tese estudo fitoquímico de genótipos de araçá (psidium...

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Universidade Federal de Pelotas

Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos

Tese

Estudo fitoquímico de genótipos de araçá (Psidium cattleianum) em

seis safras (2008 a 2013)

ANDRÉA MIRANDA TEIXEIRA

Pelotas, 2015

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ANDRÉA MIRANDA TEIXEIRA

Bacharel em Química de Alimentos

Mestre em Ciências

Estudo fitoquímico de genótipos de araçá (Psidium cattleianum) em

seis safras (2008 a 2013)

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciência e Tecnologia de

Alimentos da Universidade Federal de

Pelotas, como requisito parcial à obtenção

do título de Doutor em Ciências (área do

conhecimento: Ciência e Tecnologia de

Alimentos).

Orientação: Prof. Dr. Cesar Valmor Rombaldi - DCTA – UFPEL

Dr. Rodrigo Franzon - EMBRAPA

Pelotas, 2015

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Catalogação na fonte por Nídila Alonso Guimarães – CRB 10/1903

T266e Teixeira, Andréa Miranda

Estudo fitoquímico de genótipos de araçá (Psidium cattleianum) em seis

safras (2008 a 2013) / Andréa Miranda Teixeira; orientadores Cesar Valmor

Rombaldi, Rodrigo Franzon - Pelotas: 2015.

85f.: il:

Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia

de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015.

1. Ácido L-ascórbico. 2. Antocianinas. 3. Compostos fenólicos. 4.

Atividade antioxidante. 5. Antiprofiferativa. I. Título. II. Rombaldi, Cesar

Valmor, orient. III. Franzon, Rodrigo, orient.

CDD – 634

3

Andréa Miranda Teixeira

Estudo fitoquímico de genótipos de araçá (Psidium cattleianum) em seis safras

(2008 a 2013).

Tese aprovada, como requisito parcial, para obtenção do grau de Doutor em Ciência

e Tecnologia de Alimentos, Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia

de Alimentos, Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, Universidade Federal de

Pelotas.

Data da defesa: 24/09/2015.

Banca Examinadora:

Prof. Dr. César Valmor Rombaldi (Orientador). Doutor em Biologie Moléculaire

Végétale pela Ecole Nationale Superieure Agronomique de Tolouse

Dr. Rodrigo Franzon. Doutor em Agronomia pela Universidade Federal de Pelotas

Prof. Dr. Valdecir Carlos Ferri. Doutor em Agronomia pela Universidade Federal de

Pelotas

Profa. Dra. Carla Rosane Barboza Mendonça. Doutora em Química pela

Universidade Federal do Rio Grande do Sul

Prof. Dr. Amauri Costa da Costa. Doutor em Ciência e Tecnologia Agroindustrial pela

Universidade Federal de Pelotas

4

Dedico ao meu mais novo e eterno amor,

minha maior motivação,

meu pequeno Otávio.

5

Agradecimentos

Aos meus pais, Kleber e Vera, e irmãs, Daniele e Isabella, por todo amor,

apoio e incentivo constantes.

Ao meu marido, Franer, por ter sido paciente e compreendido meus

momentos de ausência e mudanças de humor. Pelo seu amor, carinho e apoio

desde o início desta jornada, mas, acima de tudo, por ter me dado a maior

motivação para a finalização deste trabalho, nosso pequeno Otávio, que em breve

estará entre nós.

À Universidade Federal de Pelotas (UFPel) e ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos (PPGCTA) pela oportunidade na

realização do curso.

Ao professor César Valmor Rombaldi, pela acolhida, orientação,

ensinamentos, apoio e, principalmente, pelas palavras de incentivo, mesmo quando

tudo parecia perdido.

Aos Membros da Banca de Qualificação e Tese, pela disponibilidade e

enriquecimento deste trabalho.

Á Universidade Estadual do Rio Grande do Sul (Uergs), pela possibilidade

de realização do curso. Aos colegas professores, funcionários e alunos da unidade

da Uergs em Cachoeira do Sul, pela torcida, carinho e compreensão durante o

período de Doutorado. Em especial, àqueles que, além de colegas e alunos, se

tornaram grandes amigos.

A todos os familiares e amigos queridos que sempre estiveram torcendo por

mim.

À todos que de alguma forma contribuíram para a conclusão desta tese.

6

Resumo

TEIXEIRA, Andréa Miranda. Estudo fitoquímico de genótipos de araçá (Psidium cattleianum) em seis safras (2008 a 2013). 2015. 85f. Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015.

Os benefícios à saúde, atribuídos aos alimentos ricos em compostos fenólicos e

outros antioxidantes naturais, têm elevado a procura por novas espécies que

possuam, além dessa propriedade, uma atividade biológica complementar relevante,

como proteção à doenças crônicas ou degenerativas. Na região Sul do Brasil, o

araçazeiro (Psidium cattleianum Sabine), com frutos de sabor e aroma apreciados

pelos consumidores, é uma das espécies de frutíferas nativas que mais se destaca.

Os teores de ácido L-ascórbico, antociananinas totais, carotenoides totais, taninos

totais, fenólicos totais e individuais presentes em seis genótipos (AR9, AR19, AR29,

AR27, AR46 e AR72) de frutos de araçá nos anos de 2008 a 2013, bem como sua

potencial atividade antioxidante e antiproliferativa frente a células tumorais foram

avaliados neste estudo. Os frutos estudados mostraram elevada variabilidade na

composição fitoquímica, seja em relação aos genótipos ou às safras. Os frutos de

coloração vermelha (AR9, AR19 e AR29) apresentaram maiores teores de

antocianinas e compostos fenólicos totais. Já os genótipos AR 46 e AR72, de

coloração amarela, apresentaram maiores teores de ácido L-ascórbico. A

epicatequina foi a molécula fenólica mais abundante presente nos frutos, seguida de

ácido gálico, em todos os genótipos. Apenas o teor de taninos totais de cada

genótipo não foi influenciado pelos anos agrícolas. Os extratos dos frutos

aumentaram os índices de sobrevivência das células de Saccharomyces cereviseae,

demonstrando um potencial de proteção das células frente ao agente estressor. Os

extratos também inibiram a proliferação de células de adenocarcinoma de cólon

humano demonstrando potencial ação antiproliferativa frente a células tumorais. Os

resultados deste estudo contribuem para o incentivo no consumo desses frutos

como alimentos com propriedades fitoquímicas de destaque, com potenciais

benefícios à saúde.

Palavras-chave: ácido L-ascórbico; antocianinas, compostos fenólicos; atividade

antioxidante; atividade antiproliferativa.

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Abstract

TEIXEIRA, Andréa Miranda. Phytochemicals of araça genotypes (Psidium cattleianum) n six harvests seasons (2008 a 2013). 2015. 85f. Tese (Doutorado) –

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015. The health benefits attributed to foods rich in phenolic compounds and other natural

antioxidants, have high demand for new species that have, besides this property, an

important complementary biological activity, as a protection against chronic or

degenerative diseases. In southern Brazil, the araça (Psidium cattleianum Sabine),

fruits with attractive taste and smell, is one of the native species that stands out. L-

ascorbic acid, total anthocyanins, total carotenoids, total tannins, total and individual

phenolics, antioxidant and antiproliferative activities with tumoral cells of extracts

from six araçá genotypes (AR9, AR19, AR29, AR27, AR46 and AR72) in six harvests

seasons (2008 - 2013) were evaluated. The results showed that the fruits have high

variability in the phytochemical composition wheter is relation to genotype or harvest

season. Red color genotypes (AR9, AR19 and AR29) had higher anthocyanins

contents and phenolic compounds. Already AR46 and AR72, yellow color genotypes,

showed higher L-ascorbic acid content. Epicatechin was the most abundant phenolic

molecule present in fruit, followed by gallic acid in all genotypes. Only the total tannin

content of each genotype was not affected by crop years. Araçá extracts increased

the survival rate of Saccharomyces cereviseae cells, demonstrating a potential

protecting effect against the oxidant stress agent (H2O2). Similarly, all extracts

inhibited the proliferation of the human colon adenocarcinoma cells (Caco-2)

demonstrating potencial antiproliferative activity against tumoral cells. The results of

this study contribute to promote consumption of these fruits as food with

phytochemical properties, with potential health benefits.

Keywords: L-ascorbic acid; anthocyanins; phenolics compounds; antioxidant

capacity; antiproliferative activity.

8

Lista de figuras

Figura 1. Rota metabólica de síntese de compostos

fenólicos.......................................................................................

18

Figura 2. Estrutura química dos ácidos hidroxibenzoicos (a) e do ácidos

cinâmicos (b) ...............................................................................

20

Figura 3. Núcleo fundamental dos flavonoides (flavílio) e sua

numeração...................................................................................

20

Figura 4. Estrutura dos principais flavonoides............................................ 21

Figura 5. Estrutura genérica das antocianinas a partir do esqueleto das

antocianidinas..............................................................................

22

Figura 6. Fórmulas estruturais: a) um flavonoide genérico, b) flavan-3-ol

e c) procianidina (tanino condensado).........................................

23

Figura 7. Estruturas de taninos hidrolisáveis.............................................. 24

Figura 8. Teor de compostos fenólicos totais (A), epicatequina (B), ácido

gálico (C), ácido cumárico (D), ácido ferúlico (E) e quercetina

(F) (mg.100g-1 fruto) de genótiopos de araçás vermelhos (AR9,

AR19 e AR29) e amarelos (AR27, AR46 e AR72) em seis

safras (2008 a 2013) ...................................................................

38

9

Lista de tabelas

Tabela 1. Teor de sólidos solúveis totais (°Brix a 20°C) de frutos de

araçás vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR

46, AR 72) das safras de 2008 a 2013.........................................

32

Tabela 2. pH de frutos de araçás vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e

amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013.....

33

Tabela 3. Teor de ácido L-ascórbico (mg.100g-1) de frutos de araçás

vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46,

AR 72) das safras de 2008 a 2013...............................................

34

Tabela 4. Conteúdo de antocianinas totais (mg cianidina-3-

glicosídeo.100g-1) de frutos de araçás vermelhos (AR 9, AR 19,

AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008

a 2013...........................................................................................

34

Tabela 5. Conteúdo de carotenoides totais (µg β-caroteno. g-1) de frutos

de araçás vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27,

AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013...................................

35

Tabela 6. Conteúdo de taninos totais (mg. 100g-1) de frutos de araçás

vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46,

AR 72) das safras de 2008 a 2013...............................................

36

Tabela 7. Conteúdo de compostos fenólicos totais (mg GAE.100g-1) de

frutos de araçás vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos

(AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013......................

36

Tabela 8. Atividade antioxidante de extratos de extratos aquosos de

araçás vermelhos (AR9, AR19 e AR29) e amarelos (AR27,

AR46 e AR72) sobre S. cereviseae XV 185-14C (valores médios

correspondentes às safras de 2008 a 2013).......................................

39

Tabela 9. Atividade antiproliferativa de extratos aquosos de araçás

vermelhos (AR9, AR19 e AR29) e amarelos (AR27, AR46 e

AR72) sobre células de fibroblastos embrionários (3T3) e

adenocarcinoma de cólon humano (Caco-2) (valores médios

correspondentes às safras de 2008 a 2013)......................................

40

10

Sumário

1 Introdução ............................................................................................................. 11

2 Revisão da literatura ............................................................................................. 15

2.1 Araçá (Psidium cattleianum) ........................................................................... 15

2.2 Atividade antioxidante ..................................................................................... 16

2.3 Compostos Fenólicos ..................................................................................... 18

2.4 Carotenoides .................................................................................................. 24

2.5 Ácido L-Ascórbico ........................................................................................... 25

3 Material e métodos ................................................................................................ 26

3.1 Material vegetal .............................................................................................. 26

3.2 Sólidos solúveis totais (SST) e pH .................................................................. 26

3.3 Ácido L-ascórbico ........................................................................................... 26

3.4 Antocianinas totais .......................................................................................... 27

3.5 Carotenóides totais ......................................................................................... 27

3.6 Taninos totais ................................................................................................. 28

3.7 Compostos fenólicos totais ............................................................................. 28

3.8 Compostos fenólicos individuais ..................................................................... 29

3.9 Atividade antioxidante in vivo .......................................................................... 29

3.10 Atividade antiproliferativa frente a células tumorais ........................................ 30

3.11 Desenho experimental e análise estatística .................................................... 31

4 Resultados ............................................................................................................ 32

5 Discussão ............................................................................................................. 41

6 Considerações finais ............................................................................................. 46

Referencias Bibliográficas ......................................................................................... 47

Apêndice ................................................................................................................... 58

Anexos ...................................................................................................................... 83

11

1 Introdução

A praticamente totalidade dos estudos relacionados à nutrição e à saúde

evidencia que há correlação negativa entre o consumo de vegetais (grãos, frutas e

hortaliças) e a ocorrência de doenças crônico-degenerativas (BOEING et al., 2012;

HARTMANN, 2007; OLIVERAS-LÓPEZ et al., 2014; POIROUX-GONORD et al.,

2010; REISS et al., 2012; TANG at al., 2014). Os resultados e o conhecimento

gerados nesses trabalhos são consubstanciados em estudos pontuais, relacionando

causa-efeito em modelos heterólogos (simulações químicas, in vitro e in vivo) ou

através de estudos de coorte (DIMITRIU et al., 2015; HERNANDES et al., 2014;

MEDINA et al., 2011; NERI-NUMA et al., 2013, STINCO et al., 2015; TANG at al.,

2014). São raros os casos, como Boffetta et al. (2010), em que não há essa

tendência de correlação. Assim, vai-se consolidando o senso comum de que,

efetivamente, o consumo de vegetais, associado à atividade física regular, e à

diminuição à exposição de fatores abióticos estressores (resíduos químicos, UV,

álcool, outros), promovem saúde.

