperaturas, podem ser visualizadas nas Figuras 1. 135
Em relação a L. monocytogenes, houve variação na produção de biofilme 136 entre os isolados, havendo influência significativa (p<0,05) das temperaturas 137 testadas. A produção de biofilme decresceu à medida que as temperaturas 138 diminuíram. A 37ºC, 65,8% (n=50) dos isolados produziram biofilme (A595 - 0,564 a 139 0,138); a 20ºC, 55,3% (n=42) produziram biofilme (A595 - 0,490 a 0,105); e, a 10ºC, 140 43,4% (n=33) dos isolados formaram biofilme (A595 - 0,536 a 0,067). Entretanto, 141 verificou-se que as DO médias de produção de biofilme foram significativamente 142 superiores (p<0,05) na temperatura de 37ºC quando comparadas com as médias 143 obtidas nas outras duas temperaturas testadas (20ºC e 10ºC), as quais, não 144 diferiram entre si. As cepas padrão testadas também formaram biofilme nas 3 145 temperaturas. 146
Considerando-se as fontes de isolamento de L. monocytogenes (alimentos, 147 manipulador e ambiente), não foram observadas diferenças significativas na 148 produção de biofilme (p>0,05) entre os isolados. Contudo, observou-se uma 149 correlação r=0,99 entre o aumento da temperatura e a produção de biofilme nos 150 isolados provenientes de alimentos e uma correlação r= -0,63 entre o aumento da 151 temperatura e os isolados provenientes de ambiente/manipulador da indústria de 152 alimentos. Ou seja, houve um aumento na produção de biofilme nos isolados de 153 alimentos e uma diminuição nos isolados de manipulador/ambiente com a elevação 154 da temperatura. 155
Observaram-se diferenças significativas (p<0,05) na capacidade de produção 156 de biofilme entre os isolados, havendo influência da temperatura testada. Os 157 isolados que apresentaram maior produção de biofilme foram: LA039 a 37ºC (maior 158 valor de DO) (sorotipo 1/2a), diferenciando-se significativamente de 89,45% do total 159 de isolados; LS011 a 10ºC (sorotipo 1/2c), diferenciando-se significativamente de 160 83,12%; LA008 a 20ºC (sorotipo 1/2c), diferenciando-se de 73,84%; LA035 a 37ºC 161 (sorotipo 4e), diferenciando-se de 43,46%; LA019 a 37ºC (sorotipo 1/2c), 162 diferenciando-se de 38,40%; LA041 a 37ºC e a 10ºC (sorotipo 1/2c), diferenciando-163 se de 32,07% e 18,14%, respectivamente; LS008 a 10ºC (sorotipo 1/2c), 164 diferenciando-se de 28,27%; LA036 a 37ºC (sorotipo 4e), diferenciando-se de 165 19,41%; LS010 a 10ºC (sorotipo 1/2c), diferenciando-se de 17,72% e LA043 a 37ºC 166 (sorotipo 1/2ª), diferenciando-se de 10,13%; 167
Com base nos valores de DO, pode-se observar que não houve relação entre 168 os sorotipos de L. monocytogenes isolados de alimentos e produção de biofilme. 169 Entretanto, a 10ºC, os isolados com maior capacidade de produção de biofilme, 170 pertenciam ao sorotipo 1/2c (1 proveniente de alimentos, 1 proveniente de 171 manipulador e 2 de ambiente). Considerando-se a fonte de isolamento, os isolados 172 provenientes de carcaças de frango foram os que apresentaram maior produção de 173 biofilme a 37ºC. 174
56
175
Fig. 1. Média de produção de biofilme por DOA595 dos isolados e das cepas padrão de L. monocytogenes sob diferentes 176 temperaturas 177
10ºC
20ºC
37ºC
LA
001
LA
002
LA
003
LA
004
LA
005
LA
006
LA
007
LA
008
LA
009
LA
010
LA
011
LA
012
LA
013
LA
014
LA
015
LA
016
LA
017
LA
018
LA
019
LA
020
LA
021
LA
022
LA
023
LA
024
LA
025
LA
026
LA
027
LA
028
LA
029
LA
030
LA
031
LA
032
LA
033
LA
034
LA
035
LA
036
LA
037
LA
038
LA
039
LA
040
LA
041
LA
042
LA
043
LA
044
LA
045
LA
046
LA
047
LA
048
LA
049
LA
050
LA
051
LA
052
LA
053
LS
001
LS
002
LS
003
LS
004
LS
005
LS
006
LS
007
LS
008
LS
009
LS
010
LS
011
LS
012
LS
013
LS
014
LS
015
LS
016
LS
017
LS
018
LS
019
LS
020
LS
021
LS
022
LS
023
AT
CC
7644
Scott
A
AT
CC
19117
Listeria monocytogenes
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
DO
57
5.5 Discussão 178
179
Este estudo avaliou a produção de biofilme por 76 isolados de L. 180 monocytogenes, de diferentes sorotipos e distintas fontes de isolamento. A 181 capacidade de produção de biofilme foi testada em temperaturas que podem ser 182 encontradas na natureza, em hospedeiros humanos e em diferentes etapas no 183 ambiente de processamento de alimentos. 184
A maioria dos isolados de L. monocytogenes foi capaz de produzir biofilme, 185 porém, observou-se grande variação nos níveis de produção de biofilme entre eles, 186 o que também foi descrito por outros autores (Borucki et al., 2003; Combrouse et al., 187 2013; Kadam et al., 2013; Nilsson et al., 2011). Além disso, a temperatura foi um 188 fator determinante que influenciou a produção de biofilme, pois esta aumentou 189 significativamente com a elevação da temperatura, o que corrobora os resultados de 190 outros estudos (Combrouse et al., 2013; Galvão et al.,2012; Lee et al., 2013; Nilsson 191 et al., 2011). 192
Um constituinte celular que tem sido descrito como um importante fator na 193 aderência inicial de L. monocytogenes em superfícies e na produção de biofilme é o 194 flagelo (Lemon et al., 2007) o qual, segundo os mesmos autores aumentam a 195 probabilidade dos micro-organismos encontrarem uma superfície para fixação, 196 atuam como adesinas durante o primeiro contato com a superfície abiótica e 197 fornecem estímulo necessário para superar forças repulsivas que possam existir 198 entre as bactérias e a superfície. De acordo com Way et al. (2004) e Williams et al. 199 (2005) o flagelo de L. monocytogenes apresenta sua atividade regulada acima de 200 25ºC e reprimida a 37°C, na maioria dos isolados de L. monocytogenes. Entretanto, 201 alguns autores sugerem que esta adesão pode ocorrer passivamente, independente 202 do flagelo (Tresse et al., 2009; Gamble e Muriana, 2007) ou, ainda, que alguns 203 isolados de L. monocytogenes apresentam motilidade em temperaturas maiores ou 204 iguais a 37ºC (Bigot et al., 2005; Djordjevic et al., 2002; Gamble e Muriana, 2007). 205 Assim como já foi descrito por Nilsson et al. (2011), a maior produção de biofilme 206 pelos isolados de L. monocytogenes em temperaturas mais elevadas, verificada 207 nesse estudo, pode ter sido devido a alterações nas propriedades da superfície 208 celular que são induzidas pela adaptação da bactéria. 209
