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Universidade Federal de Ouro Preto
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS DE ANÁLISE PARA DETERMINAÇÃO
DE CLORPIRIFÓS EM ÁGUAS DA ZONA RURAL DE OURO BRANCO/MG,
EMPREGANDO PLANEJAMENTOS EXPERIMENTAIS MULTIVARIADOS
Taciana Maria da Silveira
Ouro Preto, MG
Junho, 2012.
Universidade Federal de Ouro Preto
Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Taciana Maria da Silveira
ESTUDO COMPARATIVO DE MÉTODOS DE ANÁLISE PARA DETERMINAÇÃO
DE CLORPIRIFÓS EM ÁGUAS DA ZONA RURAL DE OURO BRANCO/MG,
EMPREGANDO PLANEJAMENTOS EXPERIMENTAIS MULTIVARIADOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Engenharia Ambiental, Universidade Federal de
Ouro Preto, como parte dos requisitos necessários para
obtenção do título: “Mestre em Engenharia Ambiental –
Área de concentração: Meio Ambiente”.
Orientadora: Profª. Dra. Gilmare Antônia da Silva
Ouro Preto, MG.
Junho, 2012.
Catalogação: [email protected]
S581e Silveira, Taciana Maria da.
Estudo comparativo de métodos de análise para determinação de clorpirifós em águas da
zona rural de Ouro Branco/MG, empregando planejamentos experimentais multivariados
[manuscrito] / Taciana Maria da Silveira – 2012.
89f. : il. color.. graf., tabs, mapas.
Orientadora: Profª. Drª. Gilmare Antônia da Silva.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Ouro Preto. Programa de Pós-
graduação em Engenharia Ambiental.
Área de concentração: Meio Ambiente.
1. Clorpirifós - Teses. 2. Otimização multivariada – Teses. 3. LLE/LTP – Teses.
4. HS-SPME-GC/ECD – Teses. 5. Análise de resíduos – Teses. I. Universidade Federal de
Ouro Preto. II. Título.
CDU: 632.951
CDU: 669.162.16
“Se um dia enxerguei mais longe foi porque
me apoiei nos ombros de gigantes.”
Isaac Newton
AGRADECIMENTOS
A Deus por mais essa oportunidade em minha vida.
À minha família que mesmo distante foi presença nos momentos difíceis.
À Fundação Gorceix pela bolsa concedida.
À professora Gilmare por ter aceitado a árdua tarefa de orientar uma geógrafa.
Aos professores Maria Eliana e Antônio Augusto pelo espaço cedido.
Aos professores Maurício e Robson pelas boas conversas.
À Prefeitura Municipal de Ouro Branco, especialmente Maciel, sempre solícito.
À EMATER Ouro Branco, principalmente ao Paulo, pelas informações concedidas.
A todos os bataticultores pela receptividade.
À galerinha rock n’roll: Juca, Marília, Panetone, Getulinho, Sorriso, Paulinho, Cristão, Marise
e Harlei pelas boas risadas e bebemorações!
À Márcia pela boa companhia, sempre.
A todos do LAQUA pela convivência incrível, em especial à Renatinha pelos ensinamentos, a
Bel, Fla e Fernanda pelo abrigo em Viçosa; vou sentir muitas saudades.
A todas as caronas: Ouro Branco – Ouro Preto e Ouro Preto – Viçosa, valeu!
À Ananda, Shelen, Keila, Gleicee Luciana pela amizade, ensinamentos e bons momentos de
laboratório.
À Nathália, que também se empenhou nessa pesquisa.
Ao colega Erik pela ajuda com o ArcGis.
À Paloma, amiga querida de todas as horas, te adoro.
À Rosa e ao Edinho por me “adotarem” e suprirem minha ausência familiar.
Principalmente ao meu amor Jackson pela tolerância nos momentos de estresse, pelos finais
de semana em campo e por completar minha vida.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho: “WE SALUTE
YOU”, “IT'S A LONG WAY TO THE TOP”.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................08
LISTA DE TABELAS............................................................................................................10
LISTA DE EQUAÇÕES.........................................................................................................13
LISTA DE NOTAÇÕES.........................................................................................................14
RESUMO.................................................................................................................................16
ABSTRACT.............................................................................................................................17
1. Introdução ........................................................................................................................... 18
2. Objetivos .............................................................................................................................. 21
2.1. Geral .............................................................................................................................. 21
2.2. Específicos ..................................................................................................................... 21
3. Revisão Bibliográfica .......................................................................................................... 22
3.1. Contaminação Aquática por Agrotóxicos...................................................................... 22
3.2. Agrotóxicos: Definições e Usos .................................................................................... 23
3.3. Clorpirifós ...................................................................................................................... 24
3.4. Determinação de Clorpirifós em Água .......................................................................... 26
3.4.1. Extração Líquido-Líquido com Partição a Baixa Temperatura ............................ 27
3.4.2. Microextração em Fase Sólida .............................................................................. 28
3.4.3. Cromatografia Gasosa Acoplada à Detecção por Captura de Elétrons ................. 29
3.4.4. Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas ............................. 30
3.5. Validação Analítica ....................................................................................................... 31
3.5.1. Seletividade ........................................................................................................... 32
3.5.2. Linearidade e Faixa de Aplicação ......................................................................... 32
3.5.3. Precisão ................................................................................................................. 34
3.5.4. Exatidão................................................................................................................. 34
3.5.5. Limite de Detecção ............................................................................................... 35
3.5.6. Limite de Quantificação ........................................................................................ 35
3.5.7. Robustez ................................................................................................................ 36
3.6. Métodos Quimiométricos .............................................................................................. 36
3.6.1. Planejamentos Experimentais ............................................................................... 37
4. Materiais e Métodos ........................................................................................................... 39
4.1. Área de Estudo .............................................................................................................. 39
4.2. Coleta ............................................................................................................................. 41
4.3. Reagentes e Solventes ................................................................................................... 42
4.4. Definições do Estudo para Determinação de Clorpirifós .............................................. 42
4.5. Avaliação das Técnicas de Extração/Pré-concentração................................................. 43
4.6. Instrumentação............................................................................................................... 46
4.7. Condições Cromatográficas ........................................................................................... 46
4.8. Validação do Método Analítico ..................................................................................... 47
4.8.1. Seletividade ........................................................................................................... 47
4.8.2. Limite de Detecção e Limite de Quantificação do Método .................................. 47
4.8.3. Linearidade do Método e Faixa de Trabalho ........................................................ 47
4.8.4. Precisão ................................................................................................................. 48
4.8.5. Exatidão................................................................................................................. 48
5. Resultados e Discussão ....................................................................................................... 49
5.1. Região de Estudo ........................................................................................................... 49
5.2. Coleta ............................................................................................................................. 51
5.3. Análises Cromatográficas .............................................................................................. 52
5.4. Estudo e Otimização da Técnica de Extração Líquido-Líquido com Partição a Baixa
Temperatura .......................................................................................................................... 54
5.5. Estudo e Otimização da Técnica de Microextração em Fase Sólida com Headspace .. 60
5.6. Validação do Método para Determinação de Clorpirifós em Água .................................. 69
5.6.1. Seletividade ........................................................................................................... 69
5.6.2. LOD e LOQ........................................................................................................... 70
5.6.3. Linearidade e Faixa de Trabalho ........................................................................... 71
5.6.4. Precisão ................................................................................................................. 72
5.6.5. Exatidão................................................................................................................. 73
5.7. Análise das Amostras Naturais Coletadas ..................................................................... 74
6. Conclusões ........................................................................................................................... 77
7. Sugestões para Trabalhos Futuros .................................................................................... 78
8. Referências Bibliográficas ................................................................................................. 79
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura molecular do clorpirifós. .......................................................................... 25
Figura 2. Representação de uma das rotas de hidrólise do clorpirifós. Fonte: Adaptado da ref.
21. ............................................................................................................................................. 26
Figura 3. Comunidades rurais (delimitações circulares em cinza) da cidade de Ouro
Branco/MG. Fonte: ref. 62. ...................................................................................................... 40
Figura 4. Ilustração do sistema de filtração a vácuo utilizado no trabalho. ............................ 42
Figura 5. (a) Descarte inadequado de embalagens em nascente próxima à plantação; (b)
Aplicação de agrotóxico sem EPI em plantação de batata na zona rural de Ouro Branco/MG;
(c) Descarte inadequado de embalagens em matas ciliares; e (d) Exposição a agrotóxicos sem
EPI e descarte inadequado de embalagens. .............................................................................. 49
Figura 6. Localização dos pontos de coleta na zona rural de Ouro Branco/MG. O mapa foi
confeccionado utilizando o software ArcGis............................................................................ 52
Figura 7. Cromatógrafo a gás com detector por captura de elétrons utilizado nas análises
deste trabalho. ........................................................................................................................... 53
Figura 8. Cromatógrafo a gás com detecção por espectrometria de massas utilizado em
análises deste trabalho. ............................................................................................................. 54
Figura 9. Ilustração do sistema LLE-LTP empregado neste trabalho; separação das fases
imiscíveis aquosa e orgânica. ................................................................................................... 54
Figura 10. Correlação entre os valores medidos e os valores previstos pelo modelo de
regressão quadrático do planejamento Doehlert dos valores de área de clorpirifós, na extração
por LLE-LTP. ........................................................................................................................... 59
Figura 11. Gráfico de probabilidade normal do planejamento Doehlert no estudo da
otimização da extração de clorpirifós por LLE-LTP, mostrando as variáveis significativas. .. 60
Figura 12. Esquema representativo do procedimento de extração por HS-SPME. Adaptado da
ref. 41. ....................................................................................................................................... 61
Figura 13. Montagem para extração de clorpirifós em água por HS-SPME utilizado neste
trabalho. .................................................................................................................................... 62
Figura 14. Exposição da fibra para dessorção do analito no sistema GC-ECD. ..................... 69
Figura 15. Ilustração de um dos pontos de coleta de amostra de água superficial próximo a
plantações de batata na zona rural de Ouro Branco/MG. ......................................................... 69
Figura 16. Cromatograma obtido após extração HS-SPME da amostra fortificada com
clorpirifós a 5,00 µg/L (a) seguido do cromatograma da extração HS-SPME de uma matriz de
água superficial (b).. ................................................................................................................. 70
Figura 17. Regressão do estudo da linearidade do método proposto e otimizado para análise
de clorpirifós em água. ............................................................................................................. 71
Figura 18. Faixa de trabalho obtida no processo de validação do método proposto e
otimizado para determinação de clorpirifós em água. .............................................................. 72
Figura 19. Cromatograma de clorpirifós em amostra de água natural coletada em curso
d’água da zona rural de Ouro Branco/MG, obtido por GC-ECD. ............................................ 76
Figura 20. Cromatograma de clorpirifós em amostra de água natural coletada em curso
d’água da zona rural de Ouro Branco/MG, obtido por GC-MS. .............................................. 76
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros ANVISA e INMETRO para validação de métodos analíticos. ............ 32
Tabela 2. Planejamento fatorial completo 24, com 4 replicatas no ponto central (pc), para
investigação das variáveis experimentais do método LLE-LTP: volume de fase aquosa (mL),
volume de fase orgânica (mL), tempo de agitação (min) e concentração de eletrólito (mol/L).
Os valores em parênteses indicam os níveis decodificados. .................................................... 44
Tabela 3. Planejamento fatorial completo 24, com 4 replicatas no ponto central (pc), para
investigação das variáveis experimentais do método HS-SPME: tempo de extração (min),
temperatura de extração (°C), concentração de eletrólito (mol/L) e volume de amostra (mL).
Os valores em parênteses indicam os níveis decodificados. .................................................... 45
Tabela 4. Coordenadas geodésicas dos pontos de coleta S= Sul e W= Oeste. ........................ 51
Tabela 5. Resultados (áreas cromatográficas) dos ensaios experimentais do planejamento
fatorial completo 24, com 4 replicatas no ponto central (ensaios 17 a 20), para investigação
das variáveis experimentais do método LLE/LTP: volume de fase aquosa (mL), volume de
fase orgânica (mL), tempo de agitação (min) e concentração de eletrólito (mol/L). ............... 56
Tabela 6. Efeitos do planejamento de triagem para a avaliação dos parâmetros operacionais
LLE-LTP, na extração de clorpirifós em água (1 - volume de fase aquosa (mL), 2 - volume de
fase orgânica (mL), 3 - tempo de agitação (min) e 4 - concentração de eletrólito (mol/L)). Os
valores sublinhados indicam efeitos significativos. A última coluna corresponde aos valores
do parâmetro estatístico p, ao nível de significância de 0,05, considerando o erro puro. ........ 57
Tabela 7. Planejamento Doehlert, com quatro replicatas no ponto central (ensaios 21 a 24),
para otimização das condições experimentais da técnica LLE-LTP volume de fase aquosa
(mL), volume de fase orgânica (mL), tempo de agitação (min) e concentração de eletrólito
(mol/L), para extração de clorpirifós em água. Os valores em parênteses representam os níveis
decodificados. A última coluna corresponde aos valores de área cromatográfica de clorpirifós
obtidos para cada ponto experimental do planejamento. .......................................................... 58
Tabela 8. Condição experimental ótima apontada pelo planejamento Doehlert para extração
de clorpirifós em água por LLE-LTP. ...................................................................................... 59
Tabela 9. Resultados (áreas cromatográficas) dos ensaios experimentais do planejamento
fatorial completo 24, com 4 replicatas no ponto central (ensaios 17 a 20), para investigação
das variáveis experimentais do método HS-SPME: tempo de extração (min), temperatura de
extração (°C), concentração de eletrólito (mol/L) e volume de amostra (mL)......................... 63
Tabela 10. Efeitos do planejamento de triagem para a avaliação dos parâmetros operacionais
HS-SPME, na extração de clorpirifós em água (1 - tempo de extração (min), 2 - temperatura
de extração (°C), 3 - concentração de eletrólito (mol/L) e 4 - volume de amostra (mL)). Os
valores sublinhados indicam efeitos significativos. A última coluna corresponde aos valores
do parâmetro estatístico p, ao nível de significância de 0,05, considerando o erro puro. ........ 64
Tabela 11. Planejamento Doehlert, com quatro replicatas no ponto central (ensaios 21 a 24),
para otimização das condições experimentais da técnica HS-SPME tempo de extração (min),
temperatura de extração (°C), volume de amostra (mL) e concentração de eletrólito (mol/L),
para extração de clorpirifós em água. Os valores em parênteses representam os níveis
decodificados. A última coluna corresponde aos valores de área cromatográfica de clorpirifós
obtidos para cada ponto experimental do planejamento. .......................................................... 65
Tabela 12. Condição experimental ótima apontada pelo planejamento Doehlert para extração
de clorpirifós em água por HS-SPME. ..................................................................................... 66
Tabela 13. Coeficientes do planejamento Doehlert para a avaliação dos parâmetros
operacionais HS-SPME, na extração de clorpirifós em água (1 - tempo de extração (min), 2 -
temperatura de extração (°C), 3 - volume de amostra (mL) e 4 - concentração de eletrólito
(mol/L)). Os valores sublinhados indicam efeitos significativos. A última coluna corresponde
aos valores do parâmetro estatístico p, ao nível de significância de 0,05, considerando a soma
quadrática dos resíduos. ............................................................................................................ 66
Tabela 14. Tabela de análise de variância para o planejamento Doehlert executado no estudo
da otimização das condições operacionais HS-SPME para determinação de clorpirifós em
água, no nível de significância de 0,05. Valores sublinhados indicam valores significativos.