A fim de prevenir doenças crônicas não transmissíveis, a Organização

Mundial da Saúde (OMS) recomenda o consumo mínimo de 400g de frutas e

hortaliças diariamente (WHO, 2003). Programas de incentivo ao consumo desses

alimentos foram elaborados principalmente em países desenvolvidos, como Estados

Unidos e países europeus, sendo denominados programas do tipo “Five a Day” em

que são recomendados cinco porções de frutas e hortaliças diariamente. Apesar das

recomendações, a maioria da população, inclusive desses países, não consome

quantidade adequada desses vegetais. No Brasil, dados indicam que a população

consome apenas ¼ do recomendado para esses alimentos (SILVA, 2011).

Assim, fica evidente que há necessidade de se planejar estratégias para o

aumento do consumo de frutas e hortaliças no Brasil. Obviamente, isso passa por

mudanças conjunturais, como é o caso do hábito alimentar/educação e do poder

aquisitivo, mas também implica em evolução tecnológica nos sistema de produção,

ampliando a oferta de produtos saudáveis, inovadores, práticos e mais seguros.

A OMS orienta que as iniciativas que promovem o consumo de frutas e

hortaliças sejam baseadas em evidencias científicas que enfatizem os benefícios

desses alimentos para a saúde. As frutas e hortaliças são fontes de nutrientes,

12

minerais e moléculas com potencial bioativo, muitas das quais possuem

propriedades antioxidantes, que podem estar relacionadas com o retardo do

envelhecimento e a prevenção de certas doenças. São especialmente as moléculas

sintetizadas pelo metabolismo especializado, também denominado secundário, que

conferem adaptação e proteção das plantas ao ecossistema em que são cultivadas,

e que conferem o potencial funcional a quem as consomem (ANGELO e JORGE,

2007; POIROUX-GONORD et al., 2010). Pesquisas têm demonstrado que

compostos fenólicos, como os flavonoides, assim como os bem conhecidos

carotenoides e as vitaminas C e E, contribuem para a ação antioxidante desses

vegetais (CHIM, 2008; HARTMANN, 2007; LIMA, MELO e LIMA, 2008; LIMA et al.,

2011; RUFINO et al., 2010; ZAICOVSKI, 2008).

Os benefícios à saúde, atribuídos aos alimentos ricos em compostos

fenólicos e outros antioxidantes naturais, têm elevado a procura por novas espécies

que possuam, além dessa propriedade, uma atividade biológica complementar

relevante, como proteção à doenças crônicas ou degenerativas. É nesse contexto

que o Brasil se apresenta com extrema importância, uma vez que oferece grande

diversidade e variabilidade vegetal, especialmente de espécies frutíferas. No

entanto, muitos dos frutos ainda são desconhecidos ou pouco utilizados, embora

possuam potencial para se tornarem competitivos com as espécies frutíferas

tradicionais ou exóticas. De acordo com Medina et al. (2011), Hoffmann et al. (2014),

Beskow et al. (2015) e Pereira et al. (2015), vários estudos vêm sendo realizados

com plantas e frutos tropicais, mas são escassos os dados sobre espécies frutíferas

nativas, especialmente, de clima temperado. Espera-se que frutos nativos de clima

temperado sejam portadores de algumas dessas propriedades. A maior riqueza em

espécies frutíferas nativas brasileiras encontra-se na Amazônia e no Cerrado.

Porém, a região Sul também possui uma grande abundância de espécies com

potenciais de uso, quando comparadas com outras regiões.

Os estudos com frutos nativos da região Sul do Brasil tiveram seu início em

meados da década de 80, em instituições dos três estados dessa região do país. No

Rio Grande do Sul, as pesquisas pioneiras, realizadas pela Embrapa Clima

Temperado, tinham o objetivo principal de conservação das espécies. Porém, com o

passar dos anos cresceu a ideia de se utilizar algumas dessas espécies como

complementares aos sistemas produtivos da região e, no ano de 2001, começaram

os estudos de caracterização e potencialidade desses frutos, inclusive aqueles

13

diretamente ligados aos benefícios para a saúde humana (FETTER et al, 2010;

FRANZON, 2004; MEDINA et al, 2011; RASEIRA, 2010).

Pelo fato de espécies nativas terem co-evoluÍdo no mesmo ecossistema em

que são cultivadas, acredita-se que tenham desenvolvido um complexo metabolismo

secundário, resultando, no mínimo, em frutos ricos nesses compostos, que além de

serem mecanismos de defesa, possam exercer algum benefício adicional. Na

Região Sul do Brasil, há variabilidade de espécies frutíferas nativas, mas, segundo

Raseira et al (2004), o araçá (Psidium cattleianum Sabine), pertencente à família

Myrtaceae, é um dos que mais se destaca. O araçazeiro produz frutos de tamanho

pequeno com coloração amarelada ou avermelhada, com sabor e aroma agradáveis.

Embora estudos sobre a composição físico-química, propriedades antioxidantes e

antimicrobianas do araçá, bem como de desenvolvimento de produtos com o fruto já

tenham sido realizados (CALDEIRA, et al., 2004; FETTER et al., 2010; HAMINIUK et

al., 2006; LUXIMON-RAMA, BAHORUN, CROZIER, 2003; MEDINA et al., 2011;

REISSIG, 2015; VRIESMANN et al., 2002; ZAICOVSKI, 2008), a caracterização de

fitoquímicos em safras subsequentes, ainda não foi pesquisada.

Esse questionamento precisa ser respondido, pois é amplamente citado

(LATOCHA, JANKOWSKI e RADZANOWSKA, 2011; LIMA et al., 2011; STINCO et

al., 2015) que há variações na composição dos frutos em função do ano agrícola.

Assim, por já se ter a caracterização em nível de genótipos de araçá, tendo-se

evidenciado a riqueza em compostos fitoquímicos (MEDINA et al., 2011;

ZAICOVSKI, 2008), é relevante saber-se qual a variabilidade em função do ano de

produção.

A caracterização de genótipos permite indicar cultivares com potencial de

uso pelos agricultores, bem como identificar aqueles que apresentem características

interessantes para o melhoramento. Neste sentido, o conhecimento das

características físicas e químicas dos frutos pode contribuir para a seleção de

genótipos promissores e desejáveis ao consumo in natura e/ou agroindustrialização.

Acredita-se que os diferentes genótipos produzam frutos com diferente composição

em fitoquímicos e que as variações decorrentes das safras (anos diferentes,

condições climáticas diferentes, plantas com idades diferentes), possam interferir na

composição desses frutos.

Desse modo, o objetivo do presente trabalho foi estudar os teores de

compostos fitoquímicos presentes em seis genótipos de araçá nos anos de 2008 a

14

2013, bem como sua potencial atividade antioxidante e antiproliferativa frente a

células tumorais. Os resultados deste estudo também são apresentados no

Apêndice, na forma de artigo científico, enviado para o periódico Journal of Food

Composition and Analysis.

Hipóteses

Hipótese 1. Diferentes genótipos produzem frutos com diferentes teores de

compostos fitoquímicos.

Hipótese 2. As variações climáticas, assim como o avanço na idade da planta,

proporcionam síntese e acúmulo de compostos fitoquímicos diferenciados entre os

anos agrícolas.

15

2 Revisão da Literatura

2.1 Araçá (Psidium cattleianum)

No sul do Brasil, dentre as muitas espécies frutíferas nativas existentes,

destacam-se aquelas da família Myrtaceae. A família das Mirtáceas, como é

conhecida, compreende cerca de 102 gêneros, incluindo Eugenia, Myrcianthes,

Campomanesia e Psidium, e 3024 espécies conhecidas, distribuídas e cultivadas,

principalmente em países de clima tropical e subtropical. Entretanto, algumas

espécies dessa família também ocorrem em regiões de clima temperado (FRANZON

et al., 2009).

O gênero Psidium é representado por aproximadamente 120 a 150 espécies,

das quais algumas têm sido objeto de estudos concentrados, principalmente, nos

componentes de aroma dos frutos. As atividades antioxidante e antimicrobiana de

algumas espécies também têm sido investigadas. O araçazeiro (P. cattleianum

Sabine), também conhecido pelos nomes de araçá, araçá-do-mato, araçá-do-campo

e araçá-amarelo (RASEIRA, 2004), apresenta-se como uma das espécies com

importância econômica da família das mirtáceas, ocorrendo em extensa área na

costa atlântica brasileira, desde a Bahia até o Rio Grande do Sul, estendendo-se

também ao nordeste do Uruguai. No Rio Grande do Sul, é comum na planície

costeira, na Floresta Atlântica e, eventualmente, na Depressão Central (FRANZON,

2004; LISBOA, KINUPP e BARROS, 2011; SANTOS et al., 2008).

O fruto araçá é uma baga de coloração amarela ou vermelha, de acordo com

o genótipo, cuja maturação dos frutos ocorre nos meses de fevereiro a abril na

região de Sul do Rio Grande do Sul. A polpa é branca, amarelada ou avermelhada,

mucigelatinosa, aromática, contendo muitas sementes. O sabor lembra um pouco o

da goiaba, embora seja um pouco mais ácido e de aroma mais acentuado

(FRANZON et al., 2009; MARCHIORI e SOBRAL, 1997). Nos últimos anos, essa

espécie tem despertado interesse de pesquisadores do sul do Brasil, devido à

qualidade dos frutos, os quais se mostram apropriados para a fabricação de

compotas, doces em calda, doces em massa, geleias, refrescos, sorvetes e sucos

(MANICA, 2000; LISBOA, KINUPP e BARROS, 2011). Contribuem para isso estudos

sobre a composição nutricional e fitoquímica do araçá, assim como as propriedades

antioxidante e antimicrobianas demonstrando seus potenciais benefícios à saúde

16

(FETTER et al., 2010; MEDINA et al., 2011; McCOOK-RUSSELL et al., 2012; NERI-

NUMA et al., 2013).

De acordo com Franzon, Raseira e Corrêa (2004), o araçazeiro está entre as

espécies nativas do Sul do Brasil com maior potencial para exploração econômica,

devido à possibilidade dos frutos serem comercializados na forma in natura, ou

ainda para a industrialização. Atualmente existem duas cultivares de araçazeiro,

lançadas pela Embrapa Clima Temperado, e que são plantadas em pomares

comerciais, embora em pequena escala. Embora esse potencial, sob o ponto de

vista agronômico, ainda há limitações a serem superadas, desde o sistema de

condução, ao controle de fitopatias. O cultivo em ambiente protegido pode se

constituir uma alternativa para a produção de frutos de boa aparência.

2.2 Atividade Antioxidante

Recentes estudos sugerem uma correlação positiva entre dietas ricas em

frutas e vegetais e a redução da incidência de doenças crônicas. Esses benefícios

são, primeiramente atribuídos à ocorrência de vitaminas, minerais e metabolitos

secundários como carotenoides, antocianinas, flavonoides, e outros compostos

fenólicos que estão amplamente distribuídos no reino vegetal e à atividade

antioxidante desses compostos (BOEING et al., 2012; HARTMANN, 2007;

OLIVERAS-LÓPEZ et al., 2014; POIROUX-GONORD et al., 2010; REISS et al.,

2012; TANG at al., 2014).

A atividade antioxidante de um determinado fruto é normalmente resultante

da interação de seus compostos, podendo haver efeitos sinérgicos. Tais compostos

incluem os fenóis (ácidos fenólicos e seus derivados, flavonoides, tocoferóis), ácido

ascórbico, pigmentos e esteróis (GORDON et al., 2012; KRIS-ETHERTON et al;

2002; KUSKOSKI et al. 2006; RUFINO et al., 2010).

Os compostos que são facilmente oxidados são frequentemente os melhores

antioxidantes, ou seja, moléculas capazes de doar um eletron livre ou átomos de

hidrogênio para radicais livres (CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009). As substâncias

antioxidantes presentes nas frutas atuam nas espécies reativas de oxigênio (ROS),

que incluem radicais livres reativos, tais como superóxidos, hidroxilas e peroxila, e

17

também com não radicais, como peróxido de hidrogênio. Essas substâncias atuam

na etapa de iniciação e propagação dos radicais livres ou supressão da formação

dos mesmos (LIM, LIM e TEE, 2007). Os radicais livres são, quimicamente,

quaisquer átomos, moléculas ou fragmentos de molécula contendo um ou mais

elétrons desemparelhados nas suas camadas de valência. Devido essa

configuração, tornam-se espécies altamente instáveis, com curto tempo de meia-

vida e muito reativas (POMPELLA, 1997).

Os ácidos fenólicos e os flavonoides tem atuação semelhante, seqüestrando

radicais livres como principal forma de atuação como antioxidantes. Os ácidos

derivados do ácido cinâmico são mais ativos em relação à ação antioxidante do que

aqueles derivados do ácido benzóico devido à dupla ligação do radical presente na

molécula dos derivados cinâmicos, que participa da estabilidade do radical por

ressonância do deslocamento do elétron desemparelhado (ANGELO e JORGE,

2007).

As propriedades antioxidantes dos carotenoides fundamentam-se na

estrutura destes compostos, principalmente no sistema de duplas ligações

conjugadas, tornando possível a captação de radicais livres, principalmente o radical

peroxila. Além da captação de radicais livres, os carotenóides captam energia do

oxigênio singlete, que volta ao estado fundamental (O2). O carotenoide excitado

resultante libera energia baixa e, portanto, inofensiva ao meio celular (CERQUEIRA,

MEDEIROS e AUGUSTO, 2007).

Diversos estudos têm demonstrado que uma série de doenças entre as

quais, câncer, aterosclerose, diabetes, artrite e doenças cardiovasculares podem

estar ligadas aos danos causados por formas de oxigênio extremamente reativas

(KRIS-ETHERTON et al, 2002; REISS et al., 2002). Estudos epidemiológicos

revelam que uma dieta rica em compostos fenólicos está associada à diminuição do

colesterol total e aumento das proteínas de alta densidade – HDL (high density

lipoprotein), benefícios no tratamento de doenças cardiovasculares, hipertensão,

diabetes e inibição do crescimento de células tumorais (FANG, YANG e WU, 2002;

HERNANDES et al., 2014; NERI-NUMA et al., 2013; TANG et al., 2014).

18

2.3 Compostos Fenólicos

As plantas produzem uma diversidade de compostos secundários que

contêm um grupo hidroxila funcional associado diretamente a um anel aromático.