Destaca-se que não houve diferença na produção de biofilme, a 37ºC, entre 210 os sorotipos dos isolados de L. monocytogenes provenientes de alimentos. Este 211 resultado é semelhante ao encontrado por Combrouse et al. (2013) que também não 212 encontraram diferenças na capacidade de produção de biofilme entre sorotipos, 213 quando avaliaram temperaturas próximas de 37ºC. Entretanto, outros autores 214 verificaram que a produção de biofilme é distinta entre os diferentes sorotipos 215 (Borucki et al., 2003; Djordjevic et al., 2002; Kadam et al., 2013; Lee et al., 2013 216 Nilsson et al., 2011). 217
Ressalta-se que quando se relacionou o sorotipo e a produção de biofilme em 218 baixas temperaturas, verificou-se que a 10ºC os isolados que mais formavam 219 biofilme pertenciam ao sorotipo 1/2c, o que também foi encontrado por Kadam et al. 220 (2013). Esse resultado é relevante, tendo em vista que esta temperatura é 221 comumente utilizada em determinados ambientes da indústria de alimentos, como 222 os de produtos de origem animal, e que sorotipo 1/2c é um dos mais frequentemente 223 encontrados em alimentos (Ragon et al., 2008). Desta forma, a maior frequência de 224 isolamento do sorotipo 1/2c em alimentos poderia ser causada pela sua capacidade 225
58
de produção de biofilme associada a ambientes de processamento com baixas 226 temperaturas. 227
Gamble e Muriana (2007) verificaram, de uma maneira geral, uma produção 228 de biofilme significativamente menor nos isolados de L. monocytogenes 229 provenientes de ambiente, quando comparados aos provenientes de alimentos. 230 Entretanto, neste estudo, observou-se que, apesar de haver uma baixa produção de 231 biofilme pelos isolados provenientes de ambiente, estes não apresentaram 232 diferenças significativas em relação aos isolados de alimentos. 233
A produção de biofilme por isolados provenientes de superfícies pode ser 234 aumentada com a utilização de meios ricos em nutrientes (Rodrigues et al., 2010). 235 Contudo, isto torna a produção de biofilme muito diferenciada das condições reais 236 encontradas no ambiente de processamento, pois estes são tipicamente formados 237 sob condições dinâmicas, de fluxo de nutrientes normalmente inferiores, e consistem 238 de uma variedade de espécies bacterianas. (Cruz e Fletcher, 2012). 239
Cabe ressaltar, que um dos isolados, originário de mix de superfícies das 240 mãos de manipulador (LS011), o qual foi o maior produtor de biofilme a 10ºC, foi 241 descrito como persistente em superfícies do ambiente de processamento em 242 indústrias da região sul do Rio Grande do Sul por Mendonça et al. (2012). 243
A capacidade de adesão dos isolados de L. monocytogenes a superfícies 244 pode ser significativamente aumentada após indução de estresse pelo frio, 245 especialmente após um longo período de exposição a baixas temperaturas. A 246 necessidade de adaptação a baixas temperaturas durante a fase de crescimento 247 pode influenciar a composição da parede celular e, assim, modificar as propriedades 248 da superfície, aumentando a hidrofobicidade das células e facilitando a colonização 249 em superfícies e sua persistência no ambiente (Slama et al., 2012). Portanto, além 250 da temperatura, o tempo de incubação dos isolados a baixas temperaturas pode 251 influenciar significativamente a sua capacidade de produção de biofilme (Nilsson et 252 al., 2011). Isso pode justificar o fato do isolado LS011, persistente na planta de 253 processamento, apresentar forte capacidade de produção de biofilme a 10ºC, bem 254 como a correlação negativa verificada entre as temperaturas utilizadas e os isolados 255 provenientes de manipulador/ambiente (quanto menor a temperatura maior a 256 produção de biofilme), mesmo com pouco tempo de incubação. Provavelmente, 257 estes isolados foram provenientes de ambientes com baixas temperaturas, 258 comumente encontradas na indústria alimentícia, e poderiam, assim, estar mais 259 adaptados a baixas temperaturas e promover uma melhor adesão superficial. 260
Entretanto, alguns isolados de L. monocytogenes avaliados neste estudo, e 261 que também foram relatados como persistentes por Mendonça et al. (2012), não 262 apresentaram maior capacidade de produção de biofilme, mesmo isolados de 263 ambiente, quando foram avaliados a baixas temperaturas. Estes resultados estão de 264 acordo com Djordjevick et al. (2002) e Galvão et al. (2012) que avaliaram a relação 265 entre persistência de isolados de L. monocytogenes e sua produção de biofilme 266 (respectivamente 32ºC, 25 e 37ºC), e não encontraram relação significativa. 267
Considerando que a capacidade de produção de biofilme de L. 268 monocytogenes decresceu com a temperatura, indiferente a fonte de isolamento, e 269 ao sorotipo para os isolados de alimentos, e ainda, que entre aqueles provenientes 270 de manipulador/ambiente, os isolados pertencentes ao sorotipo 1/2c produziram 271 mais biofilme a 10ºC, observa-se uma variabilidade na produção de biofilme para 272 este micro-organismo em função da temperatura. E dessa forma, denota-se a 273
59
importância do controle desta variável em associação a boas práticas de 274 manipulação nos alimentos e no ambiente de processamento a fim de evitar a 275 persistência deste micro-organismo. 276
277
5.6 Agradecimentos 278
279
Este estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado 280 do Rio Grande do Sul - FAPERGS (Processo 11/1271-9) e pelo Conselho Nacional 281 de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Processo 482524/2010-3). 282 Também ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas da Fundação Oswaldo Cruz – 283 FIOCRUZ pela sorotipagem dos isolados L. monocytogenes. 284
285
5.7 Referências 286
287
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6 Manuscrito 2: Quantificação dos níveis de expressão do locus agr e do gene prfA na produção de biofilme por isolados de Listeria monocytogenes em diferentes superfícies e condições de temperatura e tempo
Manuscrito elaborado para o periódico: “Applied and Environmental
Microbiology (AEM)”.
