universidade federal de juiz de fora ......a todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado,...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

FACULDADE DE FARMÁCIA

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

Marina Loures Borges

Pesquisa de substâncias antagonistas produzidas por amostras de bactérias

isoladas de sistemas de aquicultura

Juiz de Fora

2016




Monografia apresentada ao Programa de

graduação em Farmácia, da Universidade

Federal de Juiz de Fora como requisito

parcial a obtenção do grau de Bacharel

em Farmácia.

Orientador: Professora Doutora Ana Carolina Morais Apolônio

Juiz de Fora

2016




Monografia apresentada ao Programa de

graduação em Farmácia, da Universidade

Federal de Juiz de Fora como requisito

parcial a obtenção do grau de Bacharel

em Farmácia.

Aprovada em: ____ de ______ de ______

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Doutora Ana Carolina Morais Apolônio - Orientadora Universidade Federal de Juiz de Fora

_______________________________________

Doutora Vânia Lúcia da Silva Universidade Federal de Juiz de Fora

________________________________________

Doutora Vanessa Cordeiro Dias Laboratório Côrtes Vilela

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, figura de fé que sempre sinto tão presente em

minha vida!

Aos meus pais, Alice e Eduardo, por terem me proporcionado toda a estrutura

necessária para que eu pudesse chegar até aqui.

A minha irmã Amanda, por estar sempre ao meu lado, me apoiando e acreditando

em meu sucesso!

A Carol, por me ensinar cada detalhe com muito carinho! Além de uma orientadora

extraordinária, acredito ter ganhado uma grande amiga!

Agradeço à banca examinadora, Vanessa e Vânia, por tão gentilmente terem

aceitado compartilhar comigo deste passo tão importante em minha profissão.

As meninas do laboratório: Kelly, Izabella, Rafhaela, e Samantha, pelo

companheirismo ao longo desta jornada e por terem sido peças fundamentais na

conclusão deste trabalho.

A todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, me dando o suporte

necessário para que eu pudesse chegar até aqui.

Ao laboratório de Microbiologia, por ter me proporcionado a estrutura necessária

para a realização deste trabalho.

A todos que, de alguma forma, contribuíram para que eu pudesse chegar até aqui.

Muito obrigada!

RESUMO

Desde 1970, a aquicultura tem mantido um crescimento anual de 8,7% no mundo inteiro.

Porém, doenças infecciosas de origem bacteriana ocasionam perdas no estoque além de

constituírem riscos durante a produção dos peixes. Como forma de controlar o surgimento

dessas doenças, foi introduzido o uso dos antimicrobianos, o que levou ao aparecimento de

microrganismos resistentes. Assim a busca por alternativas ao uso de antimicrobianos na

aqüicultura vem sendo incentivada. Bacteriocinas são proteínas ou peptídeos sintetizados

nos ribossomos das bactérias, que possuem atividade antimicrobiana. Estudos já

demonstram aplicações de bacteriocinas na conservação de peixes. Assim os objetivos

deste trabalho foram avaliar a habilidade antagonista de amostras isoladas de sistemas de

aqüicultura frente a diferentes bactérias reveladoras e a influência da composição do meio

de cultivo na expressão dessas substâncias; selecionar algumas bactérias produtoras para

avaliar a presença de fatores de interferência; extrair e caracterizar parcialmente as

substâncias antagonistas detectadas. Foram analisadas 201 amostras frente às reveladoras

Edwardsiella tarda; Enterococcus faecalis (ATCC 51299); Aeromonas hydrophila;

Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphy,

obtendo-se um total de 312 halos de inibição. As amostras de C2I12 e C2I13 foram

selecionadas e testadas frente à Aeromonas hydrophila, não indicando presença de fatores

de interferência (clorofórmio, produção de ácidos e bacteriófago). Extração da substância

antagonista foi feita com sulfato de amônio 50% e a atividade antimicrobiana testada pelo

método de difusão em poços, indicando que a espessura do meio de cultura e o tempo de

incubação do inoculo interferiam na expressão e quantidade da substancia antagonista,

respectivamente. Nos testes de caracterização, ambos os extratos mostraram boa

estabilidade térmica, e a variações de pH. Extrato de C2I12 teve sua atividade preservada

quando exposto à hexano 50% e extrato de C2I13 não apresentou atividade após ser tratado

com solventes orgânicos. Ambos os extratos tiveram sua atividade antimicrobiana reduzida

quando tratados com surfactantes e com proteinase K. A concentração inibitória mínima

encontrada para extrato de C2I12 foi de 0,1558 mg/mL e de 0,2675 mg/mL para extrato de

C2I13, sendo ambos os extratos bacteriostáticos. Os resultados mostram que bactérias

isoladas de sistemas de aqüicultura são capazes de produzir substâncias antagonistas,

ativas principalmente para Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis. A purificação e

caracterização parcial da substancia antagonista de dois isolados selecionados demonstrou

uma substancia ativa para Aeromonas hydrophila sob várias condições. Essas substâncias

antagonistas podem, no futuro, contribuir no controle de doenças infecciosas que acometem

peixes na aqüicultura, diminuindo as perdas econômicas e reduzindo a resistência aos

antimicrobianos. Os resultados também sugerem que as substâncias encontradas são tipo

bacteriocina, o que justifica a necessidade de estudos complementares para purificação e

identificação dessas substâncias.

PALAVRAS-CHAVE: Substâncias antagonistas. Aquicultura. Bacteriocinas. Antimicrobiano.

Aeromonas hydrophila.

ABSTRACT

Since 1970, the aquiculture keep annual growth of 8,7% in all the world. However, infection diseases of bacterial origin cause losses in stock besides constitute risks during the fish production. In order to control the outset of these diseases was introduced the use of antimicrobials, which lead to the emergence of resistant microorganisms. So the search for alternatives to the use of antimicrobials in aquaculture is being encouraged. Bacteriocins are proteins or peptides synthesized in the ribosomes of bacteria, which have antimicrobial activity. Studies have demonstrated the application of bacteriocins in preserving fish. Thus the aims of this study were to evaluate the ability of antagonist strains isolated from aquaculture systems across the different indicator bacteria and the influence of the culture medium composition on the expression of these substances; selecting some producers to evaluate the presence of interfering factors; extract and partially characterize the antagonists substances detected. Were analyzed 201 samples front the indicators: Edwardsiella tarda; Enterococcus faecalis (ATCC 51299); Aeromonas hydrophila; Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphy, obtaining a total of 312 inhibition halos. Strains of C2I12 and C2I13 were selected and tested against Aeromonas hydrophila, indicating no presence of interfering factors (chloroform, acid production and

bacteriophage). Extraction of the antagonist substance was done with 50% ammonium sulfate and the antimicrobial activity tested by the spread-plate method, indicating that the thickness of the culture medium and inoculum incubation time interfered in the expression and amount of antagonist substance, respectively. In characterization tests both extracts showed good thermal and pH variations stability. C2I12 extract had its activity preserved when exposed to hexane 50% and C2I13 extract showed no activity after being treated with organic solvents. Both extracts reduced their antimicrobial activity when treated with surfactants and proteinase K. C2I12 and C2I13 extracts have bacteriostatic activity. The minimum inhibitory concentration found to C2I12 extract was 0.1558 mg / ml and 0.2675 mg / ml to C2I13 extract. The results show that bacteria isolated from aquaculture systems are able to produce antagonist substances active mainly for Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis. Purification and partial characterization of antagonist substance of two selected isolates demonstrated an active substance for Aeromonas hydrophila under various conditions.

These antagonistic substances may in the future contribute to the control of infectious diseases that affect fish in aquaculture, decreasing economic losses and reducing antimicrobial resistance. The results also suggest that the substances found are bacteriocin type, which justifies the need for further studies to purification and identification of such substances. KEYWORDS: antagonistic substances. Aquaculture. Bacteriocins. Antimicrobial. Aeromonas

hydrophila .

LISTA DE QUADROS

Quadro 1- Bactérias produtoras com os melhores resultados frente às reveladoras -p.35 Quadro 2- Quadro 2: Diferença de expressão da atividade antagonista entre os métodos de difusão em poços e sobrecamada para os extratos de C2I12 e C2I13- p.36 Quadro 3-Interferência da espessura do meio de cultura na expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 - p.37 Quadro 4- Diferença de tamanho das zonas de inibição dos extratos de C2I12 e C2I13

produzidos após incubação a 37°C por 24 horas, 48 horas e 72 horas - p.38

Quadro 5- Estabilidade do extrato de C2I12 ao tratamento térmico - p.39 Quadro 6- Estabilidade do extrato de C2I13 ao tratamento térmico - p.40 Quadro 7- Estabilidade do extrato de C2I12 e C2I13 a diferentes pH’s ao longo do tempo - p.42 Quadro 8 -Efeito de diferentes solventes orgânicos na atividade antagonista de C2I12 e C2I13 - p.44

Quadro 9- Influência dos surfactantes na atividade antagonista de C2I12 e C2I13 - p.45

Quadro 10- Interferência da proteinase K na atividade antagonista de C2I12 e C2I13 - p.46

Quadro 11- Concentração de proteínas no extrato bruto de C2I12 e C2I13, pelo método de Bradford (1976) - p.47

Quadro 12- Concentração Inibitória Mínima e atividade antibacteriana dos extratos de C2I12 e C2I13 e controle - p.47

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Imagem 1- Bactérias produtoras nos poços do replicador - p. 21 Imagem 2- Bactérias produtoras sendo replicadas - p. 22 Imagem 3- Halos produzidos ao redor das bactérias produtoras - p.33 Imagem 4- Ausência de zona lítica, após teste de bacteriófago - p.36 Imagem 5- Expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 na placa com 0,2 cm de meio e 0,5 cm de meio, respectivamente - p. 37

Imagem 6- Estudo de estabilidade de 15 dias, nas temperaturas de -4°C, 4°C, 25°C e 37°C, para os extratos de C2I12 e C2I13, respectivamente - p.41 Imagem 7- Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente - p.42 Imagem 8- Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I13, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente - p.43 Imagem 9- Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12 e C2I13 , após 24 horas; e controles positivo e negativo, respectivamente - p.43 Imagem 10- Teste do solvente para C2I12 e C2I13, respectivamente, após tratamento com Hexano, Metanol e Acetonitrila nas concentrações de 10% e 50%, após 15 minutos, 30 minutos e uma hora de exposição - p.45