Essas substâncias são classificadas como compostos fenólicos e representam a

principal classe de metabólitos secundários presentes nos vegetais, sendo

essenciais para o seu crescimento e desenvolvimento. Muitas vezes são derivados de

reações de defesa das plantas contra agressões do ambiente, infecções, condições de

cultivo e variações genéticas (ANGELO e JORGE, 2007).

Os compostos fenólicos são sintetizados por duas rotas metabólicas: a rota

do ácido chiquímico e a rota do ácido malônico (Figura 1), razão pela qual

constituem um grupo bastante heterogêneo do ponto de vista metabólico. A rota do

ácido chiquímico participa da biossíntese da maioria dos compostos fenólicos

vegetais, os quais, devido à diversidade química, podem ser agrupados em

compostos fenólicos simples (representados pelos ácidos fenólicos e cumarinas),

flavonoides, ligninas e taninos condensados. A rota do ácido malônico, embora seja

uma fonte importante de produtos secundários fenólicos em fungos e bactérias, é

menos expressiva em plantas superiores (SIMÕES et al., 2007; TAIZ & ZEIGER,

2013). Em alimentos, são responsáveis pela cor, adstringência, aroma e estabilidade

oxidativa.

Figura 1. Rota metabólica de síntese de compostos fenólicos.

Fonte: TAIZ e ZEIGER, 2013.

19

Os metabólitos secundários representam uma interface química entre as

plantas e o ambiente circundante, portanto, sua síntese é frequentemente afetada

por condições ambientais, como temperatura, luz e água, por exemplo. Além disso,

a presença de compostos fenólicos específicos está relacionada à fatores como o

tipo de fruta, variedade, localização geográfica, presença de doenças na planta,

condições de armazenamento pós-colheita e processamento (ANGELO e JORGE,

2007; GOBBO-NETO e LOPES, 2007).

A influência desses fatores é comprovada pela grande variabilidade no teor

de compostos fenólicos em frutos do gênero Psidium encontrados em diferentes

regiões do Brasil e do mundo. Fetter et al. (2010) encontraram teor de compostos

fenólicos entre 294,51 e 1851,38mg de equivalente de ácido clorogênico por 100g

de fruto fresco em frutos de araçá-amarelo, araçá-vermelho (P. cattleianum Sabine)

e araçá pera (P. acutangulum D.C.) cultivados no sul do Brasil. Variedades

vermelhas e amarelas de P. cattleianum das Ilhas Maurício apresentaram acima de

5000µg de equivalente de ácido gálico (EAG) por grama de fruto fresco (LUXIMON-

RAMMA et al., 2003). Já em frutos das espécies P. cattleianum Sabine (araçá) e P.

guajava (goiaba), colhidos na Jamaica, o teor de compostos fenólicos foi de 4439 e

1952µg EAG/g de fruto fresco, respectivamente (McCOOK-RUSSEL et al., 2012).

Os ácidos fenólicos caracterizam-se por possuir um anel benzênico, um

grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na

molécula. Estão divididos em dois grupos: os derivados do ácido hidroxibenzoico,

que tem estrutura comum C6-C1, e os derivados do ácido cinâmico, que são

compostos aromáticos com três carbonos que formam uma cadeia lateral com

estrutura C6-C3 (Figura 2) (SIMÕES et al, 2007).

20

Figura 2. Estrutura química dos ácidos hidroxibenzoicos (a) e do ácido cinâmicos (b)

Fonte: ANGELO e JORGE, 2007.

Os flavonoides constituem uma importante classe de compostos fenólicos,

sintetizada em abundância entre os metabólitos secundários de vegetais e

encontrada em diversas formas estruturais. Os representantes dessa classe

possuem dois anéis aromáticos, denominados anel A e B, unidos por três carbonos

que formam um anel heterocíclico, denominado anel C, possuindo hidroxilas e

glicosídeos distribuídos ao redor (Figura 3) (ANGELO e JORGE, 2007; TAIZ e

ZEIGER, 2013).

Figura 3. Núcleo fundamental dos flavonoides (flavílio) e sua numeração.

Fonte: SIMÕES et al, 2007.

Os flavonoides são classificados de acordo com o grau de oxidação da

cadeia de três carbonos, sendo os flavonóis, as flavonas e as antocianinas, classes

encontradas com maior freqüência (Figura 4). As diferenças estruturais presentes

em cada grupo são resultado da variação no número e no arranjo de grupos

hidroxilas, assim como a natureza e quantidade de alquilações e/ou glicosilações

destes grupos (ANGELO; JORGE, 2007; VOLP et al., 2008; SIMOES et al., 2007;

ZUANAZZI e MONTANHA, 2010).

Ácido p-hidroxibenzoico: R1=R2=H

Ácido gálico: R1=R2=OH

Ácido protocatéquico: R1=OH, R2=H

Ácido siríngico: R1=R2=OCH3

Ácido cumárico: R1=R2=H

Ácido caféico: R1=OH, R2=H

Ácido ferúlico: R1= OCH3, R2=H

21

Figura 4. Estrutura dos principais flavonoides.

Fonte: ZUANAZI e MONTANHA, 2010.

Os flavonóis mais comuns são a quercetina, a mircetina e o campferol,

sendo a primeira, quantitativamente, o principal constituinte fenólico encontrado em

plantas. No grupo dos flavanóis estão presentes a catequina e a epicatequina, as

quais ocorrem frequentemente na forma combinada com ácido gálico ou na forma de

polímeros em taninos condensados.

As antocianinas destacam-se como grupo pigmentado mais comum entre os

flavonoides, sendo os responsáveis pelas cores de vegetais que variam do vermelho

ao azul. As antocianinas ocorrem na natureza como glicosídeos de antocianidinas.

As antocianidinas são as estruturas básicas das antocianinas e consistem de um

anel aromático (A) ligado a um anel heterocíclico que contém oxigênio (C), que

também é ligado por uma ligação C-C a um terceiro anel aromático (B) (Figura 5).

Entre as vinte antocianidinas conhecidas, que ocorrem naturalmente, apenas seis

são mais frequentes em vegetais: cianidina (50%), delfinidina (12%), perlagonidina

(12%), peonidina (12%), petunidina (7%) e malvidina (12%) (KONG, 2003), que

diferenciam-se pelo número de grupos hidroxilas esterificados na molécula,

natureza, número e posição da glicosilação, bem como pela natureza e número de

ácidos orgânicos ligados aos resíduos de glicosídeos. Os ácidos mais comuns

encontrados são o ácido p-cumárico, ácido cafeico e ácido ferúlico. A glicosilação

pode ocorrer em várias posições, sendo observada com maior frequência na posição

22

três. Os açúcares encontrados mais frequentemente são: glicose, galactose,

ramnose, arabinose e xilose (SIMÕES et al, 2007; TAIZ e ZEIGER, 2013; RIBEIRO e

SERAVALLI, 2010).

Figura 5 - Estrutura genérica das antocianinas a partir do esqueleto das antocianidinas. Fonte: JACKMANet al., 1987.

Os taninos são um grupo de compostos fenólicos com propriedades de

defesa para o vegetal. Há duas categorias de taninos: os condensados e os

hidrolisáveis. Os taninos condensados, também conhecidos como proantocianidinas,

são polímeros de flavonoides, cujos monômeros de unidades flavan-3-ol, ou por um

derivado desta, são unidos por uma ligação carbono-carbono (Figura 6) (AGOSTINI-

COSTA et al., 2003; GU et al., 2008; QUEIROZ, MORAIS e NASCIMENTO, 2002).

Estão presentes na fração da fibra alimentar de diferentes alimentos e podem ser

considerados indigeríveis ou levemente digeríveis.

23

Figura 6. Fórmulas estruturais: a) um flavonoide genérico, b) flavan-3-ol e c) procianidina (tanino condensado).

Fonte: QUEIROZ et al., 2002.

Os taninos hidrolisáveis são polímeros heterogêneos que contêm ácidos

fenólicos, em especial o ácido gálico, e açúcares simples, como a glicose, além de

outros polióis. Esses taninos liberam ácidos fenólicos: gálico, cafeico, elágico e um

açúcar, por hidrólise ácida. Normalmente, os taninos hidrolisáveis são divididos em

galotaninos, que produzem ácido gálico e em elagitaninos, que produzem ácido

elágico, após hidrólise (Figura 7) (AGOSTINI-COSTA et al., 2003; NASCIMENTO e

MORAIS, 1996).

Nas plantas, os taninos podem ser encontrados em raízes, flores, frutos,

folhas, cascas e no caule. Nos alimentos, contribuem para o sabor adstringente.

Franco (2001) verificou, ao estudar as propriedades do araçá, a presença de taninos

na casca do fruto, além de muitos minerais, como cálcio, fósforo, ferro e fibras, todos

essenciais para o organismo humano.

24

Figura 7 - Estruturas de taninos hidrolisáveis. Fonte: QUEIROZ, MORAIS e NASCIMENTO, 2002.

2.4 Carotenoides

Os carotenoides estão amplamente distribuídos na natureza na forma de

pigmentos amarelos, laranjas e vermelhos. A estrutura básica dos carotenoides

consiste em oito unidades de isopreno e pode ser representada pelo pigmento do

tomate, o licopeno, a partir da qual podem ser obtidas outras estruturas, por meio de

reações de hidrogenação, ciclização, oxidação ou combinação dessas. Podem ser

subdivididos em dois grupos principais: os carotenos, constituídos apenas de

carbono e hidrogênio, como os precursores da vitamina A e o licopeno, e as

xantofilas, derivados obtidos por oxidação dos carotenos com formação dos grupos

hidroxila, metoxila, carboxila e cetona, como a luteína e a zeaxantina (RIBEIRO e

SERAVALLI, 2004). Nas plantas, fazem parte da rota fotossintética através da

captação do excesso de energia luminosa, juntamente com as clorofilas, protegendo

as células da oxidação e, consequentemente, da decomposição.

25

2.5 Ácido L-Ascórbico

O ácido ascórbico, mais conhecido como vitamina C, é uma vitamina

hidrossolúvel amplamente distribuída em vegetais, principalmente em frutas cítricas

e hortaliças. Encontra-se na natureza sob duas formas: reduzida ou oxidada. A

transformação do ácido ascórbico em ácido dehidroascórbico, sua forma oxidada,

ocorre normalmente no interior do organismo. Essa é uma reação reversível,

permitindo que uma dessas substâncias possa sempre ser transformada na outra, o

que funciona como um sistema oxidorredutor capaz de transportar hidrogênio nos

processos de respiração, no nível celular (WELCH et al., 1995; TAVARES et al.,

2000).

O ácido ascórbico, quando em solução, é facilmente oxidado a ácido L-

dehidroascórbico, devido à presença do grupo redutona, fortemente redutor. Como é

um forte agente redutor, atua como um antioxidante muito importante em vários

sistemas biológicos (RIBEIRO e SERAVALLI, 2007). A atividade antioxidante da

vitamina C envolve a transferência de um elétron ao radical livre e a consequente

formação do radical livre ascorbato (ROSA et al., 2007).

O teor de vitaminas das frutas pode variar dependendo da espécie, do

estádio de maturação na época da colheita, de variações genéticas, do manuseio

pós-colheita, das condições de estocagem e do processamento (LEE e KADER,

2000; TAVARINI et al., 2008). Barcia et al. (2010) encontraram 1,741mg.g-1 de ácido

ascórbico em araçá roxo (Psidium rufum), assemelhando-se ao teor do pêssego cv

Granada (1,138 mg.g-1) e significativamente superior ao da pera (0,618 mg.g-1).

26

3 Material e métodos

3.1 Material vegetal

Os frutos de araçazeiro (P. cattleianum Sabine) de coloração vermelha

(genótipos AR9, AR19 e AR29) e amarela (genótipos AR27, AR46 e AR72) foram

colhidos, em estádio maduro, na coleção de seleções da Embrapa Clima

Temperado, em Pelotas, RS (31º40’47"S, 52º26’24"W). O pomar foi implantado no

ano de 2000, com plantas originárias das cidades de Pelotas (AR9, AR19 e AR29) e

de Rio Grande (AR 27, AR 46 e AR 72).

Anualmente, foram colhidos 1 kg (em quatro coletas) de frutos de cada

planta (três plantas de cada genótipo), nos meses de fevereiro e março, nas safras

de 2008 a 2013. Os frutos foram congelados em Nitrogênio líquido e armazenados

a -80°C até a realização das análises, em cada ano.

3.2 Sólidos solúveis totais (SST) e pH

A concentração de sólidos solúveis (SST) totais foi determinada por

refratometria, diretamente no suco da amostra descongelada, com os resultados

expressos em graus Brix (°Brix). O pH foi medido em pHmetro digital diretamente no

suco que também foi usado para a determinação de SST .

3.3 Ácido L-ascórbico

O teor de ácido L-ascórbico foi determinado por cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) segundo o método de Vinci et al. (1995). O conteúdo de ácido L-

ascórbico foi extraído com uma solução de ácido metafosfórico 4,5% (m/v) ao abrigo

da luz e em temperatura ambiente. A solução foi filtrada e o volume centrifugado

(10.000g x 10min x 4°C). As amostras foram analisadas em sistema HPLC-

Shimadzu, utilizando coluna de fase reversa RP-18 CLC-ODS (4,6mm x 150mm x

5µm), acoplada a detector UV-visível a 254nm, com injetor automático. A fase móvel

foi composta por solução de água ultra pura:ácido acético (solvente A) (99,9:0,1 v/v)

e metanol (solvente B). O gradiente de eluição começou em 100% do solvente A,

seguindo uma redução linear até 98% aos 5min, mantido nessa condição por 2min e

27

retornando às condições iniciais, perfazendo um tempo de eluição de 12min por

amostra. O fluxo adotado foi de 0,8mL.min-1, com temperatura do forno da coluna de

25°C e o detector UV ajustado a 254nm. A quantificação foi realizada comparando

os tempos de retenção para o padrão externo de ácido L-ascórbico. Os resultados

foram expressos em miligramas de ácido L-ascórbico por 100g de fruto fresco.