Fator de Impacto: 3,952.
62
Quantificação dos níveis de expressão do locus agr e do gene prfA na produção 1
de biofilme por isolados de Listeria monocytogenes em diferentes superfícies e 2
condições de temperatura e tempo 3
4
Título corrido: agr e prfA na formação de biofilme em L. monocytogenes 5
6
Tatiane Kuka Valente Gandraa, Darla Silveira Volcana, Naciele Marinib, Antônio Costa 7
de Oliveirac, Caroline Peixoto Bastosd, Wladimir Padilha da Silvaa* 8
9
a Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, 10
Universidade Federal de Pelotas, Campus Capão do Leão, caixa postal 354, Pelotas, Rio Grande do Sul, 11
Brasil. 12
b Centro de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, 13
Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. 14
c Centro de Genômica e Fitomelhoramento, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal 15
de Pelotas, Campus Capão do Leão, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. 16
d Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Campus 17
Capão do Leão, Pelotas, Rio Grande do Sul, Brasil. 18
19
* Autor para correspondência: [email protected] (Silva, W. P.) 20
63
6.1 RESUMO 21
22
O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de expressão dos genes do locus agr e do 23
gene prfA, durante a formação de biofilme por isolados de L. monocytogenes, em 24
distintas superfícies e sob diferentes temperaturas e tempos. O gene agrA foi expresso 25
em maiores níveis que os demais genes do locus agr, assim como o gene prfA. Os 26
isolados produtores de biofilme apresentaram maiores níveis de expressão do locus 27
agr, sendo que a maior diferença entre isolados produtores e não produtores de biofilme 28
ocorreu nos genes agrBCD, havendo maior expressão destes genes por isolados 29
produtores de biofilme. Por outro lado, não houve diferença na expressão do prfA entre 30
os isolados, independente da capacidade de produção de biofilme. Os maiores níveis 31
de expressão global do locus agr e do prfA foram observados a 37ºC e os menores 32
níveis a 10ºC. Não foi verificada diferença na expressão do locus agr e do prfA entre os 33
tempos 12 e 24h, entretanto, os maiores níveis de expressão ocorreram em 24h. Não 34
houve diferença na expressão dos genes testados entre as superfícies avaliadas, 35
independente da capacidade de produção de biofilme dos isolados. Dessa forma, pode-36
se verificar que o locus agr possui um papel importante na adesão inicial e formação de 37
biofilme em L. monocytogenes, principalmente os genes agrBCD, sendo independente 38
da expressão do gene prfA. Além disso, verificou-se que o locus agr e o gene prfA são 39
fortemente influenciados pela temperatura e pelo tempo de contato com a superfície, 40
mas não pelas superfícies de contato. 41
64
6.2 INTRODUÇÃO 42
43
L. monocytogenes é um micro-organismo ubíquo, Gram-positivo, não esporulado e 44
intracelular facultativo, causador da listeriose, cuja grande importância em saúde 45
pública é sua severidade, com alta taxa (20-30%) de casos fatais em grupos de risco (1, 46
2, 3). 47
Este patógeno é uma ameaça particular à indústria de alimentos. Possui habilidade 48
para sobreviver por longos períodos sob condições ambientais adversas e tolerar altas 49
concentrações de sal e valores de pH relativamente baixos. Além disso, pode se 50
multiplicar em temperaturas de refrigeração e persistir em equipamentos e superfícies 51
de plantas de processamento, através da formação de biofilme (4, 5, 6, 7). Entretanto, 52
L. monocytogenes varia em sua habilidade de formar biofilme, o que pode ocorrer 53
devido à supressão ou super ativação de genes cujos produtos conferem vantagens 54
adaptativas na aderência em superfícies abióticas (8). 55
Este micro-organismo possui um extenso repertório de proteínas de transporte e de 56
genes regulatórios relacionados à sua capacidade de colonizar uma ampla variedade 57
de ecossistemas (9, 10). Entre os genes presentes nesta bactéria, estão o prfA, que é 58
um ativador transcricional chave, regulando a maior parte da expressão de genes de 59
virulência conhecidos, e o locus agr (gene regulador acessório), altamente conservado, 60
que possui ortólogos em várias bactérias Gram-positivas (10, 11, 12, 13). O locus agr é 61
composto por quatro genes co-transcritos em um operon (agrBDCA) que codificam 62
quatro proteínas. O agrB é responsável pela expressão de uma proteína de membrana, 63
cuja função seria exportar o peptídeo de agrD, que é transformado num peptídeo auto-64
indutor maduro (AIP). agrC (histidina quinase) e agrA (auto-regulador) formam um sinal 65
65
de transdução de um sistema de dois componentes. Quando a concentração 66
extracelular do AIP atinge certo limiar, em quorum sensing, o sistema é ativado, através 67
da detecção de agrC-agrA e exerce efeitos reguladores sobre substratos alvo, bem 68
como induz a sua própria produção (auto-regulação positiva) (12, 14, 15). O sistema 69
ativado regula os genes que codificam as adesinas necessárias para a formação de 70
biofilme (13, 16, 17). 71
Neste sentido, pesquisas têm demonstrado que a mutação de genes do locus agr 72
diminui a capacidade que L. monocytogenes tem em se aderir em superfícies abióticas 73
e formar biofilme (14), bem como pode afetar a sua capacidade de causar infecção (15, 74
18, 19) 75
O objetivo do trabalho foi avaliar o perfil de expressão dos genes do locus agr (agrB, 76
agrD, agrC e agrA) e do gene prfA, durante a adesão inicial e formação de biofilme, por 77
isolados de L. monocytogenes em diferentes superfícies e condições de temperatura e 78
tempo. 79
66
6.3 MATERIAIS E MÉTODOS 80
81
Isolados de L. monocytogenes 82
Foram utilizados quatro isolados de L. monocytogenes, selecionados por sua 83
capacidade de produzir biofilme (produtor e não produtor de biofilme) e por sua origem 84
(alimento ou ambiente de processamento), os quais estão descritos na Tabela 1. Além 85
destes critérios, também foi considerado para seleção, o sorotipo dos isolados, a fim de 86
comparar diferentes sorotipos (1/2a, 1/2b e 1/2c) com diferentes capacidades de 87