FV = fonte de variância, SQ = soma quadrática, nGL = número de graus de liberdade, MQ =
média quadrática, Fcalc = valor calculado do teste F, e p = parâmetro estatístico p. .............. 68
Tabela 15. Limites de detecção e quantificação do método proposto e otimizado para
determinação de clorpirifós em água. ....................................................................................... 71
Tabela 16. Coeficientes de variação da repetitividade e precisão intermediária na avaliação da
precisão do método para determinação de clorpirifós em água................................................ 73
Tabela 17. Porcentagens de recuperação de clorpirifós em amostras de água após análise com
o método proposto, otimizado e validado. ................................................................................ 74
Tabela 18. Resultados para análise de clorpirifós em água superficial por GC-ECD. ............ 75
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1 ................................................................................................................................33
Equação 2.................................................................................................................................34
Equação 3 ................................................................................................................................35
LISTA DE NOTAÇÕES
ANOVA - Tabela de Análise de Variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
Carboxen/PDMS - Carboxen/Polidimetilsiloxano
CCD - Planejamento Composto Central
CV - Coeficiente de Variação
CWX - Carbowax
DDT - Dicloro-Difenil-Tricloroetano
DNA - Ácido Desoxirribonucléico
DVB/CARBOXEN/PDMS - Divinilbenzeno/Carboxen/Polidimetilsiloxano
EMATER- Empresa de Assistência Técnica e Extensão Rural
EPA - Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
EPI - Equipamento de Proteção Individual
FS - Sílica Fundida
GC-ECD - Cromatografia a Gás com Detector por Captura de Elétrons
GC-MS - Cromatografia a Gás acoplada à Espectrometria de Massas
GPS - Sistema de Posicionamento Global
HS-SPME - Microextração em Fase Sólida com Headspace
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ICH - Conferência Internacional de Harmonização
INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia
LAQUA - Laboratório de Química Analítica
LD 50 - Dose letal para matar 50% de uma população
LLE-LTP - Extração Líquido-Líquido com Partição a Baixa Temperatura
LOD - Limite de Detecção
LOQ - Limite de Quantificação
MLR - Limite Máximo de Resíduos
PA - Poliacrilato
PDMS100 -Polidimetilsiloxano com espessura de 100 µm
PDMS/DVB - Polidimetilsiloxano/Divinilbenzeno
pH - Potencial Hidrogeniônico
RSD - Desvio Padrão Relativo
RSM - Metodologia de Superfície de Resposta
SCAN -Escaneamento de Faixa de Massa
SIM - Monitoramento de Íon Específico
TCP- Tricloropiridiol
RESUMO
Produzidos desde a década de 40, os organofosforados foram os primeiros a substituírem os
organoclorados, aos quais os insetos já apresentavam resistência. Dentre estes o clorpirifós
apresenta-se como um inseticida altamente tóxico. Devido à sua elevada lipossolubilidade é
absorvido pelo organismo humano, especialmente pela pele. Os organofosforadossão
conhecidos por induzirem ou agravarem certos problemas de saúde; assim é importante seu
monitoramento. Para a determinação de clorpirifós em amostras aquosas geralmente utiliza-se
etapas de extração/pré-concentração antes de se efetuar a quantificação. Neste trabalho,
foramavaliadas as técnicasextração líquido-líquido com partição a baixa temperatura (LLE-
LTP) e microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME) e as técnicas de
cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (GC-ECD) e cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) para definição do método analítico mais
sensível, utilizando planejamentos experimentais multivariados para a otimização dos
métodos de preparo de amostra. Após a otimização, o método HS-SPME/GC-ECD foi
validado para o monitoramento de clorpirifós em cursos d’água superficiais próximos às
principais plantações de batata na zona rural de Ouro Branco/MG. Apresença de agrotóxicos,
como o clorpirifós nesses cursos d’água, foi relacionada em pesquisas anteriores aos altos
índices dos casos de hipertensão e aborto da população da zona rural. A definição dos pontos
de coleta foi feita após visitas de campo e levantamento de informações obtidas junto aos
órgãos e pessoas competentes. O planejamento fatorial completo apontou as variáveis tempo
(1)e temperatura de extração (2), volume de amostra (3) e concentração de eletrólito (4) como
importantes para o sistema;logo as mesmas foram avaliadas em mais níveis pela matriz
Doehlert.As variáveis 1, 2 e 3 foram apontadas como as que influenciam o sistema. O modelo
quadrático do planejamento Doehlert foi significativo não apresentando falta de ajuste e a
condição ótima foi definida no tempo e temperatura de extração de 60 min e 85 °C,
respectivamente, com um volume de amostra de 11 mL e 0,04 mol/L de concentração de
eletrólito. O método otimizado foi validado considerando os parâmetros seletividade,
linearidade, precisão (repetitividade e precisão intermediária), exatidão e os limites de
detecção (LOD) e quantificação (LOQ). O LOQ e LOD foram 0,76 e 2,28 µg/L,
respectivamente. O método se mostrou linear com R2 igual a 0,992. Os resultados indicaram
que o método HS-SPME/GC-ECD proposto é eficiente para a determinação de clorpirifós em
água e as análises das amostras coletadas indicaram a presença de clorpirifós em
concentrações entre osvalores de LOD e LOQ. Os resultados desta pesquisa foram informados
à Prefeitura Municipal de Ouro Branco e órgãos competentes.
ABSTRACT
Produced since1940, organophosphates were the first to replace the organochlorines, which
already had bug resistance. Among these chlorpyrifos presents itself as a highly toxic
insecticide. Due to its high lipossolubility it is absorbed by the human body, especially the
skin. Organophosphates are known to induce or worsen certain health problems; so it is
important its monitoring. For the determination of chlorpyrifos in aqueous samples generally
are used steps of extraction/pre-concentration before performing the measurement. In this
study it was investigated the liquid-liquid extraction technique withlow temperature partition
(LLE-LTP) and solid phase microextraction with headspace (HS-SPME) and the techniques
of gas chromatography with electron capture detection (GC- ECD) and gas chromatography
coupled to mass spectrometry (GC-MS) to define the most sensitive analytical method, using
multivariate experimental designs for the optimization of the sample preparation techniques.
After optimization, the HS-SPME/GC-ECD method was validated for the monitoring of
chlorpyrifosin surface water bodies close to the main potato fields in countryside of
OuroBranco/MG; the presence of pesticides, such as chlorpyrifos, in these streams has been
linked in previous research to the high rates of hypertension and abortion cases of the
population in rural areas. The definition of the sampling was made after field visits and
information survey obtained from the competent agencies and people. The full factorial
design showed the variables time (1) and temperature of extraction (2), sample volume (3)
and concentration of electrolyte (4) as important to the system; in this way the same ones
were evaluated in more levels by Doehlert matrix. Variables 1, 2 and 3 were identified as
those that affect the system, the quadratic modelof Doehlert design was significant not
showing lack of fit and the optimal condition was set in the time and temperature of extraction
of 60 min and 85 °C, respectively, with a volume of 11 mL and 0.04 mol/L of electrolyte
concentration. The optimized method was validated considering the parameters selectivity,
linearity, precision (repeatability and intermediate precision), accuracy and limits of detection
(LOD) and quantitation (LOQ). The LOD and LOQ were 0.76 and 2.28 µg/L, respectively.
The method was linear with R2 equal to 0.992. The results indicate that the method HS-
SPME/ECD-GC proposed is efficient for the determination of chlorpyrifos in water and the
analysis of the samples indicated the presence of chlorpyrifos in concentrations between the
values of LOD and LOQ. These results were reported to the Ouro Branco City Hall and
competent agencies.
18
1. Introdução
A batata (Solanum tuberosum L.) está entre os alimentos mais consumidos no mundo,
sendo superada apenas pelo trigo, arroz e milho. No Brasil, condições favoráveis para o
desenvolvimento da batata são encontradas nas regiões Sul e Sudeste, onde se destacam como
maiores produtores os estados de Minas Gerais, São Paulo e Paraná. O estado de Minas
Gerais ocupa a liderança nacional na produção.1 - 3
O modelo de agricultura adotado no Brasil baseia-se no uso de agrotóxicos, assim,
estes compostos são empregados há bastante tempo e a partir da 2ªguerra mundial passaram a
ser mais intensamente utilizados.4 Não se pode negar que estes produtos possibilitaram o
aumento da produtividade agrícola e têm auxiliado no controle de vetores de diversas doenças
das plantas. Entretanto, seu uso desordenado e excessivo vem provocando diversos impactos
sobre o meio ambiente. Dentre os impactos ao ambiente pode-se citar a presença de resíduos
no solo, na água, no ar, nas plantas e nos animais. Apesar do desenvolvimento de técnicas
alternativas para controlar as pragas que prejudicam a bataticultura, como o uso de variedades
resistentese o controle biológico, o uso de agrotóxicos ao longo de toda área cultivada ainda é
o mais utilizado pelos produtores, que alegam que para se obter um cultivo lucrativo e
competitivo este é o método mais eficaz.2
O uso indiscriminado de agrotóxicos em plantações brasileiras é uma realidade e tal
fato não se difere do que ocorre nas plantações de batata da zona rural de Ouro Branco/MG.
Conforme informações obtidas na Secretaria de Agricultura da prefeitura da cidade de Ouro
Branco, o cultivo de batata inglesa neste município data do início do século XX.As terras de
Ouro Preto (cidade limítrofe) não eram propícias para agricultura devido à forte presença de
minerais no solo. Assim, a agricultura em geral se desenvolveu em Ouro Branco, abastecendo
a população vizinha. A cultura de batata passou a ser um dos principais cultivos e Ouro
Branco passou a se destacar na sua produção, que se tornou ciclo econômico, marcando a
cultura local; há 18 anos a cidade comemora o Festival da Batata. Segundo a Empresa de
Assistência Técnica e Extensão Rural (EMATER) Ouro Branco (2010), atualmente cerca de
50 produtores cultivam a batata inglesa na zona rural de Ouro Branco. O plantio e colheita são
feitos durante todo o ano, se dividindo em três safras, constituindo uma prática agrícola
intensiva.
Em pesquisa realizada previamente,2 vários moradores da zona rural de Ouro Branco
relataram sintomas de exposição a agrotóxicos e dentre estes, as doenças respiratórias estão
incluídas. Em uma das comunidades, 33% da população amostrada possui algum problema
19
relacionado a esta exposição, tais como: cefaleia, problemas visuais, hipertensão, dores nos
membros, arritmia cardíaca ou algum tipo de problema reprodutivo. Isso demonstra que a
população local provavelmente está exposta à ação e efeitos destes produtos químicos, o que
demanda uma ação urgente por parte de todos os envolvidos.
Nesse contexto, é abordada a problemática da contaminação dos cursos d’água por
agrotóxicos utilizados em plantações de batata inglesa na zona rural de Ouro Branco/MG.
Partindo do levantamento de todas as informações cabíveis por meio de visitas e aplicação de
questionário aos órgãos competentes, bataticultores e comércio local foram definidos os
procedimentos analíticos para determinação qualitativa e quantitativa do agrotóxico
clorpirifós, muito utilizado nas plantações de batata próximas aos cursos d’água das
comunidades rurais, como também foram decididos os pontos de coleta para monitoramento
do mesmo.
É importante a preservação da qualidade das águas onde a contaminação representa
risco para a população e principalmente para as futuras gerações, ressaltando que os
mananciais e nascentes na sua grande maioria estão inseridos na área rural, portanto, perto das
áreas de cultivo agrícola onde há uso intenso de agrotóxicos.5
Nas últimas décadas, com a evolução das técnicas analíticas, foi possível a detecção de
contaminação por agrotóxicos nos sistemas hídricos em níveis bastante reduzidos. Também,
já foi comprovado por diversos estudos que a presença de agrotóxicos nos sistemas hídricos
seria mais comum do que se imaginava, principalmente nos sistemas hídricos próximos de
regiões agrícolas intensivas na utilização de agrotóxicos,6 como é o caso deste trabalho.
Assim, neste trabalho, foi realizado o estudo da determinação do inseticida
organofosforado clorpirifós em água, avaliando-se diferentes técnicas de extração/pré-
concentração e determinação, a fim de apontar o método analítico mais sensível para sua
quantificação, com a aplicação de métodos multivariados de otimização, para se alcançar o
máximo desempenho das técnicas de preparo de amostra empregadas. Para o processo de
triagem foi aplicado o planejamento multivariado fatorial completo 24 e para a etapa de
construção de superfície de resposta o planejamento multivariado ou matriz Doehlert com
quatro variáveis. Os planejamentos multivariados possibilitaram a investigação de diferentes
fatores ao mesmo tempo, com um número reduzido de experimentos, e o apontamento da
condição operacional que proporcionasse a maior quantidade extraída. Foram avaliadas como
técnicas de extração a extração líquido-líquido com partição a baixa temperatura (LLE-
LTP)7e a microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME) e, como técnicas de
determinação, a cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (GC-ECD) e a
20
cromatografia gasosa com espectrometria de massas (GC-MS). O método mais sensível foi
validado em função das figuras de mérito sensibilidade, linearidade, precisão, exatidão e os
limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ) e aplicado para determinação de clorpirifós
em cursos d’água próximos às principais plantações de batata das comunidades rurais de Ouro
Branco/MG.
21
2. Objetivos
2.1. Geral
Determinar o inseticida organofosforado clorpirifós em cursos d’água próximos a
plantações de batata na zona rural de Ouro Branco/MG, por meio da avaliação de diferentes
técnicas de extração/pré-concentração de analitos e de determinação cromatográfica, com o
auxílio de métodos de otimização multivariada, e validação do método analítico apontado
como mais adequado.
2.2. Específicos
Identificar as principais plantações de batata na zona rural de Ouro Branco/MG e
agrotóxicos utilizados;
Definir os pontos de coleta e o agrotóxico a ser monitorado;
Georreferenciar os pontos de coleta e confeccionar o mapa com os dados de
amostragem;
Avaliar as técnicas de preparo de amostrasextração líquido-líquido com partição a
baixa temperatura e microextração em fase sólida para a extração/pré-concentração de
clorpirifós em água, por meio de técnicas de otimização multivariadatais como o
planejamento fatorialcompleto 24e o planejamento ou matriz Doehlert com quatro variáveis;
Validar o método analíticoselecionado, em função das figuras de mérito sensibilidade,
linearidade, precisão, exatidão e os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), para
determinação de clorpirifós em água;
Realizar coletasem campanhas diferentes (períodos sazonais distintos) a fim de
monitorar a presença de clorpirifós nas águas superficiais;
Determinar o clorpirifós nas amostras de água superficial coletadas; e
Contatar os órgãos e pessoas competentes locais acerca dos resultados obtidos para
auxílio na posterior utilização das informações adquiridas na tomada de decisões.
22
3.Revisão Bibliográfica
3.1. Contaminação Aquática por Agrotóxicos
A água é a substância química mais abundante da matéria viva e desempenha funções
importantes como: solvente de líquidos corpóreos, meio de transporte de moléculas, regulação
térmica, ação lubrificante, atuação nas reações de hidrólise, entre outras.8
A humanidade, até háalgumas décadas, tinha a água como um bem infinito e que a
capacidade de autodepuração dos corpos também o era. Mas nas últimas décadas, o rápido
desenvolvimento industrial, o aumento do número de habitantes e da produtividade agrícola
trouxeram como consequência a preocupação com a qualidade e disponibilidade de água para
consumo humano devido à rápida degradação dos corpos d’água.8
A diminuição da qualidade de águas superficiais e consequente escassez de água
potável é atualmente uma preocupação de órgãos públicos ambientais e da saúde. Essa
diminuição pode ser causada pela presença de substâncias potencialmente tóxicas. Os
agrotóxicos organoclorados, por exemplo, destacam-se entre os principais agentes
contaminantes por apresentarem elevada persistência ambiental.9
Existem muitos agrotóxicos disponíveis para o uso comercial e apesar de trazerem
muitos benefícios, especialmente na agricultura, eles são tóxicos para os seres humanos. Em
alguns casos esses compostos são bio-acumulativos. Portanto, se faz necessário o
desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação das diferentes classes de
agrotóxicos tanto em matrizes aquosas quanto sólidas.10
O uso de compostos agroquímicos (inseticidas, fungicidas, herbicidas, fertilizantes,
entre outros) representa um risco para a qualidade da água principalmente em áreas próximas
a regiões agrícolas, pois nestas regiões a presença desses compostos químicos nos sistemas
hídricos é muito comum, devido ao fato destas substâncias se dispersarem, principalmente
através do solo, contaminando tanto águas subterrâneas como superficiais.11
Assim, o uso de
agrotóxicos e seus possíveis efeitos à saúde humana e ao meio ambiente tornaram-se uma
grande preocupação para a comunidade científica, principalmente quando o recursohídrico
potencialmente contaminado é utilizado ou passível de utilização para consumo humano.6
Alguns trabalhos sintetizam os fatores que influenciam a dinâmica dos agrotóxicos no
ambiente12
onde mostram que é grande o grau de dificuldade na avaliação dos riscos de
contaminação de ambientes aquáticos decorrente do uso dessas substâncias. É importante
enfatizar que existe, ainda hoje, muita controvérsia com relação aos efeitos tóxicos crônicos
23
dos agrotóxicos para o ser humano, principalmente quando consumidos em baixas doses ao
longo de toda uma vida. Isto indica a necessidade de desenvolver estudos sobre a presença de
resíduos dessas substâncias no ambiente, como o aquático, a fim de promover o controle
ambiental, além de se investigar seus efeitos sobre a saúde humana e do meio ambiente.12
3.2. Agrotóxicos: Definições e Usos
O novo estilo de consumo da sociedade moderna levou ao crescimento das exigências
da qualidade e quantidade de produtos disponíveis, incrementou a demanda de recursos
naturais e também a produção agrícola. A consequência foi o uso de maneira intensiva de
produtos químicos como inseticidas, fungicidas, herbicidas, fertilizantes, entre outros. O
Brasil é o terceiro maior consumidor de agrotóxicos do mundo, aplicando aproximadamente
150 mil toneladas dos mesmos por ano, o que movimenta um mercado de 1 bilhão de dólares.