3.4 Antocianinas totais

O teor total de antocianinas foi determinado por espectrofotometria, segundo

método adaptado de Lees e Francis (1972). Para extração dos pigmentos, 1g de

fruto foi adicionado de 25mL de etanol acidificado (HCl até pH 1,0) e mantido em

repouso, na ausência de luz, sendo homogeneizado a cada 5min. Após o período de

1h, a mistura foi filtrada em algodão e completou-se o volume de 50mL com etanol.

As leituras de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro UV/Vis Ultrospec

2000 (Pharmacia Biotech), no comprimento de onda de 520nm. Os resultados foram

expressos em miligramas de cianidina-3-glucosideo por 100g de fruto fresco.

3.5 Carotenóides totais

O conteúdo total de carotenóides foi determinado por espectrofotometria,

segundo método adaptado de Rodriguez-Amaya (2001). Cinco gramas de amostra

foram triturados com celite, adicionados de 20mL de acetona gelada, para extração

dos pigmentos, e homogeneizados por aproximadamente 10 minutos. A amostra foi

filtrada a vácuo e o resíduo lavado com acetona gelada até remoção total do

pigmento e o filtrado transferido para um funil de separação, onde foi adicionado éter

de petróleo e água destilada. A fase inferior foi descartada e a lavagem com água

destilada realizada até a completa remoção da acetona. A leitura da absorbância do

extrato etéreo obtido foi realizada em espectrofotômetro UV/Vis Ultrospec 2000

(Pharmacia Biotech), em comprimento de onda 450nm. Os resultados foram

expressos em micrograma de β-caroteno por grama de fruto fresco.

28

3.6 Taninos totais

O teor de taninos totais foi determinado por espectrofotometria seguindo o

método de Folin-Denis, descrito por Gu et. al. (2008). Para a extração desses

compostos, cinco gramas de fruto triturado foram adicionados de 10mL de metanol,

e submetidos a agitação por 1 hora à temperatura ambiente, seguido de uma

filtração. Para a determinação do teor de taninos, 100µL do extrato foram

adicionados de 300µL de reagente de Folin-Denis e, após 3 minutos, adicionou-se

uma solução aquosa saturada de carbonato de sódio. A solução foi deixada em

repouso, ao abrigo da luz, em temperatura ambiente, por 1 hora. A leitura da

absorbância das amostras foi realizada em espectrofotômetro UV/Vis Ultrospec 2000

(Pharmacia Biotech), em comprimento de onda 760nm. Os resultados foram

expressos em miligramas por 100g de fruto fresco.

3.7 Compostos fenólicos totais

O procedimento de extração de compostos fenólicos seguiu o método

descrito por Medina (2009), em que 10g de frutos íntegros, congelados a -80°C,

foram triturados com nitrogênio líquido e submetidos à extração com 20mL de

etanol, em agitador orbital a 200rpm por 1 hora à temperatura ambiente (20 ± 3ºC).

Os extratos foram então centrifugados a 12000 g por 10 minutos a 4ºC e os

sobrenadantes foram coletados e concentrados, para remoção do solvente, em

rotaevaporador a 40ºC (por aproximadamente 10 minutos) sob pressão reduzida. Os

extratos resultantes foram recuperados com água ultra pura com volume ajustado

para 10mL.

O teor total de compostos fenólicos foi determinado por espectrofotometria

segundo método de Folin-Ciocalteau (SINGLETON, et al., 1999) modificado por

Dewanto et al. (2002). Para tanto, 125µL de cada extrato foram adicionados a 0,5µL

de água ultra pura e 125µL do reagente de Folin-Ciocalteau 2N. Após 6 minutos em

repouso, foram adicionados à mistura 1,25mL de carbonato de sódio 7% (m/v), e o

volume ajustado para 3mL com água ultra pura. A mistura foi mantida em repouso, à

temperatura ambiente e ao abrigo da luz, por 90 minutos. A leitura da absorbância

das amostras foi realizada em espectrofotômetro UV/Vis Ultrospec 2000 (Pharmacia

29

Biotech), em comprimento de onda 760nm. Os resultados foram expressos em

miligramas de equivalente de ácido gálico (GAE) por 100g de fruto fresco.

3.8 Compostos fenólicos individuais

Os conteúdos de compostos fenólicos individuais foram determinados por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo método descrito por

Hakkinen e Torronen (1998), com pequenas modificações.

Os compostos fenólicos foram extraídos e hidrolisados com metanol

acidificado com ácido clorídrico. O extrato foi homogeneizado a 35°C, na ausência

de luz, por 24h, filtrado em algodão e o sobrenadante concentrado em evaporador

rotativo a 40°C por 20 minutos. O resíduo concentrado foi redissolvido em metanol

até volume final de 10mL e centrifugado (7000 g por 10min). Do sobrenadante, uma

alíquota de 30µL foi injetada no cromatógrafo HPLC da Shimadzu, equipado com

injetor automático, detector UV-VIS a 280nm, coluna de fase reversa RP-18 CLC-

ODS (4,6mm x 150mm x 5µm) e coluna de guarda CLC-GODS (4mm x 200mm x

5µm). A fase móvel consistiu num gradiente de eluição com solução de ácido acético

em água (99:1) (solvente A) e metanol (solvente B), com fluxo de 0,9mL.min-1, cuja

proporção se iniciou com 100% de A, alterando-se gradativamente até 60% de A e

40% de B, em 25 minutos. Manteve-se essa proporção constante por 2 minutos e,

em seguida, alterou-se gradativamente até 95% de A e 5% de B, aos 37 minutos,

mantendo-se constante por mais 5 minutos. Após, retornou-se à fase inicial, com

tempo total de corrida de 45 minutos, segundo metodologia descrita por Zambiazi

(1997).

Os compostos fenólicos individuais foram identificados por comparação com

o tempo de retenção e quantificados com base nas curvas de calibração dos

padrões externos de ácido gálico, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, quercetina e

epicatequina. Os resultados foram expressos em miligramas do respectivo composto

fenólico por 100 gramas de fruto fresco.

3.9 Atividade antioxidante in vivo

A atividade antioxidante in vivo foi determinada segundo metodologia

descrita por Soares, Andreazza e Salvador (2005), utilizando células eucarióticas de

30

leveduras Sacchoromyces XV 185-14C (MATa, ade 2-1, arg 4-17, his 1-7, lys 1-1, trp

5-48, hom 3-10) cedida pelo Dr. R. C. Von Borstel (Genetics Department, University

of Alberta, Edmonton, AB, Canada).

A cepa foi mantida em meio Yeast Peptone Dextrose (YPD) sólido contendo

1% (m/v) de extrato de levedura, 2% (m/v) de peptona, 2% (m/v) de glicose e 2%

(m/v) de ágar. As células foram transferidas para um meio líquido (mesma

composição de meios sólidos sem ágar) e colocadas em um agitador orbital a 28°C

e 160 rpm.

As suspensões celulares contendo 2x106 UFC.mL-1, foram então tratadas

com extratos dos frutos diluídos em água na proporção de 1:4 (extrato:água) e

incubados por 1 hora a 28°C sob agitação no escuro. As células foram centrifugadas

(2000.g, 28°C por 5min) e lavadas com 0,9% (m/v) de solução de cloreto de sódio

(duas vezes). Por fim, as células foram tratadas com solução de água oxigenada

50mM por uma hora a 28°C. As amostras foram diluídas em uma solução de cloreto

de sódio (0,9% m/v), semeadas em meio de cultura completo YPD e incubadas a

28ºC por 48 horas.

Após o período de incubação, as colônias foram contadas e determinados os

percentuais de sobrevivência celular utilizando como referência as placas teste,

onde o número total de colônias observadas na placa controle (sem tratamento)

foram consideradas como 100% de sobrevivência celular.

3.10 Atividade antiproliferativa frente a células tumorais

O efeito antiproliferativo dos extratos dos frutos foi testado em células de

adenocarcinoma de cólon humano (Caco-2), enquanto uma linhagem de fibroblastos

embrionários de ratos (3T3) foi utilizada como controle. Meio RPMI 1640 contendo

soro fetal bovino (20% v/v) na presença de antibióticos (100U.mL-1 de penicilina G,

100µg.mL-1 de estreptomicina) foi usado para a cultura de células (5 x

105mL/células). As linhagens celulares foram colocadas em placas de microcultura

contendo 96 cavidades, depositando 100µL por poço mantendo durante 24 horas a

37°C em atmosfera contendo 95% de O2, 5% de CO2 e 100% de umidade relativa.

Após a incubação, o meio foi removido de cada poço deixando as células na parte

inferior. As células foram então expostas à novo meio contendo 80µg.mL-1 de

extrato. Depois da incubação por 48 horas, as celulas foram fixadas por adição de

31

ácido tricloroacético (50% m/v) e, em seguida, colocadas a 4°C durante 1h. Um

ensaio colorimétrico foi realizado adicionando solução de sulforrodamina B (0,4%

m/v) em água acidificada (ácido acético 1% v/v) em cada um dos poços. Após 30min

à temperatura ambiente, a solução não fixada foi descartada pela lavagem com

água acidificada. O corante fixado às proteínas celulares foi ressolubilizado

utilizando tampão Tris 10mM (pH 10,0), sob agitação orbital de 50 rpm, à

temperatura ambiente, durante 5 min. As leituras de densidade ópticas foram

realizados num leitor espectrofotométrico de placas de ELISA a 540 nm. Os dados

de absorbância foram correlacionados com a curva padrão de células viáveis e os

resultados foram expressos em porcentagem de sobrevivência celular comparado ao

tratamento controle composto de células cultivadas em meio RPMI 1640.

3.11 Desenho experimental e análise estatística

O trabalho foi constituído da análise descritiva de 6 genótipos (3 plantas por

genótipo), em 6 anos (2008, 2009, 2010, 2011, 2012 e 2013), com 3 colheitas de

frutos por planta em cada ano. As análises foram realizadas em triplicata. Os

resultados foram avaliados por ANOVA e a comparação de médias pelo teste de

Tukey ao nível de 5% de probabilidade utilizando-se o software Statistica v.7.1

(Statsoft, 2005).

32

4 Resultados

Do conjunto de variáveis independentes (seis genótipos e seis safras) em

estudo, o fator genótipo interferiu em todas as variáveis dependentes avaliadas

(sólidos solúveis totais, pH, teores de ácido L-ascórbico, antocianinas, carotenóides,

taninos e compostos fenólicos totais). Dentro desse fator, três genótipos são

produtores de frutos vermelhos (AR9, AR19 e AR29) e três produtores de frutos

amarelos (AR27, AR46 e AR72). De modo geral, essa diferença entre os dois grupos

se relacionou com as variáveis pH, teores de antocianinas e compostos fenólicos

totais. Em relação às safras, houve efeito sobre as variáveis dependentes, exceto

pH e taninos totais.

O teor de sólidos solúveis totais (SST) dos frutos de araçá, como esperado e

citado anteriormente, foi influenciado pelas duas variáveis independentes da

pesquisa: genótipos e safras, variando entre 6,43 e 13,30°Brix. Mais

detalhadamente, os genótipos AR19 e AR46 foram os que apresentaram o maior

teor de SST nas seis safras analisadas. Em contraste, os frutos do genótipo AR72

apresentaram os menores teores de SST em todas as safras, diferindo

significativamente dos demais. Quando comparadas as safras, em média, em 2012

se obteve a colheita de frutos com maiores teores de SST (Tabela 1).

Tabela 1. Teor de sólidos solúveis totais (°Brix a 20°C) de frutos de araçás vermelhos (AR 9,

AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 9,73 ± 0,50 cB 9,33 ± 0,29 dB 10,03 ± 0,45 bB 11,03 ± 0,1 bA 10,07 ± 0,23 dAB 10,03 ± 0,38 bB

AR 19 12,00 ± 0,20 aABC 11,87 ± 0,40 aBC 11,50 ± 0,50 aCD 12,53 ± 0,06 aAB 12,70 ± 0,10 bA 10,90 ± 0,10 abD

AR 29 9,73 ± 0,12 cC 9,80 ± 0,20 cdC 10,10 ± 0,26 bBC 11,57 ± 0,40 bA 12,13 ± 0,15 cA 10,70 ± 0,26 abB

AR 27 9,60 ± 0,40 cC 10,17 ± 0,29 bcC 10,10 ± 0,26 bC 11,60 ± 0,36 bAB 12,23 ± 0,21 cA 10,97 ± 0,06 aB

AR 46 10,60 ± 0,10 bC 10,70 ± 0,10 bC 12,20 ± 0,36 aB 12,70 ± 0,26 aAB 13,30 ± 0,17 aA 10,87 ± 0,64 abC

AR 72 6,43 ± 0,12 dB 6,77 ± 0,25 eB 6,83 ± 0,35 cB 7,97 ± 0,06 cA 8,23 ± 0,06 eA 6,77 ± 0,25 cB

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de

Tukey, ao nível de 5% de probabilidade.

33

Quando se mensurou o pH, verificou-se que, diferentemente do teor de SST,

o ano agrícola não teve efeito sobre essa característica. No entanto, genótipos de

araçá vermelhos e amarelos apresentaram diferença significativa entre si, com

destaque para uma menor acidez nos frutos de coloração amarela (Tabela 2).

Tabela 2. pH de frutos de araçás vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR

46, AR 72) das safras de 2008 a 2013.