produção de biofilme e um mesmo sorotipo (1/2a) classificado com diferente 88
capacidade de produção de biofilme. A seleção quanto a capacidade de produção de 89
biofilme, foi realizada a partir de 75 isolados de L. monocytogenes, pertencentes à 90
bacterioteca do Laboratório de Microbiologia de Alimentos, do Departamento de Ciência 91
e Tecnologia Agroindustrial, da Universidade Federal de Pelotas (UFPel), utilizando-se 92
os critérios descritos por Stepanovic et al. (20) e Djordjevic et al. (21). 93
94
Tabela 1 - Isolados de L. monocytogenes selecionados para avaliação da expressão do 95 locus agr e do gene prfA sob condições de formação de biofilme 96
Código Origem Sorotipo Classificação quanto a
produção de biofilme*
LS006 Caixa de produtos cárneos / ambiente 1/2c Não produtor
LS020 Dreno da sala de resfriamento de abatedouro de
frangos / ambiente
1/2b Produtor
LA003 Carcaça ovina / alimento 1/2a Não produtor
LA039 Frango resfriado obtido no varejo / alimento 1/2a Produtor
* Classificação segundo Stepanovic et al. 2007 (20) e Djordjevic et al. 2002 (21) 97
67
Recuperação e preparo dos isolados 98
Os isolados armazenados em ultrafreezer a -70ºC foram recuperados em caldo Triptona 99
de Soja (TSB, Oxoid CM0129) com 0,6% de Extrato de Levedura (YE, Oxoid LP0021), e 100
incubados a 37ºC por 24h. A pureza dos isolados foi verificada em ágar base Listeria 101
Cromogênico (Oxoid CM1084), com incubação a 37ºC por 48h. 102
Uma colônia pura de cada isolado foi semeada em ágar Triptona de Soja (TSA, Oxoid 103
CM0131) contendo 0,6% de YE, incubando-se a 37ºC por 24h. A partir deste cultivo, 104
uma alíquota de cada isolado foi transferida para tubos de ensaio contendo solução 105
salina 0,85% (Vetec), padronizando-se o inóculo para a escala 0,5 de MacFarland 106
(Laborclin), o que corresponde aproximadamente a 1,5 x 108UFC/mL. 107
108
Cultivo dos isolados sob condições de formação de biofilme (CFB) em diferentes 109
condições para avaliação da expressão gênica 110
Foram utilizados 2 tipos de superfícies: aço inox (AISI 304) - AI (cupons de 8cm de 111
diâmetro) e poliestireno - PS (placas de Petri), seguindo o protocolo proposto por Rieu 112
et al. (14), com adaptações. 113
Foram adicionados 9mL de TSB-YE 1% de glicose e 1mL do inóculo padronizado na 114
proporção1/10 em placas de Petri (com e sem cupons de AI), as quais foram incubadas 115
a 10ºC, 20ºC e 37ºC por 8h, 12h, 24h e 48h. Após o término de cada um destes 116
tempos, o meio de cultivo foi retirado, e os cupons ou a placa de Petri, foram lavados 117
duas vezes com 10mL de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,3 ± 0,2) (Laborclin) para a 118
remoção das células não aderidas e, após, secos 18h a 37ºC. Em seguida, as células 119
aderidas foram removidas através de esfregaço em superfície com o auxílio de dois 120
suabes esterilizados, os quais foram inseridos em tubos de ensaio contendo solução 121
68
salina 0,85%, e homogeneizados em vórtex por 1min. Uma alíquota de 1mL foi 122
transferida para um microtubo (Eppendorf) e centrifugada a 12000rpm por 5min a 4ºC, 123
para obter a concentração celular desejada. 124
125
Cultivo dos isolados sob condições planctônicas (CP) em diferentes condições 126
para avaliação da expressão gênica 127
Cada isolado de L. monocytogenes foi submetido nas mesmas CFB (10ºC, 20ºC e 37ºC 128
por 8h, 12h, 24h e 48h), entretanto, o cultivo foi realizado em microtubo (Eppendorf) 129
contendo 900µL de TSB-YE e 100µL do inóculo padronizado na proporção 1/10. Após 130
os diferentes períodos de incubação, as células planctônicas retiradas foram 131
centrifugadas a 12000rpm por 5min a 4ºC para obter a concentração celular desejada. 132
133
Primers 134
Os oligonucleotídeos utilizados podem ser visualizados na Tabela 2. 135
69
Tabela 2– Sequências dos oligonucleotídeos utilizados para a quantificação da 136
expressão do locus agr e do gene prfA em L. monocytogenes 137
Gene Sequência (5’→3’) Tm teórica
(ºC)
R2
Eficiência Referência
agrA
(F) GCAAGCAGAAGAACGGATTTCCAA
(R) CGCTGTCTCAAAAAACAAGATAT
62,9
57,4 0,9885 2,17 Rieu et al. (14)
agrB
(F) CGGCAGACACAGAAAGTTTG
(R) TGCGAATGGTATTAGCAACG
60,4
58,4 0,9879 2,07 Rieu et al. (14)
agrC
(F) GGGGTCAATCGCAGGTTTTG
(R) CTTTAAGTTCGTTGGTTGCCGTA
62,4
61 0,9554 2,24 Rieu et al. (14)
agrD
(F) AAATCAGTTGGTAAATTCCTTTCTAG
(R) AATGGACTTTTTGGTTCGTATACA
58,3
57,7 0,9859 1,98 Rieu et al. (14)
prfA
(F) GGAGCATGTGGTTTAATTCG
(R) CCAACTAAATGCTGGCAACT
58,0
58,2 0,8265 1,85 França et al. (22)
16S
(F) GGTAGCCTGTTCGCTAATGA
(R) TAACCAATGGGATCCACAAG
58,1
57,9 0,873 1,84 França et al. (22)
138
Extração do RNA e síntese de cDNA 139
O mRNA foi extraído e purificado a partir de células de L. monocytogenes sob CFB e 140
sob CP, utilizando-se o RiboPure™-Bacteria Kit (Ambion), de acordo com o protocolo 141
fornecido pelo fabricante. O RNA extraído de cada amostra foi quantificado e sua 142
pureza foi verificada através do cálculo da razão A260/A280, em espectrofotômetro 143
NanoVue Version 4282 V2.0.4. Os RNAs extraídos foram utilizados para a síntese de 144
cDNA quando apresentaram pureza entre 1,8 - 2,0. A síntese de cDNA foi realizada 145
com o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), de acordo 146
com as instruções do fabricante. 147
70
Validação e perfil de expressão do locus agr e do gene prfA por Real-time PCR 148
(RT-qPCR) 149
A validação de cada par de primers utilizado foi avaliada por meio de curvas de 150
dissociação e a média de eficiência foi de 103 ± 15%. Tanto a validação, como a 151
avaliação da expressão, foram realizadas em termociclador 7500 Fast Real-Time PCR 152
System (Applied Biosystems), como descrito no protocolo da Applied Biosystems. 153
As amostras foram colocadas, em triplicata, em placas com capacidade para 96 154
reações, e cobertas com adesivo ótico. O nível de expressão gênica, obtido através da 155
quantificação relativa (QR), foi calculado baseado no threshold cycle (Ct) descrito por 156
Pfaffl (23), com o auxílio do 7500 software 2.0.4 (24) O gene 16S rRNA foi utilizado 157