Figura 1- Preparo do Inóculo - p.24

Figura 2- Precipitação com Sulfato de Amônio 50% - p.25

Figura 3- Método da Sobrecamada - p.26 Figura 4- Método de Difusão em Poços - p.27 Figura 5- Teste de estabilidade a diferentes pH’s - p.29 Figura 6- Processo para dosagem de Proteínas pelo método de Bradford - p.31 Figura 7- Microdiluição em poços - p.32


Gráfico 1- Porcentagem da atividade antagonista frente às reveladoras testadas - p. 34

Gráfico 2- Porcentagem do número de halos produzidos, por meio de cultura - p.34 Gráfico 3- Curva absorbância X Concentração do padrão de BSA - p.47

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 13

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ....................................................................... 14

2.1 A aquicultura e seus desafios ................................................................ 14

2.2 Resistência aos antimicrobianos ............................................................ 17

2.3 Bacteriocinas ......................................................................................... 18

3 OBJETIVOS ............................................................................................... 20

3.1 Geral ...................................................................................................... 20

3.2 Específicos ............................................................................................ 20

4 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 21

4.1 Obtenção das amostras ......................................................................... 21

4.2 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas .................. 21

4.3 Avaliação da influência do meio de cultivo ............................................. 22

4.4 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância antagônica

detectada ..................................................................................................... 23

4.4.1 Avaliação da interferência do Clorofórmio........................................ 23

4.4.2.Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa ......... 23

4.4.3 Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos .................................. 23

4.5 Obtenção dos extratos brutos protéicos bacterianos (Precipitação com sulfato

de amônio) ................................................................................................... 24

4.5.1 Preparo do Inóculo .......................................................................... 24

4.5.2 Precipitação com Sulfato de Amônio ............................................... 24

4.6 Avaliação da atividade antagonista do extrato ....................................... 25

4.6.1 Difusão em poços x Sobrecamada .................................................. 25

4.6.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista27

4.6.3 Interferência do tempo de incubação na produção da substância

antagonista ............................................................................................... 27

4.7 Caracterização da substância antagonista dos extratos ........................ 28

4.7.1 Estabilidade ao tratamento térmico .................................................. 28

4.7.2 Estabilidade dos extratos frente a variações de pH ......................... 28

4.7.3 Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos29

4.7.4 Influência de Surfactantes na atividade antagonista ........................ 30

4.7.5 Suscetibilidade à enzima proteolítica ............................................... 30

4.8 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford ................................... 30

4.9 Determinação da Concentração Inibitória Mínima .................................. 31

5 RESULTADOS ........................................................................................... 33

5.1 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas .................. 33

5.2 Avaliação da influência do meio de cultivo ............................................. 34

5.3 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância antagonista

detectada ..................................................................................................... 35

5.3.1 Interferência do clorofórmio ............................................................. 35

5.3.2 Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa ......... 35

5.3.3 Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos .................................. 36

5.4 Avaliação da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 ........... 36

5.4.1 Difusão em poços X Sobrecamada .................................................. 36

5.4.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista37


antagonista ............................................................................................... 37

5.5 Manutenção da atividade antagonista dos extratos................................ 38

5.5.1 Estabilidade ao tratamento térmico .................................................. 38

5.5.2 Estabilidade dos extratos frente a variações de pH ......................... 41

5.5.3 Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos44

5.5.4 Influência de Surfactantes na atividade antagonista ........................ 45

5.5.5 Suscetibilidade a enzima proteolítica ............................................... 46

5.6 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford ................................... 46

5.7 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) ........................ 47

6 DISCUSSÃO ............................................................................................... 48

7 CONCLUSÃO ............................................................................................. 55

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................56

REFERÊNCIAS .............................................................................................. 57

ANEXO ........................................................................................................... 66

13

1 INTRODUÇÃO

Entre os setores responsáveis por produzir alimentos de origem animal, a

aquicultura vem sendo, por muitos anos, o que mais cresce. Segundo a Food and

Agriculture Organization das Nações Unidas (FAO), até 2020 ela será responsável

por metade da alimentação humana proveniente de ambientes aquáticos.

Embora a aquicultura venha crescendo de forma considerável, um fator de

grande importância impede que esse crescimento seja ainda maior. As doenças

infecciosas de origem bacteriana podem ocasionar perdas no estoque além de

constituírem riscos durante a produção dos peixes e para a saúde humana. Como

forma de controlar o surgimento dessas doenças, o uso dos antimicrobianos foi

introduzido, o que tem resultado em um aumento da pressão seletiva nas

populações bacterianas. Diante disso, uma das maiores preocupações atuais

consiste no fato dessa pressão seletiva exacerbada na aquicultura poder gerar

impactos para a medicina humana, levando a um aumento do número de infecções

ou causando infecções mais severas, que podem muitas vezes ter o tratamento

dificultado. Dessa forma, o uso de antimicrobianos em animais deve ser controlado

ou até mesmo evitado para que não seja gerada resistência aos medicamentos por

parte dos microrganismos.

Justifica-se então, a busca por alternativas viáveis que levem à diminuição

do uso de antimicrobianos na aquicultura e que, consequentemente, tenha-se uma

diminuição da resistência. Uma alternativa que vem sendo muito empregada é o

biocontrole, que consiste no controle de microrganismos utilizando microrganismos.

Entre as formas de biocontrole, algumas vêm sendo mais estudadas, como o uso de

probióticos, vacinas, imunoestimulantes e as bacteriocinas.

As bacteriocinas são peptídeos ou proteínas produzidas pelas próprias

bactérias, que possuem ação antimicrobiana. Essas substâncias são produzidas

tanto por microrganismos Gram positivos, quanto por microrganismos Gram

negativos, e vários autores vêm confirmando a ação antagonista desses peptídeos.

Assim, este trabalho buscou avaliar a produção de potenciais substâncias

antagonistas tipo bacteriocina em isolados bacterianos de sistemas de sistemas de

aqüicultura.

14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 A aquicultura e seus desafios

Aquicultura consiste em criar organismos aquáticos como peixes, moluscos

crustáceos e plantas aquáticas em um espaço confinado que possua condições

controladas. Dessa forma, os animais cultivados estão protegidos de condições

desfavoráveis ao seu crescimento, como por exemplo, fatores ambientais, a falta de

alimentação ou a presença de predadores (EMBRAPA, SD; BARROSO, 2007).

Desde 1970, a aquicultura tem mantido um crescimento anual de 8,7% no

mundo inteiro, sendo o setor de produção de alimentos de origem animal que mais

cresce (ALY, 2009). Porém, a estocagem de grandes quantidades de animais e a

intensa manipulação dos mesmos favorece o aparecimento de doenças infecciosas,

o que constitui o maior fator de impedimento para que o crescimento da aquicultura

seja ainda maior, gerando um prejuízo de cerca de dois bilhões de dólares por ano

(BALCÁZAR, 2006; SILVA, 2009; SACCHETIN, 2010; DEFOIRDT, 2011). Dentre as

doenças que infectam os peixes, as de origem bacteriana são as que causam maior

impacto, principalmente devido à taxa elevada de mortalidade, bem como o grande

gasto financeiro necessário com a prevenção e o controle dessas doenças

(SACCHETIN, 2010). Normalmente elas são causadas por microrganismos Gram

negativos das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae e Vibrionaceae, que

levam principalmente a formação de úlceras e septicemias (ALY,2009). Alguns

gêneros bacterianos são responsáveis por grandes perdas econômicas, como é o

caso de Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Flavobacterium, Edwardsiella,

Streptococcus e Enterococcus (SILVA, 2009).

Assim a indústria buscou estratégias para minimizar esses impactos, e os

antimicrobianos passaram a ser utilizados na aquicultura como forma de controlar o

surgimento de doenças bacterianas (BALCÁZAR, 2006). Porém, o emprego destas

substâncias acaba sendo empírica, devido à dificuldade existente de se determinar

doses individuais de antimicrobianos para espécies aquáticas que são cultivadas em

grandes densidades (RESENDE et al.,2016). Essa prática, porém, tem ocasionado

o aparecimento de microrganismos resistentes a diferentes tipos de antimicrobianos,

o que é um grande problema, considerando que muitos desses fármacos também

são utilizados para tratar doenças humanas (SILVA, 2009; SACCHETIN, 2010;

DEFOIRDT, 2011). Outro ponto importante a ser considerado é que alguns desses

15

microrganismos que facultativamente causam doenças nos peixes podem ser

transmitidos aos seres humanos. Além disso, a própria resistência poder ser

transmitida a microrganismos que acometem o homem, através da transferência

horizontal de genes, como já foi evidenciado para o Vibrio cholerae (ALY, 2009;

DEFOIRT, 2011). Assim, o uso de antimicrobianos na aquicultura deve ser

restringido ou até mesmo evitado. Para isso são necessárias outras formas de

controle de microrganismos (CYRINO et al., 2010).

O biocontrole nada mais é que o controle de microrganismos por

microrganismos. Ele vem sendo muito utilizado em vários ramos, e na aquicultura

está se mostrando viável como alternativa ao uso de antimicrobianos (JÚNIOR,

2000). Algumas formas de biocontrole podem ser citadas como, por exemplo, o uso

de probióticos, prebióticos, imunoestimulantes e vacinas.

Probióticos são microrganismos vivos, que quando consumidos em

quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro

(FAO/WHO,2001). Diferentemente dos animais terrestres, os organismos aquáticos

possuem uma microbiota facilmente modificada por alterações de temperatura e

salinidade. Essa alteração também pode ser rapidamente feita pela comida, ou por

microrganismos que venham na água (GATESOUPE, 1999). Assim, os probióticos

podem ser usados na aquicultura de duas maneiras: adicionando os microrganismos

nos tanques de piscicultura, de forma a transformar a microbiota ambiental,

diminuindo a presença de microrganismos causadores de doenças infecciosas; ou

ser adicionada às rações, modificando a microbiota intestinal dos peixes através dos

mecanismos de competição (REZENDE 2009; CYRINO et al., 2010).