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 3,23 ± 0,06 bcA 3,13 ± 0,06 bA 3,20 ± 0,10 bA 3,20 ± 0,10 bA 3,20 ± 0,10 bA 3,17 ± 0,23 bA

AR 19 3,37 ± 0,06 bA 3,37 ± 0,06 bA 3,33 ± 0,06 bA 3,30 ± 0,10 bA 3,33 ± 0,06 bA 3,33 ± 0,06 bA

AR 29 3,00 ± 0,10 cA 3,10 ± 0,10 bA 3,10 ± 0,10 bA 3,10 ± 0,10 bA 3,10 ± 0,10 bA 3,10 ± 0,10 bA

AR 27 3,70 ± 0,10 aA 3,73 ± 0,15 aA 3,70 ± 0,10 aA 3,73 ± 0,15 aA 3,73 ± 0,15 aA 3,73 ± 0,15 aA

AR 46 3,83 ± 0,06 aA 3,93 ± 0,06aA 3,83 ± 0,15 aA 3,83 ± 0,06 aA 3,87 ± 0,06 aA 4,00 ± 0,10 aA

AR 72 3,80 ± 0,20 aA 3,80 ± 0,20 aA 3,90 ± 0,10 aA 3,87 ± 0,06 aA 3,77 ± 0,21 aA 3,83 ± 0,06 aA



Para o ácido L-ascórbico dos frutos de araçá, tanto o genótipo quanto a

safra influenciaram o teor desse composto (Tabela 3). O genótipo AR46 apresentou

teor de ácido L-ascórbico significativamente superior aos demais em todas as safras,

atingindo valor máximo de 11mg.100g-1 fruto nos anos de 2011 e 2012. Relativo à

influência das safras, apenas os genótipos AR9 e AR46, respectivamente, com os

menores e maiores teores de ácido L-ascóbrico não diferiram significativamente ao

longo dos anos, indicando que se trata de um composto cujo acúmulo é dependente

desse fator interferente (safra).

O teor de antocianinas totais dos frutos foi afetado pelas variáveis genótipo e

safra. Os teores desses pigmentos foram significativamente maiores nos genótipos

de araçá de coloração vermelha, em todas as safras, atingindo valor máximo de

6,33mg cianidina-3-glicosídeo.100g-1 fruto na safra 2012, enquanto nos genótipos de

coloração amarela, os valores variaram entre 0,53 (AR72) e 1,33mg cianidina-3-

glicosídeo.100 g-1 fruto (AR27). No que concerne ao efeito safra, somente os

genótipos AR27 e AR46, não apresentaram alteração no teor de antocianinas totais

em relação a esse fator (Tabela 4).

34

Tabela 3. Teor de ácido L-ascórbico (mg.100g-1) de frutos de araçás vermelhos (AR 9, AR

19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 0,23 ± 0,06 cA 0,27 ± 0,06 cA 0,20 ± 0,10 cA 0,37 ± 0,06 cA 0,33 ± 0,15 cA 0,13 ± 0,06 cA

AR 19 0,47 ± 0,06 cD 0,53 ± 0,06 cBCD 0,80 ± 0,10 cABC 0,83 ± 0,21 cAB 1,00 ± 0,10 cA 0,50 ± 0,10 cCD

AR 29 0,17 ± 0,06 cA 0,20 ± 0,10 cC 0,40 ± 0,10 cAB 0,43 ± 0,06 cAB 0,50 ± 0,00 cA 0,30 ± 0,00 cBC

AR 27 0,33 ± 0,15 cB 0,30 ± 0,00 cB 0,47 ± 0,15 cB 0,53 ± 0,06 cAB 0,77 ± 0,06 cA 0,40 ± 0,10 cB

AR 46 8,00 ± 1,00 aA 8,67 ± 0,58 aA 9,67 ± 0,58 aA 11,00 ± 1,00 aA 11,00 ± 1,00 aA 9,00 ± 2,00 aA

AR 72 4,33 ± 0,58 bB 4,33 ± 1,53 bB 7,33 ± 1,53 bAB 8,00 ± 0,00 bA 8,00 ± 0,00 bA 5,33 ± 1,53 bAB



Tabela 4. Teor de antocianinas totais (mg cianidina-3-glicosídeo.100g-1) de frutos de araçás

vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a

2013

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 3,00 ± 0,00bB 3,33 ± 0,58 bB 4,00 ± 0,00 bAB 5,00 ± 1,0 aA 4,33 ± 0,58 bAB 4,00 ± 0,00 abAB

AR 19 4,33 ± 0,58 aB 5,00 ± 0,00 aAB 6,00 ± 1,0 aAB 5,67 ± 0,58 aAB 6,33 ± 0,58 aA 4,67 ± 0,58 aAB

AR 29 3,00 ± 0,00 bAB 2,33 ± 0,58 cB 4,00 ± 1,0 bAB 4,00 ± 1,0 aAB 5,00 ± 1,0 abA 3,33 ± 0,58 bAB

AR 27 0,80 ± 0,26 cA 0,80 ± 0,10 dA 1,07 ± 0,12 cA 1,33 ± 0,15 bA 1,33 ± 0,29 cA 1,07 ± 0,21 cA

AR 46 0,87 ± 0,06 cA 0,93 ± 0,25 dA 0,87 ± 0,21 cA 1,23 ± 0,06 bA 1,07 ± 0,11 cA 0,90 ± 0,10 cA

AR 72 0,53 ± 0,15 cB 0,57 ± 0,06 dB 0,70 ± 0,10 cAB 0,67 ± 0,21 bAB 0,93 ± 0,11 cA 0,60 ± 0,10 cAB



Ao se analisar o teor total de carotenoides nos frutos de araçá verificou-se

que o mesmo sofreu influência principalmente do genótipo. Somente o genótipo

AR46 foi afetado pela safra. Os genótipos de araçá apresentaram teores de

carotenoides totais significativamente distintos em cada safra, porém, não houve

uma clara diferenciação entre frutos de coloração vermelha e amarela, tampouco

uma safra destaque, com frutos com altos teores, quando comparado esse fator. Os

maiores teores foram determinados nos frutos do acesso AR9, que foi aquele com

35

maior média nos seis anos, atingindo 10,0µg β-caroteno.g-1 fruto na safra de 2010

(Tabela 5).

Tabela 5. Teor de carotenóides totais (µg β-caroteno. g-1) de frutos de araçás vermelhos

(AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 8,67 ± 2,08 aA 7,00 ± 2,64 aA 10,00 ± 1,0 aA 9,00 ± 1,0 aA 8,67 ± 1,15 aA 8,33 ± 1,53 aA

AR 19 6,00 ± 1,0 abA 6,67 ± 1,53 aA 7,67 ± 0,58 bA 8,00 ± 1,0 abA 7,33 ± 1,53 abA 8,00 ± 1,0 aA

AR 29 4,67 ± 0,58 bA 4,67 ± 1,15 aA 6,00 ± 1,0 bcA 6,67 ± 0,58 bcA 5,33 ± 0,58 abA 6,00 ± 1,0 abA

AR 27 8,33 ± 0,58 aA 8,67 ± 1,53 aA 7,67 ± 0,58 bA 8,33 ± 0,58 abA 8,67 ± 1,52 aA 8,00 ± 0,00 aA

AR 46 5,67 ± 0,58 abBC 5,00 ± 1,0 aC 6,00 ± 1,0 bcBC 7,33 ± 0,58 abAB 8,33 ± 0,58 aA 6,00 ± 1,0 abBC

AR 72 5,00 ±1,0 bA 5,67 ± 0,58 aA 4,33 ± 0,58 cA 5,00 ± 0,00 cA 4,33 ± 1,53 bA 4,67 ± 0,58 bA



O teor de taninos totais também foi influenciado apenas pela variável

genótipo em estudo. Os genótipos AR19 e AR29, de coloração vermelha,

apresentaram teores de taninos totais significativamente superior aos outros

genótipos, em cada uma das safras, com valores máximos de 398,5mg.100g-1fruto

(2009) e 412,5mg.100g-1fruto (2013), respectivamente. Os genótipos de coloração

amarela, AR27 e AR72, também diferiram dos demais, em cada ano, porém

apresentaram menores teores, 138,5 e 117 mg.100g-1fruto, respectivamente (Tabela

6).

36

Tabela 6. Teor de taninos totais (mg. 100g-1) de frutos de araçás vermelhos (AR 9, AR 19,

AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a 2013

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 301,00 ± 4,24 bA 283,50 ± 7,78bA 293,50 ± 10,61bA 292,00 ± 4,24bA 285,50 ± 0,71bA 280,50 ± 2,12bA

AR 19 398,50 ± 3,53 aA 392,00 ± 9,90 aA 382,00 ± 4,24 aA 388,50 ± 0,71 aA 394,50 ± 9,19 aA 376,00 ± 12,73 aA

AR 29 399,50 ± 2,12 aA 398,50 ± 17,68 aA 407,50 ± 6,36 aA 404,50 ± 14,85 aA 403,00 ± 12,73 aA 412,50 ± 13,43 aA

AR 27 140,00 ± 7,07 cA 138,50 ± 4,95 cA 147,50 ± 3,53 cA 149,00 ± 4,24 cA 145,50 ± 9,19 cA 141,00 ± 1,41 cA

AR 46 295,00 ± 8,48bA 300,00 ± 15,56bA 308,00 ± 18,38bA 307,00 ± 2,82bA 302,50 ± 19,09bA 297,00 ± 5,66bA

AR 72 122,00 ± 5,66 cA 133,00 ± 1,41 cA 129,50 ± 2,12 cA 124,50 ± 0,71 cA 130,50 ± 6,36 cA 117,00 ± 4,24 cA



Os compostos fenólicos dos frutos de araçá variaram significativamente entre

os genótipos, em uma mesma safra, observando-se nítida diferença entre frutos

vermelhos e amarelos. Também houve variação entre safras no teor de compostos

fenólicos dos frutos. Em todos os anos, os genótipos de coloração vermelha

apresentaram teor total de compostos fenólicos significativamente maiores que os

genótipos amarelos, variando de 606,67 (AR9/ 2008) a 689,67mg GAE.100g-1 fruto

(AR29/ 2012). Nas safras de 2010, 2011 e 2012 obteve-se frutos com teores de

compostos fenólicos totais significativamente superiores que aqueles observados

nas outras safras, em todos os acessos (Tabela 7).

Tabela 7. Teor de compostos fenólicos totais (mg GAE.100g-1) de frutos de araçás

vermelhos (AR 9, AR 19, AR 29) e amarelos (AR 27, AR 46, AR 72) das safras de 2008 a

2013

Genótipos

Safras

2008 2009 2010 2011 2012 2013

AR 9 606,67 ± 15,27 bB 625,67 ± 12,0,9 bB 671,067 ± 11,01 aA 682,67 ± 13,61 aA 678,67 ± 2,0 aA 637,00 ± 14,11 aB

AR 19 648,00 ± 6,08 aB 642,33 ± 3,78 abB 680,00 ± 4,36 aA 675,33 ± 11,37 aA 678,67 ± 2,08 aA 640,33 ± 7,23 aB

AR 29 651,67 ± 5,77 aBC 660,00 ± 5,20 aB 688,67 ± 10,02 aA 684,67 ±6,66 aA 689,67 ± 2,08 aA 642,00 ± 3,61 aC

AR 27 505,67 ± 4,73 cB 519,67 ± 18,23 cB 577,67 ± 10,02 bA 581,00 ± 5,00 bA 573,33 ± 21,94 bA 512,33 ± 11,50 bB

AR 46 495,00 ± 7,94 cB 507,00 ± 13,08 cB 533,33 ± 0,58 cA 541,33 ± 4,73 cA 550,67 ± 3,79 bA 508,00 ± 10,44 bB

AR 72 415,33 ± 6,66 dC 422,67 ± 2,08 dBC 429,33 ± 5,13 dBC 441,00 ± 13,08 dAB 453,67 ± 2,08 cA 414,67 ± 6,43 cC



37

Os compostos fenólicos encontrados nos frutos de araçá foram: epicatequina,

ácido p-cumárico, ácido gálico, ácido ferúlico e, em alguns frutos, quercetina (Figura

8). A epicatequina foi a molécula fenólica mais abundante presente nos frutos,

seguida do ácido gálico, em todas os genótipos. Os genótipos AR9, AR27 e AR72

foram os que apresentaram os maiores teores de epicatequina em todas as safras.

De modo geral, ao longo das safras, os maiores teores de ácido gálico foram

detectados nos frutos AR27 e AR72. Em contrapartida, a quercetina não foi

detectada em alguns genótipos durante algumas safras. Em 2009, a quercetina foi

detectada apenas no genótipo AR27.

38

Figura 8. Teor de compostos fenólicos totais (A), epicatequina (B), ácido gálico (C), ácido

cumárico (D), ácido ferúlico (E) e quercetina (F) (mg.100g-1 fruto) de genótipos de araçás

vermelhos (AR9, AR19 e AR29) e amarelos (AR27, AR46 e AR72) em seis safras (2008 a

2013).

39

A capacidade antioxidante in vivo dos extratos foi avaliada comparando-se os

níveis de sobrevivência da levedura S. cereviseae tratada com peróxido de

hidrogênio (controle) e com os extratos de araçá e esse agente estressor. Houve

diferença estatística em relação ao controle negativo e os extratos testados (Tabela

8). De uma forma geral, os genótipos de coloração avermelhada proporcionaram as

maiores taxas de sobrevivência celular, acima de 80%.

Tabela 8. Atividade antioxidante de extratos de extratos aquosos de araçás vermelhos (AR9, AR19 e AR29) e amarelos (AR27, AR46 e AR72) sobre S. cereviseae XV 185-14C (valores médios correspondentes às safras de 2008 a 2013)

Tratamentos Sobrevivência (%)

Controle positivo (água) 100,00 a

Controle negativo (H2O2 50mM) 42,60 d

AR9 + H2O2 50mM 85,83 b

AR19 + H2O2 50mM 86,00 b

AR29 + H2O2 50mM 82,33 bc

AR27 + H2O2 50mM 79,67 c

AR46 + H2O2 50mM 80,83 bc

AR72 + H2O2 50mM 81,50 bc

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

A proliferação de células Caco-2 foi significativamente reduzida por todos os

extratos. O tratamento de células de fibroblastos (3T3) com cada um dos extratos

não afetou as taxas de sobrevivência, confirmando as respostas obtidas com as

células Caco-2. Os genótipos de coloração amarela demonstraram menor atividade

antiproliferativa frente as células Caco-2, uma vez que essas células apresentaram

as maiores taxas de sobrevivência, embora não diferente significativamente dos

genótipos vermelhos (Tabela 9).