como normalizador endógeno e, como controle de expressão, foi utilizada a expressão 158
dos isolados em CP, nos mesmos tempos e temperaturas de contato da CFB. 159
160
Análise estatística 161
A quantificação relativa (QR) foi calculada e os resultados normalizados foram 162
submetidos a ANOVA, seguido do teste de média de Tukey, com o auxílio do software 163
STATISTICA 7.0 (25), para verificar diferenças significativas (p<0,05) entre as 164
expressões gênicas dos isolados, formadores e não formadores de biofilme, 165
considerando tempos, temperaturas e superfícies sob CFB. 166
71
6.4 RESULTADOS 167
168
De forma geral, os genes agrA e prfA foram expressos em maiores níveis (p<0,05) que 169
os demais genes avaliados, não havendo diferença significativa (p>0,05) entre a 170
expressão destes dois genes. 171
A expressão dos genes do locus agr e do gene prfA em isolados produtores e não 172
produtores de biofilme está demonstrada na Fig. 1. Os isolados LS006 e LA003, não 173
produtores de biofilme, apresentaram menor expressão dos genes do locus agr 174
(p<0,05) em comparação aos isolados LS020 e LA039, produtores de biofilme. 175
Entretanto, o gene agrA do isolado LA003, apresentou níveis de expressão 176
semelhantes aos dos isolados produtores de biofilme (p>0,05). Além disso, não houve 177
diferença na expressão (p>0,05) dos genes agrBCD entre os isolados não formadores 178
de biofilme, os quais apresentaram níveis de expressão menores quando comparados 179
aos isolados produtores de biofilme. Da mesma forma, com relação aos isolados LS020 180
e LA039, produtores de biofilme, não houve diferença (p>0,05) entre si na expressão 181
dos genes agrBCD. 182
Não houve diferença significativa (p>0,05) na expressão do gene prfA entre os isolados, 183
independente da sua capacidade de formação de biofilme. 184
72
185
Fig. 1. Variação na expressão global dos genes do locus agr e do gene prfA em 186
isolados de L. monocytogenes durante a formação de biofilme. 187
188
Em relação à influência da temperatura sobre a expressão dos genes avaliados (Fig. 2), 189
pode-se observar que a 10ºC o locus agr foi menos expresso (p<0,05) do que a 37ºC 190
havendo, também, diferença significativa na expressão individual dos genes desse 191
locus, em função da temperatura (p<0,05). O agrA apresentou maior expressão 192
(p<0,05) que os demais genes do locus agr em todas as temperaturas testadas: 193
somente a 37ºC, agrA apresentou expressão semelhante ao agrB (p<0,05). Com 194
relação ao gene prfA, também se observou diferenças (p<0,05) de expressão em 195
função das temperaturas avaliadas, a 37ºC sua expressão foi superior (p<0,05) a 10ºC. 196
LS006
não produtor biofilme
LS020
produtor biofilme
LA003
não produtor biofilme
LA039
produtor biofilmeagrA agrB agrC agrD prfA
Gene
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
LOG
QR
(Q
ua
nti
fica
ção
Rel
ati
va)
73
197
Fig. 2. Variação na expressão dos genes do locus agr e do gene prfA nos isolados de 198
L. monocytogenes em diferentes temperaturas durante a formação de biofilme. 199
200
Além da influência da temperatura sobre a expressão global dos genes do locus agr e 201
do gene prfA, foi possível identificar diferença na expressão desses genes entre os 202
isolados de L. monocytogenes (Fig. 2). Os isolados LS006 e LA003, não formadores de 203
biofilme, apresentaram as menores médias de expressão global dos genes avaliados, 204
especialmente em baixas temperaturas. Já os isolados LS020 e LA039, produtores de 205
biofilme, apresentaram os maiores níveis de expressão, especialmente a 37ºC. 206
Entretanto, a 37ºC, não houve diferença significativa na expressão global e entre genes 207
avaliados (p>0,05) entre os isolados formadores e não formadores de biofilme. A 20ºC, 208
o isolado LA039 apresentou expressão maior que os isolados não formadores de 209
biofilme, o que não foi observado para o isolado LS020. 210
Com relação ao gene prfA, não houve influência da temperatura sobre sua expressão, 211
independente do isolado ser ou não produtor de biofilme (p>0,05). 212
agrA
agrB
agrC
agrD
prfA
LS006
10ºC 20ºC 37ºC-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5LO
G Q
R (
Qua
ntif
icaç
ão R
elat
iva)
LS020
10ºC 20ºC 37ºC
LA003
10ºC 20ºC 37ºC
LA039
10ºC 20ºC 37ºC
74
O tempo de contato também influenciou a expressão dos genes do locus agr e do gene 213
prfA (Fig. 3), os quais não diferiram em expressão (p>0,05) quando comparados entre si 214
nos mesmos tempos de contato. Todos os genes apresentaram maiores níveis de 215
expressão em 12 e 24h, enquanto os menores níveis foram em 48h de contato. Além 216
disso, individualmente, não houve diferença de expressão nos tempos de 12 e 24h 217
(p<0,05). 218
219
220
Fig. 3. Variação na expressão dos genes do locus agr e do gene prfA nos isolados de 221
L. monocytogenes em diferentes tempos de contato durante a formação de biofilme. 222
223
A influência do tempo de contato sobre a expressão gênica global dos genes do locus 224
agr e do gene prfA nos isolados de L. monocytogenes formadores e não formadores de 225
biofilme, também pode ser visualizada na Fig. 3. A menor expressão ocorreu no isolado 226
LS006, não formador de biofilme, em 48h de contato (p<0,05). O isolado LA003, que 227
também não produz biofilme, apresentou uma baixa expressão gênica global dos genes 228
agrA
agrB
agrC
agrD
prfA
LS006
8h 12h 24h 48h-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
LOG
QR
(Q
uant
ific
ação
Rel
ativ
a)
LS020
8h 12h 24h 48h
LA003
8h 12h 24h 48h
LA039
8h 12h 24h 48h
75
avaliados em 48h de contato, entretanto, não diferiu significativamente (p>0,05) da 229
expressão do isolado LS020, produtor de biofilme, nesse mesmo tempo de contato. 230
Os maiores níveis de expressão global dos genes avaliados (p<0,05) foram verificados 231
nos isolados formadores de biofilme (LS020 e LA039 - p>0,05) no tempo de 24h de 232
contato. Nos tempos de contato 8h e 12h não foram observadas diferenças na 233
expressão gênica global entre os isolados formadores e não formadores de biofilme 234