É visível que praticamente toda produção agrícola em escala comercial, cujo objetivo seja
produzir intensivamente, utilize agrotóxicos no processo produtivo.13
A agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA) define agrotóxico como
qualquer substância ou mistura de substâncias com a capacidade de prevenir, destruir, repelir
ou atenuar qualquer peste. São destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento
e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas nativas ou
plantadas e de outros ecossistemas e ambientes urbanos, hídricos e industriais.14
Segundo a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), a finalidade dos agrotóxicos é alterar a
composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa dos seres vivos
considerados nocivos, com as substâncias e produtos atuando como desfolhantes, dessecantes,
estimuladores e inibidores de crescimento.15
A poluição do ambiente por agrotóxicos é uma
preocupação crescente, uma vez que estes compostos de diversas naturezas químicas são
utilizados em larga escala para diferentes fins. Estes agrotóxicos alcançam as vegetações
adjacentes aos locais de aplicação, as águas e os animais que vivem no solo.13
Vários agrotóxicos são frequentemente empregados na agricultura para controle de
pragas, uma vez que contribuem para aumentar a produtividade. No entanto, resíduos desses
compostos podem permanecer em alimentos, nos solos, no ar, na água, etc., o que é bastante
prejudicial ao ser humano.16
Segundo o Manual de Vigilância da Saúde de Populações Expostas a Agrotóxicos17
os
agrotóxicos podem ser classificados sob diversos aspectos:
24
(a) de acordo com o tipo ou espécie de organismo que se pretende eliminar ou
controlar;
(b) de acordo com a estrutura química das substâncias ativas; e
(c) de acordo com o grau de perigo à saúde humana que eles oferecem.
A seguir são apresentadas exemplificações dessas classificações:
Quanto ao organismo que eliminam ou controlam:
Inseticidas (insetos), herbicidas (ervas daninhas), fungicidas (fungos), raticidas
(roedores), bactericidas (bactérias), nematicidas (vermes), larvicidas (larvas), cupinicidas
(cupins), formicidas (formigas), pulguicidas (pulgas), piolhicidas (piolhos), carrapaticidas
(carrapatos), acaricidas (ácaros), molusquicidas (moluscos), avicidas (aves) e columbicidas
(pombos);
Quanto à estrutura química:
Organofosforados (e.g. clorpirifós, malationa, diclorvos, metil parationa,
emetamidofós), organoclorados (e.g. dicloro-difenil-tricloroetano(DDT), aldrinelindano),
carbamatos (e.g. aldicarb, carbaril e zectran),piretroides (e.g. deltametrina, cipermetrina,
permetrina e fenpropratina),neocotinoides (e.g. imidacloprido e tiacloprido), entre outros;
Quanto à toxicidade:
Esta classificação garante a interpretação direta do grau de perigo dos agrotóxicos à
saúde humana, facilitando ao agricultor e principalmente ao leigo interpretar a dimensão do
risco à saúde envolvida quando da utilização destes produtos. Ela é baseada na dose letal 50
(LD 50), que é um valor estatístico que determina a quantidade de agrotóxico em mg/kg de
peso corporal necessária para matar 50% da amostra populacional em estudos por
intoxicações agudas. Os valores são determinados em cobaias e extrapolados para humanos a
partir do peso. Existem quatro classes, a saber:
Classe I (rótulo vermelho) - extremamente tóxicas;
Classe II (rótulo amarelo) - altamente tóxicas;
Classe III (rótulo azul) - moderadamente tóxicas; e
Classe IV (rótulo verde) - pouco tóxicas.
3.3. Clorpirifós
Produzidos na década de 40, os organofosforados foram os primeiros a substituírem os
representantes do grupo dos organoclorados, aos quais os insetos já apresentavam
resistência.Porém, geralmente demonstram um efeito tóxico mais agudo para os seres
25
humanos e outros mamíferos. O clorpirifós (tiofosfatode o,o-dietil-o-(3,5,6-tricloro-2-piridila)
- fórmula estruturalC9H11Cl3NO3PS) (Figura 1), inseticida organofosforado, é altamente
tóxico (classe II) e apresenta baixa solubilidade em água (1,39 mg/L). Devido à elevada
lipossolubilidade que apresenta é absorvido pelo organismo humano, especialmente pela pele,
além de membranas mucosas e pela via respiratória. Atua inibindo a ação da enzima
acetilcolinesterase na transmissão dos impulsos nervosos.
Figura 1. Estrutura molecular do clorpirifós.
Estudos com exposição perinatal têm demonstrado que o clorpirifós é altamente tóxico
para ratos neonatos, persistindo os efeitos até a fase adulta. Exposição a doses baixas pode
provocar toxicidade sistêmica determinando alterações no desenvolvimento das células
neurais, com respeito à síntese do DNA, diferenciação celular e sinaptogenese.18
Seu uso está registrado em mais de 900 formulações diferentes de agrotóxicos no
mundo. Dependendo da formulação e tipo de aplicação, resíduos de clorpirifós podem ser
detectáveis de meses a anos. No Brasil, a agricultura tem consumido cerca de 230 mil
toneladas deste agrotóxico por ano.19
De acordo com relatório da EPA20
, clorpirifós foi detectado em águas de superfície em
1998; os resultados apontaram concentrações abaixo de 0,1 µg/L. A meia-vida do mesmo no
solo é geralmente entre 60 e 120 dias, podendo variar de duas semanas a mais de um ano
dependendo do tipo de solo, clima e outras condições.21
Possui alto coeficiente de sorção no
solo, fator que contribui para sua persistência no ambiente. Sua concentração na água é dita
baixa em parte devido ao fato de ser geralmente pouco solúvel em água e em parte devido ao
efeito de diluição. Isto, no entanto, não exclui a possibilidade de que concentrações muito
altas venham a ocorrer após períodos chuvosos intensos, especialmente quando as áreas
próximas dos cursos d’água tenham sido recentemente tratadas com altas doses do composto.
Seu uso representa um risco para a qualidade da água principalmente em áreas
próximas a regiões agrícolas, pois nestas a presença do composto nos sistemas hídricos é
26
muito comum, devido ao fato da dispersão ou lixiviação no solo, o que contamina tanto águas
subterrâneas como superficiais.11
Um dos produtos da hidrólise do clorpirifós é o 3,5,6-tricloro-2-piridiol (TCP) (Figura
2), que apresenta maior solubilidade em água do que o clorpirifós e provoca a contaminação
generalizada dos solos e ambiente aquático. Na presença de ozônio, tetróxido de dinitrogênio
e ácido perclórico, a ligação tiofosforil (P=S) pode ser oxidada a oxon (P=O). O oxons
correspondentes são muito mais tóxicos, geralmente mais potentes na inibição da
acetilcolinesterase. Além disso, o TCP também é persistente à degradação por
microrganismos.21 - 22
Outros estudos apontam quea meia-vidadoclorpirifósvariadehoras a
meses; fatores como pH influenciam nesse processo, sendo possível encontrar uma variedade
de relatos sobre a meia-vida de clorpirifós em água.22 - 28
Figura 2. Representação de uma das rotas de hidrólise do clorpirifós. Fonte: Adaptado da ref. 21.
3.4. Determinação de Clorpirifós em Água
De acordo com o guia para qualidade de água para consumo humano da EPA, a
concentração máxima aceitável de clorpirifós em água potável é de 30 µg/L.20, 29
Já a
legislação canadense estabelece que a concentração máxima aceitável de clorpirifós em água
potável é de 90 µg/L.28
No Brasil, a legislação não estabelece níveis de concentração para
clorpirifós em água.
A cromatografia gasosa (GC) é uma das técnicas mais utilizadas para identificação e
quantificação de compostos voláteis ou volatizáveis, como o clorpirifós. Destaca-se pela
TCP
Desetil Clorpirifós
27
disponibilidade de uma gama de detectores (captura de elétrons (ECD), fotométrico de chama
(FPD), espectrometria de massas (MS), etc.) que permitem detectar agrotóxicos em geral e/ou
seus produtos de degradação em quantidades inferiores aos limites máximos de resíduos
(MLR), estabelecidos pela ANVISA.27
Entretanto, para a determinação cromatográfica de clorpirifós em amostras aquosas,
geralmente faz-se necessárias etapas de pré-concentração e extração de analitos antes de se
efetuar a quantificação. As técnicas de extração e/ou pré-concentração permitem que a análise
dos componentes de interesse se torne possível. A meta final é a obtenção de uma sub-fração
da amostra original enriquecida com as substâncias de interesse analítico, de forma que se
obtenha uma separação cromatográfica livre de interferências, com detecção adequada e um
tempo razoável de análise.26
Dentre as técnicas de extração/pré-concentração disponíveis, o clorpirifós pode ser
extraído a partir da microextração em fase sólida (SPME) ou pela extração líquido-líquido, na
modalidade com partição a baixa temperatura (LLE-LTP).7
3.4.1.Extração Líquido-Líquido com Partição a Baixa Temperatura
Recentemente, a técnica de extração líquido-líquido com partição a baixa temperatura
surgiu como uma alternativa para a extração de agrotóxicos em água e em leite. A extração se
baseia na partição dos analitos entre as fases aquosa e orgânica, decorrente da diminuição da
temperatura (-20 ºC). A vantagem do método é que os componentes da amostra são retidos na
fase aquosa enquanto os agrotóxicos são extraídos pela fase orgânica.30
A LLE apresenta as vantagens de ser simples e poder utilizar um número grande de
solventes, os quais fornecem uma ampla faixa de solubilidade e seletividade.31
Trata-se de um
procedimento analítico que pode ser utilizado para a pré-concentração de agrotóxicos
organofosforados e posterior análise destes por cromatografia.26
Uma variação da técnica de LLE foi, no passado, desenvolvida para extração de
pesticidas em plantas e matrizes animais, em que os materiais gordurosos eram separados por
precipitação em baixa temperatura. O abaixamento da temperatura a valores tão baixos como
o recomendado (-70 ºC) impedia o uso intensivo da técnica. Recentemente, foi descrito o
emprego da técnica de extração em baixa temperatura para determinação de agrotóxicos em
amostras líquidas e sólidas. A técnica aplicada em amostras líquidas consistiu na adição de
acetonitrila à amostra em uma proporção de 2:1 (v/v). Com a adição da acetonitrila é formada
uma fase única líquida contendo água e solvente, a qual é resfriada a -20 ºC para separação
das fases. Para amostras sólidas a mistura formada pela fase líquida e o material sólido é
28
resfriada a -20 ºC após agitação. Com o abaixamento da temperatura, o material sólido e a
fase aquosa congelam promovendo a separação das fases. A acetonitrila, de temperatura de
congelamento igual a -46 ºC fica líquida e é retirada facilmente. Geralmente as taxas de
recuperação dos agrotóxicos ficam próximas de 90%, não sendo necessários outros processos
de purificação.32
A cromatografia em fase gasosa com detector por captura de elétrons também
pode ser utilizada em conjunto com a LLE para detecção de agrotóxicos organofosforados.33
3.4.2. Microextração em Fase Sólida
A SPME é uma microtécnica em que os processos de extração e pré-concentração de
analitos ocorrem numa escala dimensional que não é das mais usuais. O dispositivo básico de
SPME consiste de um bastão de fibra ótica de sílica fundida (FS) de 100µm de diâmetro, com
10 mm de uma extremidade recoberta com um filme fino de um polímero (e.g.
polidimetilsiloxano(PDMS), poliacrilato(PA) ou Carbowax(Cwx)) ou de um sólido
adsorvente (e.g. carvão ativo microparticulado (Carboxen)).34
Numa extração por SPME as moléculas do analito têm de se deslocar da matriz e
penetrar no recobrimento e, para isto, resistências às transferências de massa devem ser
vencidas, até que se estabeleça um equilíbrio de partição (ou de adsorção, para o caso de
recobrimentos sólidos) do analito entre a fibra e o meio que a envolve. Portanto, a teoria da
SPME baseia-se na cinética de transferência de massa entre fases e na termodinâmica que
descreve o equilíbrio de partição do analito entre elas.
Essa técnica de extração apresenta uma série de vantagens com relação à simplicidade
da amostragem, baixo custo relativo, a não utilização de solventes, maior precisão, menor
limite de detecção, reutilização da fibra e fácil automação.35
É uma técnica versátil já que a
retenção dos analitos pode ser feita na fase de vapor, ou seja, no espaço livre (headspace) em
equilíbrio sobre uma amostra sólida ou líquida ou também por imersão total da fibra em uma
amostra líquida (modo direto). A primeira modalidade é conhecida como microextração em
fase sólida em modo headspace (HS-SPME) e a segunda modalidade se denomina SPME
direta.36
São poucos os trabalhos encontrados na literatura que utilizam essa técnica para
determinação de clorpirifós em água, por ser uma das mais recentes utilizadas na extração de
agrotóxicos e por necessitar de um estudo de otimização dos vários parâmetros operacionais
que podem influenciar a extração. No entanto, a mesma vem ganhando popularidade em
muitos campos da ciência analítica para aplicação em amostras ambientais aquosas apesar de
alguns inconvenientes tais como o custo e fragilidade das fibras.37
29
A SPME difere das outras técnicas de extração para amostras aquosas pelo menor
tempo de análise e pela não utilização de solventes, minimizando a geração de descartes e a
exposição ocupacional. Ainda, é uma técnica simples, rápida e de fácil manuseio, além da
vantagem da utilização de pequena quantidade de amostra, podendo ser aplicada a diversas
áreas, tais como a farmacêutica, ambiental, alimentícia, de aroma, forense e toxicológica;
entretanto, embora seja uma técnica versátil, as condições de extração devem ser otimizadas
para cada tipo de amostra. Neste caso, os principais parâmetros a serem avaliados são o modo
de extração (headspace ou imersão direta, no caso de amostra líquida), tipo de fibra, pH,
velocidade de agitação, força iônica do meio, temperatura e volume da amostra.38
Para o desenvolvimento do método por SPME deve-seencontrar as condições de
trabalho que assegurem o máximo desempenho. Por outro lado, quanto maior o número de
fatores a investigar em um método analítico, maior também será o número de ensaios
necessários para se chegar à conclusão sobre as melhores condições operacionais.38
3.4.3. Cromatografia Gasosa Acoplada à Detecção por Captura de Elétrons
A cromatografia gasosa é atualmente a técnica instrumental mais utilizada em análises
de agrotóxicos por sua capacidade de separação eficiente dos compostos com similaridades
estruturais e pela existência de detectores com resposta de alta seletividade. Compostos
organofosforados são usualmente analisados utilizando-se os detectores: ECD, FPD,
fotométrico de chama pulsante (PFPD) e termoiônico seletivo (TSD), também conhecido
como detector para nitrogênio e fósforo (NPD). O detector ECD identifica com muita
eficiência compostos com P, S, NO2, C=O conjugado e halogenados.39
Os compostos organohalogenados são sensíveis ao ECD por possuírem em suas
estruturas químicas átomos eletronegativos, que captam ou atraem elétrons facilmente.40
O gás de arraste que alcança o detector é ionizado por elétrons que são emitidos de
uma lâmina que contém o isótopo radioativo 63
Ni. As moléculas do analito entram no detector
e capturam alguns deles causando redução da corrente elétrica que é convertida em sinal do
detector. O detector varia a frequência dos pulsos de potencial elétrico.41
Por depender de um conjunto complexo de fatores operacionais como o tipo de fonte
radioativa, a temperatura do detector, a pureza e a vazão do gás de operação, a frequência com
que ocorrem os pulsos de polarização, etc., o ECD não é um detector de fácil operação e, por
isto, é conveniente mantê-lo pronto para análises de amostras repetitivas.