Os prebióticos muitas vezes são confundidos com os probióticos, porém

constituem conceitos diferentes. Prebióticos são ingredientes adicionados à

alimentação, que não são digeridos no trato gástrico. Eles afetam o hospedeiro por

estimularem o crescimento seletivo de um número limitado de bactérias, ou ativarem

o metabolismo de bactérias que, no cólon, são benéficas para a saúde do

hospedeiro (GATESOUPE, 1999; CYRINO, 2010; SILVA, 2012). Segundo SILVA

(2012), alguns exemplos de prebióticos seriam: glicose, frutose, galactose, manose,

pentoses, ribose, xilose e arabinose, sendo que a frutose e a manose são os dois

componentes mais importantes dos grupos de prebióticos utilizados nos dias de

hoje.

16

Atualmente, o interesse em utilizar imunoestimulantes na piscicultura vem

aumentando, principalmente nas fases iniciais da vida dos peixes, em que eles estão

mais propensos a adquirirem doenças. Essa prática aumenta o bem-estar do animal,

principalmente em sistemas intensivos de produção (AGOSTINHO, 2010).

Imunoestimulante é qualquer produto que seja capaz de estimular o sistema

imunológico, aumentando a atividade das células fagocitárias, e a produção de

anticorpos. Elas diminuem o estresse devido ao manejo dos peixes, e

consequentemente diminuem as perdas econômicas devido às doenças infecciosas.

Como exemplos de imunoestimulantes podem ser citados os extratos de plantas e

de animais, ou até mesmo fatores nutricionais (TAVECHIO, 2009).

O desenvolvimento de novas vacinas e o aprimoramento das técnicas de

vacinação tem contribuído consideravelmente para a diminuição das mortes de

peixes, causadas por doenças infecciosas (LONGHI, 2012). Ao se estimular a

imunização dos peixes através da vacinação, diminui-se a necessidade do uso de

antimicrobianos (SACCHETIN, 2010). A vacinação dos peixes pode ser feita por três

métodos: via oral, por imersão, ou via intraperitoneal.

A vacinação oral consiste no método mais fácil de entrega do antígeno ao

hospedeiro, uma vez que ela é feita através da alimentação (SOMMERSET, 2005).

Esse método é considerado ideal, por ser de fácil administração, por não precisar

manipular os peixes, além de ser barato (HEPPELL, 2000). Porém, alguns estudos

já demonstraram que esse método não é tão eficiente devido à destruição de parte

dos antígenos pelo trato gastrointestinal do hospedeiro, sendo menos eficaz que a

vacinação por via intraperitoneal ou imersão. Além disso, não é possível estimar a

dose consumida por cada animal (SOMMERSET, 2005; HEPPELL, 2000).

Na vacinação por imersão, os peixes são colocados em contato com uma

solução concentrada de vacina (HEPPELL, 2000). Embora seja menos eficaz que o

método intraperitoneal, a vacinação por imersão traz a vantagem de ser mais barata

e prática, podendo ser aplicada até em espécies de pequeno porte; além disso, ela

diminui a manipulação dos peixes, evitando estresse e não necessita de mão de

obra qualificada para sua execução (LONGHI, 2012; HEPPELL, 2000).

Embora necessite de manipulação dos peixes, a vacinação injetável é a que

apresenta melhores efeitos de imunização (HEPPEL, 2000). Além disso, tem-se a

17

vantagem de todos os peixes serem vacinados e com a dose correta. A quantidade

de vacina utilizada também é baixa quando comparado com outros métodos de

vacinação (SOMMERSET, 2005). Porém, este método possui como desvantagens o

fato de possuir difícil aplicação, causando estresse aos peixes, além de necessitar

de mão de obra qualificada (LONGHI, 2012).

2.2 Resistência aos antimicrobianos

Os antimicrobianos são compostos produzidos de forma natural ou sintética,

que são capazes de matar ou inibir o crescimento de microrganismos, como fungos

e bactérias. Quando eles causam a morte do microrganismo, são classificados como

bactericidas, e quando apenas inibem seu crescimento, são chamados

bacteriostáticos (GUIMARÃES, 2010).

O primeiro antibiótico, a penincilina, foi descoberto em 1928 por Alexander

Fleming e constituiu um dos maiores marcos da história da ciência. Após a sua

produção a nível industrial, nos anos 40, o número de mortes devido a doenças

infecciosas diminuiu drasticamente em todo o mundo, o que levou a busca e a

descoberta de novos antimicrobianos, principalmente durante a segunda guerra

mundial (PEREIRA,2005; GUIMARÃES, 2010). Além das vantagens terapêuticas na

medicina humana, a descoberta dos antimicrobianos também trouxe vantagens

significativas para a veterinária, reduzindo também a morte de animais devido a

doenças infecciosas (MOTA, 2005).

Desde a descoberta da penicilina, novos medicamentos contra bactérias

Gram positivas e contra Gram negativas foram introduzidos no mercado. Porém,

entre os anos de 1980 e 2000, a descoberta de novos antimicrobianos reduziu

consideravelmente (GUIMARÃES, 2010). Paralelamente a essa diminuição, o uso

abusivo e inapropriado desses medicamentos em detrimento de medidas

preventivas favoreceu o desenvolvimento de microrganismos resistentes, que se

disseminaram por todas as regiões do planeta (MEIRELES, 2008).

O uso indiscriminado dos antimicrobianos age selecionando microrganismos

resistentes a essas drogas (SANTOS, 2004). Esta resistência pode constituir um

mecanismo intrínseco de uma determinada bactéria, ocorrendo mutação espontânea

e recombinação de genes, com a formação de microrganismos resistentes; ou

podem ser uma característica adquirida através da alteração do DNA bacteriano por

18

transferência, por exemplo, de plasmídeos entre bactérias de uma mesma espécie,

ou de espécies diferentes (ANVISA, 2016; MOTA, 2005).

Em 2004 já eram relatados, casos de resistência descritos. Muitas infecções

causadas, por exemplo, por Staphylococcus aureus, Enterococcus e Mycobacterium

tuberculosis não podiam ser tratadas com os antimicrobianos existentes,

representando uma ameaça para a humanidade (SANTOS, 2004).

Dessa forma, medidas de prevenção e de uso racional de medicamentos

vêem sendo implementadas em todo o mundo. No Brasil, a Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA), em outubro de 2010, com o objetivo de diminuir a

exposição da população e, consequentemente, combater à resistência, publicou

medidas regulatórias ao uso dos antibacterianos (NOVARETTI, AQUINO E

PISCOPO, 2014). Assim, o uso de antimicrobianos em animais também deve ser

controlado ou até mesmo evitado para que não sejam geradas resistência aos

medicamentos por parte dos microrganismos (HEUER et al, 2009).

2.3 Bacteriocinas

Ao longo do crescimento in vitro, a maioria das células bacterianas produz

compostos antagonistas, ou seja, capazes de inibir o seu próprio crescimento, ou o

crescimento de outras bactérias (SCHULTZ et al, 2003,). Essas substâncias são

produzidas como forma de competição por espaço e por recursos, podendo ter efeito

bacteriostático ou bactericida. Podemos citar, por exemplo, a produção de enzimas

bacteriolíticas, ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio, substâncias antibióticas e

as chamadas bacteriocinas (YANG 2014; OGAKI, FURLANETO e MAIA (2015).

Bacteriocinas são proteínas ou peptídeos sintetizados nos ribossomos das

bactérias, que possuem atividade antimicrobiana, podendo ter origem cromossomal

ou plasmidial (ROSA, 2002; GARCIA, 2010; BARBOSA et al, 2011).

Os primeiros registros mostram que o estudo das bacteriocinas iniciou-se em

1925 através de pepitídeos produzidos por Escherichia coli, as chamadas colicinas

(ROSA, 2002; GARCIA, 2010, BAUCIUNAS, 2013). Hoje inúmeras bacteriocinas já

são conhecidas, e sabe-se que elas são produzidas tanto por microrganismos Gram

positivos, como por microrganismos Gram negativos (BARBOSA et al, 2011).

Os microrganismos produtores dessas substâncias desenvolveram um

mecanismo de imunidade, de forma que produzem ao mesmo tempo a bacteriocina

19

e uma proteína. Esta proteína produzida lhes confere imunidade, agindo como

antagonista da ação da bacteriocina (ROSA, 2002; BARBOSA et al 2011;

BAUCIUNAS, 2013; YANG 2014). Nos microrganismos alvo, normalmente essas

substâncias agem desestabilizando a membrana citoplasmática, levando ao

surgimento de poros que causam a morte celular. Devido a esse mecanismo,

bactérias Gram negativas acabam sendo mais resistentes à ação das bacteriocinas

(ROSA, 2002; GARCIA, 2010; BARBOSA et al 2011) uma vez que possuem

membrana externa, impermeável a grande maioria das bacteriocinas (FERREIRA,

2005).

O potencial de uma bacteriocina pode ser previsto por algumas

características, como sua estabilidade à diferentes pH’s e temperaturas, e/ou pelo

seu espectro de ação. Até o momento, a única bacteriocina com utilização permitida

na conservação de alimentos é a Nisina. Porém, o interesse por essas substâncias

vem aumentando, principalmente por se acreditar que elas poderiam ser utilizadas

na indústria de alimentos quando se considera a “segurança” que essas substâncias

antagonistas conferem (SCHULZ, 2003; BARBOSA et al, 2011).

20

3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a produção de substâncias antagonistas tipo bacteriocina por

amostras de bactérias isoladas de sistemas de aquicultura.

3.2 Específicos

Avaliar a habilidade antagonista das amostras isoladas de sistemas de

aquicultura frente a diferentes bactérias reveladoras de grande

importância para a piscicultura e para a saúde humana;

Avaliar a influência da composição do meio de cultivo na expressão da

produção de substâncias antagonistas pelas amostras em estudo;

Selecionar as bactéias produtoras capazes de inibir o crescimento de um

maior número de reveladoras;

Avaliar fatores de interferência que poderiam influenciar na expressão da

atividade antagonista;

Extrair substâncias antagonistas das amostras selecionadas;

Caracterizar parcialmente a substância antagonista detectada.