(p>0,05). Da mesma forma que a temperatura, o tempo de contato influenciou a 235
expressão do gene prfA, porém, não foram observadas diferenças significativas 236
(p>0,05) entre isolados. 237
Não houve relação entre as superfícies testadas (AI e PS) e os níveis de expressão 238
gênica (p>0,05), independente dos isolados serem ou não produtores de biofilme. 239
76
6.5 DISCUSSÃO 240
241
Neste estudo, avaliou-se a expressão dos genes do locus agr e do gene prfA durante a 242
adesão inicial de isolados de L. monocytogenes em duas superfícies, com temperaturas 243
e tempos de contato distintos, utilizando-se como controle, a expressão dos isolados 244
em condições planctônicas (CP), nos mesmos tempos e temperaturas de contato da 245
condição de formação de biofilme (CFB). Foram utilizados quatro isolados de L. 246
monocytogenes (dois provenientes de superfícies de processamento e dois de 247
alimentos), sendo dois não formadores de biofilme e dois formadores de biofilme. Os 248
isolados não formadores de biofilme pertenciam aos sorotipos 1/2a e 1/2c, enquanto os 249
formadores de biofilme pertenciam aos sorotipos 1/2a e 1/2b. 250
Verificou-se que houve diferença na expressão dos genes do locus agr, em especial 251
dos genes agrBCD, entre isolados produtores e não produtores de biofilme, havendo 252
maior expressão destes genes nos isolados que produzem biofilme. Desta forma, 253
sugere-se que há uma participação efetiva do locus agr, especialmente dos genes 254
agrBCD, na fase inicial de formação de biofilme por isolados de L. monocytogenes em 255
superfícies abióticas. Estes resultados corroboram outros estudos, que utilizaram cepas 256
de L. monocytogenes mutantes (agrA- e agrD-) e verificaram redução na sua 257
capacidade de formação de biofilme, em comparação com suas cepas parentais (10, 258
14, 15, 19). 259
O gene agrA apresentou o maior nível de expressão entre todos os genes avaliados, 260
principalmente a 37ºC. Já para os demais genes do locus (agrBCD) observou-se que 261
não houve diferença entre eles (p>0,05) considerando a mesma classificação do 262
77
isolado quanto a produção de biofilme: não houve diferença (p>0,05) entre estes genes 263
nos isolados LS020 e LA039 (produtores de biofilme), nem nos isolados LS006 e LA003 264
(p>0,05) (não produtores de biofilme). Porém, houve diferença (p<0,05) entre isolados 265
produtores e não produtores de biofilme. Rieu et al.(14), por outro lado, verificaram 266
expressão semelhante entre os genes do locus agr em isolados de L. monocytogenes 267
planctônicos e em formação de biofilme, com maior nível de expressão do agrD e 268
menor nível de expressão do agrA. A maior expressão observada para o gene agrA, 269
neste trabalho, pode ser justificada pelo estudo de Garmyn et al. (10), que sugeriram 270
que o peptídeo produzido pelo agrA, além de participar efetivamente na aderência de L. 271
monocytogenes em superfícies, também pode estar envolvido em outras funções, como 272
na regulação do transporte de nitrogênio, aminoácidos, purinas e pirimidinas e, desta 273
forma, poderia ter sua expressão mais elevada. 274
Não houve relação entre os níveis de expressão do locus agr e a origem dos isolados 275
(ambiente ou alimentos), nem com o sorotipo, embora outros estudos tenham 276
demonstrado interação entre a capacidade de formação de biofilme e diferentes 277
sorotipos de L. monocytogenes (21, 26, 27, 28, 29). Desta forma, os resultados obtidos 278
enfatizam a importância do locus agr na produção de biofilme, tendo em vista que os 279
níveis de expressão deste sistema foram relacionados diretamente com a capacidade 280
do isolado em formar biofilme e não com um sorotipo específico de L. monocytogenes, 281
como relatado pelos estudos citados anteriormente. Estes resultados corroboram 282
parcialmente o estudo de Chang et al. (19), os quais observaram regiões com genes 283
interrompidos, que incluíam genes reguladores, entre eles agrA e agrB, num grupo de 284
isolados de L. monocytogenes que apresentavam capacidade moderada de formação 285
78
de biofilme. Entretanto, os mesmos autores observaram, em outro grupo de isolados de 286
L. monocytogenes com baixa capacidade de formação de biofilme, a ausência ou 287
interrupção de outros genes, que não do sistema agr. Chang et al. (19) atribuem estes 288
resultados a possíveis diferenças entre linhagens ou sorotipos, diferentemente do que 289
foi observado neste estudo. 290
Outra resposta interessante observada neste estudo, foi o comportamento do gene 291
prfA, que apresentou expressão semelhante nos isolados produtores e não produtores 292
de biofilme, tendo níveis de expressão similares ao agrA. O prfA é um ativador 293
transcricional chave que regula a expressão da maior parte dos genes de virulência de 294
L. monocytogenes conhecidos (11). Alguns autores sugerem que possa haver uma 295
atividade sinérgica entre o sistema agr e o regulador prfA, através da supressão do 296
gene agrA ou do agrD, que poderia afetar alguns genes relacionados à virulência de L. 297
monocytogenes, entre os quais o regulador prfA (12, 15), tanto a 25ºC quanto a 37ºC 298
(10). Outros estudos relatam que esta combinação possa ocorrer através da 299
participação indireta do regulador prfA na formação de biofilme (17, 30, 32). Porém, 300
esta interação não foi observada neste estudo, tendo em vista que os níveis de 301
expressão do gene prfA e do locus agr, entre os isolados produtores e não produtores 302
de biofilme, foram expressos de forma diferente nas condições de estudo avaliadas. 303
Luo et al. (11) descrevem que a supressão do gene prfA poderia alterar a expressão de 304
genes reguladores envolvidos na formação de biofilme e, consequentemente, reduziria 305
a capacidade de L. monocytogenes formar biofilme. Entretanto, observou-se que a 306
expressão do prfA foi similar entre os isolados produtores e não produtores de biofilme, 307
sugerindo que, se houver interação entre o gene prfA e o locus agr durante a produção 308
79