O emprego do GC-ECD é favorável para a determinação da maioria dos agrotóxicos
por sua alta sensibilidade e seletividade, sendo a confirmação da identidade do
30
analitopodendo também ser realizada por cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de
massas.42
3.4.4. Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas
A GC-MS tem se mostrado uma técnica de alto potencial na determinação de um
elevado número de agrotóxicos. É eficiente para a quantificação e confirmação dos mesmos,
além de possuir excelente seletividade e sensibilidade. Assim, pode ser apontado que a grande
vantagem do uso dessa técnica é a possibilidade de ser confirmatória, pois cada pico pode ser
verificado através de seu espectro de massas podendo o detector ser sensível para um analito
ou um grupo de analitos de interesse.43
Os espectrômetros de massas consistem em um dispositivo capaz de classificar íons de
acordo com sua relação massa/carga (m/z), por meio do movimento destes em campos
elétrico e magnético. Com este equipamento é possível identificarátomos ou moléculas, quer
sejam das mais simples às mais complexas. Isto quer dizer que é possível se certificar do
composto que foi detectado, evitando possíveis erros de interpretação.44
A especificidade do detector MS vem da capacidade de selecionar para um
determinado composto o(s) íon(s) característico(s) ao longo do cromatograma. Os atuais
espectrômetros demassas comerciais aliados aos cromatógrafos modernos, usando colunas
capilares de alta eficiência, injetores mais eficientes na transferência da amostra para coluna,
sistemas automáticos de introdução da amostra e dotados de controle aprimorado de
temperatura e fluxo de gases permitem atingir sensibilidade para detectar quantidades
absolutas de até 0,5 pg do analito.45
Os espectrômetros de massas trabalham com íons positivos ou negativos de elementos
ou espécies moleculares em um sistema de ultra alto vácuo. A ionização da amostra é
fundamental, pois é necessário acelerar a massa no analisador que por sua vez faz a deflexão
dos íons em função da massa, da velocidade e da intensidade de campos elétrico e/ou
magnético. Existem várias técnicas de ionização, tais como: termo-ionização, plasma, impacto
de elétron e impacto de íon.46
A combinação da cromatografia gasosa coma espectrometria de massas é
relativamente simples, uma vez que as características de funcionamento do cromatógrafo a
gás são suficientemente compatíveis com a necessidade de alto vácuo do espectrômetro de
massas.47
Quando são utilizadas colunas capilares em GC é possível conectar a saída da coluna
diretamente à fonte do espectrômetro, uma vez que, em condições normais de operação, o
31
sistema de bombeamento do espectrômetro de massas é capaz de captar todo o eluente da
coluna. Quando são utilizadas colunas recheadas, a vazão do eluente deve ser reduzida antes
da sua entrada na fonte de ionização do espectrômetro. Para isto, podem ser utilizados
divisores de fluxo, mas seu desempenho não é tão satisfatório, uma vez que podem gerar
perdas na detectabilidade.48
Quando se faz o acoplamento da cromatografia com a espectrometria de massas
obtém-se o chamado cromatograma de massas que é assim denominado por se tratar de um
cromatograma constituído de todos os íons produzidos pelo espectrômetro de massas ou
apenas pelos íons de interesse.48
3.5. Validação Analítica
A necessidade de mostrar a qualidade de medições químicas por meio de sua
comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade está sendo cada vez mais reconhecida e
exigida. Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões desastrosas e a prejuízos
financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo método analítico gere informações
confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele deve sofrer uma avaliação denominada
validação. A validação de um método é um processo contínuo que começa no planejamento
da estratégia analítica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferência. Para
registro de novos produtos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a
validação da metodologia analítica e, para isso, a maioria deles tem estabelecido documentos
oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação. Um processo de
validação bem definido e documentado oferece às agências reguladoras evidências objetivas
de que os métodos e os sistemas são adequados para o uso desejado.49
No Brasil existem duas agências credenciadas para verificar a competência dos
laboratórios de ensaios, a ANVISA e o INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial). Segundo a ANVISA “a validação deve garantir através
de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados”.
Os parâmetros analíticos (Tabela 1) normalmente encontrados na validação de
métodos de separação são: seletividade, linearidade e faixa de aplicação, precisão, exatidão,
limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estes termos são conhecidos como
parâmetros de desempenho analítico, características de desempenho e algumas vezes, como
figuras analíticas de mérito.49
32
Tabela 1. Parâmetros ANVISA e INMETRO para validação de métodos analíticos.
ANVISA INMETRO
Especificidade/seletividade
Intervalos da curva de calibração
Linearidade
Curva de calibração
Limite de detecção (LOD)
Limite de quantificação (LOQ)
-
Exatidão
Precisão
Repetibilidade (precisão intracorrida)
Precisão intermediária (precisão intercorrida)
Reprodutibilidade (precisão interlaboratorial)
Robustez
-
Especificidade/seletividade
Faixa de trabalho e faixa linear de trabalho
Linearidade
-
Limite de detecção (LOD)
Limite de quantificação (LOQ)
Sensibilidade (inclinação da curva)
Exatidão e tendência
Precisão
Repetitividade
Precisão intermediária
Reprodutibilidade
Robustez
Incerteza de medição
Fonte: ref. 49.
3.5.1. Seletividade
A seletividade é o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um método
instrumental de separação e possui a capacidade de avaliar de forma inequívoca as substâncias
em exame na presença de componentes que podem interferir com a sua determinação em uma
amostra complexa. Ela garante que o pico de resposta seja exclusivamente do analito de
interesse.49
Em cromatografia, uma das formas de avaliar a seletividade é comparar o
cromatograma da matriz isenta da substância de interesse com o da matriz adicionada com
esta substância.
A matriz da amostra pode conter componentes que interferem no desempenho da
medição. Os interferentes podem aumentar ou reduzir o sinal. Se a seletividade não for
assegurada, a linearidade, a tendência e a precisão estarão seriamente comprometidas.50
3.5.2. Linearidade e Faixa de Aplicação
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer resultados diretamente
proporcionais à concentração da substância em exame dentro de uma determinada faixa de
33
aplicação. A faixa de aplicação corresponde ao intervalo entre o valor superior e inferior de
concentração da substância em exame, que atenda aos requisitos de precisão e exatidão. A
faixa de aplicação é normalmente expressa nas mesmas unidades dos resultados obtidos pelo
método e depende do uso em questão.51
Na prática, a linearidade é determinada por meio das chamadas curvas analíticas, que
são gráficos de calibração que relacionam a resposta do equipamento em função das
diferentes concentrações do analito. Para a maioria das técnicas cromatográficas, observa-se
uma relação linear de primeira ordem entre a resposta instrumental medida (eixo y – variável
dependente) e a concentração do analito (eixo x – variável independente). Essa relação produz
uma equação de regressão linear (Equação 1) que relaciona as duas variáveis x e y e gera os
coeficientes de regressão ‘a’ (inclinação da curva) e ‘b’ (interseção da curva analítica com o
eixo y, quando x = 0).
ax
A Equação 1 é válida para um intervalo determinado de concentração do analito,
independente da técnica instrumental utilizada. Também é possível calcular o coeficiente de
determinação (R2), que pode ser utilizado como um indicativo da qualidade da curva analítica,
uma vez que demonstra uma menor variação dos dados obtidos quanto mais próximo de 1 for
seu valor.49
Valores de R2
iguais ou superiores a 0,99 e 0,90 são recomendados,
respectivamente, pela ANVISA52
e pelo INMETRO.50
Assim, um coeficiente de determinação
maior que 0,999 é considerado como evidência de um ajuste ideal dos dados para a linha de
regressão linear.
A faixa de trabalho deve cobrir a faixa de concentração dos agrotóxicos para o qual o
ensaio será aplicado, na qual a concentração central deve ser, sempre que possível, a
concentração previsível nos ensaios. Os valores inferiores dos limites de detecção e
quantificação são considerados muitas vezes como a sensibilidade do método e devem ser
distinguidos do branco do método. O limite superior da faixa de trabalho depende da
limitação do sistema de resposta do equipamento, sendo que a linearidade do método deverá
ser constante em toda a extensão da faixa de trabalho.
Em relação à quantificação do analito, esta pode ser feita por meio dos seguintes
métodos: padronização externa, padronização interna, superposição da matriz e adição de
padrão.49
34
3.5.3. Precisão
Precisão do método analítico é o grau de concordância entre resultados de medidas
independentes em torno de um valor central, efetuadas várias vezes em uma amostra
homogênea, sob condições pré-estabelecidas. É expressa em termos de desvio padrão (SD) e
desvio padrão relativo (RSD), também apresentados como coeficiente de variação (CV), o
qual pode ser calculado pela Equação 2:53
CV ( ) esvio padrão das replicatas da amostra
Média das replicatas da amostra
Em métodos de análise de traços ou impurezas são aceitos RSD de até 20%
dependendo da amostra. Uma maneira simples de melhorar a precisão é aumentar o número
de replicatas. A precisão em validação de métodos é considerada em três níveis diferentes:26
(a) Repetitividade: representa a concordância entre os resultados de medições
sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas
condições de repetitividade: mesmo procedimento, mesmo analista, mesmo instrumento
usado sob as mesmas condições, mesmo local e repetições no menor espaço de tempo
possível;49
(b) Precisão intermediária: indica o efeito das variações dentro do laboratório devido a
eventos como diferentes dias, diferentes analistas, diferentes equipamentos ou uma
combinação destes fatores. O objetivo da validação em termos da precisão intermediária é
verificar que no mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados;49
e
(c) Reprodutibilidade: representa a concordância entre os resultados das medidas de
uma mesma amostra efetuadas sob condições variadas (mudança de operador, local e
equipamentos, etc.).49
3.5.4. Exatidão
Representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um
determinado ensaio e um valor aceitável como referência, sendo este valor obtido por uma
medição perfeita. O número de ensaios varia segundo a legislação ou diretriz adotada.49
A
ICH54
(Conferência Internacional de Harmonização) e a ANVISA52
recomendam a coleta de
dados referentes a um mínimo de nove determinações sobre um mínimo de três diferentes
concentrações. A exatidão é expressa como o percentual de resposta da quantidade conhecida
35
adicionada. Na indisponibilidade de material de referência certificado a exatidão, geralmente
expressa em porcentagem, pode ser avaliada por meio dos ensaios de fortificação e
recuperação, definidos como a proporção da quantidade da substância de interesse, presente
ou adicionada na porção analítica do material teste, podendo ser calculada utilizando a
Equação 3.
( ) C C
C
Em que: C1 = concentração determinada na amostra fortificada; C2 = concentração
determinada na amostra não fortificada; e C3 = concentração usada para fortificação.
3.5.5. Limite de Detecção
O limite de detecção representa a menor concentração da substância em exame que
pode ser detectada, não necessariamente quantificada, utilizando um determinado
procedimento experimental. O LOD pode ser calculado de três maneiras diferentes: método
visual, método relação sinal-ruído (normalmente 3:1) e o método baseado em parâmetros da
curva analítica:49
(a) Método visual: utiliza a adição de concentrações mínimas e conhecidas dos
analitos em solvente de maneira que se possa distinguir os sinais, e a menor concentração
visível detectável do ativo é utilizada para determinar o LOD;
(b) Método relação sinal-ruído: comparação entre a medição dos sinais de amostras em
baixas concentrações conhecidas e um branco (matriz isenta do composto de interesse); e
(c) Método baseado em parâmetros da curva analítica: é feita uma curva analítica
utilizando a matriz contendo o composto de interesse na faixa de concentração próxima ao
limite de detecção.
3.5.6. Limite de Quantificação
O limite de quantificação representa a menor concentração da substância em exame
que pode ser medida utilizando um determinado procedimento experimental. Os critérios para
calcular o LOD podem ser adotados para calcular o LOQ, ou seja, o LOQ pode ser calculado
utilizando o método visual, o método sinal-ruído (normalmente 10:1) e o método baseado em
parâmetros da curva analítica, sendo este estatisticamente mais confiável.49
36
3.5.7. Robustez
A robustez de um método corresponde à capacidade deste não ser afetado por uma
pequena variação em seus parâmetros. A robustez de um método cromatográfico é avaliada
pela variação dos parâmetros operacionais e a provável determinação dos seus efeitos (se
houver) sobre os resultados a serem obtidos com a metodologia. Diz-se que um método é
robusto quando ele não é afetado por uma modificação pequena e deliberada em seus
parâmetros. As mudanças introduzidas refletem as alterações que podem ocorrer quando um
método é transferido para outros laboratórios, analistas ou equipamentos.49
3.6. Métodos Quimiométricos
Com o desenvolvimento da microeletrônica e a popularização dos microcomputadores,
ocorreu um avanço significativo nas análises químicas instrumentais que possibilitou a
aquisição de maneira fácil e rápida de um grande número de dados de uma mesma amostra.
Consequentemente, o tratamento desses dados passou a exigir modelos mais complexos que
vão além dos tradicionais métodos estatísticos univariados.55
Hoje, a utilização de métodos multivariados a dados químicos está bem difundida e
aceita pela comunidade científica, consistindo uma área denominada quimiometria. A
quimiometria não é uma disciplina da matemática, mas sim da química, isto é, os problemas
que ela se propõe a resolver são de interesse e originados na química, ainda que as
ferramentas de trabalho provenham principalmente da matemática, estatística e computação.
Muita ênfase tem sido dada aos sistemas multivariados, nos quais se pode medir muitas
variáveis simultaneamente, ao se analisar uma amostra qualquer. Nesses sistemas, a
conversão da resposta instrumental no dado químico de interesse requer a utilização de
técnicas de estatística multivariada, álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas se
constituem no momento na melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição
do máximo de informação sobre o sistema.
As ferramentas quimiométricas empregam métodos matemáticos e estatísticos para
planejar ou selecionar experimentos de forma otimizada e para fornecer o máximo de
informação química com a análise dos dados obtidos. Atualmente a quimiometria já é
suficientemente estabelecida e de uso disseminado para que justifique sua introdução em
cursos regulares da área de química e áreas afins.56
37
3.6.1. Planejamentos Experimentais
Com o advento da quimiometria, o uso de experimentos estatisticamente planejados
cresceu rapidamente em vários campos de pesquisa no Brasil, especialmente química,
engenharia química, engenharia de alimentos e biotecnologia. Os planejamentos
experimentais mais usados no Brasil são os fatoriais, completos ou fracionários, e os
planejamentos compostos centrais. Exemplos de utilização destes métodos são amplamente
encontrados em revistas científicas.59
A maioria dos planejamentos baseados em princípios de estatística multivariada
envolve de uma meia dúzia até varias dezenas de experimentos. É recomendável que os
experimentos sejam executados em ordem aleatória, para se obter uma estimativa confiável da
extensão do erro experimental. No entanto, químicos ou engenheiros muitas vezes trabalham
com fatores que são difíceis de variar frequentemente. Mudar os níveis desses fatores cada
vez que um experimento fosse executado poderia inviabilizar um projeto experimental ou
causar demoras inaceitáveis na obtenção de resultados. Problemas deste tipo podem ser
abordados com planejamentos do tipo lote repartido (split-plot), que permitem que variáveis
difíceis de ajustar sejam mudadas em ordem aleatória somente em blocos de experimentos,
enquanto os níveis dos fatores menos problemáticos são variados em ordem aleatória para
todos os experimentos. Este procedimento facilita os aspectos operacionais no laboratório,
mas tem seus inconvenientes. A estatística envolvida na análise dos dados é bem mais
complexa que a dos planejamentos com ensaios feitos em ordem totalmente aleatória.
Planejamentos split-plot têm sido muito empregados em estudos agrícolas para os quais, aliás,
foram inventados, o que explica a terminologia. O "lote repartido", originalmente, era um lote
de terreno. Quase todos esses estudos, porém, se limitam a fazer uma análise da variância
(ANOVA) dos dados experimentais. Para um químico, normalmente é mais interessante ir
além da ANOVA e desenvolver um modelo mostrando como os resultados da pesquisa ou as
propriedades do sistema variam em função das mudanças nos níveis dos fatores
experimentais.59
No planejamento de qualquer experimento, o primeiro passo é decidir quais são os
fatores e as respostas de interesse. Os fatores são as variáveis que o experimentador tem
condições de controlar. As respostas de interesse são as variáveis de saída do sistema as quais
se está interessado e que serão, ou não, afetadas por modificações provocadas nos
fatores.57
Dependendo do problema pode-se ter várias respostas de interesse, que talvez devam
38
ser consideradas simultaneamente, que é o caso da análise de múltiplas respostas em
determinações cromatográficas.55, 58-59
Tendo identificado todos os fatores e respostas, a próxima etapa é definir o objetivo
que se pretende alcançar com os experimentos para que se tenha condições de escolher o
planejamento mais apropriado e a metodologia experimental (tempo, custo, etc.). Objetivos
diferentes necessitarão planejamentos diferentes.57, 60
Fatores significativos selecionados após execução de um planejamento adequado de
triagem (planejamento fatorial completo ou planejamento fatorial fracionário) podem ser
empregados em uma metodologia de análise de superfície de resposta (RSM). Dentre as RSM,
os planejamentos Doehlert e composto central (CCD), possivelmente, são os mais
utilizados.60
Planejamentos experimentais são muito úteis para otimização das condições
operacionais dos procedimentos cromatográficos e de extração. Além disso, outra
metodologia quimiométrica de otimização, que emprega algoritmo genético em conjunto com
as redes neurais artificiais (abordagem neuro-genética)55,58
, pode ser utilizada. Esta
abordagem permite a otimização de muitas respostas simultaneamente e nas situações onde
ocorre falta de ajuste do modelo de regressão linear múltipla dos planejamentos
experimentais.