21

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Obtenção das amostras

Neste estudo foram utilizadas amostras previamente isoladas de sistemas

de aqüicultura (localizados na cidade de Leopoldina, Minas Gerais, Brasil) e

amostras de referência, pertencentes à coleção de culturas do laboratório de

Fisiologia e Genética Molecular Bacteriana. Estas amostras são mantidas

congeladas à -20°C em SkinMilk.

4.2 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas

Foram realizados testes para avaliar a produção de substâncias

antagonistas, frente a seis espécies bacterianas, chamadas reveladoras, por meio

do método da sobrecamada. As espécies reveladoras foram escolhidas de acordo

com a sua importância para a piscicultura e para a saúde humana, sendo elas:

Edwardsiella tarda; Enterococcus faecalis (ATCC 51299); Aeromonas hydrophila;

Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella tiphy

(CFP/IAL1472). Para esse teste, 100 µL de culturas de 24h em caldo BHI

(Laboratório KASVI) de cada uma das produtoras foram pipetados, em diferentes

poços do replicador de Steers. Dessa forma, foi possível analisar 32 amostras de

bactérias produtoras por vez, conforme mostrado na imagem 1.

Imagem 1: Bactérias produtoras nos poços do replicador.

Fonte: Os autores, 2015

As amostras produtoras foram então replicadas para placas de Petri

contendo o meio de cultura teste, conforme é mostrado pela imagem 2. As placas

devidamente identificadas foram então incubadas em estufa a 37°C, durante um

22

período de 24 horas, após o qual foi observado o crescimento das bactérias

produtoras.

Imagem 2: Bactérias produtoras sendo replicadas.

Fonte: Os autores, 2015.

Em seguida, procedeu-se a morte das bactérias produtoras por meio da

exposição ao vapor de clorofórmio: 0,5 mL de clorofórmio foi depositado na tampa

das placas de Petri, deixando as mesmas fechadas por 30 minutos e em seguida,

abertas por mais 30 minutos, para a evaporação do clorofórmio residual. Após a

morte das bactérias produtoras, colocou-se a sobrecamada contendo as bactérias

reveladoras: a cada 4 mL de meio BHI semi-sólido fundido, foi adicionado 20 µL da

bactéria reveladora, previamente crescida em caldo BHI (Laboratório KASVI) por

24h; o mesmo era homogeneizado e vertido sobre a placa de Petri contendo as

produtoras anteriormente mortas. As placas eram então incubadas em estufa a 37°C

por mais 24 horas.

No quarto dia de testes, as placas foram retiradas da estufa e foi avaliada a

existência de halo de inibição de crescimento da reveladora. Os halos detectados

eram medidos e as amostras produtoras positivas para o antagonismo armazenadas

à -20°C, no meio SkinMilk, para realização dos testes posteriores.

4.3 Avaliação da influência do meio de cultivo

Os testes da avaliação da atividade antagonista foram realizados em três

meios de cultura diferentes: ágar BHI (Laboratório KASVI), ágar Mueller Hinton

(Laboratório KASVI) e ágar Nutritivo (Laboratório KASVI), utilizando-se metodologia

descrita no item anterior.

23

4.4 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância

antagonista detectada

Para a avaliação dos fatores de interferência foram selecionadas as

amostras bacterianas C2I12 e C2I13 como produtoras e Aeromas hydrophila como

reveladora. Para a realização dos testes foi utilizado o meio Nutritivo (Laboratório

KASVI).

4.4.1.Avaliação da interferência do Clorofórmio

Após o crescimento das amostras produtoras, placas contendo Ágar nutritivo

(Laboratório KASVI) foram reveladas pelo método da sobrecamada, sem que as

mesmas fossem anteriormente mortas pelo vapor de clorofórmio.

4.4.2.Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa

Para analisar a interferência de ácidos graxos de cadeia longa na expressão

da atividade antagonista das amostras produtoras, utilizou-se o método descrito por

APOLÔNIO (2007). Foram replicados 5 µL de cultura de 24 horas da reveladora

para duas placas de Petri, a primeira contendo ágar nutritivo e a segunda ágar

nutritivo com 1% de amido. As placas foram incubadas por 24 horas a 37°C. No dia

seguinte, as placas foram reveladas com 4 mL de BHI semi-sólido (Laboratório

KASVI) contendo 20 µL de cultura de 24 horas da reveladora Aeromonas hydrophila

e incubadas à 37°C por 24 horas. A interferência dos ácidos graxos de cadeia longa

foi analisada através da presença ou ausência de halos na placa contendo amido

1%.

4.4.3 Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos

A avaliação do antagonismo por bacteriófagos foi realizada segundo método

adaptado de APOLONIO et al (2007). As amostras produtoras foram replicadas no

Ágar nutritivo, e incubadas em estufa a 37°C por 24 horas. Após esse período, as

placas foram reveladas utilizando-se 4 mL de BHI (Laboratório KASVI) contendo 20

µL de Aeromonas hydrophila e re-incubadas a 37°C por mais 24 horas. Cubos de

0,5 cm³ dos halos de inibição foram então retirados assepticamente, com o auxilio

de uma alça bacteriológica, macerados e colocados em 500 µL de BHI caldo

(Laboratório KASVI). A solução foi então centrifugada à 3600g por cinco minutos e o

sobrenadante totalmente adicionado em 4 mL de BHI semi-sólido (Laboratório

KASVI) fundido contendo 20 µL da amostra reveladora, o qual foi vertido sobre uma

placa de Petri contendo Ágar Nutritivo (Laboratório KASVI). Após incubação a 37°C

24

por 24 horas, avaliou-se a presença de zonas líticas que indicariam a presença dos

bacteriófagos.

4.5. Obtenção dos extratos brutos protéicos bacterianos (Precipitação com

sulfato de amônio)

4.5.1Preparo do Inóculo

Partindo-se da cultura congelada, o pré-inóculo foi preparado adicionando-se

50 µL da amostra produtora em 10 mL de BHI caldo seguido de incubação à 37ºC

por 24 horas. O inóculo foi então preparado: acertou-se 20 mL de BHI caldo

(Laboratório KASVI) para a escala 0,5 McFarland utilizando-se o pré-inóculo e

verteu-se o mesmo em 180 mL de BHI caldo (Laboratório KASVI). O inoculo foi

então incubado a 37ºC, por 24 horas. Foram preparados inóculos de C2I12 e C2I13. O

processo está esquematizado na figura 1.

Figura 1: Preparo do Inóculo


4.5.2 Precipitação com Sulfato de Amônio

A realização da precipitação com sulfato de amônio foi feita de acordo

com o método descrito por OLIVEIRA (2004), com adaptações. Os 200 mL de

inóculo foram então centrifugados a 8000 g, por 20 minutos, 4°C, para que as

células fossem precipitadas. Em seguida, o sobrenadante foi separado e

colocado em banho de gelo. Adicionou-se então 62,6 g (50%) de NH3SO4

(laboratório Dinâmica). Agitou-se suavemente com a ajuda de um bastão de

vidro, até que todo o sulfato de amônio tivesse sido solubilizado. A extração

prosseguiu com uma segunda centrifugação a 8000 g, por 20 minutos, 4°C, para

25

que as proteínas fossem precipitadas. O sobrenadante foi descartado e o pellet

ressuspendido em 2 mL de água destilada esterilizada, obtendo-se o extrato

bruto 50%. Foi produzido extrato bruto de C2I12 e C2I13. Foi realizada a análise de

um controle negativo com solução de sulfato de amônio 50% para analisar se

havia ou não interferência do mesmo. A figura 2 representa o processo de

extração.

Figura 2: Precipitação com Sulfato de Amônio 50%.


4.6 Avaliação da atividade antagonista do extrato

4.6.1 Difusão em poços x Sobrecamada

Este teste foi realizado com o intuito de se determinar qual era o melhor

método de difusão dos extratos através do meio de cultura. Dessa forma, dois testes

foram feitos concomitantemente para que os resultados pudessem ser comparados:

difusão em poços e sobrecamada:

26

Sobrecamada: Uma cultura de 24 horas da reveladora em BHI caldo

(Laboratório KASVI) foi acertada para a escala de 0,5 McFarland e 20 µL da

reveladora foram inoculados em 4 mL de BHI semi-sólido (Laboratório KASVI)

fundido. Em seguida, os 4 mL de BHI semi-sólido foram vertidos sob uma placa de

Ágar Nutritivo (Laboratório KASVI). Foram então pipetados para a placa, 10 µL do

extrato bruto e de sua diluição seriada na base 2 (até 1:64) em água esterilizada. A

placa foi incubada por 24 horas, a 37°C.

Difusão em Poços: Uma cultura de 24 horas da reveladora em BHI caldo

(Laboratório KASVI) foi acertada para a escala de 0,5 McFarland. Com a ajuda de

um Swab, a mesma foi espalhada na superfície de uma placa de Petri contendo ágar

nutritivo. Em seguida, os poços foram feitos com a ponta de um canudo esterilizado.

Em cada um dos poços foi colocado 10 µL do extrato bruto e de suas diluições

seriadas na base 2 (até 1:64) em água esterilizada. A placa foi incubada por 24

horas, a 37°C.

No dia seguinte, comparou-se a formação das zonas de inibição nos dois

métodos utilizados. As figuras 3 e 4 representam os métodos descritos acima.

Figura 3: Método sobrecamada.


27

Figura 4: Método de difusão em poços.


4.6.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista

Utilizando-se a técnica de difusão em poços descrita no item anterior, a

influência da espessura do meio de cultura na expressão da atividade antagonista foi

verificada: 20 µL dos extratos bruto e de suas diluições seriadas em base 2 (até

1:128) em água destilada esterilizada foram inoculados nos poços de duas placas

contendo ágar nutritivo: a primeira contendo 0,2 cm de espessura de meio, e a

segunda contendo 0,5 cm. Ambas foram incubadas a 37°C por 24 horas, e as zonas

de inibição comparadas.


antagonista

Com a finalidade de se saber em quanto tempo as bactérias testadas

atingiam seu ponto máximo de produção das substâncias antagonistas analisadas,

foram preparados três inóculos de cada bactéria produtora. Os mesmos foram

incubados a 37°C, e procedeu-se extração de cada um deles com sulfato de amônio

50% após tempos diferentes de incubação: 24 horas, 48 horas e 72 horas. No final

do último dia, os extratos tiveram sua atividade testada frente à Aeromonas

hydrophila através da técnica de difusão em poços. O tamanho das zonas de

inibição produzidas foi avaliado em uma mesma placa de Petri, sabendo-se assim

qual era o tempo necessário de incubação para que se tivesse uma melhor

produção da substância antagonista.