40

Tabela 9. Atividade antiproliferativa de extratos aquosos de araçás vermelhos (AR9, AR19

e AR29) e amarelos (AR27, AR46 e AR72) sobre células de fibroblastos embrionários (3T3) e adenocarcinoma de cólon humano (Caco-2) (valores médios correspondentes às safras de 2008 a 2013)

Genótipo Sobrevivência (%)

3T3 Caco-2

Controle 98,00 a 98,00 a

AR9 96,50 ab 47,67 b

AR19 95,67 ab 48,17 b

AR29 93,50 bc 47,17 b

AR27 95,00 abc 51,00 b

AR46 92,33 c 49,67 b

AR72 94,67 bc 48,83 b

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

41

5 Discussão

Os frutos avaliados apresentaram teores de sólidos solúveis totais (SST)

variando entre 6,43 e 13,3°Brix, o que os caracteriza como frutos de médio-baixo

potencial nesse quesito. O teor de SST é característica de interesse para o consumo

in natura dos frutos, uma vez que incluem importantes compostos responsáveis pelo

sabor e pela conseqüente aceitação por parte dos consumidores, como os açúcares

e os ácidos orgânicos. Além disso, é característica importante também para o

processamento industrial, visto que elevados teores na matéria-prima implicam em

maior rendimento industrial do fruto, pois se reduz a adição de açúcares, o tempo de

evaporação de água, o gasto de energia, resultando em maior economia no

processamento (DIAS et al., 2011). O teor de SST foi mais influenciado pelo

genótipo do que pela safra, embora nos anos 2011 e 2012 tenha se obtido frutos

com maiores concentrações de SST. No que tange aos genótipos, o que apresenta

maior potencial para produção de frutos mais ricos em SST, é o AR19, com SST

médio de 11,91°Brix. Em contraste, o que tem o menor potencial de acúmulo de

SST, é o AR72.

Em relação ao pH, não houve efeitos marcantes das safras sobre essa

variável. As diferenças ocorreram somente entre genótipos, variando entre 3,00 e

4,00. O acesso mais ácido é o AR29 e o menos ácido é o AR46. O pH é outra

variável importante para a indústria de alimentos, principalmente no que diz respeito

ao tempo e tipo de tratamento térmico a ser aplicado, visando a eliminação de bactérias

patogênicas. Produtos de frutas com pH<4,5 não necessitam de tratamentos térmicos

sob pressão, como a esterilização e a acidez elevada reduz a ação de micro-organismos

deteriorantes e minimiza a adição de conservantes (ORDOÑEZ, 2005).

Ao se analisar o teor de ácido L-ascórbico, verifica-se que o araçá é um fruto

relativamente pobre nessa vitamina, ao compará-lo com frutos reconhecidamente

ricos em ácido L-ascórbico como a acerola (Malpighia emarginata) (1357 mg.100g-1)

e o camu-camu (Myrciaria dubia) (1882 mg.100g-1), frutíferas nativas do bioma

amazônico (RUFINO et al., 2010) e também quando comparado com outras

espécies nativas da região Sul do Brasil como a guabiroba (Campomanesia

xanthocarpa O. Berg) que, de acordo com Pereira et al. (2012) contém cerca de

3050mg de ácido L-ascórbico em cada 100g de fruto fresco.

42

De fato, pode ocorrer ampla variação do teor de ácido ascórbico entre

genótipos e espécies (LEE e KADER, 2000). Os autores afirmam, também, que o

teor dessa molécula pode ser afetado ainda pelas condições climáticas, como

radiação solar e temperatura, bem como pelas condições de manejo do solo. Esse

conceito genérico foi parcialmente confirmado neste estudo, no qual se validou a

significativa variação dos teores de ácido L-ascórbico entre genótipos. Quando se

avaliam as variações entre safras observa-se diferença em quatro genótipos (AR19,

AR29, AR27 e AR72), com os maiores teores nos anos de 2011 e 2012. No entanto,

ao analisar os dados climatológicos (Anexos A, B e C), não se verifica grande

variabilidade na temperatura média, radiação e precipitação durante o período.

No que diz respeito aos teores de antocianinas, houve uma nítida

diferenciação entre frutos de coloração amarela e vermelha, o que já era esperado

uma vez que essa classe de compostos é responsável pela coloração avermelhada

de vegetais. Os teores desse pigmento foram significativamente maiores nos

genótipos de coloração vermelha, em todas as safras, atingindo valor máximo de

6,33mg cianidina-3-glicosídeo.100g-1 fruto na safra 2012, enquanto nos genótipos de

coloração amarela, os valores foram inferiores a 1,33mg cianidina-3-glicosídeo.100

g-1 fruto (AR27). Embora os genótipos AR9, AR19 e AR29, vermelhos, tenham

apresentado teores superiores aos frutos de coloração amarela, são valores

relativamente baixos quando comparados a frutos conhecidos cientificamente pelos

altos teores de antocianinas, como a amora-preta (Rubus spp) (47,7mg de cianidina-

3-glicosídeo.100g-1fruto), o mirtilo (Vaccium ashei) (128mg de cianidina-3-

glicosídeo.100g-1fruto) (JAQUES et al, 2009), e o morango (Fragaria x ananassa

Duch.) (23,4 mg de cianidina-3-glicosídeo.100g-1fruto) (SEVERO et al., 2011). Isso

se deve ao fato de que os pigmentos antociânicos estão presentes apenas em uma

fina camada da casca no fruto de araçá, enquanto na amora-preta, mirtilo e

morango, perfazem o fruto inteiro.

O teor de carotenoides variou entre 4,33 e 10,0µg de β-caroteno.g-1 fruto,

sendo que o genótipo AR9 foi o que apresentou o maior teor entre os anos de 2010

e 2013, apesar de ter casca de coloração vermelha. Fetter et al. (2010) também

encontraram teores superiores de carotenoides em frutos vermelhos ao compará-los

com frutos de coloração amarela. Entre os frutos nativos analisados por Denardin et

al. (2015), o araçá (P. cattleianum) foi o que apresentou o maior teor de

carotenóides, 6.270µg β-caroteno.g-1 fruto, significativamente maior que a pitanga

43

laranja (Eugenia uniflora) (4,02µg β-caroteno.g-1) e o butiá (Butia eriospatha) (3,85µg

β-caroteno.g-1), frutos de polpa alaranjada. Os resultados estão de acordo com a

literatura que afirma que a composição de carotenóides nas plantas pode ser

afetada por inúmeros fatores como a variedade, a parte da planta, o grau de

maturação, condições de colheita, localização geográfica, etc.

O teor de taninos totais foi influenciado apenas pela variável genótipo. Os

frutos AR19 e AR29, de coloração vermelha, apresentaram teores de taninos totais

significativamente superior aos outros genótipos, em cada uma das safras, com

valores máximos de 398,5mg.100g-1fruto (2009) e 412,5mg.100g-1fruto (2013),

respectivamente. Os genótipos de coloração amarela, AR27 e AR72, também

diferiram dos demais, em cada ano, porém apresentaram menores teores, 138,5 e

117 mg.100g-1fruto, respectivamente. Não há, na literatura, estudos relativos ao teor

de taninos em frutos de araçá. Sabe-se que esse grupo de compostos fenólicos

contribuem para o sabor adstringente dos alimentos, sugerindo que os frutos de

coloração vermelha tenham essa percepção acentuada.

Os frutos apresentaram alto teor de compostos fenólicos totais, variando entre

414,7 e 689,67mg EAG.100g-1 fruto. Em todos os anos, os genótipos de coloração

vermelha apresentaram teor total de compostos fenólicos significativamente maiores

que os genótipos amarelos, variando de 606,67 (AR9/ 2008) a 689,67mg EAG.100g-

1 fruto (AR29/ 2012). Esses mesmos genótipos também apresentaram os maiores

teores de antocianinas e taninos totais (acima de 283,5mg.100g-1 fruto), quando

comparados aos frutos amarelos. O elevado teor dessas moléculas pode ter

contribuído para os teores de compostos fenólicos totais, visto que estes compostos

são constituídos por um grande e complexo grupo de moléculas que são

parcialmente responsáveis pela cor, adstringência, aroma e estabilidade oxidativa de

alimentos. Os compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário das

plantas e possuem grande diversidade química, logo, dentre os compostos fenólicos

bioativos pertencentes aos vegetais encontram-se estruturas variadas, como ácidos

fenólicos, taninos e flavonoides, como as antocianinas (MELLO e GUERRA, 2002;

TAIZ e ZEIGER, 2004). O teor de compostos fenólicos de araçás vermelhos

(Psidium cattleianum) e amarelos (Psidium cattleianum var. lucidum) reportados por

Biegelmeyer et al. (2011) foi similar ao demonstrado neste estudo, uma vez que os

autores também encontram maiores teores nos frutos de casca vermelha (501,33mg

EAG.100g-1).

44

Entre os compostos fenólicos individuais avaliados, os frutos apresentaram a

epicatequina, com os teores variando de 66 a 269mg.100g-1 e o ácido gálico, com

teores entre 52 e 147mg.100g-1, como moléculas majoritárias em todos os acessos

contrastando com as baixas concentrações de ácido cumárico, entre 4,0 e

25mg.100g-1, ácido ferúlico, com variação entre 1,5 a 7,5mg.100g-1 e quercetina, que

variou entre nd e 3,5mg.100g-1. Observou-se grande variabilidade tanto na

composição quanto na quantidade de compostos fenólicos entre os genótipos de

araçá e entre as safras avaliadas. Essa ampla variação pode ser explicada devido

essas moléculas serem oriundas do metabolismo secundário das plantas, como já

mencionado. Haas (2011) ressalta que não é possível atribuir uma causa específica

às diferenças de teores de compostos fenólicos entre genótipos de espécies ainda

não domesticadas, como no caso da guabiroba, caracterizada em seu estudo, e o

araçá, avaliado por Medina et. al (2011). Rufino et al (2010) observou fato

semelhante em frutos nativos de clima tropical. Denardin et al. (2015), na tentativa

de traçar o perfil de compostos fenólicos de frutos nativos, identificaram como

componentes majoritários do araçá, moléculas derivadas do ácido gálico e da

quercetina, porém, não conseguiram identificar o composto fenólico específico.

Quando avaliou-se a taxa de sobrevivência de células de S. cereviseae

frente aos danos causados pela indução de estresse oxidativo com peróxido de

hidrogênio, verificou-se a capacidade de proteção dos extratos dos frutos de araçá.

Os resultados mostraram que, conforme esperado, as células de leveduras

apresentaram sensibilidade ao peróxido de hidrogênio e, somente cerca de 42-43%

sobreviveram ao agente oxidativo. Esses resultados estão de acordo com os 46% de

sobrevivência de leveduras tratadas com H2O2 reportados por Stinco et al. (2015).

A ação dos extratos como antioxidantes aumentou significativamente os

valores de sobrevivência das leveduras tratadas com H2O2. Os genótipos de

coloração vermelha aumentaram entre 40 e 46% a taxa de sobrevivência quando

comparadas as células de leveduras expostas ao H2O2. Estes mesmos genótipos

destacaram-se nos teores de antocianinas, taninos e, conseqüentemente,

compostos fenólicos totais, corroborando com autores que afirmam que esses

compostos são capazes de proteger as células contra danos causados por

diferentes agentes estressores (DANI et al., 2008; SOARES et al., 2005; STINCO et

al., 2015). Os extratos aquosos de araçá avaliados por Medina et al. (2011) também

foram eficazes nos danos causados pelo peróxido de hidrogênio, com taxa de

45

sobrevivência de leveduras acima de 82%. Fetter et al. (2010) encontraram forte

correlação positiva entre o teor de compostos fenólicos e a atividade antioxidante in

vitro de araçá-amarelo, araçá-vermelho (P. cattleianum Sabine) e araçá-pera (P.

acutangulum D. C.).

Ao avaliar o efeito dos extratos vegetais na proliferação de células de

adenocarcinoma de cólon em humanos (Caco-2) observou-se inibição da

proliferação dessas células por todos os extratos. Nas células controle de

fibroblastos (3T3) houve morte celular, porém, a inibição de proliferação celular foi

inferior (2 a 9%) à observada nas células Caco-2, tratadas com os extratos. Os

dados demonstraram que os extratos apresentaram baixa toxicidade frente às

células 3T3, como já esperado, uma vez que essas células são comumente usadas

para se avaliar a toxicidade de compostos frente à células normais. As células

tumorais Caco-2, tratadas com os extratos de genótipos de coloração amarelada, de

uma forma geral, apresentaram as maiores taxas de sobrevivência (45 a 59%)

durante os anos, o que significa que esses extratos exerceram uma menor atividade

antiproliferativa, comparados aos genótipos de coloração vermelha. Autores

relacionam o teor de compostos fenólicos com a atividade antiproliferativa (BOIEING

et al., 2012; CHAUDARY et al., 2014; HERNANDES et al., 2014).

46

6 Considerações finais

Considerando as hipóteses formuladas neste trabalho, pode-se afirmar que:

Os genótipos de frutos de araçá estudados são portadores de elevada

variabilidade na composição fitoquímica. Os genótipos de coloração vermelha (AR9,

AR19 e AR29) apresentaram maiores teores de antocianinas e compostos fenólicos

totais. Já os genótipos AR 46 e AR72, de coloração amarela, apresentaram maiores

teores de ácido L-ascórbico.

Os frutos também apresentaram variabilidade na composição de

fitoquímicos nos diferentes anos avaliados (2008 a 2013). Apenas o teor de taninos

totais de cada genótipo não foi influenciado pelos anos agrícolas.

Os extratos dos frutos estudados aumentaram os índices de sobrevivência

das células de S. cereviseae, demonstrando um potencial de proteção das células

frente ao agente estressor.

Os extratos dos frutos inibiram a proliferação de células de adenocarcinoma

de cólon humano, demonstrando potencial ação antiproliferativa frente a células

tumorais.

Desse modo, pode-se afirmar que os genótipos avaliados têm capacidade

para exploração econômica, bem como no incentivo ao consumo de frutas devido a

sua composição fitoquímica e potenciais atividades antioxidante e antiproliferativa,

com o genótipo AR19 destacando-se dos demais.