Não foram encontrados na literatura investigada, até o presente momento, estudos que
utilizassem planejamentos experimentais multivariados para determinação de clorpirifós em
águautilizando as técnicas de extração/pré-concentração LLE-LTP e HS-SPME, com
separação cromatográfica e determinação empregando detector por captura de elétrons e
espectrometria de massas.
39
4. Materiais e Métodos
4.1. Área de Estudo
O município de Ouro Branco está localizado na região central do estado de Minas
Gerais. O clima predominante é o tropical de altitude, apresentando temperatura mínima em
torno de 13 ºC no inverno, com grande estiagem e baixa umidade do ar. No verão apresenta
temperatura média em torno de 22 ºC, com altos índices pluviométricos. A vegetação divide-
se em três tipos:
(a) cerrado com vegetação rala;
(b) remanescente de Mata Atlântica; e
(c) em porções mais elevadas surgem os campos rupestres, adaptados a temperaturas
mais baixas.
As principais culturas do município são: 45,6% da área plantada de batata inglesa,
31,7% de milho, 14,3% batata baroa e 8,4% com demais culturas.61
Ouro Branco possui uma população de 35.268 habitantes, dos quais 31.608 residem na
zona urbana e 3.659 moram na zona rural.61
É constituída de diversas comunidades rurais
(Figura 3) e após as várias visitas de campo e consultas às secretarias, pessoas e órgãos
competentes do município, definiu-se as regiões e pontos de coleta alvo do monitoramento
proposto neste projeto.
40
Figura 3. Comunidades rurais (delimitações circulares em cinza) da cidade de Ouro Branco/MG. Fonte: ref. 62.
A área de avaliação deste projeto tem importância significativa no que tange os
recursos hídricos, pois, além de fazer parte de duas bacias hidrográficas federais, bacia do Rio
Doce e bacia do Rio São Francisco, constituem importante zona de recarga hídrica local e
41
regional. A parte leste da cidade tem seus recursos hídricos direcionados para a bacia
hidrográfica do Rio Doce, enquanto a maior porção das águas do município converge para a
bacia do São Francisco, via médio curso do rio Paraopeba.
4.2. Coleta
Os cursos d’água próximos às plantações de batata inglesa foram escolhidos, pois esta
cultura tem uma das produções agrícolas mais intensivas e predominantes na utilização de
agrotóxicos no município de Ouro Branco.
Por meio de trabalho de campo e consultas às secretarias, pessoas e órgãos
competentes do município foi possível identificar os principais bataticultores da zona rural de
Ouro Branco bem como as principais plantações de batata inglesa próximas aos cursos
d’água. Observou-se também os pontos de escoamento das precipitações, presença de mata
ciliar e declividade dos terrenos plantados para se definir os pontos de coleta das amostras de
água, georreferenciando tudo com o uso do equipamento de sistema de posicionamento global
(GPS). Posteriormente os dados do georreferenciamento foram tratados utilizando o programa
ArcGis para confecção do mapa geográfico com os pontos de coleta.
Foram selecionados 10 pontos de coleta, todos em sistemas hídricos superficiais. As
coletas foram realizadas nos meses de março e dezembro de 2011, durante o período de alta
precipitação pluviométrica, e junho, julho e agosto de 2011, durante o período de estiagem.
Intencionou-se com as coletas realizar o monitoramento de clorpirifós nos corpos d’água
avaliados, considerando períodos sazonais distintos.
Todas as coletas foram realizadas utilizando recipientes de vidro âmbar de 1 L
previamente lavados com o detergente não-iônico Extran 12,5% (v/v) com o auxílio de uma
escova, enxaguados exaustivamente com água corrente e, em seguida, enxaguados com
quantidade suficiente de água ultrapura para retirar os vestígios de água de torneira. Após esta
etapa, todas as vidrarias foram mantidas imersas, durante 24 h, em solução de ácido nítrico
(Sigma-Aldrich) 10 % (v/v) e, em seguida, enxaguadas com água ultrapura.
Antes da coleta, os frascos foram enxaguados com a própria água do manancial tendo
em vista reduzir a contaminação por fontes externas. As amostras foram coletadas no centro
do rio, tendo como referências pontes, a fim de evitar possíveis interferências das margens. A
profundidade não foi aferida por se tratar de rios de pouca profundidade. Foram coletados
990 mL de água por ponto de coleta sendo adicionados 10 mL de metanol (Mallinckrodt, grau
HPLC) para preservação das amostras. Logo após, as amostras foram armazenadas em caixas
42
de isopor contendo gelo químico. As mesmas foram transportadas para o Laboratório de
Estudos em Quimiometria (LEQ), da Universidade Federal de Ouro Preto, sob coordenação
da professora Gilmare Antônia da Silva, e armazenadas sob refrigeração a 4 ºC. Para a
filtração das amostras foram usados filtros de diâmetro de poro de 25 e 8 µm de membrana de
celulose e filtros de 1,2 µm de fibra de vidro, em um sistema de filtração a vácuo (Figura 4), a
fim de eliminar material particulado.
Figura 4. Ilustração do sistema de filtração a vácuo utilizado no trabalho.
4.3. Reagentes e Solventes
O padrão do inseticida clorpirifós de grau de pureza 99,9% foi obtido da Supelco. Foi
preparada solução estoque individual de 1000 µg/mL de clorpirifós diluindo-se a quantidade
apropriada em acetonitrila (Tedia/HPLC-Spectro). As soluções de trabalho em concentrações
adequadas foram obtidas pela diluição da solução estoque e armazenadas a 4ºC. Nos estudos
de avaliação da força iônica utilizou-se hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4, Vetec PA
98,5%).
4.4. Definições do Estudo para Determinação de Clorpirifós
Para a determinação de clorpirifós em água, foram avaliadas como técnicas de preparo
de amostras a extração líquido-líquido com partição a baixa temperatura e a microextração em
fase sólida com headspace e, como técnicas de determinação, a cromatografia gasosa com
detecção por captura de elétrons e a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas.
43
Foram realizados os planejamentos multivariados fatorial completo 24 (triagem) e a
matriz Doehlert (metodologia para construção de superfície de resposta) para o estudo e
otimização das variáveis operacionais de extração das técnicas LLE-LTP e da HS-SPME.
Para a montagem dos planejamentos e tratamento dos resultados foram utilizadas planilhas
eletrônicas para cálculos de planejamentos experimentais, disponíveis no site do Laboratório
de Quimiometria Teórica e Aplicada (LQTA) da Universidade Estadual de Campinas.62
As medidas por GC-ECD foram realizadas em parceria com a Universidade Federal de
Viçosa por meio da colaboração com os professores Antônio Augusto Neves e Maria Eliana
Lopes Ribeiro de Queiróz, responsáveis pelo Laboratório de Química Analítica (LAQUA), e
as medidas por GC-MS foram realizadas no Laboratório de Caracterização
Molecular/Espectrometria de Massas (LCM/EM) da Universidade Federal de Ouro Preto, sob
coordenação dos professores Maurício Xavier Coutrim e Robson José de Cássia Franco
Afonso.
4.5. Avaliação das Técnicas de Extração/Pré-concentração
Para a LLE-LTP foram usados frascos de vidro transparente com tampa e septo de
Teflon, de 22 mL de capacidade, sendo adicionados aos mesmos, volumes de água fortificada
com padrão de clorpirifós de acordo com o planejamento fatorial completo 24, com 4
replicatas no ponto central (pc), para investigação das variáveis operacionais do sistema
(Tabela 2). Posteriormente, foi adicionado Na2HPO4 para manter a força iônica dos ensaios
prevista no planejamento (Tabela 2). Cada solução foi mantida sob agitação contínua durante
20 s. Em seguida, foram adicionados volumes da mistura extratora acetonitrila: acetato de
etila (6,5:1,5), conforme descrito na Tabela 2. O sistema permaneceu sob agitação mecânica a
180 rpm, em mesa agitadora (Tecnical TE-420), por tempos definidos pelo planejamento
fatorial completo utilizado (Tabela 2), à temperatura de 25 ºC. Os ensaios foram feitos em
ordem aleatória no intuito de evitar erros sistemáticos e possíveis influências externas não
avaliadas. Após a agitação, os ensaios foram deixados em freezer a aproximadamente -20 ºC
por 3 h, para a separação das fases. Depois desse período, a fase orgânica foi separada da fase
aquosa; a fase orgânica foi retirada com a ajuda de uma pipeta. Os extratos armazenados em
vials foram deixados em freezer até o momento da análise cromatográfica. O procedimento
global se repetiu para ambos os planejamentos fatorial e Doehlert, que permite investigar as
variáveis que apresentaram os efeitos mais significativos no planejamento de triagem em um
número maior de níveis, de acordo com as designações deste.
44
Tabela 2. Planejamento fatorial completo 24, com 4 replicatas no ponto central (pc), para investigação das
variáveis experimentais do método LLE-LTP: volume de fase aquosa (mL), volume de fase orgânica (mL),
tempo de agitação(min) e concentração de eletrólito (mol/L). Os valores em parênteses indicam os níveis
decodificados.
Ensaio Volume de Fase
Aquosa (mL)
Volume de Fase
Orgânica (mL)
Tempo de
Agitação (min)
Concentração de
Eletrólito (mol/L)
1 -1(4,0) -1(4,0) -1(5) -1(0)
2 1(6,0) -1(4,0) -1(5) -1(0)
3 -1(4,0) 1(6,0) -1(5) -1(0)
4 1(6,0) 1(6,0) -1(5) -1(0)
5 -1(4,0) -1(4,0) 1(15) -1(0)
6 1(6,0) -1(4,0) 1(15) -1(0)
7 -1(4,0) 1(6,0) 1(15) -1(0)
8 1(6,0) 1(6,0) 1(15) -1(0)
9 -1(4,0) -1(4,0) -1(5) 1(0,02)
10 1(6,0) -1(4,0) -1(5) 1(0,02)
11 -1(4,0) 1(6,0) -1(5) 1(0,02)
12 1(6,0) 1(6,0) -1(5) 1(0,02)
13 -1(4,0) -1(4,0) 1(15) 1(0,02)
14 1(6,0) -1(4,0) 1(15) 1(0,02)
15 -1(4,0) 1(6,0) 1(15) 1(0,02)
16 1(6,0) 1(6,0) 1(15) 1(0,02)
17pc
0(5,0) 0(5,0) 0(10) 0(0,01)
Na HS-SPME foram usados frascos de vidro de 16 mL de capacidade com tampa de
teflon e septo de silicone contendo Na2HPO4para o estudo do efeito salting out e volumes de
água fortificados com padrão de clorpirifós de acordo com o planejamento fatorial completo
utilizado (Tabela 3). Os frascos foram transferidos para um banho termostatizado (IKA-R) e o
sistema manteve-se constantemente aquecido com as temperaturas variadas de acordo com as
designações do planejamento multivariado (Tabela 3). Para as extrações empregou-se um
suporte (holder) manual (Supelco). A fibra utilizada foi definida após avaliação dos seguintes
materiais de recobrimento: polidimetilsiloxano com espessura de 100 µm (PDMS100),
polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVB), carboxen/polidimetilsiloxano
(Carboxen/PDMS) e divinilbenzeno/carboxen/polidimetilsiloxano
45
(DVB/CARBOXEN/PDMS), todas adquiridas da Supelco. A fibra foi colocada em contato
com a fase gasosa do ensaio (headspace), com o meio sob agitação utilizando barra magnética
revestida com Teflon durante os períodos de tempo apontados pelo planejamento (Tabela 3).
Após a extração, a fibra foi retraída, retirada do frasco e, em seguida, introduzida no
cromatógrafo a gás para dessorção dos analitos durante 10 min (tempo da corrida
cromatográfica) sob fluxo do gás de arraste (N2). O procedimento global se repetiu para
ambos os planejamentos fatorial e Doehlert, de acordo com as designações deste.
Tabela 3. Planejamento fatorial completo 24, com 4 replicatas no ponto central (pc), para investigação das
variáveis experimentais do método HS-SPME: tempo de extração (min), temperatura de extração (°C),
concentração de eletrólito (mol/L) e volume de amostra (mL). Os valores em parênteses indicam os níveis
decodificados.
Ensaio Tempo de
Extração (min)
Temperatura de
Extração (°C)
Concentração de
Eletrólito (mol/L)
Volume de
Amostra (mL)
1 -1(30) -1(50) -1(0) -1(5)
2 1(60) -1(50) -1(0) -1(5)
3 -1(30) 1(80) -1(0) -1(5)
4 1(60) 1(80) -1(0) -1(5)
5 -1(30) -1(50) 1(0,04) -1(5)
6 1(60) -1(50) 1(0,04) -1(5)
7 -1(30) 1(80) 1(0,04) -1(5)
8 1(60) 1(80) 1(0,04) -1(5)
9 -1(30) -1(50) -1(0) 1(9)
10 1(60) -1(50) -1(0) 1(9)
11 -1(30) 1(80) -1(0) 1(9)
12 1(60) 1(80) -1(0) 1(9)
13 -1(30) -1(50) 1(0,04) 1(9)
14 1(60) -1(50) 1(0,04) 1(9)
15 -1(30) 1(80) 1(0,04) 1(9)
16 1(60) 1(80) 1(0,04) 1(9)
17pc
0(45) 0(65) 0(0,02) 0(7)
46
4.6. Instrumentação
As análises cromatográficas para ambos os métodos de extração investigados foram
realizadas em um cromatógrafo a gás Shimadzu – modelo 2014, com detector por captura de
elétrons.
Foi utilizado também para comparação dos métodos de extração e avaliação do
sistema de detecção, um cromatógrafo a gás Shimadzu QP 2010S – Plus equipado com
amostrador automático e controle eletrônico de fluxo acoplado ao espectrômetro de massas.
Quando da detecção por espectrometria de massas utilizou-se um detector contendo
uma fonte de ionização por elétrons (EI – 70 eV) e um analisador de massas quadrupolo,
operado no modo de varredura linear (SCAN – 40 -500 m/z)para identificação dos compostos
e no modo de monitoramento de íons específicos (SIM). Foi monitorado o íon 314 para o
inseticida clorpirifós. O comportamento e as áreas dos picos foram avaliados utilizando o
software GC-MS Solutions - Shimadzu.
4.7. Condições Cromatográficas
No GC-ECD as separações foram realizadas em coluna capilar HP-5 (Agilent; 5%
fenil / 95% dimetilpolisiloxano com 30 m ×0,25 mm de diâmetro interno × 0,1 µm de
espessura de filme). As condições de análise cromatográfica foram: temperatura do injetor
280 ºC, temperatura do forno 150 ºC com rampa de aquecimento de 20 ºC/min até 290 ºC e
temperatura do detector de 300 ºC, vazão do gás de arraste (N2) de 1,2 mL/min e divisão de
fluxo (split) de 1:5. Para a LLE-LTPo tempo de corrida foi de 7 min e para aHS-SPME
10 min, ficando a fibra exposta durante todo o tempo da análise para dessorção completa do
analito; para a LLE-LTP o volume de injeção foi de 1 µL.
Para as análises por cromatografia com detecção por espectrometria de massas foi
empregada também uma coluna HP-5. O injetor foi mantido a 280 ºC. A temperatura do
forno foi de 50 até 280 ºC com rampa de aquecimento de 50 ºC/min até 150 ºC e de 20ºC/min
até 280 ºC; a temperatura do detector foi de 280 ºC e vazão do gás de arraste (He) foi de
1,33 mL/min sem razão de divisão de fluxo (splitless). O tempo de corrida foi de 13 min. O
GC-MS foi utilizado apenas para os extratos obtidos da LLE-LTP e confirmação do analito
nas amostras naturais.
47
4.8. Validação do Método Analítico
Um método é validado a fim de assegurar que a metodologia é exata e precisa sobre
uma faixa específica de concentração em que uma substância será analisada. Dessa forma
foram avaliados os parâmetros seletividade, limite de detecção, limite de quantificação,
linearidade, faixa de trabalho, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão
para determinação de clorpirifós em água superficial,de acordo com as principais agências
reguladoras (ANVISA e INMETRO).50, 52
4.8.1. Seletividade
A seletividade foi avaliada aplicando o método de extração escolhido e otimizado em
amostras de água superficial. Para essa avaliação comparou-se os cromatogramas obtidos
após a extração da matriz isenta da substância de interesse e a matriz fortificada com a
solução padrão de clorpirifós.