28

4.7. Caracterização da substância antagonista dos extratos

Os extratos obtidos foram testados quanto à sua estabilidade frente ao

tratamento térmico, variações de pH, enzima proteolítica, solvente orgânico, e

surfactantes com o objetivo de parcialmente caracterizar a substância

antimicrobiana, estimando sua natureza química.

4.7.1 Estabilidade ao tratamento térmico

Alíquotas dos extratos foram incubadas por 15 minutos, 30 minutos, 1 hora,

1 hora e meia, 2 horas, 24 horas, 48 horas, 8 dias, 15 dias e 22 dias, nas

temperaturas de -4°C, 0°C, 25°C e 37°C. Utilizando-se a técnica de difusão em

poços, 20 µL dos extratos bruto e de suas diluições seriadas em base 2 (até 1:128)

em água destilada esterilizada, foram colocados em cada um dos poços, e a placa

foi incubada por 24 horas, à 37°C, para que a permanência ou ausência das zonas

de inibição pudessem ser observadas, e a estabilidade dos extratos ao tratamento

térmico ao longo do tempo pudesse ser analisada.

4.7.2 Estabilidade dos extratos frente a variações de pH

Em 11 tubos de ensaio esterilizados, foram colocados 5 mL de tampão

Britton Robinson e em seguida os pH’s foram acertados de 2 a 12 com o auxilio de

NaOH 1M (laboratório Nuclear) e HCl 5N (laboratório Gehaka), de modo que cada

tubo possuísse um pH diferente. Em seguida, foram passados 70 µL do conteúdo de

cada tubo para diferentes tubos de microcentrífuga e foram adicionados 70 µL do

extrato em cada um deles. Os tubos de microcentrífuga foram incubados a 4°C.

Após os tempos de 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, uma hora e meia e 24 horas, a

atividade dos extratos brutos foram testadas pelo método de difusão em poços,

frente à reveladora Aeromonas hydrophila. Após 24 horas de incubação a 37°C,

verificou-se a presença ou ausência de zonas de inibição, que indicaram a

estabilidade dos extratos aos diferentes pH’s. A cada teste, foi utilizado um controle

negativo (extrato diluído em água esterilizada 1:1) para comparação da atividade do

extrato. A figura 5 ilustra o processo.

29

Figura 5: Teste de estabilidade a diferentes pH’s.


4.7.3. Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos

O efeito dos solventes orgânicos foi analisado segundo método adaptado de

APOlÔNIO (2007). Foram preparadas soluções a 10% e a 50% de metanol, hexano

(laboratório Vetec) e acetonitrila (laboratório Panreac). Em seguida, as soluções

foram transferidas para tubos de microcentrífuga e o extrato foi acrescentado, na

proporção 1:1. Os tubos de microcentrífuga foram então incubados a 4°C e a

atividade antagonista do extrato bruto, foi testada frente Aeromonas hydrophila pelo

método de difusão em poços, adicionando-se 20 µL da solução solvente-extrato

bruto em cada um dos poços, após 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 1 hora e meia de

incubação. As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas. Como forma de

comparação dos resultados, também foi feito um controle positivo, extrato diluído em

água esterilizada na proporção 1:1, e controles negativos, solventes diluídos em

água esterilizada na proporção de 1:1.

30

4.7.4. Influência de Surfactantes na atividade antagonista

Conforme descrito por Elayaraja (2014) foram preparadas soluções a 1% de

uréia (laboratório Promega), SDS (laboratório Promega) e tween 80 (laboratório

Promega). Em diferentes tubos de microcentrífuga, foram feitas diluições dos

surfactantes com o extrato, em uma proporção de 1:1. Os mesmos foram incubados

a 37°C, e testados, frente à Aeromonas hydrophila, após 30 minutos e uma hora

pelo método de difusão em poços, adicionando-se 20 µL da solução surfactante-

extrato, em cada um dos poços. As placas então foram incubadas por 24 horas, a

37°C, e a presença ou ausência de zonas de inibição indicava a influência dos

surfactantes na atividade antagonista dos extratos. Foi feito um controle positivo,

extrato diluído em água esterilizada na proporção 1:1 e controles negativos,

surfactantes diluídos em água esterilizada na proporção de 1:1.

4.7.5 Suscetibilidade à enzima proteolítica

Para o teste de suscetibilidade a ação de enzima proteolítica, utilizou-se um

tubo de microcentrífuga para que o extrato fosse diluído na proporção de 1:1 em

uma solução de proteinase K (laboratório Promega) 1mg/mL. Em seguida, o tubo de

microcentrífuga foi incubado a 37°C e a atividade antagonista da solução extrato-

proteinase K frente à Aeromonas hydrophila foi testada após 15 minutos, 30

minutos, uma hora, e uma hora e meia. A suscetibilidade á proteinase K foi então

testada pelo método de difusão em poços, adicionando-se 20 µL da solução extrato-

proteína K, em cada um dos poços. As placas foram então incubadas por 24 horas a

37°C, e a presença ou ausência de zonas de inibição, indicava a ação da enzima

proteolítica na atividade antagonista dos extratos. Foi feito um controle positivo,

extrato diluído em água esterilizada na proporção 1:1, e um controle negativo,

proteinase K diluída em água esterilizada na proporção de 1:1 (APOLÔNIO, 2007).

4.8 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford

Para a dosagem das proteínas dos extratos, foi utilizado o método de

Bradford (1976), que consiste em um método colorimétrico no qual o corante

(Cromassie Blue G-250) se liga as proteínas do extrato, permitindo sua

quantificação. Para a realização do experimento, foi utilizada uma placa de 96

poços. Na primeira coluna, foi preparado o branco da reação, onde foi pipetada água

e o Reagente de Bradford. O padrão da reação foi preparado utilizando-se uma

31

solução estoque de Bovine Serum Albumin (BSA) 1mg/mL (laboratório Promega), de

forma que os poços da segunda coluna continham o padrão, em duplicata, nas

seguintes concentrações: 0,25mg/mL; 0,50mg/mL; 0,75mg/mL e 1,00 mg/mL. Na

terceira coluna, foi colocado o extrato bruto e suas diluições seriadas na base 2 para

reagir com o Reagente de Bradford. Os reagentes foram pipetados para a placa na

seguinte ordem: água, extrato, BSA e reagente de Bradford. A placa foi então

deixada em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente, e a leitura foi feita

utilizando espectofotômetro, no comprimento de onda de 596 nm. A figura 6

representa o processo.

Figura 6: Processo para dosagem de Proteínas pelo método de Bradford.

Fonte: Os autores, 2016. *Todos os valores correspondem à unidade µL.

4.9. Determinação da Concentração Inibitória Mínima

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) consiste na menor concentração de

uma droga, capaz de inibir o crescimento de um microrganismo, após incubação por

32

24 horas. Este teste foi realizado com o intuito de comparar a capacidade dos

extratos em inibir o crescimento da reveladora Aeromonas hydrophila, com a de um

antimicrobiano (Ampicilina 1mg/mL). Para isso, foi utilizada a técnica de

microdiluição em poços, tendo o Mueller Hinton como meio de cultura, como é

mostrado pela figura 7. Em seguida, a placa foi incubada a 37°C, por 24 horas. No

dia seguinte a leitura foi feita analisando-se qual a menor concentração de extrato

capaz de inibir o crescimento da bactéria reveladora.

Figura 7: Microdiluição em poços.

Fonte: Os autores, 2016. Os volumes correspondem à µL.

33

5 RESULTADOS

5.1 Avaliação da habilidade antagonista das amostras isoladas

No presente trabalho foram avaliadas 201 amostras bacterianas isoladas de

sistemas de aquicultura, frente a seis espécies bacterianas reveladoras e em três

meios de cultura diferentes, totalizando 3618 testes, dos quais 312 foram positivos

para a inibição do crescimento das reveladoras. A imagem 3 ilustra os halos de

inibição de crescimento obtidos pelo método da sobrecamada.

Imagem 3: Halos produzidos ao redor das bactérias produtoras.


Todas as espécies bacterianas utilizadas como reveladoras foram inibidas,

em algum momento, pelas amostras produtoras avaliadas. A reveladora inibida por

um maior número de amostras produtoras foi a espécie Staphylococcus aureus,

sendo responsável por 28,81% dos resultados positivos obtidos. Por outro lado,

Aeromonas hydrophila foi a espécie que se mostrou mais resistente, ou seja, que

teve seu crescimento inibido por um menor número de bactérias produtoras,

totalizando 2,72% dos resultados positivos.

O gráfico1 mostra a atividade antagonista das amostras produtoras frente às

amostras reveladoras e expressa em porcentagem, os resultados positivos (número

de halos de inibição encontrados para cada uma das reveladoras).

34

Gráfico1: Porcentagem da atividade antagonista frente às reveladoras testadas.


5.2 Avaliação da influência do meio de cultivo

A partir dos testes realizados, observou-se que o aparecimento de halos de

inibição ocorreu com mais freqüência quando as bactérias produtoras eram

replicadas em meio BHI, seguido do meio Mueller Hinton. O gráfico 2 faz uma

comparação entre o número de halos de inibição encontrados em cada um dos

meios testados.

Gráfico 2: Porcentagem do número de halos produzidos, por meio de cultura.


0 5 10 15 20 25 30 35

Staphylococcus aureus

Enterococcus faecalis

Pseudomonas aeruginosa

Edwardsiella tarda

Salmonella tiphy

Aeromonas hydrophila

%

BHI45%

Ágar Mueller Hinton

29%

Ágar Nutritivo26%

0%

35

No final da avaliação inicial, foram selecionadas as duas amostras

produtoras que apresentaram halos de inibição para um maior número de

reveladoras, estando incluída a espécie Aeromonas hydrophila. Esta última, além da

grande importância para a aquicultura, mostrou se como a espécie testada mais

resistente, e a descoberta de uma substância antagonista para esta espécie seria

interessante. As amostras selecionadas, isoladas de intestino de tilápias, estão

representadas no quadro 1.