47

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58

Apêndice

59

Influence of genotype and harvests season on the phytochemical composition 1

of araçá (Psidium cattleianum Sabine) fruit 2

3

Andréa M. Teixeira1, Fábio C. Chaves2, Rodrigo Franzon3, Cesar V. Rombaldi2* 4

5

1Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, Unidade Cachoeira do Sul, CEP 6

96508-010, Cachoeira do Sul, RS, Brazil 7

2UFPel/FAEM, Dept. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial, C.P. 354, CEP 90010-8

900, Pelotas, RS, Brazil. 9

3Embrapa Clima Temperado, BR 392, Km 78, C.P. 403, 96010-971, Pelotas,RS, 10

Brazil. 11

12

*Corresponding author. Tel: +55 53 32757284. Email address: [email protected] 13

14

ABSTRACT 15

16

L-ascorbic acid, total anthocyanins, total carotenoids, total tannins, total and 17

individual phenolics, antioxidant and antiproliferative activities with tumoral cells of 18

extracts from six araçá genotypes (AR9, AR19, AR29, AR27, AR46 and AR72) in six 19

harvests seasons (2008 - 2013) were evaluated. Results showed that, as a rule, 20

variations in phytochemical content were greater for genotype than between 21

harvests. Whereas red genotypes (AR9, AR19 and AR29) had higher anthocyanins 22

and total phenolics compounds contents, the yellow genotypes (AR46 and AR72) 23

revealed higher L-ascorbic acid content. Epicatechin was the most abundant 24

phenolic molecule in the fruits, followed by gallic acid, in all genotypes. Only SST, pH 25

and total tannins content were not affected by the agricultural years although 26

mailto:[email protected]

60

difference between harvests was less than that between genotypes. Regarding to 27

antioxidant activity with S. cereviseae XV 185-14C cells, all revealed a protecting 28

effect to the oxidant stress agent (H2O2). Similarly, all extracts inhibited the 29

proliferation of the human colon adenocarcinoma cells (Caco-2) with antiproliferative 30

activity but without cytotoxicity in the presence of fibroblast cells (3T3). Results show 31

that the genotype actually determines the greatest amplitude of variations in 32

phytochemical compounds, although harvests are relevant in the composition of 33

araçá fruit. 34

35

Keywords: araçá; Psidium cattleianum; phytochemicals; antioxidant activity; 36

antiproliferative activity; genotypes. 37

38

1 INTRODUCTION 39

40

Practically all investigations on nutrition and health demonstrate a negative 41

co-relation between the intake of grains, fruits and vegetables and the occurrence of 42

chronic-degenerative diseases (Boeing et al., 2012; Hartmann, 2007; Oliveras-López 43

et al., 2014; Poiroux-Gonordet al., 2010; Reiss et al., 2012; Tang at al., 2014). 44

Results and information from research are corroborated by adhoc studies which 45

relate cause and effect in heterologous models (in vitro and in vivo chemical 46

simulations), or by cohort studies (Dumitriu et al., 2015; Hernandes et al., 2014; 47

Medina et al., 2011; Neri-Numa et al., 2013;Stinco et al., 2015; Tang at al., 2014). 48

Cases of absence in such a co-relation are rare (Boffetta et al., 2010). 49

Health benefits which are attributed to food rich in phenolics compounds and 50

natural antioxidants have increasingly enhanced the search for new species that 51

61

comprise other complementary and relevant biological activities, such as protection 52

against deseases. In this case, Brazil has the great advantage of having a great 53

vegetal diversity and variability, even though many fruit species are either unknown 54

or only slightly used or even difficult to cultivate. 55

The greatest richness in native Brazilian fruit species may be found in the 56

Amazon region or in the savannahs. However, there are many fruit species in 57

temperate climates with high potentialities (Beskow et al., 2015; Franzon et al., 2009; 58

Hoffmann et al., 2014; Medina et al., 2011; Pereira et al., 2015; Raseira et al., 2004). 59

The araça (Psidium cattleianum Sabine) fruit, belonging to the Myrtaceae family, 60

produces small sized yellowish or reddish fruits with a attractive taste and smell 61

(Medina et al., 2011).Although there are several studies on the araça´s physical and 62

chemical composition, on its antioxidant and antimicrobial properties and on the 63

development of products from its fruit (Caldeira, et al., 2004; Luximon-Rama et al., 64

2003; Vriesmann et al., 2009), the characterization of its phytochemicals in 65

successive harvest has never been researched. It is a hotly debated issue (Latocha 66

et al., 2011; Lima et al., 2011; Stinco et al., 2015) that must be solved since 67

variations in the fruit´s composition due to the agricultural year are well-known. Since 68

the generic characterization of the araça and its phytochemical compounds are 69

common knowledge, it is highly important to investigate its variability according to the 70

year of production. 71

In this study were investigated the changes in the phytochemical compounds 72

contents in six genotypes of araçá between 2008 and 2013, its antioxidant activity 73

with yeasts and its antiproliferative activity in the presence of tumor cells. 74

75

62

2 MATERIALS AND METHODS 76

77

2.1 Plant material 78

79

Mature fruits of the araçá shrub (P. cattleianumSabine), red (genotypes AR9, 80

AR19 and AR29) and yellow (genotypes AR27, AR46 and AR72), were harvested 81

from the collection of EmbrapaTemperate Climate Unit in Pelotas RS Brazil. There is 82

an annual harvest of 1 kg (four harvests) of fruits from each plant (three plants from 83

each genotype) during the 2008 - 2013 harvests. The fruits were frozen in liquid 84

nitrogen and stored at -80°C till analysis in each year. All analyses were performed in 85

triplicate, six months after harvest. 86

87

2.2 Physical and chemical composition: soluble solids, pH, L-ascorbic acid, 88

total anthocyanins, total carotenoids, total tannins, total and individual 89

phenolic compounds. 90

91

The concentration of soluble solids (SS) was determined by a refractometer 92

directly on the juice of the thawed sample, with results given in degrees Brix (°Brix). 93

pH was measured directly by a digital pH-meter in juice, also used for measuring SS. 94

The L-ascorbic acid content was determined by high performance liquid 95

chromatography (HPLC), following Vinci et al. (1995) with HPLC-Shimadzu, with 96

reverse phase RP-18 CLC-ODS (4.6mm x 150mm x 5µm), locked to a UV detector 97

visible at 254nm, with automatic injector. Chromatograph conditions were exactly 98

similar to those used by Medina et al. (2011). Quantification was undertaken by 99

comparing retention times for the external standard of L-ascorbic acid. Mean 100

63

recovery index (RI) was 92.25% and results were expressed in milligrams of L-101

ascorbic acid per 100g of fresh fruit. 102

Total anthocyanins content was determined by spectrophotometry, following 103

method by Lees and Francis (1972), modified. Pigments were extracted by adding 104

25mL acidified ethanol (HCl pH 1.0) to 1g of ground fruit and the solution kept at rest 105

for 1 h, in the dark, and homogenized every 5 min. The mixture was then filtered and 106

the 50mL were completed with acidified ethanol. Absorbance was read on a 107

spectrophotometer UV/Vis Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech) at 520nm wave 108

length. Results were expressed in milligrams of cyanidin-3-glucoside per 100g of 109

fresh fruit. 110

The carotenoids content was determined by spectrophotometry, following 111

method by Rodriguez-Amaya (2001). Five grams of fruit were ground with celite, to 112

which were added 20 mL of cold acetone (4°C) for the extraction of pigments and 113

homogenized for approximately 10 min. The sample was vacuum-filtered and the 114

residue was extracted for twice as much. Filters were transferred to a separation 115

funnel and petroleum ether and distilled water were added. The lower phase was 116

discarded and then washed with distilled water till the total removal of acetone. 117

Reading of absorbance of ether extract was performed in a spectrophotometer 118

UV/Vis Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech) at 450nm wave length. Results were 119

expressed in microgram of β-carotene per gram of fresh fruit. 120

Total tannins content was determined by spectrophotometry,according to 121

method by Gu et al. (2008). Compounds were extracted by adding 10mL of methanol 122

to 5 g of the sample, stirred for 1 h at room temperature, and filtered. Tannin rates 123

were determined by adding 300µL of the reagent Folin-Denis to 100µL of the extract; 124

after 3 minutes,a water solution saturated with sodium carbonate was added. The 125

64

solution was left at rest, in the dark, at room temperature, for 1 h. Samples´ 126

absorbance was read by spectrophotometer UV/Vis Ultrospec 2000 (Pharmacia 127

Biotech) at 760nm wave length. Results were expressed in milligrams per 100g of 128

fresh fruit. 129

Phenolic compounds were extracted following method by Medina et al. (2011) 130

and concentration was determined by spectrophotometry following Folin-Ciocalteau 131

(Singleton, et al., 1999), modified by Dewanto et al. (2002) and optimized for araçá 132

by Medina et al. (2011). Reading of the samples absorbance was performed by 133

spectrophotometer UV/Vis Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech), at 760nm wave 134

length. Results were expressed in milligrams of gallic acid equivalent (GAE) per 100g 135

of fresh fruit. 136

Individual phenolic compounds were determined by high performance liquid 137

chromatography (HPLC), following method by Hakkinen and Torronen (2000), with 138

slight modifications. The phenolic compounds were extracted and hydrolyzed with 139

35mL acidified methanol (HCl, 15% v/v). Extract was homogenized at 35°C, in the 140

dark, for 24h, filtered in cotton and the supernatant concentrated in a rotation 141

evaporator at 40°C for 20 minutes. The concentrated residue was re-dissolved in 142

methanol up to a final volume of 10mL and centrifuged (7000 gfor 10min). A 30 µL 143

aliquot from the supernatant was injected in the HPLC chromatograph coupled to an 144

automatic injector, UV-VIS detector at 280nm, reverse phase column RP-18 CLC-145

ODS (4.6mm x 150mm x 5µm) and CLC-GODS guard column (4mm x 200mm x 146

5µm). The movable phase comprised an elution gradient with a solution of acetic acid 147

in water (99:1) (solvent A) and methanol (solvent B), at a flow of 0.9mL.min-1, starting 148

with 100% of A, gradually changing up to 60% of A and 40% B, in 25 min. The 149

proportion was maintained constant for 2 minutes and then gradually changed up to 150

65

95% of A and 5% of B, at 37 minutes, and maintained constant for a further 5 151

minutes. The initial phase was resumed with total running time of 45 minutes, 152

following optimization by Medina et al. (2011). Individual phenolic compounds were 153

identified by comparing retention time and quantified by calibration curve of the 154

external standards of gallic acid (IR 87.56%), p-coumaric acid (IR 92.34%), ferulic 155

acid (IR 103.87%), quercetin (IR 93.25%) and epicatechin (IR 90.08%). Results were 156

expressed in milligrams of the respective phenolic compound per 100 grams of fresh 157

fruit. 158

159

2.3 In vivo antioxidant activity 160

161

In vivo antioxidant activity was determined following methodology by Soares 162

et al. (2005), with eukaryotic cells of Sacchoromyces XV 185-14C yeasts. The strain 163

was kept in Yeast Peptone Dextrose (YPD) solid medium with 1% (m/v) yeast 164

extract, 2% (m/v) peptone, 2% (m/v) glucose and 2% (m/v) agar. Cells were 165

transferred to a liquid medium (with the same composition of solid media without 166

agar) and placed in an orbital stirrer at 28°C and at 160 rpm. Cell suspensions with 167

2x106CFU.mL-1 were treated with extracts diluted in water at 1:4 (extract:water) and 168

incubated for 1 h at 28°C while stirring in the dark. Dilutions occurred due to the 169

greater non-cytotoxic concentration in the previous assays. Cells were centrifuged 170

(2000.g, 28°C for 5min), washed twice with 0.9% (m/v) sodium chloride solution 171

(twice). Cells were then treated with a solution of oxygenated water 50mM, for 1 h, at 172

28°C. The samples were diluted in a solution of sodium chloride (0.9% m/v), seeded 173

in a complete YPD medium and incubated at 28ºC for 48 h. After incubation, the 174

colonies were counted and survival percentages determined. Test plates were taken 175

66

as reference, in which the total number of colonies in the control plate (without 176

treatment) had a 100% cell survival. 177

178

2.4 Antiproliferative activity with tumoral cells 179

180

The antiproliferative effect of extracts was tested in human colon 181

adenocarcinoma cells (Caco-2), whereas a strain of rats´ embryo fibroblasts (3T3) 182

was the control. RPMI 1640medium, with bovine fetal serum (20% v/v) and antibiotics 183

(100U.mL-1penicillin G, 100µg.mL-1streptomycin) was used for cell culture (5 x 184

105mL/cells). Cell strains were placed in 96-well microculture plates, with 100µL per 185

well, for 24 h, at 37°C in an atmosphere with 95% O2, 5% CO2and 100% relative 186

humidity. After incubation, medium was removed from each well, with cells kept in the 187

lower section. Cells were exposed to a new medium with 80µg.mL-1 extract. After 48-188

h incubation, the cells were fixed by adding trichloroacetic acid (50% m/v) and kept at 189

4°C for 1h. The colorimetric assay was performed by adding a solution of 190

sulforhodamine B (0.4% m/v) in acidified water (acetic acid1% v/v) in each well. After 191

30minat room temperature, the non-fixed solution was removed by washing with 192

acidified water. Stain fixed to cell proteins was re-solubilized with Tris10mM(pH10.0) 193

buffer, with orbital stirrer at 50rpm, at room temperature, for 5 min. Optical density 194

was read by ELISA plate spectrophotometric reader at 540nm. Absorbance data 195

were co-related with standard curve of viable cells and results were given in cell 196

survival percentage compared to control treatment with cells cultivated in RPMI 1640 197

medium. 198

199

200

67

2.5 Experimental design and statistical analysis 201

202

Assay comprised a descriptive analysis of 6 genotypes (3 plants per 203

genotype) during 6 years (2008, 2009, 2010, 2011, 2012 and 2013), with three fruit 204

harvests per plant in each year. Technical analyses were performed in triplicate. 205