de biofilme, esta esteja relacionada a expressão do agrA e não a todo sistema agr. 309
Assim, mais estudos, otimizando condições de tempo e temperatura são necessários 310
para elucidar melhor este sinergismo na formação de biofilme. 311
As variáveis temperatura e tempo apresentaram interferência sobre a expressão dos 312
genes do locus agr e do gene prfA, tanto para os isolados de L. monocytogenes 313
produtores quanto para os não produtores de biofilme. A temperatura é um importante 314
estímulo ambiental na regulação da expressão gênica de L. monocytogenes (10). Neste 315
sentido, verificou-se que os níveis de expressão do locus agr foram mais elevados a 316
37ºC, como relatado em outros estudos (7, 10, 31). O gene agrA apresentou maior 317
expressão a 37ºC, nos isolados produtores de biofilme, enquanto o agrD apresentou os 318
menores níveis de expressão a 10ºC, nos isolados não produtores de biofilme, 319
sugerindo que a temperatura é crítica na regulação de alguns genes do locus agr. 320
Muitos estudos demonstram a importância da motilidade flagelar para a formação de 321
biofilme por L. monocytogenes (31, 32, 33) e que sua expressão é regulada acima de 322
25ºC e reprimida a 37°C, na maioria das cepas deste micro-organismo (32, 33). 323
Entretanto, alguns autores verificaram que isolados de L. monocytogenes podem 324
expressar genes responsáveis pela motilidade e pela quimiotaxia em temperaturas 325
superiores ou iguais a 37ºC, podendo inclusive ser reguladas por prfA (10, 11, 21, 36, 326
37). Dessa forma, a produção de biofilme pelos isolados cujo locus agr e o prfA foram 327
expressos em níveis significativamente maiores a 37ºC, pode ter tido a participação 328
flagelar ou esta aderência inicial pode ter ocorrido passivamente, independente do 329
flagelo (38). 330
80
Em relação ao tempo de contato, as maiores expressões gênicas ocorreram em 24h, 331
tanto para o locus agr quanto para o gene prfA, corroborando outros estudos que 332
indicam a participação do locus agr na fase inicial de formação de biofilme por L. 333
monocytogenes (14, 11), bem como maiores níveis de expressão de prfA em L. 334
monocytogenes produtores de biofilme nas primeiras 24h (30). Assim, tendo em vista 335
que um biofilme maduro produzido por L. monocytogenes ocorre em 48h de contato 336
com a superfície (29), o declínio de expressão do locus agr em 48h observado neste 337
estudo indica a importância deste sistema nas primeiras horas de aderência, 338
principalmente entre 12h e 24h. Neste sentido, é provável que o locus agr possa 339
também regular indiretamente a expressão de pró-proteínas, ou seja, proteínas 340
precursoras necessárias para a célula se aderir a superfícies abióticas(14). 341
Apesar da expressão de fatores de virulência ser regulada a 37ºC (10) e do regulador 342
prfA ter apresentado expressão mais elevada a 37ºC, níveis de expressão desse gene 343
foram verificados em temperaturas mais baixas, tanto em isolados produtores como não 344
produtores de biofilme. Além disso, a expressão do prfA não apresentou variação nas 345
temperaturas de 37ºC e 20ºC, o que também foi encontrado por Garmyn et al (10), ao 346
avaliarem este gene, em cepas agrD mutantes, e por Pieta et al. (7), que encontraram 347
expressão do prfA em temperaturas ainda mais baixas (7ºC). 348
A adesão das bactérias às superfícies, principalmente nas etapas iniciais de formação 349
de biofilme, pode ser influenciada por propriedades físico-químicas da superfície, pelas 350
características do micro-organismo, e pelo conteúdo de nutrientes presentes no meio 351
(39). A hidrofobicidade da superfície pode afetar a taxa de adesão bacteriana, uma vez 352
que interações hidrofóbicas tendem a aumentar com o aumento da natureza não polar 353
81
das superfícies envolvidas (40,41). Desta maneira, as superfícies hidrofóbicas poderiam 354
favorecer a colonização pela eliminação da camada de água presente na interface 355
(40,41). Takahashi et al. (42) demonstraram uma correlação entre aderência bacteriana 356
e a formação de biofilme dependente da hidrofobicidade do material, sugerindo que 357
alterações no material de superfície poderiam ter um impacto sobre os genes 358
expressos, entre os quais estão os genes associados com a motilidade, com estruturas 359
de superfície celular, assim como genes regulatórios (19). Neste sentido, durante a 360
adesão inicial, nas condições de temperaturas utilizadas neste estudo, não foi 361
observada influência dos diferentes materiais utilizados (poliestireno e aço inox), sob a 362
expressão dos genes locus agr e do gene prfA. 363
Os resultados obtidos permitiram verificar que o locus agr possui um papel importante 364
na adesão inicial e na formação de biofilme em isolados de L. monocytogenes, 365
principalmente os genes agrBCD. A expressão do locus agr não apresentou relação 366
com a expressão do gene prfA, assim como não houve interferência do sorotipo nem da 367
origem dos isolados avaliados. Além disso, a expressão dos genes desse locus e do 368
gene prfA, são fortemente influenciados pela temperatura e pelo tempo de contato com 369
a superfície, mas não é influenciada pelas superfícies de contato que foram testadas 370
(aço inox e poliestireno). 371
82
6.6 AGRADECIMENTOS 372
373
Este trabalho teve apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do 374
Rio Grande do Sul - FAPERGS (Processo 11/1271-9) e do Conselho Nacional de 375
Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Processo 482524/2010-3). 376
Agradecemos, também, ao Laboratório de Zoonoses Bacterianas da Fundação 377
Oswaldo Cruz – FIOCRUZ pela sorotipagem dos isolados de L. monocytogenes. 378
83
6.7 REFERÊNCIAS 379
380
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7 Considerações Finais
Ao final do estudo observou-se que há variação na capacidade de produção de
biofilme entre isolados de L. monocytogenes função da temperatura. Entre os isolados
de L. monocytogenes, a capacidade de produção de biofilme decresceu à medida que
as temperaturas diminuíram.