Quadro 1: Bactérias produtoras com os melhores resultados frente às

reveladoras. Produtora Característica Espécie

C2I12 Bacilo Gram + Não identificada C2I13 Bacilo Gram + Não identificada


5.3 Avaliação dos fatores de interferência na expressão da substância

antagonista detectada

5.3.1 Interferência do clorofórmio

Esse teste foi realizado com a finalidade de se analisar a interferência do

vapor de clorofórmio na atividade antagonista encontrada. Assim, foi possível

observar que o aparecimento dos halos de inibição não ocorreu devido à retenção

de clorofórmio pelas bactérias produtoras, uma vez que o antagonismo também

ocorreu nas placas reveladas sem o uso do solvente. Dessa forma, pode-se dizer

que alguma substância produzida durante o crescimento bacteriano é a responsável

por inibir o crescimento das bactérias reveladoras.

5.3.2. Avaliação da interferência por ácidos graxos de cadeia longa

Foi necessário determinar se as substâncias produzidas pelas bactérias

escolhidas eram ou não um ácido graxo de cadeia longa, uma vez que a presença

do mesmo poderia ser a causa do aparecimento dos halos de inibição. Dessa forma

foi possível observar que a substância pesquisada não era um ácido graxo de

cadeia longa, uma vez que houve a permanência dos halos de inibição na placa

contendo 1% de amido, para ambas as bactérias.

https://www.google.com.br/search?es_sm=93&q=screening+bacteriocina&spell=1&sa=X&ved=0CBoQvwUoAGoVChMI_MjJ0N7bxgIVhRqQCh1_6Q8i

36

5.3.3.Avaliação do antagonismo por Bacteriófagos

O teste do antagonismo por bacteriófagos realizado para as produtoras C2I12

e C2I13 frente à reveladora Aeromonas hydrophila mostrou que a produção de halos

de inibição não se deve à presença de bacteriófagos, uma vez que após as placas

serem incubadas, não houve o aparecimento de zonas líticas, como indica a imagem

4.

Imagem 4: Ausência de zona lítica, após teste de bacteriófago.


5.4 Avaliação da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13

5.4. Difusão em poços X Sobrecamada

Os resultados abaixo indicam que para as duas produtoras escolhidas, o

método de difusão em poços se mostrou mais eficiente na exibição da ação

antagonista.

Quadro 2: Diferença de expressão da atividade antagonista entre os métodos de difusão em poços e sobrecamada para os extratos de C2I12 e C2I13

C2I12 Difusão

em poços Sobrecamada C2I13

Difusão

em poços Sobrecamada

Bruto + + Bruto + -

1:1 + + 1:1 + -

1:2 + + 1:2 + -

1:4 + - 1:4 + -

1:8 + - 1:8 + -

1:16 - - 1:16 + -

1:32 - - 1:32 - -

1:64 - - 1:64 - -

Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (presença de atividade antagonista); - (ausência de atividade antagonista)

37

5.4.2 Influência da espessura do meio de cultura na atividade antagonista Os resultados observados na avaliação da influência da espessura do meio

de cultura na atividade antagonista estão expressos no quadro 3. A imagem 5

demonstra os resultados encontrados.

Quadro 3: Interferência da espessura do meio de cultura na expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13.

C2I12 0,2 cm

de meio

0,5 cm

de meio C2I13

0,2 cm

de meio

0,5 cm

de meio

Bruto + - Bruto + -

1:1 + - 1:1 + -

1:2 + - 1:2 + -

1:4 +* - 1:4 + -

1:8 - - 1:8 - -

1:16 - - 1:16 - -

1:32 - - 1:32 - -

1:64 - - 1:64 - -

Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista) +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).

Imagem 5: Expressão da atividade antagonista dos extratos de C2I12 e C2I13 na placa com 0,2 cm de meio e 0,5 cm de meio, respectivamente


5.4.3 Interferência do tempo de incubação na produção da substância antagonista

Os resultados observados na avaliação da interferência do tempo de

incubação na produção da substância antagonista estão expressos no quadro 4.

38

Quadro 4: Diferença de tamanho das zonas de inibição dos extratos de C2I12 e C2I13 produzidos após incubação a 37°C por 24 horas, 48 horas e 72 horas.


5.5 Manutenção da atividade antagonista dos extratos

5.5.1. Estabilidade ao tratamento térmico

O estudo de estabilidade foi realizado durante 22 dias para ambos os

extratos, para as temperaturas de -4°C (temperatura de congelamento dos extratos),

4°C, 25°C (temperatura ambiente) e 37°C. Os resultados apresentados nos quadros

8 e 9, mostram que ambos os extratos se mantém ativos (extrato bruto) por pelo

menos 22 dias, nas temperaturas de congelamento, 4°C e ambiente. Os quadros 5 e

6 indicam os resultados e a imagem 6 ilustra o teste de estabilidade térmica dos

extratos.

39

Quadro 5:Estabilidade do extrato de C2I12 ao tratamento térmico.


40

Quadro 6: Estabilidade do extrato de C2I13 ao tratamento térmico.


41

Imagem 6: Estudo de estabilidade de 15 dias, nas temperaturas de -4°C, 4°C, 25°C e 37°C, para os extratos de C2I12 e C2I13, respectivamente.

Fonte: Os autores, 2016. Legenda: da direita para esquerda, Bruto; 1:1; 1:2; 1:4; 1:8. De baixo para cima, -4°C; 4°C, 25°C, 37°C.

5.5.2. Estabilidade dos extratos frente a variações de pH

Os resultados encontrados mostram que o extrato de C2I12 é mais

estável aos diferentes pH’s, quando comparado com o extrato de C2I13. O

extrato de C2I12 mostrou-se estável por pelo menos uma hora e meia, quando

exposto à todas as faixas de pH testadas.

O extrato de C2I13 apresentou-se pouco estável à exposição à diferentes

pH’s, o que é evidenciado pela perda de atividade antagonista nos primeiros 30

minutos, mostrando-se estável em pH’s próximos de 5. Embora algumas faixas

de pH tenham apresentado atividade antagonista residual, pode-se considerar

que em 24 horas de exposição, o mesmo não possui atividade antagonista

significativa. Os resultados estão representados no quadro 7 e as imagens 7, 8

e 9 ilustram os resultados.

42

Quadro 7: Estabilidade do extrato de C2I12 e C2I13 a diferentes pH’s ao longo do tempo.

Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista); +* (atividade antagonista fraca); +** (atividade antagonista muito fraca) - (ausência de atividade antagonista).

Imagem 7: Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente.


43

Imagem 8: Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I13, à 15 minutos e 30 minutos; e 1 hora e uma hora e meia, respectivamente.


Imagem 9: Estudo de estabilidade à diferentes faixas de pH para os extratos de C2I12 e C2I13 , após 24 horas; e controles positivo e negativo, respectivamente.


44

5.5.3 Efeito dos solventes orgânicos na atividade antagonista dos extratos

Após a realização dos testes, foi possível observar que o extrato de C2I12 é

capaz de se manter ativo por pelo menos uma hora e meia, quando em contato com

hexano a 50%. Já para o extrato de C2I13, nenhum dos solventes orgânicos

utilizados mostrou-se adequado para ser utilizado como carreador da substância

antagonista, uma vez que para todos eles pode-se observar uma redução da

atividade antagonista ao longo do tempo de exposição. Em todos os testes foram

utilizados controles positivos, para que a atividade antagonista pudesse ser

comparada, e controles negativos, o que possibilitou perceber que a atividade

antagonista não era desencadeada pelos solventes orgânicos. Os resultados estão

expressos no quadro 8, e ilustrados pela imagem 10.

Quadro 8: Efeito de diferentes solventes orgânicos na atividade antagonista de C2I12 e C2I13.

Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (atividade antagonista); +* (atividade antagonista fraca); - (ausência de atividade antagonista).

45

Imagem 10: Teste do solvente para C2I12 e C2I13, respectivamente, após tratamento com Hexano, Metanol e Acetonitrila nas concentrações de 10% e 50%, após 15

minutos, 30 minutos e uma hora de exposição.


5.5.4. Influência de Surfactantes na atividade antagonista

Os controles positivos foram utilizados a fim de comparação entre a

atividade antagonista do extrato com e sem o tratamento com os surfactantes

utilizados. Além disso, controles negativos compostos pelos próprios surfactantes

foram utilizados com a finalidade de se perceber se os mesmos poderiam estar

interferindo na apresentação da atividade antagonista, e os resultados mostraram

que os mesmos são inertes. O quadro 9 ilustra os resultados.

Quadro 9: Influência dos surfactantes na atividade antagonista de C2I12 e C2I13.

Fonte: Os autores, 2016. Legenda: + (presença de atividade antagonista); +** (atividade antagonista muito fraca) - (ausência de atividade antagonista)

46

5.5.5. Susceptibilidade a enzima proteolítica

Após o tratamento dos extratos com a solução de proteinase K 1mg/mL,

pode-se observar (quadro 10) uma redução do tamanho das zonas de inibição em

ambos os extratos, quando comparadas com o controle positivo.

Quadro 10: Interferência da proteinase K na atividade antagonista de C2I12 e C2I13.


5.6 Dosagem de proteínas pelo método de Bradford

Após calcular a absorbância do padrão, cujas concentrações eram

conhecidas, foi possível a construção de uma curva padrão de BSA e,

consequentemente, a determinação de uma equação da reta, a partir da qual era

possível se estabelecer a concentração de proteínas de cada um dos extratos

brutos. A curva padrão é mostrada pelo gráfico 3, e as concentrações de proteínas

em cada extrato estão indicadas no quadro 11.

47

Gráfico 3: Curva absorbância X Concentração do padrão de BSA.


Quadro 11: Concentração de proteínas no extrato bruto de C2I12 e C2I13, pelo método de Bradford (1976).

Extrato Concentração (mg/mL)

C2I12 1,87

C2I13 3,21


5.7 Determinação da concentração inibitória Mínima (MIC):

Após a realização do teste, observou-se que o controle positivo (ampicilina)

foi capaz de inibir o crescimento microbiano até quando em uma concentração de

0,0833 mg/mL. Os controles negativos não apresentaram crescimento perceptível. O

quadro 19 indica os resultados de CIM encontrados, e o tipo de atividade

antibacteriana encontrada.