4.8.2. Limite de Detecção e Limite de Quantificação do Método
Os limites de detecção e quantificação do método foram determinados pela razão
sinal/ruído (S/N). Amostras de água fortificadas com o analito de interesse, em concentrações
decrescentes, foram submetidas ao procedimento de extração escolhido e otimizado. Foram
empregadas as concentrações entre 5,00 e 0,05 µg/L de clorpirifós. Foram considerados como
LOD e LOQ aquelas concentrações que produziram sinais três e 10 vezes, respectivamente,
superiores ao ruído da linha de base.
4.8.3. Linearidade do Método e Faixa de Trabalho
Amostras de água superficial foram fortificadas com clorpirifós nas concentrações de
1,67; 2,50; 5,00; 27,5; 50,0; 75,0 e 100,0 µg/Le submetidas ao processo de extração escolhido
e otimizado. Avaliou-se a linearidade pelo coeficiente de determinação obtido da curva
analítica.
O estudo da faixa de trabalho foi realizado com a construção de curva analítica
preparada pela fortificação de amostras de água superficial com clorpirifós nas concentrações
do LOQ e ~23LOQ. Cada nível de concentração foi extraído em triplicata.
48
4.8.4. Precisão
A precisão do método estudado foi verificada em termos de repetitividade e precisão
intermediária.
A repetitividade do método de extração de clorpirifós em amostras de água superficial
foi determinada, conforme sugerido pelo INMETRO50
, realizando sete extrações idênticas do
agrotóxico na concentração equivalente a 3LOQ, segundo a metodologia otimizada,
avaliando-se o coeficiente de variação.
A precisão intermediária foi determinada avaliando-se o valor do coeficiente de
variação, obtido após análises executadas em três dias diferentes (dias 1, 3 e 5). As extrações
e análises foram feitas com sete repetições pelo mesmo analista em interdias. Para a
avaliação da precisão intermediária foram empregadas amostras fortificadas com clorpirifós
em concentrações equivalente a 3LOQ.
4.8.5. Exatidão
Para avaliar a exatidão do método foram determinadas as recuperações relativas do
analito de interesse. Os ensaios foram realizados em triplicata, empregando amostras de água
superficial fortificadas com clorpirifós em 3 concentrações 1,67; 5,00 e 16,7 µg/L (níveis
baixo, médio e alto).
As amostras foram submetidas ao método desenvolvido e otimizado e a concentração
do analito foi calculada pela equação obtida por regressão linear da curva analítica. As
recuperações relativas foram determinadas comparando-se as concentrações encontradas com
as concentrações após fortificação.
49
5. Resultados e Discussão
5.1. Região de Estudo
Inicialmente realizou-se o levantamento de informações em entidades de Ouro
Branco/MG (Prefeitura Municipal e EMATER) sobre o cultivo de batata na zona rural da
cidade. Sabe-se que aproximadamente 50 produtores cultivam a batata inglesa em Ouro
Branco, sendo sua maior concentração na comunidade de Castiliano. O município de Ouro
Branco conta com duas bacias hidrográficas; Rio Doce e São Francisco. A maioria das
plantações encontra-se na bacia do São Francisco.
Alguns problemas enfrentados pelos órgãos municipais incluem a conscientização
sobre o uso de equipamento de proteção individual (EPI) na aplicação dos agrotóxicos pelos
bataticultores e também o descarte adequado das embalagens, encontradas inclusive em
nascentes próximas das plantações (Figura 5).
Figura 5. (a) Descarte inadequado de embalagens em nascente próxima à plantação; (b) Aplicação de agrotóxico
sem EPI em plantação de batata na zona rural de Ouro Branco/MG; (c) Descarte inadequado de embalagens em
matas ciliares; e (d) Exposição a agrotóxicos sem EPI e descarte inadequado de embalagens.
a) b)
c) d)
50
Muitos trabalhadores rurais no município de Ouro Branco possuem baixa instrução
educacional, o que possivelmente indica uma inabilidade para o desempenho da função, uma
vez que a leitura do rótulo e o entendimento dos procedimentos de preparação e aplicação são
condições indispensáveis para o manejo e aplicação dos agrotóxicos. Ainda, na zona rural de
Ouro Branco, a população não conta com rede de abastecimento de água tratada. Dessa forma,
se utiliza os sistemas hídricos in natura como fonte de água para consumo direto. Em algumas
das plantações visitadas, as nascentes localizam-se dentro de terrenos plantados. Assim os
efeitos negativos da contaminação por agrotóxicos à saúde humana provavelmente são
potencializados pela falta de infraestrutura e de condições socioeconômicas da população
exposta à contaminação. Durante os trabalhos de campo foram relatados casos de
intoxicação, e também de mortes, que ocasionaram o afastamento de alguns produtores
contaminados do cultivo da batata inglesa.
Talvez o maior problema com relação ao agrotóxico é que na maioria dos casos o
produtor rural não usa a quantidade recomendada. Este fato pode explicar o número crescente
de doenças causadas por intoxicações por agrotóxicos no país.67
Constatou-se por meio de pesquisas anteriores2 que algumas comunidades rurais de
Ouro Branco possuem um número significativo de moradores com patologias
cardiovasculares (hipertensão) e afecções no trato respiratório; dados esses que apresentam
estreita relação com fatores como: a utilização contínua de agrotóxicos, as condições precárias
de moradia, a deficiência de saneamento básico e a dificuldade de obtenção de tratamento
médico.2 Aliado a isso, verificou-se, por meio da Secretaria Municipal de Saúde, que as
comunidades rurais apresentam muitos casos de diabetes, cefaleia, perturbação visual e aborto
espontâneo, enfermidades que também tem correlação direta com a exposição da população a
agrotóxicos.2 Uma das comunidades estudadas apresentou 18% da população com
hipertensão, 12% com perturbação visual e 5% das mulheres já tiveram aborto espontâneo.2
Observando os efeitos negativos de uma potencial contaminação por agrotóxicos à
saúde da população local, este estudo pretendeu analisar a possibilidade de contaminação por
clorpirifós dos sistemas hídricos superficiais próximos às principais regiões de cultura de
batata inglesa na zona rural do município de Ouro Branco/MG. A batata inglesa em Ouro
Branco é plantada utilizando terrenos bastante inclinados e próximos a cursos d’água a fim de
favorecer a irrigação. As características geomorfológicas da região quando associadas a um
solo pobre e intemperizado favorecem a contaminação dos sistemas hídricos. A declividade
elevada favorece o processo de deflúvio superficial, enquanto a erosão do solo e a falta de
cobertura vegetal favorecem o processo de lixiviação dos agrotóxicos.
51
5.2. Coleta
Para as análises das amostras de água superficial foram selecionados 10 pontos de
coleta, evidenciados no mapa geográfico da Figura 6, após georreferenciamento (Tabela 4),
nas seguintes comunidades que pertencem à bacia do São Francisco na cidade de Ouro
Branco/MG:
Comunidade de Campestre: a 6 km da sede, possui uma população de 122 habitantes;
Comunidade de Carreiras: a 7 km da sede municipal, liga Ouro Branco a Conselheiro
Lafaiete. Os habitantes se dividem em ocupações agrícolas ou empregos fixos na zona urbana
das duas cidades. População de 435 habitantes;
Comunidade de Castiliano: localiza-se a 9 km da sede municipal, limita-se com
Itaverava. Tem na cultura da batata seu principal fator de renda e emprego. Conta com 430
habitantes;
Comunidade de Geada: encontra-se a 7 km da sede municipal. Possui várias
plantações de batata, por consequência é nesta comunidade que reside o maior bataticultor da
cidade. O abastecimento de água provém de nascentes muitas vezes localizadas em meio às
plantações. População de 153 habitantes; e
Comunidade de João Gote: a 5 km da sede municipal, conta com uma população de
223 habitantes. O abastecimento de água se dá através de nascentes.
Tabela 4. Coordenadas geodésicas dos pontos de coleta. S= Sul e W= Oeste.
Pontos de coleta Coordenadas
1 S: ° 4’5 ” W: 4 °4 ’ ”
2 S: ° 5’ ” W: 4 °4 ’56”
3 S:20°33’09” W: 43°41’21”
4 S: 20°33’0 ” W: 4 °4 ’ 0”
5 S: ° 5’ ” W: 4 °4 ’ ”
6 S: 20°34’46” W: 4 °4 ’ 8”
7 S: ° 4’5 ” W: 4 °4 ’ 8”
8 S: ° 4’46” W: 4 °4 ’54”
9 S: 20°35’47” W: 4 °4 ’00”
10 S: ° 4’5 ” W: 43° 9’ ”
52
Figura 6. Localização dos pontos de coleta na zona rural de Ouro Branco/MG. O mapa foi confeccionado
utilizando o software ArcGis.
Tentou-se privilegiar localidades com culturas ativas de batata. Adotou-se como
critério de seleção dos pontos de coleta a proximidade com as plantações de batata inglesa. A
fim de facilitar o acesso aos cursos d’água para a amostragem, todos os pontos escolhidos
localizaram-se abaixo de pontes.
5.3. Análises Cromatográficas
Por meio do cromatógrafo a gás com detector por captura de elétrons utilizado (Figura
7) observou-se que foi possível a identificação do pico do agrotóxico organofosforado
clorpirifós com boa relação sinal/ruído e excelente resolução.
53
O detector por captura de elétrons apresenta alta sensibilidade aos compostos
halogenados possibilitando a quantificação eficiente do agrotóxico clorpirifós na análise
cromatográfica.64
Para identificação do composto estudado foi considerado o tempo retenção
(tR) de 7,5 min da solução padrão em matriz aquosa e a confirmação por GC-MS. O fato de se
ter trabalhado com apenas um analito isentou a análise de problemas com a coeluição de
outras espécies químicas de interesse.
Figura 7. Cromatógrafo a gás com detector por captura de elétrons utilizado nas análises deste trabalho.
O sistema GC-MS (Figura 8) não apresentou boa resposta para o clorpirifós. Os picos
não se apresentaram bem resolvidos e suas áreas possuíam valores bastante inferiores quando
comparadas àquelas obtidas por GC-ECD. Portanto, concluiu-se que este sistema não era
adequado para o estudo pretendido, sendo usado apenas para a confirmação da presença do
analito. Foram feitos testes nos modos SIM e SCAN; no modo SIM foi monitorado o íon 314
do clorpirifós, sendo este modo o único a apresentar resposta apreciável.
54
Figura 8. Cromatógrafo a gás com detecção por espectrometria de massas utilizado em análises deste trabalho.
5.4. Estudo e Otimização da Técnica de Extração Líquido-Líquido com Partição a
Baixa Temperatura
A LLE-LTP se mostrou uma técnica rápida, simples e que não exige instrumentação
sofisticada. Todas as variáveis analisadas (volume de fase aquosa, volume de fase extratora,
concentração de eletrólito e tempo de agitação) apresentaram efeito sobre o sistema, porém,
os ensaios experimentais apresentaram respostas distintas das extrações, devido às
características inerentes a cada variável investigada.
Como a LLE-LTP se caracteriza pela partição da amostra entre duas fases imiscíveis
(Figura 9), uma fase orgânica e outra aquosa, a eficiência da extração depende da afinidade do
soluto pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações. Dessa forma as
variáveis operacionais têm efeitos distintos sobre a extração.
Figura 9. Ilustração do sistema LLE-LTP empregado neste trabalho; separação das fases imiscíveis aquosa e
orgânica.
-20 ºC
55
Os volumes iniciais testados foram definidos em função da dinâmica do laboratório;
utilizou-se volumes de 2, 3 e 4 mL de fase aquosa e também de fase orgânica, e concentrações
de sal de 0; 0,1e 0,2 mol/L. Nessa experimentação, observou-se que nos ensaios que
apresentavam concentração de sal de 0,2 mol/L houve precipitação do mesmo, indicando que
houve supersaturação do meio. A partir destes resultados e realização de vários testes de
bancada foram definidas as novas condições para a execução do planejamento de triagem
apresentado na Tabela (item “4.5. Avaliação das Técnicas de Extração/Pré-concentração”).
Assim, neste planejamento, para as fases aquosa e orgânica foram estabelecidos os volumes
de 4, 5 e 6mL. Para o tempo de agitação foram considerados os valores de 5, 10 e 15 min a
180 rpm e, por fim, para a concentração de eletrólito foram estudados 0 (sem adição de
eletrólito); 0,01 e 0,02 mol/L.
Considerando as áreas cromatográficas obtidas de cada ensaio experimental do estudo
de triagem (Tabela 5), verificou-se que as melhores condições foram encontradas quando se
utilizou 6 mL de volume de fase aquosa e 4 mL de volume de fase orgânica.Entretanto, tais
variáveis foram também significativas em outros níveis, ou seja, outros volumes também
apresentaram boas respostas em relação às áreas de pico obtidas, sendo então todos os níveis
de volume de fase aquosa e orgânica averiguados novamente no planejamento Doehlert, com
a inclusão de mais níveis experimentais.
A adição de eletrólito é utilizada para aumentar a quantidade de analito extraída, uma
vez que a adição de sal contribui para o aumento da força iônica e influencia na solubilidade
do analito (efeito salting-out). A maior área de pico cromatográfico encontrada, que indica a
melhor condição de extração, apontou a não adição de eletrólito (Tabela 5). Porém, avaliando
as áreas dos picos consecutivos em ordem decrescente de intensidade, pôde-se observar que a
adição do eletrólito na concentração de 0,02 mol/L também apresentou resultado
adequado;em consequência disso, todas as concentrações de eletrólito estudadas no
planejamento de triagem foram novamente testadas no planejamento Doehlert.
A última variável considerada foi o tempo de agitação, que influencia cineticamente
no equilíbrio de partição entre as fases. Geralmente, quanto maior a agitação, mais rápida será
a transferência do analito da fase aquosa para a fase orgânica. Porém, um tempo muito longo
de agitação inviabiliza a dinâmica do processo. Observou-se a melhor eficiência de extração
para o clorpirifós no menor tempo de agitação, 5 min (Tabela 5). Porém, os picos com
maiores respostas para o sinal cromatográfico foram obtidos para os diferentes tempos de
agitação avaliados. Por isso, no planejamento Doehlert, esta variável foi testada em
praticamente todos os níveis avaliados na triagem, com a adição de mais alguns pontos.
56
Tabela 5. Resultados (áreas cromatográficas) dos ensaios experimentais do planejamento fatorial completo 24,
com 4 replicatas no ponto central (ensaios 17 a 20), para investigação das variáveis experimentais do método
LLE/LTP: volume de fase aquosa (mL), volume de fase orgânica (mL), tempo de agitação (min) e concentração
de eletrólito (mol/L).
Ensaio
Volume de
Fase Aquosa
(mL)
Volume de
Fase Orgânica
(mL)
Tempo de
Agitação
(min)
Concentração de
Eletrólito (mol/L)
Área
Cromatográfica
1 4,0 4,0 5 0 132262,3
2 6,0 4,0 5 0 205054,0
3 4,0 6,0 5 0 79484,3
4 6,0 6,0 5 0 131706,9
5 4,0 4,0 15 0 110615,3
6 6,0 4,0 15 0 66587,2
7 4,0 6,0 15 0 72509,0
8 6,0 6,0 15 0 123349,1
9 4,0 4,0 5 0,02 111653,3
10 6,0 4,0 5 0,02 186212,0
11 4,0 6,0 5 0,02 77135,3
12 6,0 6,0 5 0,02 137715,9
13 4,0 4,0 15 0,02 121417,1
14 6,0 4,0 15 0,02 190347,8
15 4,0 6,0 15 0,02 86085,2
16 6,0 6,0 15 0,02 125596,2
17 5,0 5,0 10 0,01 114702,0
18 5,0 5,0 10 0,01 119966,0
19 5,0 5,0 10 0,01 121978,7
20 5,0 5,0 10 0,01 123148,0
Pela tabela de análise de variância (ANOVA) verificou-se que a regressão linear do
modelo do estudo de triagem foi significativa, mas também ocorreu falta de ajuste. Em função
do erro puro (erro aleatório) avaliado considerando as replicatas da Tabela 5, foi possível
constatar, como já feito por observação das respostas experimentais (Tabela 5),que todas as
variáveis operacionais LLE-LTP apresentaram efeitos significativos sobre o sistema (Tabela
6);assim, como já mencionado, todas foram novamente selecionadas para serem estudadas no
planejamento Doehlert, contudo em mais níveis, como descrito na Tabela 7.