Não há diferença na capacidade de produção de biofilme entre isolados de L.
monocytogenes obtidos de fontes distintas (alimentos, manipulador e ambiente). Todos
os sorotipos de L. monocytogenes provenientes de alimentos apresentaram capacidade
de produção de biofilme semelhante. Entretanto, entre aqueles provenientes de
manipulador/ambiente, os isolados pertencentes ao sorotipo 1/2c produzem mais
biofilme a 10ºC.
Os resultados permitiram observar a importância do locus agr na adesão inicial e
na formação de biofilme em isolados de L. monocytogenes, principalmente dos genes
agrBCD. Cabe ressaltar que a expressão do locus agr não apresentou relação com a
expressão do gene prfA e não houve interferência do sorotipo nem da origem dos
isolados avaliados na expressão do locus agr e do gene prfA.
A expressão dos genes do locus agr e do gene prfA, é fortemente influenciada
pela temperatura e pelo tempo de contato com a superfície, mas não é influenciada
pelas superfícies de contato, aço inox e poliestireno, que foram testadas.
Como perspectiva para estudos futuros, considerando as melhores condições de
tempo e temperatura para produção de biofilme verificada com os isolados utilizados
neste estudo, podemos sugerir o aprofundamento da pesquisa partindo desta condição
otimizada, para esclarecimento do papel desempenhado por outros fatores sobre a
síntese de biofilme.
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Apêndices
99
Apêndice A – Avaliação da capacidade de adesão de isolados de L. monocytogenes
A B
C D
E F
A - recuperação dos Isolados; B – isolamento e seleção; C – crescimento; D – padronização da concentração do inóculo; E – crescimento em microplaca; F – halos de formação de biofilme.
100
Apêndice B – Cultivo dos isolados de L. monocytogenes sob CFB e CP, extração do RNA, síntese de cDNA e avaliação do perfil de expressão do locus
agr e do gene prfA por RT-qPCR
Cultivo dos isolados em CFB
A B C
D E F
G H
I
A – Adição do meio de crescimento em AI e PS; B – adição do inóculo com concentração padronizada; C – crescimento em diferentes temperaturas e tempos sob CFB; D – PS com crescimento de L. monocytogenes; E – cupons de AI após a lavagem com PBS; F – secagem das superfícies com biofilme; G – superfície de PS com biofilme após secagem; H – retirada das células de biofilme aderidas no AI; I – solução salina com células de biofilme.
101
Cultivo dos isolados em CP
A B A – Crescimento de L. monocytogenes sob CP em diferentes temperaturas e tempos; B – centrifugação dos isolados para concentração bacteriana.
102
Extração do RNA dos isolados sob CFB e CP
A B C
D E F
G H I
J
A – concentrado de células bacterianas; B – adição de reagente para lise celular; C – adição de zircônia para lise celular; D – centrifugação; E – separação dos ácidos nucléicos; F – ácidos nucléicos separados G – RNA após a purificação; H – reagentes para tratamento com dnase e síntese de cDNA; I – adição de reagentes para a síntese de cDNA; J – síntese de cDNA.
103
Avaliação do perfil de expressão por RT-qPCR
A B
C D
E
A – adição dos reagentes para verificar níveis de expressão dos genes avaliados; B – preparação da microplaca para RT-qPCR; C – aplicação de adesivo optico; D – centrifugação das microplacas; E – resultado do perfil de expressão genética por RT-qPCR.
104
Apêndice C – Validação dos primers: melt curve e cálculo do slope
Melt Curve Gene 16S
Gene agrA
Gene agrB
105
Gene agrC
Gene agrD
Gene prfA
106
Slope e eficiência Gene 16S
Amostra cDNA
log (dilui)
valor CT em cada diluicao
1/1 0,00 13,79867
1/5 -0,70 18,24442
1/25 -1,40 17,8751
1/125 -2,10 22,69905
slope -3,767
EFICIENCIA 1,84
Gene agrA
Amostra cDNA
log (dilui)
valor CT em cada diluicao
1/1 0,00 27,07195
1/5 -0,70 28,48392
1/25 -1,40 30,921
1/125 -2,10 33,17908
slope -2,969
EFICIENCIA 2,17
Gene agrB
Amostra cDNA
log (dilui)
valor CT em cada diluicao
1/1 0,00 21,48719
1/5 -0,70 22,96197
1/25 -1,40 25,61331
1/125 -2,10 27,95884
slope -
3,157
EFICIENCIA 2,07
107
Gene agrC
Amostra cDNA
log (dilui)
valor CT em cada diluicao
1/1 0,00 24,05457
1/5 -0,70 24,75768
1/25 -1,40 27,59887
1/125 -2,10 29,76826
slope -2,858
EFICIENCIA 2,24
Gene agrD
Amostra cDNA
log (dilui)
valor CT em cada diluicao
1/1 0,00 23,63125
1/5 -0,70 25,20065
1/25 -1,40 27,84953
1/125 -2,10 30,60166
-3,370
EFICIENCIA 1,98
Gene prfA
Amostra cDNA
log (dilui)
valor CT em cada diluicao
1/1 0,00 26,10425
1/5 -0,70 26,36339
1/25 -1,40 28,53453
1/125 -2,10 34,13043
slope -3,755
EFICIENCIA 1,85