Quadro 12: Concentração Inibitória Mínima e atividade antibacteriana dos extratos de C2I12 e C2I13 e controle.

CIM (mg/mL) Efeito

C2I12 ≤ 0,1558 Bacteriostático

C2I13 ≤ 0,2675 Bacteriostático

Ampicilina ≤ 0,0833 Bactericida


48

4 DISCUSSÃO

Os resultados obtidos indicaram que a maior parte dos halos de inibição

foram encontrados para a espécie Staphylococcus aureus. Este é um dado

importante quando se pensa que atualmente tem-se observado a propagação do

Staphylococcus aureus resistente à meticilina para o mundo todo, e que este fato

tem se tornado um problema de saúde publica mundial devido aos escassos

recursos para o tratamento das infecções causadas por esse tipo de microrganismo

(LUNA et al 2010).

Os resultados encontrados também indicaram substâncias capazes de inibir

o crescimento de Enterococcus faecalis, espécie frequentemente apontada como

causadora de doenças nos peixes, assim como indica o estudo realizado por

Khafagy et al (2009), que mostrou que 31% das infecções encontradas na espécie

Tilapia zilli eram causadas por Enterococcus faecalis.

Outra espécie que chama a atenção dos aquicultores é Pseudomonas

aeruginosa, uma vez que, segundo Thomas et al (2014), perdas econômicas

consideráveis estão sendo causadas no cultivo, por exemplo, de peixes da espécie

Oreochromis mossambicus devido a infecções causadas por Pseudomonas

aeruginosa. Os resultados do nosso estudo apontaram que 17,93% das bactérias

foram capazes de inibir também o crescimento desse microrganismo.

Outras espécies de importância em aquicultura e para a saúde humana,

como Edwardsiella tarda; Aeromonas hydrophila e Salmonella tiphy também foram

testadas e apresentaram resultados consideráveis.

Há muito tempo vários estudos vem indicando a espécie Aeromonas

hydrophila como causadora da morte de inúmeros peixes em aqüicultura, como

mostrado por SHOTTS (1972). Já em 1984, Cipriano et al indicava esta espécie

como sendo a mais comum em habitat de água doce, além se ser a responsável por

causar doenças graves em peixes selvagens. Ainda nos dias de hoje, Aeromonas

hydrophila é citada como sendo capaz de causar septicemias extremamente

virulentas em peixes (PLUMB, 2010). Além disso, espécies de Aeromonas

hydrophila isoladas de peixes já se mostraram resistentes a antimicrobianos

potentes como Meticilina, Rifamicina, Bacitracina e Novobiocina, sendo

49

consideradas espécies de alto risco (VIVEKANANDHAN, 2002). Estudos realizados

por RESENDE (2011) confirmaram a presença de bactérias resistentes à

antimicrobianos no ambiente aquático. Dessa forma, o presente estudo mostrou que

algumas bactérias, como C2I12 e C2I13 isoladas de aquicultura, além de serem

capazes de inibir as outras espécies-problema já citadas, também eram capazes de

inibir Aeromonas hydrophila. Diante do exposto, este foi um fator predeterminante

para a escolha destas amostras para a realização dos estudos de fatores de

interferência, extração e caracterização parcial das substâncias antagonistas.

Os enormes prejuízos que as infecções vêm causando em sistemas de

cultivo de peixes, tem aumentado o emprego de antimicrobianos. Com isso, o

aumento de microganismos resistentes tem incentivado a busca por alternativas, de

forma que novos tratamentos sejam propostos. Nesse sentido, tem-se aumentado a

busca pelas bacteriocinas (CAVALCANTE et al 2012). O presente estudo indicou a

presença de substâncias antagonistas para Aeromonas hydrophila em ambos os

extratos testados. A atividade das substâncias antagonistas encontradas é

independente à presença de fagos, ácidos ou devido ao clorofórmio. Além de

possuírem boa estabilidade térmica e a variações de pH, são parcialmente sensíveis

a ação de proteinase K, o que demonstra elevada possibilidade de se tratar de

substâncias tipo bacteriocina.

A avaliação da atividade da substância antagonista pode ser influenciada

pelo método utilizado. A atividade da substância antagonista produzida por ambas

as amostras testadas é melhor visualizada quando a técnica de difusão em poços é

utilizada, embora para o extrato de C2I12 seja possível observar atividade, ainda que

menor, também no método da sobrecamada. Estudos realizados por ALVES et al

(2008) para avaliar a atividade antimicrobiana de extratos da planta Miconia

rubiginosa (Melastomataceae) frente à seis cepas de bactérias, demonstraram

resultados semelhantes, e acredita-se que o motivo seja a maior possibilidade de

contato entre as substâncias antagonistas presentes no extrato e os microrganismos

testados. Essa dificuldade de difusão dos extratos pelo meio de cultura pode estar

relacionada à hidrossolubilidade e à massa molecular das substâncias antagonistas

analisadas (ALVES et al 2008)

50

Assim, com base nos resultados apresentados, podemos comparar as duas

substâncias antagonistas produzidas, chegando a duas hipóteses: uma vez que os

meios de cultura utilizados eram de base aquosa, pode-se inferir que provavelmente

C2I12 possui uma característica de hidrofilicidade maior que C2I13, ou que possui

massa molecular menor que esta última, uma vez que a substância antagonista

produzida por C2I12 foi capaz de inibir o crescimento da cepa reveladora em ambos

os métodos testados.

Além do método utilizado na avaliação da atividade antagonista, também foi

possível observar que a espessura do meio de cultura era capaz de interferir na

expressão da atividade antagonista dos extratos, uma vez que ele pode interferir na

permeabilidade dos extratos em questão. Os meios de cultura de 0,2 cm de

espessura possibilitavam a visualização de zonas de inibição até diluições de 1:4 do

extrato em água esterilizada para ambos os extratos, e que quando a espessura do

meio era aumentada para 0,5 cm, já não era possível observar o aparecimento de

zonas de inibição. Dessa forma, os meios de cultura utilizados para os testes

seguintes, possuíram espessura de 0,2 cm. OSTROSKY et al (2008) possui teoria

semelhante ao demonstrado pelo presente estudo, ao considerar que o volume de

meio de cultura transferido para a placa de petri interfere na produção dos halos de

inibição, e que uma solução para aumentá-los, seria exatamente a diminuição da

espessura do meio.

Muitos são os fatores que podem interferir na produção das bacteriocinas.

Além do meio de cultivo, outro fator importante é o tempo de incubação, que deve

ser determinado empiricamente (BONINI, 2005; ZORZI, 2010). Assim, objetivando-

se determinar qual o melhor tempo de incubação para a produção das substâncias

antagonistas de C2I12 e C2I13, foi realizado um último teste antes se iniciar a

caracterização propriamente dita dos extratos. Para as duas amostras teste o melhor

tempo de incubação é 48 horas, sendo o extrato de C2I12 ativo até a diluição 1:64 e o

de C2I13 até 1:32. Estudos realizados por BAGI (1992) onde foram analisadas as

melhores condições para produção de bacteriocinas pelos gêneros Erwinia,

Pseudomonas e Xanthomonas, evidenciaram que tempos maiores de incubação

tendem a possibilitar uma melhor produção de bacteriocinas.

51

O interesse na aplicação de bacteriocinas na indústria vem aumentando

devido à sua capacidade de bioconservação de alimentos. O potencial de uma

bacteriocina para este tipo de aplicação depende, entre outros fatores, de suas

características de estabilidade ao tratamento térmico e às variações de pH

(SCHULZ, 2003; BENITEZ, 2010). Estudos realizados utilizando extratos brutos de

bacteriocinas produzidas por Lactobacillus plantarum na conservação dos peixes

tirapitinga e tambaqui provenientes da aqüicultura, demonstraram melhores

indicadores físico-quimicos e sensoriais dos mesmos (MAHECHA, 2008).

Ambos os extratos obtidos a partir de nossas amostras produtoras tiveram

sua atividade parcialmente diminuída quando expostos à temperatura de 60°C por

15 minutos, semelhante ao encontrado por MARTINS (2003) para bacteriocina

produzida por Leuconostoc mesenteroides, isolada de peito de frango, que teve sua

atividade diminuída pela metade quando tratada a 60°C por 10 minutos. As outras

temperaturas testadas neste trabalho mostraram-se estáveis por pelo menos 22

dias, havendo pequenas perdas de atividade ao longo do tempo. Uma exceção foi

observada quando os extratos foram tratados com temperatura de 37°C, na qual

ambos os extratos perderam atividade após 15 dias. Foi possível perceber que o

extrato de C2I13 é mais estável às variações de temperatura do que o extrato de

C2I12, uma vez que após 15 dias exposto às condições de temperatura citadas, o

mesmo ainda se mostrou capaz de inibir o crescimento da bactéria reveladora até

diluições 1:2 em água esterilizada para todas as temperaturas testadas, diferente de

C2I12, que com 48 horas já demonstrava atividade antagonista diminuída para as

temperaturas de 4°C e 37°C. Algumas classes de bacteriocinas são consideradas

termoestáveis (SCHULZ, 2003; NASCIMENTO, 2008). Muitos autores já vêm

demonstrando que muitas delas são capazes de resistir a elevadas temperaturas,

como mostrado por LIMA (2002), onde bacteriocinas produzidas por Zymomonas

mobilis se mostraram estáveis por até 15 minutos quando expostas à temperaturas

de 80°C. Estudos relatados por LOUREIRO (2015) mostraram que a bacteriocina

ST44AM permaneceu estável mesmo após ser submetida a temperaturas de 25, 30,

45, 60 e 100°C, durante 120 minutos. Assim como nos testes anteriores, alguns

interferentes podem ser citados, como, por exemplo, a espessura do meio de

cultura, a quantidade de reveladora utilizada, o método utilizado e até mesmo a

acuidade visual dos operadores que fizeram as leituras (presença ou ausência de

52

zonas de inibição), o que justifica o fato de resultados negativos serem, em alguns

casos, seguidos de resultados positivos, para o mesmo extrato, na mesma

temperatura, em dias diferentes.