57
O planejamento Doehlert viabiliza explorar aquelas variáveis que apresentaram maior
efeito sobre o sistema em mais níveis, realizando um exame minucioso destas.
Após a execução do planejamento Doehlert (Tabela 7) foi possível concluir as
condições ótimas (Tabela 8) para a extração líquido-líquido com partição a baixa temperatura
do clorpirifós.
Tabela 6. Efeitos do planejamento de triagem para a avaliação dos parâmetros operacionais LLE-LTP, na
extração de clorpirifós em água (1 - volume de fase aquosa (mL), 2 - volume de fase orgânica (mL), 3 - tempo de
agitação (min) e 4 - concentração de eletrólito (mol/L)). Os valores sublinhados indicam efeitos significativos. A
última coluna corresponde aos valores do parâmetro estatístico p, ao nível de significância de 0,05, considerando
o erro puro.
Variáveis Efeitos
p
Média 121876,28 9×10-8
1 46925,913 0,0005
2 -36320,89 0,0016
3 -20589,64 0,017
4 14324,338 0,0582
12 3862,6625 0,5385
13 -18112,49 0,027
14 13969,338 0,0627
23 15963,913 0,0414
24 -9453,513 0,1673
34 23272,088 0,0106
124 -14712,11 0,0536
134 11438,088 0,1081
234 -20231,26 0,0181
1234 -16359,86 0,0382
58
Tabela 7. Planejamento Doehlert, com quatro replicatas no ponto central (ensaios 21 a 24), para otimização das
condições experimentais da técnica LLE-LTP volume de fase aquosa (mL), volume de fase orgânica (mL),
tempo de agitação (min) e concentração de eletrólito (mol/L), para extração de clorpirifós em água. Os valores
em parênteses representam os níveis decodificados. A última coluna corresponde aos valores de área
cromatográfica de clorpirifós obtidos para cada ponto experimental do planejamento.
Ensaio
Tempo de
Agitação
(min)
Volume de
Fase Aquosa
(mL)
Volume de
Fase Orgânica
(mL)
Concentração de
Eletrólito (mol/L)
Área
Cromatográfica
1 1 (17) 0 (5,25) 0 (4,75) 0 (0,01) 200282,0
2 0,5 (13,5) 0,866 (6,50) 0 (4,75) 0 (0,01) 231140,9
3 0,5 (13,5) 0,289 (5,67) 0,817 (6,00) 0 (0,01) 184107,6
4 0,5 (13,5) 0,289 (5,67) 0,204 (5,06) 0,791 (0,02) 184517,8
5 -1 (3) 0 (5,25) 0 (4,75) 0 (0,01) 177302,3
6 -0,5 (6,5) -0,866 (4,00) 0 (4,75) 0 (0,01) 109363,6
7 -0,5 (6,5) -0,289 (4,83) -0,817 (3,50) 0 (0,01) 119145,8
8 -0,5 (6,5) -0,289 (4,83) -0,204 (4,44) -0,791 (0) 197568,4
9 0,5 (13,5) -0,866 (4,00) 0 (4,75) 0 (0,01) 158320,5
10 0,5 (13,5) -0,289 (4,83) -0,817 (3,50) 0 (0,01) 229105,0
11 0,5 (13,5) -0,289 (4,83) -0,204 (4,44) -0,791 (0) 172190,1
12 -0,5 (6,5) 0,866 (6,50) 0 (4,75) 0 (0,01) 269984,3
13 0 (10) 0,577 (6,08) -0,817 (3,50) 0 (0,01) 309006,9
14 0 (10) 0,577 (6,08) -0,204 (4,44) -0,791 (0) 201236,1
15 -0,5 (6,5) 0,289 (5,67) 0,817 (6,00) 0 (0,01) 122092,3
16 0 (10) -0,577 (4,42) 0,817 (6,00) 0 (0,01) 124258,3
17 0 (10) 0 (5,25) 0,61 (5,69) -0,791 (0) 177142,3
18 -0,5 (6,5) 0,289 (5,67) 0,204 (5,06) 0,791 (0,02) 193540,2
19 0 (10) -0,577 (4,42) 0,204 (5,06) 0,791 (0,02) 148737,3
20 0 (10) 0 (5,25) -0,613 (3,81) 0,791 (0,02) 206926,2
21 0 (10) 0 (5,25) 0 (4,75) 0 (0,01) 222835,3
22 0 (10) 0 (5,25) 0 (4,75) 0 (0,01) 245495,9
23 0 (10) 0 (5,25) 0 (4,75) 0 (0,01) 199701,3
24 0 (10) 0 (5,25) 0 (4,75) 0 (0,01) 215329,4
59
Tabela 8. Condição experimental ótima apontada pelo planejamento Doehlert para extração de clorpirifós em
água por LLE-LTP.
Volume de Fase
Aquosa
Volume de Fase
Extratora
Concentração de
Eletrólito
Tempo de
Agitação
6,08 mL 3,50 mL 0,01 mol/L 10 min
Embora tenha sido possível apontar uma condição experimental com o maior valor de
área cromatográfica, a regressão quadrática do modelo obtido pelo planejamento Doehlert não
foi significativa, assim como também ocorreu falta de ajuste; ambas constatações foram
verificadas junto à tabela de análise de variância, ao nível de significância de 0,05. A Figura
10 mostra o ajuste dos valores de área de clorpirifós previstos pelo modelo de regressão
quadrático do planejamento Doehlert e os valores medidos, na extração por LLE-LTP. O
coeficiente de determinação dessa correlação foi de 0,8227.
Figura 10. Correlação entre os valores medidos e os valores previstos pelo modelo de regressão quadrático do
planejamento Doehlert dos valores de área de clorpirifós, na extração por LLE-LTP.
A Figura 11 apresenta o gráfico de probabilidade normal mostrando as variáveis que
influenciaram o sistema: o volume de fase aquosa e o volume de fase extratora; tais
constatações se basearam no fato de que estas variáveis foram as únicas que não tiveram seus
valores padronizados de efeito ajustados próximos à reta que cruza a origem dos eixos, assim,
60
toma-se como significativos os efeitos que se apresentarem afastados da reta; quanto maior
for o afastamento, mais significativa será a influência. Tal constatação foi verificada também
considerando o teste de hipótese por meio da rejeição da hipótese nula ao se comparar os
valores dos efeitos das variáveis com os erros puros.
Figura 11. Gráfico de probabilidade normal do planejamento Doehlert no estudo da otimização da extração de
clorpirifós por LLE-LTP, mostrando as variáveis significativas.
5.5. Estudo e Otimização da Técnica de Microextração em Fase Sólida com
Headspace
A SPME apresenta vantagens importantes sobre a LLE-LTP como a não utilização de
solventes. Consiste de duas etapas distintas, a adsorção dos analitos na fase estacionária da
fibra e a posterior dessorção dos mesmos (Figura 12). Ambas as etapas devem ser otimizadas
para uma extração bem sucedida.9
61
Figura 12. Esquema representativo do procedimento de extração por HS-SPME. Adaptado da ref. 41.
Precedendo a aplicação dos planejamentos experimentais multivariados para
otimização dos parâmetros operacionais da HS-SPME no estudo da extração de clorpirifós em
água foram realizados testes para a escolha da fibra a ser usada apenas no modo headspace,
para melhor conservação da mesma. Foram testadas as fibras PDMS 100 µm, PDMS/DVB,
Carboxen/PDMS e DVB/Carboxen/PDMS. Dentre essas, a fibra com recobrimento de
PDMS/DVB apresentou eficiência inigualável, quando da comparação dos sinais
cromatográficos originados da extração de clorpirifós alterando apenas a composição da fase
absorvente/adsorvente da fibra.
A Figura 13 mostra o sistema para extração de clorpirifós em água por HS-SPME
montado para uso neste trabalho.
62
Figura 13. Montagem para extração de clorpirifós em água por HS-SPME utilizado neste trabalho.
Os resultados obtidos para o planejamento de triagem para avaliação da HS-SPME
(Tabela 3) na extração de clorpirifós em água são apresentados na Tabela 9. Em função dessas
respostas experimentais foi possível verificar que todas as variáveis operacionais investigadas
(tempo de extração, temperatura de extração, concentração de eletrólito e volume de amostra)
apresentaram efeito significativo sobre o sistema, tanto em função do erro puro quanto da
soma quadrática dos resíduos (erro associado ao modelo gerado), já que a regressão linear foi
significativa e o modelo não apresentou falta de ajuste, ao nível de significância de 0,05.
A Tabela 10 mostra os valores dos efeitos obtidos para o planejamento da Tabela 3.
Cabe ressaltar que, embora o valor de área cromatográfica apresentado na Tabela 9 para a
replicata de número 20 não tenha apresentado concordância com os demais valores das outras
replicatas (ensaios experimentais 17 a 19), a inclusão ou retirada da mesma em todos os
cálculos de avaliação dos resultados do planejamento de triagem não provocou mudanças na
interpretação dos dados. Logo, todas as variáveis foram novamente investigadas no
planejamento Doehlert, sendo a maioria em um maior número de níveis.
63
Tabela 9. Resultados (áreas cromatográficas) dos ensaios experimentais do planejamento fatorial completo 24,
com 4 replicatas no ponto central (ensaios 17 a 20), para investigação das variáveis experimentais do método
HS-SPME: tempo de extração (min), temperatura de extração (ºC), concentração de eletrólito (mol/L) e volume
de amostra(mL).
Ensaio
Tempo de
Extração
(min)
Temperatura de
Extração (ºC)
Concentração de
Eletrólito (mol/L)
Volume de
Amostra
(mL)
Área
Cromatográfica
1 30 50 0 5 1424469,0
2 60 50 0 5 3367967,0
3 30 80 0 5 7409720,0
4 60 80 0 5 12510488,0
5 30 50 0,02 5 2722260,0
6 60 50 0,02 5 3538746,0
7 30 80 0,02 5 9140743,0
8 60 80 0,02 5 12035220,0
9 30 50 0 9 3074883,0
10 60 50 0 9 4024667,0
11 30 80 0 1 10616572,0
12 60 80 0 9 13958845,0
13 30 50 0,04 9 4346514,0
14 60 50 0,04 9 5442436,0
15 30 80 0,04 9 15382578,0
16 60 80 0,04 9 14664402,0
17 45 65 0,01 7 7131866,0
18 45 65 0,01 7 6970960,0
19 45 65 0,01 7 7557324,0
20 45 65 0,01 7 8969955,0
64
Tabela 10. Efeitos do planejamento de triagem para a avaliação dos parâmetros operacionais HS-SPME, na
extração de clorpirifós em água (1 - tempo de extração (min), 2 - temperatura de extração (ºC), 3 - concentração
de eletrólito (mol/L) e 4 - volume de amostra (mL)). Os valores sublinhados indicam efeitos significativos. A
última coluna corresponde aos valores do parâmetro estatístico p, ao nível de significância de 0,05, considerando
o erro puro.
Variáveis Efeitos
p
Média 7714530,8 3×10-7
1 1928129,0 0,0086
2 8472078,3 9×10-6
3 1360661,0 0,0317
4 2420160,5 0,0033
12 726706,5 0,1754
13 -905951,8 0,1063
14 -760678,3 0,1595
23 321168,5 0,5167
24 961396,0 0,0912
34 679579,8 0,2001
124 -582108,8 0,262
134 -72626,0 0,8809
234 374372,2 0,4533
1234 -390913,5 0,4348
A Tabela 11 apresenta o planejamento Doehlert efetuado no estudo da otimização das
condições experimentais HS-SPME para extração de clorpirifós em água. São mostrados
também nessa tabela os valores de área de pico cromatográfico oriundos de cada ponto
experimental do planejamento. Assim, foi possível definir as condições operacionais nas quais
extraiu-se a maior quantidade de clorpirifós da matriz aquosa dentro do domínio experimental
avaliado (Tabela 12), o que resultará num método mais sensível, com menores limites de
detecção e quantificação.
65
Tabela 11. Planejamento Doehlert, com quatro replicatas no ponto central (ensaios 21 a 24), para otimização das
condições experimentais da técnica HS-SPME tempo de extração (min), temperatura de extração (ºC), volume de
amostra (mL) e concentração de eletrólito (mol/L), para extração de clorpirifós em água. Os valores em
parênteses representam os níveis decodificados. A última coluna corresponde aos valores de área cromatográfica
de clorpirifós obtidos para cada ponto experimental do planejamento.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo
não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não
válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não
válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não válido.Erro! Vínculo não
válido.
Ensaio
Tempo de
Extração
(min)
Temperatura de
Extração (ºC)
Volume de
Amostra
(mL)
Concentração de
Eletrólito (mol/L)
Área
Cromatográfica
1 1 (75) 0 (80) 0 (9) 0 (0,03) 16986759
2 0,5 (60) 0,866 (95) 0 (9) 0 (0,03) 16816185
3 0,5 (60) 0,289 (85) 0,817 (11) 0 (0,03) 22378043
4 0,5 (60) 0,289 (85) 0,204 (9,5) 0,791 (0,04) 15478759
5 -1 (15) 0 (80) 0 (9) 0 (0,03) 7975135
6 -0,5 (30) -0,866 (65) 0 (9) 0 (0,03) 8084621
7 -0,5 (30) -0,289 (75) 0,817(7) 0 (0,03) 11043029
8 -0,5 (30) -0,289 (75) -0,204(8,5) -0,791 (0,02) 9815048
9 0,5 (60) -0,866 (65) 0 (9) 0 (0,03) 11041115
10 0,5 (60) -0,289 (75) 0,817 (7) 0 (0,03) 14199115
11 0,5 (60) -0,289 (75) -0,204(8,5) -0,791 (0,02) 16003753
12 -0,5 (30) 0,866 (95) 0 (9) 0 (0,03) 12233811
13 0 (45) 0,577 (90) 0,817(7) 0 (0,03) 16568605
14 0 (45) 0,577 (90) -0,204 (8,5) -0,791 (0,02) 16460618
15 -0,5 (30) 0,289 (85) 0,817(11) 0 (0,03) 16460618
16 0 (45) -0,577 (70) 0,817 (11) 0 (0,03) 13469039
17 0 (45) 0 (80) 0,61 (10,5) -0,791 (0,02) 14222903
18 -0,5 (30) 0,289 (85) 0,204 (9,5) 0,791 (0,04) 16980964
19 0 (45) -0,577 (70) 0,204 (9,5) 0,791 (0,04) 17312831
20 0 (45) 0 (80) -0,613 (7,5) 0,791 (0,04) 14038803
21 0 (45) 0 (80) 0 (9) 0 (0,03) 16265798
22 0 (45) 0 (80) 0 (9) 0 (0,03) 14538189
23 0 (45) 0 (80) 0 (9) 0 (0,03) 18162996
24 0 (45) 0 (80) 0 (9) 0 (0,03) 13855223
66
Tabela 12. Condição experimental ótima apontada pelo planejamento Doehlert para extração de clorpirifós em
água por HS-SPME.
Tempo de
extração
Temperatura de
extração
Volume de
Amostra
Concentração de
eletrólito
60 min 85 ºC 11 mL 0,04 mol/L
A Tabela 13 mostra os valores dos coeficientes obtidos para o modelo quadrático
gerado do planejamento da Tabela 11. Considerando a soma quadrática dos resíduos, ao nível
de significância de 0,05, pode ser notado que as variáveis tempo e temperatura de extração e
concentração de eletrólito apresentaram efeitos significativos na otimização.
Tabela 13. Coeficientes do planejamento Doehlert para a avaliação dos parâmetros operacionais HS-SPME, na
extração de clorpirifós em água (1 - tempo de extração (min), 2 - temperatura de extração (ºC), 3 - volume de
amostra (mL) e 4 - concentração de eletrólito (mol/L)). Os valores sublinhados indicam efeitos significativos. A
última coluna corresponde aos valores do parâmetro estatístico p, ao nível de significância de 0,05, considerando
a soma quadrática dos resíduos.
Variáveis Coeficientes
p
Média 15705551,5 1,456×10-8
1 3932212,7 0,0004897
2 3146935,6 0,0021533
3 2040055,9 0,0223045
4 1154681,0 0,1534111
11 -3224604,5 0,0512438
22 -3807513,2 0,0263388
33 1726634,1 0,233294
44 -2930,8 0,998226
12 938729,8 0,6354398
13 1357866,1 0,5411818
14 -5554680,9 0,0338645
23 1212550,4 0,584425
67
24 -3904755,0 0,1126952
34 4581889,5 0,0691146
Geralmente, com períodos de tempo de extração mais longos, a sorção de compostos
com massa molecular mais elevada torna-se favorável, o que foi observado na execução dos
planejamentos para a extração do clorpirifós (composto com massa molecular
~350 g/mol)neste trabalho. Entretanto, é importante que esse tempo não se estenda
demasiadamente, já que pode tornar a extração onerosa e de difícil aplicação.