Results were evaluated by ANOVA and averages compared by Tukey´s test at 5% 206

probability, with Statistica v.7.1 (Statsoft, 2005). 207

208

3 RESULTS AND DISCUSSION 209

210

3.1 Effect of genotype and harvest on the phytochemical composition of 211

araçá fruit 212

213

The factor genotype affected all the evaluated dependent variables (total 214

soluble solids, pH, L-ascorbic acid rates, anthocyanins, carotenoids, tannins and total 215

phenolic compounds) within the set of independent variables (6 genotypes and 6 216

harvests) under analysis (Table 1). Three of these genotypes produce red fruits 217

(AR9, AR19 and AR29) and 3 produce yellow ones (AR27, AR46 and AR72). In 218

general, difference between the two groups was related to the variables pH, 219

anthocyanin content and total phenolic compounds. 220

Soluble solids (SS) and pH varied only because of the genotypes (Table 2). 221

Harvest failed to affect these variables. The poorer fruits in SS were AR72 (7.17) and 222

those richest in SS were AR19 (11.91°Brix. Fruits with lower pH were AR29 (3.08) 223

and those with the highest pH were AR46 (3.88). The above rates characterize the 224

araçá as a fruit with relatively low SS and acids. 225

68

Genotype and harvest season affected the L-ascorbic acid content in araçá 226

fruits (Figure 1A). Genotype AR46 showed L-ascorbic acid content significantly 227

higher than that of the others, in all harvests seasons, with maximum 11mg.100g -1 228

fruit in 2011 and 2012. L-ascorbic acid content revealed the araçá as poor in this 229

molecule when compared to other fruits rich in L-ascorbic acid, such as the acerola 230

(1357 mg.100g-1) and camu-camu (1882 mg.100g-1), native fruits to the Amazon 231

biome (Rufino et al., 2010) and when compared to other native species to the 232

southern region of Brazil, such as the guabiroba (Pereira et al., 2012) or the jelly 233

palm (Denardin et al., 2015) with approximately 3050 and 9351mg of L-ascorbic acid 234

per 100g of fresh fruit, respectively. Lee and Kader (2000) report a wide variation of 235

ascorbic acid between genotype and species. The authors also insist that the content 236

of this molecule may also be affected by climate, such as solar radiation and 237

temperature, and by soil conditions. Current analysis partially corroborated variations 238

in concentrations of L-ascorbic acid between genotypes and even between harvests. 239

There was a sharp difference in anthocyanin contents between red and 240

yellow fruits (Figure 1B). This fact was expected since this compound class causes 241

the red coloration of vegetal groups. Molecule contents were significantly higher in 242

red color genotypes in all harvests, with maximum 6.33mg cyanidin-3-243

glucoside.100g-1 fruit for the 2012 harvest, whereas the content were lower than 244

1.33mg cyanidin-3-glucoside.100 g-1 fruit (AR27) in yellow-colored genotypes. 245

Although red genotypes AR9, AR19 and AR29 had higher contents than those in 246

yellow-colored fruits, were relatively low when compared to fruit scientifically 247

renowned for their high anthocyanin rates, such as the blackberry (47.7mg cyanidin-248

3-glucoside100g-1fruit), blueberry (128mg cyanidin-3-glucoside100g-1fruit) (Jaques et 249

al., 2009) and the strawberry (23.4 mg cyanidin-3-glucoside.100g-1fruit) (Severo et 250

69

al., 2011). The above is due to the fact that anthocyanin pigments occur only in the 251

thin layer of fruit peel in the araçá, whereas it involves the whole fruit in the 252

blackberry, blueberry and strawberry. 253

Analysis of total carotenoid content in araçá fruit showed that it was mainly 254

affected by genotype (Figure 1C). Only genotype AR46 was affected by the harvest 255

season. Although araçá genotypes had significantly different total carotenoid rates in 256

each harvest, varying between 4.33 and 10.0µg β-carotene.g-1, there was no sharp 257

distinction between red and yellow-colored fruits. Higher contents occurred in the 258

fruits of AR9, with 10.0µg β-carotene.g-1 fruit in the 2010 harvest even though its red 259

fruit peel. Fetter et al. (2010) also reported higher carotenoid rates in red fruits when 260

compared to those of yellow ones. Among the fruits analyzed by Denardin et al. 261

(2015), the araçá proved to have the highest carotenoid content, 6.270µg β-262

carotene.g-1 fruit, significantly higher than the orange Brazilian cherry (4.02µg β-263

carotene.g-1) and the jelly palm (3.85µg β-carotene.g-1), with orange-colored pulp. 264

Results confirm the literature which reports that the composition of carotenoids in 265

plants may be influenced by several factors, such as variety, plant´s part, ripeness 266

stage, harvest conditions, geographic location and others. 267

Total tannins was influenced only by the genotype (Figure 1D). The red-268

colored fruits AR19 and AR29 had total tannin content significantly higher than those 269

of the other genotypes, in each harvest, with maximum rates 398.5mg.100g-1fruit 270

(2009) and 412.5mg.100g-1fruit (2013), respectively. The yellow-colored genotypes, 271

AR27 and AR72, also differed from the others, at each year, but with lower rates, 272

138.5 and 117 mg.100g-1fruit, respectively. There are no reports in the literature on 273

tannin content in araça fruits. This group of phenolic compounds contributes towards 274

70

the fruit´s astringent taste and suggests that the taste of the red-colored fruits is 275

sharper. 276

The phenolic compounds of araça fruits varied significantly among the 277

genotypes, in the same harvest, with a sharp difference between red and yellow fruits 278

(Figure 2A). Fruits had a high rate of total phenolic compounds which varied between 279

414.7 and 689.67mg GAE.100g-1 fruit. Each year, red-colored genotypes provided 280

total phenolic compound rates which were higher than the yellow ones, varying 281

between 606.67 (AR9 in 2008) and 689.67mg AGE.100g-1 fruit (AR29 in 2012). The 282

same genotypes also provided the highest anthocyanin and total tannin content (over 283

283.5mg.100g-1 fruit) when compared to those in yellow fruits. The high content of 284

these molecules may have contributed towards rates of total phenolic compounds 285

since the compounds are constituent of a big complex group of molecules which are 286

partially the cause of color, astringency, taste and oxidative stability of the food. 287

Among the individual phenolic compounds analyzed in the fruit, epicatechin 288

content varied between 66 and 269mg.100g-1 and gallic acid varied between 52 and 289

147mg.100g-1. These molecules have the highest content in all genotypes and 290

contrast with the low concentrations of cumeric acid, between 4.0 and 25mg.100g -291

1;ferulic acid, between 1.5 and 7.5mg.100g-1; and quercetin, between 0.00 and 292

3.5mg.100g-1(Figure 2). A great variability existed in the composition and in the 293

quantity of phenolic compounds among the araça genotypes and between the 294

harvests seasons evaluated. Denardin et al. (2015) investigated the profile of 295

phenolics compounds of native fruits and identified molecules derived from gallic acid 296

and quercetin as major components of the araçá. However, they did not identify the 297

specific phenolic compound. 298

299

71

3.2 Effect of genotype and harvest on the in vivo antioxidant activity and the 300

anti-proliferation activity of the araçá fruit extracts 301

302

The extracts´ in vivo antioxidant activity was evaluated by comparing survival 303

levels of the yeast S. cereviseae against damages caused by the induction of 304

oxidative stress by hydrogen peroxide (negative control) and araçá extracts and this 305

stress agent. Expectedly, yeast cells revealed sensitiveness to hydrogen peroxide 306

and survival ranged between 42% and 43% in the presence of the oxidative agent. 307

Results corroborated the 46% survival of yeasts treated with H2O2 reported by Stinco 308

et al. (2015). The protection ability of extracts of the araçá fruit was registered when 309

S. cereviseae cells treated with extracts of araçá fruit and the stress agent were 310

evaluated. In fact, they revealed high survival rates (over 80%), mainly due to the 311

red-colored genotypes (Table 3). 312

The extracts´ antioxidant activity increased significantly the survival rates of 313

yeast treated with H2O2. Red-color genotypes increased survival rate between 40 314

and 46% when compared to yeast cells exposed to H2O2. The same genotypes were 315

outstanding in anthocyanin, tannin and total phenolic compounds and thus 316

corroborated reports by authors that assert the capacity of these molecules in 317

protecting cells against damages caused by different stressing agents (Dani et al., 318

2008; Soares et al., 2005; Stinco et al., 2015). 319

Since low cell death (between 2 and 9%) occurred in control fibroblast cells 320

(3T3), extracts revealed low cytotoxicity. Regardless of the harvest season, the 321

inhibition of cell proliferation in all extracts was reported when the effect of extracts of 322

araçá fruits was evaluated for the proliferation of human colon adenocarcinoma cells 323

(Caco-2). Tumoral cells Caco-2 treated with extracts of red-color genotypes had, as a 324

72

rule, a higher survival rate (between 45 and 59%) throughout the years (Table 4). 325

The above means that extracts have a lower antiproliferative activity when compared 326

to red-color genotypes. The biochemical-molecular mechanisms by which extracts 327

reduced the proliferation of CaCo-2 cells without any cytotoxic activity with cells 3T3, 328

were not studied in current assay. 329

330

4 CONCLUSION 331

332

Results showed that genotypes of the fruits of the araçá analyzed have a great 333

variability in phytochemical composition. The fruits demonstrated variability in 334

phytochemical composition throughout the 2008 – 2013 harvests seasons, probably 335

due to climatic variations and plant´s senescence. Since fruit extracts increased the 336

survival indexes of S. cereviseae cells, they revealed their protection capacity of cells 337

in the wake of the stress agent. They also inhibited the proliferation of human colon 338

adenocarcinoma cells and thus antiroliferative activities. Consequently, genotypes 339

may be economically exploited and the consumption of the fruit should be enhanced 340

due to its phytochemical composition and antioxidant and antiproliferative activities. 341

In fact, the genotype and the harvest affected the fruits´ phytochemical composition 342

even though the genotype factor provided the deepest differences. 343

344

ACKNOWLEDGMENTS 345

To Fapergs and CNPq for providing financial support for research. 346

347

348

349

350

73

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512

513

514

515

516

517

518

78

Table 1.Influence of genotypes and harvests on the rates of L-ascorbic acid, total 519

anthocyanins, total carotenoids, total tannins and total phenolics compounds of araçá 520

fruits. 521

L-ascorbic

acid

Total

anthocyanins

Total

carotenoids

Total

tannins

Total phenolics

compounds

Genotype ** ** ** ** **

Harvest season * * * ns **

ns – not significant 522

* Significantly different only after some years 523

** Significantly different 524

525

526

Table 2. Soluble solids (SS) and pH of red (AR9, AR 19 and AR29) and yellow (AR 527

27, AR46 and AR72) araçá (mean rates correspond to 2008 – 2013 harvests 528

seasons). 529

Genotype SS* (n=6) pH (n=6)

AR 9 10.04 ± 0.56b 3.19 ± 0.03d

AR 19 11.91 ± 0.66a 3.34 ± 0.02c

AR 29 10.67 ± 0.99ab 3.08 ± 0.04e

AR 27 10.78 ± 1.01ab 3.72 ± 0.02b

AR 46 11.73 ± 1.16 a 3.88 ± 0.07a

AR 72 7.17 ± 0.75 c 3.83 ± 0.05a

Means followed by the same letter in the column are not significantly different by 530

Tukey´s test (p<0.05). 531

*Soluble solids expressed as °Brix 532

533

79

Table 3.Antioxidant activity of red (AR9, AR19 and AR29) and yellow (AR27, AR46 534

and AR72) araçá extracts towards S. cereviseae XV 185-14C. 535

Treatments Survival (%)

Positive control (water) 100.00 a

Negative control (H2O2 50mM) 42.60 d

AR9 + H2O2 50mM 85.83 b

AR19 + H2O2 50mM 86.00 b

AR29 + H2O2 50mM 82.33 bc

AR27 + H2O2 50mM 79.67 c

AR46 + H2O2 50mM 80.83 bc

AR72 + H2O2 50mM 81.50 bc



538

539

540

541

542

543

544

545

546

547

548

549

80

Table 4. Antiproliferative activity of red (AR9, AR19 and AR29) and yellow (AR27, 550

AR46 and AR72) araçá extracts tested against embryonic fibroblasts (3T3) and 551

human colon adenocarcinoma (Caco-2) cells. 552

Genotype

Survival (%)

3T3 Caco-2

Control 98.00 a 98.00 a

AR9 96.50 ab 47.67 b

AR19 95.67 ab 48.17 b

AR29 93.50 bc 47.17 b

AR27 95.00 abc 51.00 b

AR46 92.33 c 49.67 b

AR72 94.67 bc 48.83 b



555

556

557

558

559

560

561

562

563

564

565

566

81

567

Figure 1. L-ascorbic acid (A), total anthocyanins (B), total carotenoids (C) and total 568

tannins (D) of red (AR9, AR19 and AR29) and yellow (AR27, AR46 and AR72) araçá 569

in six harvests (2008 - 2013). 570

571

572

573

574

575

576

577

578

82

579

Figure 2.Rates of total phenolics compounds (A), epicatechin (B), gallic acid (C), 580

coumaric acid (D), ferulic acid (E) and quercetin (F) of red (AR9, AR19 and AR29) 581

and yellow (AR27, AR46 and AR72) araçá in six harvests (2008 - 2013).582

83

Anexos

84

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

600,0

2008 2009 2010 2011 2012 2013

Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez

Anexo A. Radiação Solar Diária (cal.cm-2.dia-1) na cidade de Pelotas/RS entre 2008 e 2013.

Fonte: Estação Agroclimatológica de Pelotas. Convênio Embrapa/UFPel/INMET.

Anexo B. Temperatura média (°C) na cidade de Pelotas/RS entre 2008 e 2013.


85

Anexo C. Precipitação pluviométrica mensal (mm) na cidade de Pelotas/RS entre 2008 e 2013.


tese estudo fitoquímico de genótipos de araçá (psidium...

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