O presente estudo também demonstrou que as substâncias antagonistas

detectadas possuíam grande estabilidade quando expostas a variações de pH. Após

serem expostas a valores de pH entre 2 e 12, pode-se observar que C2I12

demonstrou resultados melhores para um possível uso em alimentos, uma vez que

foi estável a praticamente todos os valores de pH analisados, por 24 horas,

demonstrando perda quase insignificante de atividade. Já C2I13, mostrou-se mais

susceptível aos efeitos gerados pelas variações no pH, ficando mais estável em uma

faixa entre 4 e 6. BRONBERG et al (2006), apresentou resultado semelhante ao

encontrado nesse estudo para C2I12 ao demonstrar que uma bacteriocina isolada de

Lactococcus lactis ssp. hordniae CTC 484 apresentou-se estável numa faixa de pH

entre 2 e 10. Em outro estudo realizado por LISBOA (2006), uma bacteriocina

produzida por uma espécie de Bacillus, mostrou-se estável quando em pH ácido ou

alcalino, semelhante ao que foi demonstrado neste estudo para a substância

antagonista produzida por C2I13. MARTINS (2003) mostrou resultado semelhante ao

analisar a estabilidade a variações de pH de seis bacteriocinas produzidas por

bactérias láticas, demonstrando que todas foram estáveis a pH 4, e que a

bacteriocina produzida pelo Lactobacillus sake 1, foi capaz de se manter estável por

uma faixa de pH de 2-10, após 24 horas à 10°C.

Neste trabalho, foram utilizados solventes orgânicos comuns em técnicas de

separação, como HPLC (High Performance Liquid Chromatography) . O objetivo

deste teste era identificar, dentre os solventes e concentrações testadas, qual era o

melhor meio para que os extratos fossem carreados, de forma que no futuro, a

purificação possa ser feita, além de inferir se a substância antagonista possuía ou

não, partes lipídicas em sua estrutura. Os resultados apresentados mostraram que o

extrato de C2I12 permanece ativo por pelo menos uma hora e meia, quando em

contato com hexano a 50%, tendo este solvente apresentado os melhores

resultados. Embora os outros solventes também tenham apresentado um resultado

positivo, pode-se observar uma diminuição da atividade antagonista do extrato. Para

o extrato de C2I13, nenhum dos solventes orgânicos utilizados mostrou-se adequado

para ser utilizado como carreador da substância antagonista, uma vez que para

53

todos eles pode-se observar uma redução da atividade antagonista ao longo do

tempo de exposição. OLIVEIRA (2004), em estudo semelhante, mostrou que a

atividade antimicrobiana de um peptídeo isolado de Bacillus licheniformis P40, teve

sua atividade preservada quando em contato com solventes orgânicos após duas

horas de exposição, só tendo sua atividade afetada pelo butanol.

Os surfactantes são substâncias capazes de agir na interface entre duas

fases, tais como água e óleo, e são caracterizadas por possuírem uma região

hidrofílica (polar) e outra hidrofóbica (apolar) (DAVANÇO, 2007). O objetivo deste

experimento foi observar se as substâncias antagonistas eram estáveis à ação

dessas substâncias e, consequentemente, obter informações sobre a natureza

química da mesma. Os resultados apresentados mostraram que o extrato de C2I12

teve sua atividade antagonista reduzida quando tratada por pelo menos uma hora,

para todos os surfactantes utilizados. Já para o extrato de C2I13 apresentou perda

considerável quando tratado com uréia e tween 80, por uma hora, e quando tratado

com SDS, a atividade antagonista foi totalmente perdida logo nos primeiros 30

minutos de tratamento. Pode-se inferir que ambas as substâncias possuem em sua

estrutura, uma parte lipídica, que foi emulsificada pelos surfactantes, fazendo com

que as substâncias antagonistas perdessem, ou tivessem sua ação reduzida. Dessa

forma, os resultados apresentados estão de acordo com os encontrados por

Elayaraja et al (2014), onde bacteriocinas tiveram sua atividade reduzida, quando

tratadas com os mesmos surfactantes utilizados neste experimento.

Após o tratamento dos extratos com a solução de proteinase K 1mg/mL,

pode-se observar (quadros 16 e 17) uma redução do tamanho das zonas de inibição

em ambos os extratos, quando comparadas com o controle positivo. No extrato de

C2I12 houve uma redução de 50% da atividade inibitória após uma hora de exposição

enzima. Já para o extrato de C2I13, houve uma diminuição 66,7% na atividade

antagonista. Esse resultado pode ser comprovado pela estabilidade térmica

demonstrada por ambos os extratos, o que indica que a perda de atividade foi em

decorrência a ação enzimática, e não a exposição à temperatura de 37°C. Estudos

realizados por MARTINS (2003) mostraram que as substâncias antimicrobianas

produzidas por seis cepas de bactérias láticas, perderam totalmente atividade

quando tratadas com preteinase k 10mg/mL. Estudo semelhante realizado por

OLIVEIRA (2004), demonstrou que um peptídeo antimicrobiano produzido por

54

Bacillus licheniformis P40 quando tratado com proteinase k 2mg/mL teve sua

atividade praticamente toda preservada, e que quando o mesmo peptídeo era

tratado com a enzima em concentração de 10mg/mL, a atividade antimicrobiana era

inativada. Dessa forma, pode-se sugerir que os extratos de C2I12 e C2I13

provavelmente seriam totalmente inativados, caso fossem tratados com proteinase k

em uma maior concentração.

Pode-se calcular a concentração dos extratos brutos de C2I12 e C2I13 a partir

das absorbâncias encontradas para os mesmos, de forma que o extrato bruto de

C2I12 apresentou uma concentração de 1,87 mg/mL de proteínas e o extrato bruto de

C2I13 3,21 mg/mL. É importante ressaltar que as concentrações são referentes a

extratos produzidos nas condições de precipitação utilizadas (200 mL de caldo,

incubado por 24 horas a 35°C, ressuspendido em 2 mL de água destilada

esterilizada). Porém ainda são necessários mais estudos e o emprego de técnicas

de purificação para que a proteína responsável pela atividade antagonista possa ser

quantificada e melhor caracterizada.

O extrato de C2I12 mostrou-se capaz de inibir o crescimento de Aeromonas

hydrophila até valores menores ou iguais a 0,1558 mg/mL de extrato, não sendo

capaz de inibir o crescimento nas concentrações inferiores testadas. Já para o

extrato de C2I13, a menor concentração testada capaz de inibir o crescimento

microbiano foi de 0,2675 mg/ mL. Ambos os extratos demostraram atividade

bacteriostática. SCHOBITZ (2006) em estudo realizado com substâncias tipo

bacteriocina produzida por Carnobacterium piscicola, indicou resultado semelhante

ao do presente estudo, onde a mesma possuía efeito bacteriostárico sobre L.

monocytogenes.

55

5 CONCLUSÃO

Isolados bacterianos de sistemas de aquicultura produzem substancias

antagonista para algumas espécies de importância na aquicultura e em seres

humanos.

O estudo dos fatores de interferência indicaram que o efeito antagonista

observado não possuía relação com o uso do clorofórmio, com a produção de ácidos

e nem com a presença de bacteriófagos.

A espessura do meio de cultura é capaz de interferir no antagonismo dos

extratos.

A substância antagonista é produzida em maior quantidade quando o inóculo

é incubado por 48 horas e que o melhor método para avaliação do mesmo é a

difusão em poços.

Os extratos possuem boa estabilidade térmica, sendo o extrato de C2I13 mais

estável que o extrato de C2I12, sendo capaz de inibir o crescimento microbiano até

diluições 1:2 até 15 dias, incubado nas temperaturas testadas. Ambos os extratos

mostraram-se estáveis às variações de pH, sendo o extrato de C2I12 estável a uma

faixa de pH entre 2 a 12. Quando expostos a diferentes solventes orgânicos, o

extrato de C2I12 se mostrou estável à ação de hexano 50%, enquanto o extrato de

C2I13 não apresentou estabilidade significativa aos solventes orgânicos testados. Na

presença dos surfactantes testados, os extratos de C2I12 e C2I13 apresentaram

redução de suas atividades antimicrobianas. Ambos os extratos demonstraram

diminuição da atividade antagonista quando tratados com proteinase K 1mg/mL.

O extrato analisado de C2I12 possui 1,87 mg/mL de conteúdo protéico,

enquanto que extrato de C2I13, 3,21 mg/mL. A MIC de C2I12 para a reveladora

testada foi 0,1558 mg/mL, e para C2I13 0,2675 mg/mL. Ambos os extratos

demonstraram ação bacteriostática.

56

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O surgimento de linhagens bacterianas resistentes vem incentivando a

busca por alternativas ao uso dos antimicrobianos. O estudo das bacteriocinas vem

sendo muito estimulado, principalmente na área de alimentos. Estudos já indicam

seu uso em potencial na conservação de peixes, e como probióticos. Nosso estudo

mostra que bactérias isoladas de sistemas de aquicultura produzem substâncias

antagonistas, ativas principalmente Staphylococcus aureus e Enterococcus faecalis.

Além disso, os extratos das amostras selecionadas inibiram o crescimento de

Aeromonas hydrophila, sob diversas condições. Assim, as substâncias antagonistas

encontradas podem, no futuro, vir a contribuir para uma redução no número de

doenças infecciosas que acometem peixes provenientes da aquicultura, auxiliando

na diminuição das perdas econômicas geradas pela elevada mortalidade dos

animais alem de auxiliarem na redução de microrganismos resistentes,

considerando a necessidade de uma menor exposição aos antimicrobianos. Os

resultados encontrados neste trabalho vão ao encontro dos resultados encontrados

com diversos estudos relacionados à detecção e caracterização de bacteriocinas.

Assim é possível concluir que as substâncias antimicrobianas detectadas no

presente estudo possuem características normalmente encontradas em substâncias

antimicrobianas tipo bacteriocina, o que justifica que estudos complementares de

purificação e identificação sejam realizados.

57

REFERÊNCIAS

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ANEXO

universidade federal de juiz de fora ......a todos os meus amigos que sempre estiveram ao meu lado,...

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