O aumento da temperatura de extração pode aumentar a volatilização dos compostos
com massa molecular maior, especialmente quando se trata da extração na modalidade por
headspace, que constituiu a aplicação deste trabalho,uma vez que se aumenta a pressão de
vapor dos analitos favorecendo a transferência dos mesmos da amostra para a fibra.
Quanto ao volume de amostra, maiores volumes mostraram melhores resultados para a
extração, pois mesmo embora todas as concentrações de todos os volumes estudados tenham
sido mantidas constantes, em um maior volume tem-se uma maior quantidade de analito por
unidade de volume, o que, para este trabalho, apresentou efeito positivo significativo na
eficiência de extração de clorpirifós.
Por fim, o efeito salting out (quarta variável avaliada) geralmente contribui para
aumentar a eficiência da extração, ou seja, aumentar a quantidade de analito extraída pela
fibra. Com o aumento da força iônica da solução diminui-se a solubilidade de compostos
pouco polares, forçando-os a passar para a fase de vapor. Entretanto, nas condições
experimentais avaliadas da Tabela 10 este efeito não foi significativo para melhorar a
extração, como evidenciado pelos coeficientes do modelo apresentados na Tabela 12.
Na Tabela 14 é apresentada a tabela da ANOVA gerada a partir dos dados do
planejamento experimental Doehlert (Tabela 11). Pode-se notar que a regressão foi
significativa, ao nível de significância de 0,05, e que não houve falta de ajuste do modelo
quadrático gerado.
68
Tabela 14. Tabela de análise de variância para o planejamento Doehlert executado no estudo da otimização das
condições operacionais HS-SPME para determinação de clorpirifós em água, no nível de significância de 0,05.
Valores sublinhados indicam valores significativos. FV = fonte de variância, SQ = soma quadrática,
nGL = número de graus de liberdade, MQ = média quadrática, Fcalc = valor calculado do teste F, e
p = parâmetro estatístico p.
Análise de Variância – Modelo Quadrático
FV SQ nGL MQ Fcalc p
Regressão 2,31×1014
14 1,65×1013
6,011 0,0052
Resíduos 2,47×1013
9 2,75×1012
Falta de Ajuste 1,36×1013
4 3,40×1012
1,523 0,3238
Erro Puro 1,11×1013
5 2,23×1012
Total 2,56×1014
23
% variância explicada 90,338
% máxima de variação explicável 95,644
Cabe ainda ressaltar que, para a dessorção do analito, um tempo inicial de 5 min foi
estimado, porém observou-se que ocorria “efeito memória”, caracterizado pela dessorção
incompleta das espécies químicas sorvidas na fibra; então a fibra passou a ficar exposta
durante todo o tempo da corrida cromatográfica (10 min, como já citado), aonde se verificou a
completa dessorção do clorpirifós. A Figura 14 exibe o processo de introdução do holder no
injetor do cromatógrafo para posterior exposição da fibra para dessorção térmica da espécie
de interesse.
69
Figura 104. Exposição da fibra para dessorção do analito no sistema GC-ECD.
5.6. Validação do Método para Determinação de Clorpirifós em Água
O método HS-SPME/GC-ECD desenvolvido foi validado e utilizado para análise de
amostras de água superficial coletadas em cursos d’água próximos a plantações de batata na
zona rural de Ouro Branco/MG, como exemplificado na Figura 15, para a determinação do
inseticida clorpirifós.
A seguir são apresentados os resultados obtidos das figuras de mérito avaliadas para
validação do método.
Figura 15. Ilustração de um dos pontos de coleta de amostra de água superficial próximo a plantações de batata
na zona rural de Ouro Branco/MG.
5.6.1. Seletividade
Para avaliar a seletividade do método de extração e análise por cromatografia
empregados foram comparados os cromatogramas obtidos pela extração de:
(a) Amostras fortificadas com o analito de interesse; e
(b) Amostras de água superficial submetidas ao método otimizado
Alguns dos cromatogramas referentes aos passos (a) e (b) supracitados estão
apresentados na Figura 16.
70
2 4 6 8 10
0
2000000
4000000
6000000
8000000
Resp
ost
a (
mV
)
Tempo (min)
Clorpirifós
(a)
2 4 6 8 10
0
2000000
4000000
6000000
8000000
(b)
Resp
ost
a (
mV
)
Tempo (min)
Figura 11. Cromatograma obtido após extração HS-SPME da amostra fortificada com clorpirifós a 5,00 µg/L
(a), seguido do cromatograma da extração HS-SPME de uma matriz de água superficial (b).
Comparando-se os cromatogramas da Figura 16 observa-se que não há picos
coincidentes entre a matriz original e a matriz fortificada no tempo de retenção do clorpirifós;
desta forma, a resposta do analito de interesse não sofre interferência de outros componentes
da matriz. Tal resultado comprova a boa seletividade do método proposto.
5.6.2. LOD e LOQ
Os critérios para estabelecimento dos limites de detecção e quantificação do método
foram estabelecidos pelas relações sinal/ruído iguais a 3 e 10, respectivamente, por meio da
análise de concentrações decrescentes do analito. Os valores de LOD e LOQ para o método
proposto e otimizado são apresentados na Tabela 15.
71
Tabela 15. Limites de detecção e quantificação do método proposto e otimizado para determinação de
clorpirifós em água.
LOD (µg/L) LOQ(µg/L)
Clorpirifós 0,76 2,28
O valor do limite de detecção é da ordem de µg/L (ppb), indicando a viabilidade deste
método para a determinação de quantidades em nível de traços de clorpirifós em água. Para o
analito estudado o limite de quantificação do método proposto é menor do que o limite
máximo permitido estabelecido pelas principais legislações internacionais (30 e 90 µg/L).28-
29,65 Este resultado indica que o método proposto apresenta detectabilidade adequada para
aplicação como procedimento analítico para o monitoramento do analito de interesse,
clorpirifós, em águas, por exemplo, destinadas a consumo humano.
5.6.3. Linearidade e Faixa de Trabalho
A linearidade refere-se à capacidade do método de gerar resultados linearmente
proporcionais à concentração do analito, enquadrados em uma faixa analítica específica.55
A
Figura 17 mostra a curva de regressão do estudo de linearidade, na validação do método
desenvolvido para análise de clorpirifós em água.
Figura 17. Regressão do estudo da linearidade do método proposto e otimizado para análise de clorpirifós em
água.
72
A curva analítica da Figura 17 foi construída a partir da adição do padrão de
clorpirifós na matriz e posterior extração por HS-SPME. A linearidade foi avaliada por meio
das concentrações de 1,67; 2,50; 5,00; 27,5; 50,0; 75,0 e 100,0 µg/L. O método se mostrou
linear com coeficiente de determinação de 0,992 para o clorpirifós.
A faixa de trabalho utilizada foi de 2,28 a 38,7 µg/L. A Figura 18 apresenta a curva
analítica construída a partir da extração por HS-SPME de clorpirifós (após adição de solução
padrão) em amostras de água superficial na faixa de concentração entre 2,28 a 38,7 µg/L. O
coeficiente de determinação foi superior a 0,99, mostrando que a mesma é linear no intervalo
investigado. Foram empregados níveis de concentração mais restritos, dentro da faixa que
melhor atendesse os objetivos do trabalho, sendo o LOQ do analito o limite inferior da curva.
Figura 18. Faixa de trabalho obtida no processo de validação do método proposto e otimizado para
determinação de clorpirifós em água.
5.6.4. Precisão
A precisão do método HS-SPME otimizado foi verificada em termos de repetitividade
e precisão intermediária.
A repetitividade da extração de clorpirifós em amostras de água superficial foi
determinada, conforme sugerido pelo INMETRO,50
realizando-se sete extrações idênticas do
agrotóxico na concentração equivalente a 3LOQ, segundo a metodologia otimizada,
avaliando-se o coeficiente de variação. Foi obtido o coeficiente de variação de 10,76%
(Tabela 15) para amostras de água fortificadas com clorpirifós na concentração de
73
0,0050 µg/L. Esse resultado demonstra boa repetitividade, uma vez que o coeficiente de
variação se encontra abaixo do recomendado. Em métodos de análise de traços ou impurezas,
são aceitos RSD de até 20%, dependendo da amostra.
A precisão intermediária foi determinada avaliando-se o valor do coeficiente de
variação obtido após análises executadas em três dias diferentes; dias 1, 3 e 5. A extração e
análise foram feitas com sete repetições pelo mesmo analista em interdias. Para a avaliação da
precisão intermediária foram empregadas amostras fortificadas com clorpirifós na
concentração equivalente a 3LOQ. O valor obtido do CV para o clorpirifós foi de 11,41%
como apresentado na Tabela 16. Este resultado está de acordo com os critérios adotados pela
agência americana United States Food and Drug Administration (US-FDA),66
que recomenda
que os resultados de CV não devem ultrapassar 15%.
Tabela 16. Coeficientes de variação da repetitividade e precisão intermediária na avaliação da precisão do
método para determinação de clorpirifós em água.
Agrotóxico Repetitividade (CV – n = 7) Precisão intermediaria (CV – n=21)
Clorpirifós 10,76% 11,41%
5.6.5. Exatidão
A exatidão do método proposto e otimizado foi avaliada pela recuperação relativa.
Amostras de água superficial foram fortificadas com o analito de interesse em 3
concentrações: 1,67; 5,00 e 16,7 µg/L. As amostras foram submetidas ao procedimento
analítico otimizado e as concentrações do analito foram calculadas por meio das equações
obtidas por regressão linear múltipla das respectivas curvas analíticas. A Tabela 17 apresenta
os valores das concentrações de fortificação de clorpirifós e as respectivas recuperações
relativas.
74
Tabela 17. Porcentagens de recuperação de clorpirifós em amostras de água após análise com o método
proposto, otimizado e validado.
Concentração de fortificação(µg/L) Recuperação relativa(%) CV(%)
1,67 139,94 3,03
5,00 110,53 15,63
16,7 104,27 13,17
Em geral, são aceitos intervalos de recuperação entre 70 e 120%, com precisão de até
20% para a maioria dos métodos analíticos, inclusive para análise de resíduos de agrotóxicos.
Os resultados de recuperação relativa obtidos para clorpirifós estão dentro da faixa aceitável
indicando que o método proposto apresenta exatidão adequada para determinação de
clorpirifós em água, exceto no nível de fortificação de 1,67µg/L; entretanto este apresentou
CV adequado e a recuperação relativa não foi tão destoante.
5.7. Análise das Amostras Naturais Coletadas
O método otimizado e validado foi empregado para determinação de clorpirifós em
amostras de água superficial coletadas na zona rural de Ouro Branco/MG. Uma informação
importante é que para determinar se a amostra está ou não contaminada é necessário
considerar o limite de detecção do método validado e utilizado para a análise, que neste caso é
0,76 µg/L. Assim, amostras que apresentarem resultados acima do limite de detecção podem
ser consideradas contaminadas (contaminação detectável), muito embora estes valores ainda
possam estar dentro da faixa permitida pela legislação. Neste trabalho, foram apontados sinais
cromatográficos de clorpirifós nas amostras cujas áreas correspondiam a valores de
concentração entre os limites de detecção e quantificação. O método utilizado para a análise
de clorpirifós em água superficial detectou este analito, porém em níveis não quantificáveis
(Tabela 18).
75
Tabela 18. Resultados para análise de clorpirifós em água superficial por GC-ECD.
2011
Amostra (pontos de coleta) Março Junho Julho Agosto Dezembro
1 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
2 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
3 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
4 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
5 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
6 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
7 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
8 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
9 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
10 <LQ <LQ <LQ <LQ <LQ
Tal fato pode ser explicado uma vez que os compostos organofosforados em sistemas
hídricos podem se degradar rapidamente, embora a literatura reporte que os mesmos podem
permanecer no meio aquático natural por meses, além de possuírem alta afinidade de absorção
no solo. Também pode contribuir para esse resultado o tempo no qual as amostras ficaram
armazenadas, visto que as mesmas não foram analisadas imediatamente após a coleta por
motivos de ordem técnica.
Contudo, como já exposto, todas as 50 amostras analisadas em triplicata representando
os 10 pontos de amostragem referentes aos meses de março, junho, julho, agosto e dezembro
de 2011 apresentaram alguma contaminação não quantificável de clorpirifós, como
exemplificado na Figura 19.
76
0 2 4 6 8 10
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
Res
po
sta
(m
V)
Tempo (min)
Clorpirifós
Figura 19. Cromatograma de clorpirifós em amostra de água natural coletada em curso d’água da zona rural de
Ouro Branco/MG, obtido por GC-ECD.
Essa informação pode ser afirmada uma vez que as amostras foram analisadas por GC-
MS, onde foi possível a confirmação da presença de clorpirifós, pela resposta cromatográfica
para o analito em questão (exemplificação na Figura 20).
Figura 20. Cromatograma de clorpirifós em amostra de água natural coletada em curso d’água da zona rural de
Ouro Branco/MG, obtido por GC-MS.
Tempo de retenção (min)
Clorpirifós
Inte
nsi
dad
e
77
6. Conclusões
Clorpirifós foi selecionado nesta pesquisa em função do seu uso intensivo na cultura
de batata inglesa, principal cultivo da zona rural do município de Ouro Branco/MG.
Para sua determinação, foram comparadas duas técnicas de extração, LLE-LTP e HS-
SPME,e dois sistemas de detecção, GC-ECD e GC-MS. O método que apresentou melhor
desempenho e sensibilidade na análise de clorpirifós foi a HS-SPME com separação e
detecção por GC-ECD. Foram obtidos excelentes resultados na extração por HS-SPME que se
mostrou uma técnica simples e de alta concentração para o analito estudado; outra vantagem é
a não utilização de solventes e a reutilização da mesma fibra por diversas vezes, além de picos
bem resolvidos.
O estudo das técnicas de extração avaliadas se deu por meio dos planejamentos
experimentais multivariados; assim foi possível a investigação de diferentes fatores
operacionais ao mesmo tempo, com um número reduzido de experimentos.
Após a otimização, o método de análise proposto e otimizado foi validado
determinando-se as principais figuras de mérito. Os resultados indicaram que o método HS-
SPME com determinação por GC-ECD é bastante eficiente para a extração e determinação do
agrotóxico clorpirifós em água.
As amostras de água natural superficial coletadas próximas às plantações de batata em
Ouro Branco apresentaram contaminação de clorpirifós com concentrações entre os níveis de
detecção e quantificação do método otimizado e validado.
Os resultados do estudo proposto nessa dissertação foram apresentados à Prefeitura
Municipal de Ouro Branco e órgãos competentes para fins informativos e também porque
serão incluídos no Plano Municipal de Saneamento Ambiental em fase de implantação pela
Prefeitura Municipal.
78
7. Sugestões para Trabalhos Futuros
O trabalho desenvolvido neste projeto pode ser tomado como base para que novos e
diferentes estudos sejam feitos para avaliar outras possíveis fontes de contaminação na
localidade e também para a determinação de outros agrotóxicos extensivamente utilizados na
cultura local de batata como o mancozebe, glifosato e paraquat, já levantados nessa pesquisa.
Ainda, pode-se utilizar o método desenvolvido para o monitoramento contínuo do clorpirifós
nos corpos d’água da zona rural de Ouro Branco/MG.
79
8. Referências Bibliográficas
1. Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN). Disponível em:
http://www.sucen.sp.gov.br. Acesso em 27/01/2012.
2. Costa, R. V. F. Desenvolvimento do índice se salubridade ambiental (ISA) para
comunidades rurais e sua aplicação e análise nas comunidades de Ouro Branco-MG.
Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto-MG. 2010, 184 p.
3. Dardengo, R. P.; Goulart, S. M.; Neves, A. A.; Reis, C.; Zambolim, L.; Queiroz, M. E. L.
R. Pesticide residues analysis in potatoes by gás chromatography. Brazilian Journal of
Analytical Chemistry. 2011, 03, 136-142.
4. Tomita, R. Y.; Beyruth, Z. Toxicologia de agrotóxicos em ambiente aquático. O Biológico,
2002, 64, 135-142.
5. Krüger, R. A. Análise da toxicidade e da genotoxicidade de agrotóxicos utilizados na
agricultura utilizando bioensaios com Allium cepa. Dissertação de Mestrado, Centro
Universitário Feevale, Novo Hamburgo-RS. 2009, 43 p.
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